ダイゼイン資化によるエコール生成能を改善するための腸内細菌およびその利用
【課題】本発明は、腸内でダイゼインを資化してエコールを生産するもしくは腸内細菌叢全体のエコール生産を向上させる能力を有する腸内細菌を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する、ヒトの腸内細菌（特に、Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０）および、腸内細菌叢全体のダイゼインを資化してエコールを生産をする能力を効果的に向上させる能力有する腸内細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）およびそれらの利用方法を提供する。エコール生産能を向上させるための方法であって、本発明の腸内細菌または組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する方法もまた提供される。
【解決手段】本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する、ヒトの腸内細菌（特に、Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０）および、腸内細菌叢全体のダイゼインを資化してエコールを生産をする能力を効果的に向上させる能力有する腸内細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）およびそれらの利用方法を提供する。エコール生産能を向上させるための方法であって、本発明の腸内細菌または組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する方法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌と菌種特異的プライマーもしくは、ヒトの腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を向上させる腸内細菌およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１（国際公開ＷＯ９９／０７３９２号）にはダイゼインを資化してエコールを
生産する微生物であるＢａｃｔｅｉｒｏｉｄｅｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−６４３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−６４３６およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−６４３７を必須成分として含有するダイゼイン含有物が記載されている。
【０００３】
しかし、これらの微生物は、いずれもプロバイオテイクスとしての使用例の少ない菌種である。プロバイオテイクスとは、消化管内の細菌叢を改善し、宿主に有益な作用をもたらしうる有用な微生物と、それらの増殖促進物質に関する能力をいい、最近注目されている能力である。これまでのところ、プロバイオテイクスとして使用されているのは、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓなどしかない。
【０００４】
大豆食品の心臓血管疾患予防効果［非特許文献１＝Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２８巻、１５８９−１５９２頁（１９９８）］、乳癌、前立腺癌などの特定の癌の予防効果［非特許文献２＝Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ、２１、１１３−１３１（１９９４）］が示唆されている。イソフラボンは、大豆に含まれる機能性成分であり、ダイゼインはイソフラボンの主要な成分の一つである。このダイゼインは、腸内細菌の作用によって抗酸化性およびエストロゲン作用の強いエコールに資化され得ることが報告されている［非特許文献３＝Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４１巻，６３１−６３６頁（２００３）］。しかし、従来、このような特定の腸内細菌を単離してくる方法は報告されていない。
【０００５】
ところが、最近、ボランティア試験において、イソフラボンを含有する大豆食品を摂取した人の血漿コレステロールおよび血漿トリグリセリド低下効果が顕著であったのは、エコール生産能が高い人であったということが報告されている［非特許文献４＝Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ，４８巻、６７−７８頁（２００４）］。また、乳癌リスクの低さと尿中へのエコール排泄量の高さとの間に相関があるという報告［非特許文献５＝Ｌａｎｃｅｔ，３５０巻、９９０−９９４頁（１９９７）］や、男性の前立腺癌は、エコール生産能が高い人では少ないことが報告されていて［非特許文献６＝Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２巻、２９６−３００頁（２００２）］、イソフラボンの心疾患予防効果や乳癌、前立腺癌予防には、エコールが重要な役割を担っていることが推察されている。
【０００６】
非特許文献７［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６７巻，３１０４−３１１３頁（２００２）］および非特許文献８［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６８巻，６２３−６３１頁（２００２）］には、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いてイソフラボン類を生物変換する方法が記載されている。しかし、この文献で開示された細菌は、ヒトの糞便に添加した場合のエコール生産におよぼす効果については報告されておらず、エコール生産能向上効果については、全く言及しておらず、エコール生産能向上効果については、ないといえる。また同定した微生物のプロバイオテイクスとしての利用については何ら言及されていない。
【０００７】
本発明者は、非特許文献９〜１１［Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．２２巻、７０５−５１３頁（２００２）；Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．４８巻，２２５−２２９頁（２００２）；Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ Ｈｅａｌｔｈ．Ｄｉｓ １６巻、１８−２２頁（２００４）］において、エコールが動物の健康状態に与える影響を試験し、実際にエコール生産能を高めることによって、健康状態が改善したことを報告している。しかし、ヒト由来の腸内細菌であって、実際にヒトの腸内細菌叢におけるダイゼインからエコールヘの資化能力を向上作用を有するものは全く報告されていない。そのような腸内細菌は、エコール生産能向上効果を有する微生物として有用であるので、当該分野において必要性が未だに存在する。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９９／０７３９２号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２８巻、１５８９−１５９２頁（１９９８）
【非特許文献２】Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ、２１、１１３−１３１（１９９４）
【非特許文献３】Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４１巻，６３１−６３６頁（２００３）
【非特許文献４】Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ，４８巻、６７−７８頁（２００４）
【非特許文献５】Ｌａｎｃｅｔ，３５０巻、９９０−９９４頁（１９９７）
【非特許文献６】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２巻、２９６−３００頁（２００２）
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６７巻，３１０４−３１１３頁（２００２）
【非特許文献８】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６８巻，６２３−６３１頁（２００２）
【非特許文献９】Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．２２巻、７０５−５１３頁（２００２）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．４８巻，２２５−２２９頁（２００２）
【非特許文献１１】Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ Ｈｅａｌｔｈ．Ｄｉｓ １６巻、１８−２２頁（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腸内細菌叢と共存下でダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する腸内細菌および腸内細菌叢全体のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を効果的に向上させる能力を有する腸内細菌は、これまで全く見出されていない。従って、本発明は、腸内でダイゼインを資化してエコールを生産するもしくは腸内細菌叢全体のエコール生産を向上させる能力を有する腸内細菌を提供することを課題とする。
【０００９】
エコールは、たとえ大豆製品を摂取したとしても、４０％〜６０％の人では非常に生産
能力が低いことが様々な報告から明らかにされている。エコール生産能の低い人について、よりエコール生産能を高めることは、イソフラボン類が関与すると期待されている生活習慣病予防効果をより効果的に発揮させるためには、非常に重要である。
【００１０】
食品によってエコール生産能の非常に低い人のエコール生産能が高くするという方法も考えられるが、エコール生産能の非常に低い人をエコール生産能が高くする食品成分については、現在のところ見出されておらず、長期間の大豆製品を摂取した人でも、エコール生産能が変わらないといった報告があり［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．，８０巻，６９２−６９９頁（２００３）］、通常の食品の摂取だけでエコール生産能を高めることは困難であるのが現状である。
【００１１】
エコール生産能の低い人をよりエコール生産能の高い人に変えるためには、プロバイオテイクスとしてダイゼインまたはその誘導体（例えば、ダイジンなどの配糖体）を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する菌を摂取し、腸内細菌叢のエコール生産能がこの摂取菌の作用によって高めるといった方法が考えられ、ビフィドバクテリウム菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を初めとするエコール資化能を有する腸内細菌の検
索が行なわれている。
【００１２】
ところが、実際に、糞便の細菌叢に添加するだけで、ダイゼインを資化してエコールを生産能を向上させるダイゼイン資化能を有する腸内細菌および糞便細菌叢に添加するだけで、ダイゼインを資化してエコール生産能を向上させるがそれ自体はダイゼイン資化能を有さない腸内細菌は、これまで見出されていない。従って、本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌とこの菌を検出するための特異的プライマーおよびダイゼインを資化してエコールを生産する生産性を向上させる腸内細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、多くの腸内細菌について、ダイゼインまたはその誘導体を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を調べた結果、ＥＧ培地を用いることにより、効率よく、ダイゼイン資化能を有する細菌を同定することができた。そして、この菌は、実際に、腸内細菌叢のエコール生産能力を顕著に向上させた。また、この菌の菌種特異的プライマーを設計できた。さらに、ダイゼイン資化能を有さないが、腸内細菌叢のエコール生産能力を顕著に向上させる腸内細菌を見出したことによって、上記課題を解決した。
【００１４】
この新規同定方法を用いて、本発明者らは、従来にはなかったエコール生産可能なＳｌａｃｋｉａ属菌（例えば、Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０；独立行政法人産業技術総合研究所１７年１２月２日に寄託、受領番号ＡＰ−２０７２９号ヒトの腸内細菌叢のエコール生産能を向上エコール生産可能なＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＴＭｌ株；独立行政法人産業技術総合研究所１６年１２月１６日に寄託、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５）と理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＪＣＭ １２７３が存在することを見いだした。
【００１５】
本発明の代表的なＳｌａｃｋｉａ属菌とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓは、本発明者が、本発明において新規に開示した方法により、例えば、健康人の糞便より単離したものである。従って、本発明は、この新規細菌取得方法をも包含する。
【００１６】
本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する、ヒトの腸内細菌（特に、Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０）、腸内細菌叢全体のダイゼインを資化してエコールを生産をする能力を効果的に向上させる能力を有する腸内細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）およびエコール生産能を向上させるための、この腸内細菌を含む組成物、およびダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有するヒトの腸内細菌の分子生物学的手法を用いた迅速検出・定量測定方法を提供する。エコール生産能を向上させるための方法であって、本発明の腸内細菌または組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する方法もまた提供される。
（１）ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌と菌種特異的プライマーもしくは、ヒトの腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を向上させる腸内細菌。
（２）上記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する、項目１に記載の腸内細菌。
（３）上記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目１に記載の腸内細菌。
（４）上記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ種またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種に属する、項目３に記載の腸内細菌。
（５）上記腸内細菌の菌種特異的プライマーであって、配列番号３に示す配列の一部で選択的に検出可能であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（６）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能が１．０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（７）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能１０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（８）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能２０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（９）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能３０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１０）上記腸内細菌は、エコール非生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性付与効果を有することを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１１）上記腸内細菌は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対して２倍以上のエコール生産性向上効果を有することを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１２）上記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属である、項目７または８に記載の腸内細菌。
（１３）上記腸内細菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７２９号（受領日平成１７年１２月２日）のＳｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５号（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５号）（受領日平成１６年１２月１６日）として寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株、もしくは理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＪＣＭ １２７３である項目１に記載の腸内細菌。
（１４）プロバイオテイクスとして使用可能な細菌であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１５）デンプンまたはグリコーゲンを資化する能力を有することをさらに特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１６）項目１に記載の腸内細菌の組み合わせであって、上記組み合わせに含まれる上記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する細菌と、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌とを含む、組み合わせ。
（１７）上記組み合わせは、Ｓｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株との組み合わせを含む、項目１６に記載の組み合わせ。
（１８）エコール生産能を向上させるための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせを含む組成物。
（１９）食品または医薬である、項目１８に記載の組成物。
（２０）さらに他の有効成分を含む、項目１８に記載の組成物。
（２１）上記腸内細菌は、液体中に溶解して提供される、項目１８に記載の組成物。
（２２）上記腸内細菌は、固形状で提供される、項目１８に記載の組成物。
（２３）上記腸内細菌は、凍結乾燥されて提供される、項目１８に記載の組成物。
（２４）上記腸内細菌を胃液から保護する成分をさらに含む、項目１８に記載の組成物
（２５）エコール生産能を向上させるための方法であって、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせまたは項目１８〜２４のいずれか１項に記載の組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する、方法。
（２６）ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有するもしくはエコール生産能を向上させるための細菌を生産する方法であって、上記細菌を含むことが予想されるサンプルを、ＥＧ培地を用いて培養する工程を包含する、方法。
（２７）ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌もしくはエコール生産能を向上させるヒトの腸内細菌を生産する方法であって、
Ａ）ヒトの腸由来物質または糞便を含むサンプルを提供する工程；
Ｂ）上記サンプルを、ＥＧ培地を用いて、３７℃で培養する工程；
Ｃ）ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン塩酸０．５ｇ、炭酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、上記サンプル中で菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションする工程；
Ｄ）反応液中のイソフラボン類の分析を行う工程；および
Ｅ）ダイゼインまたはその誘導体を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌を選択し、生産する工程を包含する方法。
（２８）上記サンプルは、健康人の糞便に由来するサンプルである、項目２７に記載の方法。
（２９）項目２７〜２９に記載の方法により調製される細菌。
（３０）エコールを含むもしくはエコール生産性を向上させる医薬を製造するための方法であって、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を上記腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する、方法。
（３１）項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を上記腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する方法によって生産された、組成物。
（３２）項目３０に記載の方法によって得られる細菌。
（３３）エコールを含む医薬を製造するための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、項目３０に記載の方法によって得られる細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
（３４）エコール生産能を向上させるための医薬を生産するための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、項目３０に記載の方法によって得られる細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
【００１７】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する細菌を同定する方法を初めて提供することによって、そのような細菌と腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産性向上能を有する細菌の同定および生産することを初めて可能にした。本発明を利用して同定することができたダイゼインを資化してエコールを生産する本究明のＳｌａｃｋｉａ属菌もしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌は、糞便腸内細菌叢に添加するとエコール生成能を顕著に向上させることが確認された。本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌は、イソフラボン含有食品と同時もしくは個別に経口的に摂取することで、腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を短期間で向上させることができる。また、ダイゼインを資化してエコールを生産する本究明のＳｌａｃｋｉａ属菌の菌種特異的プライマーを用いることで、分子生物学的手法によるエコール生産能を有する腸内細菌の高速検出を可能とし、エコール生産性腸内細菌の検出方法に画期的な手法を提供することとなる。
【００１９】
従って、本発明は、プロバイオテイクスまたは健康食品、医薬などとして有用な腸内細菌を提供する。およびエコール生産菌の新規検出方法を提供本発明は、女性の乳癌、男性の前立腺癌などの予防医学において効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２１】
本明細書において、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）とは、４’，７−ジヒドロキシー３−ジデヒドロイソフラバン−４−オン（４’，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｉｓｏｆｌａｖａｎ−４−ｏｎｅ）という一般名で表され、以下の構造
【００２２】
【化１】
【００２３】
という構造を有するイソフラボンである。
【００２４】
本明細書においてダイゼインの誘導体とは、加水分解などによってダイゼインに変換され得る化合物をいう。そのような誘導体としては、例えば、配糖体を挙げることができ、代表的には、ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジンなどを挙げることができる
本明細書において、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）とは、７−（β−Ｄ−グルコピラノシ
ルオキシ）−４’−ヒドロキシ−２，３−ジデヒドロイソフラバンー４−オン（７−（β
−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ）−４’−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｉｓｏｆｌａｖａｎ−４−Ｏｎｅ）という一般名で表され、以下の構造
【００２５】
【化２】
【００２６】
を有する。
【００２７】
本明細書において、エコール（ｅｑｕｏｌ）とは、一般名７−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）クロマンで表され、以下の構造
【００２８】
【化３】
【００２９】
という構造を有する化合物である。エコールは、抗酸化性およびエストロゲン作用の強いイソフラボンとして知られている。
【００３０】
本明細書において、「ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能」とは、ダイゼインまたはその誘導体（例えば、ダイジンのような配糖体）に曝されたとき、エコールを生産する細胞の能力をいう。
【００３１】
本明細書において、このような細菌のダイゼイン資化能は、以下のようにエコール濃度を測定することによって判定されその値は、ダイゼイン資化能値とも称される。
【００３２】
〈Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのダイゼイン資化能測定法〉
ＥＧ培地を用い、３７℃で４８時間、Ｓｌａｃｋｉａ属菌を培養する。反応液０．２ｍｌで、Ｓｌａｃｋｉａ属菌を菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。
【００３３】
本明細書において用いられるＥＧ培地は、以下のようにして調製される。
【００３４】
組成：馬肉浸出液 ９３０ｍＬ
Ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｎｏ ３ （Ｄｉｆｃｏ） １０ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （Ｄｉｆｃｏ） ５ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４ ４ｇ
グルコース １．５ｇ
Ｌ−シスチン（予め少量の０．１Ｎ ＨＣｌで溶解して添加） ０．２ｇ
消泡剤（トーレシリコン１０％溶液） ５ｍＬ
Ｌ−システイン・ＨＣＬ・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
馬血液 ５０ｍＬ
ｐＨ ７．６〜７．８。
【００３５】
製造方法：Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液以外の成分を加熱して溶解し、ｐＨを修正、１１５℃、２０分滅菌後５０℃に冷やし、Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。なお、馬肉浸出液は、培地１０００ｍｌに対し５００ｇの馬肉からの浸出液を用いる。
本明細書において使用されるダイゼイン資化能測定法において用いられる反応性は、以下のようにして作製される：ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−シ
ステインー塩酸０．５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素
フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行う。
【００３６】
本明細書のダイゼインを資化してエコールを生産する能力の測定試験における反応の終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：
５）を加えて６０秒間激しくボルテックスする。ついで、遠心分離し得られた上澄をフィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行う。
【００３７】
本発明のヒトの腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属菌、もしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。Ｓｌａｃｋｉａ属菌は、ヒトの腸内の常在菌の一種であり、以前は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に分類されていた。また、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌は、アクチノミセス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の細菌の一属であり、分枝した、二分叉の棍棒状またはへら状の桿菌をいう。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌は、母乳で養育される乳児の腸内菌叢の主要な構成菌で、これらの菌が消化管内で糖を分解して産生する乳酸や酢酸が消化に役立つとされる。
【００３８】
本発明のヒトの腸内細菌の一方は、ＢＬ培地のコロニー形態からビフィスズ菌である可能性が考えられた。本明細書において使用される「Ｂｉｆｉｄｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ」は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌種であり、ここで使用される性質は、光岡らの糖発酵試験法（腸内菌の世界一嫌気性菌の分離と同定：叢文社、１９８４）に記載される方法に準じて行う。他方のＳｌａｃｋｉａ属菌は、コロニー形態や顕微鏡観察からは、菌の同定となる手がかりが見出せなかったため、自動細菌同定検査装置を用いたラピッドＩＤ３２ Ａアピ（日本ビオメリュー株式会社製）と篠田らの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法［非特許文献１２＝島津評論，５７巻，１２１−１３２頁（２０００）］を採用して同定を行なった。具体的には、以下の通りである。
【００３９】
ＰＹＦ培地（ペプトンーイーストエクストラクトーフィールズ（Ｐｅｐｔｏｎｅ−Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔ ｒａｃｔ−Ｆｉｅｌｄ溶液ブロス；トリプティケース（ＢＢＬ）１０ｇ；イーストエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ）５．Ｏｇ；フィールズ溶液（消化血液）４０ｍｌ ；塩溶液４０ｍｌ；Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ；精製水９２０ｍｌ、ｐＨ７．２に調整）に、各種試験用の糖類（例えば、Ｌ−アラビノース；Ｄ−キシロース；Ｄ−グルコース；Ｄ−マンノース；Ｄ一フラクトース；Ｄ−ガラクトース；マルトース；シュークロース；ラクトース；トレハロース；Ｄ−ソルビトール；Ｄ−マンニトール；イノシトール；グリセリン；デンプンなど）を添加して、滅菌し、糖資化性状検査用培地とする．分離株をＢＬＢ培地（Ｂｒｉｇｇｓ Ｌｉｖｅｒ Ｂｒｏｔｈ；トマトジュース溶液（トマトジュース（Ｄｅｌ Ｍｏｎｔｅ）を等量の水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを７・０に調整し、濾紙で濾過する）４００．０ｍｌ；Ｎｅｏｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）１５．Ｏｇ；Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）６．０ｇ；肝臓抽出物（Ｌｉｖｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ）（１０ｇの肝臓粉末を１７０ｍｌの水に入れ、５０℃〜６０℃で１時間維持し、５分間煮沸して、ｐＨを７．２に調整し、濾過することによって調製する）７５．０ｍｌ；グルコース２０．０ｇ；可溶性デンプン０・５ｇ；ＮａＣ１ ５．０ｇ；Ｔｗｅｅｎ ８０ １．０ｇ；Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ ０・２ｇ；蒸留水 ５２５．０ｍｌ、ＰＨは６．８に調整する）で３７℃、４８時間嫌気的に培養を行った後、一白金耳をこのＢＬＢ培地に接種して再び３７℃で２４時間培養し、その０・３ｍｌを遠心分離管に９ｍｌずつ分注したＢＬＢ培地に摂取し、再び３７℃２４時間培養する。次いで、菌体を遠心分離し、上清を捨て、０．１％Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと０．１％チオグリコール酸ナトリウムを含む滅菌食塩水で原培養液の２倍の濃度に再浮遊した物を接種溶液とする。この菌液を上記糖資化性状検査用培地に添加して、嫌気培養装置にて、一週間培養を行い、培地のｐＨの変動から糖の資化性を決定する。
【００４０】
ここで、特に、本発明のビフィスズ菌属の腸内細菌は、好ましくは、以下の条件：
Ａ）好気条件での発育：−
Ｂ）カタラーゼ：−
Ｃ）ゼラチン液化性：−
Ｄ）インドール産生：−
Ｅ）硝酸還元性：−
このほかに、本発明の好ましい腸内細菌は、以下の菌学的性質を有する。
【００４１】
以下の温度で良好に生育する：３７℃〜４３℃
以下のｐＨで良好に生育する：７．２〜７．５
好気性嫌気性の別：嫌気性
グラム陽性・陰性：グラム陽性菌
ウレアーゼ −
糖類から酸及びガスの生成の有無
エスクリン ＋
グリセリン −
Ｄ−キシロース ＋
Ｄ−マンノース ＋
マンニトール ＋。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法により単離される腸内細菌は、以下の糖について以下に示す酸及びガスの生成：
Ａ）Ｌ一アラビノース（＋）
Ｂ）エリスリトール（−）
Ｃ）セロビオース（＋）
Ｄ）Ｄ−ラフィノース（＋）
Ｅ）Ｄ−フルクトース（＋）
Ｆ）ガラクトース（＋）
を生理学的性質として有し得る。
このような性質は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ種が有し得るがこれに限定されない。
本発明のビフィズス細菌は、ヒトの腸内細菌叢のダイゼイン資化能を通常少なくとも３８％以上向上させる能力を有し、エコール生産菌に対しては、共存させた場合に、ダイゼイン資化能を少なくとも５００％以上向上させる能力を有する。従来の細菌で、５００％以上ものダイゼイン資化能を向上させる細菌は見つかっておらず、本発明の方法により初めて同定することができた細菌であるといえる。
本明細書において、本発明に係る腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力の向上に寄与するビフィドバクテリウム菌は、幼児、成人等の糞便から分離した多数のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌株の中から分離された。この菌株の代表例は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５号（受領日平成１６年１２月１６日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５号）として寄託済みである。
【００４３】
分離したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の同定は、光岡らの糖発酵試験法（腸内菌の世界−嫌気性菌の分離と同定 叢文社）に準拠して行なった。
【００４４】
最も好ましい実施形態において、本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１菌株は次のような菌学的性質を有し、それによりＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓに属する菌株であると同定された：グラム陽性無芽胞桿菌。顕微鏡観察では棍棒状の桿菌で分岐したものも認められる。好気条件での発育（−）、カタラーゼ（−）、ゼラチン液化性（−）、硫化水素産生（−）、インドール産生（−）、硝酸還元性（−）。ＢＬ寒天平板上ではＥＧ寒天平板上の集落よりもはるかに大型で、菌体の一部が膨らみ、湾曲し、一端が細くなったものが多く、分岐したものもみられる。ＢＳ寒天培地での生育は良好である。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１菌株は、代表的には、次のような糖発酵性を有する。
【００４６】
Ｌ−アラビノース（＋）、Ｄ−キシロース（＋）、Ｄ−フルクトース（＋）、ガラクト
ース（＋）、マルトース（＋）、セロビオース（＋）、ラクトース（＋）、Ｄ−ラフイノース（＋）、グルコース（＋）、エリスリトール（−）、メリビオース（＋）、トレハロース（−）、マンニトール（＋）、ソルビトール（−）、マンノース（＋）、ラムノース（−）。
【００４７】
分離したＳｌａｃｋｉａ属菌の同定は、自動細菌同定検査装置を用いたラピッドＩＤ３２ Ａアピ（日本ビオメリュー株式会社製）及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して行なった。また、グルコース発酵性試験、胆汁耐性試験についても検討を行った。
【００４８】
本発明のヒトの腸内細菌の他方のＳｌａｃｋｉａ属菌は、グラム陽性桿菌であり、好気条件下では生育しないいわゆる嫌気性菌である。ＥＧおよびＢＬ培地では、乳白色の微小コロニーを形成する。コロニー形状は、ドーム状に隆起し、ＢＬ培地で生育した本菌の顕微鏡観察では、短桿菌から長桿菌が混在し、いわゆるビフィズス菌等でしばしば観察される多形性を示す。グルコースをわずかに発酵し、１０％及び２０％胆汁酸共存下では、生育しない。
【００４９】
本発明のＳｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株は、以下の生化学的性質を有する（＋：陽性，−：陰性）ウレアーゼ（−）、アルギニンジヒドラーゼ（＋）、α−ガラクトシダーゼ（−）、β−ガラクトシダーゼ（−）、β−ガラクトシダーゼ−６−フォスフェート（−）、α−グルコシダーゼ（−）、β−グルコシダーゼ（−）、α−アラビノシダーゼ（−）、β−グルクロニダーゼ（−）、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（−）、Ｄ（＋）マンノース発酵（−）、ラフィノース発酵（−）、硝酸塩の還元（−）、インドール産生（−）、アルカリフォスファターゼ（−）、アルギニンアリルアミダーゼ（＋）、プロリンアリルアミダーゼ（−）、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ（−）、フェニルアラニンアリルアミダーゼ（−）、ロイシンアリルアミダーゼ（−）、ピログルタミン酸アリルアミダーゼ（−）、チロシンアリルアミダーゼ（−）、アラニンアリルアミダーゼ（−）、グリシンアリルアミダーゼ（−）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（＋）、α−フッコシダーゼ（−）、ヒスチジンアリルアミダーゼ（−）、グルタミルグルタミン酸アリルアミダーゼ（−）、セリンアリルアミダーゼ（−）。
【００５０】
Ｓｌａｃｋｉａ属菌を同定するのに用いた篠田らの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法では、細菌のゲノムをインスタジーンマトリクス（日本バイオラッド）で抽出し、２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１））と１４９２ｒ （５’−ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号２）のユニバーサルプライマー組み合わせでＰＣＲを行い、１６ＳｒＤＮＡの増幅を行った。さらに、１６ＳｒＤＮＡをキアゲンのスピンカラムで精製し、六種類のシーケンスプライマーとＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＶｅｒ１．１を用いてＰＣＲを行い、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ３１０で、遺伝子解析し、Ｓｌａｃｋｉａ属菌の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を決定した。
【００５１】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
【００５２】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５３】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
【００５４】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００５５】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
【００５６】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００５８】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５９】
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。 本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００６１】
本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００６２】
本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチドにおける任意の因子には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【００６３】
本明細書においてポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。
【００６４】
本発明の Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列（１４０２ｂｐ）を示す。
【００６５】
Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列（１４０２ｂｐ）：
ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＡＡＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＡＣＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＧＴＣＧＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡ（配列番号３）。
【００６６】
上記塩基配列をＤＤＢＪの核酸データベースでｂｌａｓｔｎを利用して相同性の高い菌を検索したところ、本発明の菌株は、Ｓｌａｃｋｉａ ｅｘｉｇｕａ （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ：ＡＦ１０１２４０）の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の１３６５個のうち１２６９が一致した（９２％）。よって本菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属すると考えられる。 Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株は、以下のようなＩｎ ｖｉｔｒｏでのダイゼイン資化能を有する。
【００６７】
【表１】
【００６８】
ここで、反応前から反応後に減少したダイゼイン濃度に対する反応２４時間後エコール濃度の割合をダイゼイン資化能として計算すると、本発明の一つの代表的な菌株は、１．６％以上のダイゼイン資化能を有するといえる。
【００６９】
本明細書において「ダイゼイン資化能」は、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションし、反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸との混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスにより攪拌し、遠心分離して得られた上澄をフィルターで濾過し、濾液を電気化学的検出器搭載のＨＰＬＣ（日本分光などから入手可能）で分析してイソフラボン類の分析を行って、エコール生産性の有無を確認し、エコールが生産（すなわち、ダイゼインが資化）されていることを確認することによって確認することができる。
【００７０】
本明細書において「ヒトフローラマウス」とは、ヒトフローラを腸内に移植したマウスを言う。ヒトのフローラに関する実験モデルとして使用される。
【００７１】
本明細書において、「エコール非生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性付与効果」とは、エコールを通常生産しないヒトフローラマウスに投与すると、エコールを生産する能力を付与する能力をいう。具体的には、本明細書において実施例３において例示されている。
【００７２】
本明細書において、「エコール生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性向上効果」とは、エコールを通常生産するヒトフローラマウスに投与すると、そのエコール生産脳が増強される能力を言う。具体的には、本明細書実施例４などに例示されている。
【００７３】
（有用組成物）
別の局面において、本発明は、エコール生産能を向上させるための、本発明の腸内細菌を含む組成物を提供する。このような組成物は、食品、飼料、健康食品、特定医療用保険食品、医薬部外品、医薬品などとして利用することができる。特に、本発明は、ヒトの腸内細菌であることから、ヒトのプロバイオテイクスとして利用することができる。
本発明の組成物には、好ましくは、さらなる有効成分を含めることができる。そのような有効成分としては、例えば、大豆オリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖などのビフイズス菌増殖促進物質などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００７４】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
【００７５】
本発明の腸内細菌または組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。腸内細菌を投与する場合は、腸に送達し得る形態であることが好ましい。
【００７６】
好ましくは、製剤化する場合は、本発明の腸内細菌の凍結乾燥菌末に、必要に応じてデンプン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの賦形剤も混合して成形する。
【００７７】
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
【００７８】
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７９】
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルポキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。
【００８０】
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルポキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８１】
固形製剤における崩壊阻害剤の好ましい例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８２】
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８３】
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ペントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８４】
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８５】
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８６】
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８７】
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。
【００８８】
液状製剤における溶剤の好ましい例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
【００８９】
液状製剤における溶解補助剤の好ましい例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９０】
液状製剤における懸濁化剤の好ましい例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ペンザルコニウム、塩化ペンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における等張化剤の好ましい例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−
マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエ
ン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における無痛化剤の好ましい例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザル
コニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９１】
液状製剤における防腐剤の好ましい例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９２】
液状製剤における抗酸化剤の好ましい例としては、亜硫酸塩、アスコルピン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９３】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
【００９４】
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、
ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【００９５】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤
（日本薬局方第１４版、その追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ・Ｒ・Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ・１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【００９６】
細胞を凍結乾燥する方法もまた、公知である。そのような方法としては、例えば、ジメチルホルムアミドなどに細胞を入れて凍結乾燥機でアンプルが真空状態になるよう処理した後、４〜２５℃で保存する方法等を挙げることができる。このほかにも、液体窒素法：１０％グリセロール加保存培地に濃厚菌を懸濁し、これを専用アンプルに収め、液体窒素タンク（−１５０〜−１９６℃）で保管することができる。
【００９７】
本発明の組成物の投与すべき量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日一数ケ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ケ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ケ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００９８】
本明細書において「患者」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「被検体」または「被験体」ともいわれる。患者は好ましくは、ヒトであり得る。
【００９９】
本発明は、患者への有効量の本発明の組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、本発明の組成物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。
【０１００】
本発明はまた、エコールを含む医薬を製造するための方法であって、本発明の腸内細菌と、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を該腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する、方法を提供する。
【０１０１】
ここで、本発明のＳｌａｃｋｉａ属腸内細菌は、ダイゼインをエコールに資化する能力を有することから、エコールを含む医薬を効率よく製造することが可能である。混合された混合物は、使用される腸内細菌が、ダイゼインをエコールに資化させる任意の条件下でインキュベートすることができることが理解される。
【０１０２】
本明細書において、ダイゼインをエコールに資化させる条件は、当業者が当該分野において公知の方法を用いて適宜決定することができる。そのような条件としては、例えば、ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン−塩酸０．５ｇ、炭
酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込
みながら試験管に分注し、ブチルゴム栓をして、オートクレープ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、該サンプル中でＳｌａｃｋｉａ属菌の菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションすることを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１０３】
生成したエコールは必要に応じて精製または分離することができる。そのような精製および分離の方法は、クロマトグラフィー、バッチ、ＨＰＬＣ、抽出など当該分野において
公知の任意の方法を用いて実施することができる。
【０１０４】
従って、本発明はまた、本発明の腸内細菌とダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を本発明の腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する方法によって生産された、組成物を提供する。このような組成物は、エコールなどのエストロゲン様効果を有するかまたは強いイソフラボンに富むことから、抗癌（乳癌、前立腺癌予防）作用、心疾患予防効果などを期待して投与するために用いられ得る。
【０１０５】
本発明はまた、別の局面において、エコール生産能を向上させるための方法を提供する。エコール生産能とは、ヒトなどの動物において用いられるとき、腸内でダイゼインをエコールに変換できる能力をいう。エコール生産能が高いと、イソフラボンの血漿コレステロールおよび血漿トリグリセリド低下効果が顕著であり、抗癌作用なども期待されることから、エコール生産能を上げることは、健康の品質を改善する役割を果たす。
【０１０６】
この方法は、本発明の腸内細菌または本発明の組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する。そのような投与は、当該分野において公知の方法を利用して実施することができる。
【０１０７】
本明細書中、「投与する」とは、本発明の医薬などまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて処置が意図される宿主に与えることを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の粘膜を通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０１０８】
（本発明の腸内細菌生産法）
別の局面において、本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、細菌および腸内細菌叢のエコール生産能向上作用を有する細菌を生産する方法であって、該細菌を含むことが予想されるサンプルを、ＥＧ培地を用いて培養する工程を包含する、方法を提供する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する、ヒトの腸内細菌を生産する方法であって、Ａ）ヒトの腸由来物質または糞便を含むサンプルを提供する工程；Ｂ）該サンプルを、ＥＧ培地を用いて、３７℃で培養する工程；Ｃ）ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン−塩酸 ０．５ｇ、炭酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレープ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、該サンプル中で菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションする工程；Ｄ）反応液中のイソフラボン類の分析を行う工程；およびＥ）ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する腸内細菌を選択し、生産する工程を包含する方法を提供する。
【０１１０】
理論に束縛されることを望まないが、本発明のような細菌がこれまで同定できなかったのは、嫌気性徴生物の培地は、多くの種類があり、ＥＧ培地は市販されておらず、自ら調製して作製する必要があることから、ＥＧ培地ではなく他の市販の培地を用いてダイゼイン資化能を有する菌を探索することが通常であったからであると考えられる。微生物の代謝活性は、培地によって大きく変動する場合がある。本発明において、ダイゼイン資化菌の同定を可能にしたのは、ダイゼイン資化菌を探索および同定する目的としては、これまで世界において全く使用されていなかったＥＧ培地のみを用いて、しかも、好ましい実施形態においては、嫌気性反応液も、嫌気度の高い反応液を組み合わせるという一連の新規な工夫を行ったからであると考えられる。
【０１１１】
本発明は、好ましくは、上記方法において、サンプルとして健康人糞便由来のものを利用することが好ましい。特に、エコール生産能の高い健康人の糞便を使用することがより好ましい。
【０１１２】
（使用）
本発明は、エコールを含む医薬を製造するためまたはエコール生産能を向上させるための医薬を生産するために、本発明の腸内細菌を使用することを企図する。このような腸内細菌は、上記（腸内細菌）に関する説明において記載される任意の形態を採用することができることが理解される。
【０１１３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１５】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない０以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ・Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＵＳＡ）などから市販されるものを用いた。
（実施例１：ダイゼイン資化能を有する腸内細菌およびダイゼイン資化能を向上させる腸内細菌の分離）
本実施例では、ＥＧ培地を用いて、細菌を分離した。ＥＧ培地は以下のようにして調製
した。
本明細書において用いられるＥＧ培地は、以下のようにして調製される。
【０１１６】
組成：馬肉浸出液 ９３０ｍＬ
Ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｎｏ ３ （Ｄｉｆｃｏ） １０ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （Ｄｉｆｃｏ） ５ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４ ４ｇ
グルコース １．５ｇ
Ｌ−シスチン（予め少量の０．１Ｎ ＨＣｌで溶解して添加） ０．２ｇ
消泡剤（トーレシリコン１０％溶液） ５ｍＬ
Ｌ−システイン・ＨＣＬ・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
馬血液 ５０ｍＬ
ｐＨ７．６〜７．８
製造方法：Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液以外の成分を加熱して溶解し、ｐＨを修正、１１５℃、２０分滅菌後５０℃に冷やし、Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。なお、馬肉浸出液は、培地１０００ｍｌに対し５００ｇの馬肉からの浸出液を用いる。
【０１１７】
新鮮なヒト糞便を滅菌ホモジナイザーに入れ、嫌気性希釈液で１０倍ずつ段階的に希釈し、それぞれの希釈段階あたり０・０５ｍｌを滅菌ピペットを用いてＥＧ培地に接種し、滅菌コンラージ棒で塗り広げて、３７℃、４８時間で簡易型嫌気性培養装置にて培養を行つた。培養終了後、コロニーを１個ずつ白金耳で拾い上げ、別のＥＧ培地に塗り広げて、再度３７℃、４８時間、簡易型嫌気性培養装置にて培養を行った。培養終了後、１白金耳ずつ２００μｌの嫌気性反応液（ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０・５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行った反応液）に懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行つた。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸との混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスにより攪拌した。次いで、遠心分離して得られた上澄をフィルターで濾過し、濾液を電気化学的検出器搭載のＨＰＬＣ（日本分光などから入手可能）で分析してイソフラボン類の分析を行って、エコール生産性の有無を確認した。次に、増菌するために、エコール生産性の認められる腸内細菌をＥＧ培地に接種し、３７℃、４８時間で簡易型嫌気性培養装置にて培養を行った。培養終了後、コロニーを１個ずつ白金耳で拾い上げ上記の嫌気性反応液２００μｌに懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、予めＥＧ培地で増菌していたエコール生産性が無い腸内細菌を１白金耳接種して、上記と同様の方法で培養、エコールの分析を行って、エコール生産性菌のエコール生産性が向上するかどうかを検討した。
【０１１８】
その結果、エコール生産性が向上したことが確認された。
【０１１９】
（実施例２： 分離した腸内細菌の資化能）
Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０のダイゼインのｉｎ ｖｉｔｒｏでの資化能を下記の方法で調べた。ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌を嫌気性希釈液に懸濁し、懸濁液２００μｌにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、３７℃、２４時間インキュベーションを行った。Ｓｌａｃｋｉａ属菌終濃度（約１０９／ｍｌ）。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスした後、フィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
本発明の代表的な菌株は、１．６％以上のダイゼイン資化能を有すると言える。
【０１２２】
（実施例３： エコール非生産性ヒトフローラマウスに対するＳｌａｃｋｉａ属菌のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
健康なヒトの糞便を嫌気性グローブボックス（窒素：炭酸ガス：水素＝８５：１０：５） 内で嫌気性輸送液を用いてホモジネートし、この糞便希釈液をビニールアイソレータ内で飼育している無菌マウス（ＩＱＩ）ＩＣＲ系成熟雄マウスに経口投与し、ヒトの腸内細菌叢を有するヒトフローラマウスを作製した。このヒトフローラマウスをガンマー線滅菌ＡＩＮ９３Ｍ飼料で１９ヶ月間飼育した後、糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行い、エコール生産能を調べたところ、１匹のマウスでエコール生産能が非常に低いヒトフローラマウスを得た。そこで、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えてさらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液２０μｌを糞便希釈液に加えた。Ｓｌａｃｋｉａ属菌終濃度（１０７／ｍｌ）。反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、菌液２０μｌの代わりに嫌気性希釈液２０μｌ加えたものを用いた。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスした後、フィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
本発明の代表的な菌株は、エコール非生産性ヒトフローラマウスに対するエコール生産能付与効果を有すると言える。
【０１２５】
（実施例４： エコール生産性ヒトフローラマウスに対するＳｌａｃｋｉａ属菌のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
健康なヒトの糞便を嫌気性グローブボックス（窒素：炭酸ガス：水素＝８５：１０：５） 内で嫌気性輸送液を用いてホモジネートし、この糞便希釈液をビニールアイソレータ内で飼育している無菌マウス（ＩＱＩ）ＩＣＲ系成熟雄マウスに経口投与し、ヒトの腸内細菌叢を有するヒトフローラマウスを作製した。このヒトフローラマウスをガンマー線滅菌ＡＩＮ９３Ｍ飼料で１９ヶ月間飼育した後、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行い、エコール生産能を調べたところ２匹のマウスでエコール生産能を有するヒトフローラマウスを得た。そこで、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えてさらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。Ｓｌａｃｋｉａ属菌終濃度（１０７／ｍｌ）。反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
本発明の代表的なＳｌａｃｋｉａ属菌株は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対する２．１倍以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１２８】
（実施例５： エコール生産能を有するＳｌａｃｋｉａ属菌に対するビフィドバクテリウム菌ＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌とビフィドバクテリウムＴＭ−１菌とをそれぞれ白金耳にて別々に嫌気性希釈液に懸濁し、Ｓｌａｃｋｉａ属菌２００μｌに対してビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株１０μｌとダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、ビフィドバクテリウム菌液１０μｌの代わりに嫌気性希釈液１０μｌ加えたものを用いた。反応液のＳｌａｃｋｉａ属菌終濃度は約１０９／ｍｌ、ビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株終濃度約１０６／ｍｌであった。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
本発明のビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、エコール生産能を有する菌に対する五倍以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１３１】
（実施例６： エコール生産能を有するＳｌａｃｋｉａ属菌に対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるダイゼイン配糖体からのエコール生産能向上効果）
ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌とビフィドバクテリウムＴＭ−１菌とをそれぞれ白金耳にて別々に嫌気性希釈液に懸濁し、次のように三種類の反応液を作製してダイゼイン配糖体の資化性を検討した。
【０１３２】
（１）Ｓｌａｃｋｉａ属菌２００μｌに対してビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株１０μｌとダイジン（４０ ｍｇ／ｍｌ）１μｌ添加 （反応液のＳｌａｃｋｉａ属菌終濃度は約１０９／ｍｌ、ビフィドバクテリウム菌終濃度約１０９／ｍｌ）
（２）Ｓｌａｃｋｉａ属菌２００μｌに対してダイジン（４０ ｍｇ／ｍｌ）１μｌ添加（反応液のＳｌａｃｋｉａ属菌終濃度は１．１２×１０９／ｍｌ
（３）ビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株２００μｌに対してダイジン（４０ ｍｇ／ｍｌ）１μｌ添加 （反応液のビフィドバクテリウム菌終濃度は約１０１０／ｍｌ
上記三種類の反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスした後、フィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行った。
【０１３３】
【表６】
【０１３４】
本発明の代表的なＳｌａｃｋｉａ属菌は、ダイゼインの配糖体からは、ダイゼインもエコールも生成できないが、本発明のビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、ダイゼインの配糖体からグルコースを加水分解し、ダイゼインを生成することで、Ｓｌａｃｋｉａ属菌のダイゼインの配糖体からのエコール生産に寄与していると言える。
【０１３５】
（実施例７： エコール生産性ヒトフローラマウスに対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
健康なヒトの糞便を嫌気性グローブボックス（窒素：炭酸ガス：水素＝８５：１０：５） 内で嫌気性輸送液を用いてホモジネートし、この糞便希釈液をビニールアイソレータ内で飼育している無菌マウス（ＩＱＩ）ＩＣＲ系成熟雄マウスに経口投与し、ヒトの腸内細菌叢を有するヒトフローラマウスを作製した。このヒトフローラマウスをガンマー線滅菌ＡＩＮ９３Ｍ飼料で１９ヶ月間飼育した後、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行い、エコール生産能を調べたところ２匹のマウスでエコール生産能を有するヒトフローラマウスを得た。そこで、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えてさらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液８μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム菌菌終濃度（約１０８／ｍｌ）。反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、菌液８μｌの代わりに嫌気性希釈液８μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
本発明の代表的なビフィドバクテリウム菌株は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対する３８％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１３８】
（実施例８： エコール生産性ＩＣＲ系マウスに対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
あらかじめエコール生産能があることを確認した二匹のＩＣＲ系雄マウスの糞便を採取し、上記希釈液で糞便当たり２５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、さらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウム ＴＭ−１菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム菌菌終濃度（約１０８／ｍｌ）。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
本発明の代表的なビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、エコール生産性コンベンショナルマウスに対する２５％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１４１】
（実施例９： エコール生産能を有するヒトに対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
エコール生産能をあらかじめ確認した健康な男性成人でしかも、過去二ヶ月以内に抗生物質を摂取したことが無いと確認がとれているヒトの糞便を採取し、上記希釈液で糞便当たり３０倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、さらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウム菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム菌菌終濃度（約１０８／ｍｌ）。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１４２】
【表９】
【０１４３】
本発明の代表的なビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、エコール生産性のヒトに対する２０％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１４４】
（実施例１０： エコール生産能を有するヒトに対するビフィドバクテリウム ブレーベＪＣＭ１２７３菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
エコール生産能をあらかじめ確認した健康な男性成人でしかも、過去二ヶ月以内に抗生物質を摂取したことが無いと確認がとれているヒトの糞便を採取し、上記希釈液で糞便当たり３０倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、さらに、ＢＬ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウム ブレーベＪＣＭ１２７３菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム ブレーベ菌終濃度（約１０７／ｍｌ）。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１４５】
【表１０】
【０１４６】
ビフィドバクテリウム ブレーベＪＣＭ１２７３菌株は、エコール生産性のヒトに対する１８％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１４７】
（実施例１１： １６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析にもとづくＳｌａｃｋｉａ属菌種の推定およびエコール生産性Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマーの取得）
ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌からインスタジーンマトリクス（バイオラッド製）で細菌のゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを篠田らの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法［非特許文献８＝島津評論，５７巻，１２１−１３２頁（２０００）］を採用してＳｌａｃｋｉａ属菌種の推定を行ったところ本菌は、Ｓｌａｃｋｉａ ｅｘｉｇｕａ （受託番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ）：ＡＦ１０１２４０）の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の１３６５個のうち１２６９が一致した（９２％）。よって本菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属すると考えられるが、種レベルでは、全くの新菌の可能性がある。そこで、本菌を特異的に検出する菌種特異的プライマーの作製を試みた。ＤＤＢＪの核酸データベースと ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ ｐｒｏｇｒａｍ ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２巻４６７３−４６８０頁 （１９９４）］を利用してエコール生産性Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマーを取得した。
Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマー：
Ｆｏｒｗａｒｄ ＳＬＣｆ ５’ＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧ３’（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＳＬＣｒ ５’ＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＴ３’（配列番号５）
生成物サイズ（ｂｐ） ３８３ｂｐ
Slackiasp. TM-30特異的プライマーによるPCR産物（配列）：３８３bp
AAGCCTCGGATGCGGCAGGGGGAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCGGGAAGAACACCGACGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGCCGGCATCGACGCTGAGGCGCGAAAGCTGGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCCAGCCGTAAACGATGGACGCTAGGTGTGGGGGGAACATCCCTCCGTGCCGAAGCCAACGCATTAAGCGTCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATACGGGTGAAGCCGGGAGAGATCCGGTGGCCGAGA（配列番号３の５６９位から９５１位）
（実施例１２：製剤例）
上記のように同定したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＴＭ−１株をＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培地ＪＣＭカタログ培地Ｎｏ１９）に接種後、３７℃、１８〜２４時間静醐養を行なった。培養終了後、７，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行い培養液の１／１００量の濃縮菌体を得た。次いで、各々の濃縮菌体にグルタミン酸ソーダ５％（重量）、可溶性澱粉５％（重量）、ショ糖５％（重量）および硫酸マグネシウム７水和物１％（重量）を含む分散媒と同量混合し、ｐＨ７．０に修正後、−４０℃以下で凍結してから凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥菌末を６０メッシュの締で粉末化して菌株の乾燥菌末を調製する。この乾燥菌末２ｍｇ（菌数、５×１０８相当）と乳糖（日局）６１ｍｇ、澱粉（日局）１１６，２ｍｇ、結合剤としてポリビニルピロリドンＫ２５（日局）２０ｍｇ、滑沢剤としてステアリン酸マグネシウム（日局）０．８ｍｇを加えて均一に混合し、打鍵機で圧縮成型し１錠当たり２００ｍｇの素錠を作り、さらに、ヒドロキシプロピルセルロースを用いてフィルムコーティングを施して白色のフィルムコーティングされた錠剤を製造する。
【０１４８】
このような錠剤は、健康食品または医薬として投与することができる。
【０１４９】
（実施例１３： エコール製剤の調製）
ソヤフラボンＨＧ（不二製油製、大豆エタノール抽出物、インフラボン含量約４０％）を２５％となるように反応液（ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ一システイン一塩酸０・５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、ブチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行った反応液）に添加する。この反応液９ｍｌに、約１０９／ｍｌ Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０を添加して、３７℃、２４時間静置培養を行い、エコールを生成させた．これを凍結乾燥して粉末とする。このエコール含有粉末は、エコール製剤および他の食品と混合することで、エコール含有食品に用いることができる。
【０１５０】
（実施例１４：別の菌株の同定）
上記実施例と同様の方法で、ダイゼインを資化して１．６％以上エコールを生産する新たに別の菌株を取得する。同定される菌株について、Ｓｌａｃｋｉａに属する菌を同定することができる。このような菌は、ダイゼイン資化能を有するにＳｌａｃｋｉａ属する菌として特定することができる。
【０１５１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明は、健康食品、食品、医薬などの産業において製造および利用することができる。従って、種々の分野において、本発明は、利用可能性を有する．
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号１：ユニバーサルプライマー２７ｆ ５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
配列番号２：ユニバーサルプライマー１４９２ｒ ５’−ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’
配列番号３：Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列（１４０２ｂｐ）：
ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＡＡＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＡＣＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＧＴＣＧＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡ
配列番号４：Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマー：Ｆｏｒｗａｒｄ ＳＬＣｆ ５’ＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧ３’
配列番号５：Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマー：Ｒｅｖｅｒｓｅ ＳＬＣｒ ５’ＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＴ３’
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌と菌種特異的プライマーもしくは、ヒトの腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を向上させる腸内細菌およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１（国際公開ＷＯ９９／０７３９２号）にはダイゼインを資化してエコールを
生産する微生物であるＢａｃｔｅｉｒｏｉｄｅｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−６４３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−６４３６およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＦＥＲＭ ＢＰ−６４３７を必須成分として含有するダイゼイン含有物が記載されている。
【０００３】
しかし、これらの微生物は、いずれもプロバイオテイクスとしての使用例の少ない菌種である。プロバイオテイクスとは、消化管内の細菌叢を改善し、宿主に有益な作用をもたらしうる有用な微生物と、それらの増殖促進物質に関する能力をいい、最近注目されている能力である。これまでのところ、プロバイオテイクスとして使用されているのは、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓなどしかない。
【０００４】
大豆食品の心臓血管疾患予防効果［非特許文献１＝Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２８巻、１５８９−１５９２頁（１９９８）］、乳癌、前立腺癌などの特定の癌の予防効果［非特許文献２＝Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ、２１、１１３−１３１（１９９４）］が示唆されている。イソフラボンは、大豆に含まれる機能性成分であり、ダイゼインはイソフラボンの主要な成分の一つである。このダイゼインは、腸内細菌の作用によって抗酸化性およびエストロゲン作用の強いエコールに資化され得ることが報告されている［非特許文献３＝Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４１巻，６３１−６３６頁（２００３）］。しかし、従来、このような特定の腸内細菌を単離してくる方法は報告されていない。
【０００５】
ところが、最近、ボランティア試験において、イソフラボンを含有する大豆食品を摂取した人の血漿コレステロールおよび血漿トリグリセリド低下効果が顕著であったのは、エコール生産能が高い人であったということが報告されている［非特許文献４＝Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ，４８巻、６７−７８頁（２００４）］。また、乳癌リスクの低さと尿中へのエコール排泄量の高さとの間に相関があるという報告［非特許文献５＝Ｌａｎｃｅｔ，３５０巻、９９０−９９４頁（１９９７）］や、男性の前立腺癌は、エコール生産能が高い人では少ないことが報告されていて［非特許文献６＝Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２巻、２９６−３００頁（２００２）］、イソフラボンの心疾患予防効果や乳癌、前立腺癌予防には、エコールが重要な役割を担っていることが推察されている。
【０００６】
非特許文献７［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６７巻，３１０４−３１１３頁（２００２）］および非特許文献８［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６８巻，６２３−６３１頁（２００２）］には、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いてイソフラボン類を生物変換する方法が記載されている。しかし、この文献で開示された細菌は、ヒトの糞便に添加した場合のエコール生産におよぼす効果については報告されておらず、エコール生産能向上効果については、全く言及しておらず、エコール生産能向上効果については、ないといえる。また同定した微生物のプロバイオテイクスとしての利用については何ら言及されていない。
【０００７】
本発明者は、非特許文献９〜１１［Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．２２巻、７０５−５１３頁（２００２）；Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．４８巻，２２５−２２９頁（２００２）；Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ Ｈｅａｌｔｈ．Ｄｉｓ １６巻、１８−２２頁（２００４）］において、エコールが動物の健康状態に与える影響を試験し、実際にエコール生産能を高めることによって、健康状態が改善したことを報告している。しかし、ヒト由来の腸内細菌であって、実際にヒトの腸内細菌叢におけるダイゼインからエコールヘの資化能力を向上作用を有するものは全く報告されていない。そのような腸内細菌は、エコール生産能向上効果を有する微生物として有用であるので、当該分野において必要性が未だに存在する。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９９／０７３９２号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２８巻、１５８９−１５９２頁（１９９８）
【非特許文献２】Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ、２１、１１３−１３１（１９９４）
【非特許文献３】Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４１巻，６３１−６３６頁（２００３）
【非特許文献４】Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ，４８巻、６７−７８頁（２００４）
【非特許文献５】Ｌａｎｃｅｔ，３５０巻、９９０−９９４頁（１９９７）
【非特許文献６】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２巻、２９６−３００頁（２００２）
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６７巻，３１０４−３１１３頁（２００２）
【非特許文献８】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６８巻，６２３−６３１頁（２００２）
【非特許文献９】Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．２２巻、７０５−５１３頁（２００２）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．４８巻，２２５−２２９頁（２００２）
【非特許文献１１】Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ Ｈｅａｌｔｈ．Ｄｉｓ １６巻、１８−２２頁（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腸内細菌叢と共存下でダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する腸内細菌および腸内細菌叢全体のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を効果的に向上させる能力を有する腸内細菌は、これまで全く見出されていない。従って、本発明は、腸内でダイゼインを資化してエコールを生産するもしくは腸内細菌叢全体のエコール生産を向上させる能力を有する腸内細菌を提供することを課題とする。
【０００９】
エコールは、たとえ大豆製品を摂取したとしても、４０％〜６０％の人では非常に生産
能力が低いことが様々な報告から明らかにされている。エコール生産能の低い人について、よりエコール生産能を高めることは、イソフラボン類が関与すると期待されている生活習慣病予防効果をより効果的に発揮させるためには、非常に重要である。
【００１０】
食品によってエコール生産能の非常に低い人のエコール生産能が高くするという方法も考えられるが、エコール生産能の非常に低い人をエコール生産能が高くする食品成分については、現在のところ見出されておらず、長期間の大豆製品を摂取した人でも、エコール生産能が変わらないといった報告があり［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．，８０巻，６９２−６９９頁（２００３）］、通常の食品の摂取だけでエコール生産能を高めることは困難であるのが現状である。
【００１１】
エコール生産能の低い人をよりエコール生産能の高い人に変えるためには、プロバイオテイクスとしてダイゼインまたはその誘導体（例えば、ダイジンなどの配糖体）を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する菌を摂取し、腸内細菌叢のエコール生産能がこの摂取菌の作用によって高めるといった方法が考えられ、ビフィドバクテリウム菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を初めとするエコール資化能を有する腸内細菌の検
索が行なわれている。
【００１２】
ところが、実際に、糞便の細菌叢に添加するだけで、ダイゼインを資化してエコールを生産能を向上させるダイゼイン資化能を有する腸内細菌および糞便細菌叢に添加するだけで、ダイゼインを資化してエコール生産能を向上させるがそれ自体はダイゼイン資化能を有さない腸内細菌は、これまで見出されていない。従って、本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌とこの菌を検出するための特異的プライマーおよびダイゼインを資化してエコールを生産する生産性を向上させる腸内細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、多くの腸内細菌について、ダイゼインまたはその誘導体を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を調べた結果、ＥＧ培地を用いることにより、効率よく、ダイゼイン資化能を有する細菌を同定することができた。そして、この菌は、実際に、腸内細菌叢のエコール生産能力を顕著に向上させた。また、この菌の菌種特異的プライマーを設計できた。さらに、ダイゼイン資化能を有さないが、腸内細菌叢のエコール生産能力を顕著に向上させる腸内細菌を見出したことによって、上記課題を解決した。
【００１４】
この新規同定方法を用いて、本発明者らは、従来にはなかったエコール生産可能なＳｌａｃｋｉａ属菌（例えば、Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０；独立行政法人産業技術総合研究所１７年１２月２日に寄託、受領番号ＡＰ−２０７２９号ヒトの腸内細菌叢のエコール生産能を向上エコール生産可能なＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＴＭｌ株；独立行政法人産業技術総合研究所１６年１２月１６日に寄託、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５）と理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＪＣＭ １２７３が存在することを見いだした。
【００１５】
本発明の代表的なＳｌａｃｋｉａ属菌とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓは、本発明者が、本発明において新規に開示した方法により、例えば、健康人の糞便より単離したものである。従って、本発明は、この新規細菌取得方法をも包含する。
【００１６】
本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する、ヒトの腸内細菌（特に、Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０）、腸内細菌叢全体のダイゼインを資化してエコールを生産をする能力を効果的に向上させる能力を有する腸内細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）およびエコール生産能を向上させるための、この腸内細菌を含む組成物、およびダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有するヒトの腸内細菌の分子生物学的手法を用いた迅速検出・定量測定方法を提供する。エコール生産能を向上させるための方法であって、本発明の腸内細菌または組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する方法もまた提供される。
（１）ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌と菌種特異的プライマーもしくは、ヒトの腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を向上させる腸内細菌。
（２）上記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する、項目１に記載の腸内細菌。
（３）上記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、項目１に記載の腸内細菌。
（４）上記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ種またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種に属する、項目３に記載の腸内細菌。
（５）上記腸内細菌の菌種特異的プライマーであって、配列番号３に示す配列の一部で選択的に検出可能であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（６）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能が１．０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（７）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能１０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（８）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能２０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（９）上記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能３０％以上であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１０）上記腸内細菌は、エコール非生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性付与効果を有することを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１１）上記腸内細菌は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対して２倍以上のエコール生産性向上効果を有することを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１２）上記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属である、項目７または８に記載の腸内細菌。
（１３）上記腸内細菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７２９号（受領日平成１７年１２月２日）のＳｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５号（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５号）（受領日平成１６年１２月１６日）として寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株、もしくは理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＪＣＭ １２７３である項目１に記載の腸内細菌。
（１４）プロバイオテイクスとして使用可能な細菌であることを特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１５）デンプンまたはグリコーゲンを資化する能力を有することをさらに特徴とする、項目１に記載の腸内細菌。
（１６）項目１に記載の腸内細菌の組み合わせであって、上記組み合わせに含まれる上記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する細菌と、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌とを含む、組み合わせ。
（１７）上記組み合わせは、Ｓｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株との組み合わせを含む、項目１６に記載の組み合わせ。
（１８）エコール生産能を向上させるための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせを含む組成物。
（１９）食品または医薬である、項目１８に記載の組成物。
（２０）さらに他の有効成分を含む、項目１８に記載の組成物。
（２１）上記腸内細菌は、液体中に溶解して提供される、項目１８に記載の組成物。
（２２）上記腸内細菌は、固形状で提供される、項目１８に記載の組成物。
（２３）上記腸内細菌は、凍結乾燥されて提供される、項目１８に記載の組成物。
（２４）上記腸内細菌を胃液から保護する成分をさらに含む、項目１８に記載の組成物
（２５）エコール生産能を向上させるための方法であって、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせまたは項目１８〜２４のいずれか１項に記載の組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する、方法。
（２６）ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有するもしくはエコール生産能を向上させるための細菌を生産する方法であって、上記細菌を含むことが予想されるサンプルを、ＥＧ培地を用いて培養する工程を包含する、方法。
（２７）ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌もしくはエコール生産能を向上させるヒトの腸内細菌を生産する方法であって、
Ａ）ヒトの腸由来物質または糞便を含むサンプルを提供する工程；
Ｂ）上記サンプルを、ＥＧ培地を用いて、３７℃で培養する工程；
Ｃ）ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン塩酸０．５ｇ、炭酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、上記サンプル中で菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションする工程；
Ｄ）反応液中のイソフラボン類の分析を行う工程；および
Ｅ）ダイゼインまたはその誘導体を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌を選択し、生産する工程を包含する方法。
（２８）上記サンプルは、健康人の糞便に由来するサンプルである、項目２７に記載の方法。
（２９）項目２７〜２９に記載の方法により調製される細菌。
（３０）エコールを含むもしくはエコール生産性を向上させる医薬を製造するための方法であって、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を上記腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する、方法。
（３１）項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を上記腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する方法によって生産された、組成物。
（３２）項目３０に記載の方法によって得られる細菌。
（３３）エコールを含む医薬を製造するための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、項目３０に記載の方法によって得られる細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
（３４）エコール生産能を向上させるための医薬を生産するための、項目１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、項目３０に記載の方法によって得られる細菌または項目１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
【００１７】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する細菌を同定する方法を初めて提供することによって、そのような細菌と腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産性向上能を有する細菌の同定および生産することを初めて可能にした。本発明を利用して同定することができたダイゼインを資化してエコールを生産する本究明のＳｌａｃｋｉａ属菌もしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌は、糞便腸内細菌叢に添加するとエコール生成能を顕著に向上させることが確認された。本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌は、イソフラボン含有食品と同時もしくは個別に経口的に摂取することで、腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を短期間で向上させることができる。また、ダイゼインを資化してエコールを生産する本究明のＳｌａｃｋｉａ属菌の菌種特異的プライマーを用いることで、分子生物学的手法によるエコール生産能を有する腸内細菌の高速検出を可能とし、エコール生産性腸内細菌の検出方法に画期的な手法を提供することとなる。
【００１９】
従って、本発明は、プロバイオテイクスまたは健康食品、医薬などとして有用な腸内細菌を提供する。およびエコール生産菌の新規検出方法を提供本発明は、女性の乳癌、男性の前立腺癌などの予防医学において効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２１】
本明細書において、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）とは、４’，７−ジヒドロキシー３−ジデヒドロイソフラバン−４−オン（４’，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｉｓｏｆｌａｖａｎ−４−ｏｎｅ）という一般名で表され、以下の構造
【００２２】
【化１】
【００２３】
という構造を有するイソフラボンである。
【００２４】
本明細書においてダイゼインの誘導体とは、加水分解などによってダイゼインに変換され得る化合物をいう。そのような誘導体としては、例えば、配糖体を挙げることができ、代表的には、ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジンなどを挙げることができる
本明細書において、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎ）とは、７−（β−Ｄ−グルコピラノシ
ルオキシ）−４’−ヒドロキシ−２，３−ジデヒドロイソフラバンー４−オン（７−（β
−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ）−４’−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｉｓｏｆｌａｖａｎ−４−Ｏｎｅ）という一般名で表され、以下の構造
【００２５】
【化２】
【００２６】
を有する。
【００２７】
本明細書において、エコール（ｅｑｕｏｌ）とは、一般名７−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）クロマンで表され、以下の構造
【００２８】
【化３】
【００２９】
という構造を有する化合物である。エコールは、抗酸化性およびエストロゲン作用の強いイソフラボンとして知られている。
【００３０】
本明細書において、「ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能」とは、ダイゼインまたはその誘導体（例えば、ダイジンのような配糖体）に曝されたとき、エコールを生産する細胞の能力をいう。
【００３１】
本明細書において、このような細菌のダイゼイン資化能は、以下のようにエコール濃度を測定することによって判定されその値は、ダイゼイン資化能値とも称される。
【００３２】
〈Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのダイゼイン資化能測定法〉
ＥＧ培地を用い、３７℃で４８時間、Ｓｌａｃｋｉａ属菌を培養する。反応液０．２ｍｌで、Ｓｌａｃｋｉａ属菌を菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。
【００３３】
本明細書において用いられるＥＧ培地は、以下のようにして調製される。
【００３４】
組成：馬肉浸出液 ９３０ｍＬ
Ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｎｏ ３ （Ｄｉｆｃｏ） １０ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （Ｄｉｆｃｏ） ５ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４ ４ｇ
グルコース １．５ｇ
Ｌ−シスチン（予め少量の０．１Ｎ ＨＣｌで溶解して添加） ０．２ｇ
消泡剤（トーレシリコン１０％溶液） ５ｍＬ
Ｌ−システイン・ＨＣＬ・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
馬血液 ５０ｍＬ
ｐＨ ７．６〜７．８。
【００３５】
製造方法：Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液以外の成分を加熱して溶解し、ｐＨを修正、１１５℃、２０分滅菌後５０℃に冷やし、Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。なお、馬肉浸出液は、培地１０００ｍｌに対し５００ｇの馬肉からの浸出液を用いる。
本明細書において使用されるダイゼイン資化能測定法において用いられる反応性は、以下のようにして作製される：ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−シ
ステインー塩酸０．５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素
フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行う。
【００３６】
本明細書のダイゼインを資化してエコールを生産する能力の測定試験における反応の終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：
５）を加えて６０秒間激しくボルテックスする。ついで、遠心分離し得られた上澄をフィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行う。
【００３７】
本発明のヒトの腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属菌、もしくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。Ｓｌａｃｋｉａ属菌は、ヒトの腸内の常在菌の一種であり、以前は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に分類されていた。また、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌は、アクチノミセス科（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）の細菌の一属であり、分枝した、二分叉の棍棒状またはへら状の桿菌をいう。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌は、母乳で養育される乳児の腸内菌叢の主要な構成菌で、これらの菌が消化管内で糖を分解して産生する乳酸や酢酸が消化に役立つとされる。
【００３８】
本発明のヒトの腸内細菌の一方は、ＢＬ培地のコロニー形態からビフィスズ菌である可能性が考えられた。本明細書において使用される「Ｂｉｆｉｄｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ」は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌種であり、ここで使用される性質は、光岡らの糖発酵試験法（腸内菌の世界一嫌気性菌の分離と同定：叢文社、１９８４）に記載される方法に準じて行う。他方のＳｌａｃｋｉａ属菌は、コロニー形態や顕微鏡観察からは、菌の同定となる手がかりが見出せなかったため、自動細菌同定検査装置を用いたラピッドＩＤ３２ Ａアピ（日本ビオメリュー株式会社製）と篠田らの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法［非特許文献１２＝島津評論，５７巻，１２１−１３２頁（２０００）］を採用して同定を行なった。具体的には、以下の通りである。
【００３９】
ＰＹＦ培地（ペプトンーイーストエクストラクトーフィールズ（Ｐｅｐｔｏｎｅ−Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔ ｒａｃｔ−Ｆｉｅｌｄ溶液ブロス；トリプティケース（ＢＢＬ）１０ｇ；イーストエクストラクト（Ｄｉｆｃｏ）５．Ｏｇ；フィールズ溶液（消化血液）４０ｍｌ ；塩溶液４０ｍｌ；Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ；精製水９２０ｍｌ、ｐＨ７．２に調整）に、各種試験用の糖類（例えば、Ｌ−アラビノース；Ｄ−キシロース；Ｄ−グルコース；Ｄ−マンノース；Ｄ一フラクトース；Ｄ−ガラクトース；マルトース；シュークロース；ラクトース；トレハロース；Ｄ−ソルビトール；Ｄ−マンニトール；イノシトール；グリセリン；デンプンなど）を添加して、滅菌し、糖資化性状検査用培地とする．分離株をＢＬＢ培地（Ｂｒｉｇｇｓ Ｌｉｖｅｒ Ｂｒｏｔｈ；トマトジュース溶液（トマトジュース（Ｄｅｌ Ｍｏｎｔｅ）を等量の水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨを７・０に調整し、濾紙で濾過する）４００．０ｍｌ；Ｎｅｏｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ）１５．Ｏｇ；Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）６．０ｇ；肝臓抽出物（Ｌｉｖｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ）（１０ｇの肝臓粉末を１７０ｍｌの水に入れ、５０℃〜６０℃で１時間維持し、５分間煮沸して、ｐＨを７．２に調整し、濾過することによって調製する）７５．０ｍｌ；グルコース２０．０ｇ；可溶性デンプン０・５ｇ；ＮａＣ１ ５．０ｇ；Ｔｗｅｅｎ ８０ １．０ｇ；Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ ０・２ｇ；蒸留水 ５２５．０ｍｌ、ＰＨは６．８に調整する）で３７℃、４８時間嫌気的に培養を行った後、一白金耳をこのＢＬＢ培地に接種して再び３７℃で２４時間培養し、その０・３ｍｌを遠心分離管に９ｍｌずつ分注したＢＬＢ培地に摂取し、再び３７℃２４時間培養する。次いで、菌体を遠心分離し、上清を捨て、０．１％Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと０．１％チオグリコール酸ナトリウムを含む滅菌食塩水で原培養液の２倍の濃度に再浮遊した物を接種溶液とする。この菌液を上記糖資化性状検査用培地に添加して、嫌気培養装置にて、一週間培養を行い、培地のｐＨの変動から糖の資化性を決定する。
【００４０】
ここで、特に、本発明のビフィスズ菌属の腸内細菌は、好ましくは、以下の条件：
Ａ）好気条件での発育：−
Ｂ）カタラーゼ：−
Ｃ）ゼラチン液化性：−
Ｄ）インドール産生：−
Ｅ）硝酸還元性：−
このほかに、本発明の好ましい腸内細菌は、以下の菌学的性質を有する。
【００４１】
以下の温度で良好に生育する：３７℃〜４３℃
以下のｐＨで良好に生育する：７．２〜７．５
好気性嫌気性の別：嫌気性
グラム陽性・陰性：グラム陽性菌
ウレアーゼ −
糖類から酸及びガスの生成の有無
エスクリン ＋
グリセリン −
Ｄ−キシロース ＋
Ｄ−マンノース ＋
マンニトール ＋。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法により単離される腸内細菌は、以下の糖について以下に示す酸及びガスの生成：
Ａ）Ｌ一アラビノース（＋）
Ｂ）エリスリトール（−）
Ｃ）セロビオース（＋）
Ｄ）Ｄ−ラフィノース（＋）
Ｅ）Ｄ−フルクトース（＋）
Ｆ）ガラクトース（＋）
を生理学的性質として有し得る。
このような性質は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ種が有し得るがこれに限定されない。
本発明のビフィズス細菌は、ヒトの腸内細菌叢のダイゼイン資化能を通常少なくとも３８％以上向上させる能力を有し、エコール生産菌に対しては、共存させた場合に、ダイゼイン資化能を少なくとも５００％以上向上させる能力を有する。従来の細菌で、５００％以上ものダイゼイン資化能を向上させる細菌は見つかっておらず、本発明の方法により初めて同定することができた細菌であるといえる。
本明細書において、本発明に係る腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力の向上に寄与するビフィドバクテリウム菌は、幼児、成人等の糞便から分離した多数のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌株の中から分離された。この菌株の代表例は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５号（受領日平成１６年１２月１６日；受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５号）として寄託済みである。
【００４３】
分離したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の同定は、光岡らの糖発酵試験法（腸内菌の世界−嫌気性菌の分離と同定 叢文社）に準拠して行なった。
【００４４】
最も好ましい実施形態において、本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１菌株は次のような菌学的性質を有し、それによりＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓに属する菌株であると同定された：グラム陽性無芽胞桿菌。顕微鏡観察では棍棒状の桿菌で分岐したものも認められる。好気条件での発育（−）、カタラーゼ（−）、ゼラチン液化性（−）、硫化水素産生（−）、インドール産生（−）、硝酸還元性（−）。ＢＬ寒天平板上ではＥＧ寒天平板上の集落よりもはるかに大型で、菌体の一部が膨らみ、湾曲し、一端が細くなったものが多く、分岐したものもみられる。ＢＳ寒天培地での生育は良好である。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１菌株は、代表的には、次のような糖発酵性を有する。
【００４６】
Ｌ−アラビノース（＋）、Ｄ−キシロース（＋）、Ｄ−フルクトース（＋）、ガラクト
ース（＋）、マルトース（＋）、セロビオース（＋）、ラクトース（＋）、Ｄ−ラフイノース（＋）、グルコース（＋）、エリスリトール（−）、メリビオース（＋）、トレハロース（−）、マンニトール（＋）、ソルビトール（−）、マンノース（＋）、ラムノース（−）。
【００４７】
分離したＳｌａｃｋｉａ属菌の同定は、自動細菌同定検査装置を用いたラピッドＩＤ３２ Ａアピ（日本ビオメリュー株式会社製）及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法に準拠して行なった。また、グルコース発酵性試験、胆汁耐性試験についても検討を行った。
【００４８】
本発明のヒトの腸内細菌の他方のＳｌａｃｋｉａ属菌は、グラム陽性桿菌であり、好気条件下では生育しないいわゆる嫌気性菌である。ＥＧおよびＢＬ培地では、乳白色の微小コロニーを形成する。コロニー形状は、ドーム状に隆起し、ＢＬ培地で生育した本菌の顕微鏡観察では、短桿菌から長桿菌が混在し、いわゆるビフィズス菌等でしばしば観察される多形性を示す。グルコースをわずかに発酵し、１０％及び２０％胆汁酸共存下では、生育しない。
【００４９】
本発明のＳｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株は、以下の生化学的性質を有する（＋：陽性，−：陰性）ウレアーゼ（−）、アルギニンジヒドラーゼ（＋）、α−ガラクトシダーゼ（−）、β−ガラクトシダーゼ（−）、β−ガラクトシダーゼ−６−フォスフェート（−）、α−グルコシダーゼ（−）、β−グルコシダーゼ（−）、α−アラビノシダーゼ（−）、β−グルクロニダーゼ（−）、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（−）、Ｄ（＋）マンノース発酵（−）、ラフィノース発酵（−）、硝酸塩の還元（−）、インドール産生（−）、アルカリフォスファターゼ（−）、アルギニンアリルアミダーゼ（＋）、プロリンアリルアミダーゼ（−）、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ（−）、フェニルアラニンアリルアミダーゼ（−）、ロイシンアリルアミダーゼ（−）、ピログルタミン酸アリルアミダーゼ（−）、チロシンアリルアミダーゼ（−）、アラニンアリルアミダーゼ（−）、グリシンアリルアミダーゼ（−）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（＋）、α−フッコシダーゼ（−）、ヒスチジンアリルアミダーゼ（−）、グルタミルグルタミン酸アリルアミダーゼ（−）、セリンアリルアミダーゼ（−）。
【００５０】
Ｓｌａｃｋｉａ属菌を同定するのに用いた篠田らの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法では、細菌のゲノムをインスタジーンマトリクス（日本バイオラッド）で抽出し、２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１））と１４９２ｒ （５’−ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号２）のユニバーサルプライマー組み合わせでＰＣＲを行い、１６ＳｒＤＮＡの増幅を行った。さらに、１６ＳｒＤＮＡをキアゲンのスピンカラムで精製し、六種類のシーケンスプライマーとＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＶｅｒ１．１を用いてＰＣＲを行い、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ３１０で、遺伝子解析し、Ｓｌａｃｋｉａ属菌の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を決定した。
【００５１】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
【００５２】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５３】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
【００５４】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００５５】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
【００５６】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００５８】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５９】
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。 本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００６１】
本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００６２】
本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチドにおける任意の因子には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【００６３】
本明細書においてポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。
【００６４】
本発明の Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列（１４０２ｂｐ）を示す。
【００６５】
Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列（１４０２ｂｐ）：
ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＡＡＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＡＣＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＧＴＣＧＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡ（配列番号３）。
【００６６】
上記塩基配列をＤＤＢＪの核酸データベースでｂｌａｓｔｎを利用して相同性の高い菌を検索したところ、本発明の菌株は、Ｓｌａｃｋｉａ ｅｘｉｇｕａ （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ：ＡＦ１０１２４０）の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の１３６５個のうち１２６９が一致した（９２％）。よって本菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属すると考えられる。 Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株は、以下のようなＩｎ ｖｉｔｒｏでのダイゼイン資化能を有する。
【００６７】
【表１】
【００６８】
ここで、反応前から反応後に減少したダイゼイン濃度に対する反応２４時間後エコール濃度の割合をダイゼイン資化能として計算すると、本発明の一つの代表的な菌株は、１．６％以上のダイゼイン資化能を有するといえる。
【００６９】
本明細書において「ダイゼイン資化能」は、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションし、反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸との混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスにより攪拌し、遠心分離して得られた上澄をフィルターで濾過し、濾液を電気化学的検出器搭載のＨＰＬＣ（日本分光などから入手可能）で分析してイソフラボン類の分析を行って、エコール生産性の有無を確認し、エコールが生産（すなわち、ダイゼインが資化）されていることを確認することによって確認することができる。
【００７０】
本明細書において「ヒトフローラマウス」とは、ヒトフローラを腸内に移植したマウスを言う。ヒトのフローラに関する実験モデルとして使用される。
【００７１】
本明細書において、「エコール非生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性付与効果」とは、エコールを通常生産しないヒトフローラマウスに投与すると、エコールを生産する能力を付与する能力をいう。具体的には、本明細書において実施例３において例示されている。
【００７２】
本明細書において、「エコール生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性向上効果」とは、エコールを通常生産するヒトフローラマウスに投与すると、そのエコール生産脳が増強される能力を言う。具体的には、本明細書実施例４などに例示されている。
【００７３】
（有用組成物）
別の局面において、本発明は、エコール生産能を向上させるための、本発明の腸内細菌を含む組成物を提供する。このような組成物は、食品、飼料、健康食品、特定医療用保険食品、医薬部外品、医薬品などとして利用することができる。特に、本発明は、ヒトの腸内細菌であることから、ヒトのプロバイオテイクスとして利用することができる。
本発明の組成物には、好ましくは、さらなる有効成分を含めることができる。そのような有効成分としては、例えば、大豆オリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖などのビフイズス菌増殖促進物質などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００７４】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
【００７５】
本発明の腸内細菌または組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。腸内細菌を投与する場合は、腸に送達し得る形態であることが好ましい。
【００７６】
好ましくは、製剤化する場合は、本発明の腸内細菌の凍結乾燥菌末に、必要に応じてデンプン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの賦形剤も混合して成形する。
【００７７】
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
【００７８】
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７９】
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルポキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。
【００８０】
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルポキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８１】
固形製剤における崩壊阻害剤の好ましい例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８２】
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８３】
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ペントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８４】
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８５】
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８６】
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００８７】
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。
【００８８】
液状製剤における溶剤の好ましい例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
【００８９】
液状製剤における溶解補助剤の好ましい例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９０】
液状製剤における懸濁化剤の好ましい例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ペンザルコニウム、塩化ペンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における等張化剤の好ましい例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−
マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエ
ン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における無痛化剤の好ましい例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザル
コニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９１】
液状製剤における防腐剤の好ましい例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９２】
液状製剤における抗酸化剤の好ましい例としては、亜硫酸塩、アスコルピン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９３】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
【００９４】
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、
ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【００９５】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤
（日本薬局方第１４版、その追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ・Ｒ・Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ・１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【００９６】
細胞を凍結乾燥する方法もまた、公知である。そのような方法としては、例えば、ジメチルホルムアミドなどに細胞を入れて凍結乾燥機でアンプルが真空状態になるよう処理した後、４〜２５℃で保存する方法等を挙げることができる。このほかにも、液体窒素法：１０％グリセロール加保存培地に濃厚菌を懸濁し、これを専用アンプルに収め、液体窒素タンク（−１５０〜−１９６℃）で保管することができる。
【００９７】
本発明の組成物の投与すべき量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日一数ケ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ケ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ケ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００９８】
本明細書において「患者」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「被検体」または「被験体」ともいわれる。患者は好ましくは、ヒトであり得る。
【００９９】
本発明は、患者への有効量の本発明の組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、本発明の組成物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。
【０１００】
本発明はまた、エコールを含む医薬を製造するための方法であって、本発明の腸内細菌と、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を該腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する、方法を提供する。
【０１０１】
ここで、本発明のＳｌａｃｋｉａ属腸内細菌は、ダイゼインをエコールに資化する能力を有することから、エコールを含む医薬を効率よく製造することが可能である。混合された混合物は、使用される腸内細菌が、ダイゼインをエコールに資化させる任意の条件下でインキュベートすることができることが理解される。
【０１０２】
本明細書において、ダイゼインをエコールに資化させる条件は、当業者が当該分野において公知の方法を用いて適宜決定することができる。そのような条件としては、例えば、ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン−塩酸０．５ｇ、炭
酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込
みながら試験管に分注し、ブチルゴム栓をして、オートクレープ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、該サンプル中でＳｌａｃｋｉａ属菌の菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションすることを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１０３】
生成したエコールは必要に応じて精製または分離することができる。そのような精製および分離の方法は、クロマトグラフィー、バッチ、ＨＰＬＣ、抽出など当該分野において
公知の任意の方法を用いて実施することができる。
【０１０４】
従って、本発明はまた、本発明の腸内細菌とダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を本発明の腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する方法によって生産された、組成物を提供する。このような組成物は、エコールなどのエストロゲン様効果を有するかまたは強いイソフラボンに富むことから、抗癌（乳癌、前立腺癌予防）作用、心疾患予防効果などを期待して投与するために用いられ得る。
【０１０５】
本発明はまた、別の局面において、エコール生産能を向上させるための方法を提供する。エコール生産能とは、ヒトなどの動物において用いられるとき、腸内でダイゼインをエコールに変換できる能力をいう。エコール生産能が高いと、イソフラボンの血漿コレステロールおよび血漿トリグリセリド低下効果が顕著であり、抗癌作用なども期待されることから、エコール生産能を上げることは、健康の品質を改善する役割を果たす。
【０１０６】
この方法は、本発明の腸内細菌または本発明の組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する。そのような投与は、当該分野において公知の方法を利用して実施することができる。
【０１０７】
本明細書中、「投与する」とは、本発明の医薬などまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて処置が意図される宿主に与えることを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の粘膜を通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０１０８】
（本発明の腸内細菌生産法）
別の局面において、本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、細菌および腸内細菌叢のエコール生産能向上作用を有する細菌を生産する方法であって、該細菌を含むことが予想されるサンプルを、ＥＧ培地を用いて培養する工程を包含する、方法を提供する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明は、ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する、ヒトの腸内細菌を生産する方法であって、Ａ）ヒトの腸由来物質または糞便を含むサンプルを提供する工程；Ｂ）該サンプルを、ＥＧ培地を用いて、３７℃で培養する工程；Ｃ）ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン−塩酸 ０．５ｇ、炭酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレープ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、該サンプル中で菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションする工程；Ｄ）反応液中のイソフラボン類の分析を行う工程；およびＥ）ダイゼインを資化してエコールを生産する能力を有する腸内細菌を選択し、生産する工程を包含する方法を提供する。
【０１１０】
理論に束縛されることを望まないが、本発明のような細菌がこれまで同定できなかったのは、嫌気性徴生物の培地は、多くの種類があり、ＥＧ培地は市販されておらず、自ら調製して作製する必要があることから、ＥＧ培地ではなく他の市販の培地を用いてダイゼイン資化能を有する菌を探索することが通常であったからであると考えられる。微生物の代謝活性は、培地によって大きく変動する場合がある。本発明において、ダイゼイン資化菌の同定を可能にしたのは、ダイゼイン資化菌を探索および同定する目的としては、これまで世界において全く使用されていなかったＥＧ培地のみを用いて、しかも、好ましい実施形態においては、嫌気性反応液も、嫌気度の高い反応液を組み合わせるという一連の新規な工夫を行ったからであると考えられる。
【０１１１】
本発明は、好ましくは、上記方法において、サンプルとして健康人糞便由来のものを利用することが好ましい。特に、エコール生産能の高い健康人の糞便を使用することがより好ましい。
【０１１２】
（使用）
本発明は、エコールを含む医薬を製造するためまたはエコール生産能を向上させるための医薬を生産するために、本発明の腸内細菌を使用することを企図する。このような腸内細菌は、上記（腸内細菌）に関する説明において記載される任意の形態を採用することができることが理解される。
【０１１３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１５】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない０以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ・Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＵＳＡ）などから市販されるものを用いた。
（実施例１：ダイゼイン資化能を有する腸内細菌およびダイゼイン資化能を向上させる腸内細菌の分離）
本実施例では、ＥＧ培地を用いて、細菌を分離した。ＥＧ培地は以下のようにして調製
した。
本明細書において用いられるＥＧ培地は、以下のようにして調製される。
【０１１６】
組成：馬肉浸出液 ９３０ｍＬ
Ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｎｏ ３ （Ｄｉｆｃｏ） １０ｇ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （Ｄｉｆｃｏ） ５ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４ ４ｇ
グルコース １．５ｇ
Ｌ−シスチン（予め少量の０．１Ｎ ＨＣｌで溶解して添加） ０．２ｇ
消泡剤（トーレシリコン１０％溶液） ５ｍＬ
Ｌ−システイン・ＨＣＬ・Ｈ２Ｏ ０．５ｇ
馬血液 ５０ｍＬ
ｐＨ７．６〜７．８
製造方法：Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液以外の成分を加熱して溶解し、ｐＨを修正、１１５℃、２０分滅菌後５０℃に冷やし、Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏと馬血液を加え、シャーレに分注して平板とする。なお、馬肉浸出液は、培地１０００ｍｌに対し５００ｇの馬肉からの浸出液を用いる。
【０１１７】
新鮮なヒト糞便を滅菌ホモジナイザーに入れ、嫌気性希釈液で１０倍ずつ段階的に希釈し、それぞれの希釈段階あたり０・０５ｍｌを滅菌ピペットを用いてＥＧ培地に接種し、滅菌コンラージ棒で塗り広げて、３７℃、４８時間で簡易型嫌気性培養装置にて培養を行つた。培養終了後、コロニーを１個ずつ白金耳で拾い上げ、別のＥＧ培地に塗り広げて、再度３７℃、４８時間、簡易型嫌気性培養装置にて培養を行った。培養終了後、１白金耳ずつ２００μｌの嫌気性反応液（ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０・５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行った反応液）に懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行つた。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸との混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスにより攪拌した。次いで、遠心分離して得られた上澄をフィルターで濾過し、濾液を電気化学的検出器搭載のＨＰＬＣ（日本分光などから入手可能）で分析してイソフラボン類の分析を行って、エコール生産性の有無を確認した。次に、増菌するために、エコール生産性の認められる腸内細菌をＥＧ培地に接種し、３７℃、４８時間で簡易型嫌気性培養装置にて培養を行った。培養終了後、コロニーを１個ずつ白金耳で拾い上げ上記の嫌気性反応液２００μｌに懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、予めＥＧ培地で増菌していたエコール生産性が無い腸内細菌を１白金耳接種して、上記と同様の方法で培養、エコールの分析を行って、エコール生産性菌のエコール生産性が向上するかどうかを検討した。
【０１１８】
その結果、エコール生産性が向上したことが確認された。
【０１１９】
（実施例２： 分離した腸内細菌の資化能）
Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０のダイゼインのｉｎ ｖｉｔｒｏでの資化能を下記の方法で調べた。ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌を嫌気性希釈液に懸濁し、懸濁液２００μｌにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、３７℃、２４時間インキュベーションを行った。Ｓｌａｃｋｉａ属菌終濃度（約１０９／ｍｌ）。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスした後、フィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
本発明の代表的な菌株は、１．６％以上のダイゼイン資化能を有すると言える。
【０１２２】
（実施例３： エコール非生産性ヒトフローラマウスに対するＳｌａｃｋｉａ属菌のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
健康なヒトの糞便を嫌気性グローブボックス（窒素：炭酸ガス：水素＝８５：１０：５） 内で嫌気性輸送液を用いてホモジネートし、この糞便希釈液をビニールアイソレータ内で飼育している無菌マウス（ＩＱＩ）ＩＣＲ系成熟雄マウスに経口投与し、ヒトの腸内細菌叢を有するヒトフローラマウスを作製した。このヒトフローラマウスをガンマー線滅菌ＡＩＮ９３Ｍ飼料で１９ヶ月間飼育した後、糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行い、エコール生産能を調べたところ、１匹のマウスでエコール生産能が非常に低いヒトフローラマウスを得た。そこで、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えてさらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液２０μｌを糞便希釈液に加えた。Ｓｌａｃｋｉａ属菌終濃度（１０７／ｍｌ）。反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、菌液２０μｌの代わりに嫌気性希釈液２０μｌ加えたものを用いた。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスした後、フィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
本発明の代表的な菌株は、エコール非生産性ヒトフローラマウスに対するエコール生産能付与効果を有すると言える。
【０１２５】
（実施例４： エコール生産性ヒトフローラマウスに対するＳｌａｃｋｉａ属菌のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
健康なヒトの糞便を嫌気性グローブボックス（窒素：炭酸ガス：水素＝８５：１０：５） 内で嫌気性輸送液を用いてホモジネートし、この糞便希釈液をビニールアイソレータ内で飼育している無菌マウス（ＩＱＩ）ＩＣＲ系成熟雄マウスに経口投与し、ヒトの腸内細菌叢を有するヒトフローラマウスを作製した。このヒトフローラマウスをガンマー線滅菌ＡＩＮ９３Ｍ飼料で１９ヶ月間飼育した後、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行い、エコール生産能を調べたところ２匹のマウスでエコール生産能を有するヒトフローラマウスを得た。そこで、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えてさらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。Ｓｌａｃｋｉａ属菌終濃度（１０７／ｍｌ）。反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
本発明の代表的なＳｌａｃｋｉａ属菌株は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対する２．１倍以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１２８】
（実施例５： エコール生産能を有するＳｌａｃｋｉａ属菌に対するビフィドバクテリウム菌ＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌とビフィドバクテリウムＴＭ−１菌とをそれぞれ白金耳にて別々に嫌気性希釈液に懸濁し、Ｓｌａｃｋｉａ属菌２００μｌに対してビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株１０μｌとダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、ビフィドバクテリウム菌液１０μｌの代わりに嫌気性希釈液１０μｌ加えたものを用いた。反応液のＳｌａｃｋｉａ属菌終濃度は約１０９／ｍｌ、ビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株終濃度約１０６／ｍｌであった。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
本発明のビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、エコール生産能を有する菌に対する五倍以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１３１】
（実施例６： エコール生産能を有するＳｌａｃｋｉａ属菌に対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるダイゼイン配糖体からのエコール生産能向上効果）
ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌とビフィドバクテリウムＴＭ−１菌とをそれぞれ白金耳にて別々に嫌気性希釈液に懸濁し、次のように三種類の反応液を作製してダイゼイン配糖体の資化性を検討した。
【０１３２】
（１）Ｓｌａｃｋｉａ属菌２００μｌに対してビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株１０μｌとダイジン（４０ ｍｇ／ｍｌ）１μｌ添加 （反応液のＳｌａｃｋｉａ属菌終濃度は約１０９／ｍｌ、ビフィドバクテリウム菌終濃度約１０９／ｍｌ）
（２）Ｓｌａｃｋｉａ属菌２００μｌに対してダイジン（４０ ｍｇ／ｍｌ）１μｌ添加（反応液のＳｌａｃｋｉａ属菌終濃度は１．１２×１０９／ｍｌ
（３）ビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株２００μｌに対してダイジン（４０ ｍｇ／ｍｌ）１μｌ添加 （反応液のビフィドバクテリウム菌終濃度は約１０１０／ｍｌ
上記三種類の反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。反応終了後、反応液１に対して４倍量のメタノールと酢酸混合液（メタノール：酢酸＝１００：５）を加えて６０秒間激しくボルテックスした後、フィルターで濾過し、濾液を電気化学検出器搭載のＨＰＬＣで分析して、イソフラボン類の分析を行った。
【０１３３】
【表６】
【０１３４】
本発明の代表的なＳｌａｃｋｉａ属菌は、ダイゼインの配糖体からは、ダイゼインもエコールも生成できないが、本発明のビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、ダイゼインの配糖体からグルコースを加水分解し、ダイゼインを生成することで、Ｓｌａｃｋｉａ属菌のダイゼインの配糖体からのエコール生産に寄与していると言える。
【０１３５】
（実施例７： エコール生産性ヒトフローラマウスに対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
健康なヒトの糞便を嫌気性グローブボックス（窒素：炭酸ガス：水素＝８５：１０：５） 内で嫌気性輸送液を用いてホモジネートし、この糞便希釈液をビニールアイソレータ内で飼育している無菌マウス（ＩＱＩ）ＩＣＲ系成熟雄マウスに経口投与し、ヒトの腸内細菌叢を有するヒトフローラマウスを作製した。このヒトフローラマウスをガンマー線滅菌ＡＩＮ９３Ｍ飼料で１９ヶ月間飼育した後、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行い、エコール生産能を調べたところ２匹のマウスでエコール生産能を有するヒトフローラマウスを得た。そこで、このヒトフローラマウスの糞便を滅菌試験管に採取し、上記希釈液で糞便当たり３５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えてさらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液８μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム菌菌終濃度（約１０８／ｍｌ）。反応は、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションを行った。また対照には、菌液８μｌの代わりに嫌気性希釈液８μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
本発明の代表的なビフィドバクテリウム菌株は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対する３８％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１３８】
（実施例８： エコール生産性ＩＣＲ系マウスに対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
あらかじめエコール生産能があることを確認した二匹のＩＣＲ系雄マウスの糞便を採取し、上記希釈液で糞便当たり２５倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、さらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウム ＴＭ−１菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム菌菌終濃度（約１０８／ｍｌ）。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
本発明の代表的なビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、エコール生産性コンベンショナルマウスに対する２５％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１４１】
（実施例９： エコール生産能を有するヒトに対するビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
エコール生産能をあらかじめ確認した健康な男性成人でしかも、過去二ヶ月以内に抗生物質を摂取したことが無いと確認がとれているヒトの糞便を採取し、上記希釈液で糞便当たり３０倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、さらに、ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウム菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム菌菌終濃度（約１０８／ｍｌ）。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１４２】
【表９】
【０１４３】
本発明の代表的なビフィドバクテリウムＴＭ−１菌株は、エコール生産性のヒトに対する２０％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１４４】
（実施例１０： エコール生産能を有するヒトに対するビフィドバクテリウム ブレーベＪＣＭ１２７３菌株のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるエコール生産能向上効果）
エコール生産能をあらかじめ確認した健康な男性成人でしかも、過去二ヶ月以内に抗生物質を摂取したことが無いと確認がとれているヒトの糞便を採取し、上記希釈液で糞便当たり３０倍に希釈し、この希釈液０．２ｍＬにダイゼイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１μｌ加えて、さらに、ＢＬ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったビフィドバクテリウム ブレーベＪＣＭ１２７３菌を白金耳にて嫌気性希釈液に懸濁し、菌液４μｌを糞便希釈液に加えた。ビフィドバクテリウム ブレーベ菌終濃度（約１０７／ｍｌ）。また対照には、菌液４μｌの代わりに嫌気性希釈液４μｌ加えたものを用いた。反応終了後、上記と同様の方法で、イソフラボン類の分析を行った。
【０１４５】
【表１０】
【０１４６】
ビフィドバクテリウム ブレーベＪＣＭ１２７３菌株は、エコール生産性のヒトに対する１８％以上のエコール生産能向上効果を有すると言える。
【０１４７】
（実施例１１： １６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析にもとづくＳｌａｃｋｉａ属菌種の推定およびエコール生産性Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマーの取得）
ＥＧ培地で３７℃で４８時間嫌気培養を行ったＳｌａｃｋｉａ属菌からインスタジーンマトリクス（バイオラッド製）で細菌のゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを篠田らの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析による細菌の系統分類方法［非特許文献８＝島津評論，５７巻，１２１−１３２頁（２０００）］を採用してＳｌａｃｋｉａ属菌種の推定を行ったところ本菌は、Ｓｌａｃｋｉａ ｅｘｉｇｕａ （受託番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ）：ＡＦ１０１２４０）の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の１３６５個のうち１２６９が一致した（９２％）。よって本菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属すると考えられるが、種レベルでは、全くの新菌の可能性がある。そこで、本菌を特異的に検出する菌種特異的プライマーの作製を試みた。ＤＤＢＪの核酸データベースと ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ ｐｒｏｇｒａｍ ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２巻４６７３−４６８０頁 （１９９４）］を利用してエコール生産性Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマーを取得した。
Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマー：
Ｆｏｒｗａｒｄ ＳＬＣｆ ５’ＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧ３’（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＳＬＣｒ ５’ＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＴ３’（配列番号５）
生成物サイズ（ｂｐ） ３８３ｂｐ
Slackiasp. TM-30特異的プライマーによるPCR産物（配列）：３８３bp
AAGCCTCGGATGCGGCAGGGGGAGGCGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCGGGAAGAACACCGACGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGCCGGCATCGACGCTGAGGCGCGAAAGCTGGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCCAGCCGTAAACGATGGACGCTAGGTGTGGGGGGAACATCCCTCCGTGCCGAAGCCAACGCATTAAGCGTCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATACGGGTGAAGCCGGGAGAGATCCGGTGGCCGAGA（配列番号３の５６９位から９５１位）
（実施例１２：製剤例）
上記のように同定したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＴＭ−１株をＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培地ＪＣＭカタログ培地Ｎｏ１９）に接種後、３７℃、１８〜２４時間静醐養を行なった。培養終了後、７，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行い培養液の１／１００量の濃縮菌体を得た。次いで、各々の濃縮菌体にグルタミン酸ソーダ５％（重量）、可溶性澱粉５％（重量）、ショ糖５％（重量）および硫酸マグネシウム７水和物１％（重量）を含む分散媒と同量混合し、ｐＨ７．０に修正後、−４０℃以下で凍結してから凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥菌末を６０メッシュの締で粉末化して菌株の乾燥菌末を調製する。この乾燥菌末２ｍｇ（菌数、５×１０８相当）と乳糖（日局）６１ｍｇ、澱粉（日局）１１６，２ｍｇ、結合剤としてポリビニルピロリドンＫ２５（日局）２０ｍｇ、滑沢剤としてステアリン酸マグネシウム（日局）０．８ｍｇを加えて均一に混合し、打鍵機で圧縮成型し１錠当たり２００ｍｇの素錠を作り、さらに、ヒドロキシプロピルセルロースを用いてフィルムコーティングを施して白色のフィルムコーティングされた錠剤を製造する。
【０１４８】
このような錠剤は、健康食品または医薬として投与することができる。
【０１４９】
（実施例１３： エコール製剤の調製）
ソヤフラボンＨＧ（不二製油製、大豆エタノール抽出物、インフラボン含量約４０％）を２５％となるように反応液（ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ一システイン一塩酸０・５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、ブチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行った反応液）に添加する。この反応液９ｍｌに、約１０９／ｍｌ Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０を添加して、３７℃、２４時間静置培養を行い、エコールを生成させた．これを凍結乾燥して粉末とする。このエコール含有粉末は、エコール製剤および他の食品と混合することで、エコール含有食品に用いることができる。
【０１５０】
（実施例１４：別の菌株の同定）
上記実施例と同様の方法で、ダイゼインを資化して１．６％以上エコールを生産する新たに別の菌株を取得する。同定される菌株について、Ｓｌａｃｋｉａに属する菌を同定することができる。このような菌は、ダイゼイン資化能を有するにＳｌａｃｋｉａ属する菌として特定することができる。
【０１５１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明は、健康食品、食品、医薬などの産業において製造および利用することができる。従って、種々の分野において、本発明は、利用可能性を有する．
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号１：ユニバーサルプライマー２７ｆ ５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
配列番号２：ユニバーサルプライマー１４９２ｒ ５’−ＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’
配列番号３：Ｓｌａｃｋｉａ属菌ＴＭ−３０菌株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列（１４０２ｂｐ）：
ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＡＡＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＣＴＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＧＴＧＡＣＧＴＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＣＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＡＣＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＧＧＧＴＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＧＴＣＧＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡ
配列番号４：Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマー：Ｆｏｒｗａｒｄ ＳＬＣｆ ５’ＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧ３’
配列番号５：Ｓｌａｃｋｉａ属菌種の検出のための菌種特異的プライマー：Ｒｅｖｅｒｓｅ ＳＬＣｒ ５’ＴＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＴ３’
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌と菌種特異的プライマーもしくは、ヒトの腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を向上させる腸内細菌。
【請求項２】
前記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項３】
前記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項４】
前記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ種またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種に属する、請求項３に記載の腸内細菌。
【請求項５】
前記腸内細菌の菌種特異的プライマーであって、配列番号３に示す配列の一部で選択的に検出可能であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項６】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能が１．０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項７】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能１０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項８】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能２０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項９】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能３０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１０】
前記腸内細菌は、エコール非生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性付与効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１１】
前記腸内細菌は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対して２倍以上のエコール生産性向上効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１２】
前記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属である、請求項７または８に記載の腸内細菌。
【請求項１３】
前記腸内細菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７２９号（受領日平成１７年１２月２日）のＳｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５号（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５号）（受領日平成１６年１２月１６日）として寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株、もしくは理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＪＣＭ １２７３である請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１４】
プロバイオテイクスとして使用可能な細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１５】
デンプンまたはグリコーゲンを資化する能力を有することをさらに特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１６】
請求項１に記載の腸内細菌の組み合わせであって、該組み合わせに含まれる前記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する細菌と、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌とを含む、組み合わせ。
【請求項１７】
前記組み合わせは、Ｓｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株との組み合わせを含む、請求項１６に記載の組み合わせ。
【請求項１８】
エコール生産能を向上させるための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせを含む組成物。
【請求項１９】
食品または医薬である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
さらに他の有効成分を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記腸内細菌は、液体中に溶解して提供される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記腸内細菌は、固形状で提供される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記腸内細菌は、凍結乾燥されて提供される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記腸内細菌を胃液から保護する成分をさらに含む、請求項１８に記載の組成物
【請求項２５】
エコール生産能を向上させるための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせまたは請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有するもしくはエコール生産能を向上させるための細菌を生産する方法であって、該細菌を含むことが予想されるサンプルを、ＥＧ培地を用いて培養する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌もしくはエコール生産能を向上させるヒトの腸内細菌を生産する方法であって、
Ａ）ヒトの腸由来物質または糞便を含むサンプルを提供する工程；
Ｂ）該サンプルを、ＥＧ培地を用いて、３７℃で培養する工程；
Ｃ）ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン塩酸０．５ｇ、炭酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、該サンプル中で菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションする工程；
Ｄ）反応液中のイソフラボン類の分析を行う工程；および
Ｅ）ダイゼインまたはその誘導体を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌を選択し、生産する工程を包含する方法。
【請求項２８】
前記サンプルは、健康人の糞便に由来するサンプルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７〜２９に記載の方法により調製される細菌。
【請求項３０】
エコールを含むもしくはエコール生産性を向上させる医薬を製造するための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を該腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を該腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する方法によって生産された、組成物。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法によって得られる細菌。
【請求項３３】
エコールを含む医薬を製造するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、請求項３０に記載の方法によって得られる細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
【請求項３４】
エコール生産能を向上させるための医薬を生産するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、請求項３０に記載の方法によって得られる細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
【請求項１】
ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌と菌種特異的プライマーもしくは、ヒトの腸内細菌叢のダイゼインを資化してエコールを生産する能力を向上させる腸内細菌。
【請求項２】
前記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項３】
前記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項４】
前記腸内細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ種またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種に属する、請求項３に記載の腸内細菌。
【請求項５】
前記腸内細菌の菌種特異的プライマーであって、配列番号３に示す配列の一部で選択的に検出可能であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項６】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能が１．０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項７】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能１０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項８】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能２０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項９】
前記腸内細菌は、ダイゼインを基質として２４時間後に測定したダイゼイン資化能３０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１０】
前記腸内細菌は、エコール非生産性ヒトフローラマウスに対してエコール生産性付与効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１１】
前記腸内細菌は、エコール生産性ヒトフローラマウスに対して２倍以上のエコール生産性向上効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１２】
前記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属である、請求項７または８に記載の腸内細菌。
【請求項１３】
前記腸内細菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７２９号（受領日平成１７年１２月２日）のＳｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０３２５号（受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０３２５号）（受領日平成１６年１２月１６日）として寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株、もしくは理化学研究所微生物系統保存施設の保存菌株であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＪＣＭ １２７３である請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１４】
プロバイオテイクスとして使用可能な細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１５】
デンプンまたはグリコーゲンを資化する能力を有することをさらに特徴とする、請求項１に記載の腸内細菌。
【請求項１６】
請求項１に記載の腸内細菌の組み合わせであって、該組み合わせに含まれる前記腸内細菌は、Ｓｌａｃｋｉａ属に属する細菌と、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌とを含む、組み合わせ。
【請求項１７】
前記組み合わせは、Ｓｌａｃｋｉａ ＴＭ−３０株とＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓ ｃｅｎｔｉｓ ＴＭ−１株との組み合わせを含む、請求項１６に記載の組み合わせ。
【請求項１８】
エコール生産能を向上させるための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせを含む組成物。
【請求項１９】
食品または医薬である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
さらに他の有効成分を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記腸内細菌は、液体中に溶解して提供される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記腸内細菌は、固形状で提供される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記腸内細菌は、凍結乾燥されて提供される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記腸内細菌を胃液から保護する成分をさらに含む、請求項１８に記載の組成物
【請求項２５】
エコール生産能を向上させるための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせまたは請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組成物を、処置が必要とされる被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有するもしくはエコール生産能を向上させるための細菌を生産する方法であって、該細菌を含むことが予想されるサンプルを、ＥＧ培地を用いて培養する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
ダイゼインを資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する、ヒトの腸内細菌もしくはエコール生産能を向上させるヒトの腸内細菌を生産する方法であって、
Ａ）ヒトの腸由来物質または糞便を含むサンプルを提供する工程；
Ｂ）該サンプルを、ＥＧ培地を用いて、３７℃で培養する工程；
Ｃ）ブレインハートインフュージョン３７ｇ、寒天１ｇ、Ｌ−システイン塩酸０．５ｇ、炭酸ナトリウム ４ｇを１リットルの蒸留水に加温溶解し、酸素フリーの炭酸ガスを吹き込みながら試験管に分注し、プチルゴム栓をして、オートクレーブ滅菌処理を行って作製した反応液０．２ｍｌ中で、該サンプル中で菌濃度が約１０９／ｍｌになるように懸濁し、ダイゼイン１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、簡易型嫌気性培養装置アネロパックで３７℃、２４時間インキュベーションする工程；
Ｄ）反応液中のイソフラボン類の分析を行う工程；および
Ｅ）ダイゼインまたはその誘導体を資化してエコールを生産するダイゼイン資化能を有する腸内細菌を選択し、生産する工程を包含する方法。
【請求項２８】
前記サンプルは、健康人の糞便に由来するサンプルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７〜２９に記載の方法により調製される細菌。
【請求項３０】
エコールを含むもしくはエコール生産性を向上させる医薬を製造するための方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を該腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせと、ダイゼインとを混合する工程、および混合された混合物を該腸内細菌が資化する条件下でインキュベートする工程を包含する方法によって生産された、組成物。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法によって得られる細菌。
【請求項３３】
エコールを含む医薬を製造するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、請求項３０に記載の方法によって得られる細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
【請求項３４】
エコール生産能を向上させるための医薬を生産するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の腸内細菌、請求項３０に記載の方法によって得られる細菌または請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の組み合わせの使用。
【公開番号】特開２００６−２０４２９６（Ｐ２００６−２０４２９６Ａ）
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７６６５３（Ｐ２００５−３７６６５３）
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（５０１１４５２９５）独立行政法人食品総合研究所 (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（５０１１４５２９５）独立行政法人食品総合研究所 (27)
【Ｆターム（参考）】
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