タイトジャンクション調節因子
【課題】本発明は、タイトジャンクション（ＴＪ）に作用するトリセルリンを誘導しうる因子を提供することを課題とする。さらには、ＴＪ調節因子を提供し、該ＴＪ調節因子を用いた薬剤デリバリーシステムを提供することを課題とする。
【解決手段】ＬＳＲ（lipolysis-stimulated receptor）が検出される部位にトリセルリンが検出されることから、ＬＳＲがトリセルリンを誘導しうる因子と考えられる。さらに、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質が、トリセルリンを介してＴＪの機能を調節しうるＴＪ調節因子となる。さらに、ＴＪ調節因子と薬剤を含む薬剤デリバリーシステムによる。
【解決手段】ＬＳＲ（lipolysis-stimulated receptor）が検出される部位にトリセルリンが検出されることから、ＬＳＲがトリセルリンを誘導しうる因子と考えられる。さらに、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質が、トリセルリンを介してＴＪの機能を調節しうるＴＪ調節因子となる。さらに、ＴＪ調節因子と薬剤を含む薬剤デリバリーシステムによる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＳＲ（lipolysis-stimulated receptor）を含むトリセルリン誘導因子およびＬＳＲと相互作用する物質からなるタイトジャンクション調節因子に関する。また、これらのいずれかの因子を含むタイトジャンクション調節剤に関し、それを用いた薬剤デリバリーシステムまたは医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞の特徴として、アドヘレンスジャンクション（以下、単に「ＡＪ」という場合がある。）やタイトジャンクション（以下、単に「ＴＪ」という場合がある。）からなる細胞間接着装置複合体(junction complex)がある。このうち、接着分子カドヘリンが機能する場であるＡＪの分子生物学的な研究が先行しており、その研究の過程では、カドヘリンやカテニンの異常が、がん細胞の浸潤・転移にきわめて重要であることが明らかにされてきた。また、ＡＪに隣接して構造的に密接な関係のあるＴＪに関連しては、ＴＪの膜タンパク質であるオクルディン(occuludin)（非特許文献１）や、ＴＪの主要接着分子であるクローディン(claudin)ファミリー（非特許文献２）が同定され、研究が進められてきた。
【０００３】
脳、網膜、精巣、胎盤など体の各部においては、血管からの物質の移行が著しく制限されている。特に、血液中から脳への薬剤移行性の低さ（脳血管関門）は、中枢神経系疾患に対する薬剤の選択肢、ひいては治療の手段を大きく制限している。このような薬剤移行性の低さは、ＴＪなどの特別なバリア機構によるものと考えられている。しかし、このような薬剤などの物質の移行性に対するバリア機構は血管においてのみ機能しているわけでなく、血中に至る以前にも消化管、皮膚など体のいたる所において厳密に機能している。このため、経皮、経粘膜的に非侵襲的、非観血的に薬剤を体内へ移行させる方法が長らく求められてきた。脳血管の場合と同様に、皮膚や粘膜に対してクローディンの機能を阻害することが、薬剤デリバリーの１つの可能性として考えられる。ＴＪを形成するクローディンには２４種類の遺伝子が存在することが知られており、さらに一般に多くの組織の上皮細胞では、同時に複数の種類のクローディンがＴＪを形成している。
【０００４】
ＴＪについてさらに研究が進められ、ＴＪの特殊な形態であるトリセルラージャンクション（３細胞結合）の構成分子であるトリセルリンが同定されている（非特許文献３）。また、トリセルリン遺伝子の発現またはトリセルリンの機能を抑制する因子を用いた薬剤デリバリー系について開示がある（特許文献１）。しかしながら、トリセルリンの作用・機能については、まだ十分には明らかにされていない。
【０００５】
脂質を取り込むための受容体としての機能を有するＬＳＲについて報告がある（特許文献２、非特許文献４）。しかしながら、ＬＳＲの膜機能や接着に係る作用については、全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2008-271784号公報
【特許文献２】特許第3726969号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Cell Biol. 123: 1777-1788, 1993
【非特許文献２】J. Cell Biol. 141: 1539-1550, 1998
【非特許文献３】J. Cell Biol. 171: 939-945, 2005
【非特許文献４】J. Biological Chemistry 270 (29): 17068-17071, 1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タイトジャンクション（ＴＪ）に局在し、ＴＪに作用するトリセルリンを誘導しうる因子を提供することを課題とする。さらには、ＴＪの機能を調節しうるＴＪ調節因子を提供し、該ＴＪ調節因子を用いた薬剤デリバリーシステムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＬＳＲが検出される部位にトリセルリンが検出されることに初めて着目し、ＬＳＲの存在がトリセルリンの局在に影響を及ぼすことを確認した。これにより、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質が、トリセルリンを介してＴＪの機能を調節しうることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．ＬＳＲを含むトリセルリン誘導因子。
２．ＬＳＲと相互作用する物質からなるタイトジャンクション調節因子。
３．ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質である前項２に記載のタイトジャンクション調節因子。
４．ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＬＳＲに対する抗体、阻害ペプチド、ドミナントネガティブ変異体からなる群より選択される前項３に記載のタイトジャンクション調節因子。
５．ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するｓｉＲＮＡ、またはそれと同等の機能を有する相同体ＲＮＡである前項４に記載のタイトジャンクション調節因子。
６．前項２〜５のいずれか１に記載のタイトジャンクション調節因子を含むタイトジャンクション調節剤。
７．前項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む薬剤デリバリー系。
８．前項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトリセルリン誘導因子はＬＳＲを含むため、トリセルラージャンクションなどのＴＪにＬＳＲを導入することにより、トリセルリンを誘導し、細胞間の結合が強化される。逆に、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質をトリセルラージャンクションなどのＴＪに導入することにより、トリセルリンの導入が抑制され、細胞間の結合が緩和される。本発明のタイトジャンクション調節因子は、ＬＳＲと相互作用する物質を含む。本発明のタイトジャンクション調節因子を薬剤とともに用いる薬剤デリバリー系や、タイトジャンクション調節因子および薬剤を含む医薬組成物により、従来では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】培養上皮細胞におけるＬＳＲの細胞内局在を確認した写真図である。（参考例１）
【図２】培養上皮細胞並びにマウスの小腸および顎下腺における内在性ＬＳＲおよびトリセルリンの局在を確認した写真図である。（参考例２）
【図３】培養上皮細胞での内在性ＬＳＲをノックアウトしたときのトリセルリンの局在を確認した写真図である。（参考例３）
【図４】培養上皮細胞での内在性ＬＳＲをノックアウトしたのちに、全長ＬＳＲを細胞に入れ戻したときのトリセルリンの局在を確認した写真図である。（参考例３）
【図５】電気抵抗により、タイトジャンクションの結合強度を確認した図である。結合強度が強いほど電気抵抗が増し、結合強度が緩和されると電気抵抗が低くなる。（実施例１）
【図６】トレーサーの移動量により、タイトジャンクションの結合強度を確認した図である。結合強度が強いほど、トレーサーの移動量が低下し、結合強度が緩和されると増加する。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「ＬＳＲ」とは、lipolysis-stimulated receptorをいう。本発明は、ＬＳＲを含むトリセルリン誘導因子に関する。トリセルリンは、上記非特許文献３および特許文献１に示されるタンパク質であり、哺乳動物に広く分布している。トリセルリンは、３つの細胞が向かい合うトリセルラージャンクション（３細胞結合）の構成分子であり、多くはここに分布する。ここで、トリセルラージャンクションは、タイトジャンクション（ＴＪ）の特殊な形態であり、ＴＪに包含される。また、トリセルリンはトリセルラージャンクションに多く分布するが、トリセルラージャンクション以外のＴＪにも分布する。トリセルリンをコードするＤＮＡの塩基配列は、Genebank Accession No. AB219936（ヒト・トリセルリン）、Genebank Accession No. AB219937（ヒト・トリセルリンの別形態）、Genebank Accession No. AB219935（マウス・トリセルリン）などに開示されている。
【００１４】
本発明におけるＬＳＲの構造は、Genebank Accession No. NP 059101に開示されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列のうち、１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは誘導されてなるアミノ酸配列により特定される。ＬＳＲは、特許文献２および非特許文献４に開示されるように、脂質を取り込むための受容体としての機能を有することは公知であるが、その他の機能については解明されていないことが多く残されている。ＬＳＲとトリセルリンの挙動は必ずしも一致するものではないが、トリセルリンはＬＳＲが検出される部位に検出される。本発明において、ＬＳＲが存在しないか、またはＬＳＲの機能が阻害されている場合にはトリセルリンの検出が抑制されていることを初めて確認した。したがって、ＬＳＲは、ＴＪにおいてトリセルリンを誘導し、特にトリセルラージャンクションにおいてトリセルリンを誘導しうる。そこで、本発明のトリセルリン誘導因子は、ＬＳＲを含む。
【００１５】
ＴＪにおいて、トリセルリン遺伝子の発現またはトリセルリンの機能を抑制することによって、ＴＪを通る物質の透過性、とりわけトリセルラージャンクションを通る物質の透過性を増加させ、効率よく薬剤を体内に取り込ませることができることは、特許文献１に示す如くである。特に、経皮、経粘膜的に非侵襲的、非観血的に多くの薬剤を体内へ移行させることができる。
【００１６】
本発明のＬＳＲは、ＴＪにおいてトリセルリンを誘導することから、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質は、ＬＳＲを抑制し、その結果、トリセルリンの誘導が阻害されることとなる。ここで、トリセルリンの誘導が阻害されるとは、通常はトリセルリンがトリセルラージャンクションなどのＴＪへ局在しているのに対し、トリセルラージャンクションへの局在が阻害されることをいう。トリセルリンの誘導が阻害されることで、上述の如くＴＪを通る物質の透過性、とりわけトリセルラージャンクションを通る物質の透過性を増加させることができる。このことから、本発明において、ＬＳＲと相互作用する物質をＴＪの調節因子という。
【００１７】
本発明のＴＪ調節因子のうち、「ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質」とは、ＬＳＲ遺伝子の発現を通常レベルよりも低下させる、または完全に消失させうる物質をいう。ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質の例としては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法は当業者に公知であり、作製すべきｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの種類、用途等に応じて、適宜選択することができる。
【００１８】
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡやアンチセンスオリゴヌクレオチドはＬＳＲ遺伝子に対する特異性が高く、ノックダウンあるいはノックアウト効率も高く、副作用のリスクも小さいという利点を有する。
【００１９】
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとしては、具体的には、以下の配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらには、配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち、１〜複数個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは誘導されており、実質的に配列番号１に示すｓｉＲＮＡと同等の機能を有する相同体ＲＮＡであり、例えばマウス、ヒトまたはその他の哺乳動物のいずれかのＬＳＲ遺伝子の発現を抑制しうるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ：AGAAGAGGCUUUAAAGAAA（配列番号１）
【００２０】
本発明のＴＪ調節因子のうち、「ＬＳＲの機能阻害物質」とは、ＬＳＲの機能を通常レベルよりも低下させ、または完全に消失させてしまう物質をいい、ＬＳＲ抑制物質ともいう。ＬＳＲの機能阻害物質の例としては、ＬＳＲ抗体、ＬＳＲ阻害ペプチド、ＬＳＲのドミナントネガティブ変異体などが挙げられるが、これらに限定されない。特に好適には、ＬＳＲに対する抗体が挙げられる。抗体は、種々のものが知られており、例えばポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、キメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。抗体の製造方法は当業者に公知であり、作製すべき抗体の種類、用途等に応じて、適宜選択することができる。
【００２１】
本発明のＴＪ調節剤は、上記のＴＪ調節因子を含む。これらのＴＪ調節因子のうち少なくとも１種を含むことで、ＴＪの結合、とりわけトリセルラータイトジャンクションの結合が緩和される。ＴＪ調節剤を構成しうる物質は、例えばＴＪ調節因子がＤＮＡのような遺伝子の場合には、アデノウイルスベクターなどのベクターを含むことができる。また、ＴＪ調節因子がＬＳＲ抗体、ＬＳＲ阻害ペプチド、ＬＳＲのドミナントネガティブ変異体などの場合は、薬学的に許容しうる担体を含ませることができる。上記のＴＪ調節剤の製造に用いられる薬理学的に許容しうる担体としては、例えば、賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を挙げることができる。
【００２２】
本発明は、本発明のＴＪ調節剤を用いることを特徴とするＴＪ調節方法にも及ぶ。上記のＴＪ調節因子は、ＴＪの調節を要する所望の部位、例えば薬剤デリバリーのための所望部位の細胞を、本発明のＴＪ調節因子で処理することにより、所望部位の細胞におけるＬＳＲ遺伝子の発現を抑制でき、あるいはＬＳＲの機能を抑制でき、その結果ＴＪ、とりわけトリセルラージャンクションの結合能の強度を調節することができる。
【００２３】
本発明のＴＪ調節因子で処理するとは、例えば、細胞を本発明のＴＪ調節因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより達成される。ＴＪ調節因子がタンパク質の場合は、これをコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。ＴＪ調節因子が遺伝子の場合やＴＪ調節因子をコードする遺伝子の場合は、該遺伝子を細胞に導入する一般的な方法は当該分野で公知である。例えば、細胞への遺伝子の導入には、ベクターによる方法（例えば、アデノウイルスベクター等用いる方法）、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、直接導入法などの方法を用いることができる。本発明のＴＪ調節因子がＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの場合は、該ｓｉＲＮＡの体内への導入方法は、直接導入法、アデノウイルスベクターを用いる方法、経皮的なリポフェクション、エレクトロポレーションなどの公知の方法を採用することができる。
【００２４】
本発明の薬剤デリバリー系は、本発明のＴＪ調節剤およびデリバリーされるべき薬剤を必須成分とする。本発明の薬剤デリバリー系は、上記以外の他の成分、例えば、皮膚や粘膜の透過性を上昇させることがすでに知られている薬剤、薬剤デリバリー用の器具などを含んでいてもよい。本発明の薬剤デリバリー系を用いることにより、ＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、またはＬＳＲの機能を抑制し、トリセルリンの誘導を抑制することでＴＪの結合能を調節し、細胞層への薬剤の透過性を高め、多くの薬剤を速やかに体内にデリバリーすることができる。本明細書において「薬剤」とは、投与された場合に所望の治療効果または予防効果を有する、あるいは有することが期待される物質をいう。本発明の薬剤デリバリー系において、本発明のＴＪ調節剤および薬剤は、同時に使用してもよいし、前後して使用してもよい。
【００２５】
本発明は、本発明のＴＪ調節剤および薬剤を含む医薬組成物にも及ぶ。本発明の医薬組成物は、含有される本発明のＴＪ調節剤の作用によりＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、またはＬＳＲの機能を抑制し、トリセルリンの誘導を抑制することでＴＪの結合能を調節し、細胞層への薬剤の透過性を高め、体内への薬剤の透過性を高めることができるので、多くの薬剤を速やかに体内に移行させることができる。本発明の医薬組成物の剤形はいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは、経皮剤形（ローション、クリーム、軟膏、発布剤など）または経粘膜剤形、あるいは点眼剤である。これらの剤形の製造方法は公知であり、当業者は適宜選択することができる。
【００２６】
本発明の薬剤デリバリー系を利用することにより、あるいは本発明の医薬組成物を投与することにより、従来では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができる。このことは、対象の負担を軽減することにもつながる。本発明の薬剤デリバリー系または医薬組成物中でのＴＪ調節剤の使用量は特に制限はなく、目的に応じたものとすることができる。例えば、必要とされる透過性の程度、デリバリーされる薬剤、疾病の種類、対象の状態、適用部位等に応じて、本発明のＴＪ調節剤の使用量を変更することができる。適用部位についても特に制限はなく、２箇所以上の部位に適用してもよい。好ましい適用部位としては皮膚、粘膜、眼球、特に角膜等が挙げられる。
【００２７】
本発明は、上記説明した本発明の薬剤デリバリー系あるいは医薬組成物を製造するための、本発明のＴＪ調節剤の使用にも及ぶ。本発明のＴＪ調節剤を用いて製造される薬剤デリバリー系あるいは医薬組成物は、従来の薬剤デリバリー系あるいは医薬組成物では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができ、しかも対象の負担を軽減することが可能である。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明の理解をより確実にするために、本発明を完成するに至った経緯を参考例に示し、本発明の内容を具体的に実施例に示して詳細かつ具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【００２９】
（参考例１）培養上皮細胞におけるＬＳＲの細胞内局在の確認
ＬＳＲを培養上皮細胞（マウスＥｐＨ４細胞）に過剰発現させて、培養上皮細胞でのＬＳＲの細胞内局在を確認した。
市販のＬＳＲクローニングベクター（Accession No.AK146807, RIKEN FANTOM(R), ダナフォーム社）を購入し、開始コドン直前および終止コドンにEcoR1認識配列を組み込んだプライマーを用いてPCRを行った。該PCR産物をEcoR1で消化し、同じくEcoR1で消化したpCAGGS-neo-GFP発現ベクターに導入し、発現ベクターpCAG-LSRを調製し、マウスＥｐＨ４細胞に導入し、過剰発現させた。
【００３０】
上記マウスＥｐＨ４細胞に過剰発現させたＬＳＲの分布を免疫組織染色にて確認した。また、ＬＳＲの分布とＴＪとの関係を確認するために、ＴＪの構成タンパク質であるクローディン４についても同様に確認した。
上記マウスＥｐＨ４細胞を10％ホルマリンで固定し、界面活性剤(0.2％tritonX-100)にて透過処理を行ったものに、ＬＳＲ検出用一次抗体として抗ＧＦＰ抗体（自製）およびクローディン４検出用一次抗体として抗クローディン４抗体（インビトロジェン製）を付加し、各々二次抗体として抗ラットAlexa488抗体および抗マウスCy3抗体を付加して免疫組織染色を行なった。
【００３１】
上記の結果、培養上皮細胞において、ＬＳＲおよびクローディン４の局在分布は、ほぼ一致することが確認され、ＬＳＲもＴＪに局在することが確認された。また、ＬＳＲはＴＪのうち、特に３つの細胞が向かい合うトリセルラージャンクションの部位に局在することが確認された（図１）。
【００３２】
（参考例２）内在性ＬＳＲの局在確認
上皮培養細胞（マウスＥｐＨ４細胞）並びにマウスの小腸および顎下腺におけるＬＳＲおよびトリセルリンの発現と分布を、免疫組織染色にて確認した。上記マウスＥｐＨ４細胞について、10％ホルマリンで固定し、界面活性剤(0.2％tritonX-100)にて透過処理を行った。また、マウスの小腸組織および顎下腺組織については99.5％エタノールで固定し、100％アセトン処理後に凍結した組織から薄切切片を作製した。各細胞または組織に、ＬＳＲ検出用一次抗体として抗ＬＳＲポリクローナル抗体（自製）を、トリセルリン検出用一次抗体としてトリセルリンモノクローナル抗体（J. Cell Biol. 171: 939-945, 2005）を付加し、各々二次抗体として抗ラビットCy3抗体および抗ラットAlexa488抗体を付加して免疫組織染色を行なった。
【００３３】
上記の結果、培養上皮細胞並びにマウスの小腸および顎下腺において、ＬＳＲおよびトリセルリンの局在分布は、ほぼ一致することが確認された（図２）。
【００３４】
（参考例３）トリセルリンの細胞内局在
ｓｈＲＮＡ法によりＬＳＲ発現を抑制したマウスＥｐｈ４細胞株でのトリセルリンの細胞内局在と、該細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻したときのトリセルリンの細胞内局在を調べた。使用したｓｉＲＮＡは、以下の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ：AGAAGAGGCUUUAAAGAAA（配列番号１）
【００３５】
上記の結果、ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いて、ＬＳＲの発現を抑制した細胞株では、トリセルリンの発現も抑制されることが確認された（図３）。一方細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻した細胞株ではＬＳＲの発現部位にトリセルリンも発現しており、局在分布もほぼ一致することが確認された（図４）。
【００３６】
（実施例１）細胞間隙における透過性変化の定量的測定１
参考例３に記載の方法により、マウスＥｐｈ４細胞株内でｓｉＲＮＡによりＬＳＲ発現を抑制させ、その後該細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻した。この場合の細胞間隙における透過性変化を、ＴＪの機能的な定量法の１つであるＴＥＲ（trans-epithelial electrical resistance）法を用いて定量的に測定した。ＴＥＲ法による定量は、上皮細胞であるマウスＥｐｈ４細胞をダブルチャンバー(two-chamber)の培養ディッシュ（１２穴）１ウェルあたりに1×105個を播種し、DMEM培地中で５日間培養し、上皮細胞シートの上下に発生する電気抵抗値（ＴＥＲ）を電極Millicell-ERS（MILLIPORE社）を用いて測定し、上皮細胞の間の溶質の透過しやすさを測定することにより行なった。
【００３７】
上記の測定方法では、ＴＪの結合強度が強いほど電気抵抗が増し、結合強度が緩和されると電気抵抗が低く示される。その結果、対照（Ｅｐｈ４（ＷＴ））に比べて、ｓｉＲＮＡを用いてＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、ノックアウトした系（ＬＳＲＫＤ）では、電気抵抗が低下し、ＴＪの結合強度が緩和されたことが確認された。一方、全長ＬＳＲを入れ戻した系（ＬＳＲＫＤrescue）では、電気抵抗が増加し、ＴＪの結合強度が強くなったことが確認された（図５）。この結果により、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制によるＴＪの結合機能が低下して、イオンの細胞間隙における透過性が亢進したことを示す。この結果から、ＬＳＲ遺伝子の発現を抑制しうる物質、すなわちＬＳＲと相互作用する物質が、ＴＪ調節因子として機能しうることが示唆された。
【００３８】
（実施例２）細胞間隙における透過性変化の定量的測定２
参考例３に記載の方法により、マウスＥｐｈ４細胞株内でｓｉＲＮＡによりＬＳＲ発現を抑制し、その後該細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻した。この場合の細胞間隙における透過性変化を、ＴＪの機能的な定量法の１つであるトレーサー法を用いて定量的に測定した。
トレーサー法による定量は、上皮細胞であるマウスＥｐｈ４細胞をダブルチャンバーの培養ディッシュ（１２穴）１ウェルあたりに1×105個を播種し、HBSS培地中で５日間培養し、上皮細胞の上部チャンバーにトレーサー（FITC-dextran 250KDおよび4KD）を加えて２時間培養したとき、下部チャンバーに移動するトレーサー量を定量し、上皮細胞の間のトレーサーの透過しやすさを測定することにより行なった。上部チャンバーに加えたトレーサー量を100としたときの下部チャンバーに移動したトレーサー量の割合で、透過性を評価した。
【００３９】
上記の測定方法では、ＴＪの結合強度が強いほど下部のトレーサー量が低い値を示し、結合強度が緩和されると高い値を示す。その結果、分子量が４ＫＤのトレーサーを用いた場合は、対照（Ｅｐｈ４（ＷＴ））に比べて、ｓｉＲＮＡを用いてＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、ノックアウトした系（ＬＳＲＫＤ）では、下部のトレーサー量が高い値を示し、ＴＪの結合強度が緩和されたことが確認された。一方、全長ＬＳＲを入れ戻した系（ＬＳＲＫＤrescue）では、トレーサー量が低い値を示し、ＴＪの結合強度が強くなったことが確認された（図６）。この結果により、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制によるＴＪの結合機能が低下して、トレーサーの細胞間隙における透過性が亢進したことを示す。この結果から、ＬＳＲ遺伝子の発現を抑制しうる物質、すなわちＬＳＲと相互作用する物質が、ＴＪ調節因子として機能しうることが示唆され、さらに薬剤デリバリーに影響を及ぼすことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上詳述したように、本発明のトリセルリン誘導因子はＬＳＲを含むため、トリセルラージャンクションなどのＴＪにＬＳＲを導入することにより、トリセルリンを誘導し、細胞間の結合が強化される。逆に、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質をトリセルラージャンクションなどのＴＪに導入することにより、トリセルリンの導入が抑制され、細胞間の結合が緩和される。本発明のタイトジャンクション調節因子は、ＬＳＲと相互作用する物質を含む。本発明のタイトジャンクション調節因子を薬剤とともに用いる薬剤デリバリー系や、タイトジャンクション調節因子および薬剤を含む医薬組成物により、従来では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができる。
【００４１】
以上により、本発明のタイトジャンクション調節因子の使用により、従来制限のあった薬剤や治療の手段の選択肢の拡大が期待されることが確認された。そのため、本発明は医薬品の開発、医学、生理学および薬学的研究などの分野において有用であり、利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＳＲ（lipolysis-stimulated receptor）を含むトリセルリン誘導因子およびＬＳＲと相互作用する物質からなるタイトジャンクション調節因子に関する。また、これらのいずれかの因子を含むタイトジャンクション調節剤に関し、それを用いた薬剤デリバリーシステムまたは医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞の特徴として、アドヘレンスジャンクション（以下、単に「ＡＪ」という場合がある。）やタイトジャンクション（以下、単に「ＴＪ」という場合がある。）からなる細胞間接着装置複合体(junction complex)がある。このうち、接着分子カドヘリンが機能する場であるＡＪの分子生物学的な研究が先行しており、その研究の過程では、カドヘリンやカテニンの異常が、がん細胞の浸潤・転移にきわめて重要であることが明らかにされてきた。また、ＡＪに隣接して構造的に密接な関係のあるＴＪに関連しては、ＴＪの膜タンパク質であるオクルディン(occuludin)（非特許文献１）や、ＴＪの主要接着分子であるクローディン(claudin)ファミリー（非特許文献２）が同定され、研究が進められてきた。
【０００３】
脳、網膜、精巣、胎盤など体の各部においては、血管からの物質の移行が著しく制限されている。特に、血液中から脳への薬剤移行性の低さ（脳血管関門）は、中枢神経系疾患に対する薬剤の選択肢、ひいては治療の手段を大きく制限している。このような薬剤移行性の低さは、ＴＪなどの特別なバリア機構によるものと考えられている。しかし、このような薬剤などの物質の移行性に対するバリア機構は血管においてのみ機能しているわけでなく、血中に至る以前にも消化管、皮膚など体のいたる所において厳密に機能している。このため、経皮、経粘膜的に非侵襲的、非観血的に薬剤を体内へ移行させる方法が長らく求められてきた。脳血管の場合と同様に、皮膚や粘膜に対してクローディンの機能を阻害することが、薬剤デリバリーの１つの可能性として考えられる。ＴＪを形成するクローディンには２４種類の遺伝子が存在することが知られており、さらに一般に多くの組織の上皮細胞では、同時に複数の種類のクローディンがＴＪを形成している。
【０００４】
ＴＪについてさらに研究が進められ、ＴＪの特殊な形態であるトリセルラージャンクション（３細胞結合）の構成分子であるトリセルリンが同定されている（非特許文献３）。また、トリセルリン遺伝子の発現またはトリセルリンの機能を抑制する因子を用いた薬剤デリバリー系について開示がある（特許文献１）。しかしながら、トリセルリンの作用・機能については、まだ十分には明らかにされていない。
【０００５】
脂質を取り込むための受容体としての機能を有するＬＳＲについて報告がある（特許文献２、非特許文献４）。しかしながら、ＬＳＲの膜機能や接着に係る作用については、全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2008-271784号公報
【特許文献２】特許第3726969号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Cell Biol. 123: 1777-1788, 1993
【非特許文献２】J. Cell Biol. 141: 1539-1550, 1998
【非特許文献３】J. Cell Biol. 171: 939-945, 2005
【非特許文献４】J. Biological Chemistry 270 (29): 17068-17071, 1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タイトジャンクション（ＴＪ）に局在し、ＴＪに作用するトリセルリンを誘導しうる因子を提供することを課題とする。さらには、ＴＪの機能を調節しうるＴＪ調節因子を提供し、該ＴＪ調節因子を用いた薬剤デリバリーシステムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＬＳＲが検出される部位にトリセルリンが検出されることに初めて着目し、ＬＳＲの存在がトリセルリンの局在に影響を及ぼすことを確認した。これにより、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質が、トリセルリンを介してＴＪの機能を調節しうることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．ＬＳＲを含むトリセルリン誘導因子。
２．ＬＳＲと相互作用する物質からなるタイトジャンクション調節因子。
３．ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質である前項２に記載のタイトジャンクション調節因子。
４．ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＬＳＲに対する抗体、阻害ペプチド、ドミナントネガティブ変異体からなる群より選択される前項３に記載のタイトジャンクション調節因子。
５．ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するｓｉＲＮＡ、またはそれと同等の機能を有する相同体ＲＮＡである前項４に記載のタイトジャンクション調節因子。
６．前項２〜５のいずれか１に記載のタイトジャンクション調節因子を含むタイトジャンクション調節剤。
７．前項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む薬剤デリバリー系。
８．前項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む医薬組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトリセルリン誘導因子はＬＳＲを含むため、トリセルラージャンクションなどのＴＪにＬＳＲを導入することにより、トリセルリンを誘導し、細胞間の結合が強化される。逆に、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質をトリセルラージャンクションなどのＴＪに導入することにより、トリセルリンの導入が抑制され、細胞間の結合が緩和される。本発明のタイトジャンクション調節因子は、ＬＳＲと相互作用する物質を含む。本発明のタイトジャンクション調節因子を薬剤とともに用いる薬剤デリバリー系や、タイトジャンクション調節因子および薬剤を含む医薬組成物により、従来では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】培養上皮細胞におけるＬＳＲの細胞内局在を確認した写真図である。（参考例１）
【図２】培養上皮細胞並びにマウスの小腸および顎下腺における内在性ＬＳＲおよびトリセルリンの局在を確認した写真図である。（参考例２）
【図３】培養上皮細胞での内在性ＬＳＲをノックアウトしたときのトリセルリンの局在を確認した写真図である。（参考例３）
【図４】培養上皮細胞での内在性ＬＳＲをノックアウトしたのちに、全長ＬＳＲを細胞に入れ戻したときのトリセルリンの局在を確認した写真図である。（参考例３）
【図５】電気抵抗により、タイトジャンクションの結合強度を確認した図である。結合強度が強いほど電気抵抗が増し、結合強度が緩和されると電気抵抗が低くなる。（実施例１）
【図６】トレーサーの移動量により、タイトジャンクションの結合強度を確認した図である。結合強度が強いほど、トレーサーの移動量が低下し、結合強度が緩和されると増加する。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「ＬＳＲ」とは、lipolysis-stimulated receptorをいう。本発明は、ＬＳＲを含むトリセルリン誘導因子に関する。トリセルリンは、上記非特許文献３および特許文献１に示されるタンパク質であり、哺乳動物に広く分布している。トリセルリンは、３つの細胞が向かい合うトリセルラージャンクション（３細胞結合）の構成分子であり、多くはここに分布する。ここで、トリセルラージャンクションは、タイトジャンクション（ＴＪ）の特殊な形態であり、ＴＪに包含される。また、トリセルリンはトリセルラージャンクションに多く分布するが、トリセルラージャンクション以外のＴＪにも分布する。トリセルリンをコードするＤＮＡの塩基配列は、Genebank Accession No. AB219936（ヒト・トリセルリン）、Genebank Accession No. AB219937（ヒト・トリセルリンの別形態）、Genebank Accession No. AB219935（マウス・トリセルリン）などに開示されている。
【００１４】
本発明におけるＬＳＲの構造は、Genebank Accession No. NP 059101に開示されるアミノ酸配列、あるいは前記アミノ酸配列のうち、１〜複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは誘導されてなるアミノ酸配列により特定される。ＬＳＲは、特許文献２および非特許文献４に開示されるように、脂質を取り込むための受容体としての機能を有することは公知であるが、その他の機能については解明されていないことが多く残されている。ＬＳＲとトリセルリンの挙動は必ずしも一致するものではないが、トリセルリンはＬＳＲが検出される部位に検出される。本発明において、ＬＳＲが存在しないか、またはＬＳＲの機能が阻害されている場合にはトリセルリンの検出が抑制されていることを初めて確認した。したがって、ＬＳＲは、ＴＪにおいてトリセルリンを誘導し、特にトリセルラージャンクションにおいてトリセルリンを誘導しうる。そこで、本発明のトリセルリン誘導因子は、ＬＳＲを含む。
【００１５】
ＴＪにおいて、トリセルリン遺伝子の発現またはトリセルリンの機能を抑制することによって、ＴＪを通る物質の透過性、とりわけトリセルラージャンクションを通る物質の透過性を増加させ、効率よく薬剤を体内に取り込ませることができることは、特許文献１に示す如くである。特に、経皮、経粘膜的に非侵襲的、非観血的に多くの薬剤を体内へ移行させることができる。
【００１６】
本発明のＬＳＲは、ＴＪにおいてトリセルリンを誘導することから、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質は、ＬＳＲを抑制し、その結果、トリセルリンの誘導が阻害されることとなる。ここで、トリセルリンの誘導が阻害されるとは、通常はトリセルリンがトリセルラージャンクションなどのＴＪへ局在しているのに対し、トリセルラージャンクションへの局在が阻害されることをいう。トリセルリンの誘導が阻害されることで、上述の如くＴＪを通る物質の透過性、とりわけトリセルラージャンクションを通る物質の透過性を増加させることができる。このことから、本発明において、ＬＳＲと相互作用する物質をＴＪの調節因子という。
【００１７】
本発明のＴＪ調節因子のうち、「ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質」とは、ＬＳＲ遺伝子の発現を通常レベルよりも低下させる、または完全に消失させうる物質をいう。ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質の例としては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法は当業者に公知であり、作製すべきｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの種類、用途等に応じて、適宜選択することができる。
【００１８】
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡやアンチセンスオリゴヌクレオチドはＬＳＲ遺伝子に対する特異性が高く、ノックダウンあるいはノックアウト効率も高く、副作用のリスクも小さいという利点を有する。
【００１９】
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとしては、具体的には、以下の配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらには、配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのうち、１〜複数個のヌクレオチドが、置換、欠失、付加若しくは誘導されており、実質的に配列番号１に示すｓｉＲＮＡと同等の機能を有する相同体ＲＮＡであり、例えばマウス、ヒトまたはその他の哺乳動物のいずれかのＬＳＲ遺伝子の発現を抑制しうるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ：AGAAGAGGCUUUAAAGAAA（配列番号１）
【００２０】
本発明のＴＪ調節因子のうち、「ＬＳＲの機能阻害物質」とは、ＬＳＲの機能を通常レベルよりも低下させ、または完全に消失させてしまう物質をいい、ＬＳＲ抑制物質ともいう。ＬＳＲの機能阻害物質の例としては、ＬＳＲ抗体、ＬＳＲ阻害ペプチド、ＬＳＲのドミナントネガティブ変異体などが挙げられるが、これらに限定されない。特に好適には、ＬＳＲに対する抗体が挙げられる。抗体は、種々のものが知られており、例えばポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、キメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。抗体の製造方法は当業者に公知であり、作製すべき抗体の種類、用途等に応じて、適宜選択することができる。
【００２１】
本発明のＴＪ調節剤は、上記のＴＪ調節因子を含む。これらのＴＪ調節因子のうち少なくとも１種を含むことで、ＴＪの結合、とりわけトリセルラータイトジャンクションの結合が緩和される。ＴＪ調節剤を構成しうる物質は、例えばＴＪ調節因子がＤＮＡのような遺伝子の場合には、アデノウイルスベクターなどのベクターを含むことができる。また、ＴＪ調節因子がＬＳＲ抗体、ＬＳＲ阻害ペプチド、ＬＳＲのドミナントネガティブ変異体などの場合は、薬学的に許容しうる担体を含ませることができる。上記のＴＪ調節剤の製造に用いられる薬理学的に許容しうる担体としては、例えば、賦形剤、崩壊剤若しくは崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤若しくは溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を挙げることができる。
【００２２】
本発明は、本発明のＴＪ調節剤を用いることを特徴とするＴＪ調節方法にも及ぶ。上記のＴＪ調節因子は、ＴＪの調節を要する所望の部位、例えば薬剤デリバリーのための所望部位の細胞を、本発明のＴＪ調節因子で処理することにより、所望部位の細胞におけるＬＳＲ遺伝子の発現を抑制でき、あるいはＬＳＲの機能を抑制でき、その結果ＴＪ、とりわけトリセルラージャンクションの結合能の強度を調節することができる。
【００２３】
本発明のＴＪ調節因子で処理するとは、例えば、細胞を本発明のＴＪ調節因子と接触させ、あるいは細胞にこれらの因子を導入することにより達成される。ＴＪ調節因子がタンパク質の場合は、これをコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。ＴＪ調節因子が遺伝子の場合やＴＪ調節因子をコードする遺伝子の場合は、該遺伝子を細胞に導入する一般的な方法は当該分野で公知である。例えば、細胞への遺伝子の導入には、ベクターによる方法（例えば、アデノウイルスベクター等用いる方法）、細胞融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リポフェクション、直接導入法などの方法を用いることができる。本発明のＴＪ調節因子がＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの場合は、該ｓｉＲＮＡの体内への導入方法は、直接導入法、アデノウイルスベクターを用いる方法、経皮的なリポフェクション、エレクトロポレーションなどの公知の方法を採用することができる。
【００２４】
本発明の薬剤デリバリー系は、本発明のＴＪ調節剤およびデリバリーされるべき薬剤を必須成分とする。本発明の薬剤デリバリー系は、上記以外の他の成分、例えば、皮膚や粘膜の透過性を上昇させることがすでに知られている薬剤、薬剤デリバリー用の器具などを含んでいてもよい。本発明の薬剤デリバリー系を用いることにより、ＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、またはＬＳＲの機能を抑制し、トリセルリンの誘導を抑制することでＴＪの結合能を調節し、細胞層への薬剤の透過性を高め、多くの薬剤を速やかに体内にデリバリーすることができる。本明細書において「薬剤」とは、投与された場合に所望の治療効果または予防効果を有する、あるいは有することが期待される物質をいう。本発明の薬剤デリバリー系において、本発明のＴＪ調節剤および薬剤は、同時に使用してもよいし、前後して使用してもよい。
【００２５】
本発明は、本発明のＴＪ調節剤および薬剤を含む医薬組成物にも及ぶ。本発明の医薬組成物は、含有される本発明のＴＪ調節剤の作用によりＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、またはＬＳＲの機能を抑制し、トリセルリンの誘導を抑制することでＴＪの結合能を調節し、細胞層への薬剤の透過性を高め、体内への薬剤の透過性を高めることができるので、多くの薬剤を速やかに体内に移行させることができる。本発明の医薬組成物の剤形はいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは、経皮剤形（ローション、クリーム、軟膏、発布剤など）または経粘膜剤形、あるいは点眼剤である。これらの剤形の製造方法は公知であり、当業者は適宜選択することができる。
【００２６】
本発明の薬剤デリバリー系を利用することにより、あるいは本発明の医薬組成物を投与することにより、従来では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができる。このことは、対象の負担を軽減することにもつながる。本発明の薬剤デリバリー系または医薬組成物中でのＴＪ調節剤の使用量は特に制限はなく、目的に応じたものとすることができる。例えば、必要とされる透過性の程度、デリバリーされる薬剤、疾病の種類、対象の状態、適用部位等に応じて、本発明のＴＪ調節剤の使用量を変更することができる。適用部位についても特に制限はなく、２箇所以上の部位に適用してもよい。好ましい適用部位としては皮膚、粘膜、眼球、特に角膜等が挙げられる。
【００２７】
本発明は、上記説明した本発明の薬剤デリバリー系あるいは医薬組成物を製造するための、本発明のＴＪ調節剤の使用にも及ぶ。本発明のＴＪ調節剤を用いて製造される薬剤デリバリー系あるいは医薬組成物は、従来の薬剤デリバリー系あるいは医薬組成物では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができ、しかも対象の負担を軽減することが可能である。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明の理解をより確実にするために、本発明を完成するに至った経緯を参考例に示し、本発明の内容を具体的に実施例に示して詳細かつ具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【００２９】
（参考例１）培養上皮細胞におけるＬＳＲの細胞内局在の確認
ＬＳＲを培養上皮細胞（マウスＥｐＨ４細胞）に過剰発現させて、培養上皮細胞でのＬＳＲの細胞内局在を確認した。
市販のＬＳＲクローニングベクター（Accession No.AK146807, RIKEN FANTOM(R), ダナフォーム社）を購入し、開始コドン直前および終止コドンにEcoR1認識配列を組み込んだプライマーを用いてPCRを行った。該PCR産物をEcoR1で消化し、同じくEcoR1で消化したpCAGGS-neo-GFP発現ベクターに導入し、発現ベクターpCAG-LSRを調製し、マウスＥｐＨ４細胞に導入し、過剰発現させた。
【００３０】
上記マウスＥｐＨ４細胞に過剰発現させたＬＳＲの分布を免疫組織染色にて確認した。また、ＬＳＲの分布とＴＪとの関係を確認するために、ＴＪの構成タンパク質であるクローディン４についても同様に確認した。
上記マウスＥｐＨ４細胞を10％ホルマリンで固定し、界面活性剤(0.2％tritonX-100)にて透過処理を行ったものに、ＬＳＲ検出用一次抗体として抗ＧＦＰ抗体（自製）およびクローディン４検出用一次抗体として抗クローディン４抗体（インビトロジェン製）を付加し、各々二次抗体として抗ラットAlexa488抗体および抗マウスCy3抗体を付加して免疫組織染色を行なった。
【００３１】
上記の結果、培養上皮細胞において、ＬＳＲおよびクローディン４の局在分布は、ほぼ一致することが確認され、ＬＳＲもＴＪに局在することが確認された。また、ＬＳＲはＴＪのうち、特に３つの細胞が向かい合うトリセルラージャンクションの部位に局在することが確認された（図１）。
【００３２】
（参考例２）内在性ＬＳＲの局在確認
上皮培養細胞（マウスＥｐＨ４細胞）並びにマウスの小腸および顎下腺におけるＬＳＲおよびトリセルリンの発現と分布を、免疫組織染色にて確認した。上記マウスＥｐＨ４細胞について、10％ホルマリンで固定し、界面活性剤(0.2％tritonX-100)にて透過処理を行った。また、マウスの小腸組織および顎下腺組織については99.5％エタノールで固定し、100％アセトン処理後に凍結した組織から薄切切片を作製した。各細胞または組織に、ＬＳＲ検出用一次抗体として抗ＬＳＲポリクローナル抗体（自製）を、トリセルリン検出用一次抗体としてトリセルリンモノクローナル抗体（J. Cell Biol. 171: 939-945, 2005）を付加し、各々二次抗体として抗ラビットCy3抗体および抗ラットAlexa488抗体を付加して免疫組織染色を行なった。
【００３３】
上記の結果、培養上皮細胞並びにマウスの小腸および顎下腺において、ＬＳＲおよびトリセルリンの局在分布は、ほぼ一致することが確認された（図２）。
【００３４】
（参考例３）トリセルリンの細胞内局在
ｓｈＲＮＡ法によりＬＳＲ発現を抑制したマウスＥｐｈ４細胞株でのトリセルリンの細胞内局在と、該細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻したときのトリセルリンの細胞内局在を調べた。使用したｓｉＲＮＡは、以下の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ：AGAAGAGGCUUUAAAGAAA（配列番号１）
【００３５】
上記の結果、ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いて、ＬＳＲの発現を抑制した細胞株では、トリセルリンの発現も抑制されることが確認された（図３）。一方細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻した細胞株ではＬＳＲの発現部位にトリセルリンも発現しており、局在分布もほぼ一致することが確認された（図４）。
【００３６】
（実施例１）細胞間隙における透過性変化の定量的測定１
参考例３に記載の方法により、マウスＥｐｈ４細胞株内でｓｉＲＮＡによりＬＳＲ発現を抑制させ、その後該細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻した。この場合の細胞間隙における透過性変化を、ＴＪの機能的な定量法の１つであるＴＥＲ（trans-epithelial electrical resistance）法を用いて定量的に測定した。ＴＥＲ法による定量は、上皮細胞であるマウスＥｐｈ４細胞をダブルチャンバー(two-chamber)の培養ディッシュ（１２穴）１ウェルあたりに1×105個を播種し、DMEM培地中で５日間培養し、上皮細胞シートの上下に発生する電気抵抗値（ＴＥＲ）を電極Millicell-ERS（MILLIPORE社）を用いて測定し、上皮細胞の間の溶質の透過しやすさを測定することにより行なった。
【００３７】
上記の測定方法では、ＴＪの結合強度が強いほど電気抵抗が増し、結合強度が緩和されると電気抵抗が低く示される。その結果、対照（Ｅｐｈ４（ＷＴ））に比べて、ｓｉＲＮＡを用いてＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、ノックアウトした系（ＬＳＲＫＤ）では、電気抵抗が低下し、ＴＪの結合強度が緩和されたことが確認された。一方、全長ＬＳＲを入れ戻した系（ＬＳＲＫＤrescue）では、電気抵抗が増加し、ＴＪの結合強度が強くなったことが確認された（図５）。この結果により、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制によるＴＪの結合機能が低下して、イオンの細胞間隙における透過性が亢進したことを示す。この結果から、ＬＳＲ遺伝子の発現を抑制しうる物質、すなわちＬＳＲと相互作用する物質が、ＴＪ調節因子として機能しうることが示唆された。
【００３８】
（実施例２）細胞間隙における透過性変化の定量的測定２
参考例３に記載の方法により、マウスＥｐｈ４細胞株内でｓｉＲＮＡによりＬＳＲ発現を抑制し、その後該細胞株に全長ＬＳＲを入れ戻した。この場合の細胞間隙における透過性変化を、ＴＪの機能的な定量法の１つであるトレーサー法を用いて定量的に測定した。
トレーサー法による定量は、上皮細胞であるマウスＥｐｈ４細胞をダブルチャンバーの培養ディッシュ（１２穴）１ウェルあたりに1×105個を播種し、HBSS培地中で５日間培養し、上皮細胞の上部チャンバーにトレーサー（FITC-dextran 250KDおよび4KD）を加えて２時間培養したとき、下部チャンバーに移動するトレーサー量を定量し、上皮細胞の間のトレーサーの透過しやすさを測定することにより行なった。上部チャンバーに加えたトレーサー量を100としたときの下部チャンバーに移動したトレーサー量の割合で、透過性を評価した。
【００３９】
上記の測定方法では、ＴＪの結合強度が強いほど下部のトレーサー量が低い値を示し、結合強度が緩和されると高い値を示す。その結果、分子量が４ＫＤのトレーサーを用いた場合は、対照（Ｅｐｈ４（ＷＴ））に比べて、ｓｉＲＮＡを用いてＬＳＲ遺伝子の発現を抑制し、ノックアウトした系（ＬＳＲＫＤ）では、下部のトレーサー量が高い値を示し、ＴＪの結合強度が緩和されたことが確認された。一方、全長ＬＳＲを入れ戻した系（ＬＳＲＫＤrescue）では、トレーサー量が低い値を示し、ＴＪの結合強度が強くなったことが確認された（図６）。この結果により、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制によるＴＪの結合機能が低下して、トレーサーの細胞間隙における透過性が亢進したことを示す。この結果から、ＬＳＲ遺伝子の発現を抑制しうる物質、すなわちＬＳＲと相互作用する物質が、ＴＪ調節因子として機能しうることが示唆され、さらに薬剤デリバリーに影響を及ぼすことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上詳述したように、本発明のトリセルリン誘導因子はＬＳＲを含むため、トリセルラージャンクションなどのＴＪにＬＳＲを導入することにより、トリセルリンを誘導し、細胞間の結合が強化される。逆に、ＬＳＲと相互作用する物質、すなわちＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質をトリセルラージャンクションなどのＴＪに導入することにより、トリセルリンの導入が抑制され、細胞間の結合が緩和される。本発明のタイトジャンクション調節因子は、ＬＳＲと相互作用する物質を含む。本発明のタイトジャンクション調節因子を薬剤とともに用いる薬剤デリバリー系や、タイトジャンクション調節因子および薬剤を含む医薬組成物により、従来では体内に移行させることが不可能、あるいは不十分にしかできなかった薬剤を、大量かつ速やかに、しかも非侵襲的、非観血的に体内へ移行させることができる。
【００４１】
以上により、本発明のタイトジャンクション調節因子の使用により、従来制限のあった薬剤や治療の手段の選択肢の拡大が期待されることが確認された。そのため、本発明は医薬品の開発、医学、生理学および薬学的研究などの分野において有用であり、利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＳＲを含むトリセルリン誘導因子。
【請求項２】
ＬＳＲと相互作用する物質からなるタイトジャンクション調節因子。
【請求項３】
ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質である請求項２に記載のタイトジャンクション調節因子。
【請求項４】
ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＬＳＲに対する抗体、阻害ペプチド、ドミナントネガティブ変異体からなる群より選択される請求項３に記載のタイトジャンクション調節因子。
【請求項５】
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するｓｉＲＮＡ、またはそれと同等の機能を有する相同体ＲＮＡである請求項４に記載のタイトジャンクション調節因子。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１に記載のタイトジャンクション調節因子を含むタイトジャンクション調節剤。
【請求項７】
請求項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む薬剤デリバリー系。
【請求項８】
請求項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む医薬組成物。
【請求項１】
ＬＳＲを含むトリセルリン誘導因子。
【請求項２】
ＬＳＲと相互作用する物質からなるタイトジャンクション調節因子。
【請求項３】
ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子の発現抑制物質またはＬＳＲの機能阻害物質である請求項２に記載のタイトジャンクション調節因子。
【請求項４】
ＬＳＲと相互作用する物質が、ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＬＳＲに対する抗体、阻害ペプチド、ドミナントネガティブ変異体からなる群より選択される請求項３に記載のタイトジャンクション調節因子。
【請求項５】
ＬＳＲ遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するｓｉＲＮＡ、またはそれと同等の機能を有する相同体ＲＮＡである請求項４に記載のタイトジャンクション調節因子。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１に記載のタイトジャンクション調節因子を含むタイトジャンクション調節剤。
【請求項７】
請求項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む薬剤デリバリー系。
【請求項８】
請求項６に記載のタイトジャンクション調節剤を含む医薬組成物。
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２４８０９４（Ｐ２０１０−２４８０９４Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９６９７６（Ｐ２００９−９６９７６）
【出願日】平成２１年４月１３日（２００９．４．１３）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１３日（２００９．４．１３）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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