ナノ粒子及びその製造方法
【課題】水性媒体における高められた分散性と反応性を有するナノ粒子を提供する。
【解決手段】コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有するナノ粒子。
【解決手段】コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有するナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子及びその製造方法に関し、特に、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体ナノ粒子は、無機、結晶性半導性材料で構成されるナノ粒子であり、量子サイズ効果から生じる固有の光物理学、光化学および非直線状の光学特性を有している。それ故、ライフサイエンス領域における生体分子検出試薬として、また光触媒、電荷移動デバイスおよび分析化学の領域における有用な材料としての応用が注目されている。
半導体ナノ粒子は疎水性であるため、このような用途で使用する場合には、水溶解性又は少なくとも水分散性にすることが必要である。このため、半導体ナノ粒子に種々の有機コーティングを用いて良好な水分散性を付与するための方法が提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には界面活性剤モノマーを分散剤として使用し、ナノ粒子は界面活性剤の疎水性領域と相互作用し、親水性領域が水性媒体に対して親和性を有することでナノ粒子の水性懸濁液を安定化するための方法が記載されている。特許文献２には式ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｘのモノマー化合物（ここで、ｎは、好ましくは≧１０であり、Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートである）が、モノマーの界面活性剤の代わりに開示されている。
【０００４】
一方、ナノサイズの粒子は分散安定性や表面の非特異吸着が不十分である場合があるので、非特許文献１では、メトキシシランやシラノールを用いて酸化亜鉛表面を修飾することによって、疎水性ナノ結晶の水分散性を向上させている。この技術では、元のホスフィン／ホスフィンオキシド界面活性剤層と、より極性のリガンドとの交換を行っている。しかしながら、この方法では量子収量がかなり減少しかつこれは決して完全には回復されないという欠点を有しており、また、水中に分散された粒子のコロイド安定性は十分ではない。
【０００５】
また、金属ナノ粒子表面を長鎖のＰＥＧで修飾することが金属ナノ粒子の水分散性を向上させること、抗原性や人体に与える影響が少ないことが一般的に知られている。例えば、非特許文献２では、上記の利点を生かすために、末端にＳｉＣｌ3を付加させたＰＥＧで酸化亜鉛表面を修飾することによって金属ナノ結晶の水分散性を向上するという表面修飾技術を開示している。また、非特許文献３では、金属ナノ粒子の表面修飾剤として、分子量６００の長鎖のＰＥＧの末端に反応性を有する有機性基を付加させたトルフルオロエチルエステル−ＰＥＧ末端シランを用いて、水分散性を向上させている。これにより、水分散性を向上させている。
【０００６】
【非特許文献１】J.Phys.Chem, 2001, Vol.105, pp.8861-8871
【非特許文献２】Biomed.Microdevices, 1998, Vol.1, pp.81-89
【非特許文献３】J.Am.Chem.Soc., 2004, Vol.126, pp.7206-7211
【特許文献１】国際公開第００／１７６５５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／１７６５６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、水分散性を向上させるために長鎖のＰＥＧを表面修飾させた場合、表面に十分な水和層を形成させる十分な数の長鎖ＰＥＧ分子を導入することができないため充分な水分散性が得られない。また、これを解消するために長鎖のＰＥＧの末端に反応性を有する有機性基を付加させた表面修飾剤を連結させても、長鎖のＰＥＧ自体によって有機性基の反応性が阻害されてしまい、効果的に水分散性を向上させることができない。
従って、本発明の目的は、水性媒体における高められた分散性と反応性を有するナノ粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のナノ粒子は、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有することを特徴としている。
上記ナノ粒子において、前記表面有機層が、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤と、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤とによる表面処理によって形成されたものであることが好ましい。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは粒子表面の官能基と結合形成可能な置換基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
【０００９】
また、上記ナノ粒子において、前記コア部が金属酸化物で構成されていることが好ましい。
上記ナノ粒子において、前記被標識物質が、生体関連分子であることが好ましい。
【００１０】
本発明のナノ粒子の製造方法は、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子の製造方法であって、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤を用いて、前記コア部及び表面有機層で構成された前駆体粒子を形成すること、前記前駆体粒子に対して、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理を行って、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基で表される表面反応性基を形成すること、を含むことを特徴としている。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒは有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは粒子表面の官能基と結合形成可能な置換基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
【００１１】
本発明にかかるナノ粒子は、ナノ粒子における表面有機層に、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たすことによって長さが異なる２種の表面反応性基を有しているので、Ｌ2を含む長鎖の表面反応性基によって水分散性を向上させることができると共に、Ｌ1を含む短鎖の表面反応性基によって被標識物質との反応性を向上させることができる。これにより、水分散性と反応性との高いレベルでの両立を図ることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水性媒体における高められた分散性と反応性を有するナノ粒子を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のナノ粒子は、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有している。
このようなナノ粒子は、好ましくは、前記表面有機層が、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤と、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理によって形成されたものである。
【００１４】
本発明のナノ粒子は、その表面に異なる長さの表面反応性基を有するので、水性媒体における分散性と反応性を高めることができる。これにより、元の粒子の量子効率を保存し、コロイド安定性を維持し、そして粒子径分布の任意の変化を避けるかまたは最小にしながら、水性媒体において疎水性半導性ナノ結晶に分散性を付与することができる。また、このような特性は、ナノ粒子の種類に影響されず、半導性ナノ粒子、疎水性表面を有する他の型のナノ粒子（例えば、結晶性である必要がない半導性ナノ粒子、および他の表面修飾剤で処理されている金属性ナノ粒子）であっても同様である。
【００１５】
［１］第１の表面修飾剤
本発明にかかる第１の表面修飾剤は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその分解生成物である。このような表面修飾剤によりコア部の表面を修飾することで、ナノ粒子の水や親水性溶媒への分散性が改良でき、体液などによるナノ粒子蛍光体の溶出や蛍光の消光を防止できる。さらに標的分子を検出するための分子プローブを結合しやすくなるという利点も有する。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
【００１６】
上記式中、Ｍはケイ素（Ｓｉ）原子又はチタン（Ｔｉ）原子を表し、水分散性の観点からケイ素原子であることが好ましい。
Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。
Ｒ2で表わされる有機性基中、他の有機性基と反応性を有する官能基としては、連結基Ｌを介して、末端にビニル基、アリルオキシ基、アクリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲンなどが結合したものである。これらの反応性を有する基の中で生体高分子との反応性の観点から特に好ましくは末端にアミノ基を有するものである。
なお、ここでＲ2が反応可能な他の有機性基には、被標識物質の他、後述する一般式（III）中のＸが含まれる。
【００１７】
連結基Ｌとしては、例えば、アルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜１０、末端の官能基の反応性の観点から好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）が挙げられる。
また、連結基Ｌは不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜１０、末端の官能基の反応性の観点から好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）、アリーレン基（例：フェニレン基、ナフチレン基など炭素数が６〜１０、末端の官能基の反応性の観点から好ましくは６のフェニレン基）が挙げられる。
【００１８】
連結基Ｌは１個又は２個以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの炭素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が好ましく、酸素原子が水分散性の観点からもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが水分散性の観点から５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。
【００１９】
連結基Ｌは上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良く、これらの官能基はＬにそれぞれ複数個存在してもよい。複数個存在する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
反応性の観点から官能基として好ましくは、アルケニル基、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。
【００２０】
Ｒ2で表わされるその他の有機性基としては、任意の基が挙げられるが、反応性の観点から好ましくはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ブトキシ基などのアルコキシ基及びフェノキシ基である。これらのアルコキシ基及びフェノキシ基はさらに置換基を有していてもよいが、合計の炭素数が８以下のものが望ましい。本発明に用いられる表面修飾剤は、アミノ基、カルボキシル基などが、酸又は塩基と塩を形成したものでもよい。
【００２１】
本発明に用いられる表面修飾剤の具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。なお、これらは単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリメトキシシリルプロピル）アミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−ベンズアミドトリメトキシシラン、３−ヒドラジドプロピルトリメトキシシラン、３−マレイミドプロピルトリメトキシシラン、（ｐ−カルボキシ）フェニルトリメトキシシラン、３−カルボキシプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルチタニウムトリプロポキシド、３−アミノプロピルメトキシエチルチタニウムジエトキシド、３−カルボキシプロピルチタニウムトリメトキシドなど。
【００２２】
なお、これらのうち、反応性の観点から、次のものが好ましい。
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン。
【００２３】
［２］第２及び第３の表面修飾剤
本発明にかかる第２及び第３の表面修飾剤はそれぞれ、下記一般式（II）及び（III）で表される化合物又はその分解生成物である。
【００２４】
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
Ｘで表わされる有機性基は粒子表面の官能基と結合形成可能な置換基である。ここでいう「粒子表面の官能基」とは、コア部の表面のみならず表面修飾剤によりコア部表面の表面有機層中に形成された官能基も含まれ、例えば前述の第１の表面修飾剤におけるＲ2も該当する。
Ｘで表わされる有機性基としては、ビニル基、アリルオキシ基、アクリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲンなどがあり、アミノ基との反応性の観点から好ましくはカルボキシル基、マレイミド基、アミノ基であり、最も好ましくはカルボキシル基である。
Ｙで表される有機性基は被標識物質と反応性を有する基である。Ｙで表される有機性基としては、マレイミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、メタンチオ硫酸基などがあり、ＳＨ基との反応性の観点から好ましくは、マレイミド基、アルデヒド基であり、最も好ましくはマレイミド基である。
【００２５】
Ｒ1で表される有機性基は、炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表し、このうち、水分散性の観点から好ましくは水素原子である。
連結基Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基である。このようにＬ1及びＬ2で長さが異なることによって、水分散性と反応性とを共に高めることができる。
Ｌ1、Ｌ2としては、例えば、アルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜１０、有機性基の反応性の観点から好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）を挙げることができ、これらを単数又は複数組み合わせてもよい。
【００２６】
また、連結基Ｌ1、Ｌ2は不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）、アリーレン基（例：フェニレン基、ナフチレン基、など炭素数が６〜１０、好ましくは６のフェニレン基）が挙げることができ、これらを単独又は複数組み合わせてもよく、更には上記のアルキレン基等と組み合わせてもよい。
【００２７】
これらのうち、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たすことを条件として、Ｌ1全体としては、有機性基の反応阻害性の観点から炭素数が１〜１０、より好ましくは１〜４の鎖状または環状のものを挙げることができる。これに対してＬ2全体としては、水分散性の観点から好ましくは炭素数が５０〜５０００、より好ましくは５０〜３００の鎖状または環状のものを好ましく挙げることができる。
Ｌ1とＬ2のサイズは、Ｌ1＜Ｌ2の関係が満たされていればどんな相対関係であってもよいが、有機性基の反応阻害性と水分散性の両立の観点から好ましくは、Ｌ2はＬ1の主鎖の長さとして５０倍〜５０００倍、更に好ましくは５０倍〜３００倍とすることができる。このような組み合わせとしては、例えば、Ｌ1が炭素数１〜４のアルキレン基又は炭素数２から１０のポリオキシエチレン基であり、Ｌ2が炭素数５０〜３００のポリオキシエチレン基である組み合わせを挙げることができる。
【００２８】
また、連結基Ｌ1、Ｌ2は１個又は２個以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの炭素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が安定性の観点から好ましく、酸素原子がもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。
【００２９】
連結基Ｌ1、Ｌ2は上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良く、これらの官能基は基Ｌ1、Ｌ2にそれぞれ複数個存在してもよい。複数個存在する場合には、上記条件が満たされる限りそれらは同一でも異なっていてもよい。
【００３０】
官能基として好ましくは、アルケニル基、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。
【００３１】
以下、第２の表面修飾剤の具体例を列挙するが、これらの化合物に限定されるものではない。なお、これらは単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
メトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシブチル酸、メトキシエトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシエトキシブチル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸。
【００３２】
また第３の表面修飾剤の具体例を列挙するが、これらの化合物に限定されるものではない。なお、これらは単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
カルボキシ−ＰＥＧ−アミン、カルボキシ−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボキシ−ＰＥＧ−カルボン酸、カルボキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミド、カルボキシ−ＰＥＧ−チオールを上げることができ、このうち、ＳＨ基との反応性の観点から、カルボキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミド、カルボキシ−ＰＥＧ−チオールが好ましく、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミドが最も好ましい。
【００３３】
本発明に用いられるこれらの表面修飾剤のうち一般式（Ｉ）〜（III）で表されるものの分解生成物とは、アルコキシ基が加水分解した水酸化物、水酸基同士間の脱水縮合反応により生成した低分子量のオリゴマー（これはリニア構造、環状構造、架橋構造などいずれであってもよい）、水酸基と未加水分解のアルコキシ基による脱アルコール縮合反応生成物、これらがさらに脱水縮合反応して形成したゾル、及びゲルをいう。
【００３４】
本発明に用いられる表面修飾剤はいずれも、末端のＮＨ2基又はＣＯＯＨ基が、酸又は塩基と塩を形成したものであってもよい。また、本発明に使用する表面修飾剤は、ナノ粒子の表面全体を被覆していても、その一部に結合していてもよい。また、本発明において各表面修飾剤は、単独で用いても複数併用してもよい。
【００３５】
なお、上記表面修飾剤に加えて、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１）ラウリルエーテルリン酸、ラウリルエーテルリン酸、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムなど）がナノ粒子合成時、あるいは合成後共存させてもよい。
【００３６】
また、本発明におけるナノ粒子の表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基を形成可能であれば、上記表面修飾剤（Ｉ）〜（III）による表面修飾処理に限定されない。
【００３７】
［３］コア部
本発明におけるコア部としては、所定の励起光で蛍光発光する粒子であればよく、所謂ナノサイズの数平均粒径を有するものであれば如何なるものも含まれる。数平均粒径としては、好ましくは０．５〜１００ｎｍであり、より好ましくは０．５〜５０ｎｍであり、さらに好ましくは１〜１０ｎｍである。ナノ粒子の粒径分布は、変動係数で好ましくは０〜５０％、より好ましくは０〜２０％、さらに好ましくは０〜１０％である。なお、変動係数は、算術標準偏差を数平均粒径で除し、これを百分率で表した値（算術標準偏差×１００／数平均粒径）を意味する。
【００３８】
ナノ粒子として好ましいものは、金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子である。金属酸化物又は金属硫化物を構成する金属としては、例えば、ＺｎなどのＩＩＢ族、Ｙ、Ｅｕ、ＴｂなどのＩＩＩＡ族、Ｇａ、ＩｎなどのＩＩＩＢ族、Ｚｒ、ＨｆなどのＩＶＡ族、Ｓｉ、ＧｅなどのＩＶＢ族、Ｖ、ＮｂなどのＶＡ族、Ｍｏ、ＷなどのＶＩＡ族などが挙げられる。これらの中で生体にやさしいＺｎが特に好ましい。また、Ｚｎ2ＳｉＯ4、ＣａＳｉＯ3、ＭｇＷＯ4、ＹＶＯ4、Ｙ2ＳｉＯ5などの複合金属酸化物であってもよい。本発明におけるナノ粒子としては、安定に製造できること、毒性の懸念が少ないこと、安価に製造できること、粒子の単分散性が高いこと、強い発光が得られること、発光スペクトルの波長域が本目的に合致しやすいこと、の観点から、酸化亜鉛（ＺｎＯ）及び硫化亜鉛（ＺｎＳ）であることが特に好ましく、酸化亜鉛（ＺｎＯ）であることが最も好ましい。
【００３９】
さらに、これらの金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子は、構成する金属酸化物又は金属硫化物中の金属とは異なる金属イオンを少量含有せしめることも好ましい。該金属イオンとしては、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｔｍ、Ｃｅ、Ａｌ、Ａｇなどの金属イオンが挙げられる。これらの金属イオンは、塩化物イオンやフッ化物イオンを組み合わせた化合物としてドープされることも好ましい。ドープする金属イオンは１種類の原子も、複数種類の原子からなるものでもよい。該金属イオンの濃度は、ナノ粒子を構成する金属および、その種類によって最適量が異なるが、０．００１〜１０原子％の範囲が好ましく、０．０１〜１０原子％の範囲がより好ましい。
【００４０】
また本発明にかかるナノ粒子は、励起光とシグナル蛍光との分離、安価光源の利用、簡便な検出系構築の観点から、好ましくは紫外域の光で励起するものであり、より好ましくは２５０ｎｍ〜３８０ｎｍの紫外光を励起光とする蛍光体ナノ粒子であることが好ましい。この励起光によって、可視域の光、より好ましくは４００ｎｍ〜７００ｎｍの可視光を発するものであることが好ましい。可視光を発光することによって、可視域の蛍光色素を励起することができ、よりエネルギーが低く、反応性、特に生体に対して激しく反応することなく、蛍光色素を発色させることができる。
【００４１】
本発明におけるナノ粒子は、発光の半値幅が５０〜２００ｎｍであることが好ましく、簡易な装置で高感度に発光を検出するためには、６０〜１８０ｎｍであることが好ましい。更に、蛍光標識材料としては発光ピーク波長と吸収ピーク波長が異なることが好ましく、高感度に発光を検出するためには、その発光ピーク波長が吸収端波長と２０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、５０ｎｍ以上離れていることが特に好ましい。このような発光のピーク波長および半値幅を持つ蛍光体ナノ粒子は、金属酸化物又は金属硫化物の蛍光体ナノ粒子であって、当業者であれば、上記のように、構成する金属等を適宜選択することによって容易に得ることができる。
【００４２】
［４］ナノ粒子およびその分散液の製造方法
金属酸化物で構成されるナノ粒子は、含有される金属のアルコキシド、アセチルアセトナートなどの有機金属化合物を加水分解するゾル−ゲル法、該金属の塩の水溶液にアルカリを加えて水酸化物として沈降させた後、脱水、アニールする水酸化物沈殿法、該金属の上記プレカーサーの溶液を用いて、超音波を照射する超音波分解法、高温高圧下で分解反応を行なうソルボサーマル法、高温下に噴霧するスプレーパイロリシスなどの液相合成法により得ることができる。また、有機金属化合物を用いる熱ＣＶＤ法やプラズマＣＶＤ法、該金属または該金属酸化物のターゲットを用いるスパッタ法やレーザーアブレーション法などの気相合成法によっても得ることができる。
【００４３】
金属硫化物で構成されるナノ粒子は、含有される金属のジエチルジチオカルバメート化合物などの熱分解性金属化合物をトリアルキルホスフィンオキシド類、トリアルキルホスフィン類、ω−アミノアルカン類などの高沸点有機溶媒中で結晶成長させるホットソープ法、該金属の塩の溶液に硫化ナトリウムや硫化アンモニウムなどの硫化物溶液を添加して結晶成長させる共沈法、界面活性剤を含む上記原料水溶液をアルカン類、エーテル類、芳香族炭化水素などの非極性有機溶媒中に逆ミセルとして存在させ該逆ミセル中で結晶成長させる逆ミセル法などの液相合成法により得ることができる。また、前記金属酸化物ナノ粒子の場合と同様の気相合成法によっても得ることができる。
【００４４】
上述した表面修飾剤は、ナノ粒子の合成時に添加することもできるが、好ましくは合成後に添加し、その少なくとも一部を加水分解することにより該ナノ粒子と結合して、ナノ粒子の表面の少なくとも一部を被覆（表面修飾）させる。なお、ナノ粒子は遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、本発明に用いられる表面修飾剤を含有する溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、２−エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒）に分散させて被覆してもよい。
【００４５】
表面修飾剤の添加量は、ナノ粒子の粒子サイズ、粒子の濃度、表面修飾剤の種類（大きさ、構造）等により変動するが、第１の表面修飾剤は、金属酸化物又は金属硫化物等に対し、好ましくは０．００１〜１０倍モル、さらに好ましくは０．０１〜２倍モルである。第２の表面修飾剤は、金属酸化物又は金属硫化物等に対して、水分散性の観点から好ましくは１〜２００倍モル、更に好ましくは１００〜２００倍モルであり、第３の表面修飾剤は、第２の表面修飾剤に対して、水分散性の観点から好ましくは０．０１〜１倍モル、被標識物質との反応性の観点から更に好ましくは０．１〜１倍モルである。
【００４６】
前述した通り、一般式（Ｉ）〜（III）で表される表面修飾剤以外に、公知の表面修飾剤を併用することができる。公知の表面修飾剤の添加量は、特に制限はないが、好ましくは金属酸化物又は金属硫化物等に対して、０．０１〜１００倍モル、さらに好ましくは０．０５〜１０倍モルである。
【００４７】
表面修飾剤が結合したナノ粒子の分散液において、ナノ粒子の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭが好ましく、より好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭである。分散媒としては、上記アルコール類の他、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦなどの親水性有機溶媒や水が好ましい。
【００４８】
なお、ナノ粒子の表面が表面修飾剤で被覆されていることは、ＦＥ−ＴＥＭ等の高分解性ＴＥＭで観察した際に粒子間に一定の間隔が認められること、および化学分析により確認することができる。
【００４９】
上述した本発明のナノ粒子は、好ましくは、上記の一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤を用いて、前記コア部及び表面有機層で構成された前駆体粒子を形成すること、前記前駆体粒子に対して、上記の一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理を行って、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基で表される表面反応性基を形成すること、を含むことにより製造することができる。
【００５０】
このように第１の表面修飾剤によってコア部に対して表面処理を行って前駆体粒子（即ち、表面反応性基未形成粒子）を形成した後に、第２及び第３の表面修飾剤による表面修飾処理を行うことによって、効率よく本発明のナノ粒子を製造することができる。
このとき、第２及び第３の表面修飾剤による表面修飾処理は、同時に行ってもよく、いずれか一方を先に行ってもよい。
【００５１】
一般式（１）〜（３）で表される表面修飾剤で被覆された本発明のナノ粒子は、上記表面反応基を表面有機層に有しているので、その表面反応性基であるアミノ基やカルボキシル基などに対するアミド化反応等により、さらに、核酸（単量体やオリゴヌクレオチド等）、抗体（モノクローナルや、その他のタンパク質（アミノ酸）や多糖類などの被標識物質と反応して例えばペプチド結合を形成することにより、特定の生体内分子などに対する蛍光標識物質として作用することが可能になる。
【００５２】
被標識物質としては、生体中に検出されうる生体関連分子や、その他の関連分子を挙げることができ、このうち生体関連分子であることが好ましい。被標識物質としては、抗体、タンパク、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、誘導ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然若しくは合成脂質、薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラス粒子、プラスチック粒子、重合体膜などを含む物質を挙げることができ、このうち、タンパク質、抗体、ペプチドであることが好ましい。
【００５３】
表面有機層中の反応性基と結合する被標識物質上の反応性基としては、表面有機層中の反応性基との組み合わせに応じて特に制限されず、アミノ基及びＳＨ基等を挙げることができるが、被標識物質として抗体を用いる場合には、ＳＨ基であることが好ましい。ＳＨ基を利用することによって、抗原認識部分の修飾を避けて、特異性を低下させることがなく、その上、非特異吸着の増加を回避することができる。また、ナノ粒子との結合に用いられるＳＨ基としては、ヒンジ部のジスルフィドを開裂させることによって得られたＳＨ基が、抗原認識部位とは無関係であって抗体の特異性を損なわないため、特に好ましい。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」はポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物から得られる抗体を含む。
用語「モノクローナル抗体」は、異種抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種類または供給源に関して制限されないし、これが作製される様式によって制限されることを意図しない。従って、この用語は、マウスハイブリドーマ、ならびにマウスハイブリドーマではなくヒトハイブリドーマを使用して得られたヒトモノクロナール抗体を含む。
【００５５】
機能的な抗体フラグメントは、抗体分子から、例えば、ペプシンを使用して、抗原結合を担っていない定常領域を切断することによって産出され得、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを生成する。これらのフラグメントは、２つの抗原結合部位を含むが、重鎖の各々から定常領域の部分を欠く。同様に、Ｆａｂフラグメント（これは、単一の抗原結合部位を含む）は、例えば、パパインを用いるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の消化によって、産出され得る。機能的なフラグメント（重鎖および軽鎖の可変領域のみを含む）が、組替え産出または免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解切断のような標準的な技術を使用して産出され得る。これらのフラグメントは、Ｆｖとして公知である。
本発明で使用する抗体として好ましくはモノクローナル抗体であり、より好ましくはＦａｂ’フラグメントである。
本発明で使用する抗体として、血液診断に有効であれば特に好ましく、例えば抗ＡＦＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＴＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗テオフィリン抗体などを挙げることができる。
【００５６】
アミド化反応は、カルボキシル基あるいはその誘導基（エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物など）とアミノ基の縮合により行なわれる。酸無水物や酸ハロゲン化物を用いる場合には塩基を共存させることが望ましい。カルボン酸のメチルエステルやエチルエステルなどのエステルを用いる場合には、生成するアルコールを除去するために加熱や減圧を行なうことが望ましい。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ＤＣＣ、Ｍｏｒｐｈｏ−ＣＤＩ、ＷＳＣなどのアミド化試薬、ＨＢＴなどの縮合添加剤、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート、２，４，５−トリクロロフェノールなどの活性エステル剤などのアミド化反応を促進する物質を共存させたり、予め反応させておいてもよい。また、アミド化反応時、アミド化により結合させる親和性分子のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを常法に従って適当な保護基で保護し、反応後脱保護することが望ましい。
【００５７】
アミド化反応により被標識物質を結合したナノ粒子は、ゲルろ過などの常法により洗浄、精製後、水または親水性溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、２−エトキシエタノールなど）に分散させて使用する。この分散液中のナノ粒子の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、１０-1Ｍ〜１０-15Ｍが好ましく、より好ましくは１０-2Ｍ〜１０-10Ｍである。
【００５８】
また、タンパク質、抗体、ペプチドを被標識物質として用いる場合には、これらの分子中のＳＨ基と、ナノ粒子表面の表面反応性基とを結合させることもできる。この場合には、ヒンジ法等を用いることによって容易に結合することができる。
この反応は、抗原認識部位とは無関係な、抗体ヒンジ部のジスルフィドを開裂させたＳＨ基を利用する反応である。即ち、ペプシン処理をしてＦ（ａｂ’）2を調整し、更に還元剤を加えジスルフィドを切断して得られたＦａｂ’のＳＨ基とマレイミド基とを反応させることによって、結合することができる。
【００５９】
本発明は、水性媒体中で良好な分散性を有するとともに優れたコロイド安定性および光物理的安定性を有するので、種々の分野（生物学、分析化学およびコンビナトリアル化学、医療診断、および遺伝子分析を含む）において有用である。また、蛍光特定性を利用して、バイオ・医療の分野で検査試薬の他、蛍光試薬や発光素子として用いることができる。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］
酸化亜鉛ナノ粒子の合成
酢酸亜鉛２水和物（５．４９ｇ，２５ｍｍｏｌ）に脱水エタノール（２５０ｍｌ）を加え、Dean-Steark脱水装置にて溶媒を留去しながら穏やかに２時間加熱還流を行った。留去された溶媒は１５０ｍｌであった。白濁した反応液に再度脱水ＥｔＯＨを１５０ｍｌ添加して加熱還流を行い、透明化した反応液を室温まで水冷した。
該反応液にテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（２５％メタノール溶液、１１．４ｍｌ，２８ｍｍｏｌ）を添加して室温にて４時間攪拌した。
続いて３−アミノプロピルトリメトキシシラン（４．７ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）と水（１．５ｍｌ，８３．３ｍｍｏｌ）を添加して６０℃にて４時間攪拌を行った。反応開始７分後に白色固体が析出する。反応液を室温まで水冷した後、固体を吸引ろ過し、エタノールで洗浄した。得られた白色粉末を減圧下で乾燥すると表面がアミノ化された酸化亜鉛ナノ粒子が得られた。収量６．０ｇ
【００６１】
上記粒子２００ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解し、Sephadex G25を充填したカラムを用いてゲルろ過を行った。以降の反応は全て該脱塩水溶液を使用した。
本処方により合成したナノ粒子は１０ｗｔ％でも透明な良好な分散状態を示す。粉末Ｘ線回折空間群Ｐ６3ｍｃに属する六方昌系（ウルツ鉱型）酸化亜鉛の標品とピークパターンが一致し、粒径はＴＥＭによる測定で３ｎｍであった。
以下、酸化亜鉛粒子の濃度は粒径３ｎｍの酸化亜鉛の体積（１４．１３×１０-27ｍ3ｍｏｌ-1）、分子量（８１．３８）、および密度（５．６７）から見積もることとした。
【００６２】
［実施例２］
酸化亜鉛ナノ粒子への水分散性の付与
０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液１ｍｌにＷＳＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをそれぞれ５ｍｇ加え、更にメトキシエトキシ酢酸を２．５×１０-5ｍｏｌ添加して室温で反応させた。３０分後、平均直径３ｎｍの酸化亜鉛粒子表面をアミノプロピルシランで被覆したナノ粒子（濃度１４ｍｇ／ｍｌ、ｍｉｌｌｉＱ水に分散）１ｍｌを加え、室温で７時間反応させた。ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）でゲルろ過した。該粒子は無色透明な良好な水分散物（粒子分散物Ａ）であった。
メトキシエトキシ酢酸の代わりに、メトキシエトキシエトキシ酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸を用いて、粒子分散物Ｂ〜Ｄを得た。各粒子分散物の光学的性質について表１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
［実施例３］
酸化亜鉛ナノ粒子の親水化及びマレイミド化
ＨＣｌ・ＮＨ2−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ．５０００、炭素数２２６；ＮＥＫＴＡＲ社）５０ｍｇを０．１Ｍ（ｐＨ８．０）ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍｌに溶解し、３．０ｍｇのＮ−（２−マレイミドエチルオキシ）スクシミドを添加し室温で６時間反応させた。
平均直径３ｎｍの酸化亜鉛粒子表面をアミノプロピルシランで被覆したナノ粒子（濃度１４ｍｇ／ｍｌ、ｍｉｌｌｉＱ水に分散）１ｍｌに０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液１ｍｌ、上記マレイミド化溶液１００μｌ（第３の表面修飾剤として０．００１ｍｍｏｌ）を加え、更にＷＳＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシミドをそれぞれ５ｍｇ加えて室温で反応させた。３０分後、メトキシエトキシ酢酸を２．５×１０-5ｍｏｌ添加して３時間２０分反応させた。ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し無色透明のマレイミド化酸化亜鉛ナノ粒子分散液（粒子分散液Ｅ）を得た。
メトキシエトキシ酢酸の代わりに、メトキシエトキシエトキシ酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸を用いた粒子分散液Ｆ〜Ｈを得た。これらの粒子分散液の光学的性質について表２に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
上述した本実施例によるナノ粒子の合成工程については、以下にその一例を示す。
【００６７】
【化１】
【００６８】
［実施例４］
酸化亜鉛ナノ粒子と抗テオフィリン抗体の連結
抗テオフィリン抗体をペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画溶液０．８ｍｌ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）；０．９６ｍｇ／ｍｌ）を、実施例３で調整したマレイミド化酸化亜鉛ナノ粒子分散液（４ｍｇ／ｍｌ）３．５ｍｌと混合し４℃で一晩反応させた。攪拌した後、Sephadex Ｇ１００（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶離）でゲルろ過により精製、Ｆａｂ’連結ＰＥＧ化酸化亜鉛ナノ粒子を得た。
【００６９】
このように、本実施例では、蛍光体としての耐久性の高い半導体ナノ粒子と、炭素数が短い、ＰＥＧ鎖以外の分散促進剤を用いることによって、高い反応性を維持した高機能蛍光体を得ることが可能になった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子及びその製造方法に関し、特に、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体ナノ粒子は、無機、結晶性半導性材料で構成されるナノ粒子であり、量子サイズ効果から生じる固有の光物理学、光化学および非直線状の光学特性を有している。それ故、ライフサイエンス領域における生体分子検出試薬として、また光触媒、電荷移動デバイスおよび分析化学の領域における有用な材料としての応用が注目されている。
半導体ナノ粒子は疎水性であるため、このような用途で使用する場合には、水溶解性又は少なくとも水分散性にすることが必要である。このため、半導体ナノ粒子に種々の有機コーティングを用いて良好な水分散性を付与するための方法が提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には界面活性剤モノマーを分散剤として使用し、ナノ粒子は界面活性剤の疎水性領域と相互作用し、親水性領域が水性媒体に対して親和性を有することでナノ粒子の水性懸濁液を安定化するための方法が記載されている。特許文献２には式ＨＳ−（ＣＨ2）n−Ｘのモノマー化合物（ここで、ｎは、好ましくは≧１０であり、Ｘは、カルボキシレートまたはスルホネートである）が、モノマーの界面活性剤の代わりに開示されている。
【０００４】
一方、ナノサイズの粒子は分散安定性や表面の非特異吸着が不十分である場合があるので、非特許文献１では、メトキシシランやシラノールを用いて酸化亜鉛表面を修飾することによって、疎水性ナノ結晶の水分散性を向上させている。この技術では、元のホスフィン／ホスフィンオキシド界面活性剤層と、より極性のリガンドとの交換を行っている。しかしながら、この方法では量子収量がかなり減少しかつこれは決して完全には回復されないという欠点を有しており、また、水中に分散された粒子のコロイド安定性は十分ではない。
【０００５】
また、金属ナノ粒子表面を長鎖のＰＥＧで修飾することが金属ナノ粒子の水分散性を向上させること、抗原性や人体に与える影響が少ないことが一般的に知られている。例えば、非特許文献２では、上記の利点を生かすために、末端にＳｉＣｌ3を付加させたＰＥＧで酸化亜鉛表面を修飾することによって金属ナノ結晶の水分散性を向上するという表面修飾技術を開示している。また、非特許文献３では、金属ナノ粒子の表面修飾剤として、分子量６００の長鎖のＰＥＧの末端に反応性を有する有機性基を付加させたトルフルオロエチルエステル−ＰＥＧ末端シランを用いて、水分散性を向上させている。これにより、水分散性を向上させている。
【０００６】
【非特許文献１】J.Phys.Chem, 2001, Vol.105, pp.8861-8871
【非特許文献２】Biomed.Microdevices, 1998, Vol.1, pp.81-89
【非特許文献３】J.Am.Chem.Soc., 2004, Vol.126, pp.7206-7211
【特許文献１】国際公開第００／１７６５５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／１７６５６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、水分散性を向上させるために長鎖のＰＥＧを表面修飾させた場合、表面に十分な水和層を形成させる十分な数の長鎖ＰＥＧ分子を導入することができないため充分な水分散性が得られない。また、これを解消するために長鎖のＰＥＧの末端に反応性を有する有機性基を付加させた表面修飾剤を連結させても、長鎖のＰＥＧ自体によって有機性基の反応性が阻害されてしまい、効果的に水分散性を向上させることができない。
従って、本発明の目的は、水性媒体における高められた分散性と反応性を有するナノ粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のナノ粒子は、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有することを特徴としている。
上記ナノ粒子において、前記表面有機層が、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤と、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤とによる表面処理によって形成されたものであることが好ましい。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは粒子表面の官能基と結合形成可能な置換基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
【０００９】
また、上記ナノ粒子において、前記コア部が金属酸化物で構成されていることが好ましい。
上記ナノ粒子において、前記被標識物質が、生体関連分子であることが好ましい。
【００１０】
本発明のナノ粒子の製造方法は、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子の製造方法であって、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤を用いて、前記コア部及び表面有機層で構成された前駆体粒子を形成すること、前記前駆体粒子に対して、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理を行って、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基で表される表面反応性基を形成すること、を含むことを特徴としている。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒは有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは粒子表面の官能基と結合形成可能な置換基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
【００１１】
本発明にかかるナノ粒子は、ナノ粒子における表面有機層に、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たすことによって長さが異なる２種の表面反応性基を有しているので、Ｌ2を含む長鎖の表面反応性基によって水分散性を向上させることができると共に、Ｌ1を含む短鎖の表面反応性基によって被標識物質との反応性を向上させることができる。これにより、水分散性と反応性との高いレベルでの両立を図ることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水性媒体における高められた分散性と反応性を有するナノ粒子を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のナノ粒子は、コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有している。
このようなナノ粒子は、好ましくは、前記表面有機層が、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤と、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理によって形成されたものである。
【００１４】
本発明のナノ粒子は、その表面に異なる長さの表面反応性基を有するので、水性媒体における分散性と反応性を高めることができる。これにより、元の粒子の量子効率を保存し、コロイド安定性を維持し、そして粒子径分布の任意の変化を避けるかまたは最小にしながら、水性媒体において疎水性半導性ナノ結晶に分散性を付与することができる。また、このような特性は、ナノ粒子の種類に影響されず、半導性ナノ粒子、疎水性表面を有する他の型のナノ粒子（例えば、結晶性である必要がない半導性ナノ粒子、および他の表面修飾剤で処理されている金属性ナノ粒子）であっても同様である。
【００１５】
［１］第１の表面修飾剤
本発明にかかる第１の表面修飾剤は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその分解生成物である。このような表面修飾剤によりコア部の表面を修飾することで、ナノ粒子の水や親水性溶媒への分散性が改良でき、体液などによるナノ粒子蛍光体の溶出や蛍光の消光を防止できる。さらに標的分子を検出するための分子プローブを結合しやすくなるという利点も有する。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
【００１６】
上記式中、Ｍはケイ素（Ｓｉ）原子又はチタン（Ｔｉ）原子を表し、水分散性の観点からケイ素原子であることが好ましい。
Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。
Ｒ2で表わされる有機性基中、他の有機性基と反応性を有する官能基としては、連結基Ｌを介して、末端にビニル基、アリルオキシ基、アクリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲンなどが結合したものである。これらの反応性を有する基の中で生体高分子との反応性の観点から特に好ましくは末端にアミノ基を有するものである。
なお、ここでＲ2が反応可能な他の有機性基には、被標識物質の他、後述する一般式（III）中のＸが含まれる。
【００１７】
連結基Ｌとしては、例えば、アルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜１０、末端の官能基の反応性の観点から好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）が挙げられる。
また、連結基Ｌは不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜１０、末端の官能基の反応性の観点から好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）、アリーレン基（例：フェニレン基、ナフチレン基など炭素数が６〜１０、末端の官能基の反応性の観点から好ましくは６のフェニレン基）が挙げられる。
【００１８】
連結基Ｌは１個又は２個以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの炭素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が好ましく、酸素原子が水分散性の観点からもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが水分散性の観点から５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。
【００１９】
連結基Ｌは上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良く、これらの官能基はＬにそれぞれ複数個存在してもよい。複数個存在する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
反応性の観点から官能基として好ましくは、アルケニル基、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。
【００２０】
Ｒ2で表わされるその他の有機性基としては、任意の基が挙げられるが、反応性の観点から好ましくはメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ブトキシ基などのアルコキシ基及びフェノキシ基である。これらのアルコキシ基及びフェノキシ基はさらに置換基を有していてもよいが、合計の炭素数が８以下のものが望ましい。本発明に用いられる表面修飾剤は、アミノ基、カルボキシル基などが、酸又は塩基と塩を形成したものでもよい。
【００２１】
本発明に用いられる表面修飾剤の具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。なお、これらは単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリメトキシシリルプロピル）アミン、Ｎ−（３−アミノプロピル）−ベンズアミドトリメトキシシラン、３−ヒドラジドプロピルトリメトキシシラン、３−マレイミドプロピルトリメトキシシラン、（ｐ−カルボキシ）フェニルトリメトキシシラン、３−カルボキシプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルチタニウムトリプロポキシド、３−アミノプロピルメトキシエチルチタニウムジエトキシド、３−カルボキシプロピルチタニウムトリメトキシドなど。
【００２２】
なお、これらのうち、反応性の観点から、次のものが好ましい。
Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン。
【００２３】
［２］第２及び第３の表面修飾剤
本発明にかかる第２及び第３の表面修飾剤はそれぞれ、下記一般式（II）及び（III）で表される化合物又はその分解生成物である。
【００２４】
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
Ｘで表わされる有機性基は粒子表面の官能基と結合形成可能な置換基である。ここでいう「粒子表面の官能基」とは、コア部の表面のみならず表面修飾剤によりコア部表面の表面有機層中に形成された官能基も含まれ、例えば前述の第１の表面修飾剤におけるＲ2も該当する。
Ｘで表わされる有機性基としては、ビニル基、アリルオキシ基、アクリロイル基、メタクリロイル基、イソシアナト基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲンなどがあり、アミノ基との反応性の観点から好ましくはカルボキシル基、マレイミド基、アミノ基であり、最も好ましくはカルボキシル基である。
Ｙで表される有機性基は被標識物質と反応性を有する基である。Ｙで表される有機性基としては、マレイミド基、カルボキシル基、アルデヒド基、メタンチオ硫酸基などがあり、ＳＨ基との反応性の観点から好ましくは、マレイミド基、アルデヒド基であり、最も好ましくはマレイミド基である。
【００２５】
Ｒ1で表される有機性基は、炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表し、このうち、水分散性の観点から好ましくは水素原子である。
連結基Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基である。このようにＬ1及びＬ2で長さが異なることによって、水分散性と反応性とを共に高めることができる。
Ｌ1、Ｌ2としては、例えば、アルキレン基（例：メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、プロピレン基、エチルエチレン基、シクロヘキシレン基など炭素数が１〜１０、有機性基の反応性の観点から好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）を挙げることができ、これらを単数又は複数組み合わせてもよい。
【００２６】
また、連結基Ｌ1、Ｌ2は不飽和結合を有していてもよい。不飽和基としては、アルケニレン基（例：ビニレン基、プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基、２−ペンテニレン基、８−ヘキサデセニレン基、１，３−ブタンジエニレン基、シクロヘキセニレン基など炭素数が１〜１０、好ましくは１〜８の鎖状または環状のもの）、アリーレン基（例：フェニレン基、ナフチレン基、など炭素数が６〜１０、好ましくは６のフェニレン基）が挙げることができ、これらを単独又は複数組み合わせてもよく、更には上記のアルキレン基等と組み合わせてもよい。
【００２７】
これらのうち、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たすことを条件として、Ｌ1全体としては、有機性基の反応阻害性の観点から炭素数が１〜１０、より好ましくは１〜４の鎖状または環状のものを挙げることができる。これに対してＬ2全体としては、水分散性の観点から好ましくは炭素数が５０〜５０００、より好ましくは５０〜３００の鎖状または環状のものを好ましく挙げることができる。
Ｌ1とＬ2のサイズは、Ｌ1＜Ｌ2の関係が満たされていればどんな相対関係であってもよいが、有機性基の反応阻害性と水分散性の両立の観点から好ましくは、Ｌ2はＬ1の主鎖の長さとして５０倍〜５０００倍、更に好ましくは５０倍〜３００倍とすることができる。このような組み合わせとしては、例えば、Ｌ1が炭素数１〜４のアルキレン基又は炭素数２から１０のポリオキシエチレン基であり、Ｌ2が炭素数５０〜３００のポリオキシエチレン基である組み合わせを挙げることができる。
【００２８】
また、連結基Ｌ1、Ｌ2は１個又は２個以上のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、硫黄原子などの炭素原子以外の任意の原子を意味する）を有していてもよい。へテロ原子は酸素原子又は硫黄原子が安定性の観点から好ましく、酸素原子がもっとも好ましい。ヘテロ原子の数は特に規定されないが５個以下であることが好ましく、より好ましくは３個以下である。
【００２９】
連結基Ｌ1、Ｌ2は上記ヘテロ原子と隣接する炭素原子を含む官能基を部分構造として含んでいてもよい。該官能基としてはエステル基（カルボン酸エステル、炭酸エステル、スルホン酸エステル、スルフィン酸エステルを含む）、アミド基（カルボン酸アミド、ウレタン、スルホン酸アミド、スルフィン酸アミドを含む）、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、イミド基などが挙げられる。上記の官能基はさらに置換基を有していても良く、これらの官能基は基Ｌ1、Ｌ2にそれぞれ複数個存在してもよい。複数個存在する場合には、上記条件が満たされる限りそれらは同一でも異なっていてもよい。
【００３０】
官能基として好ましくは、アルケニル基、エステル基、アミド基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基又はアミノ基であり、さらに好ましくはアルケニル基、エステル基、エーテル基である。
【００３１】
以下、第２の表面修飾剤の具体例を列挙するが、これらの化合物に限定されるものではない。なお、これらは単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
メトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシブチル酸、メトキシエトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシエトキシブチル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸。
【００３２】
また第３の表面修飾剤の具体例を列挙するが、これらの化合物に限定されるものではない。なお、これらは単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
カルボキシ−ＰＥＧ−アミン、カルボキシ−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボキシ−ＰＥＧ−カルボン酸、カルボキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミド、カルボキシ−ＰＥＧ−チオールを上げることができ、このうち、ＳＨ基との反応性の観点から、カルボキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミド、カルボキシ−ＰＥＧ−チオールが好ましく、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミドが最も好ましい。
【００３３】
本発明に用いられるこれらの表面修飾剤のうち一般式（Ｉ）〜（III）で表されるものの分解生成物とは、アルコキシ基が加水分解した水酸化物、水酸基同士間の脱水縮合反応により生成した低分子量のオリゴマー（これはリニア構造、環状構造、架橋構造などいずれであってもよい）、水酸基と未加水分解のアルコキシ基による脱アルコール縮合反応生成物、これらがさらに脱水縮合反応して形成したゾル、及びゲルをいう。
【００３４】
本発明に用いられる表面修飾剤はいずれも、末端のＮＨ2基又はＣＯＯＨ基が、酸又は塩基と塩を形成したものであってもよい。また、本発明に使用する表面修飾剤は、ナノ粒子の表面全体を被覆していても、その一部に結合していてもよい。また、本発明において各表面修飾剤は、単独で用いても複数併用してもよい。
【００３５】
なお、上記表面修飾剤に加えて、公知の表面修飾剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン（１）ラウリルエーテルリン酸、ラウリルエーテルリン酸、トリオクチルホスフィン、トリオクチルホスフィンオキシド、ポリリン酸ナトリウム、ビス（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムなど）がナノ粒子合成時、あるいは合成後共存させてもよい。
【００３６】
また、本発明におけるナノ粒子の表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基を形成可能であれば、上記表面修飾剤（Ｉ）〜（III）による表面修飾処理に限定されない。
【００３７】
［３］コア部
本発明におけるコア部としては、所定の励起光で蛍光発光する粒子であればよく、所謂ナノサイズの数平均粒径を有するものであれば如何なるものも含まれる。数平均粒径としては、好ましくは０．５〜１００ｎｍであり、より好ましくは０．５〜５０ｎｍであり、さらに好ましくは１〜１０ｎｍである。ナノ粒子の粒径分布は、変動係数で好ましくは０〜５０％、より好ましくは０〜２０％、さらに好ましくは０〜１０％である。なお、変動係数は、算術標準偏差を数平均粒径で除し、これを百分率で表した値（算術標準偏差×１００／数平均粒径）を意味する。
【００３８】
ナノ粒子として好ましいものは、金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子である。金属酸化物又は金属硫化物を構成する金属としては、例えば、ＺｎなどのＩＩＢ族、Ｙ、Ｅｕ、ＴｂなどのＩＩＩＡ族、Ｇａ、ＩｎなどのＩＩＩＢ族、Ｚｒ、ＨｆなどのＩＶＡ族、Ｓｉ、ＧｅなどのＩＶＢ族、Ｖ、ＮｂなどのＶＡ族、Ｍｏ、ＷなどのＶＩＡ族などが挙げられる。これらの中で生体にやさしいＺｎが特に好ましい。また、Ｚｎ2ＳｉＯ4、ＣａＳｉＯ3、ＭｇＷＯ4、ＹＶＯ4、Ｙ2ＳｉＯ5などの複合金属酸化物であってもよい。本発明におけるナノ粒子としては、安定に製造できること、毒性の懸念が少ないこと、安価に製造できること、粒子の単分散性が高いこと、強い発光が得られること、発光スペクトルの波長域が本目的に合致しやすいこと、の観点から、酸化亜鉛（ＺｎＯ）及び硫化亜鉛（ＺｎＳ）であることが特に好ましく、酸化亜鉛（ＺｎＯ）であることが最も好ましい。
【００３９】
さらに、これらの金属酸化物又は金属硫化物のナノ粒子は、構成する金属酸化物又は金属硫化物中の金属とは異なる金属イオンを少量含有せしめることも好ましい。該金属イオンとしては、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｔｍ、Ｃｅ、Ａｌ、Ａｇなどの金属イオンが挙げられる。これらの金属イオンは、塩化物イオンやフッ化物イオンを組み合わせた化合物としてドープされることも好ましい。ドープする金属イオンは１種類の原子も、複数種類の原子からなるものでもよい。該金属イオンの濃度は、ナノ粒子を構成する金属および、その種類によって最適量が異なるが、０．００１〜１０原子％の範囲が好ましく、０．０１〜１０原子％の範囲がより好ましい。
【００４０】
また本発明にかかるナノ粒子は、励起光とシグナル蛍光との分離、安価光源の利用、簡便な検出系構築の観点から、好ましくは紫外域の光で励起するものであり、より好ましくは２５０ｎｍ〜３８０ｎｍの紫外光を励起光とする蛍光体ナノ粒子であることが好ましい。この励起光によって、可視域の光、より好ましくは４００ｎｍ〜７００ｎｍの可視光を発するものであることが好ましい。可視光を発光することによって、可視域の蛍光色素を励起することができ、よりエネルギーが低く、反応性、特に生体に対して激しく反応することなく、蛍光色素を発色させることができる。
【００４１】
本発明におけるナノ粒子は、発光の半値幅が５０〜２００ｎｍであることが好ましく、簡易な装置で高感度に発光を検出するためには、６０〜１８０ｎｍであることが好ましい。更に、蛍光標識材料としては発光ピーク波長と吸収ピーク波長が異なることが好ましく、高感度に発光を検出するためには、その発光ピーク波長が吸収端波長と２０ｎｍ以上離れていることがより好ましく、５０ｎｍ以上離れていることが特に好ましい。このような発光のピーク波長および半値幅を持つ蛍光体ナノ粒子は、金属酸化物又は金属硫化物の蛍光体ナノ粒子であって、当業者であれば、上記のように、構成する金属等を適宜選択することによって容易に得ることができる。
【００４２】
［４］ナノ粒子およびその分散液の製造方法
金属酸化物で構成されるナノ粒子は、含有される金属のアルコキシド、アセチルアセトナートなどの有機金属化合物を加水分解するゾル−ゲル法、該金属の塩の水溶液にアルカリを加えて水酸化物として沈降させた後、脱水、アニールする水酸化物沈殿法、該金属の上記プレカーサーの溶液を用いて、超音波を照射する超音波分解法、高温高圧下で分解反応を行なうソルボサーマル法、高温下に噴霧するスプレーパイロリシスなどの液相合成法により得ることができる。また、有機金属化合物を用いる熱ＣＶＤ法やプラズマＣＶＤ法、該金属または該金属酸化物のターゲットを用いるスパッタ法やレーザーアブレーション法などの気相合成法によっても得ることができる。
【００４３】
金属硫化物で構成されるナノ粒子は、含有される金属のジエチルジチオカルバメート化合物などの熱分解性金属化合物をトリアルキルホスフィンオキシド類、トリアルキルホスフィン類、ω−アミノアルカン類などの高沸点有機溶媒中で結晶成長させるホットソープ法、該金属の塩の溶液に硫化ナトリウムや硫化アンモニウムなどの硫化物溶液を添加して結晶成長させる共沈法、界面活性剤を含む上記原料水溶液をアルカン類、エーテル類、芳香族炭化水素などの非極性有機溶媒中に逆ミセルとして存在させ該逆ミセル中で結晶成長させる逆ミセル法などの液相合成法により得ることができる。また、前記金属酸化物ナノ粒子の場合と同様の気相合成法によっても得ることができる。
【００４４】
上述した表面修飾剤は、ナノ粒子の合成時に添加することもできるが、好ましくは合成後に添加し、その少なくとも一部を加水分解することにより該ナノ粒子と結合して、ナノ粒子の表面の少なくとも一部を被覆（表面修飾）させる。なお、ナノ粒子は遠心分離やろ過などの常法により洗浄、精製後、本発明に用いられる表面修飾剤を含有する溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、２−エトキシエタノールなどの親水性有機溶媒）に分散させて被覆してもよい。
【００４５】
表面修飾剤の添加量は、ナノ粒子の粒子サイズ、粒子の濃度、表面修飾剤の種類（大きさ、構造）等により変動するが、第１の表面修飾剤は、金属酸化物又は金属硫化物等に対し、好ましくは０．００１〜１０倍モル、さらに好ましくは０．０１〜２倍モルである。第２の表面修飾剤は、金属酸化物又は金属硫化物等に対して、水分散性の観点から好ましくは１〜２００倍モル、更に好ましくは１００〜２００倍モルであり、第３の表面修飾剤は、第２の表面修飾剤に対して、水分散性の観点から好ましくは０．０１〜１倍モル、被標識物質との反応性の観点から更に好ましくは０．１〜１倍モルである。
【００４６】
前述した通り、一般式（Ｉ）〜（III）で表される表面修飾剤以外に、公知の表面修飾剤を併用することができる。公知の表面修飾剤の添加量は、特に制限はないが、好ましくは金属酸化物又は金属硫化物等に対して、０．０１〜１００倍モル、さらに好ましくは０．０５〜１０倍モルである。
【００４７】
表面修飾剤が結合したナノ粒子の分散液において、ナノ粒子の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、０．０１ｍＭ〜１０００ｍＭが好ましく、より好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭである。分散媒としては、上記アルコール類の他、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦなどの親水性有機溶媒や水が好ましい。
【００４８】
なお、ナノ粒子の表面が表面修飾剤で被覆されていることは、ＦＥ−ＴＥＭ等の高分解性ＴＥＭで観察した際に粒子間に一定の間隔が認められること、および化学分析により確認することができる。
【００４９】
上述した本発明のナノ粒子は、好ましくは、上記の一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤を用いて、前記コア部及び表面有機層で構成された前駆体粒子を形成すること、前記前駆体粒子に対して、上記の一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理を行って、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基で表される表面反応性基を形成すること、を含むことにより製造することができる。
【００５０】
このように第１の表面修飾剤によってコア部に対して表面処理を行って前駆体粒子（即ち、表面反応性基未形成粒子）を形成した後に、第２及び第３の表面修飾剤による表面修飾処理を行うことによって、効率よく本発明のナノ粒子を製造することができる。
このとき、第２及び第３の表面修飾剤による表面修飾処理は、同時に行ってもよく、いずれか一方を先に行ってもよい。
【００５１】
一般式（１）〜（３）で表される表面修飾剤で被覆された本発明のナノ粒子は、上記表面反応基を表面有機層に有しているので、その表面反応性基であるアミノ基やカルボキシル基などに対するアミド化反応等により、さらに、核酸（単量体やオリゴヌクレオチド等）、抗体（モノクローナルや、その他のタンパク質（アミノ酸）や多糖類などの被標識物質と反応して例えばペプチド結合を形成することにより、特定の生体内分子などに対する蛍光標識物質として作用することが可能になる。
【００５２】
被標識物質としては、生体中に検出されうる生体関連分子や、その他の関連分子を挙げることができ、このうち生体関連分子であることが好ましい。被標識物質としては、抗体、タンパク、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、誘導ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然若しくは合成脂質、薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラス粒子、プラスチック粒子、重合体膜などを含む物質を挙げることができ、このうち、タンパク質、抗体、ペプチドであることが好ましい。
【００５３】
表面有機層中の反応性基と結合する被標識物質上の反応性基としては、表面有機層中の反応性基との組み合わせに応じて特に制限されず、アミノ基及びＳＨ基等を挙げることができるが、被標識物質として抗体を用いる場合には、ＳＨ基であることが好ましい。ＳＨ基を利用することによって、抗原認識部分の修飾を避けて、特異性を低下させることがなく、その上、非特異吸着の増加を回避することができる。また、ナノ粒子との結合に用いられるＳＨ基としては、ヒンジ部のジスルフィドを開裂させることによって得られたＳＨ基が、抗原認識部位とは無関係であって抗体の特異性を損なわないため、特に好ましい。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」はポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物から得られる抗体を含む。
用語「モノクローナル抗体」は、異種抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種類または供給源に関して制限されないし、これが作製される様式によって制限されることを意図しない。従って、この用語は、マウスハイブリドーマ、ならびにマウスハイブリドーマではなくヒトハイブリドーマを使用して得られたヒトモノクロナール抗体を含む。
【００５５】
機能的な抗体フラグメントは、抗体分子から、例えば、ペプシンを使用して、抗原結合を担っていない定常領域を切断することによって産出され得、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを生成する。これらのフラグメントは、２つの抗原結合部位を含むが、重鎖の各々から定常領域の部分を欠く。同様に、Ｆａｂフラグメント（これは、単一の抗原結合部位を含む）は、例えば、パパインを用いるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の消化によって、産出され得る。機能的なフラグメント（重鎖および軽鎖の可変領域のみを含む）が、組替え産出または免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解切断のような標準的な技術を使用して産出され得る。これらのフラグメントは、Ｆｖとして公知である。
本発明で使用する抗体として好ましくはモノクローナル抗体であり、より好ましくはＦａｂ’フラグメントである。
本発明で使用する抗体として、血液診断に有効であれば特に好ましく、例えば抗ＡＦＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＴＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗テオフィリン抗体などを挙げることができる。
【００５６】
アミド化反応は、カルボキシル基あるいはその誘導基（エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物など）とアミノ基の縮合により行なわれる。酸無水物や酸ハロゲン化物を用いる場合には塩基を共存させることが望ましい。カルボン酸のメチルエステルやエチルエステルなどのエステルを用いる場合には、生成するアルコールを除去するために加熱や減圧を行なうことが望ましい。カルボキシル基を直接アミド化する場合には、ＤＣＣ、Ｍｏｒｐｈｏ−ＣＤＩ、ＷＳＣなどのアミド化試薬、ＨＢＴなどの縮合添加剤、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテート、２，４，５−トリクロロフェノールなどの活性エステル剤などのアミド化反応を促進する物質を共存させたり、予め反応させておいてもよい。また、アミド化反応時、アミド化により結合させる親和性分子のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを常法に従って適当な保護基で保護し、反応後脱保護することが望ましい。
【００５７】
アミド化反応により被標識物質を結合したナノ粒子は、ゲルろ過などの常法により洗浄、精製後、水または親水性溶媒（好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、２−エトキシエタノールなど）に分散させて使用する。この分散液中のナノ粒子の濃度は、蛍光強度によって異なるので特に限定されないが、１０-1Ｍ〜１０-15Ｍが好ましく、より好ましくは１０-2Ｍ〜１０-10Ｍである。
【００５８】
また、タンパク質、抗体、ペプチドを被標識物質として用いる場合には、これらの分子中のＳＨ基と、ナノ粒子表面の表面反応性基とを結合させることもできる。この場合には、ヒンジ法等を用いることによって容易に結合することができる。
この反応は、抗原認識部位とは無関係な、抗体ヒンジ部のジスルフィドを開裂させたＳＨ基を利用する反応である。即ち、ペプシン処理をしてＦ（ａｂ’）2を調整し、更に還元剤を加えジスルフィドを切断して得られたＦａｂ’のＳＨ基とマレイミド基とを反応させることによって、結合することができる。
【００５９】
本発明は、水性媒体中で良好な分散性を有するとともに優れたコロイド安定性および光物理的安定性を有するので、種々の分野（生物学、分析化学およびコンビナトリアル化学、医療診断、および遺伝子分析を含む）において有用である。また、蛍光特定性を利用して、バイオ・医療の分野で検査試薬の他、蛍光試薬や発光素子として用いることができる。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］
酸化亜鉛ナノ粒子の合成
酢酸亜鉛２水和物（５．４９ｇ，２５ｍｍｏｌ）に脱水エタノール（２５０ｍｌ）を加え、Dean-Steark脱水装置にて溶媒を留去しながら穏やかに２時間加熱還流を行った。留去された溶媒は１５０ｍｌであった。白濁した反応液に再度脱水ＥｔＯＨを１５０ｍｌ添加して加熱還流を行い、透明化した反応液を室温まで水冷した。
該反応液にテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（２５％メタノール溶液、１１．４ｍｌ，２８ｍｍｏｌ）を添加して室温にて４時間攪拌した。
続いて３−アミノプロピルトリメトキシシラン（４．７ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）と水（１．５ｍｌ，８３．３ｍｍｏｌ）を添加して６０℃にて４時間攪拌を行った。反応開始７分後に白色固体が析出する。反応液を室温まで水冷した後、固体を吸引ろ過し、エタノールで洗浄した。得られた白色粉末を減圧下で乾燥すると表面がアミノ化された酸化亜鉛ナノ粒子が得られた。収量６．０ｇ
【００６１】
上記粒子２００ｍｇを蒸留水１０ｍｌに溶解し、Sephadex G25を充填したカラムを用いてゲルろ過を行った。以降の反応は全て該脱塩水溶液を使用した。
本処方により合成したナノ粒子は１０ｗｔ％でも透明な良好な分散状態を示す。粉末Ｘ線回折空間群Ｐ６3ｍｃに属する六方昌系（ウルツ鉱型）酸化亜鉛の標品とピークパターンが一致し、粒径はＴＥＭによる測定で３ｎｍであった。
以下、酸化亜鉛粒子の濃度は粒径３ｎｍの酸化亜鉛の体積（１４．１３×１０-27ｍ3ｍｏｌ-1）、分子量（８１．３８）、および密度（５．６７）から見積もることとした。
【００６２】
［実施例２］
酸化亜鉛ナノ粒子への水分散性の付与
０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液１ｍｌにＷＳＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをそれぞれ５ｍｇ加え、更にメトキシエトキシ酢酸を２．５×１０-5ｍｏｌ添加して室温で反応させた。３０分後、平均直径３ｎｍの酸化亜鉛粒子表面をアミノプロピルシランで被覆したナノ粒子（濃度１４ｍｇ／ｍｌ、ｍｉｌｌｉＱ水に分散）１ｍｌを加え、室温で７時間反応させた。ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）でゲルろ過した。該粒子は無色透明な良好な水分散物（粒子分散物Ａ）であった。
メトキシエトキシ酢酸の代わりに、メトキシエトキシエトキシ酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸を用いて、粒子分散物Ｂ〜Ｄを得た。各粒子分散物の光学的性質について表１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
［実施例３］
酸化亜鉛ナノ粒子の親水化及びマレイミド化
ＨＣｌ・ＮＨ2−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（ＭＷ．５０００、炭素数２２６；ＮＥＫＴＡＲ社）５０ｍｇを０．１Ｍ（ｐＨ８．０）ＨＥＰＥＳ緩衝液１ｍｌに溶解し、３．０ｍｇのＮ−（２−マレイミドエチルオキシ）スクシミドを添加し室温で６時間反応させた。
平均直径３ｎｍの酸化亜鉛粒子表面をアミノプロピルシランで被覆したナノ粒子（濃度１４ｍｇ／ｍｌ、ｍｉｌｌｉＱ水に分散）１ｍｌに０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液１ｍｌ、上記マレイミド化溶液１００μｌ（第３の表面修飾剤として０．００１ｍｍｏｌ）を加え、更にＷＳＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシミドをそれぞれ５ｍｇ加えて室温で反応させた。３０分後、メトキシエトキシ酢酸を２．５×１０-5ｍｏｌ添加して３時間２０分反応させた。ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し無色透明のマレイミド化酸化亜鉛ナノ粒子分散液（粒子分散液Ｅ）を得た。
メトキシエトキシ酢酸の代わりに、メトキシエトキシエトキシ酢酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸を用いた粒子分散液Ｆ〜Ｈを得た。これらの粒子分散液の光学的性質について表２に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
上述した本実施例によるナノ粒子の合成工程については、以下にその一例を示す。
【００６７】
【化１】
【００６８】
［実施例４］
酸化亜鉛ナノ粒子と抗テオフィリン抗体の連結
抗テオフィリン抗体をペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画溶液０．８ｍｌ（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）；０．９６ｍｇ／ｍｌ）を、実施例３で調整したマレイミド化酸化亜鉛ナノ粒子分散液（４ｍｇ／ｍｌ）３．５ｍｌと混合し４℃で一晩反応させた。攪拌した後、Sephadex Ｇ１００（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶離）でゲルろ過により精製、Ｆａｂ’連結ＰＥＧ化酸化亜鉛ナノ粒子を得た。
【００６９】
このように、本実施例では、蛍光体としての耐久性の高い半導体ナノ粒子と、炭素数が短い、ＰＥＧ鎖以外の分散促進剤を用いることによって、高い反応性を維持した高機能蛍光体を得ることが可能になった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、
表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有するナノ粒子。
【請求項２】
前記表面有機層が、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤と、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤とによる表面処理によって形成されたものであることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは一般式（Ｉ）中のＲ2と結合形成可能な基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
【請求項３】
前記コア部が金属酸化物で構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
Ｌ1が炭素数１から４のアルキレン基又は炭素数２から１０のポリオキシエチレン基、Ｌ2が炭素数５０から３００のポリオキシエチレン基である請求項１乃至３のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記第２の表面処理剤が、メトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシブチル酸、メトキシエトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシエトキシブチル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸及び３−ヒドロキシヘプタン酸から選択された少なくともひとつであることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記第３の表面処理剤が、カルボキシ−ＰＥＧ−アミン、カルボキシ−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボキシ−ＰＥＧ−カルボン酸、カルボキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミド及びカルボキシ−ＰＥＧ−チオールから選択された少なくともひとつであることを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項７】
金属酸化物が酸化亜鉛であり、前記第１の表面処理剤がＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン及び３−アミノプロピルトリエトキシシランから選択された少なくともひとつであることを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記被標識物質が、生体関連分子であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項９】
コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子の製造方法であって、
下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤を用いて、前記コア部及び表面有機層で構成された前駆体粒子を形成すること、
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。）
前記前駆体粒子に対して、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理を行って、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基で表される表面反応性基を形成すること、
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは粒子表面の官能基と結合形成可能な基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
を含むことを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【請求項１】
コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子であって、
表面有機層に、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基（式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す）で表される表面反応性基を有するナノ粒子。
【請求項２】
前記表面有機層が、下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤と、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤とによる表面処理によって形成されたものであることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは一般式（Ｉ）中のＲ2と結合形成可能な基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
【請求項３】
前記コア部が金属酸化物で構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
Ｌ1が炭素数１から４のアルキレン基又は炭素数２から１０のポリオキシエチレン基、Ｌ2が炭素数５０から３００のポリオキシエチレン基である請求項１乃至３のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記第２の表面処理剤が、メトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシブチル酸、メトキシエトキシエトキシ酢酸、メトキシエトキシエトキシプロピオン酸、メトキシエトキシエトキシブチル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシブチル酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸及び３−ヒドロキシヘプタン酸から選択された少なくともひとつであることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記第３の表面処理剤が、カルボキシ−ＰＥＧ−アミン、カルボキシ−ＰＥＧ−アルデヒド、カルボキシ−ＰＥＧ−カルボン酸、カルボキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、カルボキシ−ＰＥＧ−マレイミド及びカルボキシ−ＰＥＧ−チオールから選択された少なくともひとつであることを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項７】
金属酸化物が酸化亜鉛であり、前記第１の表面処理剤がＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン及び３−アミノプロピルトリエトキシシランから選択された少なくともひとつであることを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記被標識物質が、生体関連分子であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載のナノ粒子。
【請求項９】
コア部とその表面を被覆する表面有機層とで構成されたナノ粒子の製造方法であって、
下記一般式（Ｉ）で表される第１の表面処理剤を用いて、前記コア部及び表面有機層で構成された前駆体粒子を形成すること、
一般式（Ｉ）
Ｍ−（Ｒ2）4
（上記式中、ＭはＳｉ又はＴｉ原子を、Ｒ2は有機性基を示す。Ｒ2はそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、Ｒ2のうちの少なくとも１つは他の有機性基と反応性を有する官能基を示す。）
前記前駆体粒子に対して、下記一般式（II）で表される第２の表面処理剤及び下記一般式（III）で表される第３の表面処理剤による表面処理を行って、Ｒ1Ｏ−Ｌ1−基及びＹ−Ｌ2−基で表される表面反応性基を形成すること、
一般式（II）
Ｒ1Ｏ−Ｌ1−Ｘ
一般式（III）
Ｘ−Ｌ2−Ｙ
（上記式中、Ｌ1及びＬ2は、Ｌ1＜Ｌ2の長さ関係を満たす二価の連結基を表す。Ｒ1は炭素数１から３のアルキル基又は水素原子を表す。Ｘは粒子表面の官能基と結合形成可能な基を表す。Ｙは被標識物質と反応性を有する基を表す。）
を含むことを特徴とするナノ粒子の製造方法。
【公開番号】特開２００７−１１２６７９（Ｐ２００７−１１２６７９Ａ）
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０７６９５（Ｐ２００５−３０７６９５）
【出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２１日（２００５．１０．２１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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