グレリン結合核酸
本発明は、グレリンのアンタゴニスト（ここで、該アンタゴニストは核酸であり、そして好ましくは、該核酸はグレリンに結合している）に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、グレリンのアンタゴニスト、グレリンに結合する核酸、そのような核酸の使用、そのような核酸を含んでなる組成物および複合体、標的分子に結合する核酸の作製および／もしくは同定の方法、標的分子に結合するＬ−核酸の作製の方法ならびにグレリンアンタゴニストのスクリーニングの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリンは、成長ホルモン分泌促進因子受容体１ａ（ＧＨＳＲ １ａ）の天然リガンドとして同定された。該受容体は、下垂体においてそして脳の視床下部部分において最も豊富であるが、他の組織においても低濃度で検出することができる。７０年代後半以来、分泌促進因子と名付けられた合成ペプチドおよび他の化合物は、成長ホルモンの放出を刺激することが示されていた。しかしながら、成長ホルモンの放出に関与する天然リガンドは、１９９９年におけるグレリンの発見まで依然として不明であった。グレリンは、そのＮ末端の第三のアミノ酸（セリン３）でオクタノイル酸側鎖を有する非常に塩基性の２８アミノ酸のペプチドホルモンである。この珍しい修飾は、ＧＨＳ受容体での相互作用およびその活性に必要とされる。精製されたラットグレリンのアミノ酸配列は、ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲであるとタンパク質シーケンサーにより決定された。
【０００３】
グレリンは、タンパク同化状態に関する生理的機能を媒介することが示されている。それは下垂体からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出を直接刺激するが、視床下部ニューロンに作用することによりＧＨに依存しない方法で摂食行動を誘導することもまたげっ歯類における実験によりグレリンに示された。興味深いことに、グレリン生産の主要部位は胃の胃酸分泌腺においてであり、それが胃、下垂体および視床下部の間のホルモンリンクとして働くことを示唆する。ラットにおけるグレリン投与は、エネルギー摂取および／もしくは燃料利用における変化の結果として体重増加をもたらしたという結果は、そのような役割を裏付ける。さらに、ヒトにおける全身グレリン投与は、試験被験体において空腹感を引き起こし、そして過食を誘導する。これらの結果に基づいて、グレリンは、食欲および体重の調節において重要な役割を有し、栄養不良状態の急性ならびに慢性シグナルとして働くと考えられる。この仮説のさらなる裏づけは、グレリンレベルならびに食欲が胃バイパス後の個体において減少され、体重減少をもたらすことにおける該処置の効率に少なくとも部分的に寄与するという結果によってもたらされる。プラダーウィリ症候群にかかっている患者からの臨床データもまた、該疾患と関連する過食症および肥満症が著しい高グレリン血症の結果であることを示唆する。さらに、グレリンは、高血糖およびインシュリン放出の阻害を誘導することが見出され、グルコース代謝への関与を示唆する。エネルギー代謝におけるこれらの機能に加えて、グレリンはまた多数の他のプロセスにも関係があるとされている。それは、多数の神経内分泌腫瘍において発現され、そして下垂体からのＧＨ放出に加えて、ＡＣＴＨ、ＰＲＬおよびコルチゾールの放出を刺激することが見出された。健常人へのグレリンの単回注射は、心拍出量を増加しそして血圧を減少することが見出された。従って、グレリンの作用は、様々な異なるタスクに関与しているようである。背景となる情報は、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９から取り出すことができる。
【非特許文献１】Ｍ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｈ．Ｈｏｓｏｄａ，Ｙ．Ｄａｔｅ，Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ，Ｈ．Ｍａｔｓｕ，Ｋ．Ｋａｎｇａｗａ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｃｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓｔｏｍａｃｈ”，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：６５６−６０，１９９９
【非特許文献２】Ｍ．Ｔｓｃｈｏｐ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．Ｈｅｉｍａｎ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｄｉｐｏｓｉｔｙ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：９０８−１３，２０００
【非特許文献３】Ａ．Ｍ．Ｗｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｈｒｅｌｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｐｐｅｔｉｔｅ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８６：５９９２−６，２００１
【非特許文献４】Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｅｄｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：１９４−８，２００１
【非特許文献５】Ｎ．Ｎａｇａｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１ Ｍａｙ；２８０（５）：Ｒ１４８３−７；Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．
【非特許文献６】Ｖｏｌａｎｔｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００２ Ｍａｒ；８７（３）：１３００−８．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ＧＨ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ．
【非特許文献７】Ｊｅｆｆｅｒｙ ＰＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２ Ｍａｒ；１７２（３）：Ｒ７−１１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．
【非特許文献８】Ｅｇｉｄｏ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２ Ｆｅｂ；１４６（２）：２４１−４ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ｏｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．
【非特許文献９】Ｂｒｏｇｌｉｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００１ Ｏｃｔ；８６（１０）：５０８３−６，Ｇｈｒｅｌｉｎ，ａ ｎａｔｕｒａｌ ＧＨ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｃｈ，ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．
【発明の開示】
【０００４】
［発明の要約］
本発明の基礎となる問題は、グレリンの特異的アンタゴニストを提供することである。本発明の基礎となる問題のさらなる態様は、成長ホルモン分泌促進因子受容体１ａ（ＧＨＳＲ １ａ）の特異的アンタゴニストを提供することである。本発明の基礎となる問題の別の態様は、グレリンおよびＧＨＳＲ １ａ受容体にそれぞれ関する疾患および障害の処置のための化合物を提供することである。
【０００５】
本発明の基礎となる問題は、第１の態様としてグレリンのアンタゴニストにより解決され、ここで、該アンタゴニストは核酸である。好ましい実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）として、該核酸はグレリンに結合している。
【０００６】
本発明の基礎となる問題は、第１の態様としてＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニストにより解決され、ここで、該アンタゴニストは核酸である。好ましい実施形態として、該核酸は該受容体のリガンドに結合しており、そしてここで、該リガンドは好ましくはグレリンである。
【０００７】
本発明の第１および第２の態様の実施形態として、核酸は少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる。
【０００８】
本発明の第１および第２の態様の好ましい実施形態として、アンタゴニストはＬ−核酸である。
【０００９】
本発明の第１および第２の態様のさらに好ましい実施形態として、核酸は本明細書に開示するとおりの核酸である。好ましくは、核酸は、本発明の第３および第４の態様に記載の核酸である。
【００１０】
本発明の基礎となる問題は、第３の態様としてグレリンに結合する核酸により解決される。好ましくは、核酸はＬ−グレリンに結合するＬ−核酸である。
【００１１】
好ましい実施形態として、Ｌ−核酸は本明細書に開示するとおりの核酸である。好ましくは、核酸は、本発明の第４の態様に記載の核酸である。
【００１２】
本発明の基礎となる問題は、第４の態様として配列番号７〜配列番号１２５に記載の配列を含んでなる群から選択される配列を有する核酸により解決される。
【００１３】
ある実施形態として、核酸は少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる。
【００１４】
好ましい実施形態として、核酸はＬ−核酸である。
【００１５】
さらなる実施形態として、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡおよびその組み合わせを含んでなる群から選択される。
【００１６】
好ましい実施形態として、核酸のＫｄは１μＭ未満、好ましくは０．２５μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満、そして最も好ましくは０．０１μＭ未満である。
【００１７】
さらに好ましい実施形態として、核酸のＫｄは１００ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きく、より好ましくは１ｎＭより大きく、そして最も好ましくは０．０５ｎＭより大きい。
【００１８】
さらに好ましい実施形態として、核酸は１５〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチドおよび３０〜５０ヌクレオチドを含んでなる群から選択される長さのものである。
【００１９】
なおさらなる実施形態として、核酸は最小結合モチーフを含んでなる。
【００２０】
本発明の第３〜第６の態様の別の好ましい実施形態として、核酸は少なくとも二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）構造を有する。
【００２１】
本発明の基礎となる問題は、第５の態様として、グレリンおよび／もしくはＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニストとしての本発明の核酸、好ましくは、本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸の使用により解決される。
【００２２】
本発明の基礎となる問題は、第６の態様として、標的分子がグレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子と接触させる段階；
ｃ）標的分子と相互作用しない核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；
ｄ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；および
ｅ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）をシーケンスする段階
を含んでなる標的分子に結合する核酸の、好ましくは請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸の作製および／もしくは同定の方法により解決される。
【００２３】
該方法のある実施形態として、段階ｃ）の後で段階ｃａ）を実施し、ここで、段階ｃａ）は標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）の増幅からなる。
【００２４】
好ましい実施形態として、段階ｂ）〜ｄ）を繰り返す。
【００２５】
さらに好ましい実施形態として、核酸の不均一集団は本発明の少なくとも１つの核酸を含んでなる。好ましくは、本発明の核酸は、本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。
【００２６】
本発明の基礎となる問題は、第７の態様によれば、標的分子がＬ−グレリンであり、そして標的分子の光学対掌体がＤ−グレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）Ｄ−核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる段階；
ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する段階；
ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸をシーケンスする段階；および
ｅ）段階ｄ）において得られるＤ−核酸（１つもしくは複数）の配列と同一であるＬ−核酸配列（１つもしくは複数）を合成する段階；
を含んでなる自然立体配置における標的分子に結合するＬ−核酸の作製の方法により解決される。
【００２７】
該方法のある実施形態として、段階ｃ）の後で以下の段階：
ｃａ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸を増幅する段階
を導入する。
【００２８】
好ましい実施形態として、段階ｂ）〜ｅ）を繰り返す。
【００２９】
さらに好ましい実施形態として、核酸の不均一集団は本発明の核酸を含んでなる。好ましくは、核酸は、本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。
【００３０】
本発明の基礎となる問題は、第８の態様として、薬剤の製造のための本発明の核酸のそして／もしくは本発明のアンタゴニストの使用により解決される。あるいはまた、上記の使用は美容製品の製造のためである。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらに好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは、本発明の第１および／もしくは第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３１】
さらなる実施形態として、薬剤は肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧ならびに／または心臓血管疾患を含んでなる群から選択される疾患もしくは障害の処置用である。さらなる実施形態として、美容製品は、食欲および体重管理用そして／もしくは肥満症用である。
【００３２】
第９の態様として、本発明の基礎となる問題は、本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニスト、ならびに製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物、好ましくは製薬学的組成物により解決される。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらに好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３３】
第１０の態様として、本発明の基礎となる問題は、グレリンおよび本発明の核酸のいずれかを含んでなる複合体により解決される。好ましい実施形態として、複合体は結晶性複合体である。なおさらなる実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。
【００３４】
第１１の態様として、本発明の基礎となる問題は、グレリンの検出のための本発明の核酸のそして／もしくは本発明のアンタゴニストのいずれかの使用により解決される。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらなる好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３５】
第１２の態様として、本発明の基礎となる問題は以下の段階：
−候補グレリンアンタゴニストを準備する段階；
−本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニストを準備する段階；
−グレリンアンタゴニストの存在下でシグナルを与える試験系を準備する段階；および
−候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるかどうかを決定する段階
を含んでなるグレリンアンタゴニストのスクリーニングの方法により解決される。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらなる好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３６】
第１３の態様として、本発明の基礎となる問題は、本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニストを含んでなるグレリンの検出のためのキットにより解決される。好ましくは、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらなる好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
［発明の詳細な記述］
グレリンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドであり、そして脂肪酸側鎖で修飾されている。グレリンの計算されたｐＩは、１１．０９である。本明細書において用いる場合、グレリンという用語は、哺乳類グレリンが包含されるがこれらに限定されるものではない任意のグレリンをさす。好ましくは、哺乳類グレリンは、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターおよびヒトグレリンを含んでなる群から選択される。最も好ましくは、グレリンはヒトグレリンである。
【００３７】
本発明は、グレリンに特異的にそして高い親和性で結合する核酸を作製することが可能であるという驚くべき発見に基づく。塩基性タンパク質を対象とするアプタマー（すなわち、標的分子に結合する核酸）の作製は、この種の標的は高いが非特異的なシグナル対ノイズ比をもたらすので一般に非常に難しいことをＥａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．；Ｇｏｌｄ，Ｌ．；Ｈｉｃｋｅ，Ｂ．Ｊ．；Ｊａｎｊｉｃ，Ｎ．；Ｊｕｃｋｅｒ，Ｆ．Ｍ．；Ｓｅｂｏｓｔａ，Ｄ．Ｐ．；Ｔａｒａｓｏｗ，Ｔ．Ｍ．；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．Ｃ．；Ｚｉｃｈｉ，Ｄ．Ａ．；Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ５，Ｎｏ．６；ｐｐ１０８７−１０９６，１９９７）が認めた限りにおいてこの発見は驚くべきことである。この高いシグナル対ノイズ比は、塩基性標的に対する核酸により示される高い非特異的な親和性に起因する。
【００３８】
本明細書に記述するような本発明の核酸の特徴は、該核酸を単独でもしくは任意の組み合わせで用いる本発明の任意の態様において実現することができる。
【００３９】
本発明の核酸はまた、本明細書に開示する特定の配列に本質的に相同である核酸も含んでなるものとする。実質的に相同なという用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％より大きいように理解されるものとする。
【００４０】
本発明の核酸（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）もしくは本発明の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）という用語はまた、本明細書に開示する核酸配列の一部を含んでなる核酸も含んでなるものとする（好ましくは、該一部はグレリンへの結合に関与する限りにおいて）。そのような核酸は、例えばトランケーションにより、本明細書に開示するものから得ることができる。トランケーションは、本明細書に開示するような核酸の末端のいずれかもしくは両方に関することができる。また、トランケーションは、ヌクレオチドの内部配列に関することもでき、すなわち、それは、それぞれ、５’および３’末端ヌクレオチド間のヌクレオチド（１つもしくは複数）に関することができる。さらに、トランケーションは、本明細書に開示する核酸の配列からの単一のヌクレオチドほどの欠失を含んでなるものとする。トランケーションはまた、本発明の核酸（１つもしくは複数）の１ストレッチより多くに関することもでき、ここで、該ストレッチは、わずか１ヌクレオチドの長さほどであることができる。本発明の核酸のトランケーションの例は、本記述の実施例部分に記述されている。
【００４１】
本発明の核酸は、Ｄ−核酸もしくはＬ−核酸のいずれかであることができる。好ましくは、本発明の核酸はＬ−核酸である。さらに、核酸の１つもしくはいくつかの部分はＤ−核酸として存在するかまたは核酸の少なくとも１つもしくはいくつかの部分はＬ−核酸であることが可能である。核酸の「部分」という用語は、わずか１ヌクレオチドほどを意味するものとする。そのような核酸は、それぞれ、Ｄ−およびＬ−核酸と本明細書において一般に呼ばれる。
【００４２】
本発明の核酸はさらに長い核酸の一部であり、ここで、このさらに長い核酸はいくつかの部分を含んでなり、ここで、少なくとも１つの部分は本発明の核酸もしくはその一部であることもまた本発明の範囲内である。これらのさらに長い核酸の他の部分は、Ｄ−核酸もしくはＬ−核酸のいずれかであることができる。任意の組み合わせを本発明に関連して用いることができる。さらに長い核酸のこれらの他の部分（１つもしくは複数）は、結合することと異なる機能を示すことができる。１つの可能な機能は、例えば、固定化、架橋、検出もしくは増幅のためのような他の分子との相互作用を可能にすることである。
【００４３】
Ｌ−核酸は、本明細書において用いる場合、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＬ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【００４４】
Ｄ核酸は、本明細書において用いる場合、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＤ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【００４５】
本発明の核酸がＤ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドもしくは両方の組み合わせ（該組み合わせは、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなるストレッチのランダムな組み合わせもしくは定義された配列である）からなるかどうかにかかわらず、該核酸はデオキシリボヌクレオチド（１つもしくは複数）、リボヌクレオチド（１つもしくは複数）もしくはその組み合わせからなることができる。
【００４６】
本発明の核酸をＬ−核酸として設計することは、いくつかの理由で有利である。Ｌ−核酸は、天然に存在する核酸の鏡像異性体である。Ｄ−核酸は、しかしながら、ヌクレアーゼの広範囲に及ぶ存在のために水溶液においてそして特に生体系もしくは生体サンプルにおいてあまり安定ではない。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞からのヌクレアーゼは、Ｌ−核酸を分解することができない。このために、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物および人体を包含するそのような系において有意に増加される。Ｌ−核酸の分解性を欠くことのために、いかなるヌクレアーゼ分解産物も生成されず、従って、それに起因するいかなる副作用も認められない。この態様は、グレリンの存在に関する疾患および／もしくは障害の治療において使用する事実上全ての他の化合物のＬ−核酸の範囲を定める。
【００４７】
本発明の核酸は、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸もしくはＤ，Ｌ−核酸として存在するかどうかまたはそれらがＤＮＡもしくはＲＮＡであるかどうかにかかわらず、一本鎖もしくは二本鎖核酸として存在することができることもまた本発明の範囲内である。典型的に、本発明の核酸は、一次配列のために確定される二次構造を示し、従って３次構造を形成することもできる一本鎖核酸である。しかしながら、本発明の核酸はまた、相互に相補的である２本の鎖が相互にハイブリダイズしているという意味において二本鎖であることもできる。これは核酸に安定性を与え、それは、核酸がＬ−形態よりむしろ天然に存在するＤ−形態で存在する場合に有利である。
【００４８】
本発明の核酸は、修飾することができる。そのような修飾は、核酸の単一のヌクレオチドに関することができ、そして当該技術分野において周知である。そのような修飾の例は、とりわけ、Ｋｕｓｓｅｒ，Ｗ．（２０００）Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４：２７−３８；Ａｕｒｕｐ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２２，２０−４；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２３，２０１９−２４；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２，６３３−８；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２，６８３−９５；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，３６，８３１−４１;Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７８３２−８；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，４６９，２１３−４３に記述されている。
【００４９】
本発明の核酸は、多くの部分に分かれた核酸であることができる。多くの部分に分かれた核酸は、本明細書において用いる場合、少なくとも２本の核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２本の核酸鎖は機能単位を形成し、ここで、該機能単位は標的分子に対するリガンドである。少なくとも２本の核酸鎖は、２本の鎖を生成するように核酸を切断することによりもしくは本発明の、すなわち全部の核酸の第１の部分に対応する１つ核酸および全部の核酸の第２の部分に対応する別の核酸を合成することにより本発明の核酸のいずれかから得ることができる。切断および合成の両方とも、上記に例示するような２本より多い鎖がある多くの部分に分かれた核酸を作製するために適用することができると認識されるべきである。言い換えれば、少なくとも２本の核酸鎖は、様々な核酸部分間のある程度の相補性は存在し得るが、相補的でありそして相互にハイブリダイズする２本の鎖と典型的に異なる。
【００５０】
結合定数を決定する可能性は、いわゆるビアコア装置の使用であり、それもまた当業者に既知である。親和性もまた、本明細書において用いる場合、実施例に記述するような「ビーズアッセイ」の使用により測定された。本発明の場合グレリンである標的への本発明の核酸間の結合の強さを表すために適切な尺度は、いわゆるＫｄ値であり、それはその決定の方法と同様に当業者に周知である。
【００５１】
本発明の核酸は、ある種のＫｄ値を特徴とする。好ましくは、本発明の核酸により示されるＫｄ値は１μＭ未満である。約１μＭのＫｄ値は、標的への核酸の非特異的な結合に特徴的であると言われる。当業者により認識されるように、本発明の核酸のような一群の化合物のＫｄ値は、ある範囲内である。約1μＭの上記のＫｄは、Ｋｄ値の好ましい上限値である。標的結合核酸のＫｄの好ましい下限値は、約１０ピコモル以上であることができる。グレリンに結合する個々の核酸のＫｄ値は、好ましくは、この範囲内であることは本発明の範囲内である。好ましい範囲は、この範囲内の任意の第１の数およびこの範囲内の任意の第２の数を選択することにより定義することができる。好ましい上限値は０．２５μＭ、０．１μＭおよび０．０１μＭであり、好ましい下限値は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．０５ｎＭである。
【００５２】
本発明の核酸分子は、それらが依然として標的分子に結合することができるならば任意の長さを有することができる。本発明の核酸の好ましい長さがあることは当該技術分野において認識される。典型的に、該長さは１５〜１２０ヌクレオチドの間である。１５〜１２０の間の任意の整数が本発明の核酸の可能な長さであることは当業者により認識される。本発明の核酸の長さのさらに好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５０ヌクレオチドおよび約３０〜５０ヌクレオチドの長さである。
【００５３】
グレリンに結合しそして特に本明細書に開示するようなさらなる特徴および特性を有する核酸の作製および／もしくは同定のための本明細書に開示する本発明の方法は、米国特許５，４７５，０９６に従がういわゆるＳＥＬＥＸプロセスに基づく。基本的に、ＳＥＬＥＸプロセスは以下の段階：
ａ）核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子と接触させる段階；
ｃ）標的分子と相互作用しない核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；
ｄ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；および
ｅ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）をシーケンスする段階
を含んでなる。
【００５４】
ＳＥＬＥＸプロセスの正確な操作は、当業者に既知である。
【００５５】
好ましくは、ＳＥＬＥＸプロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる標的分子に結合する個々の核酸の増幅を含んでなる。この増幅を実現することにより、さらに高い割合の非特異的ヌクレオチド導入を実現することができ、それは、結合核酸の一次配列の変化をもたらす。これらの変化のために、とりわけ、増大した親和性もしくは特異性のような出発配列の一つと異なる結合特性を示す新しい配列を作製することができる。
【００５６】
本発明の配列は、選択プロセスの出発材料となる核酸ライブラリーのメンバーのランダム化部分に完全にもしくは部分的に由来することは本発明の範囲内である。しかしながら、本発明の配列は、選択プロセスの出発材料となる核酸ライブラリーのメンバーの非ランダム化部分に完全にもしくは部分的に由来することもまた本発明の範囲内である。そのような非ランダム化部分は、例えば、増幅プライマーの結合部位として用いる部分である。
【００５７】
グレリンに結合するＬ−核酸の作製のための本発明の方法は、国際特許出願ＷＯ９８／０８８５６に従属しているＦｕｒｓｔｅ ｅｔ ａｌ．の方法に基づく。基本的に、この方法は以下の段階：
ａ）Ｄ−核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる段階；
ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する段階；
ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸をシーケンスする段階；および
ｅ）段階ｄ）において得られるＤ−核酸（１つもしくは複数）の配列と同一であるＬ−核酸配列（１つもしくは複数）を合成する段階；
を含んでなる。
【００５８】
本発明によれば、光学対掌体はグレリンである。光学対掌体は、ペプチドを形成するアミノ酸の全てがＤ−アミノ酸であることを意味するＤ−ペプチドとして存在する。標的分子、すなわち、グレリンはＬ−鏡像異性体として存在する。Ｌ−鏡像異性体はＬ−アミノ酸からなり、そして天然に存在する形態である。
【００５９】
該プロセスを実現する方法に関するプロトコルは、当業者に既知である。
【００６０】
本発明の核酸のいずれも、本発明のグレリンに結合する核酸の作製および／もしくは同定の方法ならびに／またはグレリンに結合するＬ−核酸の作製の方法にそれぞれ使用できることもまた本発明の範囲内である。
【００６１】
本明細書において本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニストとも呼ばれる本発明の核酸は、薬剤の作製もしくは製造に用いることができる。そのような薬剤は、場合によりさらなる製薬学的活性化合物と一緒に、本発明の核酸の少なくとも１つを含有し、ここで、本発明の核酸は、好ましくは、製薬学的活性化合物それ自体として作用する。そのような薬剤は、好ましい実施形態として、少なくとも製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。そのような担体は、例えば、水、バッファー、澱粉、糖、ゼラチンもしくは任意の他の許容しうる担体物質であることができる。そのような担体は、一般に、当業者に既知である。そのような薬剤をその処置および／もしくは予防に用いることができる疾患および／もしくは障害および／もしくは病的症状には、肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧ならびに心臓血管疾患が包含されるが、これらに限定されるものではない。当業者により認識されるように、本発明の核酸は、グレリンのアンタゴニストをそのようなアンタゴニストを必要とする患者に投与することができそしてそのようなアンタゴニストが疾患もしくは障害の原因を取り除くためにまたは少なくとも疾患もしくは障害からの影響を減らすために適当である任意の疾患において事実上用いることができる。そのような影響には、肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍処置、血圧ならびに心臓血管疾患が包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的のためにエネルギーバランスの調節は疾患と見なされる。さらに特に、該使用は、エネルギーバランスの調節がグレリンにより直接的にもしくは間接的に影響を受けそしてグレリンの生物学的利用能の減少が所望される任意の疾患の処置のためである。同じことが糖代謝、血圧ならびに食欲および体重に当てはまる。場合により全身もしくは局所使用で、本発明の核酸を用いて処置することができるさらなる疾患は、下垂体腫瘍、先端巨大症、中心性（ｃｅｎｔｒａｌ）クッシング症候群、副腎性クッシング症候群、腫瘍随伴性クッシング症候群、異所性クッシング症候群、副腎腫瘍、ストレス、副腎皮質機能亢進症、心不全、心筋梗塞、発作、副腎皮質不全、低血圧症、大動脈弁狭窄症、肺緊張亢進（ｐｕｌｍｏｎａｌ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉａ）、収縮性心内膜炎、感染症、感染性中毒性低血圧症、血液量減少および低ナトリウム血症を含んでなる群から選択することができるものである。
【００６２】
本発明の核酸ならびにアンタゴニストは、薬剤としてもしくは薬剤の製造のためにだけでなく、美容目的に、特に肥満症におけるグレリンの関与に関しても使用できると理解されるべきである。同じ目的のために、本発明の核酸ならびにアンタゴニストは、食品添加剤、体重管理の手段および／もしくは食欲制御の手段として用いることができる。本発明の核酸ならびにアンタゴニストを含んでなる組成物は、上記の目的のいずれかに用いることができる。
【００６３】
本発明の核酸はさらに、薬剤設計の出発材料として用いることができる。基本的に、２つの可能な方法がある。１つの方法は、化合物ライブラリーのスクリーニングであり、一方、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは、低分子量化合物ライブラリーである。そのようなライブラリーは、当業者に既知である。あるいはまた、本発明の核酸は、薬剤の合理的設計に用いることができる。
【００６４】
薬剤の合理的設計は、本発明の核酸のいずれかから開始することができ、そして本発明の核酸の構造に類似するかもしくは本発明の核酸の構造の結合媒介部分と同一である構造、好ましくは３次元構造を含む。いずれの場合でもそのような構造は、本発明の核酸と同じもしくは同様の結合特性を依然として示す。薬剤の合理的設計におけるさらなる段階においてもしくは代替段階として、神経伝達物質に結合する核酸のそれらの部分の好ましくは３次元構造をヌクレオチドおよび核酸と異なる化学基で模倣する。この模倣により核酸と異なる化合物を設計することができる。そのような化合物は、好ましくは、小分子もしくはペプチドである。
【００６５】
当業者に既知である競合アッセイを用いることによるような、化合物ライブラリーのスクリーニングの場合、適切なグレリンアナログ、グレリンアゴニストもしくはグレリンアンタゴニストを見出すことができる。そのような競合アッセイは、下記のように設定することができる。本発明の核酸、好ましくは標的結合Ｌ−核酸であるスピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を固相に連結する。グレリンアナログを同定するために標識したグレリンをアッセイに加えることができる。可能性があるアナログは、スピーゲルマーに結合するグレリン分子と競合し、それはそれぞれの標識により得られるシグナルの減少と同調する。アゴニストもしくはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者に既知であるような細胞培養アッセイの使用を含むことができる。
【００６６】
本発明のキットは、本発明の核酸の少なくとも１つもしくはいくつかを含んでなることができる。さらに、該キットは、少なくとも１つもしくはいくつかの陽性もしくは陰性コントロールを含んでなることができる。陽性コントロールは、例えばグレリン、特に本発明の核酸が、好ましくは液状で、それに対して選択されるかもしくはそれに結合するものであることができる。陰性コントロールは、例えば、グレリンと同様の生物物理学的性質に関して定義されるが本発明の核酸により認識されないペプチドであることができる。さらに、該キットは、１つもしくはいくつかのバッファーを含んでなることができる。様々な成分は、乾燥もしくは凍結乾燥形態でキットに含有するかまたは液体に溶解することができる。キットは１つもしくはいくつかの容器を含んでなることができ、それらはまたキットの１つもしくはいくつかの成分を含有することができる。
【００６７】
本発明は、図面、実施例および配列表によりさらに説明され、それらからさらなる特徴、実施形態および利点を理解することができる。
【００６８】
以下の表は、配列番号と本明細書に記述する様々なクローンおよび識別名をそれぞれ結び付ける。クローンＢ１１〜Ｇ５は２つの異なる形態で存在することが理解されるべきである。本明細書において「完全」と称する形態は、使用するプールのランダム化ストレッチもしくはその一部ならびにＤＥ．４０Ｆプライマー配列およびＤＥ．４０Ｒプライマーを含んでなり、一方、本明細書において「コア」と称する形態は、それぞれの完全な形態から作製された最小結合モチーフである。別に示されない限り、表す鎖は（＋）鎖であり、そして使用する核酸は２’ＯＨ ＲＮＡである。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】
［実施例］
【実施例１】
【００７３】
手動インビトロ選択
標的分子
ビオチニル化ラットＤ−グレリン（アミノ酸配列、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（オクタノイル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりカスタム合成された。選択中に使用したペプチドは、ビオチン−ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）相互作用を用いて結合していない核酸種からの分別を可能にするためにＣ末端にビオチン部分を含有する。
選択プール、開始プールの作製
選択プールＤＥ．４０は、５’末端でＴ７プロモーター保有３８ｎｔプライマーそして３’末端で２０ｎｔリバースプライマーが隣接する４０ヌクレオチドのランダム領域からなる。Ｔ７プライマーは、転写開始配列、続いてフォワードプライマー配列を保有する。フォワードプライマーは、転写効率を高めるためにグアノシントリプレットから始まる。
ＤＥ．４０−プール（ＲＮＡに対して補正する）
ＲＮＡ−プール：５’−ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＣＴＣ Ｇ ＴＧ−Ｎ４０−ＣＡ ＣＧＴ ＡＣＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＡＣ−３’
逆相補物：５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＧ ＴＧ−Ｎ４０−ＣＡ ＣＧＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ＣＴＣ Ｃ−３’
ＤＥ．４０Ｔ７：５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＧ−３’
ＤＥ．４０Ｒ：５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＧ−３’
（Ｔ７プロモーターに下線を引く）
アニーリング温度を理論的に計算し、そしてプライマーのアニーリングの温度および時間を変えるいくつかの実験により後で最適化した。
【００７４】
【表４】
【００７５】
Ｔｍ＝融解温度、Ｔｐ＝２２＋１．４６ｘ［２ｘ（＃ＧＣ）＋（＃ＡＴ）］（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．：ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０，２３３（１９９１））；Ｔ７プロモーター領域のない
プールを化学的に合成し、塩基組成を決定し、そして１ｘ１０Ｅ１５の異なる分子の複雑さ＝１．７８ｎｍｏｌの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をワンステップＰＣＲにより増幅した。２−Ｆ’−ＲＮＡ開始プールでは、プロトコル１を用いて１．７８ｎｍｏｌの二本鎖ＤＮＡを２’フルオロ修飾ピリミジン（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を使用して転写し；ＲＮＡプールは、プロトコル２を用いて非修飾ヌクレオチドで転写した。
【００７６】
【表５】
【００７７】
【表６】
【００７８】
ラットＤ−グレリン結合アプタマーのインビトロ選択
選択バッファー
全選択中に使用する選択バッファーは、ヒト血液における生理条件に従った（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２）。ｐＨ７．４は、３７℃で調整した。
選択およびストリンジェンシー
Ｄ−グレリン（「標的」）結合アプタマーの選択は、２’−フルオロ修飾ＤＥ．４０プール（２’Ｆ−ＲＮＡ）および非修飾ＲＮＡプール（ＲＮＡ）を用いて実施した。標的へのプールの結合は、溶液中で２時間（１０μＭ〜１０ｎＭのペプチド）および１２時間（１０ｎＭ〜５００ｐＭ）行われた。ペプチド−ＲＮＡ複合体の固定化は、ストレプトアビジン／ニュートラアビジン−ビオチン系を用いて行った。ビオチニル化ペプチドをニュートラアビジン誘導（ｄｅｒｉｖａｔｅｄ）アガロースもしくはストレプトアビジン結合ポリアクリルアミド（ｓ．ｃ．ウルトラリンク）と３７℃で１０分間インキュベーションし、そして短時間の遠心分離により分離した。その後でマトリックスを選択バッファーで洗浄して結合していないプールと弱く結合するプールを除いた。高親和性での標的への結合にマトリックスを必要とする、２価のアプタマーの生成を防ぐために２ラウンドごとのマトリックス交換を行った（ニュートラアビジン−アガロースから開始する）。結合ＲＮＡおよび２’Ｆ−ＲＮＡの溶出は、シェーカーにおいて１０分間２段階（３７℃、６５℃）で４Ｍグアニジンチオシアネートでペプチド−ＲＮＡ複合体を変性させることにより実施した。ラウンド１３からは第３の溶出段階を９５℃で実施した。溶出ＲＮＡもしくは２’Ｆ−ＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出してペプチドを除き、イソプロパノールで沈殿させ、そしてＰＣＲにより増幅した。
ＲＮＡ／２’Ｆ−ＲＮＡのフォールディング
アプタマーの２価の独立したフォールディングを防ぐために、氷上での変性および再生をＭｇ２＋およびＣａ２＋なしに行った。プールをＰＣＲサイクラーにおいて９５℃で５分間変性させ、そしてクラッシュアイス上で２分間スナップ冷却した。その後でＴｗｅｅｎ ２０（最終濃度０．１％）および２価のカチオンを１０倍ミックスから加え、そして３７℃でさらに１０分間インキュベーションした。反応物をプレカラムに直接加えた。
プレカラム
ペプチドを溶液に加える前にプールＲＮＡを純粋なマトリックスとインキュベーションする。これは、マトリックス結合アプタマーの濃縮を防ぐために行う。プレカラムのマトリックス容量は、ＲＮＡ−ペプチド複合体を結合していない種から分離するために用いるメインカラムといつも同じ容量であった。純粋なマトリックスをフォールディングしたＤＥ．４０プールと一緒にシェーカーにおいて３７℃で１０〜１５分間インキュベーションし、結合していないプールを取り除き、そして溶液中のグレリン結合反応物に直接加えた。
溶液中での結合および複合体の固定化
ある濃度を有するビオチニル化Ｄ−グレリンをプールにそれをプレカラムから取り除いた後に直接加えた。ＲＮＡおよび２’Ｆ−ＲＮＡでの選択に使用したペプチド濃度の勾配を図４Ａおよび図４Ｂに示す。ｂｉｏ−グレリン結合ＲＮＡ複合体の固定化は、結合反応物へのマトリックスの直接添加および８００ｒｐｍでサーモシェーカーにおける３７℃で１０分間のインキュベーションにより実施した。
分別
固定化された複合体を予熱した選択バッファーで数回洗浄して結合していない分子と弱く結合する分子を取り除いた。洗浄段階は、５ｘ１００μｌでそしてラウンド１３からは５ｘ１０００μｌの選択バッファーで行った。
結合分子の溶出
結合ＲＮＡおよび２Ｆ’ＲＮＡの溶出は、ペプチド−ＲＮＡ複合体をシェーカーにおいて１０分間２段階（３７℃、６５℃）で４Ｍグアニジンチオシアネートで変性させることにより実施した。ラウンド１３からは、９５℃での第３の溶出段階を実施した。各選択ラウンドに使用した全核酸に対するパーセントでの溶出ＲＮＡおよび２’Ｆ−ＲＮＡの経過を図５および図６に示す。バックグラウンドシグナルとグレリン媒介シグナルとを区別するために、コントロールカラム（いかなるペプチドも加えない）を各ラウンドで行った。コントロールカラムでのシグナルは、ノイズもしくはバックグラウンドシグナルと定義した。グレリン媒介シグナル対ノイズシグナルの比を図１および図２に示す。シグナル対ノイズ比が増加するたびに次の選択ラウンドにおける標的濃度を下げることによりストリンジェンシーを上げた。その後で、異なるペプチド濃度でのシグナル−ノイズ比の別の増加が得られるまでペプチド濃度を一定レベルで保った。該比の増加は、あるペプチド濃度での結合アプタマーの濃縮の手掛かりである。溶出ＲＮＡもしくは２’−Ｆ−ＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出してペプチドを除き、イソプロパノールで沈殿させ、そしてＰＣＲにより増幅した。
ダブルラウンドおよび結合試験
ダブルラウンドは、増幅なしの２回の後続選択ラウンドのプロセスを表す。第１の選択ラウンドｓ．ｃ．コレクションラウンド（ＣＲ）は、結合しないアプタマーを除去するために比較的高濃度の標的で全てのＤ−グレリン結合アプタマーを集めるために用いる。結合ＲＮＡ／２’−Ｆ−ＲＮＡの溶出および抽出の後に溶出核酸をそれを増幅せずに次のラウンドに使用する。このラウンドはダブルラウンド（ＤＲ）と呼ばれ、そして通常は非常に低い濃度の標的で行う。選択のこのプロセスは、アプタマーの増幅およびフォールディング／再フォールディングの圧力を除くために用いる。
【００７９】
これらの選択において３回のダブルラウンドを行った（ＲＮＡではラウンド１２、１３、１４そして２’−Ｆ−ＲＮＡではラウンド１４、１５、１６）。各コレクションラウンド（ＣＲ）の前に広範囲の標的濃度にわたる「結合の試験」を実施してアプタマーを集めるために最もよい標的濃度を評価した。この試験はまた、ラウンドごとのプール濃縮の向上をモニターするためにも用いる。これらのダブルラウンドおよび結合の試験の結果を図７Ａ、７Ｂ、８Ａおよび８Ｂに示す。
増幅
抽出および沈殿
溶出ＲＮＡもしくは２’Ｆ−ＲＮＡをフェノール−クロロホルム抽出により精製し、そしてキャリアとして２μｌのグリコーゲン、０．３Ｍの酢酸ナトリウム ｐＨ５．５および１容量のよく冷えたイソプロパノールで−２０℃で２０〜３０分間沈殿させた。
逆転写（ＲＴ）
沈殿したＲＮＡ／２’Ｆ−ＲＮＡを逆転写酵素を用いることにより一本鎖ＤＮＡに翻訳した。３０μｌの反応当たり５ｐｍｏｌ以下の鋳型をリバースプライマーと一緒に０．８Ｍのベタインにおいて９５℃で５分間変性させ、リバースプライマーを氷上で５分間アニーリングさせ、反応バッファーおよびヌクレオチドを加え、そして反応物を４８℃で２分間加熱し、その後で５ユニットの逆転写酵素を加えた。反応は、サーモサイクラーにおいて温度勾配（３０分４８℃、５０℃２０分、５５℃１０分、７０℃１５分）で行われた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＲＴ反応物の３つの１０μｌアリコートをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。反応の成分を下記のように加えた：
【００８０】
【表７】
【００８１】
８〜１２サイクルの間の以下のプログラムをＰＣＲサイクラーにおいて行った。
変性９５℃：１分
アニーリング６３℃：１分
伸長７２℃：１分
反応物のアリコートをポリアクリルアミドゲル上で分析した。その後でＰＣＲ反応物を１μｌのグリコーゲン、０．３Ｍの酢酸ナトリウム ｐＨ５．５および３容量のよく冷えた１００％エタノールで−８０℃で２０〜３０分間沈殿させた。ペレットを水に再懸濁し、そして５０〜１００ｐｍｏｌをインビトロ転写の鋳型として用いた。
２’−フルオロ転写
５０〜１００ｐｍｏｌのｄｓＤＮＡをインビトロ転写の鋳型として用いた。条件は、開始プールの作製に関する上記のようにであった。作製されたＲＮＡを次の選択ラウンドに用いる。各ラウンドに使用する量を図３に記載する。
【００８２】
この選択の結果は、ＲＮＡプールを用いる選択は図２２および図２３に、そしてＦ’ＲＮＡプールを用いる選択は図２４および２５に示す。そのトランケーションした形態（これらは、しかしながら、依然として標的に結合することができる）を包含する、該図に示す配列のいずれも本発明の核酸であると理解されるべきである。
【実施例２】
【００８３】
自動インビトロ選択
特異的に結合するラットＤ−グレリン結合アプタマーの自動選択を下記に記述する。
材料
ビオチニル化ラットＤ−グレリン（アミノ酸配列、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（オクタノイル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりカスタム合成された。選択中に使用したペプチドは、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を用いる結合していない核酸種から分別を可能にするためにＣ末端にビオチン部分を含有する。このために、ニュートラアビジンアガロースおよびニュートラアビジンウルタラリンクプラス（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ Ｐｌｕｓ）（両方ともＰｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素およびＲＮａｓｅＯＵＴ ＲＮアーゼインヒビターは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から、そしてＤＮアーゼＩはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からであった。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ二本鎖ＤＮＡ検出色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから、ＮＴＰはＬａｒｏｖａ（Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
プール、プライマーおよびＲＮＡスピーゲルマー
ＤＮＡプールの配列は、５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＧＴ Ｇ−Ｎ４０−ＣＡＣ ＧＴＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＴＣＧ ＧＴＴ ＣＣＡ Ｃ−３’であり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴの等モル混合物を表す。
フォワード（Ｔ７）プライマー ＤＥ．４０Ｔ７：
５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＧ−３’
リバースプライマー ＤＥ．４０Ｒ：
５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＧ−３’
濃縮されたプールのクローニングおよびシーケンスは、ＧＡＴＣ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により行われた。
自動インビトロ選択のプロセス
自動インビトロ選択中の大部分の液体処理操作は、取り外し可能なふたを有する９６ウェルプレート（ＮＣＣプレート;Ｂｉｌａｔｅｃ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行い；結合ＲＮＡ種からの結合していないものの分別は、Ｍｏｂｉｃｏｌカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行い；インビトロ転写産物の自動精製は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
自動選択に使用する投入ＲＮＡ
第一の自動選択ラウンド（ラウンド３）のＲＮＡは、第三の手動選択ラウンドにおいて使用したものと同じであった（実施例１を参照）。このＲＮＡの２５０ｐｍｏｌｅをラウンド３および４における；１００ｐｍｏｌｅを全てのさらなるラウンドにおける結合反応当たりの投入量として用いた。
ＲＮＡの変性
標的分子ラットＤ−グレリンと接触させる前のＲＮＡの変性を除く全ての非酵素的選択段階は、選択バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ;１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＣａＣｌ２；０．１％［ｗｔ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ−２０）において行った。変性には、１００〜２５０ｐｍｏｌのＲＮＡプールをＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含まない５７μｌの選択バッファーにおいて９５℃に５分間加熱した。変性後に、ＲＮＡを素早く４℃に２分間冷却し、そして次に３７℃で平衡化した。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を各々１ｍＭの最終濃度になるように加え、そして混合物を３７℃でさらに５分間インキュベーションした（ＲＮＡのフォールディング）。
結合していないＲＮＡからの結合したものの分別
変性後に、ＲＮＡをペプチドなしに１０μｌの選択マトリックス（それぞれ、ニュートラアビジンアガロースもしくはニュートラアビジンウルトラリンク）と３７℃で１５分間接触させた。このいわゆる前選択は、混合物からの潜在的マトリックス結合ＲＮＡ種を除くために考案された。マトリックス粒子を懸濁状態で保つために、サンプルを１，４００ｒｐｍ（３７℃）で振盪した。次に、マトリックスを単純な沈降により溶液中のＲＮＡから分離し、上清を新しいウェルに移し、そしてラットＤ−グレリンを図９に示すような濃度になるように加えた。３７℃で６０分後に、１０μｌのビオチン結合マトリックスを加え、そして結合反応物を振盪（１，４００ｒｐｍ、３７℃）下でさらに１０分間インキュベーションした。洗浄には、マトリックスを次にＭｏｂｉｃｏｌカラムに移し、そして１３５マトリックス容量までの予熱した選択バッファー（３７℃）で洗浄して結合ＲＮＡ種から結合していないものを除いた。洗浄容量は、４５（ラウンド３、すなわち、第１の自動ラウンド）〜後のラウンドにおける１３５マトリックス容量の間で異なった（図９参照）。
結合ＲＮＡの溶出
結合ＲＮＡの溶出は、９５μｌのＲＴ−ＰＣＲバッファーに結合ＲＮＡを有するマトリックス粒子を再懸濁しそして９５℃に３分間加熱することにより行った。逆転写およびその後のＰＣＲの酵素は、５０℃で２分間の平衡化の後に加えた。バッファー条件および酵素の量は、供給業者Ｑｉａｇｅｎにより勧められるように使用した。
増幅
インビトロ転写−選択プロセスに使用するＲＮＡの作製
転写は、１５０μｌの容量においてＴ７反応バッファー（８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５；２２ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭスペルミジン；１０ｍＭジチオスレイトール；４ｍＭ［各々］ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＡＴＰおよびＵＰＴ；８０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中１５０ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび４０ＵのＲＮａｓｅＯｕｔ ＲＮアーゼインヒビターで行った。１つの転写反応において、２５μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応物をインビトロ転写の鋳型として用いた。反応物を３７℃で３時間インキュベーションした。最後に、鋳型ＤＮＡを消化するためにＤＮアーゼＩを加え、そして反応物を３７℃で１５分間インキュベーションした。次に、沈殿した無機ピロリン酸塩を５０℃のワークステーション上でＥＤＴＡを２５ｍＭの最終濃度になるように加えることにより溶解した。生成ＲＮＡを残存するＮＴＰおよび他の所望されない反応成分から８Ｍ尿素を含有する変性ゲルによってもしくはＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０マイクロ濃縮器を使用する限外濾過を用いることにより分離した。限外濾過精製したＲＮＡは、限外濾過膜から単にすすぎ、ゲル精製では、ＲＮＡバンドをＵＶ光下で切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出し、エタノール沈殿し、乾燥させ、そして水に再懸濁した。
選択ＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ
選択ＲＮＡ分子の逆転写は、１２０μｌの容量においてニュートラアビジンアガロースもしくはウルトラリンクプラスマトリックスの存在下で供給業者により推奨されるような条件下でＱｉａｇｅｎワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを用いて行った。サンプル（マトリックスおよび付着ＲＮＡと一緒にＲＴ−ＰＣＲ反応バッファー）を９５℃で３分間加熱し、そして酵素を加える前に５０℃で２分間平衡化した。逆転写では、反応物を５０℃で２０分間そして６０℃で１０分間保った。ＲＴ酵素の不活性化ならびに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性化は、９５℃で１５分間の混合物のインキュベーションにより実施した。
【００８４】
熱循環パラメーターは下記のとおりであった：変性、９５℃で３０秒；アニーリング、６３℃で３０秒；重合、７２℃で３０秒。
ＰＣＲ進行の制御
ＰＣＲサイクルの数を最小限に保つために、ＰＣＲにおいて生成される二本鎖ＤＮＡの量を半定量的に追跡した。反応は、インビトロ転写に十分な鋳型ＤＮＡが生成される間のみ循環させた。ＰＣＲ中に、既定数のサイクルの後に３μｌのアリコートを反応物からサンプリングし、そしてＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液（ＴＥバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８；１ｍＭ ＥＤＴＡ］に１：４００希釈する）と混合した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、溶液中に遊離している場合にはほとんど全く蛍光を示さない蛍光色素である。しかしながら、該色素は二本鎖ＤＮＡに結合している場合に、強く蛍光を発する（ｅｘ：４８５ｎｍ；ｅｍ：５２０ｎｍ）。熱安定性ポリメラーゼを欠くコントロールと比較した蛍光の測定は、ＰＣＲ進行のかなり正確な概算を可能にする。設定閾値（ポリメラーゼを有する蛍光強度／ポリメラーゼなしの蛍光強度＞２）に達した後、ＲＴ−ＰＣＲ反応物のアリコートをインビトロ転写の鋳型として直接用いた。
自動操作
ラウンド３からは、６回のゲル精製段階を除く全ての操作をピペッティングロボット上で完全に自動化して行った。プロセス中に使用するモジュールの配置を図１０に示し、モジュールの使用の順序を図１１に示した。以下のモジュールを選択プロセス中に使用した：
・ＰＣＲ中の増幅進行の制御のための蛍光読取機。インビトロ転写のために十分な量のｄｓＤＮＡをすでに生成したサンプルは、中間で４℃で保存され、そしてさらなる熱循環に供されなかった。
・分別用のＡ室および転写反応物の精製用のＢ室を有するダブル真空マニホールド
・使い捨ての導電性バリアチップのラック
・ＰＣＲプログラムならびに様々なインキュベーション段階を行うためのサーモサイクラー
・結合もしくは反応バッファーに粒子状マトリックスを懸濁するためのシェーカー
・酵素反応のホットスタートのためのもしくは蛍光測定中にサンプルを採取するためにＰＣＲ反応物を高温で保つための５０℃のワークステーション
・ＰＣＲもしくは転写反応物の中間保存用の４℃のワークステーション
・温度感受性試薬の保存用の４℃の試薬ラック
・洗浄バッファーの保存および予熱用の３７℃の試薬ラック
・大部分のピペッティング段階を行うための３７℃のワークステーション
・蛍光測定反応物を調製するための蛍光プレートワークステーション
・現在使用していないマイクロタイタープレートの保存用のホテル（ｈｏｔｅｌ）
・使用したピペットチップの処分用の廃棄物ステーション
本実施例に関連したモジュールの関与ならびに自動インビトロ選択のプロセス中の関与の順序を図１１に図示する。
選択の結果
選択の経過
ラットＤ−グレリンに対するインビトロ選択の経過を図９に示す。あらゆる選択ラウンドにおいて、異なるストリンジェンシーを有する３つの結合反応に加えて標的分子を欠く１つのボイドカラムを行った。ストリンジェンシーは、洗浄容量を変えることならびに標的濃度を下げることにより調整した。
【００８５】
所望のプールの複雑さを表すために必要である多量のＲＮＡプールは、ロボットにより安全に処理することができなかったので、選択ラウンド１および２を手動で行った。ラウンド３からは、選択を完全に自動で行った。２ラウンドごとに、どのストリンジェンシーをその後の２ラウンドに使用すべきかの決定を行った。
【００８６】
図９において、図１３に示す配列をもたらした選択ストランドを強調表示する。一般に、バックグラウンドに対して有意なシグナルを依然として示した最もストリンジェントなストランド（すなわち、それぞれ、最も低い標的濃度もしくは最も大きい洗浄容量を有するもの）の選択ＲＮＡを次のラウンドの投入として用いた。閾値レベルに達するために必要であったＰＣＲサイクルの数（「ＰＣＲ進行の制御」を参照）を尺度として用いた。全部で、１９の選択ラウンド（そのうち１７は自動）を行った。
【００８７】
ラウンド１７〜ラウンド１９（各々６．２ｎＭのＤ−グレリンで）からのｄｓＤＮＡ分子の集団をクローン化し、そしてシーケンスした。全部で、９６個のクローンをシーケンスした（ラウンド１７およびラウンド１９からそれぞれ４８個）。１４の異なるクローンの頻度および発生は、図１２（表５）に示すとおりであった。
配列
配列分析の結果を図１３に見ることができる。全部で９６個のクローンから、８７個において両方のプライマーを見出すことができた。
【００８８】
そのトランケーションした形態（これらは、しかしながら、依然として標的に結合することができる）を包含する、図１３に示す配列のいずれも本発明の核酸であると理解されるべきである。
【実施例３】
【００８９】
Ｄ−グレリンに対するＲＮＡアプタマーの特性化
「ビーズアッセイ」（溶液における結合）を用いることによるクローンの順位付け
Ｄ−グレリンに対する自動インビトロ選択から得られた１４個全てのクローンをビーズアッセイを用いることによりそれらの結合挙動に関して順位付けした。
【００９０】
この目的のために、２ｐｍｏｌ（２０ｎＭ）のＲＮＡをＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋およびＴｗｅｅｎ ２０を含まない１００μｌの選択バッファーにおいて９５℃で５分間変性させ、そして次に氷上に直接置くことによりスナップ冷却した。次に、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を各々１ｍＭの最終濃度になるように、そしてＴｗｅｅｎ ２０を０．１％の最終濃度になるように加えた。溶液を３７℃に平衡化した。
【００９１】
このＲＮＡを異なる濃度のビオチニル化Ｄ−グレリンと３７℃で１時間プレインキュベーションした。次に、この溶液の４０μｌをマイクロタイタープレートに移し、そして３０μｌの常磁性ストレプトアビジン磁性粒子（「ビーズ」；Ｒｏｃｈｅ，１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベーションして全てのビオチニル化Ｄ−グレリンをビーズ上に固定化した（遊離のペプチドならびにＲＮＡ：ペプチド複合体）。Ｄ−グレリン濃度に依存する上清におけるＲＮＡ濃度の減少をモニターするために、上清におけるＲＮＡの量をＯｌｉＧｒｅｅｎ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量した。
【００９２】
ＯｌｉＧｒｅｅｎの蛍光は、オリゴヌクレオチドへの分子の結合に強く依存し；溶液中で結合していない場合、４８５ｎｍの光で励起するとＯｌｉＧｒｅｅｎは弱い蛍光を示すのみである。しかしながら、核酸が存在する場合、５２０ｎｍでの蛍光シグナルは核酸の濃度に比例して上昇する。
【００９３】
次に、ビーズを６Ｍの尿素に再懸濁しそして３７℃で１０分間インキュベーションすることによりＲＮＡ−標的複合体を分離した。標的濃度に依存する溶出ＲＮＡの増加をモニターするために、この溶出液におけるＲＮＡの量を同様に定量した。全ての値は、ペプチドなしのコントロールにおけるバックグラウンドシグナルに対して補正した。上清および溶出液の代表的な結合曲線を図１４Ａ〜Ｅに示す。
【００９４】
０、２０、１００および５００ｎＭのＤ−グレリン濃度を用いる第一の順位付けは、試験した全てのクローンが１００ｎＭ未満の活性構造のＫＤで同様に十分に結合したことを示した。上清におけるＲＮＡ濃度の減少から判断されるように、ＲＮＡの約４０〜５０％が活性構造であるようである。
【００９５】
クローンＢ１１、Ｃ１１、Ｃ１２、Ａ８およびＦ１２の０、５、１０、２０、５０、１００、２００および４００ｎＭのＤ−グレリン濃度を今度は配置するさらに詳細な順位付けは、これらのクローンが全てこのアッセイにおいて約１０ｎＭの活性構造のＫＤで結合することを示した（図１４Ａ〜Ｅ）。
【００９６】
これらの図は、ビオチニル化Ｄ−グレリンの濃度に依存する核酸媒介蛍光の増加を示す。ｙ軸上にペプチドなしのコントロールにおけるバックグラウンドシグナル（＝０％）に対する溶出液における蛍光シグナルの増加［％］を示す。クローンＡ８に決定したデータ点は、式
【００９７】
【数１】
【００９８】
（Ｂｍａｘは、高いペプチド濃度での蛍光の増加の最大プラトー値の値である。ＫＤは、［ｎＭ］での結合定数ＫＤを示す。）を用いて１部位結合（ＯｎｅＳｉｔｅＢｉｎｄｉｎｇ）モデルで適合させた。
【００９９】
１０ｎＭ未満の結合定数はこのアッセイで分析することができないので、次に、３個の選択クローンの結合特性を放射性標識したＲＮＡを用いる結合アッセイによりならびにビアコア２０００装置の使用により特性化した。
選択した放射性標識クローンのそれらの結合挙動に関する順位付け
標的分子ラットＤ−グレリンに対する３個の選択分子の結合挙動の順位付けを行った。この目的のために、クローンＢ１１、Ｅ３およびＦ１２をα３２Ｐ−ＧＴＰおよびα３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でインビトロ転写した。２〜５ｐｍｏｌｅの放射性標識ＲＮＡをＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない選択バッファーにおいて９５℃で３分間変性させ、これらのイオンを３７℃で１ｍＭの最終濃度になるように加えることによりフォールディングし、そして０、３、１０、３０、１００、３００、１０００および３０００ｎＭの濃度のビオチニル化ラットＤ−グレリンと３７℃で１時間インキュベーションした。次に、一定量のニュートラアビジンアガロースをマトリックスとして加え、そしてＲＮＡ：ペプチド複合体を３７℃でもう１０分間振盪した。次に、結合したペプチドおよびペプチド：ＲＮＡ複合体を有するマトリックスを分離し、上清を除き、そして結合したＲＮＡと結合していないＲＮＡとの差を決定した。計算した数から、コントロール（０ｎＭのＤ−グレリン）をバックグラウンドとして引いた（図１５、表６）。付着数での結合曲線を図１６Ａ〜Ｃに示す。
ビアコア２０００装置を用いることによるクローンの順位付け
１４個全てのクローンのビアコア測定は、グレリンチップ上でのＲＮＡ溶液の直接結合アッセイとして行った。結合パートナーは、遊離のＲＮＡおよび前もって固定化したグレリンである。
【０１００】
グレリンチップは、その表面が下記のようにＥＤＣ／ＮＨＳアミノカップリングで連結された４つのフローセルを有するＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）からなった：
フローセル１：基準セルとして１２６５ＲＵのアビジン
フローセル２：１２７０ＲＵのＬ−グレリン（ラット）
フローセル３：７４０ＲＵのＤ−グレリン（ラット）
フローセル４：６００ＲＵのＤ−グレリン（ラット）
試験するサンプルは、選択バッファーにおいて５００ｎＭの濃度に調整し、そして３７℃に平衡化した。測定自体は、以下の条件下でビアコア２０００装置で行った：
温度 ３７℃
流量 ２０μｌ／分
結合 ５分
解離 ５分
再生 １Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１４の試験したＤ−ＲＮＡのうち１３がアミノ連結したＤ−グレリンに１００〜２００ｎＭの範囲のＫＤを有することが判明した（図１７）。Ｃ１２調製物のＤ−ＲＮＡ濃度は全ての他のものよりはるかに低く、それははるかに低い最大シグナルをもたらす。これは解釈を困難にし、そして約２０ｎＭの明白な低いＫＤは疑わしい。
遊離のラットＤ−グレリンでのクローンＢ１１の競合
遊離のラットＤ−グレリンに対するクローンＤ−Ｂ１１の結合特性を評価するために、競合実験を行った。一定濃度のＤ−Ｂ１１（１００ｎＭ）を異なる濃度の遊離のＤ−グレリン（０〜５００ｎＭ）と選択バッファーにおいて３７℃でプレインキュベーションし、そして次にビアコアに注入した。ビアコアチップ上の固定化グレリンと遊離のグレリンはＲＮＡの結合に関して競合し、それは遊離のグレリンの増加する濃度とともにＲＮＡのいっそう低い見かけの濃度、従っていっそう低いビアコアシグナルをもたらす。
【０１０１】
図１８に示すように、ビアコアシグナルは溶液中のＤ−グレリンの増加する濃度とともに減少する。これは、固定化Ｄ−グレリンへの結合を遊離のＤ−グレリンと競合できることを意味する。
【実施例４】
【０１０２】
Ｂ１１のトランケーションおよびスピーゲルマーの特性化
アプタマーＢ１１の二次構造は、図１９に示すようにプログラムｒｎａｆｏｌｄ（Ｉ．Ｌ．Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ １２５：１６７−１８８）を用いることにより計算した。
【０１０３】
ＲＮＡスピーゲルマーの製造には、得られる結合モチーフが合理的努力下で化学合成を可能にしそしてグレリンへの親和性が失われないようにＢ１１配列をトランケーションすることが必要であった。
【０１０４】
これを行うために、塩基１〜１７および６５〜８２を取り除いた。それぞれの４７ｍｅｒ Ｂ１１ｔｒｃ（ｒｎａｆｏｌｄにより計算された二次構造は、図１９を参照）は、Ｔ７プロモーター配列を含有するｓｓＤＮＡを合成し、ｓｓＤＮＡをプライマーおよびＴａｑポリメラーゼを用いて転写可能なｄｓＤＮＡに埋め、そしてこの鋳型でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応を設定することにより酵素的にＤ−ＲＮＡとして製造した。製造されたＲＮＡをゲル精製し、そして水に溶解した。対応するスピーゲルマーを標準的なβ−シアノエチル化学を用いて合成した。
【０１０５】
ＬおよびＤ形態の両方のトランケーションしたＢ１１バージョンならびに全長Ｄ−ＲＮＡを同じ実行において上記のようにビアコア２０００装置で試験し、そして１００〜２００ｎＭの間のＫＤの同様の結果を与えた（図２０）。クローンＢ１１（Ｄ−ＲＮＡ）およびトランケーションしたＢ１１（それぞれ、Ｄ−およびＬ−ＲＮＡ）のビアコア測定のオーバーレイを図２１に示す。
【実施例５】
【０１０６】
グレリン結合スピーゲルマーによるグレリン誘発性カルシウム放出の阻害を分析する方法
ヒトグレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）を発現する安定なトランスフェクションＣＨＯ細胞（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ，Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍから得られた）を透明な底を有する黒色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）においてウェル当たり５〜７ｘ１０４個の細胞で接種し、そして１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび２．５μｇ／ｍｌのファンギゾンをさらに含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）において３７℃および５％ ＣＯ２で一晩培養した。
【０１０７】
スピーゲルマーを０．２ｍｌのロープロファイル９６チューブプレートにおいて５ｍＭのプロベネシドおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（ＣＨＯ−Ｕ＋）においてヒトもしくはラットグレリン（Ｂａｃｈｅｍ）と一緒に室温もしくは３７℃で１５〜６０分間インキュベーションする。
【０１０８】
カルシウム指示色素ｆｌｕｏ−４を負荷する前に、細胞を２００μｌのＣＨＯ−Ｕ＋で１回洗浄する。次に、５０μｌの指示色素溶液（ＣＨＯ−Ｕ＋中１０μＭのｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、０．０８％のｐｌｕｒｏｎｉｃ １２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を加え、そして細胞を３７℃で６０分間インキュベーションする。その後で細胞を１８０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋で３回洗浄する。最後に、９０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋をウェル当たり加える。
【０１０９】
蛍光シグナルの測定は、注入ポンプを備えたＦｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａマルチ検出プレート読取機（ＢＭＧ）において４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で行う。
【０１１０】
カルシウム濃度のグレリン誘発性変化の正確な時間経過を分析するために、刺激用の溶液をＣＨＯ−Ｕ＋における１０ｘ濃縮溶液として調製し、そして注入ポンプの助けを借りて注入する。この種の測定では各ウェルを別個に分析する。各ウェルからの記録の最後に、１０μｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を注入して適切な負荷を制御する。
【０１１１】
いくつかのサンプルの平行測定には、９６ウェルプレートの１（垂直）列のウェルを一緒に記録する。４秒の時間差を有する最初の３回の読み取りは、ベースラインの決定のために行う。次に記録を中断し、そしてプレートを装置から取り出す。マルチチャンネルピペットを用いて、１０μｌの刺激溶液をウェルに加え、次にプレートを再び装置に入れ、そして測定を続ける。４秒の時間間隔を有する全部で２０回の記録を行う。
【０１１２】
各ウェルで最大蛍光とベースライン値との差を決定し、そしてグレリン濃度に対して、もしくはスピーゲルマーによるカルシウム放出の阻害に関する実験ではスピーゲルマーの濃度に対してプロットする。
【実施例６】
【０１１３】
自動再選択
向上した結合親和性を有するＲＮＡ結合物（ｂｉｎｄｅｒ）を得るために、グレリン結合アプタマーＣ１２に基づく再選択を行った。それぞれのＤＮＡプールの配列は、５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＧＧＧ ＴＧＡ ＧＧ ｃａａ ａａａ ｃｇｔ ａａｇ ａｃｃ ｇａａ ｇｇｔ ａａｃ ｃａｔ ｔ ＣＣＴ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＧＴＧ ＴＣＧ ＧＴＴ ＣＣＡ Ｃ−３’であり、小文字は３４％のそれぞれの塩基、２２％の３つの他の塩基の混合物を表す。フォワードプライマーＤＥ２．Ｔ７は、配列５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＧ−３’を有し、リバースプライマーＤＥ２．Ｒは、配列５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＧＡＴ ＧＧ−３’を有した。
【０１１４】
最初の２回の選択ラウンドは、実施例１の「手動インビトロ選択」に記述するように手動で行い；ラウンド３〜１０は、実施例２の「自動インビトロ選択」に記述するようにロボットにより行った。
【０１１５】
ラウンド１０（１２ｎＭのＤ−グレリンで）からのｄｓＤＮＡ分子の集団をクローン化し、そしてシーケンスした。全部で、４６個のクローンをシーケンスした。結合特性を調べた２５個の異なるクローンのヌクレオチド配列を図３１に示す。
【実施例７】
【０１１６】
再選択からの個々のクローンの分析
異なる位置でバリエーションを示す再選択プールからの２５個のクローン（実施例６、図３１）を実施例３に記述する「ビーズアッセイ」を用いる順位付けのために選択した。Ｄ−ＲＮＡアプタマーの結合を０、１０、２０、５０、１００、２００、４００および８００ｎＭのＤ−グレリン濃度で分析し；基準として、アプタマーＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）を平行して分析した。いくつかの候補は、コントロールアプタマーＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）より強くＤ−グレリンに結合し、いっそう低いＫＤもしくはいっそう多量の活性構造のいずれかを示す。
【０１１７】
さらに、これらのアプタマーの結合をビアコア２０００装置（実施例３）を用いて分析した。全てのＲＮＡは、シグナル強度ならびに結合および解離挙動の偏差を有するが、ｂｉｏ−Ｄ−グレリンに結合することが判明した（図３２を参照）。クローンＳＯＴ−１０８−Ｂ１、ＳＯＴ−１０８−Ｃ８、ＳＯＴ−１０８−Ｆ２、ＳＯＴ−１０８−Ｂ６、ＳＯＴ−１０８−Ｂ７、ＳＯＴ−１０８−Ｄ５、ＳＯＴ−１０８−Ｆ７、ＳＯＴ−１０８−Ｇ３、ＳＯＴ−１０８−Ｈ４、ＳＯＴ−１０８−Ｅ６およびＳＯＴ−１０８−Ｃ６は、コントロールクローンＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）およびＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）より優れた結合を有するようであり、測定におけるいっそう高いシグナルもしくはいっそう遅い解離速度を示す。これらのクローンは、「ビーズアッセイ」においても同様に優れていたことを記載しなければならない。
【０１１８】
従って、これらのクローンを細胞培養アッセイ（実施例５）においてスピーゲルマーとしてそれらの活性に関して試験した。同時に、これらの配列を５０ヌクレオチド未満のサイズにトランケーションすることができるかどうかを分析した。試験したスピーゲルマーを図３３に要約する。
【０１１９】
細胞アッセイの第一の組において、グレリン依存性カルシウム放出へのスピーゲルマーの阻害の影響を１０ｎＭおよび３ｎＭのＬ−ＲＮＡ濃度でそれぞれ検出した。これは、トランケーションしたクローンの生物学的活性の大まかな概算を可能にする。この２点測定の結果を図３４に示す。
【０１２０】
細胞アッセイ条件下で、これらのトランケーションした再選択クローンは、ＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）のものと匹敵する阻害活性を示す。しかしながら、スピーゲルマーｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４は、コントロールＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）およびＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）と比較して、３ｎＭおよび１０ｎＭでグレリン活性を有意に強く阻害する。
【０１２１】
実験の第二の組は、異なる濃度のＬ−ＲＮＡ（実施例５）でこれらのスピーゲルマーｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４の阻害活性を分析する。得られる用量応答曲線を図３５に示す。全てのクローンは、１０ｎＭでグレリン誘発性カルシウム放出のほぼ最大の阻害を示した。明らかなＩＣ５０を〜５ｎＭで検出することができ、一方、１ｎＭのスピーゲルマー濃度ではいかなる応答も認めることができない。比較して、このアッセイにおけるＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）のＩＣ５０は、１０ｎＭを超えて検出された。
【０１２２】
細胞アッセイは５ｎＭのグレリン濃度で機能し、これはさらに低いＩＣ５０を有する結合事象を分析することを困難にし；スピーゲルマーがグレリンに比較してサブ化学量論（ｓｕｂ−ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）量で存在する場合に、完全な阻害を認めることができないと考えられなければならない。しかしながら、１０ｎＭでのグレリン活性のほとんど完全な阻害は、スピーゲルマーｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４の生物学的活性が、検出されるよりさらに優れている可能性があることを示唆する。
【実施例８】
【０１２３】
正常マウスの摂餌量へのｉ．ｖ．投与した抗グレリン−スピーゲルマーの効果の調査
研究の開始の前に、マウス（ＮＭＲＩ）を少なくとも５日間順応させた。マウスは餌および水を自由に入手することができ、そして個々に飼育した。実験は、各々８匹の動物の３群で実施した。これらの群に、明期の最後に食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかをｉ．ｖ．注射により与えた。スピーゲルマーは、９０ｍｇ／ｋｇ（１．８μＭ／ｋｇ）の用量で使用した。投与後に動物は餌および水を無制限に入手することができ、そして摂餌量を５分の間隔で２４時間記録した。全部で２４匹の動物での実験を各々１２匹の２組に分け、そして２つの異なる日に実施した。
【０１２４】
第１組において摂餌量の減少が認められ（図３６Ａおよび３６Ｂ）、一方、第２組では抗グレリンスピーゲルマーとコントロールスピーゲルマーとの違いを認めることができない（図３７Ａおよび３７Ｂ）。全体で、抗グレリン−スピーゲルマーの投与後の期間における摂餌量の減少への傾向が示される（図３８Ａおよび３８Ｂ）。
【実施例９】
【０１２５】
食餌訓練したマウスの摂餌量へのｉ．ｖ．投与した抗グレリン−スピーゲルマーの効果の調査
マウス（ＮＭＲＩ）を１時間の期間にわたって暗期中に２回のみ餌を入手できるように訓練した。これらの条件下でそれらはそれらの食餌必要条件を満たすためにその時間中に餌を食べることを素早く学ぶ。この方法の理論的根拠は、個々の試験動物と群全体との間のより優れた比較可能性を得ることである。
【０１２６】
実験を各々８匹の動物の３群で実施した。これらの群に明期の最後に食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかをｉ．ｖ．注射により与えた。スピーゲルマーは、６０ｍｇ／ｋｇ（１μＭ／ｋｇ）の用量で使用した。全部で２４匹の動物での実験を各々１２匹の２組に分け、そして２つの異なる日に実施した。試験動物は、投与後１および７時間で１時間の期間にわたって餌を入手できるようにした。消費された餌の量は、各給餌期間後に手動で決定した。図３９は、第１の実験における１２匹の動物の摂餌量を示し、そして図４０は第２の実験を要約する。群当たりの全ての動物の全摂餌量を図４１に示す。
【０１２７】
特に、第１の給餌期間中に動物は餌消費の減少への傾向を示した（図３９Ａおよび３９Ｂ）。しかしながら、全体では餌消費への抗グレリンスピーゲルマーの弱いそして一時的な効果のみを認めることができた。
【実施例１０】
【０１２８】
カニューレを挿入したラットの摂餌量へのｉ．ｃ．ｖ．投与した抗グレリン−スピーゲルマーの効果の調査
オスウィスター系ラットを照明コントロール室（１２時間の明／１２時間の暗サイクル）において飼育し、そして標準的なラットの餌を自由に入手できるようにした。実験の１〜２週前にオスウィスター系ラットを脳室内注入のために準備した。ステンレス鋼脳室内（ｉｃｖ）カニューレをラットの頭蓋骨に麻酔下で埋め込んだ。ｉｃｖカニューレ配置は、実験後に色素を導入することにより全てのラットにおいて確かめた。処置の日に群当たり４匹のラットに明期の最後にａ）コントロールスピーゲルマー（０．７ｍＭ／５μｌ／ラット）、ｂ）スピーゲルマーＢ１１（０．７ｍＭ／５μｌ／ラット）もしくはｃ）賦形剤（０．９％食塩水／５μｌ／ラット）の単回ｉｃｖ投与を与えた。摂餌量を２４時間測定し、そして注入前の日（ベースライン記録）と比較した（図４２）。
【０１２９】
この実験において、抗グレリンスピーゲルマーの効果は、コントロール群において認められる結果と有意に異ならなかった。
【実施例１１】
【０１３０】
抗グレリン−スピーゲルマーによる外因性グレリン投与後の成長ホルモン放出の阻害
本実験は、スプラーグ・ドーリーラットで群当たり６匹の動物の３群において７日の順応後に行った。２群には１５０ｎｍｏｌのＰＥＧ化抗グレリンスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化コントロールスピーゲルマーの単回ｉ．ｖ．注射のいずれかを与えた。スピーゲルマー投与の３０分後に各ラットに３ｎｍｏｌのグレリン（２５０μｌ）の静脈内注射を与えた。血液サンプルを成長ホルモンレベルのベースライン記録のためにグレリン投与の前にそして注射の５分、１５分、３０分および４５分後に麻酔下で採取した。得られる血漿サンプルをラジオイムノアッセイ系（成長ホルモン、ラット、Ｂｉｏｔｒａｋアッセイキット、ＲＰＮ２５６１，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）により分析した。
【０１３１】
ＧＨ放出は、スピーゲルマー処置群において観察の全期間にわたって持続的に抑制されて阻害され（図４３）、記述するモデルにおける抗グレリンスピーゲルマーのインビボ活性を示す。
【０１３２】
さらに、ＧＨ放出の阻害を抗グレリンスピーゲルマーの異なる用量を投与することにより調べた（図４５）。１５ｎｍｏｌの単回用量はＧＨ放出へのグレリンの効果を抑制し、一方、３ｎｍｏｌの用量は十分ではなかった。
【実施例１２】
【０１３３】
抗グレリンスピーゲルマーによる外因性グレリンの摂餌量の刺激の中和
本研究は、全部で３２匹のオススプラーグ・ドーリーラットを用いて４群の動物で２つの実験に分けた。７日の順応の後に、動物を各々８匹の４群に無作為に割り当てた。ラットを個々に飼育し、そして通常の明暗サイクルで維持した。動物は餌および水を自由に入手することができた。動物、給餌ジャーおよび水ボトルを明期の開始後約２時間で秤量した（０．１ｇの位まで）。給餌ジャーおよび水ボトルを４時間後に秤量し、そしてラットの異なる群の餌および水摂取量を計算した。
【０１３４】
第１組において外因性グレリンの最適用量を試験した。グレリンの３つの異なる用量（それぞれ、１６．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、３３．４ｎｍｏｌ／ｋｇおよび８３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を腹腔内経路により投与した。異なる用量群の餌および水摂取量を同時に決定した。給餌ジャーおよび水ボトルを薬剤投与の時点でそして１、２および４時間後に秤量した（図４４）。ｉ．ｐ．投与後のラットにおける摂餌量の刺激の最適用量は、１０ｎｍｏｌ／動物であった（図４４）。
【０１３５】
前記と同じプロトコルに従って行う次の実験において、抗グレリンスピーゲルマーによる摂餌量への外因性グレリンの効果の中和を調べた。最初に１５０ｎｍｏｌ／動物および３０ｎｍｏｌ／動物の２つの用量レベルのスピーゲルマーをｓ．ｃ．投与した。１時間後にラットにグレリンをｉ．ｐ．投与により与えた。コントロール群には賦形剤を与えた。餌および水摂取量を上記のように１、２および４時間後にモニターした。抗グレリンスピーゲルマーは、摂餌量への効果を示した。
【０１３６】
本明細書、配列表、請求項および／もしくは図面に開示する本発明の特徴は、別個にそしてその任意の組み合わせの両方で本発明をその様々な形態で実現するための材料であることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】Ｄ−グレリン結合アプタマーのＲＮＡ選択のシグナル対ノイズ比を示す表１Ａを示す。
【図２】Ｄ−グレリン結合アプタマーの２’Ｆ−ＲＮＡ選択のシグナル対ノイズ比を示す表１Ｂを示す。
【図３】選択プロセスに使用するＲＮＡ／２’Ｆ−ＲＮＡの量を示す表２を示す。
【図４Ａ】ＲＮＡ選択に使用するグレリンペプチド濃度の経過を示す。
【図４Ｂ】２’Ｆ−ＲＮＡ選択に使用するグレリンペプチド濃度の経過を示す。
【図５】ペプチド濃度の経過の間の全使用ＲＮＡのパーセントでの溶出ＲＮＡの経過を示す。
【図６】ペプチド濃度の経過の間の全使用２’Ｆ−ＲＮＡのパーセントでの溶出ＲＮＡの経過を示す。
【図７Ａ】ＲＮＡ選択のラウンド１２〜１４で行ったダブルラウンドおよび結合アッセイを示す表３を示す；グレリンへのパーセント結合でのデータ、＊は配列を明らかにする。
【図７Ｂ】ダブルラウンドにわたってモニターしたＤ−グレリンへのＲＮＡプール結合の向上を示す。
【図８Ａ】２’Ｆ−ＲＮＡ選択のラウンド１３〜１５で行ったダブルラウンドおよび結合アッセイを示す表４を示す；グレリンへのパーセント結合でのデータ、＊は配列を明らかにする。
【図８Ｂ】ダブルラウンドにわたってモニターしたＤ−グレリンへの２’Ｆ−ＲＮＡプール結合の向上を示す。
【図９】ラットＤ−グレリンに対する自動インビトロ選択の経過を示す。
【図１０】ＲＮＡの自動インビトロ選択用のロボットのワークサーフェスを示す。
【図１１】自動ＲＮＡ選択中にロボットにより実行される作業手順を示すスキームを示す。
【図１２】選択プロセス中の同一配列の発生を示す表５を示す；内部基準および配列番号を示す。
【図１３】実施例２に記述するようなグレリンに対する自動インビトロ選択により単離されたＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示す。
【図１４Ａ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＡ８の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｂ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＢ１１の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｃ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＣ１１の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｄ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＣ１２の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｅ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＦ１２の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１５】自動インビトロ選択により単離されたクローンＢ１１、Ｆ１２およびＥ３のＤ−グレリンへの結合挙動を示す表６を示す。
【図１６Ａ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＢ１１の結合曲線、活性およびＫｄを示す、対応するデータを図８に示す。
【図１６Ｂ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＦ１２の結合曲線、活性およびＫｄを示す、対応するデータを図８に示す。
【図１６Ｃ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＥ３の結合曲線、活性およびＫｄを示す、対応するデータを図８に示す。
【図１７】ビアコア２０００装置を用いて決定した場合のＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＡ３、Ａ８、Ａ１２、Ｂ７、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｅ３、Ｅ１２、Ｆ５、Ｆ１２、Ｇ２およびＧ５のＫｄ値を示す表７を示す。
【図１８】ビアコア２０００装置を用いて行った、クローンＢ１１での競合実験を示す。
【図１９】Ｄ−グレリン結合ＲＮＡスピーゲルマークローンＢ１１のおよびトランケーションしたクローンＢ１１ｔｒｃの計算された二次構造を示す、二次構造は、プログラム「ｒｎａｆｏｌｄ」（Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ，Ｃｈｅｍ １２５：１６７−１８８）で計算した。
【図２０】Ｄ形態のＲＮＡクローンＢ１１ならびにＤおよびＬ形態のトランケーションしたクローンＢ１１のＫｄを示す表８を示す、Ｋｄはビアコア２０００装置で測定した。
【図２１】Ｄ形態のＲＮＡクローンＢ１１ならびにＤおよびＬ形態のトランケーションしたクローンＢ１１のビアコア２０００による結合アッセイを示す。
【図２２】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１３）により単離されたＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２３】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１４）により単離されたＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２４】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１４）により単離された２’−Ｆ−ＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２５】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１５）により単離された２’−Ｆ−ＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２６】３３ｎＭのグレリンでのヒトグレリン受容体（ＧＨＳＲ１）を安定に発現するＣＨＯ細胞の刺激後に得られる蛍光シグナルの時間経過を示す；細胞にＣａ＋＋指示色素Ｆｌｕｏ４を負荷し、そして蛍光シグナルを蛍光プレート読取機で記録し；記録の最後に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えて細胞の適切な色素負荷を調べた。
【図２７】ヒトグレリン受容体を安定に発現するＣＨＯ細胞におけるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の用量応答曲線を示す；刺激に使用したグレリン濃度に対して最大シグナルとベースラインシグナルとの差をプロットし、約５ｎＭの半数有効濃度（ＥＣ５０）を示す、グレリンの用量応答曲線が得られ、この濃度をスピーゲルマーによるＣａ＋＋放出の阻害に関するさらなる実験に用いた。
【図２８】室温でのスピーゲルマーＢ１１によるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の阻害の用量応答曲線を示す；細胞を５ｎＭのグレリンもしくは様々な量のスピーゲルマーＢ１１と室温でプレインキュベーションしたグレリンで刺激した；結果は、スピーゲルマーなしに得られるシグナルに正規化した蛍光シグナルのパーセンテージを示す；スピーゲルマーＢ１１は、約５ｎＭのＩＣ５０でグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出を阻害することが見出された。
【図２９】３７℃でのスピーゲルマーＢ１１によるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の阻害の用量応答曲線を示す；細胞を５ｎＭのグレリンもしくは様々な量のスピーゲルマーＢ１１と３７℃でプレインキュベーションしたグレリンで刺激した；結果は、スピーゲルマーなしに得られるシグナルに正規化した蛍光シグナルのパーセンテージを示す；スピーゲルマーＢ１１は、約６ｎＭのＩＣ５０で３７℃でグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出を阻害することが見出された。
【図３０】スピーゲルマーＢ１１およびＣ１２によるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の阻害の比較を示す；細胞を５ｎＭのグレリンもしくは様々な量のスピーゲルマーＢ１１もしくはスピーゲルマーＣ１２と室温でプレインキュベーションしたグレリンで刺激した；結果は、スピーゲルマーなしに得られるシグナルに正規化した蛍光シグナルのパーセンテージを示す；この実験において、スピーゲルマーＢ１１は、約８ｎＭのＩＣ５０でグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出を阻害することが見出され、一方、スピーゲルマーＣ１２ではＩＣ５０は約４ｎＭであった。
【図３１】自動再選択から得られるクローンのヌクレオチド配列を示す、５’−Ｘ−、５’プライマー配列ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＡＣＵＵＡＧＣＡ、３’−Ｙ−、３’プライマー配列ＡＵＣＧＡＧＵＧＵＣＧＧＵＵＣＣＡＣ、ここで、ＴはＵとして理解されるものとし、下線を引いた配列は、分子内らせん構造を形成すると考えられ、クローンのコア形態は下線を引いた配列から始まり、終わる、クローンＳＯＴ−１０８−Ｈ３は５回発生し、ＳＯＴ−１０８−Ａ６、ＳＯＴ−１０８−Ｂ７、ＳＯＴ−１０８−Ｃ２、ＳＯＴ−１０８−Ｃ３およびＳＯＴ−１０８−Ｄ４は２回発生し、全ての他のクローンは１回のみ得られた。
【図３２Ａ−Ｃ】３７℃でのｂｉｏ−Ｄ−グレリンへの再選択プールからのアプタマーのビアコア２０００による結合アッセイを示す。
【図３３】細胞アッセイにおいて試験した再選択スピーゲルマーの配列を示す；ここで、ＴはＵとして理解されるものとし、スピーゲルマーの配列、名称およびサイズ、ならびにそれが由来する再選択クローンの名称を示す。
【図３４】細胞アッセイにおけるグレリン誘発性カルシウム放出へのスピーゲルマーの阻害活性を示す；結果は３回の独立した測定から合わせ、コントロールＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）およびＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）をそれらの各々に示す（全てのスピーゲルマーは、３ｎＭおよび１０ｎＭの濃度で二重反復で分析した）。
【図３５】スピーゲルマーＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４の用量応答曲線を示す；各スピーゲルマーによるグレリン誘発性カルシウム放出の阻害は、二重反復で測定する。
【図３６Ａ−３８Ｂ】ｉ．ｖ．注射による食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかの投与後のマウスの摂餌量を示す。
【図３９−４０】ｉ．ｖ．注射による食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかの投与後のマウスの摂餌量を示す；マウスを１時間の期間にわたって暗期中に２回のみ餌を入手できるように訓練した；全部で２４匹の動物での実験を１２匹の動物の２組に分け、図３９は第１の実験における１２匹の動物の摂餌量を示し、そして図４０は第２の実験を示す。
【図４１】図３９〜４０に示すデータを要約する、２４匹全てのマウスの全摂餌量を示す。
【図４２】食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかのｉｃｖ投与後のラットの２４時間摂餌量を示す。
【図４３】１５０ｎｍｏｌ／ラットの抗グレリンスピーゲルマーの単回ｉ．ｖ．注射による外因性グレリン投与後の成長ホルモン放出の阻害を示す。
【図４４】ラットにおける摂餌量へのグレリン（それぞれ、１６．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、３３．４ｎｍｏｌ／ｋｇ、８３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単回ｉ．ｐ．投与の効果を示す。
【図４５】ラットにおけるグレリンで刺激されるＧＨ放出への抗グレリンスピーゲルマーの異なる用量の効果を示す；ＧＨ放出を３ｎｍｏｌｅのグレリンの単回静脈内投与で誘導し（Ａ）、そしてＧＨのグレリン誘発性放出は、１５ｎｍｏｌｅ（Ｃ）および３０ｎｍｏｌｅ（Ｄ）の抗グレリンスピーゲルマーの事前の静脈内投与により抑制されたが、３ｎｍｏｌｅの抗グレリンスピーゲルマー（Ｂ）では抑制されなかった。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、グレリンのアンタゴニスト、グレリンに結合する核酸、そのような核酸の使用、そのような核酸を含んでなる組成物および複合体、標的分子に結合する核酸の作製および／もしくは同定の方法、標的分子に結合するＬ−核酸の作製の方法ならびにグレリンアンタゴニストのスクリーニングの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリンは、成長ホルモン分泌促進因子受容体１ａ（ＧＨＳＲ １ａ）の天然リガンドとして同定された。該受容体は、下垂体においてそして脳の視床下部部分において最も豊富であるが、他の組織においても低濃度で検出することができる。７０年代後半以来、分泌促進因子と名付けられた合成ペプチドおよび他の化合物は、成長ホルモンの放出を刺激することが示されていた。しかしながら、成長ホルモンの放出に関与する天然リガンドは、１９９９年におけるグレリンの発見まで依然として不明であった。グレリンは、そのＮ末端の第三のアミノ酸（セリン３）でオクタノイル酸側鎖を有する非常に塩基性の２８アミノ酸のペプチドホルモンである。この珍しい修飾は、ＧＨＳ受容体での相互作用およびその活性に必要とされる。精製されたラットグレリンのアミノ酸配列は、ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲであるとタンパク質シーケンサーにより決定された。
【０００３】
グレリンは、タンパク同化状態に関する生理的機能を媒介することが示されている。それは下垂体からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出を直接刺激するが、視床下部ニューロンに作用することによりＧＨに依存しない方法で摂食行動を誘導することもまたげっ歯類における実験によりグレリンに示された。興味深いことに、グレリン生産の主要部位は胃の胃酸分泌腺においてであり、それが胃、下垂体および視床下部の間のホルモンリンクとして働くことを示唆する。ラットにおけるグレリン投与は、エネルギー摂取および／もしくは燃料利用における変化の結果として体重増加をもたらしたという結果は、そのような役割を裏付ける。さらに、ヒトにおける全身グレリン投与は、試験被験体において空腹感を引き起こし、そして過食を誘導する。これらの結果に基づいて、グレリンは、食欲および体重の調節において重要な役割を有し、栄養不良状態の急性ならびに慢性シグナルとして働くと考えられる。この仮説のさらなる裏づけは、グレリンレベルならびに食欲が胃バイパス後の個体において減少され、体重減少をもたらすことにおける該処置の効率に少なくとも部分的に寄与するという結果によってもたらされる。プラダーウィリ症候群にかかっている患者からの臨床データもまた、該疾患と関連する過食症および肥満症が著しい高グレリン血症の結果であることを示唆する。さらに、グレリンは、高血糖およびインシュリン放出の阻害を誘導することが見出され、グルコース代謝への関与を示唆する。エネルギー代謝におけるこれらの機能に加えて、グレリンはまた多数の他のプロセスにも関係があるとされている。それは、多数の神経内分泌腫瘍において発現され、そして下垂体からのＧＨ放出に加えて、ＡＣＴＨ、ＰＲＬおよびコルチゾールの放出を刺激することが見出された。健常人へのグレリンの単回注射は、心拍出量を増加しそして血圧を減少することが見出された。従って、グレリンの作用は、様々な異なるタスクに関与しているようである。背景となる情報は、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９から取り出すことができる。
【非特許文献１】Ｍ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｈ．Ｈｏｓｏｄａ，Ｙ．Ｄａｔｅ，Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ，Ｈ．Ｍａｔｓｕ，Ｋ．Ｋａｎｇａｗａ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａｃｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｓｔｏｍａｃｈ”，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：６５６−６０，１９９９
【非特許文献２】Ｍ．Ｔｓｃｈｏｐ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．Ｈｅｉｍａｎ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｄｉｐｏｓｉｔｙ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：９０８−１３，２０００
【非特許文献３】Ａ．Ｍ．Ｗｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｈｒｅｌｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｐｐｅｔｉｔｅ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８６：５９９２−６，２００１
【非特許文献４】Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｅｄｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：１９４−８，２００１
【非特許文献５】Ｎ．Ｎａｇａｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１ Ｍａｙ；２８０（５）：Ｒ１４８３−７；Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｈｒｅｌｉｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．
【非特許文献６】Ｖｏｌａｎｔｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００２ Ｍａｒ；８７（３）：１３００−８．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ＧＨ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ．
【非特許文献７】Ｊｅｆｆｅｒｙ ＰＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２ Ｍａｒ；１７２（３）：Ｒ７−１１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｈｒｅｌｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．
【非特許文献８】Ｅｇｉｄｏ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２ Ｆｅｂ；１４６（２）：２４１−４ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｈｒｅｌｉｎ ｏｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．
【非特許文献９】Ｂｒｏｇｌｉｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００１ Ｏｃｔ；８６（１０）：５０８３−６，Ｇｈｒｅｌｉｎ，ａ ｎａｔｕｒａｌ ＧＨ ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｏｍａｃｈ，ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．
【発明の開示】
【０００４】
［発明の要約］
本発明の基礎となる問題は、グレリンの特異的アンタゴニストを提供することである。本発明の基礎となる問題のさらなる態様は、成長ホルモン分泌促進因子受容体１ａ（ＧＨＳＲ １ａ）の特異的アンタゴニストを提供することである。本発明の基礎となる問題の別の態様は、グレリンおよびＧＨＳＲ １ａ受容体にそれぞれ関する疾患および障害の処置のための化合物を提供することである。
【０００５】
本発明の基礎となる問題は、第１の態様としてグレリンのアンタゴニストにより解決され、ここで、該アンタゴニストは核酸である。好ましい実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）として、該核酸はグレリンに結合している。
【０００６】
本発明の基礎となる問題は、第１の態様としてＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニストにより解決され、ここで、該アンタゴニストは核酸である。好ましい実施形態として、該核酸は該受容体のリガンドに結合しており、そしてここで、該リガンドは好ましくはグレリンである。
【０００７】
本発明の第１および第２の態様の実施形態として、核酸は少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる。
【０００８】
本発明の第１および第２の態様の好ましい実施形態として、アンタゴニストはＬ−核酸である。
【０００９】
本発明の第１および第２の態様のさらに好ましい実施形態として、核酸は本明細書に開示するとおりの核酸である。好ましくは、核酸は、本発明の第３および第４の態様に記載の核酸である。
【００１０】
本発明の基礎となる問題は、第３の態様としてグレリンに結合する核酸により解決される。好ましくは、核酸はＬ−グレリンに結合するＬ−核酸である。
【００１１】
好ましい実施形態として、Ｌ−核酸は本明細書に開示するとおりの核酸である。好ましくは、核酸は、本発明の第４の態様に記載の核酸である。
【００１２】
本発明の基礎となる問題は、第４の態様として配列番号７〜配列番号１２５に記載の配列を含んでなる群から選択される配列を有する核酸により解決される。
【００１３】
ある実施形態として、核酸は少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる。
【００１４】
好ましい実施形態として、核酸はＬ−核酸である。
【００１５】
さらなる実施形態として、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡおよびその組み合わせを含んでなる群から選択される。
【００１６】
好ましい実施形態として、核酸のＫｄは１μＭ未満、好ましくは０．２５μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満、そして最も好ましくは０．０１μＭ未満である。
【００１７】
さらに好ましい実施形態として、核酸のＫｄは１００ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きく、より好ましくは１ｎＭより大きく、そして最も好ましくは０．０５ｎＭより大きい。
【００１８】
さらに好ましい実施形態として、核酸は１５〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチドおよび３０〜５０ヌクレオチドを含んでなる群から選択される長さのものである。
【００１９】
なおさらなる実施形態として、核酸は最小結合モチーフを含んでなる。
【００２０】
本発明の第３〜第６の態様の別の好ましい実施形態として、核酸は少なくとも二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）構造を有する。
【００２１】
本発明の基礎となる問題は、第５の態様として、グレリンおよび／もしくはＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニストとしての本発明の核酸、好ましくは、本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸の使用により解決される。
【００２２】
本発明の基礎となる問題は、第６の態様として、標的分子がグレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子と接触させる段階；
ｃ）標的分子と相互作用しない核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；
ｄ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；および
ｅ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）をシーケンスする段階
を含んでなる標的分子に結合する核酸の、好ましくは請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸の作製および／もしくは同定の方法により解決される。
【００２３】
該方法のある実施形態として、段階ｃ）の後で段階ｃａ）を実施し、ここで、段階ｃａ）は標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）の増幅からなる。
【００２４】
好ましい実施形態として、段階ｂ）〜ｄ）を繰り返す。
【００２５】
さらに好ましい実施形態として、核酸の不均一集団は本発明の少なくとも１つの核酸を含んでなる。好ましくは、本発明の核酸は、本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。
【００２６】
本発明の基礎となる問題は、第７の態様によれば、標的分子がＬ−グレリンであり、そして標的分子の光学対掌体がＤ−グレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）Ｄ−核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる段階；
ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する段階；
ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸をシーケンスする段階；および
ｅ）段階ｄ）において得られるＤ−核酸（１つもしくは複数）の配列と同一であるＬ−核酸配列（１つもしくは複数）を合成する段階；
を含んでなる自然立体配置における標的分子に結合するＬ−核酸の作製の方法により解決される。
【００２７】
該方法のある実施形態として、段階ｃ）の後で以下の段階：
ｃａ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸を増幅する段階
を導入する。
【００２８】
好ましい実施形態として、段階ｂ）〜ｅ）を繰り返す。
【００２９】
さらに好ましい実施形態として、核酸の不均一集団は本発明の核酸を含んでなる。好ましくは、核酸は、本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。
【００３０】
本発明の基礎となる問題は、第８の態様として、薬剤の製造のための本発明の核酸のそして／もしくは本発明のアンタゴニストの使用により解決される。あるいはまた、上記の使用は美容製品の製造のためである。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらに好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは、本発明の第１および／もしくは第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３１】
さらなる実施形態として、薬剤は肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧ならびに／または心臓血管疾患を含んでなる群から選択される疾患もしくは障害の処置用である。さらなる実施形態として、美容製品は、食欲および体重管理用そして／もしくは肥満症用である。
【００３２】
第９の態様として、本発明の基礎となる問題は、本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニスト、ならびに製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物、好ましくは製薬学的組成物により解決される。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらに好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３３】
第１０の態様として、本発明の基礎となる問題は、グレリンおよび本発明の核酸のいずれかを含んでなる複合体により解決される。好ましい実施形態として、複合体は結晶性複合体である。なおさらなる実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。
【００３４】
第１１の態様として、本発明の基礎となる問題は、グレリンの検出のための本発明の核酸のそして／もしくは本発明のアンタゴニストのいずれかの使用により解決される。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらなる好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３５】
第１２の態様として、本発明の基礎となる問題は以下の段階：
−候補グレリンアンタゴニストを準備する段階；
−本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニストを準備する段階；
−グレリンアンタゴニストの存在下でシグナルを与える試験系を準備する段階；および
−候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるかどうかを決定する段階
を含んでなるグレリンアンタゴニストのスクリーニングの方法により解決される。好ましい実施形態として、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらなる好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
【００３６】
第１３の態様として、本発明の基礎となる問題は、本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニストを含んでなるグレリンの検出のためのキットにより解決される。好ましくは、本発明の核酸は本発明の第３および／もしくは第４の態様に記載の核酸である。さらなる好ましい実施形態として、本発明のアンタゴニストは本発明の第１および第２の態様に記載のアンタゴニストである。
［発明の詳細な記述］
グレリンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドであり、そして脂肪酸側鎖で修飾されている。グレリンの計算されたｐＩは、１１．０９である。本明細書において用いる場合、グレリンという用語は、哺乳類グレリンが包含されるがこれらに限定されるものではない任意のグレリンをさす。好ましくは、哺乳類グレリンは、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターおよびヒトグレリンを含んでなる群から選択される。最も好ましくは、グレリンはヒトグレリンである。
【００３７】
本発明は、グレリンに特異的にそして高い親和性で結合する核酸を作製することが可能であるという驚くべき発見に基づく。塩基性タンパク質を対象とするアプタマー（すなわち、標的分子に結合する核酸）の作製は、この種の標的は高いが非特異的なシグナル対ノイズ比をもたらすので一般に非常に難しいことをＥａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．；Ｇｏｌｄ，Ｌ．；Ｈｉｃｋｅ，Ｂ．Ｊ．；Ｊａｎｊｉｃ，Ｎ．；Ｊｕｃｋｅｒ，Ｆ．Ｍ．；Ｓｅｂｏｓｔａ，Ｄ．Ｐ．；Ｔａｒａｓｏｗ，Ｔ．Ｍ．；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．Ｃ．；Ｚｉｃｈｉ，Ｄ．Ａ．；Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ５，Ｎｏ．６；ｐｐ１０８７−１０９６，１９９７）が認めた限りにおいてこの発見は驚くべきことである。この高いシグナル対ノイズ比は、塩基性標的に対する核酸により示される高い非特異的な親和性に起因する。
【００３８】
本明細書に記述するような本発明の核酸の特徴は、該核酸を単独でもしくは任意の組み合わせで用いる本発明の任意の態様において実現することができる。
【００３９】
本発明の核酸はまた、本明細書に開示する特定の配列に本質的に相同である核酸も含んでなるものとする。実質的に相同なという用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％より大きいように理解されるものとする。
【００４０】
本発明の核酸（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）もしくは本発明の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）という用語はまた、本明細書に開示する核酸配列の一部を含んでなる核酸も含んでなるものとする（好ましくは、該一部はグレリンへの結合に関与する限りにおいて）。そのような核酸は、例えばトランケーションにより、本明細書に開示するものから得ることができる。トランケーションは、本明細書に開示するような核酸の末端のいずれかもしくは両方に関することができる。また、トランケーションは、ヌクレオチドの内部配列に関することもでき、すなわち、それは、それぞれ、５’および３’末端ヌクレオチド間のヌクレオチド（１つもしくは複数）に関することができる。さらに、トランケーションは、本明細書に開示する核酸の配列からの単一のヌクレオチドほどの欠失を含んでなるものとする。トランケーションはまた、本発明の核酸（１つもしくは複数）の１ストレッチより多くに関することもでき、ここで、該ストレッチは、わずか１ヌクレオチドの長さほどであることができる。本発明の核酸のトランケーションの例は、本記述の実施例部分に記述されている。
【００４１】
本発明の核酸は、Ｄ−核酸もしくはＬ−核酸のいずれかであることができる。好ましくは、本発明の核酸はＬ−核酸である。さらに、核酸の１つもしくはいくつかの部分はＤ−核酸として存在するかまたは核酸の少なくとも１つもしくはいくつかの部分はＬ−核酸であることが可能である。核酸の「部分」という用語は、わずか１ヌクレオチドほどを意味するものとする。そのような核酸は、それぞれ、Ｄ−およびＬ−核酸と本明細書において一般に呼ばれる。
【００４２】
本発明の核酸はさらに長い核酸の一部であり、ここで、このさらに長い核酸はいくつかの部分を含んでなり、ここで、少なくとも１つの部分は本発明の核酸もしくはその一部であることもまた本発明の範囲内である。これらのさらに長い核酸の他の部分は、Ｄ−核酸もしくはＬ−核酸のいずれかであることができる。任意の組み合わせを本発明に関連して用いることができる。さらに長い核酸のこれらの他の部分（１つもしくは複数）は、結合することと異なる機能を示すことができる。１つの可能な機能は、例えば、固定化、架橋、検出もしくは増幅のためのような他の分子との相互作用を可能にすることである。
【００４３】
Ｌ−核酸は、本明細書において用いる場合、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＬ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【００４４】
Ｄ核酸は、本明細書において用いる場合、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくはＤ−ヌクレオチドから完全になる核酸である。
【００４５】
本発明の核酸がＤ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドもしくは両方の組み合わせ（該組み合わせは、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなるストレッチのランダムな組み合わせもしくは定義された配列である）からなるかどうかにかかわらず、該核酸はデオキシリボヌクレオチド（１つもしくは複数）、リボヌクレオチド（１つもしくは複数）もしくはその組み合わせからなることができる。
【００４６】
本発明の核酸をＬ−核酸として設計することは、いくつかの理由で有利である。Ｌ−核酸は、天然に存在する核酸の鏡像異性体である。Ｄ−核酸は、しかしながら、ヌクレアーゼの広範囲に及ぶ存在のために水溶液においてそして特に生体系もしくは生体サンプルにおいてあまり安定ではない。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞からのヌクレアーゼは、Ｌ−核酸を分解することができない。このために、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物および人体を包含するそのような系において有意に増加される。Ｌ−核酸の分解性を欠くことのために、いかなるヌクレアーゼ分解産物も生成されず、従って、それに起因するいかなる副作用も認められない。この態様は、グレリンの存在に関する疾患および／もしくは障害の治療において使用する事実上全ての他の化合物のＬ−核酸の範囲を定める。
【００４７】
本発明の核酸は、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸もしくはＤ，Ｌ−核酸として存在するかどうかまたはそれらがＤＮＡもしくはＲＮＡであるかどうかにかかわらず、一本鎖もしくは二本鎖核酸として存在することができることもまた本発明の範囲内である。典型的に、本発明の核酸は、一次配列のために確定される二次構造を示し、従って３次構造を形成することもできる一本鎖核酸である。しかしながら、本発明の核酸はまた、相互に相補的である２本の鎖が相互にハイブリダイズしているという意味において二本鎖であることもできる。これは核酸に安定性を与え、それは、核酸がＬ−形態よりむしろ天然に存在するＤ−形態で存在する場合に有利である。
【００４８】
本発明の核酸は、修飾することができる。そのような修飾は、核酸の単一のヌクレオチドに関することができ、そして当該技術分野において周知である。そのような修飾の例は、とりわけ、Ｋｕｓｓｅｒ，Ｗ．（２０００）Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４：２７−３８；Ａｕｒｕｐ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２２，２０−４；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２３，２０１９−２４；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２，６３３−８；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２，６８３−９５；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，３６，８３１−４１;Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７８３２−８；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，４６９，２１３−４３に記述されている。
【００４９】
本発明の核酸は、多くの部分に分かれた核酸であることができる。多くの部分に分かれた核酸は、本明細書において用いる場合、少なくとも２本の核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２本の核酸鎖は機能単位を形成し、ここで、該機能単位は標的分子に対するリガンドである。少なくとも２本の核酸鎖は、２本の鎖を生成するように核酸を切断することによりもしくは本発明の、すなわち全部の核酸の第１の部分に対応する１つ核酸および全部の核酸の第２の部分に対応する別の核酸を合成することにより本発明の核酸のいずれかから得ることができる。切断および合成の両方とも、上記に例示するような２本より多い鎖がある多くの部分に分かれた核酸を作製するために適用することができると認識されるべきである。言い換えれば、少なくとも２本の核酸鎖は、様々な核酸部分間のある程度の相補性は存在し得るが、相補的でありそして相互にハイブリダイズする２本の鎖と典型的に異なる。
【００５０】
結合定数を決定する可能性は、いわゆるビアコア装置の使用であり、それもまた当業者に既知である。親和性もまた、本明細書において用いる場合、実施例に記述するような「ビーズアッセイ」の使用により測定された。本発明の場合グレリンである標的への本発明の核酸間の結合の強さを表すために適切な尺度は、いわゆるＫｄ値であり、それはその決定の方法と同様に当業者に周知である。
【００５１】
本発明の核酸は、ある種のＫｄ値を特徴とする。好ましくは、本発明の核酸により示されるＫｄ値は１μＭ未満である。約１μＭのＫｄ値は、標的への核酸の非特異的な結合に特徴的であると言われる。当業者により認識されるように、本発明の核酸のような一群の化合物のＫｄ値は、ある範囲内である。約1μＭの上記のＫｄは、Ｋｄ値の好ましい上限値である。標的結合核酸のＫｄの好ましい下限値は、約１０ピコモル以上であることができる。グレリンに結合する個々の核酸のＫｄ値は、好ましくは、この範囲内であることは本発明の範囲内である。好ましい範囲は、この範囲内の任意の第１の数およびこの範囲内の任意の第２の数を選択することにより定義することができる。好ましい上限値は０．２５μＭ、０．１μＭおよび０．０１μＭであり、好ましい下限値は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．０５ｎＭである。
【００５２】
本発明の核酸分子は、それらが依然として標的分子に結合することができるならば任意の長さを有することができる。本発明の核酸の好ましい長さがあることは当該技術分野において認識される。典型的に、該長さは１５〜１２０ヌクレオチドの間である。１５〜１２０の間の任意の整数が本発明の核酸の可能な長さであることは当業者により認識される。本発明の核酸の長さのさらに好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５０ヌクレオチドおよび約３０〜５０ヌクレオチドの長さである。
【００５３】
グレリンに結合しそして特に本明細書に開示するようなさらなる特徴および特性を有する核酸の作製および／もしくは同定のための本明細書に開示する本発明の方法は、米国特許５，４７５，０９６に従がういわゆるＳＥＬＥＸプロセスに基づく。基本的に、ＳＥＬＥＸプロセスは以下の段階：
ａ）核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子と接触させる段階；
ｃ）標的分子と相互作用しない核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；
ｄ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；および
ｅ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）をシーケンスする段階
を含んでなる。
【００５４】
ＳＥＬＥＸプロセスの正確な操作は、当業者に既知である。
【００５５】
好ましくは、ＳＥＬＥＸプロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる標的分子に結合する個々の核酸の増幅を含んでなる。この増幅を実現することにより、さらに高い割合の非特異的ヌクレオチド導入を実現することができ、それは、結合核酸の一次配列の変化をもたらす。これらの変化のために、とりわけ、増大した親和性もしくは特異性のような出発配列の一つと異なる結合特性を示す新しい配列を作製することができる。
【００５６】
本発明の配列は、選択プロセスの出発材料となる核酸ライブラリーのメンバーのランダム化部分に完全にもしくは部分的に由来することは本発明の範囲内である。しかしながら、本発明の配列は、選択プロセスの出発材料となる核酸ライブラリーのメンバーの非ランダム化部分に完全にもしくは部分的に由来することもまた本発明の範囲内である。そのような非ランダム化部分は、例えば、増幅プライマーの結合部位として用いる部分である。
【００５７】
グレリンに結合するＬ−核酸の作製のための本発明の方法は、国際特許出願ＷＯ９８／０８８５６に従属しているＦｕｒｓｔｅ ｅｔ ａｌ．の方法に基づく。基本的に、この方法は以下の段階：
ａ）Ｄ−核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる段階；
ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する段階；
ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸をシーケンスする段階；および
ｅ）段階ｄ）において得られるＤ−核酸（１つもしくは複数）の配列と同一であるＬ−核酸配列（１つもしくは複数）を合成する段階；
を含んでなる。
【００５８】
本発明によれば、光学対掌体はグレリンである。光学対掌体は、ペプチドを形成するアミノ酸の全てがＤ−アミノ酸であることを意味するＤ−ペプチドとして存在する。標的分子、すなわち、グレリンはＬ−鏡像異性体として存在する。Ｌ−鏡像異性体はＬ−アミノ酸からなり、そして天然に存在する形態である。
【００５９】
該プロセスを実現する方法に関するプロトコルは、当業者に既知である。
【００６０】
本発明の核酸のいずれも、本発明のグレリンに結合する核酸の作製および／もしくは同定の方法ならびに／またはグレリンに結合するＬ−核酸の作製の方法にそれぞれ使用できることもまた本発明の範囲内である。
【００６１】
本明細書において本発明の核酸および／もしくは本発明のアンタゴニストとも呼ばれる本発明の核酸は、薬剤の作製もしくは製造に用いることができる。そのような薬剤は、場合によりさらなる製薬学的活性化合物と一緒に、本発明の核酸の少なくとも１つを含有し、ここで、本発明の核酸は、好ましくは、製薬学的活性化合物それ自体として作用する。そのような薬剤は、好ましい実施形態として、少なくとも製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。そのような担体は、例えば、水、バッファー、澱粉、糖、ゼラチンもしくは任意の他の許容しうる担体物質であることができる。そのような担体は、一般に、当業者に既知である。そのような薬剤をその処置および／もしくは予防に用いることができる疾患および／もしくは障害および／もしくは病的症状には、肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧ならびに心臓血管疾患が包含されるが、これらに限定されるものではない。当業者により認識されるように、本発明の核酸は、グレリンのアンタゴニストをそのようなアンタゴニストを必要とする患者に投与することができそしてそのようなアンタゴニストが疾患もしくは障害の原因を取り除くためにまたは少なくとも疾患もしくは障害からの影響を減らすために適当である任意の疾患において事実上用いることができる。そのような影響には、肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍処置、血圧ならびに心臓血管疾患が包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的のためにエネルギーバランスの調節は疾患と見なされる。さらに特に、該使用は、エネルギーバランスの調節がグレリンにより直接的にもしくは間接的に影響を受けそしてグレリンの生物学的利用能の減少が所望される任意の疾患の処置のためである。同じことが糖代謝、血圧ならびに食欲および体重に当てはまる。場合により全身もしくは局所使用で、本発明の核酸を用いて処置することができるさらなる疾患は、下垂体腫瘍、先端巨大症、中心性（ｃｅｎｔｒａｌ）クッシング症候群、副腎性クッシング症候群、腫瘍随伴性クッシング症候群、異所性クッシング症候群、副腎腫瘍、ストレス、副腎皮質機能亢進症、心不全、心筋梗塞、発作、副腎皮質不全、低血圧症、大動脈弁狭窄症、肺緊張亢進（ｐｕｌｍｏｎａｌ ｈｙｐｅｒｔｏｎｉａ）、収縮性心内膜炎、感染症、感染性中毒性低血圧症、血液量減少および低ナトリウム血症を含んでなる群から選択することができるものである。
【００６２】
本発明の核酸ならびにアンタゴニストは、薬剤としてもしくは薬剤の製造のためにだけでなく、美容目的に、特に肥満症におけるグレリンの関与に関しても使用できると理解されるべきである。同じ目的のために、本発明の核酸ならびにアンタゴニストは、食品添加剤、体重管理の手段および／もしくは食欲制御の手段として用いることができる。本発明の核酸ならびにアンタゴニストを含んでなる組成物は、上記の目的のいずれかに用いることができる。
【００６３】
本発明の核酸はさらに、薬剤設計の出発材料として用いることができる。基本的に、２つの可能な方法がある。１つの方法は、化合物ライブラリーのスクリーニングであり、一方、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは、低分子量化合物ライブラリーである。そのようなライブラリーは、当業者に既知である。あるいはまた、本発明の核酸は、薬剤の合理的設計に用いることができる。
【００６４】
薬剤の合理的設計は、本発明の核酸のいずれかから開始することができ、そして本発明の核酸の構造に類似するかもしくは本発明の核酸の構造の結合媒介部分と同一である構造、好ましくは３次元構造を含む。いずれの場合でもそのような構造は、本発明の核酸と同じもしくは同様の結合特性を依然として示す。薬剤の合理的設計におけるさらなる段階においてもしくは代替段階として、神経伝達物質に結合する核酸のそれらの部分の好ましくは３次元構造をヌクレオチドおよび核酸と異なる化学基で模倣する。この模倣により核酸と異なる化合物を設計することができる。そのような化合物は、好ましくは、小分子もしくはペプチドである。
【００６５】
当業者に既知である競合アッセイを用いることによるような、化合物ライブラリーのスクリーニングの場合、適切なグレリンアナログ、グレリンアゴニストもしくはグレリンアンタゴニストを見出すことができる。そのような競合アッセイは、下記のように設定することができる。本発明の核酸、好ましくは標的結合Ｌ−核酸であるスピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）を固相に連結する。グレリンアナログを同定するために標識したグレリンをアッセイに加えることができる。可能性があるアナログは、スピーゲルマーに結合するグレリン分子と競合し、それはそれぞれの標識により得られるシグナルの減少と同調する。アゴニストもしくはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者に既知であるような細胞培養アッセイの使用を含むことができる。
【００６６】
本発明のキットは、本発明の核酸の少なくとも１つもしくはいくつかを含んでなることができる。さらに、該キットは、少なくとも１つもしくはいくつかの陽性もしくは陰性コントロールを含んでなることができる。陽性コントロールは、例えばグレリン、特に本発明の核酸が、好ましくは液状で、それに対して選択されるかもしくはそれに結合するものであることができる。陰性コントロールは、例えば、グレリンと同様の生物物理学的性質に関して定義されるが本発明の核酸により認識されないペプチドであることができる。さらに、該キットは、１つもしくはいくつかのバッファーを含んでなることができる。様々な成分は、乾燥もしくは凍結乾燥形態でキットに含有するかまたは液体に溶解することができる。キットは１つもしくはいくつかの容器を含んでなることができ、それらはまたキットの１つもしくはいくつかの成分を含有することができる。
【００６７】
本発明は、図面、実施例および配列表によりさらに説明され、それらからさらなる特徴、実施形態および利点を理解することができる。
【００６８】
以下の表は、配列番号と本明細書に記述する様々なクローンおよび識別名をそれぞれ結び付ける。クローンＢ１１〜Ｇ５は２つの異なる形態で存在することが理解されるべきである。本明細書において「完全」と称する形態は、使用するプールのランダム化ストレッチもしくはその一部ならびにＤＥ．４０Ｆプライマー配列およびＤＥ．４０Ｒプライマーを含んでなり、一方、本明細書において「コア」と称する形態は、それぞれの完全な形態から作製された最小結合モチーフである。別に示されない限り、表す鎖は（＋）鎖であり、そして使用する核酸は２’ＯＨ ＲＮＡである。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】
［実施例］
【実施例１】
【００７３】
手動インビトロ選択
標的分子
ビオチニル化ラットＤ−グレリン（アミノ酸配列、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（オクタノイル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりカスタム合成された。選択中に使用したペプチドは、ビオチン−ニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）相互作用を用いて結合していない核酸種からの分別を可能にするためにＣ末端にビオチン部分を含有する。
選択プール、開始プールの作製
選択プールＤＥ．４０は、５’末端でＴ７プロモーター保有３８ｎｔプライマーそして３’末端で２０ｎｔリバースプライマーが隣接する４０ヌクレオチドのランダム領域からなる。Ｔ７プライマーは、転写開始配列、続いてフォワードプライマー配列を保有する。フォワードプライマーは、転写効率を高めるためにグアノシントリプレットから始まる。
ＤＥ．４０−プール（ＲＮＡに対して補正する）
ＲＮＡ−プール：５’−ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＡＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＣＴＣ Ｇ ＴＧ−Ｎ４０−ＣＡ ＣＧＴ ＡＣＣ ＡＣＴ ＧＴＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＡＣ−３’
逆相補物：５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＧ ＴＧ−Ｎ４０−ＣＡ ＣＧＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＡＧ ＣＴＣ Ｃ−３’
ＤＥ．４０Ｔ７：５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＧ−３’
ＤＥ．４０Ｒ：５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＧ−３’
（Ｔ７プロモーターに下線を引く）
アニーリング温度を理論的に計算し、そしてプライマーのアニーリングの温度および時間を変えるいくつかの実験により後で最適化した。
【００７４】
【表４】
【００７５】
Ｔｍ＝融解温度、Ｔｐ＝２２＋１．４６ｘ［２ｘ（＃ＧＣ）＋（＃ＡＴ）］（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．：ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０，２３３（１９９１））；Ｔ７プロモーター領域のない
プールを化学的に合成し、塩基組成を決定し、そして１ｘ１０Ｅ１５の異なる分子の複雑さ＝１．７８ｎｍｏｌの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をワンステップＰＣＲにより増幅した。２−Ｆ’−ＲＮＡ開始プールでは、プロトコル１を用いて１．７８ｎｍｏｌの二本鎖ＤＮＡを２’フルオロ修飾ピリミジン（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を使用して転写し；ＲＮＡプールは、プロトコル２を用いて非修飾ヌクレオチドで転写した。
【００７６】
【表５】
【００７７】
【表６】
【００７８】
ラットＤ−グレリン結合アプタマーのインビトロ選択
選択バッファー
全選択中に使用する選択バッファーは、ヒト血液における生理条件に従った（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２）。ｐＨ７．４は、３７℃で調整した。
選択およびストリンジェンシー
Ｄ−グレリン（「標的」）結合アプタマーの選択は、２’−フルオロ修飾ＤＥ．４０プール（２’Ｆ−ＲＮＡ）および非修飾ＲＮＡプール（ＲＮＡ）を用いて実施した。標的へのプールの結合は、溶液中で２時間（１０μＭ〜１０ｎＭのペプチド）および１２時間（１０ｎＭ〜５００ｐＭ）行われた。ペプチド−ＲＮＡ複合体の固定化は、ストレプトアビジン／ニュートラアビジン−ビオチン系を用いて行った。ビオチニル化ペプチドをニュートラアビジン誘導（ｄｅｒｉｖａｔｅｄ）アガロースもしくはストレプトアビジン結合ポリアクリルアミド（ｓ．ｃ．ウルトラリンク）と３７℃で１０分間インキュベーションし、そして短時間の遠心分離により分離した。その後でマトリックスを選択バッファーで洗浄して結合していないプールと弱く結合するプールを除いた。高親和性での標的への結合にマトリックスを必要とする、２価のアプタマーの生成を防ぐために２ラウンドごとのマトリックス交換を行った（ニュートラアビジン−アガロースから開始する）。結合ＲＮＡおよび２’Ｆ−ＲＮＡの溶出は、シェーカーにおいて１０分間２段階（３７℃、６５℃）で４Ｍグアニジンチオシアネートでペプチド−ＲＮＡ複合体を変性させることにより実施した。ラウンド１３からは第３の溶出段階を９５℃で実施した。溶出ＲＮＡもしくは２’Ｆ−ＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出してペプチドを除き、イソプロパノールで沈殿させ、そしてＰＣＲにより増幅した。
ＲＮＡ／２’Ｆ−ＲＮＡのフォールディング
アプタマーの２価の独立したフォールディングを防ぐために、氷上での変性および再生をＭｇ２＋およびＣａ２＋なしに行った。プールをＰＣＲサイクラーにおいて９５℃で５分間変性させ、そしてクラッシュアイス上で２分間スナップ冷却した。その後でＴｗｅｅｎ ２０（最終濃度０．１％）および２価のカチオンを１０倍ミックスから加え、そして３７℃でさらに１０分間インキュベーションした。反応物をプレカラムに直接加えた。
プレカラム
ペプチドを溶液に加える前にプールＲＮＡを純粋なマトリックスとインキュベーションする。これは、マトリックス結合アプタマーの濃縮を防ぐために行う。プレカラムのマトリックス容量は、ＲＮＡ−ペプチド複合体を結合していない種から分離するために用いるメインカラムといつも同じ容量であった。純粋なマトリックスをフォールディングしたＤＥ．４０プールと一緒にシェーカーにおいて３７℃で１０〜１５分間インキュベーションし、結合していないプールを取り除き、そして溶液中のグレリン結合反応物に直接加えた。
溶液中での結合および複合体の固定化
ある濃度を有するビオチニル化Ｄ−グレリンをプールにそれをプレカラムから取り除いた後に直接加えた。ＲＮＡおよび２’Ｆ−ＲＮＡでの選択に使用したペプチド濃度の勾配を図４Ａおよび図４Ｂに示す。ｂｉｏ−グレリン結合ＲＮＡ複合体の固定化は、結合反応物へのマトリックスの直接添加および８００ｒｐｍでサーモシェーカーにおける３７℃で１０分間のインキュベーションにより実施した。
分別
固定化された複合体を予熱した選択バッファーで数回洗浄して結合していない分子と弱く結合する分子を取り除いた。洗浄段階は、５ｘ１００μｌでそしてラウンド１３からは５ｘ１０００μｌの選択バッファーで行った。
結合分子の溶出
結合ＲＮＡおよび２Ｆ’ＲＮＡの溶出は、ペプチド−ＲＮＡ複合体をシェーカーにおいて１０分間２段階（３７℃、６５℃）で４Ｍグアニジンチオシアネートで変性させることにより実施した。ラウンド１３からは、９５℃での第３の溶出段階を実施した。各選択ラウンドに使用した全核酸に対するパーセントでの溶出ＲＮＡおよび２’Ｆ−ＲＮＡの経過を図５および図６に示す。バックグラウンドシグナルとグレリン媒介シグナルとを区別するために、コントロールカラム（いかなるペプチドも加えない）を各ラウンドで行った。コントロールカラムでのシグナルは、ノイズもしくはバックグラウンドシグナルと定義した。グレリン媒介シグナル対ノイズシグナルの比を図１および図２に示す。シグナル対ノイズ比が増加するたびに次の選択ラウンドにおける標的濃度を下げることによりストリンジェンシーを上げた。その後で、異なるペプチド濃度でのシグナル−ノイズ比の別の増加が得られるまでペプチド濃度を一定レベルで保った。該比の増加は、あるペプチド濃度での結合アプタマーの濃縮の手掛かりである。溶出ＲＮＡもしくは２’−Ｆ−ＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出してペプチドを除き、イソプロパノールで沈殿させ、そしてＰＣＲにより増幅した。
ダブルラウンドおよび結合試験
ダブルラウンドは、増幅なしの２回の後続選択ラウンドのプロセスを表す。第１の選択ラウンドｓ．ｃ．コレクションラウンド（ＣＲ）は、結合しないアプタマーを除去するために比較的高濃度の標的で全てのＤ−グレリン結合アプタマーを集めるために用いる。結合ＲＮＡ／２’−Ｆ−ＲＮＡの溶出および抽出の後に溶出核酸をそれを増幅せずに次のラウンドに使用する。このラウンドはダブルラウンド（ＤＲ）と呼ばれ、そして通常は非常に低い濃度の標的で行う。選択のこのプロセスは、アプタマーの増幅およびフォールディング／再フォールディングの圧力を除くために用いる。
【００７９】
これらの選択において３回のダブルラウンドを行った（ＲＮＡではラウンド１２、１３、１４そして２’−Ｆ−ＲＮＡではラウンド１４、１５、１６）。各コレクションラウンド（ＣＲ）の前に広範囲の標的濃度にわたる「結合の試験」を実施してアプタマーを集めるために最もよい標的濃度を評価した。この試験はまた、ラウンドごとのプール濃縮の向上をモニターするためにも用いる。これらのダブルラウンドおよび結合の試験の結果を図７Ａ、７Ｂ、８Ａおよび８Ｂに示す。
増幅
抽出および沈殿
溶出ＲＮＡもしくは２’Ｆ−ＲＮＡをフェノール−クロロホルム抽出により精製し、そしてキャリアとして２μｌのグリコーゲン、０．３Ｍの酢酸ナトリウム ｐＨ５．５および１容量のよく冷えたイソプロパノールで−２０℃で２０〜３０分間沈殿させた。
逆転写（ＲＴ）
沈殿したＲＮＡ／２’Ｆ−ＲＮＡを逆転写酵素を用いることにより一本鎖ＤＮＡに翻訳した。３０μｌの反応当たり５ｐｍｏｌ以下の鋳型をリバースプライマーと一緒に０．８Ｍのベタインにおいて９５℃で５分間変性させ、リバースプライマーを氷上で５分間アニーリングさせ、反応バッファーおよびヌクレオチドを加え、そして反応物を４８℃で２分間加熱し、その後で５ユニットの逆転写酵素を加えた。反応は、サーモサイクラーにおいて温度勾配（３０分４８℃、５０℃２０分、５５℃１０分、７０℃１５分）で行われた。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＲＴ反応物の３つの１０μｌアリコートをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。反応の成分を下記のように加えた：
【００８０】
【表７】
【００８１】
８〜１２サイクルの間の以下のプログラムをＰＣＲサイクラーにおいて行った。
変性９５℃：１分
アニーリング６３℃：１分
伸長７２℃：１分
反応物のアリコートをポリアクリルアミドゲル上で分析した。その後でＰＣＲ反応物を１μｌのグリコーゲン、０．３Ｍの酢酸ナトリウム ｐＨ５．５および３容量のよく冷えた１００％エタノールで−８０℃で２０〜３０分間沈殿させた。ペレットを水に再懸濁し、そして５０〜１００ｐｍｏｌをインビトロ転写の鋳型として用いた。
２’−フルオロ転写
５０〜１００ｐｍｏｌのｄｓＤＮＡをインビトロ転写の鋳型として用いた。条件は、開始プールの作製に関する上記のようにであった。作製されたＲＮＡを次の選択ラウンドに用いる。各ラウンドに使用する量を図３に記載する。
【００８２】
この選択の結果は、ＲＮＡプールを用いる選択は図２２および図２３に、そしてＦ’ＲＮＡプールを用いる選択は図２４および２５に示す。そのトランケーションした形態（これらは、しかしながら、依然として標的に結合することができる）を包含する、該図に示す配列のいずれも本発明の核酸であると理解されるべきである。
【実施例２】
【００８３】
自動インビトロ選択
特異的に結合するラットＤ−グレリン結合アプタマーの自動選択を下記に記述する。
材料
ビオチニル化ラットＤ−グレリン（アミノ酸配列、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（オクタノイル）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によりカスタム合成された。選択中に使用したペプチドは、ビオチン−ニュートラアビジン相互作用を用いる結合していない核酸種から分別を可能にするためにＣ末端にビオチン部分を含有する。このために、ニュートラアビジンアガロースおよびニュートラアビジンウルタラリンクプラス（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ Ｐｌｕｓ）（両方ともＰｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素およびＲＮａｓｅＯＵＴ ＲＮアーゼインヒビターは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から、そしてＤＮアーゼＩはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からであった。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ二本鎖ＤＮＡ検出色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから、ＮＴＰはＬａｒｏｖａ（Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
プール、プライマーおよびＲＮＡスピーゲルマー
ＤＮＡプールの配列は、５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＧＴ Ｇ−Ｎ４０−ＣＡＣ ＧＴＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＴＣＧ ＧＴＴ ＣＣＡ Ｃ−３’であり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴの等モル混合物を表す。
フォワード（Ｔ７）プライマー ＤＥ．４０Ｔ７：
５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＧ−３’
リバースプライマー ＤＥ．４０Ｒ：
５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＣＧ−３’
濃縮されたプールのクローニングおよびシーケンスは、ＧＡＴＣ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により行われた。
自動インビトロ選択のプロセス
自動インビトロ選択中の大部分の液体処理操作は、取り外し可能なふたを有する９６ウェルプレート（ＮＣＣプレート;Ｂｉｌａｔｅｃ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行い；結合ＲＮＡ種からの結合していないものの分別は、Ｍｏｂｉｃｏｌカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において行い；インビトロ転写産物の自動精製は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０限外濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
自動選択に使用する投入ＲＮＡ
第一の自動選択ラウンド（ラウンド３）のＲＮＡは、第三の手動選択ラウンドにおいて使用したものと同じであった（実施例１を参照）。このＲＮＡの２５０ｐｍｏｌｅをラウンド３および４における；１００ｐｍｏｌｅを全てのさらなるラウンドにおける結合反応当たりの投入量として用いた。
ＲＮＡの変性
標的分子ラットＤ−グレリンと接触させる前のＲＮＡの変性を除く全ての非酵素的選択段階は、選択バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ;１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＣａＣｌ２；０．１％［ｗｔ／ｖｏｌ］Ｔｗｅｅｎ−２０）において行った。変性には、１００〜２５０ｐｍｏｌのＲＮＡプールをＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を含まない５７μｌの選択バッファーにおいて９５℃に５分間加熱した。変性後に、ＲＮＡを素早く４℃に２分間冷却し、そして次に３７℃で平衡化した。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を各々１ｍＭの最終濃度になるように加え、そして混合物を３７℃でさらに５分間インキュベーションした（ＲＮＡのフォールディング）。
結合していないＲＮＡからの結合したものの分別
変性後に、ＲＮＡをペプチドなしに１０μｌの選択マトリックス（それぞれ、ニュートラアビジンアガロースもしくはニュートラアビジンウルトラリンク）と３７℃で１５分間接触させた。このいわゆる前選択は、混合物からの潜在的マトリックス結合ＲＮＡ種を除くために考案された。マトリックス粒子を懸濁状態で保つために、サンプルを１，４００ｒｐｍ（３７℃）で振盪した。次に、マトリックスを単純な沈降により溶液中のＲＮＡから分離し、上清を新しいウェルに移し、そしてラットＤ−グレリンを図９に示すような濃度になるように加えた。３７℃で６０分後に、１０μｌのビオチン結合マトリックスを加え、そして結合反応物を振盪（１，４００ｒｐｍ、３７℃）下でさらに１０分間インキュベーションした。洗浄には、マトリックスを次にＭｏｂｉｃｏｌカラムに移し、そして１３５マトリックス容量までの予熱した選択バッファー（３７℃）で洗浄して結合ＲＮＡ種から結合していないものを除いた。洗浄容量は、４５（ラウンド３、すなわち、第１の自動ラウンド）〜後のラウンドにおける１３５マトリックス容量の間で異なった（図９参照）。
結合ＲＮＡの溶出
結合ＲＮＡの溶出は、９５μｌのＲＴ−ＰＣＲバッファーに結合ＲＮＡを有するマトリックス粒子を再懸濁しそして９５℃に３分間加熱することにより行った。逆転写およびその後のＰＣＲの酵素は、５０℃で２分間の平衡化の後に加えた。バッファー条件および酵素の量は、供給業者Ｑｉａｇｅｎにより勧められるように使用した。
増幅
インビトロ転写−選択プロセスに使用するＲＮＡの作製
転写は、１５０μｌの容量においてＴ７反応バッファー（８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５；２２ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭスペルミジン；１０ｍＭジチオスレイトール；４ｍＭ［各々］ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＡＴＰおよびＵＰＴ；８０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中１５０ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび４０ＵのＲＮａｓｅＯｕｔ ＲＮアーゼインヒビターで行った。１つの転写反応において、２５μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応物をインビトロ転写の鋳型として用いた。反応物を３７℃で３時間インキュベーションした。最後に、鋳型ＤＮＡを消化するためにＤＮアーゼＩを加え、そして反応物を３７℃で１５分間インキュベーションした。次に、沈殿した無機ピロリン酸塩を５０℃のワークステーション上でＥＤＴＡを２５ｍＭの最終濃度になるように加えることにより溶解した。生成ＲＮＡを残存するＮＴＰおよび他の所望されない反応成分から８Ｍ尿素を含有する変性ゲルによってもしくはＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３０マイクロ濃縮器を使用する限外濾過を用いることにより分離した。限外濾過精製したＲＮＡは、限外濾過膜から単にすすぎ、ゲル精製では、ＲＮＡバンドをＵＶ光下で切り出し、ＲＮＡをゲルから溶出し、エタノール沈殿し、乾燥させ、そして水に再懸濁した。
選択ＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ
選択ＲＮＡ分子の逆転写は、１２０μｌの容量においてニュートラアビジンアガロースもしくはウルトラリンクプラスマトリックスの存在下で供給業者により推奨されるような条件下でＱｉａｇｅｎワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを用いて行った。サンプル（マトリックスおよび付着ＲＮＡと一緒にＲＴ−ＰＣＲ反応バッファー）を９５℃で３分間加熱し、そして酵素を加える前に５０℃で２分間平衡化した。逆転写では、反応物を５０℃で２０分間そして６０℃で１０分間保った。ＲＴ酵素の不活性化ならびに熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性化は、９５℃で１５分間の混合物のインキュベーションにより実施した。
【００８４】
熱循環パラメーターは下記のとおりであった：変性、９５℃で３０秒；アニーリング、６３℃で３０秒；重合、７２℃で３０秒。
ＰＣＲ進行の制御
ＰＣＲサイクルの数を最小限に保つために、ＰＣＲにおいて生成される二本鎖ＤＮＡの量を半定量的に追跡した。反応は、インビトロ転写に十分な鋳型ＤＮＡが生成される間のみ循環させた。ＰＣＲ中に、既定数のサイクルの後に３μｌのアリコートを反応物からサンプリングし、そしてＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液（ＴＥバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８；１ｍＭ ＥＤＴＡ］に１：４００希釈する）と混合した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、溶液中に遊離している場合にはほとんど全く蛍光を示さない蛍光色素である。しかしながら、該色素は二本鎖ＤＮＡに結合している場合に、強く蛍光を発する（ｅｘ：４８５ｎｍ；ｅｍ：５２０ｎｍ）。熱安定性ポリメラーゼを欠くコントロールと比較した蛍光の測定は、ＰＣＲ進行のかなり正確な概算を可能にする。設定閾値（ポリメラーゼを有する蛍光強度／ポリメラーゼなしの蛍光強度＞２）に達した後、ＲＴ−ＰＣＲ反応物のアリコートをインビトロ転写の鋳型として直接用いた。
自動操作
ラウンド３からは、６回のゲル精製段階を除く全ての操作をピペッティングロボット上で完全に自動化して行った。プロセス中に使用するモジュールの配置を図１０に示し、モジュールの使用の順序を図１１に示した。以下のモジュールを選択プロセス中に使用した：
・ＰＣＲ中の増幅進行の制御のための蛍光読取機。インビトロ転写のために十分な量のｄｓＤＮＡをすでに生成したサンプルは、中間で４℃で保存され、そしてさらなる熱循環に供されなかった。
・分別用のＡ室および転写反応物の精製用のＢ室を有するダブル真空マニホールド
・使い捨ての導電性バリアチップのラック
・ＰＣＲプログラムならびに様々なインキュベーション段階を行うためのサーモサイクラー
・結合もしくは反応バッファーに粒子状マトリックスを懸濁するためのシェーカー
・酵素反応のホットスタートのためのもしくは蛍光測定中にサンプルを採取するためにＰＣＲ反応物を高温で保つための５０℃のワークステーション
・ＰＣＲもしくは転写反応物の中間保存用の４℃のワークステーション
・温度感受性試薬の保存用の４℃の試薬ラック
・洗浄バッファーの保存および予熱用の３７℃の試薬ラック
・大部分のピペッティング段階を行うための３７℃のワークステーション
・蛍光測定反応物を調製するための蛍光プレートワークステーション
・現在使用していないマイクロタイタープレートの保存用のホテル（ｈｏｔｅｌ）
・使用したピペットチップの処分用の廃棄物ステーション
本実施例に関連したモジュールの関与ならびに自動インビトロ選択のプロセス中の関与の順序を図１１に図示する。
選択の結果
選択の経過
ラットＤ−グレリンに対するインビトロ選択の経過を図９に示す。あらゆる選択ラウンドにおいて、異なるストリンジェンシーを有する３つの結合反応に加えて標的分子を欠く１つのボイドカラムを行った。ストリンジェンシーは、洗浄容量を変えることならびに標的濃度を下げることにより調整した。
【００８５】
所望のプールの複雑さを表すために必要である多量のＲＮＡプールは、ロボットにより安全に処理することができなかったので、選択ラウンド１および２を手動で行った。ラウンド３からは、選択を完全に自動で行った。２ラウンドごとに、どのストリンジェンシーをその後の２ラウンドに使用すべきかの決定を行った。
【００８６】
図９において、図１３に示す配列をもたらした選択ストランドを強調表示する。一般に、バックグラウンドに対して有意なシグナルを依然として示した最もストリンジェントなストランド（すなわち、それぞれ、最も低い標的濃度もしくは最も大きい洗浄容量を有するもの）の選択ＲＮＡを次のラウンドの投入として用いた。閾値レベルに達するために必要であったＰＣＲサイクルの数（「ＰＣＲ進行の制御」を参照）を尺度として用いた。全部で、１９の選択ラウンド（そのうち１７は自動）を行った。
【００８７】
ラウンド１７〜ラウンド１９（各々６．２ｎＭのＤ−グレリンで）からのｄｓＤＮＡ分子の集団をクローン化し、そしてシーケンスした。全部で、９６個のクローンをシーケンスした（ラウンド１７およびラウンド１９からそれぞれ４８個）。１４の異なるクローンの頻度および発生は、図１２（表５）に示すとおりであった。
配列
配列分析の結果を図１３に見ることができる。全部で９６個のクローンから、８７個において両方のプライマーを見出すことができた。
【００８８】
そのトランケーションした形態（これらは、しかしながら、依然として標的に結合することができる）を包含する、図１３に示す配列のいずれも本発明の核酸であると理解されるべきである。
【実施例３】
【００８９】
Ｄ−グレリンに対するＲＮＡアプタマーの特性化
「ビーズアッセイ」（溶液における結合）を用いることによるクローンの順位付け
Ｄ−グレリンに対する自動インビトロ選択から得られた１４個全てのクローンをビーズアッセイを用いることによりそれらの結合挙動に関して順位付けした。
【００９０】
この目的のために、２ｐｍｏｌ（２０ｎＭ）のＲＮＡをＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋およびＴｗｅｅｎ ２０を含まない１００μｌの選択バッファーにおいて９５℃で５分間変性させ、そして次に氷上に直接置くことによりスナップ冷却した。次に、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を各々１ｍＭの最終濃度になるように、そしてＴｗｅｅｎ ２０を０．１％の最終濃度になるように加えた。溶液を３７℃に平衡化した。
【００９１】
このＲＮＡを異なる濃度のビオチニル化Ｄ−グレリンと３７℃で１時間プレインキュベーションした。次に、この溶液の４０μｌをマイクロタイタープレートに移し、そして３０μｌの常磁性ストレプトアビジン磁性粒子（「ビーズ」；Ｒｏｃｈｅ，１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベーションして全てのビオチニル化Ｄ−グレリンをビーズ上に固定化した（遊離のペプチドならびにＲＮＡ：ペプチド複合体）。Ｄ−グレリン濃度に依存する上清におけるＲＮＡ濃度の減少をモニターするために、上清におけるＲＮＡの量をＯｌｉＧｒｅｅｎ蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量した。
【００９２】
ＯｌｉＧｒｅｅｎの蛍光は、オリゴヌクレオチドへの分子の結合に強く依存し；溶液中で結合していない場合、４８５ｎｍの光で励起するとＯｌｉＧｒｅｅｎは弱い蛍光を示すのみである。しかしながら、核酸が存在する場合、５２０ｎｍでの蛍光シグナルは核酸の濃度に比例して上昇する。
【００９３】
次に、ビーズを６Ｍの尿素に再懸濁しそして３７℃で１０分間インキュベーションすることによりＲＮＡ−標的複合体を分離した。標的濃度に依存する溶出ＲＮＡの増加をモニターするために、この溶出液におけるＲＮＡの量を同様に定量した。全ての値は、ペプチドなしのコントロールにおけるバックグラウンドシグナルに対して補正した。上清および溶出液の代表的な結合曲線を図１４Ａ〜Ｅに示す。
【００９４】
０、２０、１００および５００ｎＭのＤ−グレリン濃度を用いる第一の順位付けは、試験した全てのクローンが１００ｎＭ未満の活性構造のＫＤで同様に十分に結合したことを示した。上清におけるＲＮＡ濃度の減少から判断されるように、ＲＮＡの約４０〜５０％が活性構造であるようである。
【００９５】
クローンＢ１１、Ｃ１１、Ｃ１２、Ａ８およびＦ１２の０、５、１０、２０、５０、１００、２００および４００ｎＭのＤ−グレリン濃度を今度は配置するさらに詳細な順位付けは、これらのクローンが全てこのアッセイにおいて約１０ｎＭの活性構造のＫＤで結合することを示した（図１４Ａ〜Ｅ）。
【００９６】
これらの図は、ビオチニル化Ｄ−グレリンの濃度に依存する核酸媒介蛍光の増加を示す。ｙ軸上にペプチドなしのコントロールにおけるバックグラウンドシグナル（＝０％）に対する溶出液における蛍光シグナルの増加［％］を示す。クローンＡ８に決定したデータ点は、式
【００９７】
【数１】
【００９８】
（Ｂｍａｘは、高いペプチド濃度での蛍光の増加の最大プラトー値の値である。ＫＤは、［ｎＭ］での結合定数ＫＤを示す。）を用いて１部位結合（ＯｎｅＳｉｔｅＢｉｎｄｉｎｇ）モデルで適合させた。
【００９９】
１０ｎＭ未満の結合定数はこのアッセイで分析することができないので、次に、３個の選択クローンの結合特性を放射性標識したＲＮＡを用いる結合アッセイによりならびにビアコア２０００装置の使用により特性化した。
選択した放射性標識クローンのそれらの結合挙動に関する順位付け
標的分子ラットＤ−グレリンに対する３個の選択分子の結合挙動の順位付けを行った。この目的のために、クローンＢ１１、Ｅ３およびＦ１２をα３２Ｐ−ＧＴＰおよびα３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でインビトロ転写した。２〜５ｐｍｏｌｅの放射性標識ＲＮＡをＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない選択バッファーにおいて９５℃で３分間変性させ、これらのイオンを３７℃で１ｍＭの最終濃度になるように加えることによりフォールディングし、そして０、３、１０、３０、１００、３００、１０００および３０００ｎＭの濃度のビオチニル化ラットＤ−グレリンと３７℃で１時間インキュベーションした。次に、一定量のニュートラアビジンアガロースをマトリックスとして加え、そしてＲＮＡ：ペプチド複合体を３７℃でもう１０分間振盪した。次に、結合したペプチドおよびペプチド：ＲＮＡ複合体を有するマトリックスを分離し、上清を除き、そして結合したＲＮＡと結合していないＲＮＡとの差を決定した。計算した数から、コントロール（０ｎＭのＤ−グレリン）をバックグラウンドとして引いた（図１５、表６）。付着数での結合曲線を図１６Ａ〜Ｃに示す。
ビアコア２０００装置を用いることによるクローンの順位付け
１４個全てのクローンのビアコア測定は、グレリンチップ上でのＲＮＡ溶液の直接結合アッセイとして行った。結合パートナーは、遊離のＲＮＡおよび前もって固定化したグレリンである。
【０１００】
グレリンチップは、その表面が下記のようにＥＤＣ／ＮＨＳアミノカップリングで連結された４つのフローセルを有するＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）からなった：
フローセル１：基準セルとして１２６５ＲＵのアビジン
フローセル２：１２７０ＲＵのＬ−グレリン（ラット）
フローセル３：７４０ＲＵのＤ−グレリン（ラット）
フローセル４：６００ＲＵのＤ−グレリン（ラット）
試験するサンプルは、選択バッファーにおいて５００ｎＭの濃度に調整し、そして３７℃に平衡化した。測定自体は、以下の条件下でビアコア２０００装置で行った：
温度 ３７℃
流量 ２０μｌ／分
結合 ５分
解離 ５分
再生 １Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１４の試験したＤ−ＲＮＡのうち１３がアミノ連結したＤ−グレリンに１００〜２００ｎＭの範囲のＫＤを有することが判明した（図１７）。Ｃ１２調製物のＤ−ＲＮＡ濃度は全ての他のものよりはるかに低く、それははるかに低い最大シグナルをもたらす。これは解釈を困難にし、そして約２０ｎＭの明白な低いＫＤは疑わしい。
遊離のラットＤ−グレリンでのクローンＢ１１の競合
遊離のラットＤ−グレリンに対するクローンＤ−Ｂ１１の結合特性を評価するために、競合実験を行った。一定濃度のＤ−Ｂ１１（１００ｎＭ）を異なる濃度の遊離のＤ−グレリン（０〜５００ｎＭ）と選択バッファーにおいて３７℃でプレインキュベーションし、そして次にビアコアに注入した。ビアコアチップ上の固定化グレリンと遊離のグレリンはＲＮＡの結合に関して競合し、それは遊離のグレリンの増加する濃度とともにＲＮＡのいっそう低い見かけの濃度、従っていっそう低いビアコアシグナルをもたらす。
【０１０１】
図１８に示すように、ビアコアシグナルは溶液中のＤ−グレリンの増加する濃度とともに減少する。これは、固定化Ｄ−グレリンへの結合を遊離のＤ−グレリンと競合できることを意味する。
【実施例４】
【０１０２】
Ｂ１１のトランケーションおよびスピーゲルマーの特性化
アプタマーＢ１１の二次構造は、図１９に示すようにプログラムｒｎａｆｏｌｄ（Ｉ．Ｌ．Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ １２５：１６７−１８８）を用いることにより計算した。
【０１０３】
ＲＮＡスピーゲルマーの製造には、得られる結合モチーフが合理的努力下で化学合成を可能にしそしてグレリンへの親和性が失われないようにＢ１１配列をトランケーションすることが必要であった。
【０１０４】
これを行うために、塩基１〜１７および６５〜８２を取り除いた。それぞれの４７ｍｅｒ Ｂ１１ｔｒｃ（ｒｎａｆｏｌｄにより計算された二次構造は、図１９を参照）は、Ｔ７プロモーター配列を含有するｓｓＤＮＡを合成し、ｓｓＤＮＡをプライマーおよびＴａｑポリメラーゼを用いて転写可能なｄｓＤＮＡに埋め、そしてこの鋳型でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応を設定することにより酵素的にＤ−ＲＮＡとして製造した。製造されたＲＮＡをゲル精製し、そして水に溶解した。対応するスピーゲルマーを標準的なβ−シアノエチル化学を用いて合成した。
【０１０５】
ＬおよびＤ形態の両方のトランケーションしたＢ１１バージョンならびに全長Ｄ−ＲＮＡを同じ実行において上記のようにビアコア２０００装置で試験し、そして１００〜２００ｎＭの間のＫＤの同様の結果を与えた（図２０）。クローンＢ１１（Ｄ−ＲＮＡ）およびトランケーションしたＢ１１（それぞれ、Ｄ−およびＬ−ＲＮＡ）のビアコア測定のオーバーレイを図２１に示す。
【実施例５】
【０１０６】
グレリン結合スピーゲルマーによるグレリン誘発性カルシウム放出の阻害を分析する方法
ヒトグレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）を発現する安定なトランスフェクションＣＨＯ細胞（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ，Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍから得られた）を透明な底を有する黒色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）においてウェル当たり５〜７ｘ１０４個の細胞で接種し、そして１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび２．５μｇ／ｍｌのファンギゾンをさらに含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）において３７℃および５％ ＣＯ２で一晩培養した。
【０１０７】
スピーゲルマーを０．２ｍｌのロープロファイル９６チューブプレートにおいて５ｍＭのプロベネシドおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（ＣＨＯ−Ｕ＋）においてヒトもしくはラットグレリン（Ｂａｃｈｅｍ）と一緒に室温もしくは３７℃で１５〜６０分間インキュベーションする。
【０１０８】
カルシウム指示色素ｆｌｕｏ−４を負荷する前に、細胞を２００μｌのＣＨＯ−Ｕ＋で１回洗浄する。次に、５０μｌの指示色素溶液（ＣＨＯ−Ｕ＋中１０μＭのｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、０．０８％のｐｌｕｒｏｎｉｃ １２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を加え、そして細胞を３７℃で６０分間インキュベーションする。その後で細胞を１８０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋で３回洗浄する。最後に、９０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋をウェル当たり加える。
【０１０９】
蛍光シグナルの測定は、注入ポンプを備えたＦｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａマルチ検出プレート読取機（ＢＭＧ）において４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で行う。
【０１１０】
カルシウム濃度のグレリン誘発性変化の正確な時間経過を分析するために、刺激用の溶液をＣＨＯ−Ｕ＋における１０ｘ濃縮溶液として調製し、そして注入ポンプの助けを借りて注入する。この種の測定では各ウェルを別個に分析する。各ウェルからの記録の最後に、１０μｌの１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を注入して適切な負荷を制御する。
【０１１１】
いくつかのサンプルの平行測定には、９６ウェルプレートの１（垂直）列のウェルを一緒に記録する。４秒の時間差を有する最初の３回の読み取りは、ベースラインの決定のために行う。次に記録を中断し、そしてプレートを装置から取り出す。マルチチャンネルピペットを用いて、１０μｌの刺激溶液をウェルに加え、次にプレートを再び装置に入れ、そして測定を続ける。４秒の時間間隔を有する全部で２０回の記録を行う。
【０１１２】
各ウェルで最大蛍光とベースライン値との差を決定し、そしてグレリン濃度に対して、もしくはスピーゲルマーによるカルシウム放出の阻害に関する実験ではスピーゲルマーの濃度に対してプロットする。
【実施例６】
【０１１３】
自動再選択
向上した結合親和性を有するＲＮＡ結合物（ｂｉｎｄｅｒ）を得るために、グレリン結合アプタマーＣ１２に基づく再選択を行った。それぞれのＤＮＡプールの配列は、５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＧＧＧ ＴＧＡ ＧＧ ｃａａ ａａａ ｃｇｔ ａａｇ ａｃｃ ｇａａ ｇｇｔ ａａｃ ｃａｔ ｔ ＣＣＴ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＧＡ ＧＴＧ ＴＣＧ ＧＴＴ ＣＣＡ Ｃ−３’であり、小文字は３４％のそれぞれの塩基、２２％の３つの他の塩基の混合物を表す。フォワードプライマーＤＥ２．Ｔ７は、配列５’−ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＣＡ ＧＧ−３’を有し、リバースプライマーＤＥ２．Ｒは、配列５’−ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＧＡＴ ＧＧ−３’を有した。
【０１１４】
最初の２回の選択ラウンドは、実施例１の「手動インビトロ選択」に記述するように手動で行い；ラウンド３〜１０は、実施例２の「自動インビトロ選択」に記述するようにロボットにより行った。
【０１１５】
ラウンド１０（１２ｎＭのＤ−グレリンで）からのｄｓＤＮＡ分子の集団をクローン化し、そしてシーケンスした。全部で、４６個のクローンをシーケンスした。結合特性を調べた２５個の異なるクローンのヌクレオチド配列を図３１に示す。
【実施例７】
【０１１６】
再選択からの個々のクローンの分析
異なる位置でバリエーションを示す再選択プールからの２５個のクローン（実施例６、図３１）を実施例３に記述する「ビーズアッセイ」を用いる順位付けのために選択した。Ｄ−ＲＮＡアプタマーの結合を０、１０、２０、５０、１００、２００、４００および８００ｎＭのＤ−グレリン濃度で分析し；基準として、アプタマーＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）を平行して分析した。いくつかの候補は、コントロールアプタマーＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）より強くＤ−グレリンに結合し、いっそう低いＫＤもしくはいっそう多量の活性構造のいずれかを示す。
【０１１７】
さらに、これらのアプタマーの結合をビアコア２０００装置（実施例３）を用いて分析した。全てのＲＮＡは、シグナル強度ならびに結合および解離挙動の偏差を有するが、ｂｉｏ−Ｄ−グレリンに結合することが判明した（図３２を参照）。クローンＳＯＴ−１０８−Ｂ１、ＳＯＴ−１０８−Ｃ８、ＳＯＴ−１０８−Ｆ２、ＳＯＴ−１０８−Ｂ６、ＳＯＴ−１０８−Ｂ７、ＳＯＴ−１０８−Ｄ５、ＳＯＴ−１０８−Ｆ７、ＳＯＴ−１０８−Ｇ３、ＳＯＴ−１０８−Ｈ４、ＳＯＴ−１０８−Ｅ６およびＳＯＴ−１０８−Ｃ６は、コントロールクローンＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）およびＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）より優れた結合を有するようであり、測定におけるいっそう高いシグナルもしくはいっそう遅い解離速度を示す。これらのクローンは、「ビーズアッセイ」においても同様に優れていたことを記載しなければならない。
【０１１８】
従って、これらのクローンを細胞培養アッセイ（実施例５）においてスピーゲルマーとしてそれらの活性に関して試験した。同時に、これらの配列を５０ヌクレオチド未満のサイズにトランケーションすることができるかどうかを分析した。試験したスピーゲルマーを図３３に要約する。
【０１１９】
細胞アッセイの第一の組において、グレリン依存性カルシウム放出へのスピーゲルマーの阻害の影響を１０ｎＭおよび３ｎＭのＬ−ＲＮＡ濃度でそれぞれ検出した。これは、トランケーションしたクローンの生物学的活性の大まかな概算を可能にする。この２点測定の結果を図３４に示す。
【０１２０】
細胞アッセイ条件下で、これらのトランケーションした再選択クローンは、ＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）のものと匹敵する阻害活性を示す。しかしながら、スピーゲルマーｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４は、コントロールＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）およびＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）と比較して、３ｎＭおよび１０ｎＭでグレリン活性を有意に強く阻害する。
【０１２１】
実験の第二の組は、異なる濃度のＬ−ＲＮＡ（実施例５）でこれらのスピーゲルマーｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４の阻害活性を分析する。得られる用量応答曲線を図３５に示す。全てのクローンは、１０ｎＭでグレリン誘発性カルシウム放出のほぼ最大の阻害を示した。明らかなＩＣ５０を〜５ｎＭで検出することができ、一方、１ｎＭのスピーゲルマー濃度ではいかなる応答も認めることができない。比較して、このアッセイにおけるＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）のＩＣ５０は、１０ｎＭを超えて検出された。
【０１２２】
細胞アッセイは５ｎＭのグレリン濃度で機能し、これはさらに低いＩＣ５０を有する結合事象を分析することを困難にし；スピーゲルマーがグレリンに比較してサブ化学量論（ｓｕｂ−ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）量で存在する場合に、完全な阻害を認めることができないと考えられなければならない。しかしながら、１０ｎＭでのグレリン活性のほとんど完全な阻害は、スピーゲルマーｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４の生物学的活性が、検出されるよりさらに優れている可能性があることを示唆する。
【実施例８】
【０１２３】
正常マウスの摂餌量へのｉ．ｖ．投与した抗グレリン−スピーゲルマーの効果の調査
研究の開始の前に、マウス（ＮＭＲＩ）を少なくとも５日間順応させた。マウスは餌および水を自由に入手することができ、そして個々に飼育した。実験は、各々８匹の動物の３群で実施した。これらの群に、明期の最後に食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかをｉ．ｖ．注射により与えた。スピーゲルマーは、９０ｍｇ／ｋｇ（１．８μＭ／ｋｇ）の用量で使用した。投与後に動物は餌および水を無制限に入手することができ、そして摂餌量を５分の間隔で２４時間記録した。全部で２４匹の動物での実験を各々１２匹の２組に分け、そして２つの異なる日に実施した。
【０１２４】
第１組において摂餌量の減少が認められ（図３６Ａおよび３６Ｂ）、一方、第２組では抗グレリンスピーゲルマーとコントロールスピーゲルマーとの違いを認めることができない（図３７Ａおよび３７Ｂ）。全体で、抗グレリン−スピーゲルマーの投与後の期間における摂餌量の減少への傾向が示される（図３８Ａおよび３８Ｂ）。
【実施例９】
【０１２５】
食餌訓練したマウスの摂餌量へのｉ．ｖ．投与した抗グレリン−スピーゲルマーの効果の調査
マウス（ＮＭＲＩ）を１時間の期間にわたって暗期中に２回のみ餌を入手できるように訓練した。これらの条件下でそれらはそれらの食餌必要条件を満たすためにその時間中に餌を食べることを素早く学ぶ。この方法の理論的根拠は、個々の試験動物と群全体との間のより優れた比較可能性を得ることである。
【０１２６】
実験を各々８匹の動物の３群で実施した。これらの群に明期の最後に食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかをｉ．ｖ．注射により与えた。スピーゲルマーは、６０ｍｇ／ｋｇ（１μＭ／ｋｇ）の用量で使用した。全部で２４匹の動物での実験を各々１２匹の２組に分け、そして２つの異なる日に実施した。試験動物は、投与後１および７時間で１時間の期間にわたって餌を入手できるようにした。消費された餌の量は、各給餌期間後に手動で決定した。図３９は、第１の実験における１２匹の動物の摂餌量を示し、そして図４０は第２の実験を要約する。群当たりの全ての動物の全摂餌量を図４１に示す。
【０１２７】
特に、第１の給餌期間中に動物は餌消費の減少への傾向を示した（図３９Ａおよび３９Ｂ）。しかしながら、全体では餌消費への抗グレリンスピーゲルマーの弱いそして一時的な効果のみを認めることができた。
【実施例１０】
【０１２８】
カニューレを挿入したラットの摂餌量へのｉ．ｃ．ｖ．投与した抗グレリン−スピーゲルマーの効果の調査
オスウィスター系ラットを照明コントロール室（１２時間の明／１２時間の暗サイクル）において飼育し、そして標準的なラットの餌を自由に入手できるようにした。実験の１〜２週前にオスウィスター系ラットを脳室内注入のために準備した。ステンレス鋼脳室内（ｉｃｖ）カニューレをラットの頭蓋骨に麻酔下で埋め込んだ。ｉｃｖカニューレ配置は、実験後に色素を導入することにより全てのラットにおいて確かめた。処置の日に群当たり４匹のラットに明期の最後にａ）コントロールスピーゲルマー（０．７ｍＭ／５μｌ／ラット）、ｂ）スピーゲルマーＢ１１（０．７ｍＭ／５μｌ／ラット）もしくはｃ）賦形剤（０．９％食塩水／５μｌ／ラット）の単回ｉｃｖ投与を与えた。摂餌量を２４時間測定し、そして注入前の日（ベースライン記録）と比較した（図４２）。
【０１２９】
この実験において、抗グレリンスピーゲルマーの効果は、コントロール群において認められる結果と有意に異ならなかった。
【実施例１１】
【０１３０】
抗グレリン−スピーゲルマーによる外因性グレリン投与後の成長ホルモン放出の阻害
本実験は、スプラーグ・ドーリーラットで群当たり６匹の動物の３群において７日の順応後に行った。２群には１５０ｎｍｏｌのＰＥＧ化抗グレリンスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化コントロールスピーゲルマーの単回ｉ．ｖ．注射のいずれかを与えた。スピーゲルマー投与の３０分後に各ラットに３ｎｍｏｌのグレリン（２５０μｌ）の静脈内注射を与えた。血液サンプルを成長ホルモンレベルのベースライン記録のためにグレリン投与の前にそして注射の５分、１５分、３０分および４５分後に麻酔下で採取した。得られる血漿サンプルをラジオイムノアッセイ系（成長ホルモン、ラット、Ｂｉｏｔｒａｋアッセイキット、ＲＰＮ２５６１，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）により分析した。
【０１３１】
ＧＨ放出は、スピーゲルマー処置群において観察の全期間にわたって持続的に抑制されて阻害され（図４３）、記述するモデルにおける抗グレリンスピーゲルマーのインビボ活性を示す。
【０１３２】
さらに、ＧＨ放出の阻害を抗グレリンスピーゲルマーの異なる用量を投与することにより調べた（図４５）。１５ｎｍｏｌの単回用量はＧＨ放出へのグレリンの効果を抑制し、一方、３ｎｍｏｌの用量は十分ではなかった。
【実施例１２】
【０１３３】
抗グレリンスピーゲルマーによる外因性グレリンの摂餌量の刺激の中和
本研究は、全部で３２匹のオススプラーグ・ドーリーラットを用いて４群の動物で２つの実験に分けた。７日の順応の後に、動物を各々８匹の４群に無作為に割り当てた。ラットを個々に飼育し、そして通常の明暗サイクルで維持した。動物は餌および水を自由に入手することができた。動物、給餌ジャーおよび水ボトルを明期の開始後約２時間で秤量した（０．１ｇの位まで）。給餌ジャーおよび水ボトルを４時間後に秤量し、そしてラットの異なる群の餌および水摂取量を計算した。
【０１３４】
第１組において外因性グレリンの最適用量を試験した。グレリンの３つの異なる用量（それぞれ、１６．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、３３．４ｎｍｏｌ／ｋｇおよび８３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）を腹腔内経路により投与した。異なる用量群の餌および水摂取量を同時に決定した。給餌ジャーおよび水ボトルを薬剤投与の時点でそして１、２および４時間後に秤量した（図４４）。ｉ．ｐ．投与後のラットにおける摂餌量の刺激の最適用量は、１０ｎｍｏｌ／動物であった（図４４）。
【０１３５】
前記と同じプロトコルに従って行う次の実験において、抗グレリンスピーゲルマーによる摂餌量への外因性グレリンの効果の中和を調べた。最初に１５０ｎｍｏｌ／動物および３０ｎｍｏｌ／動物の２つの用量レベルのスピーゲルマーをｓ．ｃ．投与した。１時間後にラットにグレリンをｉ．ｐ．投与により与えた。コントロール群には賦形剤を与えた。餌および水摂取量を上記のように１、２および４時間後にモニターした。抗グレリンスピーゲルマーは、摂餌量への効果を示した。
【０１３６】
本明細書、配列表、請求項および／もしくは図面に開示する本発明の特徴は、別個にそしてその任意の組み合わせの両方で本発明をその様々な形態で実現するための材料であることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】Ｄ−グレリン結合アプタマーのＲＮＡ選択のシグナル対ノイズ比を示す表１Ａを示す。
【図２】Ｄ−グレリン結合アプタマーの２’Ｆ−ＲＮＡ選択のシグナル対ノイズ比を示す表１Ｂを示す。
【図３】選択プロセスに使用するＲＮＡ／２’Ｆ−ＲＮＡの量を示す表２を示す。
【図４Ａ】ＲＮＡ選択に使用するグレリンペプチド濃度の経過を示す。
【図４Ｂ】２’Ｆ−ＲＮＡ選択に使用するグレリンペプチド濃度の経過を示す。
【図５】ペプチド濃度の経過の間の全使用ＲＮＡのパーセントでの溶出ＲＮＡの経過を示す。
【図６】ペプチド濃度の経過の間の全使用２’Ｆ−ＲＮＡのパーセントでの溶出ＲＮＡの経過を示す。
【図７Ａ】ＲＮＡ選択のラウンド１２〜１４で行ったダブルラウンドおよび結合アッセイを示す表３を示す；グレリンへのパーセント結合でのデータ、＊は配列を明らかにする。
【図７Ｂ】ダブルラウンドにわたってモニターしたＤ−グレリンへのＲＮＡプール結合の向上を示す。
【図８Ａ】２’Ｆ−ＲＮＡ選択のラウンド１３〜１５で行ったダブルラウンドおよび結合アッセイを示す表４を示す；グレリンへのパーセント結合でのデータ、＊は配列を明らかにする。
【図８Ｂ】ダブルラウンドにわたってモニターしたＤ−グレリンへの２’Ｆ−ＲＮＡプール結合の向上を示す。
【図９】ラットＤ−グレリンに対する自動インビトロ選択の経過を示す。
【図１０】ＲＮＡの自動インビトロ選択用のロボットのワークサーフェスを示す。
【図１１】自動ＲＮＡ選択中にロボットにより実行される作業手順を示すスキームを示す。
【図１２】選択プロセス中の同一配列の発生を示す表５を示す；内部基準および配列番号を示す。
【図１３】実施例２に記述するようなグレリンに対する自動インビトロ選択により単離されたＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示す。
【図１４Ａ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＡ８の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｂ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＢ１１の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｃ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＣ１１の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｄ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＣ１２の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１４Ｅ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＦ１２の結合曲線を示す、結合挙動はビーズアッセイを用いて分析した。
【図１５】自動インビトロ選択により単離されたクローンＢ１１、Ｆ１２およびＥ３のＤ−グレリンへの結合挙動を示す表６を示す。
【図１６Ａ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＢ１１の結合曲線、活性およびＫｄを示す、対応するデータを図８に示す。
【図１６Ｂ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＦ１２の結合曲線、活性およびＫｄを示す、対応するデータを図８に示す。
【図１６Ｃ】自動インビトロ選択により単離されたＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＥ３の結合曲線、活性およびＫｄを示す、対応するデータを図８に示す。
【図１７】ビアコア２０００装置を用いて決定した場合のＤ−グレリン結合ＲＮＡクローンＡ３、Ａ８、Ａ１２、Ｂ７、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｅ３、Ｅ１２、Ｆ５、Ｆ１２、Ｇ２およびＧ５のＫｄ値を示す表７を示す。
【図１８】ビアコア２０００装置を用いて行った、クローンＢ１１での競合実験を示す。
【図１９】Ｄ−グレリン結合ＲＮＡスピーゲルマークローンＢ１１のおよびトランケーションしたクローンＢ１１ｔｒｃの計算された二次構造を示す、二次構造は、プログラム「ｒｎａｆｏｌｄ」（Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ，Ｃｈｅｍ １２５：１６７−１８８）で計算した。
【図２０】Ｄ形態のＲＮＡクローンＢ１１ならびにＤおよびＬ形態のトランケーションしたクローンＢ１１のＫｄを示す表８を示す、Ｋｄはビアコア２０００装置で測定した。
【図２１】Ｄ形態のＲＮＡクローンＢ１１ならびにＤおよびＬ形態のトランケーションしたクローンＢ１１のビアコア２０００による結合アッセイを示す。
【図２２】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１３）により単離されたＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２３】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１４）により単離されたＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２４】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１４）により単離された２’−Ｆ−ＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２５】実施例１に記述するようなグレリンに対する手動インビトロ選択（ラウンド１５）により単離された２’−Ｆ−ＲＮＡリガンドの配列のアライメントを示す、ここで、線は欠けているヌクレオチドを示し、そして配列のプライマー部分はボールド体で印刷され、そしてここで、ＴはＵとして理解されるものとする。
【図２６】３３ｎＭのグレリンでのヒトグレリン受容体（ＧＨＳＲ１）を安定に発現するＣＨＯ細胞の刺激後に得られる蛍光シグナルの時間経過を示す；細胞にＣａ＋＋指示色素Ｆｌｕｏ４を負荷し、そして蛍光シグナルを蛍光プレート読取機で記録し；記録の最後に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えて細胞の適切な色素負荷を調べた。
【図２７】ヒトグレリン受容体を安定に発現するＣＨＯ細胞におけるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の用量応答曲線を示す；刺激に使用したグレリン濃度に対して最大シグナルとベースラインシグナルとの差をプロットし、約５ｎＭの半数有効濃度（ＥＣ５０）を示す、グレリンの用量応答曲線が得られ、この濃度をスピーゲルマーによるＣａ＋＋放出の阻害に関するさらなる実験に用いた。
【図２８】室温でのスピーゲルマーＢ１１によるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の阻害の用量応答曲線を示す；細胞を５ｎＭのグレリンもしくは様々な量のスピーゲルマーＢ１１と室温でプレインキュベーションしたグレリンで刺激した；結果は、スピーゲルマーなしに得られるシグナルに正規化した蛍光シグナルのパーセンテージを示す；スピーゲルマーＢ１１は、約５ｎＭのＩＣ５０でグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出を阻害することが見出された。
【図２９】３７℃でのスピーゲルマーＢ１１によるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の阻害の用量応答曲線を示す；細胞を５ｎＭのグレリンもしくは様々な量のスピーゲルマーＢ１１と３７℃でプレインキュベーションしたグレリンで刺激した；結果は、スピーゲルマーなしに得られるシグナルに正規化した蛍光シグナルのパーセンテージを示す；スピーゲルマーＢ１１は、約６ｎＭのＩＣ５０で３７℃でグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出を阻害することが見出された。
【図３０】スピーゲルマーＢ１１およびＣ１２によるグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出の阻害の比較を示す；細胞を５ｎＭのグレリンもしくは様々な量のスピーゲルマーＢ１１もしくはスピーゲルマーＣ１２と室温でプレインキュベーションしたグレリンで刺激した；結果は、スピーゲルマーなしに得られるシグナルに正規化した蛍光シグナルのパーセンテージを示す；この実験において、スピーゲルマーＢ１１は、約８ｎＭのＩＣ５０でグレリン誘発性Ｃａ＋＋放出を阻害することが見出され、一方、スピーゲルマーＣ１２ではＩＣ５０は約４ｎＭであった。
【図３１】自動再選択から得られるクローンのヌクレオチド配列を示す、５’−Ｘ−、５’プライマー配列ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＡＣＵＵＡＧＣＡ、３’−Ｙ−、３’プライマー配列ＡＵＣＧＡＧＵＧＵＣＧＧＵＵＣＣＡＣ、ここで、ＴはＵとして理解されるものとし、下線を引いた配列は、分子内らせん構造を形成すると考えられ、クローンのコア形態は下線を引いた配列から始まり、終わる、クローンＳＯＴ−１０８−Ｈ３は５回発生し、ＳＯＴ−１０８−Ａ６、ＳＯＴ−１０８−Ｂ７、ＳＯＴ−１０８−Ｃ２、ＳＯＴ−１０８−Ｃ３およびＳＯＴ−１０８−Ｄ４は２回発生し、全ての他のクローンは１回のみ得られた。
【図３２Ａ−Ｃ】３７℃でのｂｉｏ−Ｄ−グレリンへの再選択プールからのアプタマーのビアコア２０００による結合アッセイを示す。
【図３３】細胞アッセイにおいて試験した再選択スピーゲルマーの配列を示す；ここで、ＴはＵとして理解されるものとし、スピーゲルマーの配列、名称およびサイズ、ならびにそれが由来する再選択クローンの名称を示す。
【図３４】細胞アッセイにおけるグレリン誘発性カルシウム放出へのスピーゲルマーの阻害活性を示す；結果は３回の独立した測定から合わせ、コントロールＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）およびＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｄ（Ｃ１２）をそれらの各々に示す（全てのスピーゲルマーは、３ｎＭおよび１０ｎＭの濃度で二重反復で分析した）。
【図３５】スピーゲルマーＮＯＸ−ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１）、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５４、ｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０５６およびｓｏｔ＿ｄ＿ｌｒ＿０６４の用量応答曲線を示す；各スピーゲルマーによるグレリン誘発性カルシウム放出の阻害は、二重反復で測定する。
【図３６Ａ−３８Ｂ】ｉ．ｖ．注射による食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかの投与後のマウスの摂餌量を示す。
【図３９−４０】ｉ．ｖ．注射による食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかの投与後のマウスの摂餌量を示す；マウスを１時間の期間にわたって暗期中に２回のみ餌を入手できるように訓練した；全部で２４匹の動物での実験を１２匹の動物の２組に分け、図３９は第１の実験における１２匹の動物の摂餌量を示し、そして図４０は第２の実験を示す。
【図４１】図３９〜４０に示すデータを要約する、２４匹全てのマウスの全摂餌量を示す。
【図４２】食塩水溶液、非活性コントロールスピーゲルマーもしくはＰＥＧ化Ｂ１１スピーゲルマーのいずれかのｉｃｖ投与後のラットの２４時間摂餌量を示す。
【図４３】１５０ｎｍｏｌ／ラットの抗グレリンスピーゲルマーの単回ｉ．ｖ．注射による外因性グレリン投与後の成長ホルモン放出の阻害を示す。
【図４４】ラットにおける摂餌量へのグレリン（それぞれ、１６．７ｎｍｏｌ／ｋｇ、３３．４ｎｍｏｌ／ｋｇ、８３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単回ｉ．ｐ．投与の効果を示す。
【図４５】ラットにおけるグレリンで刺激されるＧＨ放出への抗グレリンスピーゲルマーの異なる用量の効果を示す；ＧＨ放出を３ｎｍｏｌｅのグレリンの単回静脈内投与で誘導し（Ａ）、そしてＧＨのグレリン誘発性放出は、１５ｎｍｏｌｅ（Ｃ）および３０ｎｍｏｌｅ（Ｄ）の抗グレリンスピーゲルマーの事前の静脈内投与により抑制されたが、３ｎｍｏｌｅの抗グレリンスピーゲルマー（Ｂ）では抑制されなかった。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸であり且つ好ましくは該核酸がグレリンに結合するグレリンのアンタゴニスト。
【請求項２】
核酸であり且つ好ましくは該核酸が該受容体のリガンドに結合し、そして好ましくは該リガンドがグレリンであるＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニスト。
【請求項３】
核酸が少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる請求項１もしくは２に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
アンタゴニストがＬ−核酸である請求項１〜３のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
核酸が請求項６〜１４のいずれかに定義するとおりの核酸である請求項１〜４のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
グレリンに結合する核酸、好ましくは、Ｌ−グレリンに結合するＬ−核酸。
【請求項７】
Ｌ−核酸が請求項８〜１４のいずれかに定義するとおりの核酸である請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
配列番号７〜配列番号１２５に記載の配列を含んでなる群から選択される配列を有する核酸。
【請求項９】
核酸が少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
核酸がＬ−核酸である請求項８〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
核酸がＤＮＡ、ＲＮＡおよびその組み合わせを含んでなる群から選択される請求項８〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
核酸のＫｄが１μＭ未満、好ましくは０．２５μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満、そして最も好ましくは０．０１μＭ未満である請求項８〜１１のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
核酸のＫｄが１００ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きく、より好ましくは１ｎＭより大きく、そして最も好ましくは０．０５ｎＭより大きい請求項８〜１２のいずれかに記載の核酸。
【請求項１４】
核酸が１５〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチドおよび３０〜５０ヌクレオチドを含んでなる群から選択される長さのものである請求項８〜１３のいずれかに記載の核酸。
【請求項１５】
グレリンおよび／もしくはＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニストとしての請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項１６】
標的分子がグレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子と接触させる段階；
ｃ）標的分子と相互作用しない核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；
ｄ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；および
ｅ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）をシーケンスする段階
を含んでなる標的分子に結合する核酸の、好ましくは請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸の作製および／もしくは同定の方法。
【請求項１７】
段階ｃ）の後に、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）の増幅からなる段階ｃａ）を実施する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
段階ｂ）〜ｄ）を繰り返す請求項１６もしくは１７に記載の方法。
【請求項１９】
核酸の不均一集団が請求項６〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸を含んでなる請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
標的分子がＬ−グレリンであり、そして標的分子の光学対掌体がＤ−グレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）Ｄ−核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる段階；
ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する段階；
ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸をシーケンスする段階；および
ｅ）段階ｄ）において得られるＤ−核酸（１つもしくは複数）の配列と同一であるＬ−核酸配列（１つもしくは複数）を合成する段階；
を含んでなる自然立体配置（ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）における標的分子に結合するＬ−核酸の作製の方法。
【請求項２１】
段階ｃ）の後で以下の段階：
ｃａ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸を増幅する段階
を導入することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｂ）〜ｅ）を繰り返すことを特徴とする請求項２０〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
核酸の不均一集団が請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸を含んでなることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
薬剤の製造のための請求項６〜１７のいずれかに記載の核酸のそして／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストの使用。
【請求項２５】
薬剤が肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧ならびに心臓血管疾患を含んでなる群から選択される疾患もしくは障害の処置用であることを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸および／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニスト、ならびに製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
【請求項２７】
グレリンおよび請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸のいずれかを含んでなる複合体（好ましくは、該複合体は結晶性複合体である）。
【請求項２８】
グレリンの検出のための請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸のそして／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストのいずれかの使用。
【請求項２９】
以下の段階：
−候補グレリンアンタゴニストを準備する段階；
−請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸および／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストを準備する段階；
−グレリンアンタゴニストの存在下でシグナルを与える試験系を準備する段階；および
−候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるかどうかを決定する段階
を含んでなるグレリンアンタゴニストのスクリーニングの方法。
【請求項３０】
請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸および／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストを含んでなるグレリンの検出のためのキット。
【請求項１】
核酸であり且つ好ましくは該核酸がグレリンに結合するグレリンのアンタゴニスト。
【請求項２】
核酸であり且つ好ましくは該核酸が該受容体のリガンドに結合し、そして好ましくは該リガンドがグレリンであるＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニスト。
【請求項３】
核酸が少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる請求項１もしくは２に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
アンタゴニストがＬ−核酸である請求項１〜３のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
核酸が請求項６〜１４のいずれかに定義するとおりの核酸である請求項１〜４のいずれかに記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
グレリンに結合する核酸、好ましくは、Ｌ−グレリンに結合するＬ−核酸。
【請求項７】
Ｌ−核酸が請求項８〜１４のいずれかに定義するとおりの核酸である請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
配列番号７〜配列番号１２５に記載の配列を含んでなる群から選択される配列を有する核酸。
【請求項９】
核酸が少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含んでなる請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
核酸がＬ−核酸である請求項８〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
核酸がＤＮＡ、ＲＮＡおよびその組み合わせを含んでなる群から選択される請求項８〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
核酸のＫｄが１μＭ未満、好ましくは０．２５μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満、そして最も好ましくは０．０１μＭ未満である請求項８〜１１のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
核酸のＫｄが１００ｎＭより大きく、好ましくは１０ｎＭより大きく、より好ましくは１ｎＭより大きく、そして最も好ましくは０．０５ｎＭより大きい請求項８〜１２のいずれかに記載の核酸。
【請求項１４】
核酸が１５〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチドおよび３０〜５０ヌクレオチドを含んでなる群から選択される長さのものである請求項８〜１３のいずれかに記載の核酸。
【請求項１５】
グレリンおよび／もしくはＧＨＳＲ １ａ受容体系のアンタゴニストとしての請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項１６】
標的分子がグレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子と接触させる段階；
ｃ）標的分子と相互作用しない核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；
ｄ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）を分離する段階；および
ｅ）場合により、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）をシーケンスする段階
を含んでなる標的分子に結合する核酸の、好ましくは請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸の作製および／もしくは同定の方法。
【請求項１７】
段階ｃ）の後に、標的分子と相互作用する核酸（１つもしくは複数）の増幅からなる段階ｃａ）を実施する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
段階ｂ）〜ｄ）を繰り返す請求項１６もしくは１７に記載の方法。
【請求項１９】
核酸の不均一集団が請求項６〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸を含んでなる請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
標的分子がＬ−グレリンであり、そして標的分子の光学対掌体がＤ−グレリンであることを特徴とする、以下の段階：
ａ）Ｄ−核酸の不均一集団を作製する段階；
ｂ）段階ａ）の集団を標的分子の光学対掌体と接触させる段階；
ｃ）標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する段階；
ｄ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸をシーケンスする段階；および
ｅ）段階ｄ）において得られるＤ−核酸（１つもしくは複数）の配列と同一であるＬ−核酸配列（１つもしくは複数）を合成する段階；
を含んでなる自然立体配置（ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）における標的分子に結合するＬ−核酸の作製の方法。
【請求項２１】
段階ｃ）の後で以下の段階：
ｃａ）標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸を増幅する段階
を導入することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｂ）〜ｅ）を繰り返すことを特徴とする請求項２０〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
核酸の不均一集団が請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸を含んでなることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
薬剤の製造のための請求項６〜１７のいずれかに記載の核酸のそして／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストの使用。
【請求項２５】
薬剤が肥満症、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧ならびに心臓血管疾患を含んでなる群から選択される疾患もしくは障害の処置用であることを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸および／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニスト、ならびに製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
【請求項２７】
グレリンおよび請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸のいずれかを含んでなる複合体（好ましくは、該複合体は結晶性複合体である）。
【請求項２８】
グレリンの検出のための請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸のそして／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストのいずれかの使用。
【請求項２９】
以下の段階：
−候補グレリンアンタゴニストを準備する段階；
−請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸および／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストを準備する段階；
−グレリンアンタゴニストの存在下でシグナルを与える試験系を準備する段階；および
−候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるかどうかを決定する段階
を含んでなるグレリンアンタゴニストのスクリーニングの方法。
【請求項３０】
請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸および／もしくは請求項１〜５のいずれかに記載のアンタゴニストを含んでなるグレリンの検出のためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３２Ｃ】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【図３７Ａ】
【図３７Ｂ】
【図３８Ａ】
【図３８Ｂ】
【図３９Ａ−Ｂ】
【図４０Ａ−Ｂ】
【図４１Ａ−Ｂ】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４−１】
【図２４−２】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２Ａ】
【図３２Ｂ】
【図３２Ｃ】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【図３７Ａ】
【図３７Ｂ】
【図３８Ａ】
【図３８Ｂ】
【図３９Ａ−Ｂ】
【図４０Ａ−Ｂ】
【図４１Ａ−Ｂ】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【公表番号】特表２００６−５０１８６４（Ｐ２００６−５０１８６４Ａ）
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６０７４（Ｐ２００５−５０６０７４）
【出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００８５４２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１３２７４
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【出願人】（５０４４１１２１４）ノクソン・フアルマ・アクチエンゲゼルシヤフト (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００８５４２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０１３２７４
【国際公開日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【出願人】（５０４４１１２１４）ノクソン・フアルマ・アクチエンゲゼルシヤフト (8)
【Ｆターム（参考）】
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