グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びその用途
本発明は、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、コクやまろやかさに優れた酒類を製造する醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼであるGpd1pをコードする遺伝子GPD1またはGpd2pをコードする遺伝子GPD2、特にビール酵母に特徴的なnon-ScGPD1遺伝子またはnon-ScGPD2遺伝子の発現量を高めることによって、製品のコクやまろやかさに寄与するグリセロールの生成能を向上させた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、コクやまろやかさに優れた酒類を製造する醸造酵母、低温保存性、凍結保存性、乾燥耐性、浸透圧耐性に優れた醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼであるGpd1pをコードする遺伝子GPD1またはGpd2pをコードする遺伝子GPD2、特にビール酵母に特徴的なnon-ScGPD1遺伝子またはnon-ScGPD2遺伝子の発現量を高めることによって、製品のコクやまろやかさを向上させることができる酵母、低温保存性、凍結保存性、乾燥耐性、浸透圧耐性に優れた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
グリセロールは甘味以外に酒のコクやまろやかさに寄与するといわれており、重要な呈味成分の１つである。
【０００３】
これまでにも酒のグリセロール含量を高める目的でグリセロール高生産酵母が育種されている。酵母に変異処理を施し、グリセロール高生産酵母を効率よく分離するために、アリルアルコールあるいはピラゾール耐性を指標とする方法（特公平7-89901号公報）、グリセロールモノクロロヒドリン耐性を指標とする方法（特開平10−210968号公報）、耐塩性を指標とする方法（特開平７−115956号公報）、アミノ酸アナログ耐性を指標とする方法（J.Ferment.Bioeng.,80,218-222(1995)）がすでに報告されている。
【０００４】
一方、遺伝子操作技術を利用した酵母の育種による方法ではSaccharomyces cerevisiaeのグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼGPD1あるいはGPD2をビール酵母やワイン酵母で高発現させた例が報告されている（FEMS Yeast Res. 2:225-232 （2002）、Appl Environ Microbiol. 65:143-149(1999) 、Austr. J. Grape Wine Res. 6:208-215 (2000)）。
【０００５】
さらに酵母は高浸透圧ストレスにされされた時、細胞内外の浸透圧差を解消するために適合溶質であるグリセロールを合成 ・蓄積することも知られている。グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをはじめとするグリセロール合成系の遺伝子がストレスによって誘導されることも知られている（Microbiol Mol Biol Rev. 66:300-372 （2002））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のとおり、製品中のグリセロール含量を増大させるために、変異株の取得が行なわれているが、その結果予期せぬ発酵遅延や、好ましくない香味成分の増加が認められる場合もあり、実用酵母とするには問題があった。このことから、発酵速度や製品の品質を損なうことなく、充分量のグリセロールを生産できる酵母の育種方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母からグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、グリセロール生成量が増加することを確認して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、ビール酵母に存在するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のグリセロール生成量の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００９】
（１）以下の(a)〜(ｆ)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１０】
（２）以下の(g)〜(i)からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列又は配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１１】
（３）配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１２】
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７a）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
【００１３】
（８）上記（７）または（７ａ）に記載のベクターが導入された酵母。
（９）グリセロール生成能が増強された上記(８)に記載の酵母。
（９ａ）上記（８）に記載のベクターを導入することによって、グリセロール生成能が増強された酵母。
（１０）低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が増強された上記（８）〜（９ａ）のいずれかに記載の酵母。
（１１）浸透圧耐性が増強された上記（８）〜（９ａ）のいずれかに記載の酵母。
（１２）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってグリセロール生成能が向上した上記（９）または（９ａ）に記載の酵母。
（１３）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が向上した上記（１０）に記載の酵母。
（１４）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって浸透圧耐性が向上した上記（１１）に記載の酵母。
【００１４】
（１５）上記（８）〜（１４）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１７）醸造する酒類がワインである上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１８）上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１５】
（１９）配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のグリセロール生成能について評価する方法。
（１９ａ）上記（１９）に記載の方法によって、グリセロール生成能が高い酵母を選別する方法。
（１９ｂ）上記（１９ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（２０）被検酵母を培養し、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のグリセロール生成能を評価する方法。
（２０ａ）上記（２０）に記載の方法で、被検酵母を評価し、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、グリセロール生成能の高い酵母を選別する方法。
（２０ｂ）上記（２０ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１６】
（２１）被検酵母を培養して、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリセロール生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１ａ）被検酵母を培養して、グリセロール生成能またはグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定し、目的とするグリセロール生成能またはグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。
（２３）基準酵母および被検酵母を培養して、各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。
【００１７】
（２４）上記（８）〜（１４）に記載の酵母および上記（２１）〜（２３）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、グリセロール生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【００１８】
（２５）以下の(j)〜(l)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、酵母の低温保存性を増強させる方法：
(j)配列番号：１０のアミノ酸配列又は配列番号：１０のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：１０のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、製品にコクやまろやかさを付与するグリセロール含量を増大させることができるため、コクやまろやかさに優れた酒類を製造することが可能となる。また、本発明の形質転換酵母はグリセロール含量が増加している。グリセロール生成量が増加した酵母は浸透圧をはじめとするストレスに対して迅速に対応することができると考えられるため、低温保存性、凍結耐性、乾燥耐性に優れている。さらに本発明の形質転換酵母は浸透圧耐性を有しており、高濃度醸造において発酵期間を短縮することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明者らは、酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼの活性を増大させることによって、さらに効率よくグリセロールを生成させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードするnon-ScGPD1遺伝子およびnon-ScGPD2を単離・同定した。これらの塩基配列を、それぞれ配列番号：1および配列番号：３に示す。またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：２および配列番号：４に示す。さらに、ビール酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードするScGPD1遺伝子も単離・同定した。この塩基配列を配列番号：９に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
【００２１】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えばYeast 12:1331-1337,1996に記載の方法によって測定することができる。
【００２２】
また、本発明は、(e)配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２３】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド(例えば、DNA)をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２４】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ)が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２５】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド(例えばDNA)を検出することができる。
【００２６】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci． USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２７】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(l)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２８】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２９】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３０】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
【００３１】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
【００３２】
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３３】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でかつグリセロール含量が増加し、香味を増した酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。また、本発明において得られた醸造酵母は浸透圧耐性を有しているので、高濃度醸造において発酵期間を短縮することができる。
対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でグリセロール含量を低減させた酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、グリセロール生成量を調節（増加又は低減）することによって、所望の種類で、かつグリセロール含量が調節（増加または低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、グリセロール含量を増加させた酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、コクやまろやかさ等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。さらに、既存の施設を用い、高濃度醸造における発酵期間を短縮することができるので、コストを低減させることも期待される。
【００３５】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のグリセロール生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００３６】
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のグリセロール生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性質についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００３７】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のグリセロール生成能を評価することもできる。なお、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリセロール生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の製造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００３８】
あるいは、被検酵母を培養して、グリセロール生成能の高いまたは低い、あるいはグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。グリセロール生成能は、例えば、Method of Enzymatic Analysis,vol.4 1825-1831,1974に記載の方法によって測定することができる。グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、Yeast 12:1331-1337,1996に記載の方法によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエ、およびサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲン シス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１：グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（non-ScGPD1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、non-ScGPD1を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnon-ScGPD1_for（配列番号：５）／non-ScGPD1_rv（配列番号：６）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記する場合がある。）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnon-ScGPD1の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.2kb）を取得した。
【００４１】
上記のようにして得られたnon-ScGPD1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。non-ScGPD1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４２】
実施例２：ビール試醸中のnon-ScGPD1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。non-ScGPD1遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnon-ScGPD1遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４３】
実施例３：non-ScGPD1高発現株の作製
実施例１に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびBamHI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびBamHI処理したpYEGNotに連結させ、non-ScGPD1高発現ベクターnon-ScGPD1/ pYEGNotを構築した。pYEGNotはYEp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
【００４４】
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株、あるいはサッカロマイセス セレヴィシアエBH174株、あるいはサッカロマイセス セレヴィシアエBH172株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００４５】
実施例４：グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（non-ScGPD2）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、non-ScGPD2を見出した（配列番号：３）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnon-ScGPD2_for（配列番号：７）／non-ScGPD2_rv（配列番号：８）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnon-ScGPD2の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.3kb）を取得した。
【００４６】
上記のようにして得られたnon-ScGPD2遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。non-ScGPD2遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４７】
実施例５：ビール試醸中のnon-ScGPD2遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図４）、外観エキス濃度（図５）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。non-ScGPD2遺伝子の発現パターンを図６に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnon-ScGPD2遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４８】
実施例６：ビール試験醸造におけるグリセロール生成量の解析
親株（34/70株）ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 12%
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 10ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）(図７)、エキス消費量の経時変化(図８)、グリセロール生成量の経時変化(図９)を調べた。醪中のグリセロールの定量は、F-キット グリセロール(製品番号 148270、ロッシュ社製)を用いて行った（文献Method of Enzymatic Analysis,vol.4 1825-1831,1974）。発酵終了時の醪中のグリセロールは、親株が1.7ｇ/Lであったのに対し、non-ScGPD1高発現株では6.2ｇ/Lと約3.6倍に増加していた。
【００４９】
実施例７：高濃度麦汁を用いたビール醸造試験
親株（34/70株）ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 19.3%（12%麦汁に糖化シロップを添加）
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 10ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）(図１０)、エキス消費量の経時変化(図１１)エタノール生成量の経時変化(図１２)を調べた。エタノール生成量はF-キット エタノール(製品番号 176290、ロッシュ社製) を用いて行った（文献Z. Anal. Chem.284:113-117,1977）。図１２に示すように、発酵１８４時間後におけるエタノール生成量は親株の68ｇ/Lに対してnon-ScGPD1高発現株では74ｇ/Lであり、non-ScGPD1高発現による発酵促進が認められた。
【００５０】
実施例８：低温保存性試験
親株(BH174株)ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた低温保存性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、約80cells/mlとなるように５％エタノールに懸濁して4℃で29日間保持した後、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。同様に１０％エタノールに懸濁して4℃で2日間保持した後、生菌率を測定した。表１に示すように親株の生菌率が５％エタノールで29日後に45.1％、１０％エタノールで2日後に54.1％であったのに対し、non-ScGPD1高発現株ではそれぞれ58.7％、76.6％と生菌率の増加が認められた。
【表１】
【００５１】
実施例９：凍結保存性試験
親株(BH174株)ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた凍結保存性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、約80cells/mlとなるように水に懸濁して-20℃で29日間保持した後、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。表２に示すように親株の生菌率が33.3％であったのに対し、non-ScGPD1高発現株では39.3％と生菌率の増加が認められた。
【表２】
【００５２】
実施例１０：乾燥耐性試験
親株(BH172株)ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた乾燥耐性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、約80cells/mlとなるように水に懸濁して真空乾燥し、4℃で29日間保存した後、水で復水し、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。表３に示すように親株の生菌率が0％であったのに対し、non-ScGPD1高発現株では23.3％と生菌率の増加が認められた。
【表３】
【００５３】
実施例１１：低温保存性試験
親株(KN009F株)ならびにFEMS Yeast Res. 2:225-232 （2002）に記載された方法で得られたScGPD1高発現株を用いた低温保存性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、５％エタノールに懸濁して4℃で10日間保持した後、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。表４に示すように親株の生菌率が64％であったのに対し、ScGPD1高発現株では94％と生菌率の増加が認められた。
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の酒類製造法によれば、製品にコクやまろやかさを付与するグリセロール含量が増大するため、香味優れた酒類を製造することが可能となる。また、本発明によれば、低温保存性、凍結保存性、乾燥耐性に優れた醸造用酵母を提供することができる。さらに、本発明の醸造用酵母によれば、高濃度醸造において発酵期間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるnon-ScGPD1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】図４は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図５】図５は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図６】図６は、ビール試験醸造中の酵母におけるnon-ScGPD2遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図７】図７は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図８】図８は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図９】図９は、ビール試験醸造におけるグリセロール生成量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はグリセロール量（ｇ/L）の値を示している。
【図１０】図１０は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図１１】図１１は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図１２】図１２は、ビール試験醸造におけるエタノール生成量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はエタノール量（ｇ/L）の値を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びその用途に関し、特に、コクやまろやかさに優れた酒類を製造する醸造酵母、低温保存性、凍結保存性、乾燥耐性、浸透圧耐性に優れた醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼであるGpd1pをコードする遺伝子GPD1またはGpd2pをコードする遺伝子GPD2、特にビール酵母に特徴的なnon-ScGPD1遺伝子またはnon-ScGPD2遺伝子の発現量を高めることによって、製品のコクやまろやかさを向上させることができる酵母、低温保存性、凍結保存性、乾燥耐性、浸透圧耐性に優れた酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
グリセロールは甘味以外に酒のコクやまろやかさに寄与するといわれており、重要な呈味成分の１つである。
【０００３】
これまでにも酒のグリセロール含量を高める目的でグリセロール高生産酵母が育種されている。酵母に変異処理を施し、グリセロール高生産酵母を効率よく分離するために、アリルアルコールあるいはピラゾール耐性を指標とする方法（特公平7-89901号公報）、グリセロールモノクロロヒドリン耐性を指標とする方法（特開平10−210968号公報）、耐塩性を指標とする方法（特開平７−115956号公報）、アミノ酸アナログ耐性を指標とする方法（J.Ferment.Bioeng.,80,218-222(1995)）がすでに報告されている。
【０００４】
一方、遺伝子操作技術を利用した酵母の育種による方法ではSaccharomyces cerevisiaeのグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼGPD1あるいはGPD2をビール酵母やワイン酵母で高発現させた例が報告されている（FEMS Yeast Res. 2:225-232 （2002）、Appl Environ Microbiol. 65:143-149(1999) 、Austr. J. Grape Wine Res. 6:208-215 (2000)）。
【０００５】
さらに酵母は高浸透圧ストレスにされされた時、細胞内外の浸透圧差を解消するために適合溶質であるグリセロールを合成 ・蓄積することも知られている。グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをはじめとするグリセロール合成系の遺伝子がストレスによって誘導されることも知られている（Microbiol Mol Biol Rev. 66:300-372 （2002））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のとおり、製品中のグリセロール含量を増大させるために、変異株の取得が行なわれているが、その結果予期せぬ発酵遅延や、好ましくない香味成分の増加が認められる場合もあり、実用酵母とするには問題があった。このことから、発酵速度や製品の品質を損なうことなく、充分量のグリセロールを生産できる酵母の育種方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母からグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を同定・単離することに成功した。また、得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、グリセロール生成量が増加することを確認して、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、ビール酵母に存在するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる製品中のグリセロール生成量の制御方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。
【０００９】
（１）以下の(a)〜(ｆ)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(ｆ)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１０】
（２）以下の(g)〜(i)からなる群から選択される上記（１）に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列又は配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００１１】
（３）配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）DNAである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【００１２】
（７）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（７a）以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（７）に記載のベクター：
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
【００１３】
（８）上記（７）または（７ａ）に記載のベクターが導入された酵母。
（９）グリセロール生成能が増強された上記(８)に記載の酵母。
（９ａ）上記（８）に記載のベクターを導入することによって、グリセロール生成能が増強された酵母。
（１０）低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が増強された上記（８）〜（９ａ）のいずれかに記載の酵母。
（１１）浸透圧耐性が増強された上記（８）〜（９ａ）のいずれかに記載の酵母。
（１２）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってグリセロール生成能が向上した上記（９）または（９ａ）に記載の酵母。
（１３）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が向上した上記（１０）に記載の酵母。
（１４）上記（６）に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって浸透圧耐性が向上した上記（１１）に記載の酵母。
【００１４】
（１５）上記（８）〜（１４）のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
（１６）醸造する酒類が麦芽飲料である上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１７）醸造する酒類がワインである上記（１５）に記載の酒類の製造方法。
（１８）上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【００１５】
（１９）配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のグリセロール生成能について評価する方法。
（１９ａ）上記（１９）に記載の方法によって、グリセロール生成能が高い酵母を選別する方法。
（１９ｂ）上記（１９ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
（２０）被検酵母を培養し、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のグリセロール生成能を評価する方法。
（２０ａ）上記（２０）に記載の方法で、被検酵母を評価し、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、グリセロール生成能の高い酵母を選別する方法。
（２０ｂ）上記（２０ａ）に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。
【００１６】
（２１）被検酵母を培養して、上記（６）に記載のタンパク質を定量または配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリセロール生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２１ａ）被検酵母を培養して、グリセロール生成能またはグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定し、目的とするグリセロール生成能またはグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
（２２）基準酵母および被検酵母を培養して、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。
（２３）基準酵母および被検酵母を培養して、各酵母における上記（６）に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記（２１）に記載の酵母の選択方法。
【００１７】
（２４）上記（８）〜（１４）に記載の酵母および上記（２１）〜（２３）に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、グリセロール生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【００１８】
（２５）以下の(j)〜(l)からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、酵母の低温保存性を増強させる方法：
(j)配列番号：１０のアミノ酸配列又は配列番号：１０のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：１０のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、製品にコクやまろやかさを付与するグリセロール含量を増大させることができるため、コクやまろやかさに優れた酒類を製造することが可能となる。また、本発明の形質転換酵母はグリセロール含量が増加している。グリセロール生成量が増加した酵母は浸透圧をはじめとするストレスに対して迅速に対応することができると考えられるため、低温保存性、凍結耐性、乾燥耐性に優れている。さらに本発明の形質転換酵母は浸透圧耐性を有しており、高濃度醸造において発酵期間を短縮することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明者らは、酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼの活性を増大させることによって、さらに効率よくグリセロールを生成させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開2004-283169号公報に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードするnon-ScGPD1遺伝子およびnon-ScGPD2を単離・同定した。これらの塩基配列を、それぞれ配列番号：1および配列番号：３に示す。またこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：２および配列番号：４に示す。さらに、ビール酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードするScGPD1遺伝子も単離・同定した。この塩基配列を配列番号：９に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
【００２１】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、(a)配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記のビール酵母由来のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質としては、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、例えば、１〜100個、１〜90個、１〜80個、１〜70個、１〜60個、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
なお、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えばYeast 12:1331-1337,1996に記載の方法によって測定することができる。
【００２２】
また、本発明は、(e)配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
【００２３】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド(例えば、DNA)をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２４】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド(例えばＤＮＡ)が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２５】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド(例えばDNA)を検出することができる。
【００２６】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci． USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２７】
２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(l)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２、配列番号：４または配列番号：１０のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００２８】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２９】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３０】
３．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(l)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
【００３１】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（YIp型）のいずれもが利用可能である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983) 、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987) 、YIp型ベクターとしてはYIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76, 1035, 1979) が知られており、容易に入手することができる。
【００３２】
酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーター／ターミネーターとしては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えばM. F. Tuite et al., EMBO J., 1, 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用できないので、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）などが利用可能である。
上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにウイスキー酵母、例えばサッカロマイセス セレビシエNCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌスが好ましく用いられる。
【００３３】
酵母の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J. Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えばYEPD培地“Genetic Engineering. Vo1.1, Plenum Press, New York, 117(1979)”等）で、OD600nmの値が1〜6となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約３０℃で、約60分間静置した後、導入するDNA（約1〜20μg）とともに約30℃で、約60分間静置する。ポリエチレングリコール、好ましくは約4,000ダルトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約20％〜50％となるように加える。約30℃で、約30分間静置した後、この細胞を約42℃で約5分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、約30℃で約60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローニング第3版」、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)”等を参照することができる。
【００３４】
４．本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でかつグリセロール含量が増加し、香味を増した酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。また、本発明において得られた醸造酵母は浸透圧耐性を有しているので、高濃度醸造において発酵期間を短縮することができる。
対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でグリセロール含量を低減させた酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、グリセロール生成量を調節（増加又は低減）することによって、所望の種類で、かつグリセロール含量が調節（増加または低減）された酒類を製造することができる。
これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、グリセロール含量を増加させた酒類を製造するためのコストを増加させることはない。つまり、本発明によれば、コクやまろやかさ等に優れた酒類を、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。さらに、既存の施設を用い、高濃度醸造における発酵期間を短縮することができるので、コストを低減させることも期待される。
【００３５】
５．本発明の酵母の評価方法
本発明は、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のグリセロール生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、ＷＯ０１／０４０５１４号公報、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検酵母のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)）。得られたゲノムを対象にして、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列（好ましくは、ORF配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。
【００３６】
遺伝子または特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施することができる。例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、10bp以上であり、15〜25bpであることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、300 〜2000bpが適当である。
PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度：90〜95℃、アニーリング温度：40〜60℃、伸長温度：60〜75℃、サイクル数：10回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分のDNA 分子を含む大きさかどうかによって、その酵母のグリセロール生産能について予測・評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性質についてより正確に予測・評価することが可能である。
【００３７】
また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のグリセロール生成能を評価することもできる。なお、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の産物であるmRNA又はタンパク質を定量することによって可能である。mRNA又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、mRNAの定量は例えばノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は例えばウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
さらに、被検酵母を培養して、配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリセロール生成能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の製造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現量を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号：１、配列番号：３または配列番号：９の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現である被検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。
【００３８】
あるいは、被検酵母を培養して、グリセロール生成能の高いまたは低い、あるいはグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。
これらの場合、被検酵母または基準酵母としては、例えば、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。グリセロール生成能は、例えば、Method of Enzymatic Analysis,vol.4 1825-1831,1974に記載の方法によって測定することができる。グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、Yeast 12:1331-1337,1996に記載の方法によって測定することができる。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、ｐ67-75、学会出版センターなど参照）。
なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる。具体的には、サッカロマイセス（Saccharomyces）属等の酵母（例えば、サッカロマイセス パストリアヌス、サッカロマイセス セレビシエ、およびサッカロマイセス カールスベルゲンシス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセス パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）W34/70等、サッカロマイセス カールスベルゲン シス（Saccharomyces carlsbergensis）NCYC453、NCYC456等、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等が使用できる。さらにワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用1号、同3号、同4号等、清酒酵母、例えば協会酵母 清酒用7号、同9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母から任意の組み合わせで選択しても良い。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１：グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（non-ScGPD1）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、non-ScGPD1を見出した（配列番号：１）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnon-ScGPD1_for（配列番号：５）／non-ScGPD1_rv（配列番号：６）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株（「W34/70株」と略記する場合がある。）の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnon-ScGPD1の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.2kb）を取得した。
【００４１】
上記のようにして得られたnon-ScGPD1遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。non-ScGPD1遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４２】
実施例２：ビール試醸中のnon-ScGPD1遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図１）、外観エキス濃度（図２）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。non-ScGPD1遺伝子の発現パターンを図３に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnon-ScGPD1遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４３】
実施例３：non-ScGPD1高発現株の作製
実施例１に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびBamHI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびBamHI処理したpYEGNotに連結させ、non-ScGPD1高発現ベクターnon-ScGPD1/ pYEGNotを構築した。pYEGNotはYEp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
【００４４】
上述の方法で作製した高発現ベクターを用い、特開平07-303475に記載された方法でサッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株、あるいはサッカロマイセス セレヴィシアエBH174株、あるいはサッカロマイセス セレヴィシアエBH172株を形質転換した。ジェネチシン300mg/Lを含むYPD平板培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天）で形質転換体を選択した。
【００４５】
実施例４：グリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（non-ScGPD2）のクローニング
特開2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母のグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、non-ScGPD2を見出した（配列番号：３）。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnon-ScGPD2_for（配列番号：７）／non-ScGPD2_rv（配列番号：８）を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnon-ScGPD2の全長遺伝子を含むDNA断片（約1.3kb）を取得した。
【００４６】
上記のようにして得られたnon-ScGPD2遺伝子断片を、TAクローニングによってpCR2.1-TOPOベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。non-ScGPD2遺伝子の塩基配列をサンガーの方法 (F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。
【００４７】
実施例５：ビール試醸中のnon-ScGPD2遺伝子発現解析
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁エキス濃度 12.69％
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図４）、外観エキス濃度（図５）の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製したmRNAをビオチンラベルして、ビール酵母DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GCOS;GeneChip Operating Software 1.0、アフィメトリクス社製）を用いて行った。non-ScGPD2遺伝子の発現パターンを図６に示す。この結果より、通常のビール発酵においてnon-ScGPD2遺伝子が発現していることが確認できた。
【００４８】
実施例６：ビール試験醸造におけるグリセロール生成量の解析
親株（34/70株）ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 12%
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 10ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）(図７)、エキス消費量の経時変化(図８)、グリセロール生成量の経時変化(図９)を調べた。醪中のグリセロールの定量は、F-キット グリセロール(製品番号 148270、ロッシュ社製)を用いて行った（文献Method of Enzymatic Analysis,vol.4 1825-1831,1974）。発酵終了時の醪中のグリセロールは、親株が1.7ｇ/Lであったのに対し、non-ScGPD1高発現株では6.2ｇ/Lと約3.6倍に増加していた。
【００４９】
実施例７：高濃度麦汁を用いたビール醸造試験
親株（34/70株）ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
麦汁エキス濃度 19.3%（12%麦汁に糖化シロップを添加）
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 約 10ppm
発酵温度 15℃一定
酵母投入量 5g湿酵母菌体／L麦汁
発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660）(図１０)、エキス消費量の経時変化(図１１)エタノール生成量の経時変化(図１２)を調べた。エタノール生成量はF-キット エタノール(製品番号 176290、ロッシュ社製) を用いて行った（文献Z. Anal. Chem.284:113-117,1977）。図１２に示すように、発酵１８４時間後におけるエタノール生成量は親株の68ｇ/Lに対してnon-ScGPD1高発現株では74ｇ/Lであり、non-ScGPD1高発現による発酵促進が認められた。
【００５０】
実施例８：低温保存性試験
親株(BH174株)ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた低温保存性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、約80cells/mlとなるように５％エタノールに懸濁して4℃で29日間保持した後、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。同様に１０％エタノールに懸濁して4℃で2日間保持した後、生菌率を測定した。表１に示すように親株の生菌率が５％エタノールで29日後に45.1％、１０％エタノールで2日後に54.1％であったのに対し、non-ScGPD1高発現株ではそれぞれ58.7％、76.6％と生菌率の増加が認められた。
【表１】
【００５１】
実施例９：凍結保存性試験
親株(BH174株)ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた凍結保存性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、約80cells/mlとなるように水に懸濁して-20℃で29日間保持した後、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。表２に示すように親株の生菌率が33.3％であったのに対し、non-ScGPD1高発現株では39.3％と生菌率の増加が認められた。
【表２】
【００５２】
実施例１０：乾燥耐性試験
親株(BH172株)ならびに実施例３に記載の方法によって得られたnon-ScGPD1高発現株を用いた乾燥耐性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、約80cells/mlとなるように水に懸濁して真空乾燥し、4℃で29日間保存した後、水で復水し、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。表３に示すように親株の生菌率が0％であったのに対し、non-ScGPD1高発現株では23.3％と生菌率の増加が認められた。
【表３】
【００５３】
実施例１１：低温保存性試験
親株(KN009F株)ならびにFEMS Yeast Res. 2:225-232 （2002）に記載された方法で得られたScGPD1高発現株を用いた低温保存性試験を以下の条件で行った。
YPD液体培地（1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース）で30℃にて一晩培養した菌体を遠心分離にて集菌し、５％エタノールに懸濁して4℃で10日間保持した後、死滅した菌数をメチレンブルー染色（ビール酒造組合編、BCOJ微生物分析法）で判定し、生菌率を測定した。表４に示すように親株の生菌率が64％であったのに対し、ScGPD1高発現株では94％と生菌率の増加が認められた。
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の酒類製造法によれば、製品にコクやまろやかさを付与するグリセロール含量が増大するため、香味優れた酒類を製造することが可能となる。また、本発明によれば、低温保存性、凍結保存性、乾燥耐性に優れた醸造用酵母を提供することができる。さらに、本発明の醸造用酵母によれば、高濃度醸造において発酵期間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図２】図２は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図３】図３は、ビール試験醸造中の酵母におけるnon-ScGPD1遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図４】図４は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図５】図５は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図６】図６は、ビール試験醸造中の酵母におけるnon-ScGPD2遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。
【図７】図７は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図８】図８は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図９】図９は、ビール試験醸造におけるグリセロール生成量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はグリセロール量（ｇ/L）の値を示している。
【図１０】図１０は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はOD660の値を示している。
【図１１】図１１は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%）を示している。
【図１２】図１２は、ビール試験醸造におけるエタノール生成量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸はエタノール量（ｇ/L）の値を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i) からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列又は配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項９】
グリセロール生成能が向上した請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が増強された請求項８または９に記載の酵母。
【請求項１１】
浸透圧耐性が増強された請求項８または９に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってグリセロール生成能が向上した請求項９に記載の酵母。
【請求項１３】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が向上した請求項１０に記載の酵母。
【請求項１４】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって浸透圧耐性が向上した請求項１１に記載の酵母。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
醸造する酒類がワインである請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１９】
配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のグリセロール生成能について評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養し、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のグリセロール生成能を評価する方法。
【請求項２１】
被検酵母を培養して、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリセロール生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母および被検酵母を培養して、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項２１に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
基準酵母および被検酵母を培養して、各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項２１に記載の酵母の選択方法。
【請求項２４】
請求項８〜１４に記載の酵母および請求項２１〜２３に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、グリセロール生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項２５】
以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、酵母の低温保存性を増強させる方法：
(j)配列番号：１０のアミノ酸配列又は配列番号：１０のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：１０のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１】
以下の(a)〜(f)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(d) 配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(e)配列番号：１または配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(f)配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(g)〜(i) からなる群から選択される請求項１に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列又は配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(h) 配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(i)配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：１または配列番号：３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターが導入された酵母。
【請求項９】
グリセロール生成能が向上した請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が増強された請求項８または９に記載の酵母。
【請求項１１】
浸透圧耐性が増強された請求項８または９に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってグリセロール生成能が向上した請求項９に記載の酵母。
【請求項１３】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低温保存性、凍結保存性または乾燥耐性が向上した請求項１０に記載の酵母。
【請求項１４】
請求項６に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって浸透圧耐性が向上した請求項１１に記載の酵母。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
【請求項１６】
醸造する酒類が麦芽飲料である請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１７】
醸造する酒類がワインである請求項１５に記載の酒類の製造方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
【請求項１９】
配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のグリセロール生成能について評価する方法。
【請求項２０】
被検酵母を培養し、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のグリセロール生成能を評価する方法。
【請求項２１】
被検酵母を培養して、請求項６に記載のタンパク質を定量または配列番号：１もしくは配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするグリセロール生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
【請求項２２】
基準酵母および被検酵母を培養して、配列番号：１または配列番号：３の塩基配列を有するグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現している被検酵母を選択する、請求項２１に記載の酵母の選択方法。
【請求項２３】
基準酵母および被検酵母を培養して、各酵母における請求項６に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、請求項２１に記載の酵母の選択方法。
【請求項２４】
請求項８〜１４に記載の酵母および請求項２１〜２３に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、グリセロール生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
【請求項２５】
以下の(j)〜(l) からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、酵母の低温保存性を増強させる方法：
(j)配列番号：１０のアミノ酸配列又は配列番号：１０のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(k) 配列番号：１０のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び
(l)配列番号：９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５２８０２２（Ｐ２００９−５２８０２２Ａ）
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３５２１５（Ｐ２００８−５３５２１５）
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５３７０４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０２３５３
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０５３７０４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０２３５３
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
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