本発明は、組換え細菌発酵と発酵後硫酸化との組合せによるコンドロイチン硫酸の生産を含む、コンドロイチンを生産するための組換えDNA技術の分野に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kfoD、orf3（kfoI）、kfoE、またはorf1（kfoH）の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
【請求項２】
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項３】
コンドロイチンが宿主細胞から分泌される、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項４】
遺伝子クラスターがkfoGをさらに含む、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項５】
遺伝子クラスターがkfoBをさらに含む、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項６】
遺伝子クラスターがkpsMおよびkpsTをさらに含む、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項７】
pDD66、pDD67、pCX040、pCX041、pCX042、pCX043、pCX096、またはpBR1052を含む、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項８】
kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
【請求項９】
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、およびそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を含むコンストラクトであって、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するかまたはコンドロイチンの量を増加させるのに適している、コンストラクト。
【請求項１０】
コンドロイチンが宿主細胞から分泌されない、請求項8または9記載のコンストラクト。
【請求項１１】
kfoD、orf3、kfoE、またはorf1の1つまたは複数の機能的遺伝子も含有しない、請求項8または9記載のコンストラクト。
【請求項１２】
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、請求項8または9記載のコンストラクト。
【請求項１３】
遺伝子クラスターがkfoG、kfoB、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項8記載のコンストラクト。
【請求項１４】
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、およびkfoGを含む、請求項8または9記載のコンストラクト。
【請求項１５】
pCX039、pCX044、またはpCX092を含む、請求項8または9記載のコンストラクト。
【請求項１６】
pCX075、pCX081、pCX082、pCX101、pBR1102、pBR1100、またはpBR1101を含む、請求項9記載のコンストラクト。
【請求項１７】
pCX045またはpCX048を含む、請求項11記載のコンストラクト。
【請求項１８】
1つまたは複数の遺伝子が、細菌宿主細胞において最適なコドン使用頻度になるように修飾されている、請求項1〜17のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項１９】
さらにプロモーターを含む、請求項1〜18のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項２０】
プロモーターが、Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、およびPrecAからなる群より選択される、請求項19記載のコンストラクト。
【請求項２１】
プロモーターがPmである、請求項20記載のコンストラクト。
【請求項２２】
第2のプロモーターをさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項２３】
第2のプロモーターが、Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、およびPrecAからなる群より選択される、請求項22記載のコンストラクト。
【請求項２４】
第2のプロモーターがPmである、請求項23記載のコンストラクト。
【請求項２５】
第2のプロモーターが1つまたは複数の遺伝子に機能的に連結されている、請求項22記載のコンストラクト。
【請求項２６】
第2のプロモーターがkpsFEDUCSに機能的に連結されている、請求項25記載のコンストラクト。
【請求項２７】
xylS調節遺伝子をさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項２８】
抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、請求項1〜27のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項２９】
抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール（CamR）、カナマイシン（KanR）、アンピシリン（AmpR）、テトラサイクリン（TetR）、ブレオマイシン（BleR）、スペクチノマイシン（SpcR）、スルホンアミド（SuR）、ストレプトマイシン（StrR）、カルベニシリン（CbR）、およびエリスロマイシン（EryR）からなる群より選択される、請求項28記載のコンストラクト。
【請求項３０】
K4遺伝子クラスターを含む、請求項1〜29のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項３１】
細菌宿主細胞が、エシェリキア（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）、キサントモナス（Xanthomonas）、メチロモナス（Methylomonas）、アシネトバクター（Acinetobacter）、およびスフィンゴモナス（Sphingomonas）からなる群より選択される非病原性生物であるか、または該非病原性生物に由来する、請求項1〜30のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項３２】
請求項1〜31のいずれか一項記載のコンストラクトを含む、非病原性細菌宿主細胞。
【請求項３３】
MSC279、MSC280、MSC315、MSC316、MSC317、MSC319、MSC322、MSC323、MSC324、MSC325、MSC326、MSC328、MSC346、MSC347、MSC348、MSC350、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC461、MSC466、MSC467、MSC469、MSC480、MSC494、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723およびMSC724からなる群より選択される菌株である、請求項32記載の非病原性細菌宿主細胞。
【請求項３４】
（a）請求項1〜31のいずれか一項記載のコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程、および
（b）コンドロイチンが細菌宿主細胞によって生産される発酵条件下で細菌宿主細胞を培養する工程
を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
【請求項３５】
請求項1〜31のいずれか一項記載のコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を、コンドロイチンの生産にとって十分な発酵条件下で培養する工程を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
【請求項３６】
請求項1〜31のいずれか一項記載のコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載のコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を作製するための方法。
【請求項３７】
コンストラクトの遺伝子クラスターまたは遺伝子が細菌宿主細胞の染色体中に組み込まれる、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
2コピーまたはそれ以上の遺伝子クラスターまたは遺伝子が細菌宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、請求項34または35記載の方法。
【請求項４０】
コンドロイチンを硫酸化する工程をさらに含む、請求項34または35記載の方法。
【請求項４１】
（a）請求項34または35の方法によってコンドロイチンを生産する工程、および
（b）コンドロイチンを硫酸化する工程
を含む、コンドロイチン硫酸を生産するための方法。
【請求項４２】
硫酸化する工程が、ホルムアミド中で三酸化硫黄-トリエチルアミン錯体またはクロロスルホン酸をコンドロイチンと混合することを含む、請求項40または41記載の方法。
【請求項４３】
細菌宿主細胞が、エシェリキア、シュードモナス、キサントモナス、メチロモナス、アシネトバクター、およびスフィンゴモナスからなる群より選択される非病原性生物であるか、または該非病原性生物に由来する、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
細菌宿主細胞がグラム陰性生物であるか、またはグラム陰性生物に由来する、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
細菌宿主細胞がキサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）である、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
キサントモナス・カンペストリス（X.campestris）が、MSC255、MSC256、MSC257、MSC225、およびMSC226からなる群より選択される菌株である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
細菌宿主細胞が非病原性大腸菌（E.coli）である、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
非病原性大腸菌が大腸菌K-12および大腸菌Bからなる群より選択される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
大腸菌K-12が、MSC188およびMSC175からなる群より選択される菌株である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
大腸菌Bが菌株MSC364である、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
細菌宿主細胞の内因性遺伝子が、相同組換えによって欠失または不活化される、請求項34〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
細菌宿主細胞が、該宿主細胞にとって内因性の細胞外多糖を発現しない、請求項34〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
細菌宿主細胞が実験室クローニング株からの接合伝達に適している、請求項34〜50のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
細菌宿主細胞からコンドロイチンを回収する工程をさらに含む、請求項34または35記載の方法。
【請求項５５】
細胞外培養培地からコンドロイチンを回収する工程をさらに含む、請求項34または35記載の方法。
【請求項５６】
1g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、請求項34または35記載の方法。
【請求項５７】
5g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
15g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
コンドロイチンを精製する工程をさらに含む、請求項34または35記載の方法。
【請求項６０】
細菌宿主細胞が、25℃〜37℃で培養される、請求項34または35記載の方法。
【請求項６１】
細菌宿主細胞が、グリセリンを含む培地で培養される、請求項34または35記載の方法。
【請求項６２】
請求項34〜35または37〜61のいずれか一項記載の方法によって生産された、コンドロイチン。
【請求項６３】
請求項62記載のコンドロイチンを含む、組成物。
【請求項６４】
KpsFのSEQ ID NO：92、KpsEのSEQ ID NO：93、KpsDのSEQ ID NO：94、KpsUのSEQ ID NO：95、KpsCのSEQ ID NO：96、KpsSのSEQ ID NO：97、KpsTのSEQ ID NO：91、KfoAのSEQ ID NO：83、KfoBのSEQ ID NO：84、KfoCのSEQ ID NO：85、KfoI（Orf3）のSEQ ID NO：86、KfoEのSEQ ID NO：87、KfoH（Orf1）のSEQ ID NO：88、KfoFのSEQ ID NO：89、およびKfoGのSEQ ID NO：90の群から選択されるアミノ酸配列に結合する、抗体または抗体フラグメント。

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ−０１】

【図３Ｂ−０２】

【図４Ａ】

【図４Ｂ−０１】

【図４Ｂ−０２】

【図４Ｂ−０３】

【図４Ｂ−０４】

【図４Ｂ−０５】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図８Ｅ】

【図８Ｆ】

【図８Ｇ】

【図８Ｈ】

【図８Ｉ】

【図８Ｊ−０１】

【図８Ｊ−０２】

【図８Ｋ】

【図８Ｌ】

【図８Ｍ】

【図８Ｎ】

【図８Ｏ】

【図８Ｐ】

【図８Ｑ】

【図８Ｒ】

【図８Ｓ】

【図８Ｔ】

【図８Ｕ】

【図９】

【図１０Ａ−０１】

【図１０Ａ−０２】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ−０１】

【図１０Ｃ−０２】

【図１０Ｄ−０１】

【図１０Ｄ−０２】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１４Ｄ】

【図１４Ｅ】

【図１４Ｆ】

【図１４Ｇ】

【図１４Ｈ】

【図１４Ｉ】

【図１４Ｊ】

【図１４Ｋ】

【図１４Ｌ】

【図１４Ｍ】

【図１４Ｎ】

【図１４Ｏ】

【図１４Ｐ】

【図１４Ｑ】

【図１４Ｒ】

【図１４Ｓ】

【図１４Ｔ】

【図１４Ｕ】

【図１４Ｖ】

【図１４Ｗ】

【図１４Ｘ】

【図１５】

【公表番号】特表２０１３−５２０９９５（Ｐ２０１３−５２０９９５Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５６１８４（Ｐ２０１２−５５６１８４）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６７４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０９４３８
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム　アイピー　アセッツ　ビー．ブイ． (873)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】