カロテノイドに基づく着色剤
その動物飼料を与えられた動物の組織に色を付加するための動物飼料への添加のための、合成抗酸化剤を含まない、安定化されたカロテノイドに基づく着色剤。カロテノイドに基づく着色剤は、天然源から鹸化反応を通して得られた遊離型のカロテノイド類を含む。希釈剤、好ましくはグリセロールまたはグリセロール様の物質と組み合わせられた天然抗酸化剤、例えばブドウの種の抽出物、緑茶の抽出物、チョウジノキの蕾油、チョウジノキの葉油、ビタミンＣ、ニッケイの葉油、ウコン色素、トコフェロール、トコトリエノール、ローズマリーの抽出物および没食子酸またはそれらの塩類は、鹸化反応の後に着色剤に添加される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001] 本出願は、２００６年１２月２２日に出願された米国特許出願一連番号６０／８７６，９４２に対して優先権を主張する。
[0002] 本発明は、概してカロテノイドに基づく着色剤（ｐｉｇｍｅｎｔｅｒ）に、より詳細には、天然抗酸化剤により酸化に対して安定化されたカロテノイドに基づく着色剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0003] 外観は消費者による食物の選択に関する重要な基準の１つである。切り分けられた鶏肉および卵黄の色の強化は、飼料中のカロテノイド類を増加させた結果である。カロテノイドに基づく着色剤製品を含め、着色剤製品は酸化を受けやすい。合成抗酸化剤、例えばエトキシキン（ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）は、しばしば安定化の目的で最終的な着色剤製品の中に入れられる。エトキシキンは食料および飼料の用途における最も一般的な合成抗酸化剤の１つである。カロテノイド類に基づく有名な着色剤は、カロテノイドを酸化に対して保護するためにエトキシキンを抗酸化剤として用いている。しかし、エトキシキンの使用は、特にペットへの健康の懸念が主張されるため、依然として議論の的である。最近、日本政府はエトキシキンを好ましくは天然源からの別の抗酸化剤でできるかぎり置き換える検討に取り組み始めた。
【発明の概要】
【０００３】
[0004] グリセロールまたはグリセロール様の物質と組み合わせた没食子酸を抗酸化剤として用いて、新規のカロテノイドに基づく着色剤組成物を開発した。新規組成物を、合成抗酸化剤をカロテノイド類の安定および着色効力の維持のために用いる既存のカロテノイドに基づく着色剤製品と比較した。前記新規着色剤組成物は、合成抗酸化剤で安定化された着色剤製品と同じくらい、カロテノイド類、および特にトランスカプサンチンの安定に有効であることが分かった（Ｐ＞０．０５）。両方の製品の着色効力は同程度であった。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
[0005] 事実上、商業市場における全てのカロテノイドに基づく着色剤は、天然源から抽出されたカロテノイド類を含んでいる。ほとんどのカロテノイド類は天然源の中に、カロテノイドがエステルと結合したエステル化された形で存在する。遊離型のカロテノイドを得るために、一般には強アルカリを用いた鹸化の工程が実施される。没食子酸を抗酸化剤として用いる天然源からの改良された着色剤製品を作るための過程において、没食子酸は鹸化の工程の後に添加しなければならない。さらに、没食子酸は、没食子酸の着色剤製品中への分散を助けるために、および没食子酸のカロテノイドに基づく着色剤製品を酸化に対して守る効力を向上させるために、希釈剤、好ましくはグリセロールまたはグリセロール様の物質と一緒に添加する必要がある。改良された着色剤の他の利益は、動物組織に色を付加する着色剤の効力が天然抗酸化剤系の使用により有害な影響を受けないということである。
【０００５】
[0006] 本発明は、天然抗酸化剤化合物（例えばブドウの種の抽出物、緑茶の抽出物、チョウジの蕾油、チョウジノキの葉油、ビタミンＣ、ニッケイの葉油、ウコン樹脂油（ｏｌｅｏｒｅｓｉｎ ｔｕｒｍｅｒｉｃ）、トコフェロール、トコトリエノール、ローズマリーの抽出物および没食子酸）を固体および液体の配合物の中に組み入れた抗酸化剤系からなる。天然抗酸化剤分子は着色剤製品中で限られた可溶性を有する可能性があるため、天然の希釈剤、例えばベンジルアルコール、グリセロールおよび水が、天然抗酸化剤分子の着色剤製品中への分散を増進するためのキャリヤーとして選択される。我々の結果は、着色剤に添加する天然抗酸化剤として没食子酸を用いた場合、没食子酸の量は０．０１〜５重量パーセント、好ましくは０．１〜３重量パーセント、より好ましくは０．５〜２重量パーセントであることを示した。希釈剤は色素に、０．５〜１５重量パーセント、好ましくは１〜１０重量パーセント、より好ましくは２〜８重量パーセントの量で添加される。おおよそ１％の没食子酸と４％グリセロールの組み合わせが最も優れた抗酸化剤の効能を示した。さらに、安定性のデータはこの製品が９ヶ月まで安定であることを明らかにした。我々の研究において、我々は天然抗酸化剤を製法の中に加える順序が非常に重要であることを見出した。天然抗酸化剤は、抗酸化剤として作用するためには、鹸化した色素の中に分散させるために希釈剤に溶解しなければならない。さらに、グリセロール中の没食子酸を用いる場合、アルカリによる没食子酸の中和を避けるため、および必要な程度の鹸化を維持するため、その溶液は鹸化の工程の後に添加しなければならない。
【０００６】
[0007] さらに、半合成抗酸化剤、例えば没食子酸プロピル、没食子酸オクチル、没食子酸ドデシルおよびパルミチン酸アスコルビルは没食子酸と類似する抗酸化剤特性を示し、本発明の範囲内で用いることができる。使用することのできる他の合成希釈剤は、モノプロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびアルコール様の溶媒である。グリセロール性化合物には、グリセロールの水素部分の１個以上が異なる部分で置換されており、置換された化合物がなお、カロテノイドに基づく着色剤に添加された際に抗酸化剤の優れた分散を示す化合物が含まれる。
【０００７】
[0008]
【実施例】
【０００８】
[0009] 材料および方法
[0010] 分析プロトコルにおいて用いた全ての化学製品および試薬は分析試薬グレードのものである。市販食品グレードの没食子酸、エトキシキン、グリセロール、プロピレングリコール、水酸化カリウム、小麦ふすまおよびシリカを製品開発研究に用いた。
【０００９】
[0011] カロテノイドアッセイ。０．５ｇ（＋／−０．１ｍｇ）の試料を、１００ｍｌ褐色容量フラスコに入れる。フラスコを抽出溶媒としてのＨＥＡＴ（ヘキサン：エタノール：アセトン：トルエン−１０：６：７：７）で満たし、磁力撹拌子で１５分間撹拌する。５ｍｌをピペットにより５０ｍｌ褐色容量フラスコに移し、ＨＥＡＴで印まで希釈し、振とうして内容物を混合する。紫外−可視分光光度計のキュベットをこの溶液で満たし、吸光度を４６０ｎｍにおいて抽出溶媒と対比して測定する。吸光度が０．３〜０．７でなかった場合、試料の量を調節する必要がある可能性があることに注意する。総カロテノイド類は次の式により与えられ、ここでＡ４６０は４６０ｎｍにおける吸光度である：
総カロテノイド類（ｇ／ｋｇ）＝［Ａ４６０×４．４２６］／試料の重量。
【００１０】
[0012] トランスカプサンチンアッセイ。０．４ｇ（＋／−０．１ｍｇ）の試料を、１００ｍｌ褐色容量フラスコに入れる。フラスコに抽出溶媒として３０ｍｌのＨＥＡＴ（ヘキサン：エタノール：アセトン：トルエン−１０：６：７：７）を添加し、フラスコを１分間超音波処理する。１ｍｌの蒸留水および２ｍｌの４０％ＫＯＨ−メタノールをフラスコに添加する。フラスコに空気冷却器を接続し、フラスコを５６℃の水浴中で２０分間加熱する。フラスコの内容物を１番目の３００ｍｌ分液漏斗に移し、３０ｍｌの抽出溶媒および４０ｍｌの３％Ｎａ２ＳＯ４溶液で洗浄する。１番目の分液漏斗を３０秒間振とうし、分離のため脇に置く。分離したら、１番目の漏斗中の下の水層を２番目の３００ｍｌ分液漏斗に移し、３０ｍｌの抽出溶媒を添加する。２番目の分液漏斗を３０秒間振とうし、分離のため脇に置く。分離したら、２番目の分液漏斗中の下の水層を廃棄し、漏斗の１個の中で２個の分液漏斗からの上の有機層を合わせる。５０ｍｌの３％ＮａＣｌを添加し、漏斗を３０秒間振とうし、脇に置いて分離させる。下の水層を廃棄する。残りの層を５０ｍｌの蒸留水で洗浄し、分離した後、下の水層を廃棄する。数滴の１％フェノールフタレイン溶液により測定して、下の層が中性ではなかった場合、追加の洗浄が必要である可能性がある。上の有機層を１００ｍｌ褐色容量フラスコに移し、フラスコを印まで抽出溶媒で満たす。２ｍｌをピペットにより５０ｍｌ丸底フラスコに移し、この溶液をロータリーエバポレーター中で蒸発乾固させる。６３ｐｐｍ分析グレードα−トコフェロールをＨＰＬＣグレードのヘキサンに添加し、このヘキサンをＨＰＬＣグレードのアセトンと８１：１９ヘキサン：アセトンの比率で混合してＨＰＬＣの移動相を作る。２ｍｌの移動相を丸底フラスコに入れ、溶液を再び蒸発乾固させる。２ｍｌの移動相を添加し、溶液をＨＰＬＣに注入する（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＬＣ−ＳＩＬ（Ｍ）；流速１．１ｍｌ／分；４７４ｎｍで検出；２０℃；注入体積２０μｌ）。トランスカプサンチンの量は次の式により与えられる：
総トランスカプサンチン＝総カロテノイド類×クロマトグラムからの面積％。
【００１１】
[0013] エトキシキンアッセイ。１ｇ（＋／−０．１ｍｇ）を栓付き５０ｍｌコニカルフラスコの中に入れる。１０ｍｌの溶媒（１ｌメタノール中０．１ｇＢＨＴ）を添加し、３０分間超音波処理する。Ｎｏ．４の濾紙を用いて溶液を濾過し、濾液を１００ｍｌ丸底フラスコの中に集める。コニカルフラスコおよび濾紙を５０ｍｌの溶媒で完全にすすぐ。全ての濾液を丸底フラスコの中に集め、１個目をシリカ、２個目を無水塩化カルシウムで充填した２個のガストラップを持つ真空蒸留装置を用いて乾燥させる。乾燥した試料を５ｇの第２溶媒（１：１アセトニトリル：メタノール；リットルあたり０．０５ｇＢＨＴ）に溶解する。試料を０．２μｍディスクフィルターを通して濾過する。０．０１ｇのエトキシキンを１０ｇの第２溶媒に溶解し、０．１ｐｐｍエトキシキンに達するまでの系列希釈を用いてエトキシキン標準を調製する。試料およびエトキシキン標準を、一連の標準、試料、標準を用いて、ＨＰＬＣ（Ｃ１８，５μｍ，４．６×２５０ｍｍ；４０℃；ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（７５：２５）移動相；流速１ｍｌ／分；注入体積２０μｌ；分光蛍光計，Ｅｘ３６０ｎｍ，Ｅｍ４３５ｎｍ）の中に注入する。エトキシキンの量は次の式により与えられ、ここでＳＡａｖｅはＨＰＬＣクロマトグラムからの２個の標準ピーク面積の平均であり、試料面積はＨＰＬＣクロマトグラムからの試料のピークの面積であり、ＥＱｓｔｄは標準中のエトキシキンの量（ｐｐｍ）である：
試料中のエトキシキン（ｐｐｍ）＝試料面積×ＥＱｓｔｄ／５×ＳＡａｖｅ。
【００１２】
[0014] 抗酸化剤アッセイ。抗酸化剤分子の選別は、ＤＤＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）法を用いて行われた。標準とする０．１ｍＭ ＤＰＰＨの均一な溶液をエタノール中で超音波処理の下で調製した。この標準溶液の吸光度を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ分光光度計（Ｍｏｄｅｌ ＵＶ−２４０１ＰＣ）で５１７ｎｍにおいて、エタノールのブランクに対比して測定した。試料をエタノールに溶解し、１００ｐｐｍの均一な試験試料溶液を調製した。試験試料がエタノール中で完全に溶解していることを確実にするため、溶液を５分間超音波処理した。１ｍｌのこの試料溶液をピペットで試験管の中に入れ、エタノールを用いて１０ｍｌに希釈した。この試験溶液の吸光度を、５１７ｎｍにおいて、エタノールのブランクに対比して測定した。２ｍｌの標準０．１ｎＭ ＤＰＰＨ溶液を試験管に入れ、０．１ｍｌの試験試料を添加した。混合物を１分間ボルテックスし、１５分間放置した後、５１７ｎｍにおいてエタノールのブランクに対比して吸光度を測定した。酸化阻害の百分率は、下記のように計算された：
酸化阻害の％＝［（１−（Ａｓｐｌ−Ａｂｋｇ））／Ａｃｔｌ］×１００；
ここで、Ａｓｐｌは１５分間のＤＰＰＨとの反応の後の試験試料溶液の吸光度、Ａｂｋｇは１００ｐｐｍ試験試料溶液の吸光度、Ａｃｔｌは標準１００ｐｐｍ ＤＰＰＨ溶液の吸光度である。
【００１３】
[0015] 新製品の着色効力を、４４週齢Ｌｏｈｍａｎ ＬＳＬ Ｃｌａｓｓｉｃ産卵鶏（ｌａｙｅｒ ｂｉｒｄｓ）を用いて試験した。処置あたり２０羽の鳥がいた。試験期間は２４日間であった。飼料中の着色製品の用量は０．１４％であった。２４日間の試験の後、処置あたり１０個の卵を集め、Ｒｏｃｈｅカラーファン（ＲＣＦ）の点数に関して分析した。
【００１４】
[0016] ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（サンディエゴ、米国）、バージョン３．０２のソフトウェアを、統計分析のために用いた。
[0017] 結果および論考
[0018] ２．５５ｇ／ｋｇのトランスカプサンチンを含む４種類の試験用着色剤配合物を、それぞれ０．８％、１．１％、１．５％および２．０％の没食子酸を用いて、鹸化されたパプリカ（ｐａｐｒｉｋａ）抽出物からのものでありＫｅｍｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（アジア）Ｐｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ（シンガポール）により販売される、トランスカプサンチンを含む赤色カロテノイド類の乾燥して安定化された原料であるＫｅｍ ＧＬＯ（登録商標）を用いて作った。これらの配合物中のカロテノイド類の安定性を、開いた袋の中で、７５℃および室温の両方において試験した。
【００１５】
[0019] 表１は、ストレス条件における７５℃でのこれらの試験用配合物のカロテノイド類の安定性を示す。この結果は、異なる没食子酸濃度を有する配合物の間での有意差を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００１６】
[0020] 表１：７５℃で保存された、異なる没食子酸（ＧＡ）濃度を有する試験用のカロテノイドに基づく着色剤配合物中のカロテノイド類の保持
【００１７】
【表１】
【００１８】
[0021] 室温であるが開いた袋の中での他のストレステストにおいて、結果は没食子酸およびエトキシキン配合物の間で有意な差を示さなかった（Ｐ＞０．０５）（表２）。
[0022] 表２：開いた袋の中での、室温における、エトキシキンおよび没食子酸を有する着色剤配合物中のカロテノイド類およびトランスカプサンチンの保持
【００１９】
【表２】
【００２０】
[0023] 別の着色剤組成物を、３．８ｇ／ｋｇのトランスカプサンチンを有するように配合し、１．１％没食子酸で安定化した。この組成物を、閉じた袋の中で、通常のＫｅｍ ＧＬＯ（登録商標）（エトキシキンで安定化された）および抗酸化剤なしの類似の配合物と一緒に、リアルタイム安定性試験を受けさせた。結果（表３）は、抗酸化剤なしのＫｅｍ ＧＬＯ（登録商標）配合物中の総カロテノイド類およびトランスカプサンチンの安定性は、エトキシキンまたは没食子酸のいずれかを含む他の２種類の配合物よりも有意に低かったこと（Ｐ＜０．０５）、および後者の２種類の製品には安定性において有意差はなかったことを示した（Ｐ＞０．０５）。
【００２１】
[0024] 表３：抗酸化剤なしの、没食子酸またはエトキシキン（ＥＱ）を有する、着色剤配合物中の総カロテノイド類およびトランスカプサンチンの保持
【００２２】
【表３】
【００２３】
ａ，ｂ共通の上付き文字を有しない列は有意差がある（Ｐ＜０．０５）。
[0025] ３．８ｇ／ｋｇのトランスカプサンチンを含み、１．１％没食子酸で安定化された試験用組成物を、Ｋｅｍ ＧＬＯ（登録商標）製品（エトキシキンを有する、および有しない）、ならびに公に入手できる、同じトランスカプサンチン含有率の、乾燥したカロテノイドに基づく着色剤製品（Ｋｏｋｈｉｎ、日本）と一緒に、着色効力試験を受けさせた。全ての処置は、同じ濃度（０．１４％）の色素を飼料中に与えられた。異なる処置に関するＲＣＦの点数の結果は、没食子酸を含む試験用着色剤組成物を与えられた産卵鶏からの卵黄が１３点を越えるＲＣＦの点数を獲得したことを示した。異なる処置の間で、卵の生産、卵の重量および卵の殻の強度について気づいた有意な差はなかった。
【００２４】
[0026] 結論
[0027] 本試験から、没食子酸は乾燥したカロテノイドに基づく着色剤製品中の抗酸化剤としてエトキシキンと置き換わり、トランスカプサンチンを含むカロテノイド類に酸化に対して優れた保護を提供できることが分かった。没食子酸を有する新製品中のカロテノイド類およびトランスカプサンチンの安定性は、合成抗酸化剤エトキシキンにより安定化された既存製品に匹敵する（Ｐ＞０．０５）。効力試験は、新製品が卵黄において望ましいＲＣＦの点数である１３点を与えることができたことを示した。
【００２５】
[0028] 上記の記述および図は本発明の説明的な態様を含む。上記の態様および本明細書で記述される方法は、当業者の能力、経験、および好みに基づいて変更されてよい。単に本方法の工程を特定の順序で列挙することは、本方法の工程の順序にいかなる制限も構成しない。上記の記述および図は単に本発明を説明および図説するものであり、特許請求の範囲がそう限定される場合を除いて、本発明はそれらに限定されない。それらより前の開示を有する当業者は、本発明の範囲から逸脱することなくそれに修正および変更をすることができるであろう。
【技術分野】
【０００１】
[0001] 本出願は、２００６年１２月２２日に出願された米国特許出願一連番号６０／８７６，９４２に対して優先権を主張する。
[0002] 本発明は、概してカロテノイドに基づく着色剤（ｐｉｇｍｅｎｔｅｒ）に、より詳細には、天然抗酸化剤により酸化に対して安定化されたカロテノイドに基づく着色剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0003] 外観は消費者による食物の選択に関する重要な基準の１つである。切り分けられた鶏肉および卵黄の色の強化は、飼料中のカロテノイド類を増加させた結果である。カロテノイドに基づく着色剤製品を含め、着色剤製品は酸化を受けやすい。合成抗酸化剤、例えばエトキシキン（ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）は、しばしば安定化の目的で最終的な着色剤製品の中に入れられる。エトキシキンは食料および飼料の用途における最も一般的な合成抗酸化剤の１つである。カロテノイド類に基づく有名な着色剤は、カロテノイドを酸化に対して保護するためにエトキシキンを抗酸化剤として用いている。しかし、エトキシキンの使用は、特にペットへの健康の懸念が主張されるため、依然として議論の的である。最近、日本政府はエトキシキンを好ましくは天然源からの別の抗酸化剤でできるかぎり置き換える検討に取り組み始めた。
【発明の概要】
【０００３】
[0004] グリセロールまたはグリセロール様の物質と組み合わせた没食子酸を抗酸化剤として用いて、新規のカロテノイドに基づく着色剤組成物を開発した。新規組成物を、合成抗酸化剤をカロテノイド類の安定および着色効力の維持のために用いる既存のカロテノイドに基づく着色剤製品と比較した。前記新規着色剤組成物は、合成抗酸化剤で安定化された着色剤製品と同じくらい、カロテノイド類、および特にトランスカプサンチンの安定に有効であることが分かった（Ｐ＞０．０５）。両方の製品の着色効力は同程度であった。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
[0005] 事実上、商業市場における全てのカロテノイドに基づく着色剤は、天然源から抽出されたカロテノイド類を含んでいる。ほとんどのカロテノイド類は天然源の中に、カロテノイドがエステルと結合したエステル化された形で存在する。遊離型のカロテノイドを得るために、一般には強アルカリを用いた鹸化の工程が実施される。没食子酸を抗酸化剤として用いる天然源からの改良された着色剤製品を作るための過程において、没食子酸は鹸化の工程の後に添加しなければならない。さらに、没食子酸は、没食子酸の着色剤製品中への分散を助けるために、および没食子酸のカロテノイドに基づく着色剤製品を酸化に対して守る効力を向上させるために、希釈剤、好ましくはグリセロールまたはグリセロール様の物質と一緒に添加する必要がある。改良された着色剤の他の利益は、動物組織に色を付加する着色剤の効力が天然抗酸化剤系の使用により有害な影響を受けないということである。
【０００５】
[0006] 本発明は、天然抗酸化剤化合物（例えばブドウの種の抽出物、緑茶の抽出物、チョウジの蕾油、チョウジノキの葉油、ビタミンＣ、ニッケイの葉油、ウコン樹脂油（ｏｌｅｏｒｅｓｉｎ ｔｕｒｍｅｒｉｃ）、トコフェロール、トコトリエノール、ローズマリーの抽出物および没食子酸）を固体および液体の配合物の中に組み入れた抗酸化剤系からなる。天然抗酸化剤分子は着色剤製品中で限られた可溶性を有する可能性があるため、天然の希釈剤、例えばベンジルアルコール、グリセロールおよび水が、天然抗酸化剤分子の着色剤製品中への分散を増進するためのキャリヤーとして選択される。我々の結果は、着色剤に添加する天然抗酸化剤として没食子酸を用いた場合、没食子酸の量は０．０１〜５重量パーセント、好ましくは０．１〜３重量パーセント、より好ましくは０．５〜２重量パーセントであることを示した。希釈剤は色素に、０．５〜１５重量パーセント、好ましくは１〜１０重量パーセント、より好ましくは２〜８重量パーセントの量で添加される。おおよそ１％の没食子酸と４％グリセロールの組み合わせが最も優れた抗酸化剤の効能を示した。さらに、安定性のデータはこの製品が９ヶ月まで安定であることを明らかにした。我々の研究において、我々は天然抗酸化剤を製法の中に加える順序が非常に重要であることを見出した。天然抗酸化剤は、抗酸化剤として作用するためには、鹸化した色素の中に分散させるために希釈剤に溶解しなければならない。さらに、グリセロール中の没食子酸を用いる場合、アルカリによる没食子酸の中和を避けるため、および必要な程度の鹸化を維持するため、その溶液は鹸化の工程の後に添加しなければならない。
【０００６】
[0007] さらに、半合成抗酸化剤、例えば没食子酸プロピル、没食子酸オクチル、没食子酸ドデシルおよびパルミチン酸アスコルビルは没食子酸と類似する抗酸化剤特性を示し、本発明の範囲内で用いることができる。使用することのできる他の合成希釈剤は、モノプロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびアルコール様の溶媒である。グリセロール性化合物には、グリセロールの水素部分の１個以上が異なる部分で置換されており、置換された化合物がなお、カロテノイドに基づく着色剤に添加された際に抗酸化剤の優れた分散を示す化合物が含まれる。
【０００７】
[0008]
【実施例】
【０００８】
[0009] 材料および方法
[0010] 分析プロトコルにおいて用いた全ての化学製品および試薬は分析試薬グレードのものである。市販食品グレードの没食子酸、エトキシキン、グリセロール、プロピレングリコール、水酸化カリウム、小麦ふすまおよびシリカを製品開発研究に用いた。
【０００９】
[0011] カロテノイドアッセイ。０．５ｇ（＋／−０．１ｍｇ）の試料を、１００ｍｌ褐色容量フラスコに入れる。フラスコを抽出溶媒としてのＨＥＡＴ（ヘキサン：エタノール：アセトン：トルエン−１０：６：７：７）で満たし、磁力撹拌子で１５分間撹拌する。５ｍｌをピペットにより５０ｍｌ褐色容量フラスコに移し、ＨＥＡＴで印まで希釈し、振とうして内容物を混合する。紫外−可視分光光度計のキュベットをこの溶液で満たし、吸光度を４６０ｎｍにおいて抽出溶媒と対比して測定する。吸光度が０．３〜０．７でなかった場合、試料の量を調節する必要がある可能性があることに注意する。総カロテノイド類は次の式により与えられ、ここでＡ４６０は４６０ｎｍにおける吸光度である：
総カロテノイド類（ｇ／ｋｇ）＝［Ａ４６０×４．４２６］／試料の重量。
【００１０】
[0012] トランスカプサンチンアッセイ。０．４ｇ（＋／−０．１ｍｇ）の試料を、１００ｍｌ褐色容量フラスコに入れる。フラスコに抽出溶媒として３０ｍｌのＨＥＡＴ（ヘキサン：エタノール：アセトン：トルエン−１０：６：７：７）を添加し、フラスコを１分間超音波処理する。１ｍｌの蒸留水および２ｍｌの４０％ＫＯＨ−メタノールをフラスコに添加する。フラスコに空気冷却器を接続し、フラスコを５６℃の水浴中で２０分間加熱する。フラスコの内容物を１番目の３００ｍｌ分液漏斗に移し、３０ｍｌの抽出溶媒および４０ｍｌの３％Ｎａ２ＳＯ４溶液で洗浄する。１番目の分液漏斗を３０秒間振とうし、分離のため脇に置く。分離したら、１番目の漏斗中の下の水層を２番目の３００ｍｌ分液漏斗に移し、３０ｍｌの抽出溶媒を添加する。２番目の分液漏斗を３０秒間振とうし、分離のため脇に置く。分離したら、２番目の分液漏斗中の下の水層を廃棄し、漏斗の１個の中で２個の分液漏斗からの上の有機層を合わせる。５０ｍｌの３％ＮａＣｌを添加し、漏斗を３０秒間振とうし、脇に置いて分離させる。下の水層を廃棄する。残りの層を５０ｍｌの蒸留水で洗浄し、分離した後、下の水層を廃棄する。数滴の１％フェノールフタレイン溶液により測定して、下の層が中性ではなかった場合、追加の洗浄が必要である可能性がある。上の有機層を１００ｍｌ褐色容量フラスコに移し、フラスコを印まで抽出溶媒で満たす。２ｍｌをピペットにより５０ｍｌ丸底フラスコに移し、この溶液をロータリーエバポレーター中で蒸発乾固させる。６３ｐｐｍ分析グレードα−トコフェロールをＨＰＬＣグレードのヘキサンに添加し、このヘキサンをＨＰＬＣグレードのアセトンと８１：１９ヘキサン：アセトンの比率で混合してＨＰＬＣの移動相を作る。２ｍｌの移動相を丸底フラスコに入れ、溶液を再び蒸発乾固させる。２ｍｌの移動相を添加し、溶液をＨＰＬＣに注入する（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＬＣ−ＳＩＬ（Ｍ）；流速１．１ｍｌ／分；４７４ｎｍで検出；２０℃；注入体積２０μｌ）。トランスカプサンチンの量は次の式により与えられる：
総トランスカプサンチン＝総カロテノイド類×クロマトグラムからの面積％。
【００１１】
[0013] エトキシキンアッセイ。１ｇ（＋／−０．１ｍｇ）を栓付き５０ｍｌコニカルフラスコの中に入れる。１０ｍｌの溶媒（１ｌメタノール中０．１ｇＢＨＴ）を添加し、３０分間超音波処理する。Ｎｏ．４の濾紙を用いて溶液を濾過し、濾液を１００ｍｌ丸底フラスコの中に集める。コニカルフラスコおよび濾紙を５０ｍｌの溶媒で完全にすすぐ。全ての濾液を丸底フラスコの中に集め、１個目をシリカ、２個目を無水塩化カルシウムで充填した２個のガストラップを持つ真空蒸留装置を用いて乾燥させる。乾燥した試料を５ｇの第２溶媒（１：１アセトニトリル：メタノール；リットルあたり０．０５ｇＢＨＴ）に溶解する。試料を０．２μｍディスクフィルターを通して濾過する。０．０１ｇのエトキシキンを１０ｇの第２溶媒に溶解し、０．１ｐｐｍエトキシキンに達するまでの系列希釈を用いてエトキシキン標準を調製する。試料およびエトキシキン標準を、一連の標準、試料、標準を用いて、ＨＰＬＣ（Ｃ１８，５μｍ，４．６×２５０ｍｍ；４０℃；ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（７５：２５）移動相；流速１ｍｌ／分；注入体積２０μｌ；分光蛍光計，Ｅｘ３６０ｎｍ，Ｅｍ４３５ｎｍ）の中に注入する。エトキシキンの量は次の式により与えられ、ここでＳＡａｖｅはＨＰＬＣクロマトグラムからの２個の標準ピーク面積の平均であり、試料面積はＨＰＬＣクロマトグラムからの試料のピークの面積であり、ＥＱｓｔｄは標準中のエトキシキンの量（ｐｐｍ）である：
試料中のエトキシキン（ｐｐｍ）＝試料面積×ＥＱｓｔｄ／５×ＳＡａｖｅ。
【００１２】
[0014] 抗酸化剤アッセイ。抗酸化剤分子の選別は、ＤＤＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）法を用いて行われた。標準とする０．１ｍＭ ＤＰＰＨの均一な溶液をエタノール中で超音波処理の下で調製した。この標準溶液の吸光度を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ分光光度計（Ｍｏｄｅｌ ＵＶ−２４０１ＰＣ）で５１７ｎｍにおいて、エタノールのブランクに対比して測定した。試料をエタノールに溶解し、１００ｐｐｍの均一な試験試料溶液を調製した。試験試料がエタノール中で完全に溶解していることを確実にするため、溶液を５分間超音波処理した。１ｍｌのこの試料溶液をピペットで試験管の中に入れ、エタノールを用いて１０ｍｌに希釈した。この試験溶液の吸光度を、５１７ｎｍにおいて、エタノールのブランクに対比して測定した。２ｍｌの標準０．１ｎＭ ＤＰＰＨ溶液を試験管に入れ、０．１ｍｌの試験試料を添加した。混合物を１分間ボルテックスし、１５分間放置した後、５１７ｎｍにおいてエタノールのブランクに対比して吸光度を測定した。酸化阻害の百分率は、下記のように計算された：
酸化阻害の％＝［（１−（Ａｓｐｌ−Ａｂｋｇ））／Ａｃｔｌ］×１００；
ここで、Ａｓｐｌは１５分間のＤＰＰＨとの反応の後の試験試料溶液の吸光度、Ａｂｋｇは１００ｐｐｍ試験試料溶液の吸光度、Ａｃｔｌは標準１００ｐｐｍ ＤＰＰＨ溶液の吸光度である。
【００１３】
[0015] 新製品の着色効力を、４４週齢Ｌｏｈｍａｎ ＬＳＬ Ｃｌａｓｓｉｃ産卵鶏（ｌａｙｅｒ ｂｉｒｄｓ）を用いて試験した。処置あたり２０羽の鳥がいた。試験期間は２４日間であった。飼料中の着色製品の用量は０．１４％であった。２４日間の試験の後、処置あたり１０個の卵を集め、Ｒｏｃｈｅカラーファン（ＲＣＦ）の点数に関して分析した。
【００１４】
[0016] ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（サンディエゴ、米国）、バージョン３．０２のソフトウェアを、統計分析のために用いた。
[0017] 結果および論考
[0018] ２．５５ｇ／ｋｇのトランスカプサンチンを含む４種類の試験用着色剤配合物を、それぞれ０．８％、１．１％、１．５％および２．０％の没食子酸を用いて、鹸化されたパプリカ（ｐａｐｒｉｋａ）抽出物からのものでありＫｅｍｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（アジア）Ｐｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ（シンガポール）により販売される、トランスカプサンチンを含む赤色カロテノイド類の乾燥して安定化された原料であるＫｅｍ ＧＬＯ（登録商標）を用いて作った。これらの配合物中のカロテノイド類の安定性を、開いた袋の中で、７５℃および室温の両方において試験した。
【００１５】
[0019] 表１は、ストレス条件における７５℃でのこれらの試験用配合物のカロテノイド類の安定性を示す。この結果は、異なる没食子酸濃度を有する配合物の間での有意差を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００１６】
[0020] 表１：７５℃で保存された、異なる没食子酸（ＧＡ）濃度を有する試験用のカロテノイドに基づく着色剤配合物中のカロテノイド類の保持
【００１７】
【表１】
【００１８】
[0021] 室温であるが開いた袋の中での他のストレステストにおいて、結果は没食子酸およびエトキシキン配合物の間で有意な差を示さなかった（Ｐ＞０．０５）（表２）。
[0022] 表２：開いた袋の中での、室温における、エトキシキンおよび没食子酸を有する着色剤配合物中のカロテノイド類およびトランスカプサンチンの保持
【００１９】
【表２】
【００２０】
[0023] 別の着色剤組成物を、３．８ｇ／ｋｇのトランスカプサンチンを有するように配合し、１．１％没食子酸で安定化した。この組成物を、閉じた袋の中で、通常のＫｅｍ ＧＬＯ（登録商標）（エトキシキンで安定化された）および抗酸化剤なしの類似の配合物と一緒に、リアルタイム安定性試験を受けさせた。結果（表３）は、抗酸化剤なしのＫｅｍ ＧＬＯ（登録商標）配合物中の総カロテノイド類およびトランスカプサンチンの安定性は、エトキシキンまたは没食子酸のいずれかを含む他の２種類の配合物よりも有意に低かったこと（Ｐ＜０．０５）、および後者の２種類の製品には安定性において有意差はなかったことを示した（Ｐ＞０．０５）。
【００２１】
[0024] 表３：抗酸化剤なしの、没食子酸またはエトキシキン（ＥＱ）を有する、着色剤配合物中の総カロテノイド類およびトランスカプサンチンの保持
【００２２】
【表３】
【００２３】
ａ，ｂ共通の上付き文字を有しない列は有意差がある（Ｐ＜０．０５）。
[0025] ３．８ｇ／ｋｇのトランスカプサンチンを含み、１．１％没食子酸で安定化された試験用組成物を、Ｋｅｍ ＧＬＯ（登録商標）製品（エトキシキンを有する、および有しない）、ならびに公に入手できる、同じトランスカプサンチン含有率の、乾燥したカロテノイドに基づく着色剤製品（Ｋｏｋｈｉｎ、日本）と一緒に、着色効力試験を受けさせた。全ての処置は、同じ濃度（０．１４％）の色素を飼料中に与えられた。異なる処置に関するＲＣＦの点数の結果は、没食子酸を含む試験用着色剤組成物を与えられた産卵鶏からの卵黄が１３点を越えるＲＣＦの点数を獲得したことを示した。異なる処置の間で、卵の生産、卵の重量および卵の殻の強度について気づいた有意な差はなかった。
【００２４】
[0026] 結論
[0027] 本試験から、没食子酸は乾燥したカロテノイドに基づく着色剤製品中の抗酸化剤としてエトキシキンと置き換わり、トランスカプサンチンを含むカロテノイド類に酸化に対して優れた保護を提供できることが分かった。没食子酸を有する新製品中のカロテノイド類およびトランスカプサンチンの安定性は、合成抗酸化剤エトキシキンにより安定化された既存製品に匹敵する（Ｐ＞０．０５）。効力試験は、新製品が卵黄において望ましいＲＣＦの点数である１３点を与えることができたことを示した。
【００２５】
[0028] 上記の記述および図は本発明の説明的な態様を含む。上記の態様および本明細書で記述される方法は、当業者の能力、経験、および好みに基づいて変更されてよい。単に本方法の工程を特定の順序で列挙することは、本方法の工程の順序にいかなる制限も構成しない。上記の記述および図は単に本発明を説明および図説するものであり、特許請求の範囲がそう限定される場合を除いて、本発明はそれらに限定されない。それらより前の開示を有する当業者は、本発明の範囲から逸脱することなくそれに修正および変更をすることができるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その動物飼料を与えられた動物の組織に色を付加するための動物飼料へ添加するための安定化されたカロテノイドに基づく着色剤であって、次のものを含む着色剤：
（ａ）天然源から鹸化反応を通して得られた遊離型のカロテノイド類を含む、カロテノイドに基づく着色剤；ならびに
（ｂ）鹸化反応の後に、希釈剤と組み合わせられて着色剤に添加される、ブドウの種の抽出物、緑茶の抽出物、チョウジノキの蕾油、チョウジノキの葉油、ビタミンＣ、ニッケイの葉油、ウコン色素、トコフェロール、トコトリエノール、ローズマリーの抽出物および没食子酸またはそれらの塩類からなるグループから選択される天然抗酸化剤。
【請求項２】
請求項１に定めた着色剤であって、着色剤が約０．０１重量％〜約２０重量％のカロテノイド類を含む着色剤。
【請求項３】
請求項１に定めた着色剤であって、没食子酸またはその塩類が着色剤の約０．０１重量％〜約５重量％である着色剤。
【請求項４】
請求項１に定めた着色剤であって、抗酸化剤が没食子酸またはその塩類であり、希釈剤がグリセロールまたはそのグリセロール様の物質であり、没食子酸またはその塩類のグリセロールまたはグリセロール様の物質に対する比率が約０．１〜約２、および好ましくは約０．２〜１．５である着色剤。
【請求項５】
動物の組織に色を付加する方法であり、次の工程を含む方法：
（ａ）天然源から１種類以上のエステル化されたカロテノイド類を抽出する；
（ｂ）抽出物を鹸化して遊離型のカロテノイド類を有する着色剤を製造する；
（ｃ）没食子酸またはその塩類をグリセロールまたはグリセロール様の物質と組み合わせて天然抗酸化剤を製造する；
（ｄ）天然抗酸化剤を着色剤に添加して安定化された着色剤を製造する；
（ｅ）安定化された着色剤を動物飼料に添加する；および
（ｆ）動物飼料を動物に与える。
【請求項６】
請求項５に定めた方法であって、動物の組織に付加された色が、カロテノイドを基準として同量の合成抗酸化剤で安定化された着色剤を与えた動物の組織に付加された色と同等である方法。
【請求項１】
その動物飼料を与えられた動物の組織に色を付加するための動物飼料へ添加するための安定化されたカロテノイドに基づく着色剤であって、次のものを含む着色剤：
（ａ）天然源から鹸化反応を通して得られた遊離型のカロテノイド類を含む、カロテノイドに基づく着色剤；ならびに
（ｂ）鹸化反応の後に、希釈剤と組み合わせられて着色剤に添加される、ブドウの種の抽出物、緑茶の抽出物、チョウジノキの蕾油、チョウジノキの葉油、ビタミンＣ、ニッケイの葉油、ウコン色素、トコフェロール、トコトリエノール、ローズマリーの抽出物および没食子酸またはそれらの塩類からなるグループから選択される天然抗酸化剤。
【請求項２】
請求項１に定めた着色剤であって、着色剤が約０．０１重量％〜約２０重量％のカロテノイド類を含む着色剤。
【請求項３】
請求項１に定めた着色剤であって、没食子酸またはその塩類が着色剤の約０．０１重量％〜約５重量％である着色剤。
【請求項４】
請求項１に定めた着色剤であって、抗酸化剤が没食子酸またはその塩類であり、希釈剤がグリセロールまたはそのグリセロール様の物質であり、没食子酸またはその塩類のグリセロールまたはグリセロール様の物質に対する比率が約０．１〜約２、および好ましくは約０．２〜１．５である着色剤。
【請求項５】
動物の組織に色を付加する方法であり、次の工程を含む方法：
（ａ）天然源から１種類以上のエステル化されたカロテノイド類を抽出する；
（ｂ）抽出物を鹸化して遊離型のカロテノイド類を有する着色剤を製造する；
（ｃ）没食子酸またはその塩類をグリセロールまたはグリセロール様の物質と組み合わせて天然抗酸化剤を製造する；
（ｄ）天然抗酸化剤を着色剤に添加して安定化された着色剤を製造する；
（ｅ）安定化された着色剤を動物飼料に添加する；および
（ｆ）動物飼料を動物に与える。
【請求項６】
請求項５に定めた方法であって、動物の組織に付加された色が、カロテノイドを基準として同量の合成抗酸化剤で安定化された着色剤を与えた動物の組織に付加された色と同等である方法。
【公表番号】特表２０１０−５１４４２３（Ｐ２０１０−５１４４２３Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３２８５（Ｐ２００９−５４３２８５）
【出願日】平成１９年１２月２２日（２００７．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８７５３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０１５２
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５００４６２３２８）ケミン、インダストリーズ、インコーポレーテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＫＥＭＩＮ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２２日（２００７．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８７５３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０１５２
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５００４６２３２８）ケミン、インダストリーズ、インコーポレーテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＫＥＭＩＮ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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