ケンペロール−３−Ｏ−ルチノシドを製造する方法及びこれを含有する皮膚外用剤組成物
本発明は、ケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法及びこれを有効成分として含有する皮膚外用剤組成物に関する。より詳細には、植物抽出物でケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から酵素または微生物を利用して選択的に糖を除去する加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する方法及びこれを有効成分として含有し、しわ改善効果に優れた皮膚外用剤組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法、及びこれを有効成分として含有する皮膚外用剤組成物に関する。より詳細には、植物抽出物中のケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から酵素または微生物を利用する選択的糖除去が可能な加水分解を通じて、ケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する方法、及びこれを有効成分として含有し、しわ改善効果に優れた皮膚外用剤組成物に関する。
【０００２】
【化１】
【背景技術】
【０００３】
上記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドは、フラボノイドの１つであるフラボノールの代表的な成分中の１つであって、植物の花または葉に広く分布している（Redox report, 4, 13-16, 1999）。特に、ケンペロール-3-O-ルチノシドは、抗酸化（Redox Report, Vol.4, No.3, 1999）、血行改善（Biol. Pharm. Bull. 25(4)505-508, 2002）などの生理活性に優れた物質として多様な効能が研究されており、多様な分野への適用がなされている。しかし、現在使用されているケンペロール-3-O-ルチノシドは、大部分が植物抽出物に微量含有された形態であって、その含有量が数ppmから数十ppm程度であり、ケンペロール-3-O-ルチノシドの実質的な効能を発現させるのは困難である。また、ケンペロール-3-O-ルチノシドを多量に含有する植物を見つけ出すのは困難であり、多量のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造するための分離精製も経済性を勘案するとメリットに乏しく、ケンペロール-3-O-ルチノシドの大量生産に対する研究はほとんどなされていないのが実情である。
【０００４】
一方、皮膚の外形は、真皮組職の細胞外マトリックス（ECM；extracelluar matrix）成分が担当するようになり、ＥＣＭ全体の約７０〜８０%を占めているものがコラーゲンである。皮膚しわの生成は、老化や紫外線などによって誘発されるコラーゲンの生成低下または破壊に起因し、特に、コラゲナーゼのようなマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metallo protease）の発現に起因して皮膚内で正常的に生成されたコラーゲンが分解され、しわが生成されるようになる。
【０００５】
このようなしわ生成の原因となるコラーゲンの減少を抑制しようとする目的で、さまざまな物質が開発されて使用されており、レチノール、レチノイン酸などのレチノイド物質は、しわ改善効果を示し（Dermatology therapy, 1998, 16, 357〜364）、麦芽抽出物などを含む組成物は、コラゲナーゼを抑制するのに応用されている（日本国特許第5,105,693号公報）。しかし、これらレチノイドは、少量だけを皮膚に適用しても、刺激が現われるという短所を有する。また、大部分の天然物来由の原料は、単純抽出物の形態で使用されて来、その抽出物が示す効能が正確にどんな物質によるものであるかが明らかにされていないため、その抽出物の活性を持続的に維持、制御することが難しいことが現実である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特許第5,105,693号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Redox report, 4, 13-16, 1999
【非特許文献２】Redox Report, Vol.4, No.3, 1999
【非特許文献３】Biol. Pharm. Bull. 25(4)505-508, 2002
【非特許文献４】Dermatology therapy, 1998, 16, 357〜364
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これより、本発明者らは、緑茶にカメリアシードＡ、カメリアシードＢなどの配糖体が多量含有されていることを知見し、これから生理活性に優れたケンペロール-3-O-ルチノシドを大量生産することができる方法を研究し、また、ケンペロール-3-O-ルチノシドが皮膚しわ改善効果に優れていることを確認するようになった。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、化粧品及び食品素材として活用が可能な高純度のケンペロール-3-O-ルチノシドを大量に製造することができる方法を提供し、また、上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有し、しわ改善効果に優れた皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のような目的を達成するために、本発明では、下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法において、ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的に糖除去が可能な酵素または微生物を利用した加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法を提供する。
【００１１】
【化２】
【００１２】
また、本発明は、ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物を提供する。
【００１３】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
上記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法は、
（１）水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物を収得する段階と、
（２）酵素または微生物を利用して上記抽出物でケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的に糖を除去する加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する段階と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
（１）水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物 抽出物を収得する段階
植物、特に、緑茶（Camellia sinensis）から水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシドまたはケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物を収得するために、緑茶の葉または緑茶の種子に約１乃至６倍、好ましくは、約３倍の有機溶媒を入れ、常温で１乃至５回撹拌しながら抽出して脱脂させる。脱脂された植物に約１乃至８倍、好ましくは、約４倍の水または有機溶媒を入れ、１乃至５回還流抽出した後、１０乃至２０℃で１乃至３日間沈積させる。次に、濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテルなどを利用して色素を除去する。水層を有機溶媒を使用して１乃至５回抽出した後、収得した有機溶媒層を減圧濃縮して有機溶媒抽出物を得る。次に、これを少量のメタノールなどに溶解した後、大量のエチルアセテートなどを追加して生成された沈殿物を乾燥させて、本発明の上記ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する抽出物を収得することができる。
【００１５】
上記段階で収得する抽出物に含有されたケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体は、特にカメリアシードＡまたはカメリアシードＢであることを特徴とする。
【００１６】
また、上記有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選択された１種以上の有機溶媒またはこれらと水の混合物を使用することができ、好ましくは、８０%エタノールを使用することができる。
【００１７】
（２）酵素または微生物を利用して上記抽出物でケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体か ら選択的に糖を除去する加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する 段階
上記（１）段階で製造された抽出物のうちケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体であるカメリアシードＡまたはＢから酵素または微生物を利用してケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する。
【００１８】
また、上記酵素は、糖結合を分解する酵素であって、微生物などから得ることができる酵素である。この酵素は、商業的に市販されるものを使用するか、または、必要に応じて製造して使用することができる。この酵素は、特に、ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から糖を選択的に除去することによって、ケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する活性を有する酵素であることを特徴とする。
【００１９】
カメリアシードＡからケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する反応は、下記反応式１のとおりである。
【００２０】
【化３】
【００２１】
上記反応では、ケンペロール-3-O-ルチノシドは、カメリアシードＡからガラクトピラノースグループの糖を選択的に除去して収得されるものであることを特徴とし、カメリアシードＡから糖を除去するための酵素は、グルコシダーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ及びアミログルコシダーゼよりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする。
【００２２】
カメリアシードＢからケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する反応は、下記反応式２のとおりである。
【００２３】
【化４】
【００２４】
上記反応では、ケンペロール-3-O-ルチノシドは、カメリアシードＢからキシロピラノースグループの糖を選択的に除去して収得されるものであることを特徴とし、カメリアシードＢから糖を除去するための酵素は、キシロシダーゼ、キシラナーゼ及びナリギナーゼよりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする。
【００２５】
また、反応式１及び２で使用する微生物は、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属、クモノスカビ（Rhizopus）属、ケカビ（Mucor）属、タラロミセス属、ビフィドバクテリウム属、クサレケカビ(Mortierella)属、クリプトコックス属、及びミクロバクテリウム属よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする。
【００２６】
この時、酵素または微生物の反応時のｐＨは、４．０乃至５．５の範囲であることが好ましく、ｐＨ４未満なら反応速度が遅くなり、ｐＨ５．５を超過すれば、収率が低下する問題点がある。また、酵素または微生物の反応温度は、３０乃至５０℃であることが好ましく、上記温度が３０℃未満なら反応速度が遅くなり、反応速度が５０℃を超過すれば、酵素の反応選択性が低下する問題点がある。
【００２７】
一方、上記マトリックスとして緑茶種子抽出物の濃度は、５乃至２０%範囲であることが好ましく、上記範囲から外れる場合、酵素または微生物の使用量対比経済性が低下するか、反応速度が非常に遅くなる問題点がある。この時、反応時間は、４８乃至７６時間であることが好ましい。
【００２８】
最後に、反応液について薄層クロマトグラフィーでマトリックスの消去率を確認し、マトリックスが完全に消失されれば、熱水（80〜100℃）中で５乃至１５分間加熱し、反応を終了させる。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１乃至５回撹拌させた後、沈殿された塩を濾過により除去する。その後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8：1〜4：1）で分離し、純粋なケンペロール-3-O-ルチノシドを収得することができる。
【００２９】
本発明では、ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物を提供する。
【００３０】
上記の方法で植物、特に緑茶から得たケンペロール-3-O-ルチノシドを含有する外用剤組成物は、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼの発現抑制活性の複合相乗作用によりしわ改善効果に優れている。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤組成物は、上記の方法で得たケンペロール-3-O-ルチノシドを組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量%含有することを特徴とする。含量が０．０００１重量%未満の場合には、上記成分による皮膚しわ改善効果などを得ることができず、含量が１０重量%超過する場合には、含量増加に比べて効果の増加が大きくないからである。
【００３２】
本発明によるケンペロール-3-O-ルチノシドは、皮膚外用剤組成物に使用されることができ、その剤形において特に限定されるものではない。例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クルレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メーキャップベース、ファウンデーション、染毛剤、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤などの化粧料組成物、または軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、噴霧剤などの医薬用組成物に剤形化されることができる。これら各剤形は、その剤形の製剤化に必要であり、適切な各種の基剤と添加物を含有することができ、これら成分の種類と量は、発明者によって容易に選定されることができる。
【発明の効果】
【００３３】
以上説明したように、植物、特に緑茶に多量含有されているカメリアシードＡ、カメリアシードＢを抽出した後、酵素または微生物を利用した選択的糖除去を通じて、主要な生理活性物質の１つであるケンペロール-3-O-ルチノシドを大量で生産することができる。上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼ発現抑制効果を示し、この２つの活性の複合相乗作用により優秀な皮膚しわ改善効果があり、上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、製造例、実施例及び実験例により本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、これらの例に限定されるものではない。
【００３５】
［製造例１：緑茶種子抽出物の製造］
緑茶種子２kgにヘキサン６リットル(L)を入れ、常温で３回撹拌抽出して脱脂させた後、脱脂された緑茶種子１kgに８０%メタノール４Lを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾過布を用いた濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテル１Lで５回抽出して色素を除去し、水層を1-ブタノール５００mLで３回抽出した。これより得た全体1-ブタノール層を減圧濃縮して1-ブタノール抽出物を得、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加し、生成された沈殿物を乾燥することによって、緑茶種子抽出物２５０gを収得した。
【００３６】
［実施例１：カメリアシードＡを選択的に加水分解する酵素の選別］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに酵素１．５gを添加して３７℃水浴で２４時間及び４８時間反応させた。反応の転換率分析は、ＨＰＬＣを利用してＣ１８逆相カラム（reverse phase column）でアセトニトリル：水（40：60）を移動相にしてＵＶ波長２７０nmで分析した。実験に使用された酵素の種類と転換率の結果を下記表１に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
上記表１で、一定時間経過後の生成率が５０%前後である酵素は、反応選択性が高い可能性がある酵素を意味すると見られる。したがって、ベータ-グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼ-Ａ及びベータ-ガラクトシダーゼは、上記選択的糖除去反応において選択性が高い候補群であることを予測することができる。
【００３９】
［実施例２：カメリアシードＢを選択的に加水分解する酵素の選別］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに酵素１．５gを添加して３７℃水浴で２４時間及び４８時間反応させた。反応の転換率分析は、ＨＰＬＣを利用してC18逆相カラム（reverse phase column）でアセトニトリル：水（40：60）を移動相にしてＵＶ波長２７０nmで分析した。実験に使用された酵素の種類と転換率の結果を下記表２に示した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
上記表２で、一定時間経過後の生成率が５０%前後である酵素は、反応選択性が高い可能性がある酵素を意味すると見られる。したがって、ベータ-キシロシダーゼ、キシラナーゼ及びナリギナーゼは、上記選択的糖除去反応において選択性が高い候補群であることを予測することができる。
【００４２】
［試験例１：温度によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、多様な温度でのケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
３０乃至５０℃でケンペロール-3-O-ルチノシドが円滑に転換されることを確認することができた。また、３０℃や４０℃よりは３５℃でさらに高い転換率を示したが、これは、温度によって酵素の反応性が増加した結果である。しかし、４５℃以上の温度では生成率が低くなる現象を示したが、これは、温度増加による酵素の不安定性から起因したものと把握される。
【００４５】
［試験例２：反応時間によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、３７℃水浴で反応時間によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００４６】
【表４】
【００４７】
反応開始後、７２時間経過後に９８%の生成率を示し、それ以上の反応時にも同様の生成率を示した。
【００４８】
［試験例３：反応ｐＨによるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、３７℃水浴で緩衝溶液のｐＨによるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００４９】
【表５】
【００５０】
上記結果によれば、ｐＨ４．０乃至５．５範囲で９０%以上の高い生成率を示し、ｐＨ４．５で９８%の最高生成率を示した。
【００５１】
［試験例４：マトリックス濃度によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物を５乃至５０%に調整し、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、３７℃水浴でケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００５２】
【表６】
【００５３】
上記結果によれば、マトリックス濃度は、５乃至２０%範囲で９０%以上の高い転換率を示し、１０%のマトリックス濃度で９８%の最高転換率を示した。
【００５４】
［試験例５：ケンペロール-3-O-ルチノシドの同定］
上記実施例１乃至６で製造された生成物は、下記のような特性を示し、ケンペロール-3-O-ルチノシドで同定（Varian Gemini 2000 300MHz, Varian社）した。
【００５５】
＜ケンペロール-3-O-ルチノシドの物理化学的性状＞
性状：淡い緑黄色の微細結晶
陽性FAB-MS：595[M+H]+
1HNMR：6.31(1H,d,2,H6), 6.63(1H,d,2,H8), 7.03(2H,d,8,H3',5'), 8.21(2H,d,8,H2',6'), 12.04(1H,s,5-OH)， 1.10(3H,d,4,Me-rha), 4.61(1H,brs,H1-rha), 5.20(1H,d,8,H1-glc)
13C-NMR：156.6, 133.5, 177.5, 161.3, 98.9, 16.2, 93.8, 156.9, 104.2, 121.1, 130.9, 115.2, 159.9, 115.2, 130.9, 101.6, 74.4, 76.7, 70.9, 76.0, 67.1, 100.8, 70.5, 70.2, 72.1, 68.3, 17.7
【００５６】
［実施例３：カメリアシードＡの酵素反応によるケンペロール-3-O-ルチノシドの製造］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、酵素１．５gを添加して、３７℃水浴で４８時間乃至７６時間反応させた。ここで、酵素は、ベータ-グルコシダーゼ（実施例3-1）、セルラーゼ-Ａ（実施例3-2）またはベータ-ガラクトシダーゼ（実施例3-3）を使用してそれぞれの酵素を利用して製造されたケンペロール-3-O-ルチノシドを収得するようにした。その後、反応液について薄層クロマトグラフィーでマトリックスの消去率を確認し、マトリックスが完全に消失すれば、熱水（80〜100℃）内で５〜１５分間加熱して反応を終了させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１〜５回撹拌させた後、沈殿された塩を濾過により除去した。その後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8：1〜4：1）で分離し、純粋なケンペロール-3-O-ルチノシドを収得した。
【００５７】
［実施例４：カメリアシードＢの酵素反応によるケンペロール-3-O-ルチノシドの製造］
使用した酵素がベータ-キシロシダーゼ（実施例4-1）、キシラナーゼ（実施例4-2）またはナリギナーゼ（実施例4-3）であることを上記実施例１と同一の方法にしてカメリアシードＢからケンペロール-3-O-ルチノシドを製造した。
【００５８】
［試験例６：コラゲナーゼ発現抑制効能測定］
上記実施例３乃至４から得たケンペロール-3-O-ルチノシドのコラゲナーゼ生成抑制能をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して測定した。トコフェロール及びＥＧＣＧは、抗酸化物質であって、皮膚の表皮細胞を再生させて皮膚の老化を防止する機能があるものと知られた物質である。
【００５９】
試験は、２．５%の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Media）培地が入っている96-孔平板培養器（96-well microtiter plate）に人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／孔（well）になるように入れ、９０%程度成長するまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された上記実施例３乃至４のケンペロール-3-O-ルチノシド、トコフェロール及びＥＧＣＧを１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００６０】
採取した細胞培養液を商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定器具（米国アマシャムファルマシア社製）を利用してコラゲナーゼ生成程度を測定した。まず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された96-孔平板に採取された細胞培養液を入れ、３時間抗原-抗体反応を恒温槽で実施した。
【００６１】
３時間後、発色団が結合された２次コラーゲン抗体を96-孔平板に入れ、さらに１５分間反応させた。１５分後、発色誘発物質を入れ、室温で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫酸を入れ、反応（発色）を中止させれば、反応液の色は、黄色を呈し、反応進行の程度によって黄色の程度が異なって現われた。
【００６２】
黄色を呈する９６-孔平板の吸光度を吸光計を利用して４０５nmで測定し、下記数式１によってコラゲナーゼの合成程度を計算した。この時、組成物を処理しない群の採取された細胞培養液の反応吸光度を対照群とした。すなわち、非処理群でのコラゲナーゼの発現程度を１００にし、これに対比して組成物を処理した群でのコラゲナーゼの発現程度を求め、結果を表７に示した。
【００６３】
［数式１］
コラゲナーゼ発現程度(%)
＝(上記物質処理細胞群の吸光度／対照群の吸光度)×１００
【００６４】
【表７】
【００６５】
コラゲナーゼの発現程度が低いほどコラゲナーゼの発現抑制能が高く、皮膚内のコラーゲンの分解が少なく生じ、したがって、生成されるしわの量が少なくなる。表７から明らかなように、実施例３及び実施例４で使用した酵素によってコラゲナーゼ発現の程度に差異があるが、本発明によるケンペロール-3-O-ルチノシドは、試験管内（in vitro）でコラゲナーゼの発現を抑制することを確認することができた。また、コラゲナーゼの発現抑制能が抗酸化物質として知られているトコフェロールより優れていることを確認することができた。
【００６６】
［試験例７：プロコラーゲン生成促進効能実験］
上記実施例３乃至４から得たケンペロール-3-O-ルチノシドのプロコラーゲン生成能をビタミンＣと比較して測定した。プロコラーゲンは、コラーゲン生成誘導物質であって、コラーゲン生成と老化防止に必要な物質であり、ビタミンＣは、コラーゲンの合成に必須成分として知られている。
【００６７】
試験は、２．５%の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Media）培地が入っている96-孔平板培養器に人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／孔になるように入れ、９０%程度成長するまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された上記実施例３乃至４のケンペロール-3-O-ルチノシド、ビタミンＣを１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。２４時間後に培地中に遊離されたプロコラーゲンの量をプロコラーゲンタイプ-1C-ペプチッドEIAキット（procollagen type-1C-peptide EIA kit）（MK101 Takara, Japan）を使用して測定した。
【００６８】
非処理群でのプロコラーゲン生成程度を１００にし、これに対比して組成物を処理した群でのプロコラーゲン生成程度を求め、結果を表８に示した。
【００６９】
【表８】
【００７０】
プロコラーゲンの生成程度が高いほどコラーゲンの生成程度が高くなり、したがって、皮膚しわの生成を防止することができる。表８から明らかなように、実施例３及び実施例４で使用した酵素によってプロコラーゲン生成程度に差異があるが、本発明によるケンペロール-3-O-ルチノシドは、試験管内（in vitro）でプロコラーゲンの生成を促進することを確認することができた。また、プロコラーゲンの生成促進程度がコラーゲンの合成に必須な成分として知られているビタミンＣより優れていることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、植物抽出物に含有されているケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から酵素または微生物を利用することによって、選択的に糖を除去し、ケンペロール-3-O-ルチノシドを大量で生産することができる方法を提供する。また、上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有することによって、しわ改善に効果がある皮膚外用剤組成物を提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法、及びこれを有効成分として含有する皮膚外用剤組成物に関する。より詳細には、植物抽出物中のケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から酵素または微生物を利用する選択的糖除去が可能な加水分解を通じて、ケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する方法、及びこれを有効成分として含有し、しわ改善効果に優れた皮膚外用剤組成物に関する。
【０００２】
【化１】
【背景技術】
【０００３】
上記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドは、フラボノイドの１つであるフラボノールの代表的な成分中の１つであって、植物の花または葉に広く分布している（Redox report, 4, 13-16, 1999）。特に、ケンペロール-3-O-ルチノシドは、抗酸化（Redox Report, Vol.4, No.3, 1999）、血行改善（Biol. Pharm. Bull. 25(4)505-508, 2002）などの生理活性に優れた物質として多様な効能が研究されており、多様な分野への適用がなされている。しかし、現在使用されているケンペロール-3-O-ルチノシドは、大部分が植物抽出物に微量含有された形態であって、その含有量が数ppmから数十ppm程度であり、ケンペロール-3-O-ルチノシドの実質的な効能を発現させるのは困難である。また、ケンペロール-3-O-ルチノシドを多量に含有する植物を見つけ出すのは困難であり、多量のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造するための分離精製も経済性を勘案するとメリットに乏しく、ケンペロール-3-O-ルチノシドの大量生産に対する研究はほとんどなされていないのが実情である。
【０００４】
一方、皮膚の外形は、真皮組職の細胞外マトリックス（ECM；extracelluar matrix）成分が担当するようになり、ＥＣＭ全体の約７０〜８０%を占めているものがコラーゲンである。皮膚しわの生成は、老化や紫外線などによって誘発されるコラーゲンの生成低下または破壊に起因し、特に、コラゲナーゼのようなマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metallo protease）の発現に起因して皮膚内で正常的に生成されたコラーゲンが分解され、しわが生成されるようになる。
【０００５】
このようなしわ生成の原因となるコラーゲンの減少を抑制しようとする目的で、さまざまな物質が開発されて使用されており、レチノール、レチノイン酸などのレチノイド物質は、しわ改善効果を示し（Dermatology therapy, 1998, 16, 357〜364）、麦芽抽出物などを含む組成物は、コラゲナーゼを抑制するのに応用されている（日本国特許第5,105,693号公報）。しかし、これらレチノイドは、少量だけを皮膚に適用しても、刺激が現われるという短所を有する。また、大部分の天然物来由の原料は、単純抽出物の形態で使用されて来、その抽出物が示す効能が正確にどんな物質によるものであるかが明らかにされていないため、その抽出物の活性を持続的に維持、制御することが難しいことが現実である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特許第5,105,693号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Redox report, 4, 13-16, 1999
【非特許文献２】Redox Report, Vol.4, No.3, 1999
【非特許文献３】Biol. Pharm. Bull. 25(4)505-508, 2002
【非特許文献４】Dermatology therapy, 1998, 16, 357〜364
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これより、本発明者らは、緑茶にカメリアシードＡ、カメリアシードＢなどの配糖体が多量含有されていることを知見し、これから生理活性に優れたケンペロール-3-O-ルチノシドを大量生産することができる方法を研究し、また、ケンペロール-3-O-ルチノシドが皮膚しわ改善効果に優れていることを確認するようになった。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、化粧品及び食品素材として活用が可能な高純度のケンペロール-3-O-ルチノシドを大量に製造することができる方法を提供し、また、上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有し、しわ改善効果に優れた皮膚外用剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のような目的を達成するために、本発明では、下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法において、ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的に糖除去が可能な酵素または微生物を利用した加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法を提供する。
【００１１】
【化２】
【００１２】
また、本発明は、ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物を提供する。
【００１３】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
上記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法は、
（１）水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物を収得する段階と、
（２）酵素または微生物を利用して上記抽出物でケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的に糖を除去する加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する段階と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
（１）水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物 抽出物を収得する段階
植物、特に、緑茶（Camellia sinensis）から水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシドまたはケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物を収得するために、緑茶の葉または緑茶の種子に約１乃至６倍、好ましくは、約３倍の有機溶媒を入れ、常温で１乃至５回撹拌しながら抽出して脱脂させる。脱脂された植物に約１乃至８倍、好ましくは、約４倍の水または有機溶媒を入れ、１乃至５回還流抽出した後、１０乃至２０℃で１乃至３日間沈積させる。次に、濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテルなどを利用して色素を除去する。水層を有機溶媒を使用して１乃至５回抽出した後、収得した有機溶媒層を減圧濃縮して有機溶媒抽出物を得る。次に、これを少量のメタノールなどに溶解した後、大量のエチルアセテートなどを追加して生成された沈殿物を乾燥させて、本発明の上記ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する抽出物を収得することができる。
【００１５】
上記段階で収得する抽出物に含有されたケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体は、特にカメリアシードＡまたはカメリアシードＢであることを特徴とする。
【００１６】
また、上記有機溶媒としては、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート及びクロロホルムよりなる群から選択された１種以上の有機溶媒またはこれらと水の混合物を使用することができ、好ましくは、８０%エタノールを使用することができる。
【００１７】
（２）酵素または微生物を利用して上記抽出物でケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体か ら選択的に糖を除去する加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する 段階
上記（１）段階で製造された抽出物のうちケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体であるカメリアシードＡまたはＢから酵素または微生物を利用してケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する。
【００１８】
また、上記酵素は、糖結合を分解する酵素であって、微生物などから得ることができる酵素である。この酵素は、商業的に市販されるものを使用するか、または、必要に応じて製造して使用することができる。この酵素は、特に、ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から糖を選択的に除去することによって、ケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する活性を有する酵素であることを特徴とする。
【００１９】
カメリアシードＡからケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する反応は、下記反応式１のとおりである。
【００２０】
【化３】
【００２１】
上記反応では、ケンペロール-3-O-ルチノシドは、カメリアシードＡからガラクトピラノースグループの糖を選択的に除去して収得されるものであることを特徴とし、カメリアシードＡから糖を除去するための酵素は、グルコシダーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ及びアミログルコシダーゼよりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする。
【００２２】
カメリアシードＢからケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する反応は、下記反応式２のとおりである。
【００２３】
【化４】
【００２４】
上記反応では、ケンペロール-3-O-ルチノシドは、カメリアシードＢからキシロピラノースグループの糖を選択的に除去して収得されるものであることを特徴とし、カメリアシードＢから糖を除去するための酵素は、キシロシダーゼ、キシラナーゼ及びナリギナーゼよりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする。
【００２５】
また、反応式１及び２で使用する微生物は、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属、クモノスカビ（Rhizopus）属、ケカビ（Mucor）属、タラロミセス属、ビフィドバクテリウム属、クサレケカビ(Mortierella)属、クリプトコックス属、及びミクロバクテリウム属よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする。
【００２６】
この時、酵素または微生物の反応時のｐＨは、４．０乃至５．５の範囲であることが好ましく、ｐＨ４未満なら反応速度が遅くなり、ｐＨ５．５を超過すれば、収率が低下する問題点がある。また、酵素または微生物の反応温度は、３０乃至５０℃であることが好ましく、上記温度が３０℃未満なら反応速度が遅くなり、反応速度が５０℃を超過すれば、酵素の反応選択性が低下する問題点がある。
【００２７】
一方、上記マトリックスとして緑茶種子抽出物の濃度は、５乃至２０%範囲であることが好ましく、上記範囲から外れる場合、酵素または微生物の使用量対比経済性が低下するか、反応速度が非常に遅くなる問題点がある。この時、反応時間は、４８乃至７６時間であることが好ましい。
【００２８】
最後に、反応液について薄層クロマトグラフィーでマトリックスの消去率を確認し、マトリックスが完全に消失されれば、熱水（80〜100℃）中で５乃至１５分間加熱し、反応を終了させる。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１乃至５回撹拌させた後、沈殿された塩を濾過により除去する。その後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8：1〜4：1）で分離し、純粋なケンペロール-3-O-ルチノシドを収得することができる。
【００２９】
本発明では、ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物を提供する。
【００３０】
上記の方法で植物、特に緑茶から得たケンペロール-3-O-ルチノシドを含有する外用剤組成物は、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼの発現抑制活性の複合相乗作用によりしわ改善効果に優れている。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤組成物は、上記の方法で得たケンペロール-3-O-ルチノシドを組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量%含有することを特徴とする。含量が０．０００１重量%未満の場合には、上記成分による皮膚しわ改善効果などを得ることができず、含量が１０重量%超過する場合には、含量増加に比べて効果の増加が大きくないからである。
【００３２】
本発明によるケンペロール-3-O-ルチノシドは、皮膚外用剤組成物に使用されることができ、その剤形において特に限定されるものではない。例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クルレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メーキャップベース、ファウンデーション、染毛剤、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤などの化粧料組成物、または軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、噴霧剤などの医薬用組成物に剤形化されることができる。これら各剤形は、その剤形の製剤化に必要であり、適切な各種の基剤と添加物を含有することができ、これら成分の種類と量は、発明者によって容易に選定されることができる。
【発明の効果】
【００３３】
以上説明したように、植物、特に緑茶に多量含有されているカメリアシードＡ、カメリアシードＢを抽出した後、酵素または微生物を利用した選択的糖除去を通じて、主要な生理活性物質の１つであるケンペロール-3-O-ルチノシドを大量で生産することができる。上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼ発現抑制効果を示し、この２つの活性の複合相乗作用により優秀な皮膚しわ改善効果があり、上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、製造例、実施例及び実験例により本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、これらの例に限定されるものではない。
【００３５】
［製造例１：緑茶種子抽出物の製造］
緑茶種子２kgにヘキサン６リットル(L)を入れ、常温で３回撹拌抽出して脱脂させた後、脱脂された緑茶種子１kgに８０%メタノール４Lを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾過布を用いた濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エーテル１Lで５回抽出して色素を除去し、水層を1-ブタノール５００mLで３回抽出した。これより得た全体1-ブタノール層を減圧濃縮して1-ブタノール抽出物を得、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加し、生成された沈殿物を乾燥することによって、緑茶種子抽出物２５０gを収得した。
【００３６】
［実施例１：カメリアシードＡを選択的に加水分解する酵素の選別］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに酵素１．５gを添加して３７℃水浴で２４時間及び４８時間反応させた。反応の転換率分析は、ＨＰＬＣを利用してＣ１８逆相カラム（reverse phase column）でアセトニトリル：水（40：60）を移動相にしてＵＶ波長２７０nmで分析した。実験に使用された酵素の種類と転換率の結果を下記表１に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
上記表１で、一定時間経過後の生成率が５０%前後である酵素は、反応選択性が高い可能性がある酵素を意味すると見られる。したがって、ベータ-グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ、セルラーゼ-Ａ及びベータ-ガラクトシダーゼは、上記選択的糖除去反応において選択性が高い候補群であることを予測することができる。
【００３９】
［実施例２：カメリアシードＢを選択的に加水分解する酵素の選別］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに酵素１．５gを添加して３７℃水浴で２４時間及び４８時間反応させた。反応の転換率分析は、ＨＰＬＣを利用してC18逆相カラム（reverse phase column）でアセトニトリル：水（40：60）を移動相にしてＵＶ波長２７０nmで分析した。実験に使用された酵素の種類と転換率の結果を下記表２に示した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
上記表２で、一定時間経過後の生成率が５０%前後である酵素は、反応選択性が高い可能性がある酵素を意味すると見られる。したがって、ベータ-キシロシダーゼ、キシラナーゼ及びナリギナーゼは、上記選択的糖除去反応において選択性が高い候補群であることを予測することができる。
【００４２】
［試験例１：温度によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、多様な温度でのケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
３０乃至５０℃でケンペロール-3-O-ルチノシドが円滑に転換されることを確認することができた。また、３０℃や４０℃よりは３５℃でさらに高い転換率を示したが、これは、温度によって酵素の反応性が増加した結果である。しかし、４５℃以上の温度では生成率が低くなる現象を示したが、これは、温度増加による酵素の不安定性から起因したものと把握される。
【００４５】
［試験例２：反応時間によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、３７℃水浴で反応時間によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００４６】
【表４】
【００４７】
反応開始後、７２時間経過後に９８%の生成率を示し、それ以上の反応時にも同様の生成率を示した。
【００４８】
［試験例３：反応ｐＨによるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、３７℃水浴で緩衝溶液のｐＨによるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００４９】
【表５】
【００５０】
上記結果によれば、ｐＨ４．０乃至５．５範囲で９０%以上の高い生成率を示し、ｐＨ４．５で９８%の最高生成率を示した。
【００５１】
［試験例４：マトリックス濃度によるケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率変化］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物を５乃至５０%に調整し、これに上記候補酵素のうちベータ-ガラクトシダーゼ１．５gを添加して、３７℃水浴でケンペロール-3-O-ルチノシドの生成率を確認した。
【００５２】
【表６】
【００５３】
上記結果によれば、マトリックス濃度は、５乃至２０%範囲で９０%以上の高い転換率を示し、１０%のマトリックス濃度で９８%の最高転換率を示した。
【００５４】
［試験例５：ケンペロール-3-O-ルチノシドの同定］
上記実施例１乃至６で製造された生成物は、下記のような特性を示し、ケンペロール-3-O-ルチノシドで同定（Varian Gemini 2000 300MHz, Varian社）した。
【００５５】
＜ケンペロール-3-O-ルチノシドの物理化学的性状＞
性状：淡い緑黄色の微細結晶
陽性FAB-MS：595[M+H]+
1HNMR：6.31(1H,d,2,H6), 6.63(1H,d,2,H8), 7.03(2H,d,8,H3',5'), 8.21(2H,d,8,H2',6'), 12.04(1H,s,5-OH)， 1.10(3H,d,4,Me-rha), 4.61(1H,brs,H1-rha), 5.20(1H,d,8,H1-glc)
13C-NMR：156.6, 133.5, 177.5, 161.3, 98.9, 16.2, 93.8, 156.9, 104.2, 121.1, 130.9, 115.2, 159.9, 115.2, 130.9, 101.6, 74.4, 76.7, 70.9, 76.0, 67.1, 100.8, 70.5, 70.2, 72.1, 68.3, 17.7
【００５６】
［実施例３：カメリアシードＡの酵素反応によるケンペロール-3-O-ルチノシドの製造］
上記製造例１で収得した緑茶種子抽出物１０gを１００mLの0.1M酢酸緩衝溶液（pH4.5）に溶解させ、酵素１．５gを添加して、３７℃水浴で４８時間乃至７６時間反応させた。ここで、酵素は、ベータ-グルコシダーゼ（実施例3-1）、セルラーゼ-Ａ（実施例3-2）またはベータ-ガラクトシダーゼ（実施例3-3）を使用してそれぞれの酵素を利用して製造されたケンペロール-3-O-ルチノシドを収得するようにした。その後、反応液について薄層クロマトグラフィーでマトリックスの消去率を確認し、マトリックスが完全に消失すれば、熱水（80〜100℃）内で５〜１５分間加熱して反応を終了させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にアルコールを加えて１〜５回撹拌させた後、沈殿された塩を濾過により除去した。その後、濾過された濾液を減圧濃縮して粗生成物を収得し、収得された粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8：1〜4：1）で分離し、純粋なケンペロール-3-O-ルチノシドを収得した。
【００５７】
［実施例４：カメリアシードＢの酵素反応によるケンペロール-3-O-ルチノシドの製造］
使用した酵素がベータ-キシロシダーゼ（実施例4-1）、キシラナーゼ（実施例4-2）またはナリギナーゼ（実施例4-3）であることを上記実施例１と同一の方法にしてカメリアシードＢからケンペロール-3-O-ルチノシドを製造した。
【００５８】
［試験例６：コラゲナーゼ発現抑制効能測定］
上記実施例３乃至４から得たケンペロール-3-O-ルチノシドのコラゲナーゼ生成抑制能をトコフェロール及びＥＧＣＧと比較して測定した。トコフェロール及びＥＧＣＧは、抗酸化物質であって、皮膚の表皮細胞を再生させて皮膚の老化を防止する機能があるものと知られた物質である。
【００５９】
試験は、２．５%の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Media）培地が入っている96-孔平板培養器（96-well microtiter plate）に人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／孔（well）になるように入れ、９０%程度成長するまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された上記実施例３乃至４のケンペロール-3-O-ルチノシド、トコフェロール及びＥＧＣＧを１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。
【００６０】
採取した細胞培養液を商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定器具（米国アマシャムファルマシア社製）を利用してコラゲナーゼ生成程度を測定した。まず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された96-孔平板に採取された細胞培養液を入れ、３時間抗原-抗体反応を恒温槽で実施した。
【００６１】
３時間後、発色団が結合された２次コラーゲン抗体を96-孔平板に入れ、さらに１５分間反応させた。１５分後、発色誘発物質を入れ、室温で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫酸を入れ、反応（発色）を中止させれば、反応液の色は、黄色を呈し、反応進行の程度によって黄色の程度が異なって現われた。
【００６２】
黄色を呈する９６-孔平板の吸光度を吸光計を利用して４０５nmで測定し、下記数式１によってコラゲナーゼの合成程度を計算した。この時、組成物を処理しない群の採取された細胞培養液の反応吸光度を対照群とした。すなわち、非処理群でのコラゲナーゼの発現程度を１００にし、これに対比して組成物を処理した群でのコラゲナーゼの発現程度を求め、結果を表７に示した。
【００６３】
［数式１］
コラゲナーゼ発現程度(%)
＝(上記物質処理細胞群の吸光度／対照群の吸光度)×１００
【００６４】
【表７】
【００６５】
コラゲナーゼの発現程度が低いほどコラゲナーゼの発現抑制能が高く、皮膚内のコラーゲンの分解が少なく生じ、したがって、生成されるしわの量が少なくなる。表７から明らかなように、実施例３及び実施例４で使用した酵素によってコラゲナーゼ発現の程度に差異があるが、本発明によるケンペロール-3-O-ルチノシドは、試験管内（in vitro）でコラゲナーゼの発現を抑制することを確認することができた。また、コラゲナーゼの発現抑制能が抗酸化物質として知られているトコフェロールより優れていることを確認することができた。
【００６６】
［試験例７：プロコラーゲン生成促進効能実験］
上記実施例３乃至４から得たケンペロール-3-O-ルチノシドのプロコラーゲン生成能をビタミンＣと比較して測定した。プロコラーゲンは、コラーゲン生成誘導物質であって、コラーゲン生成と老化防止に必要な物質であり、ビタミンＣは、コラーゲンの合成に必須成分として知られている。
【００６７】
試験は、２．５%の牛胎児血清が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Media）培地が入っている96-孔平板培養器に人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／孔になるように入れ、９０%程度成長するまで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解された上記実施例３乃至４のケンペロール-3-O-ルチノシド、ビタミンＣを１０-4モル濃度で２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。２４時間後に培地中に遊離されたプロコラーゲンの量をプロコラーゲンタイプ-1C-ペプチッドEIAキット（procollagen type-1C-peptide EIA kit）（MK101 Takara, Japan）を使用して測定した。
【００６８】
非処理群でのプロコラーゲン生成程度を１００にし、これに対比して組成物を処理した群でのプロコラーゲン生成程度を求め、結果を表８に示した。
【００６９】
【表８】
【００７０】
プロコラーゲンの生成程度が高いほどコラーゲンの生成程度が高くなり、したがって、皮膚しわの生成を防止することができる。表８から明らかなように、実施例３及び実施例４で使用した酵素によってプロコラーゲン生成程度に差異があるが、本発明によるケンペロール-3-O-ルチノシドは、試験管内（in vitro）でプロコラーゲンの生成を促進することを確認することができた。また、プロコラーゲンの生成促進程度がコラーゲンの合成に必須な成分として知られているビタミンＣより優れていることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、植物抽出物に含有されているケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から酵素または微生物を利用することによって、選択的に糖を除去し、ケンペロール-3-O-ルチノシドを大量で生産することができる方法を提供する。また、上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを含有することによって、しわ改善に効果がある皮膚外用剤組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法において、ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的糖除去が可能な酵素または微生物を利用した加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【化１】
【請求項２】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法は、
（１）水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物を収得する段階と、
（２）酵素または微生物を利用して上記抽出物でケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的に糖を除去する加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する段階と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項３】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体は、カメリアシードＡまたはカメリアシードＢであることを特徴とする請求項１に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項４】
ケンペロール-3-O-ルチノシドは、上記カメリアシードＡからガラクトピラノ−スグループの糖を選択的に除去するか、または、上記カメリアシードＢからキシロピラノースグループの糖を選択的に除去して収得するものであることを特徴とする請求項３に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項５】
上記カメリアシードＡから糖を除去するための酵素は、グルコシダーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ及びアミログルコシダーゼよりなる群から選択された１種以上であり、上記カメリアシードＢから糖を除去するための酵素は、キシロシダーゼ、キシラナーゼ及びナリギナーゼよりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項４に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項６】
上記微生物は、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属 、クモノスカビ(Rhizopus)属 、ケカビ(Mucor)属、 タラロミセス属、ビフィドバクテリウム属、 クサレケカビ(Mortierella)属、クリプトコックス属及びミクロバクテリウム属よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項２に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項７】
上記酵素または微生物の反応は、ｐＨ４．０乃至５．５で行われることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項８】
上記酵素または微生物の反応温度は、３０乃至５０℃であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項９】
上記酵素または微生物の反応時間は、４８乃至７６時間であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項１０】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物は、緑茶抽出物であることを特徴とする請求項２に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項１１】
下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【化２】
【請求項１２】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼ発現抑制効果の複合相乗作用を有するものであることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１３】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量％含有されることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１４】
上記組成物は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クルレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メーキャップベース、ファウンデーション、染毛剤、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤の剤形を有する化粧料組成物であることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１５】
上記組成物は、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、噴霧剤の剤形を有する医薬用組成物であることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１６】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、緑茶から分離したものであることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１】
下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法において、ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的糖除去が可能な酵素または微生物を利用した加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【化１】
【請求項２】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法は、
（１）水または有機溶媒を利用してケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物を収得する段階と、
（２）酵素または微生物を利用して上記抽出物でケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体から選択的に糖を除去する加水分解を通じてケンペロール-3-O-ルチノシドを分離する段階と、
を含むことを特徴とする請求項１に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項３】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体は、カメリアシードＡまたはカメリアシードＢであることを特徴とする請求項１に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項４】
ケンペロール-3-O-ルチノシドは、上記カメリアシードＡからガラクトピラノ−スグループの糖を選択的に除去するか、または、上記カメリアシードＢからキシロピラノースグループの糖を選択的に除去して収得するものであることを特徴とする請求項３に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項５】
上記カメリアシードＡから糖を除去するための酵素は、グルコシダーゼ、セルラーゼ、ガラクトシダーゼ及びアミログルコシダーゼよりなる群から選択された１種以上であり、上記カメリアシードＢから糖を除去するための酵素は、キシロシダーゼ、キシラナーゼ及びナリギナーゼよりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項４に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項６】
上記微生物は、アスペルギルス属、バチルス属、ペニシリウム属 、クモノスカビ(Rhizopus)属 、ケカビ(Mucor)属、 タラロミセス属、ビフィドバクテリウム属、 クサレケカビ(Mortierella)属、クリプトコックス属及びミクロバクテリウム属よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項２に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項７】
上記酵素または微生物の反応は、ｐＨ４．０乃至５．５で行われることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項８】
上記酵素または微生物の反応温度は、３０乃至５０℃であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項９】
上記酵素または微生物の反応時間は、４８乃至７６時間であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項１０】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシド配糖体を含有する植物抽出物は、緑茶抽出物であることを特徴とする請求項２に記載のケンペロール-3-O-ルチノシドを製造する方法。
【請求項１１】
下記化学式１で表されるケンペロール-3-O-ルチノシドを含有するしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【化２】
【請求項１２】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼ発現抑制効果の複合相乗作用を有するものであることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１３】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量％含有されることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１４】
上記組成物は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クルレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メーキャップベース、ファウンデーション、染毛剤、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤の剤形を有する化粧料組成物であることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１５】
上記組成物は、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、噴霧剤の剤形を有する医薬用組成物であることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【請求項１６】
上記ケンペロール-3-O-ルチノシドは、緑茶から分離したものであることを特徴とする請求項１１に記載のしわ改善用皮膚外用剤組成物。
【公表番号】特表２０１０−５０５４４１（Ｐ２０１０−５０５４４１Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３２２７８（Ｐ２００９−５３２２７８）
【出願日】平成１９年４月２５日（２００７．４．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２０３０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４４８１８
【国際公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（５０３３２７６９１）株式會社アモーレパシフィック (73)
【住所又は居所原語表記】１８１， Ｈａｎｋａｎｇ−ｒｏ ２−ｋａ， Ｙｏｎｇｓａｎ−ｋｕ， Ｓｅｏｕｌ １４０−７７７ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２５日（２００７．４．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２０３０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４４８１８
【国際公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（５０３３２７６９１）株式會社アモーレパシフィック (73)
【住所又は居所原語表記】１８１， Ｈａｎｋａｎｇ−ｒｏ ２−ｋａ， Ｙｏｎｇｓａｎ−ｋｕ， Ｓｅｏｕｌ １４０−７７７ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]