ネトリン−１による内皮細胞死の誘導物質選択方法およびその適用
本発明は、内皮細胞、好ましくは血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するインビトロでの方法に関する。本発明は、更に内皮細胞、好ましくはネトリン−１を発現する腫瘍の血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物としてのネトリン−１の機能阻害剤の使用を含んでなる。最後に、本発明は、内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮細胞、好ましくは血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのインビトロ（in vitro）の方法に関する。本発明は更に、内皮細胞、好ましくはネトリン−１を発現する腫瘍の血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物としてのネトリン−１の機能阻害剤の使用も含んでなる。最後に、本発明は、内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
軸索誘導分子として最初に報告されたネトリン−１は、分枝器官の形態発生における役割から血管形成における機能までの範囲の神経外過程においても機能することが最近示されている（Cirulli and Yebra, 2007; Liu et al., 2004; Lu et al., 2004; Wilson et al., 2006）。興味深いことには、血管形成中のネトリン−１の役割に関して矛盾する結果が報告された。しかしながら、以下の２つの明らかな発生学的結果は、最初はちぐはぐであると思われた：Ｅｉｃｈｍａｎｎ、Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅと共同研究者らは、マウスにおけるＵＮＣ５Ｂの発生学的不活性化は血管形成の増加と関係しており、それによってネトリン−１の抗血管形成活性が示唆されることをあざやかに立証したが、Ｌｉと共同研究者らは、ＵＮＣ５Ｂのリガンドをコードするネトリン−１ａの不活性化は、ゼブラフィッシュ発生中の血管の喪失と関係していることを示した（Lu et al., 2004; Wilson et al., 2006）。
【０００３】
血管形成は、多数の様々な疾病状態の開始および／または拡散における重要な要因であるので、信頼性のあるやり方で血管形成を制御しまたは阻害することができる治療組成物が必要である。実際に、血管形成の過程は、多数の疾病状態で変更されることが分かっており、多くの場合に、疾病と関連する病理学的損傷は抑制されていない血管形成に関係している。例えば、腫瘍は成長するためには新たな毛細血管の成長を刺激し続けなければならないので、血管形成は腫瘍成長における一因子である。従って、血管または新生血管の内皮細胞の死を促進しまたは誘発することができる化合物は、新たな毛細血管の成長を阻害することができ、これらの疾患の治療に有用なことがある。
【発明の開示】
【０００４】
従って、本発明の目的は、内皮細胞死の誘導物質としての活性を示す化合物および医薬組成物を提供することである。
【０００５】
本発明者らは、報告された、ネトリン−１が血管形成促進性または抗血管形成性であるという矛盾した結論を生じた明らかに対立する観察結果は、ネトリン−１が内皮細胞の生存因子として作用し、一方、その未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体が細胞のアポトーシスを誘発するという事実から生じていることを明らかにした。血管発生に対するネトリン−１の効果は、エクスビボ（ex vivo）アッセイにおけるカスパーゼ阻害剤に似ており、カスパーゼ活性の阻害またはＵＮＣ５Ｂ受容体のようなネトリン−１受容体のサイレンシングは、いずれもゼブラフィッシュにおけるネトリン−１サイレンシングによって誘発される血管発芽欠損を救済するのに十分である。
【０００６】
従って、未結合ＵＮＣ５Ｂのアポトーシス促進効果と内皮細胞上のネトリン−１に結合したＵＮＣ５Ｂとの生存効果は、血管形成過程中に協同するものと思われる。
【０００７】
第一の態様では、本発明は、ネトリン−１が血管形成中の内皮細胞アポトーシスを阻害することを見出したことに基づく内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するインビトロでの方法に関する。
【０００８】
従って、本発明は、内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択するインビトロでの方法であって、
ａ）ネトリン−１、またはその断片、および内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、
ｃ）前記内皮細胞の死を測定し、および
ｄ）段階ｃ）における測定が前記化合物の存在下にて内皮細胞死の有意な誘発を示しているときに、前記化合物を選択する
段階を含んでなる、方法に関する。
【０００９】
特定態様では、試験する化合物の存在によって誘発される細胞死は、下記の材料および方法「細胞死分析」の項に示されているトリパンブルー染色法を用いることによって分析しまたは評価することができる（Mehlen et al., Nature, 1998も参照されたい）。
【００１０】
もう一つの態様では、本発明は、内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、
ｃ）前記の試験する化合物のこのネトリン−１受容体のアポトーシス促進活性を促進する能力を測定し、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物が、このネトリン−１受容体の、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてこのネトリン−１受容体の、アポトーシス促進活性を有意に促進することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法に関する。
【００１１】
もう一つの態様では、本発明は、
段階ｃ）の測定が、試験する化合物の細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の活性化を誘発する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にて細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の有意な活性化を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質インデューサーとして選択する、
本発明による内皮細胞の死を誘発することができる化合物の選択方法に関する。
【００１２】
もう一つの態様では、本発明は、
段階ｃ）の測定が、試験する化合物のＤＡＰＫリン酸化を阻害する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてＤＡＰＫリン酸化の有意な阻害を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する、
請求項２に記載の内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法に関する。
【００１３】
もう一つの態様では、本発明は、内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、かつ前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインがネトリン−１の存在下にて二量体化または多量体化することができ、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、培地が更にネトリン−１、またはネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるその断片を含み、
ｃ）前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化が上記の試験する化合物の存在下で阻害されるかどうかを決定し、および
ｄ）段階ｃ）における決定が、前記内皮細胞の前記ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化または多量体化を有意に阻害することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法に関する。
【００１４】
試験する化合物の存在下における前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化の阻害の決定分析は、例えば、２００７年９月７日に公表された特許文献Mehlen et al., ＷＯ２００７／０９９１３３号に見出すことができる。
【００１５】
好ましい態様では、段階ａ）の培地はネトリン−１を更に含む。
【００１６】
もう一つの好ましい態様では、本発明による内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択する方法において、前記化合物は血管または新生血管の死を誘発することができる。
【００１７】
好ましい態様では、本発明による方法の段階ａ）において、前記内皮細胞は、ＤＣＣ(Deleted in Colorectal Cancer)、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択される少なくとも１種類のネトリン−１受容体、好ましくはＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である。
【００１８】
ヒトネトリン−１、またはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂ（Ｕｎｃ−５ホモログ１、２および３はＵｎｃ−５ホモログＡ、ＢおよびＣと同義である）のようなヒトネトリン受容体のアミノ酸配列は、当業者に周知である。特定ドメインの局在化を有するこれらのアミノ酸配列の例は、例えば、ヒトネトリン−１についてはＧｅｎｂａｎｋに受入番号ＡＡＤ０９２２１またはＮＰ００４８１３、ヒトネトリン受容体ＤＣＣ前駆体についてはＮＰ＿００５２０６、ヒトネトリン受容体Ｕｎｃ−５ホモログ１についてはＮＰ５８８６１０、ネトリン受容体Ｕｎｃ−５ホモログ２についてはＱ８ＩＺＪ１、およびＵｎｃ−５ホモログ３についてはＯ９５１８５、およびヒトＵＮＣ５ＤについてはＡＡＱ８８５１４により見出すことができる。
【００１９】
更に好ましくは、ネトリン−１受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である。
【００２０】
もう一つの好ましい態様では、本発明による方法において、段階ａ）の前記内皮細胞は、ヒトまたはニワトリの内皮細胞からなる群、好ましくはヒトまたはニワトリ血管または新生血管、更に好ましくはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）またはヒナドリ漿尿膜から選択される内皮細胞である。
【００２１】
第二の態様では、本発明は、
ネトリン−１と上記ネトリン−１受容体との相互作用を特異的に阻害することができるネトリン−１受容体またはその断片の細胞外ドメインを含んでなる化合物、
ネトリン−１またはネトリン−１受容体に対して特異的な、特に前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインまたは前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるネトリン−１断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
ネトリン−１タンパク質をコードする核酸に特異的なアンチセンスおよびＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）オリゴヌクレオチドからなる群から選択されるネトリン−１発現を阻害することができる化合物
からなる群から選択される、内皮細胞死の誘導物質としての、化合物を含んでなる。
【００２２】
好ましくは、本発明は、血管または新生血管の死を誘発する内皮細胞死の誘導物質としての化合物に関する。
【００２３】
更に好ましい態様では、本発明は、腫瘍の血管または新生血管の死の誘導物質としての化合物に関する。
【００２４】
もう一つのより好ましい態様では、前記腫瘍の腫瘍細胞はネトリン−１を発現または過剰発現する。
【００２５】
「ネトリン−１と前記ネトリン−１受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができる」という表現におけるネトリン−１とそのネトリン−１受容体との間の相互作用という用語は、本明細書では、一般にリガンドとその受容体との間の特異的結合による相互作用を表すことを指している。この相互作用の阻害は、一般的には、特に競合的リガンド（前記ネトリン−１受容体のこの細胞外膜ドメインに対する抗体など）の存在下、またはネトリン−１（そのネトリン−１受容体の可溶性細胞外膜ドメイン、またはその部分など）と特異的複合体を形成することができる化合物の存在下にて、ネトリン−１のその受容体への結合の完全または部分的阻害によって得ることができる。
【００２６】
前記ネトリン−１受容体断片は、ネトリン−１受容体の細胞外ドメイン、またはネトリン−１と特異的に相互作用することができるその部分を含んでなるか、またはそれらである。
【００２７】
前記ネトリン−１および／または前記ネトリン−１受容体は、好ましくは哺乳類由来であり、特にマウス、ラットまたはヒト由来であり、更に好ましくはヒト由来である。前記ネトリン−１は、組換えネトリン−１であることができる。前記ネトリン−１は、ニワトリ由来であることもできる。
【００２８】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちネトリン−１タンパク質またはその受容体と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を表す。
【００２９】
「抗体」という用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体だけでなく、キメラまたはヒト化抗体をも含んでなる。
【００３０】
単離したネトリン−１タンパク質またはネトリン−１受容体タンパク質、またはそれらの特異的断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的手法を用いてこのようなタンパク質を結合する抗体を生成するための免疫原として用いることができる。また、これらの特異抗体を生成するのに用いてもよい少なくとも１種類の抗原決定基を含むこれらのタンパク質の任意の断片を用いてもよい。
【００３１】
タンパク質免疫原は、典型的には、適当な被検体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）を免疫原で免疫することによって抗体を調製するのに用いられる。適当な免疫原製剤は、前記タンパク質またはその断片を含むことができ、更にフロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバント、または同様な免疫刺激剤を含むこともできる。
【００３２】
従って、本発明によって用いられる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナルキメラまたはヒト化抗体が挙げられる。ネトリン−１タンパク質またはその受容体のアミノ酸配列の少なくとも８〜１０個のアミノ酸の連続スパンを含んでなるポリペプチドを含むエピトープに選択的に結合することができるまたは選択的に結合している抗体。インタクト（intact）抗体またはその機能性断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ）を用いることができる。
【００３３】
例えば、候補オリゴヌクレオチドの検出のためのインビトロ手法としては、ノーザンまたはサザンブロットハイブリダイゼーションおよびインサイチュー（in situ）ハイブリダイゼーションが挙げられる。候補タンパク質の検出のためのインビトロ手法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈澱および免疫蛍光が挙げられる。
【００３４】
アンチセンスは、ネトリン−１コード配列のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、またはその相補性配列に特異的にハイブリダイズする長さが少なくとも１０、１５または２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであることができる。ネトリン−１コード配列の対応する断片と少なくとも９５％、９８％、９９％および１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３５】
干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がその相補性配列を有する遺伝子の発現を特異的に抑制する現象である。ＲＮＡｉは、従って多くの生物の有用な研究手段となっている。ｄｓＲＮＡにより遺伝子発現を抑制する機構は完全には理解されていないが、実験データは重要な識見を提供している。この手法は、哺乳類細胞における遺伝子機能を研究する手段として大きな可能性を有しており、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）に基づく薬剤の開発へと導くことができる。
【００３６】
好ましくは、本発明の化合物において、ネトリン−１受容体またはその断片の前記細胞外ドメインは、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂからなる群から選択され、更に好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５ＢおよびＵＮＣ５Ｃの群から選択される。ＵＮＣ５Ｂが、さらにより好ましい。
【００３７】
もう一つの態様では、本発明は、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含む腫瘍に罹っている患者を治療するための癌の進行を阻害することを目的とする医薬組成物の調製のための本発明による化合物に関する。
【００３８】
好ましくは、前記癌は、乳癌、結直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性脊髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌、膵腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、肝腺癌および直腸腺癌からなる群から選択される。
【００３９】
好ましくは、前記癌は転移性または侵攻性癌である。
【００４０】
本発明の化合物を患者に投与するときには、場合によっては薬学上許容可能なビヒクルを含んでなる組成物の成分として投与するのが好ましい。この組成物は、経口または任意の他の好都合な経路によって投与することができ、別の生物活性剤と共に投与してもよい。投与は、全身または局所的であることができる。例えば、リポソームでのカプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルなどの様々な送達系が知られており、選択された本発明の化合物またはその薬学上許容可能な塩を投与するのに用いることができる。
【００４１】
投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、経口、舌下、鼻内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または局所的投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与様式は、現場実務者の裁量に任される。ほとんどの場合に、投与によって、化合物は血流中にまたは直接原発性腫瘍に放出される。
【００４２】
本発明による、または本発明による方法によって選択された化合物を含んでなる組成物も、本発明の部分を形成する。これらの組成物は、薬学上許容可能なビヒクルの適量をさらに含んでなり、患者に適正に投与するための形態を提供するようにすることもできる。「薬学上許容可能な」という用語は、規制当局によって認可され、または動物、哺乳類、更に詳細にはヒトで使用するための国定または承認された薬局方に記載されていることを意味する。「ビヒクル」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはキャリヤーであって、これによって本発明の化合物を投与するものを表す。このような薬学ビヒクルは、水および油のような液体であり、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など石油、動物、植物または合成起源のものであることができる。薬学ビヒクルは、塩水、ゼラチン、澱粉などであることができる。更に、補助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤および着色料を用いてもよい。食塩溶液、水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射溶液の液体ビヒクルとして用いることもできる。適当な薬学ビヒクルとしては、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水などの賦形剤も挙げられる。試験化合物の組成物は、所望ならば、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。本発明の組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体を含むカプセル、散剤、徐放性処方物、座薬、エマルション、エアゾール、スプレー、懸濁液の形態、または使用に適当な任意の他の形態を採ることができる。前記組成物は、通常は経口投与または静脈内投与の目的でヒトに適合させた医薬組成物として常法に準じて処方される。活性化合物の量または治療に有効となる量は、標準的臨床手法によって決定することができる。更に、インビトロまたはインビボ（in vivo）アッセイを場合によって用いて、最適用量範囲を確認しやすくすることができる。用いられる正確な用量は投与経路および疾病の重篤度によって変化し、現場実務者の判断およびそれぞれの患者の環境によって決定されるべきである。しかしながら、経口、鼻内、皮内または静脈内投与は、通常は約０．０１〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重／日、更に好ましくは約０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００４３】
第三の態様では、本発明は、内皮細胞、好ましくは血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのキットであって、
ネトリン−１タンパク質またはネトリン−１受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるその断片、および
ネトリン−１受容体、好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂからなる群から選択され、更に好ましくは受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞
を含んでなる、キットに関する。
【００４４】
好ましい態様では、前記キットは、内皮細胞ＨＵＶＥＣまたはＨＵＡＥＣ細胞を含んでなる。
【００４５】
本発明を上記態様に関して説明してきたが、上記説明および下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内における他の態様、利点および変更は、本発明が関係する当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｈ：ネトリン−１は、恐らくはＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスを阻害することにより内皮細胞アポトーシスを防止する。 図１Ａ：ヒト臍帯静脈／動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ）はＵＮＣ５ＡおよびＵＮＣ５Ｂ依存性受容体を発現するが、ネトリン−１を発現しない。定量ＲＴ−ＰＣＲは、実験手順に記載の通りに行った。
【図１Ｂ】図１Ｂ：ネトリン−１投与は、トリパンブルー排除によって測定される血清飢餓時に見られるＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ細胞死を阻害する。少なくとも１００個の細胞／条件を計数した。相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として示す。＊:ｐ値＜０．００５；＊＊：ｐ値＜０．０００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｃ】図１Ｃ：ネトリン−１は、ＴＵＮＥＬ染色によって測定したＨＵＶＥＣにおけるアポトーシスを防止する。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍである（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｄ】図１Ｄ：ネトリン−１投与により、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるカスパーゼ−３活性が減少する。カスパーゼ−３活性の相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として表される。開裂したカスパーゼ−３陽性細胞の免疫染色および相対指数（平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ）が示される（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｅ】図１Ｅ：ネトリン−１投与により、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるカスパーゼ−３活性が減少する。カスパーゼ−３活性の相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として表される。開裂したカスパーゼ−３陽性細胞の免疫染色および相対指数（平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ）が示される（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｆ】図１Ｆ：ｓｉＲＮＡによる、ＵＮＣ５Ａではなく、ＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、カスパーゼ−３活性の減少と関連している。値は、平均値およびｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）である。総て、ｐ＜０．０５（コントロール条件におけるレベルと比較したＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｇ】図１Ｇ：ＤＡＰキナーゼは、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスを介在する。ＤＡＰキナーゼΔＣａＭ（ＤＡＰキナーゼの構成性の活性突然変異体型）およびＤＡＰキナーゼＤＤ（ＤＡＰキナーゼのドミナントネガティブ型）の強制発現後の内皮細胞における細胞死（Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔ）。値は平均値およびｓ．ｅ．ｍ．である。総て、ｐ＜０．００１（コントロール条件におけるレベルと比較したＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｈ】図１Ｈ：ネトリン−１投与により、ＤＡＰキナーゼリン酸化が誘発される。抗ホスホ−ＤＡＰキナーゼを用いて、酵素活性のレベルを測定した。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆ：カスパーゼ阻害剤およびＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、新生血管形成におけるネトリン−１効果に似ている。 図２Ａ：ネトリン−１またはカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＢＡＦは、エクスビボでのネズミ大動脈リングマトリゲルアッセイにおける微小血管形成を促進する。少なくとも８種類のマウスから切除された大動脈リングを、条件毎に示す。微小血管全長（ピクセル単位）の定量は、実験手順に記載の通りに行った。総てのｐ値を示す（χ２検定）。
【図２Ｂ】図２Ｂ：ネトリン−１またはカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＢＡＦは、エクスビボでのネズミ大動脈リングマトリゲルアッセイにおける微小血管形成を促進する。少なくとも８種類のマウスから切除された大動脈リングを、条件毎に示す。微小血管全長（ピクセル単位）の定量は、実験手順に記載の通りに行った。総てのｐ値を示す（χ２検定）。
【図２Ｃ】図２Ｃ：ネトリン−１およびカスパーゼ阻害剤は、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を誘発する。ＣＡＭモデルは、材料および方法に記載の通りに処理した８日齢のヒナドリ胚（ｎ≧１０）を用いて調製した。メチルセルロースディスクに輪郭を描く。デノボ（de novo）血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ≧１３フィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。＊：ｐ値＜０．０２；＊＊：ｐ値＜０．０００５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図２Ｄ】図２Ｄ：ネトリン−１およびカスパーゼ阻害剤は、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を誘発する。ＣＡＭモデルは、材料および方法に記載の通りに処理した８日齢のヒナドリ胚（ｎ≧１０）を用いて調製した。メチルセルロースディスクに輪郭を描く。デノボ血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ≧１３フィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。＊：ｐ値＜０．０２；＊＊：ｐ値＜０．０００５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図２Ｅ】図２Ｅ：ｓｉＲＮＡによるＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を増加する。実験手順に記載の通りに３回のｓｉＲＮＡ注射をＥ．５とＥ．９との間に行った。スクランブルｓｉＲＮＡを、コントロールとして用いた。デノボ血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ＞３０異なるフィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。Ｐ値＝０．００９（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図２Ｆ】図２Ｆ：ｓｉＲＮＡによるＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を増加する。実験手順に記載の通りに３回のｓｉＲＮＡ注射をＥ．５とＥ．９との間に行った。スクランブルｓｉＲＮＡを、コントロールとして用いた。デノボ血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ＞３０異なるフィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。Ｐ値＝０．００９（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃ：ノックダウンネトリン−１ａゼブラフィッシュ胚の表現型は、アポトーシスの阻害によって救済される。 ｆｌｉ：ｅｇｆｐゼブラフィッシュ胚を、１〜４細胞期でコントロール（ｃｔｌ）、スプライス（ｓｐｌ）または翻訳（ｔｓｌ）遮断ネトリン１ａ、ＵＮＣ５ＢおよびＤＡＰキナーゼモルホリノと共に単独でまたは組み合わせて投与した。表現型を、２４〜５４ｈｐｆに分析した。主要血管構造の典型的なイメージを示す。左が先。カスパーゼ阻害剤ＢＡＦは、ネトリン−１ａ ｓｐｌモルホリノを投与したゼブラフィッシュ胚では傍脊索血管形成（星印）を回復し（図３Ａ）、ネトリン−１ａ ｔｓｌモルホリノを投与したゼブラフィッシュ胚ではＩＳＶ形成を回復する（図３Ｂ）。同様の表現型の救済は、ゼブラフィッシュ胚におけるＵＮＣ５ＢまたはＤＡＰキナーゼおよびネトリン１ａ ｔｓｌ遮断モルホリノの同時投与によって観察された（図３Ｂ）。 図３Ａ：定量を示す。ｐ値を示す（χ２検定）。
【図３Ｂ】図３Ｂ：定量を示す。ｐ値を示す（χ２検定）。
【図３Ｃ】図３Ｃ：ＢＡＦ処理またはＵＮＣ５Ｂ遮断モルホリノ投与は、ＴＵＮＥＬ染色（左パネル）またはカスパーゼ−３活性（右パネル）によって示されるようにゼブラフィッシュ胚におけるネトリン１ａ ｔｓｌ遮断モルホリノ投与後に観察されるアポトーシスの増加を阻害する。カスパーゼ−３活性は、ネトリン−１ａ ｔｓｌモルホリノのみを投与した胚に関する相対指数として表される。平均値およびｓ．ｅ．ｍ．は、３回の独立した実験から計算される。ｐ値を示す（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｇ：ネトリン−１は、ＵＮＣ５Ｂによって引き起こされる内皮細胞アポトーシスを防止する。 図４Ａ〜４Ｂ：ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞におけるネトリン−１発現の評価。 図４Ａ：特異的ネトリン−１抗体を用いる免疫蛍光を用いた。ネトリン−１標識は、ＭＲＣ−５肺繊維芽細胞系とは反対に、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞では検出されなかった。
【図４Ｂ】図４Ｂ：培地に分泌されたネトリン−１の定量は、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のネトリン−１（ヒト）ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。
【図４Ｃ】図４Ｃ：ネトリン−１処理により、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるカスパーゼ−３活性は用量依存的に減少する。カスパーゼ−３活性の相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍと表される（ｎ＝３）。＊：ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００２５（コントロール条件におけるレベルと比較したＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図４Ｄ】図４Ｄ：ネトリン−１処理により、５０μＭエトポシドで一晩処理したときに見られたＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ細胞死が阻害される。細胞死は、実験手順に記載のＴｏｘｉｌｉｇｈｔアッセイを用いて評価する。相対指数は、平均値およびｓ．ｅ．ｍである（ｎ＝３）（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図４Ｅ】図４Ｅ：ラットＵＮＣ５Ｈ２の細胞外ドメインに対応する組換えタンパク質の添加により、ネトリン−１によって介在される細胞死阻害が防止される。結果は、それぞれの場合にコントロールに対する相対指数として表される（平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ，ｎ＝３、ｔ検定）。
【図４Ｆ】図４Ｆ：スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたコントロール細胞と比較したＵＮＣ５ＢｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞におけるＵＮＣ５Ｂ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。トランスフェクションの効率を示す、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞におけるＧＦＰ発現の典型的画像。
【図４Ｇ】図４Ｇ：スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたコントロール細胞と比較したＵＮＣ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞におけるＵＮＣ５Ａ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃ：エクスビボセッティングにおけるＵＮＣ５Ｂの発現。 図５Ａ：大動脈リングでのＵＮＣ５Ｂ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図５Ｂ】図５Ｂ：ＣＡＭでの定量ＲＴ−ＰＣＲによるネトリン−１、ＵＮＣ５Ｈ２（マウスＵＮＣ５Ｂ）およびＤＡＰキナーゼ発現の分析。ネトリン−１とは反対に、ＵＮＣ５Ｈ２およびその下流エフェクターが発現する。
【図５Ｃ】図５Ｃ：ＣＡＭでのＵＮＣ５Ｂ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析、およびスクランブルｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションしたコントロールと比較したＣＡＭでのＵＮＣ５Ｂ発現に対する血液循環に投与したＵＮＣ５ＢｓｉＲＮＡの効果。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄ：ゼブラフィッシュ胚におけるネトリン−１ａおよびＵＮＣ５Ｂモルホリノの効果。 図６Ａ：ネトリン−１ｂは、ゼブラフィッシュにおける発生上の血管形成に関与しているとは思われない。翻訳遮断ネトリン−１ｂモルホリノは、発生上の血管形成に対して重大な欠損を持っていない。欠損のない胚の割合および分析した胚の総数を示す。ネトリン−１オーソログ(otholog)遺伝子の系統発生的研究。１００ブートストラップ複製を用いるＪＴＴモデルでのタンパク質配列に関するＭＬ。ゼブラフィッシュにおけるネトリン−１オーソログであるネトリン−１ａおよびネトリン−１ｂには、下線を付けている。
【図６Ｂ】図６Ｂ：ゼブラフィッシュ胚におけるネトリン−１ａおよびＵＮＣ５Ｂ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図６Ｃ】図６Ｃ：第三のネトリン−１ａ遮断モルホリノは、図３Ａ〜３Ｃに記載のものと同様な血管の欠損を生じる。ＩＳＶ欠損を有する胚の割合および分析した胚の総数を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄ：ネトリン−１ａサイレンシングは、全ゼブラフィッシュ胚のカスパーゼ−３活性を増加させる。カスパーゼ−３活性は、コントロールＭＯを投与した胚に関する相対指数として表される。平均値およびｓ．ｅ．ｍ．は、３回の独立した実験から計算される。
【図７】ＤＣＣ−５Ｆｂｎデコイペプチドは、内皮細胞に対するネトリン生存効果を逆転させる。ＨＵＶＥＣにおけるネトリン−１によるカスパーゼ−３活性化の減少は、ＤＣＣの第五の細胞外免疫グロブリンドメインに対応するデコイペプチドＤＣＣ−５Ｆｂｎによる細胞の同時処理によって減少する。カスパーゼ−３活性の相対的減少割合は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍとして表される（ｎ＝３）。Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定：ｐ＜０．０１５。
【００４７】
材料および方法
Ａ）内皮細胞培養およびトランスフェクション
内皮細胞培養およびトランスフェクション：
ヒト臍帯静脈および動脈細胞（Promocell，継代数＜８）を、２％血清（キット、Promocell）を補足した内皮細胞成長培地（ECGM,Promocell）で８０％コンフルエンスに達するまで培養した。ＨＵＶＥＣを、ＡＭＡＸＡ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを用いて製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。簡単に説明すれば、５００，０００個の細胞を１００μｌのＨＵＶＥＣ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁し、１μｇｓｉＲＮＡまたは１．５μｇプラスミドＤＮＡおよび０．５μｇＧＦＰコードコントロールプラスミドを用いてトランスフェクションした。ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５ＢおよびスクランブルｓｉＲＮＡは、Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏによってデザインされた。突然変異体ＤＡＰキナーゼ（ＤＡＰキナーゼΔＣａｍおよびＤＡＰキナーゼＤＤ）をコードするプラスミドは、以前に記載された（Llambi et al.,2005）。トランスフェクション後、細胞を１％成長培地で培養し、２４時間後に回収した。
【００４８】
Ｂ）細胞死アッセイ
細胞死アッセイは、上記に記載の通りに行った。簡単に説明すれば、内皮細胞を、１０，０００個／ｃｍ２を完全培地に１６時間播種した。細胞死は、無血清培地（内皮細胞基礎培地、Promocell）での飢餓によりまたは５０μＭエトポシドに暴露することにより誘発した。ネトリン−１は、Ａｘｘｏｒａ−Ａｐｏｔｅｃｈから購入した。細胞死は、上記の通りにトリパンブルー排除アッセイによって評価した。ＤＮＡ断片化を検出するため、カバーグラス上で培養した処理済み細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に２０分間固定し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）を、３００Ｕ／ｍｌＴＵＮＥＬ酵素（３００Ｕ／ｍｌ）および６μＭビオチニル化ｄＵＴＰ(Roche Diagnostics)で行った。カスパーゼ−３活性を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国）製ＡｐｏＡｌｅｒｔ ＣＰＰ３２キットを用いて、文献記載の抗活性カスパーゼ−３抗体（Cell signaling）を用いる固定細胞での免疫染色によって測定した（Llambi et al.,2005; Tauszig-Delamasure et al.,2007）。Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔアッセイは、製造業者の指示に従って行った(Lonza)。ネトリン−１滴定実験のため、ラット組換えＵＮＣ５Ｈ２−Ｆｃ(R&D)を１μｇ／ｍｌで用いた。
【００４９】
Ｃ）ウェスタンブロット分析および免疫蛍光
１０，０００個／ｃｍ２で播種し、無血清培地（内皮細胞基礎培地，Promocell）中でネトリン−１と共に２４時間処理したまたは処理しなかった内皮細胞を回収して、プロテアーゼ阻害剤の存在下にて５０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１２５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＮＰ−４０緩衝液中で溶解した。タンパク質抽出物を、抗ＤＡＰ−キナーゼおよび抗ホスホ−ＤＡＰキナーゼ抗体(Sigma)で免疫ブロットした。免疫蛍光分析のため、細胞をＬａｂＴｅｋチャンバースライド上に播種し、４％ＰＦＡで１５分間固定した。抗ネトリン−１ラットモノクローナル抗体（R&D）を１／１５０の希釈倍率で用い、特異的二次抗体（Alexa488 Donkey anti-Rat,Molecular Probes-Invitrogen）を用いて可視化した。
【００５０】
Ｄ）定量ＲＴ−ＰＣＲ
ＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ、大動脈リング、ＣＡＭおよびゼブラフィッシュ胚におけるネトリン−１、依存性受容体、ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ａ−Ｄ、およびＤＡＰキナーゼ発現を評価するため、総ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡＩＩキット(Macherey-Nagel)を用いて抽出し、１μｇをｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット(BioRad)を用いて逆転写した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡＭａｓｔｅｒＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩキット(Roche)を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０装置(Roche)上で行った。総ての最適増幅のための反応条件並びにプライマー選択は、上記の通りに決定した。プライマーの配列は、必要であれば入手可能である。
【００５１】
Ｅ）大動脈リングアッセイ
大動脈リングアッセイは、Ｎｉｃｏｓｉａと共同研究者らによって記載されている方法によって行った（Nicosia and Ottinetti,1990）。大動脈は６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスから切除し、外膜周囲の脂肪および結合組織を除去し、ＥＣＧＭで２回洗浄し、１〜１．５ｍｍの長さのリングに切断した。成長因子減少マトリゲル（Growth factor reduced Matrigel; BD Biosciences）１００μｌを、４８穴組織培養プレート(Costar)のそれぞれのウェルに添加し、３７°Ｃで３０分間固化させた。大動脈リングをマトリックス層に置き、Ｍａｔｒｉｇｅｌ１００μｌに埋設し、完全成長培地(ECGM,Promocell)で２４時間回復させた。次いで、それらをネトリン−１（１５０ｎｇ／ｍｌ）、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Tebu；２０ｎＭ）、ＢＡＦ（Sigma；２０ｎＭ）またはＶＥＧＦ（Sigma；１３ｎｇ／ｍｌ）で処理しまたは処理せずに、４日目に位相差顕微鏡で写真を撮った。微小血管生長の全長は、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎＲｅｌｅａｓｅ４．６ソフトウェアを用いて計算した。
【００５２】
Ｆ）ＣＡＭアッセイ
ヒナドリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイは、上記に記載の通りに行った。白色レグホンの卵を、加湿雰囲気下にて３７°Ｃでインキュベーションした。７２時間インキュベーションした後、３ｍｌの卵白を除去し、四角い窓を殻に開けた。開口部は、８日目までセロテープで閉じた。次いで、ネトリン−１（１５０ｎｇ／ｍｌ）、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Tebu；２０ｎＭ）、ＢＡＦ（Sigma；２０ｎＭ）またはＶＥＧＦ（Sigma）をＰＢＳで希釈し、等容のオートクレーブ処理した１％メチルセルロース溶液と混合した。コントロールは、ビヒクルのみで調製した。それぞれの試料溶液（１０μｌ）をパラフィルムに滴下して乾燥した。メチルセルロースディスクをパラフィルムから外して、８日齢ヒナドリ胚のＣＡＭ上に置いた。３日後、ＣＡＭを撮影して、血管形成応答をＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎＲｅｌｅａｓｅ４．６ソフトウェアを用いてメチルセルロースディスク下で二次異所性血管芽の数を測定することによって評価した。ＣＡＭにおけるＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、Ｅ．５、Ｅ．７およびＥ．９でのＣＡＭ血液循環中でＳｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏによってデザインされた特異的ｓｉＲＮＡを投与することによって行った。分析は、Ｅ．１１で行った。
【００５３】
Ｇ）ゼブラフィッシュ胚のモルホリノノックダウン
トランスジェニックｆｌｉ：ｅｇｆｐゼブラフィッシュをＺｅｂｒａｆｉｓｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ(オレゴン大学)から入手し、２８°Ｃで標準的飼育条件下に保持した(Lawson and Weinstein,2002)。胚をプロナーゼ酵素処理を用いてコリオン除去し、６ｎｇのスプライス／翻訳遮断ネトリン−１、ＵＮＣ５Ｂおよび予めデザインして特性決定したコントロールモルホリノを、単独でまたは組み合わせて１〜４細胞期の胚の高卵黄に投与した。第三のスプライス遮断モルホリノ特異ターゲッティングネトリン−１ａをデザインし(GeneTools)、同じ用量で胚に投与した。最後に、ＤＡＰキナーゼ(GeneTools)の翻訳遮断モルホリノターゲッティングゼブラフィッシュオーソログ３ｎｇを投与し、コントロールと比較してノックダウン胚におけるＤＡＰキナーゼｍＲＮＡ発現を３５％減少させた。モルホリノの配列は、必要であれば入手可能である。胚を０．００３％フェニルチオ尿素を補足したＥ３培地で培養し、色素形成を阻害した。ネトリン−１ａサイレンシングによって誘発される表現型の救済を、モルホリノ投与の４時間後にＥ３培地に４０ｎＭＢＡＦを加えることによって試験した。ＴＵＮＥＬ染色のため、胚を４％ＰＦＡ中で４８ｈｐｆで４°Ｃにて一晩固定した。次いで、それらをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％（ＰＢＳＴ）で１０分間洗浄し、連続的メタノール槽（２５、５０、７５および１００％）で累進的に脱水した。再水和（７５、５０および２５％メタノール系）の後、胚をＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ(Roche)で５分間処理し、ＰＢＳＴで再度洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ１％中で３０分間インキュベーションした。ＴＵＮＥＬ標識は、予め上記したとおりに行い、Ｃｙ３結合−ストレプトアビジン（１／４００；Jackson Immunoresearch）を用いて可視化した。カスパーゼ−３活性アッセイは、２４時間発生時に胚全体について上記の通りに行った。微速度撮影実験のため、ゼブラフィッシュ胚を０．０１６％トリカインを含む３％メチルセルロース溶液に埋設し、運動を抑制した(Isogai et al.,Development and Disease,2003)。透過ビデオ顕微鏡画像化を、Ｔｉｍｅｌａｐｓｅ Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００Ｍ(PLATIM,ENS Lyon)を用いて行った。
【００５４】
ＤＣＣ−５Ｆｂｎ産生：ＤＣＣ−５Ｆｂｎ産生は、標準的手順を用いて行うことができる。簡単に説明すれば、ＢＬ２１細胞をイミダゾールに応じてＤＣＣ−５Ｆｂｎを強制的に発現させ、ＢＬ２１溶解物をＦｌａｇ−アガロース(Sigma)を用いてアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
【実施例】
【００５５】
本発明者らは、本明細書において、これらの２つの明らかに対立する観察を、ネトリン−１の未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体によって誘発されるアポトーシスを遮断することにより、血管形成中に内皮細胞の生存を促進するネトリン−１の能力を説明することができるかどうかを検討した。実際に、ネトリン−１は、いわゆる依存性受容体ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ａ−Ｄについてのリガンドとして作用することによって上皮細胞死を予防し、それらのリガンドの存在下および非存在下のいずれにおいても活性な機能特性を共有しており、リガンド結合は正のシグナル伝達を誘発するが、依存性受容体は別のシグナル伝達カスケードを誘発し、それらの栄養リガンドから解放されたときに細胞死を生じる（Llambi et al.,2001; Mehlen et al.,1998; Tanikawa et al.,2003）（Bredesen et al.,2005; Mehlen and Bredesen,2004）。このスキームでは、ＵＮＣ５Ｂの喪失、すなわちアポトーシス促進シグナル伝達の喪失は、実際に血管数の増加と関連している（Lu et al.,2004）。一方、ネトリン−１の喪失、すなわちアポトーシス促進シグナル伝達の増加は、血管消失と関係していると予想される（Wilson et al.,2006）。このような内皮細胞生存とアポトーシスとの間の動的バランスは、血管の完全性の保持を助長する可能性があり、これはまた、以前に報告されているように血管発生および病理学的血管形成の際の血管ホメオスタシスにも重要である（Alavi et al.,2003; Carmeliet,2005; Duval et al.,2003; Santoro et al.,2007; Winn et al.,2005）。
【００５６】
例１：ネトリン−１はその未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体によって誘発される内皮細胞アポトーシスを遮断する
ネトリン−１がその未結合ＵＮＣＢ受容体によって誘発されるアポトーシスを遮断するかどうかを決定するため、どのネトリン−１依存性受容体、すなわちＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄが、ヒト臍帯静脈／動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ）で発現するかを最初に決定した。定量ＲＴ−ＰＣＲによって示されているように、ＵＮＣ５ＡおよびＵＮＣ５Ｂは、いずれもＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣで発現するが（図１Ａ）、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５ＤおよびＤＣＣを検出することはできなかった（データは示さず）。ネトリン−１は、これらの細胞では、ＲＮＡ（図１Ａ）またはタンパク質レベル（図４Ａ〜４Ｂ）でも発現しなかった。次いで、ネトリン−１が内皮細胞の生存因子として働くかどうかを、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣが血清飢餓下で経験する細胞死の自発的傾向を遮断するその能力を分析することによって検討した。ネトリンは、５０ｎｇ／ｍｌの用量が、生理学的かつ機能的であることが以前に報告されているので、総てのインビトロ実験でこの用量を用いた（(Serafini et al.,1996; Serafini et al.,1994）および図４Ｃ）。図１Ｂに示されているように、ネトリン−１は、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ両方の細胞死を阻害した（ｐ＜０．００５）。同様な結果は、エトポシドによって引き起こされる細胞死についても得られた（図４Ｄ）。ネトリン−１は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数の減少（図１Ｃ）およびカスパーゼ−３活性の減少（図１Ｄ〜１Ｅ）によって示されるように、内皮細胞のアポトーシスを防止した（ＨＵＶＥＣについては３０％までおよびＨＵＡＥＣについては４０％まで；総てｐ＜０．００５）。ＵＮＣ５Ｈ２の細胞外ドメインに対応する組換えタンパク質の添加により、ネトリン−１によって介在される細胞死の阻害が防止され、生存効果はネトリン−１に特異的であるという結論を支持していた（図４Ｅ）。従って、ネトリン−１は、内皮細胞に対して生存因子として働く。
【００５７】
ＵＮＣ５Ｂおよび／またはＵＮＣ５Ａが内皮細胞のアポトーシスを誘発するかどうかを決定するため、ｓｉＲＮＡ法を用いてそれらの発現を一過的にサイレンシングした（図１Ｆおよび図４Ｆ〜４Ｇ）。ＵＮＣ５Ｂサイレンシングにより、カスパーゼ−３活性は減少したが、ＵＮＣ５Ａ ｓｉＲＮＡはカスパーゼ−３活性に対して全く効果を示さなかった（図１Ｆ；総てｐ＜０．０５）。更に、ＵＮＣ５Ｂサイレンシングと一緒のネトリン−１の添加は、追加的生存効果と関連しなかった（図１Ｆ）。従って、内皮細胞に対するネトリン−１生存効果は、ＵＮＣ５Ｂ発現、および別の状況では未結合ＵＮＣ５Ｂによって誘発されるアポトーシスの阻害からの同様な結果によって変化する。ＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスはＤＡＰキナーゼによって介在されることが示されているので、最初にＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞で構成性の活性ＤＡＰキナーゼＤＡＰＫΔＣａＭを発現させた（Shohat et al.,2001）。図１Ｇに示されるように、ＤＡＰキナーゼの構成性の活性形態の発現により、細胞死が引き起こされた（総てｐ＜０．０００１）。次に、ＤＡＰキナーゼのドミナントネガティブ突然変異体ＤＡＰＫ ＤＤを強制発現させた（Llambi et al.,2005）。ネトリン−１処理と同様に、ＤＡＰＫ ＤＤは細胞死誘発を防止した。更に、ＵＮＣ５Ｂアポトーシス促進シグナル伝達は、ＤＡＰキナーゼ自動リン酸化の阻害を介するＤＡＰキナーゼの活性化によって介在されるので（Llambi et al.,2005）、次にＤＡＰキナーゼリン酸化レベルを測定した。図１Ｈに示されるように、ネトリン−１処理により、恐らくはＵＮＣ５Ｂアポトーシス促進シグナル伝達カスケードの遮断によってＨＵＶＥＣにおけるＤＡＰキナーゼリン酸化が増加した。ＵＮＣ５Ｂ突然変異体胚における血管数の増加が見られたことと一緒に（Lu et al.,2004）、これらのインビトロデータは、ネトリン−１が血管形成の際にＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスを遮断することができるという考察を支持している。
【００５８】
例２：ネトリン−１の血管形成促進効果は、カスパーゼ阻害およびＵＮＣ５Ｂサイレンシングに似ている
次に、ネトリン−１の血管形成促進活性が、細胞生存を促進するその能力に関するという概念を、新血管形成のエクスビボモデルを用いて検討した。最初に、マウス大動脈リングアッセイを用いて、大動脈外植片におけるＵＮＣ５ＢのネズミオーソログであるＵＮＣ５Ｈ２の発現を評価した（図５Ａ）。ネトリン−１は、外植片において発現されることは見られなかった（データは示さず）。ＶＥＧＦで観察されたのと同様に、ネトリン−１処理では、コントロール条件と比較してマトリゲルに埋設した大動脈リングから毛細血管の出芽が増大し（図２Ａ〜２Ｂ；ｐ＜０．００１）、ネトリン−１の血管形成促進活性を支持していた。興味深いことには、カスパーゼ阻害薬ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＢＡＦも新毛細血管形成を誘発し、ネトリン−１の効果に似ていた（図２Ａ〜２Ｂ；ｐ＜０．００２）。同じ結果は、ヒナドリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイで得られた（図２Ｃ〜２Ｄ、および発現分析についての図５Ｂ）。実際に、ＶＥＧＦ、ネトリン−１、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋまたはＢＡＦで浸漬したメチルセルロースディスク付近では、新血管形成の有意な増加が観察された（図２Ｃ〜２Ｄ；ｐ＜０．０２）。従って、これらのエクスビボ生理学的モデルでは、アポトーシスの阻害はネトリン−１の効果に十分似ていると思われる。更に、ＣＡＭでのｓｉＲＮＡによるＵＮＣ５Ｂサイレンシングにより新血管分枝が増加し（図５Ｃ）、ネトリン−１およびその受容体ＵＮＣ５Ｂは、血管形成過程中に拮抗的に作用する（図２Ｅ〜２Ｆ；ｐ＝０．００９）。
【００５９】
例３:ゼブラフィッシュ発生中のネトリン−１ａサイレンシングは、カスパーゼ阻害およびＵＮＣ５Ｂ／ＤＡＰキナーゼサイレンシングによって救済される血管欠損を生じる
ネトリン−１の血管形成促進および抗アポトーシス活性の間の原因と結果の関係をインビボで更に調査するため、抗アポトーシス処理がゼブラフィッシュ発生中にネトリン−１崩壊によって誘発される血管欠損を救済することができるかどうかを検討した。２種類のネトリン−１遺伝子オーソログであるネトリン−１ａおよびネトリン−１ｂは、ゼブラフィッシュで特性決定されている（Lauderdale et al.,1997; Strahle et al.,1997）。ネトリン−１ｂサイレンシングは血管発生に対して何ら明らかな効果を持たないが（図６Ａ）、ＥｉｃｈｍａｎのグループおよびＬｉのグループはそれぞれ異なるネトリン−１ａモルホリノを用いて、ネトリン−１ａのサイレンシングが血管発生欠損と関連していることを示した（Lu et al.,2004; Wilson et al.,2006）。スプライス遮断モルホリノ（ｓｐｌ−ネトリン−１ａ）を用いるネトリン−１ａサイレンシングは、傍脊索血管（parachordal vessels：ＰＡＶ）の形成を防止することが示されている（Wilson et al.,2006）。ｆｌｉ：ｅｇｆｐトランスジェニックゼブラフィッシュ、血管において特異的にＧＦＰの発現をターゲッティングするトランスジェニックモデル（Lawson and Weinstein,2002）を用いて、受精から５０〜５４時間後（ｈｐｆ）に、このようなｓｐｌ−ネトリン−１ａモルホリノを投与した胚の５７．３％がＰＡＶを欠いており（ｎ＝７５）、節間血管（intersegmental vessels：ＩＳＶ）および背側縦吻合血管（dorsal longitudinal anastomotic vessels：ＤＬＡＶ）の発生は正常である（図３Ａ）ことを観察した。ｓｐｌ−ネトリン−１ａを投与した胚を汎用カスパーゼ阻害剤ＢＡＦで処理すると、ＰＡＶ形成は、未処理胚での４２．７％と比較して処理済み胚の９２．６％（ｎ＝５４）で見られたので、この表現型を良好に逆転した（図３Ａ；ｐ＜０．０００１）。以前に報告されているように（Wilson et al.,2006）、翻訳遮断モルホリノ（ｔｓｌ−ネトリン−１ａ、図６Ｂ）並びに第三のネトリン−１ａ遮断モルホリノ（図６Ｃ）を用いるネトリン−１ａサイレンシングにより、ＩＳＶの組織崩壊、背側吻合血管（ＤＬＡＶ）の非存在（図３Ｂ）および発生上の欠損を生じた。ＩＳＶ発生の微速度撮影分析により、ＩＳＶの非存在または未熟成長停止（premature growth arrest）を確かめた（例４参照）。同様の欠損は、アポトーシスタンパク質スルビビンの小阻害剤についてノックダウンしたゼブラフィッシュ胚に以前に報告されていた（Ma et al.,2007）。更に、カスパーゼ−３活性の増加が、ネトリン−１ａノックダウン胚で観察された（図６Ｄ）。これらの胚のＢＡＦによる処理は、コントロールでの２３．０％と比較して処理済み胚の５４．５％が少なくとも部分的ＩＳＶを示したので（図３Ｂ；ｐ＜０．００１）、ＩＳＶ形成の救済に十分であった。依存性受容体概念に従って、ＵＮＣ５Ｂモルホリノの同時投与（図６Ｂ）は、胚の７９．６％（ｎ＝５４）においてｔｓｌ−ネトリン−１ａモルホリノ投与によって誘発される欠損を修正することもできた（図３Ｂ；ｐ＜０．０００１）。同様の救済は、ｔｓｌ−ネトリン−１ａ遮断モルホリノとモルホリノターゲッティングＤＡＰキナーゼの共投与によって得られた（図３Ｂ；ｐ＜０．０００１）。
【００６０】
ＢＡＦ処理またはＵＮＣ５Ｂモルホリノ投与は、ＴＵＮＥＬ免疫染色アッセイおよびカスパーゼ−３活性アッセイ（図３Ｃ）によって測定されるように、ネトリン−１ａサイレンシング後の胚で観察される細胞死の増加を救済し、ネトリン−１ａによって阻害された内皮細胞死は、血管発生中にＵＮＣ５Ｂによって特異的に介在されるという考えを更に支持する。
【００６１】
例４：ｆｌｉ−ＥＧＦＰゼブラフィッシュ胚における主要血管発生に対するネトリン−１ａモルホリノ効果の微速度撮影分析
ｆｌｉ−ＥＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュにおける血管動力学の微速度撮影画像を得ることができる。従って、節間血管（ＩＳＶ）の最初の出現は、３分間の時点間隔で収集した時点によって示すことができる。
【００６２】
これらの微速度撮影画像（データは示さず）は、ＩＳＶおよび背側縦吻合血管（ＤＬＡＶ）形成は、通常はコントロールモルホリノを投与したｆｌｉ−ＥＧＦＰゼブラフィッシュ胚で起こることを示している。翻訳遮断ネトリン−１ａモルホリノを投与したｆｌｉ−ＥＧＦＰゼブラフィッシュ胚では、ＩＳＶは未熟成長停止（premature growth arrest）を形成または提示することができず、ＤＬＡＶは存在しない。
【００６３】
本発明者らは、本明細書において、ネトリン−１が内皮細胞の生存を制御し、かつ、その未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体によって誘発されるアポトーシスを遮断することによって少なくとも部分的に血管形成を促進することを示した。この機能の調節緩和(deregulation)は、本発明者らおよび第三者が観察した血管形成の調節を説明することができる（Lu et al.,2004; Wilson et al.,2006）。このことは、発生および病理学的血管形成中の細胞死調節の重要性を記載している証拠の成長線と一致する（Birdsey et al.,2008; O'Connor et al.,2000; Santoro et al.,2007）。
【００６４】
ネトリン−１依存性受容体は、別の状況では栄養リガンドの利用できないことのセッティングにおいて発生する上皮細胞のアポトーシスを誘発することによって腫瘍サプレッサーとして作用することが最近提案された（Grady,2007; Mehlen and Puisieux,2006）。従って、その依存性受容体のアポトーシス促進活性の喪失は、結直腸癌におけるＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｃ発現の頻繁な喪失によって例示されるように、腫瘍細胞についての選択的利点を表している（Bernet et al.,2007; Mazelin et al.,2004）。相補的に、ネトリン−１発現の利得は、腫瘍細胞についての同様な選択的利点を表しており、この現象は、転移性乳癌や肺癌などの幾つかの種類の侵攻性癌で実際に観察される（Delloye et al.,2008; Fitamant et al.,2008）。本明細書に示された結果を考慮して、本発明者らは、腫瘍上皮細胞における発現のこのオートクラインネトリン−１利得が２つの付加的効果を有することがあることを提案する。第一には、報告されているように、依存性受容体によって引き起こされる細胞死を阻害することによって上皮腫瘍細胞についての選択的利点を付与する（Fitamant et al.,2008）。第二には、それは、潜在的に血管保持および／または発生にも有利であり、従って癌の進行を促進する可能性がある。従って、ネトリン−１受容体との相互作用の滴定または阻害によるネトリン−１の機能の崩壊に基づく抗癌法は、腫瘍上皮細胞だけでなく腫瘍血管形成血管をも根絶するものであり、従って癌における決定的なターゲットとしてのネトリン−１の位置を更に強化する。
【００６５】
例５：ＤＣＣ−５Ｆｂｎデコイペプチドは、内皮細胞に対するネトリン−１生存効果を防止する
ＤＣＣの第五の免疫グロブリンドメインに対応するデコイペプチドＤＣＣ−５Ｆｂｎでの処理は、ネトリン−１受容体多量体化を阻害することによってネトリン−１生存効果を逆転することが以前に示された（Mille et al.,2009）。
【００６６】
このようなペプチドが内皮細胞に対するネトリン−１効果を遮断できるかどうかを決定するため、内皮細胞をネトリン−１のみまたはネトリン−１およびＤＣＣ−５Ｆｂｎで処理したときのカスパーゼ−３活性の相対的減少を比較した。ＤＣＣ−５Ｆｂｎを添加すると、カスパーゼ−３活性に対するネトリン−１効果は１／２に減少し、従って内皮細胞に対するその生存効果を強力に減少する（図７，ｐ＜０．０１５）。
【００６７】
文献
Alavi et al.(2003). Science 301,94-96.
Bernet et al.(2007). Gastroenterology 133,1840-1848.
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Wilson et al.(2006). Science 313,640.
Winn et al.(2005). J Thromb Haemost 3,1815-1824.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮細胞、好ましくは血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのインビトロ（in vitro）の方法に関する。本発明は更に、内皮細胞、好ましくはネトリン−１を発現する腫瘍の血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物としてのネトリン−１の機能阻害剤の使用も含んでなる。最後に、本発明は、内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
軸索誘導分子として最初に報告されたネトリン−１は、分枝器官の形態発生における役割から血管形成における機能までの範囲の神経外過程においても機能することが最近示されている（Cirulli and Yebra, 2007; Liu et al., 2004; Lu et al., 2004; Wilson et al., 2006）。興味深いことには、血管形成中のネトリン−１の役割に関して矛盾する結果が報告された。しかしながら、以下の２つの明らかな発生学的結果は、最初はちぐはぐであると思われた：Ｅｉｃｈｍａｎｎ、Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅと共同研究者らは、マウスにおけるＵＮＣ５Ｂの発生学的不活性化は血管形成の増加と関係しており、それによってネトリン−１の抗血管形成活性が示唆されることをあざやかに立証したが、Ｌｉと共同研究者らは、ＵＮＣ５Ｂのリガンドをコードするネトリン−１ａの不活性化は、ゼブラフィッシュ発生中の血管の喪失と関係していることを示した（Lu et al., 2004; Wilson et al., 2006）。
【０００３】
血管形成は、多数の様々な疾病状態の開始および／または拡散における重要な要因であるので、信頼性のあるやり方で血管形成を制御しまたは阻害することができる治療組成物が必要である。実際に、血管形成の過程は、多数の疾病状態で変更されることが分かっており、多くの場合に、疾病と関連する病理学的損傷は抑制されていない血管形成に関係している。例えば、腫瘍は成長するためには新たな毛細血管の成長を刺激し続けなければならないので、血管形成は腫瘍成長における一因子である。従って、血管または新生血管の内皮細胞の死を促進しまたは誘発することができる化合物は、新たな毛細血管の成長を阻害することができ、これらの疾患の治療に有用なことがある。
【発明の開示】
【０００４】
従って、本発明の目的は、内皮細胞死の誘導物質としての活性を示す化合物および医薬組成物を提供することである。
【０００５】
本発明者らは、報告された、ネトリン−１が血管形成促進性または抗血管形成性であるという矛盾した結論を生じた明らかに対立する観察結果は、ネトリン−１が内皮細胞の生存因子として作用し、一方、その未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体が細胞のアポトーシスを誘発するという事実から生じていることを明らかにした。血管発生に対するネトリン−１の効果は、エクスビボ（ex vivo）アッセイにおけるカスパーゼ阻害剤に似ており、カスパーゼ活性の阻害またはＵＮＣ５Ｂ受容体のようなネトリン−１受容体のサイレンシングは、いずれもゼブラフィッシュにおけるネトリン−１サイレンシングによって誘発される血管発芽欠損を救済するのに十分である。
【０００６】
従って、未結合ＵＮＣ５Ｂのアポトーシス促進効果と内皮細胞上のネトリン−１に結合したＵＮＣ５Ｂとの生存効果は、血管形成過程中に協同するものと思われる。
【０００７】
第一の態様では、本発明は、ネトリン−１が血管形成中の内皮細胞アポトーシスを阻害することを見出したことに基づく内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するインビトロでの方法に関する。
【０００８】
従って、本発明は、内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択するインビトロでの方法であって、
ａ）ネトリン−１、またはその断片、および内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、
ｃ）前記内皮細胞の死を測定し、および
ｄ）段階ｃ）における測定が前記化合物の存在下にて内皮細胞死の有意な誘発を示しているときに、前記化合物を選択する
段階を含んでなる、方法に関する。
【０００９】
特定態様では、試験する化合物の存在によって誘発される細胞死は、下記の材料および方法「細胞死分析」の項に示されているトリパンブルー染色法を用いることによって分析しまたは評価することができる（Mehlen et al., Nature, 1998も参照されたい）。
【００１０】
もう一つの態様では、本発明は、内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、
ｃ）前記の試験する化合物のこのネトリン−１受容体のアポトーシス促進活性を促進する能力を測定し、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物が、このネトリン−１受容体の、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてこのネトリン−１受容体の、アポトーシス促進活性を有意に促進することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法に関する。
【００１１】
もう一つの態様では、本発明は、
段階ｃ）の測定が、試験する化合物の細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の活性化を誘発する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にて細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の有意な活性化を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質インデューサーとして選択する、
本発明による内皮細胞の死を誘発することができる化合物の選択方法に関する。
【００１２】
もう一つの態様では、本発明は、
段階ｃ）の測定が、試験する化合物のＤＡＰＫリン酸化を阻害する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてＤＡＰＫリン酸化の有意な阻害を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する、
請求項２に記載の内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法に関する。
【００１３】
もう一つの態様では、本発明は、内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、かつ前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインがネトリン−１の存在下にて二量体化または多量体化することができ、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、培地が更にネトリン−１、またはネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるその断片を含み、
ｃ）前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化が上記の試験する化合物の存在下で阻害されるかどうかを決定し、および
ｄ）段階ｃ）における決定が、前記内皮細胞の前記ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化または多量体化を有意に阻害することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法に関する。
【００１４】
試験する化合物の存在下における前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化の阻害の決定分析は、例えば、２００７年９月７日に公表された特許文献Mehlen et al., ＷＯ２００７／０９９１３３号に見出すことができる。
【００１５】
好ましい態様では、段階ａ）の培地はネトリン−１を更に含む。
【００１６】
もう一つの好ましい態様では、本発明による内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択する方法において、前記化合物は血管または新生血管の死を誘発することができる。
【００１７】
好ましい態様では、本発明による方法の段階ａ）において、前記内皮細胞は、ＤＣＣ(Deleted in Colorectal Cancer)、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択される少なくとも１種類のネトリン−１受容体、好ましくはＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である。
【００１８】
ヒトネトリン−１、またはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂ（Ｕｎｃ−５ホモログ１、２および３はＵｎｃ−５ホモログＡ、ＢおよびＣと同義である）のようなヒトネトリン受容体のアミノ酸配列は、当業者に周知である。特定ドメインの局在化を有するこれらのアミノ酸配列の例は、例えば、ヒトネトリン−１についてはＧｅｎｂａｎｋに受入番号ＡＡＤ０９２２１またはＮＰ００４８１３、ヒトネトリン受容体ＤＣＣ前駆体についてはＮＰ＿００５２０６、ヒトネトリン受容体Ｕｎｃ−５ホモログ１についてはＮＰ５８８６１０、ネトリン受容体Ｕｎｃ−５ホモログ２についてはＱ８ＩＺＪ１、およびＵｎｃ−５ホモログ３についてはＯ９５１８５、およびヒトＵＮＣ５ＤについてはＡＡＱ８８５１４により見出すことができる。
【００１９】
更に好ましくは、ネトリン−１受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である。
【００２０】
もう一つの好ましい態様では、本発明による方法において、段階ａ）の前記内皮細胞は、ヒトまたはニワトリの内皮細胞からなる群、好ましくはヒトまたはニワトリ血管または新生血管、更に好ましくはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）またはヒナドリ漿尿膜から選択される内皮細胞である。
【００２１】
第二の態様では、本発明は、
ネトリン−１と上記ネトリン−１受容体との相互作用を特異的に阻害することができるネトリン−１受容体またはその断片の細胞外ドメインを含んでなる化合物、
ネトリン−１またはネトリン−１受容体に対して特異的な、特に前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインまたは前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるネトリン−１断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
ネトリン−１タンパク質をコードする核酸に特異的なアンチセンスおよびＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）オリゴヌクレオチドからなる群から選択されるネトリン−１発現を阻害することができる化合物
からなる群から選択される、内皮細胞死の誘導物質としての、化合物を含んでなる。
【００２２】
好ましくは、本発明は、血管または新生血管の死を誘発する内皮細胞死の誘導物質としての化合物に関する。
【００２３】
更に好ましい態様では、本発明は、腫瘍の血管または新生血管の死の誘導物質としての化合物に関する。
【００２４】
もう一つのより好ましい態様では、前記腫瘍の腫瘍細胞はネトリン−１を発現または過剰発現する。
【００２５】
「ネトリン−１と前記ネトリン−１受容体との間の相互作用を特異的に阻害することができる」という表現におけるネトリン−１とそのネトリン−１受容体との間の相互作用という用語は、本明細書では、一般にリガンドとその受容体との間の特異的結合による相互作用を表すことを指している。この相互作用の阻害は、一般的には、特に競合的リガンド（前記ネトリン−１受容体のこの細胞外膜ドメインに対する抗体など）の存在下、またはネトリン−１（そのネトリン−１受容体の可溶性細胞外膜ドメイン、またはその部分など）と特異的複合体を形成することができる化合物の存在下にて、ネトリン−１のその受容体への結合の完全または部分的阻害によって得ることができる。
【００２６】
前記ネトリン−１受容体断片は、ネトリン−１受容体の細胞外ドメイン、またはネトリン−１と特異的に相互作用することができるその部分を含んでなるか、またはそれらである。
【００２７】
前記ネトリン−１および／または前記ネトリン−１受容体は、好ましくは哺乳類由来であり、特にマウス、ラットまたはヒト由来であり、更に好ましくはヒト由来である。前記ネトリン−１は、組換えネトリン−１であることができる。前記ネトリン−１は、ニワトリ由来であることもできる。
【００２８】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちネトリン−１タンパク質またはその受容体と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を表す。
【００２９】
「抗体」という用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体だけでなく、キメラまたはヒト化抗体をも含んでなる。
【００３０】
単離したネトリン−１タンパク質またはネトリン−１受容体タンパク質、またはそれらの特異的断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的手法を用いてこのようなタンパク質を結合する抗体を生成するための免疫原として用いることができる。また、これらの特異抗体を生成するのに用いてもよい少なくとも１種類の抗原決定基を含むこれらのタンパク質の任意の断片を用いてもよい。
【００３１】
タンパク質免疫原は、典型的には、適当な被検体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）を免疫原で免疫することによって抗体を調製するのに用いられる。適当な免疫原製剤は、前記タンパク質またはその断片を含むことができ、更にフロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバント、または同様な免疫刺激剤を含むこともできる。
【００３２】
従って、本発明によって用いられる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナルキメラまたはヒト化抗体が挙げられる。ネトリン−１タンパク質またはその受容体のアミノ酸配列の少なくとも８〜１０個のアミノ酸の連続スパンを含んでなるポリペプチドを含むエピトープに選択的に結合することができるまたは選択的に結合している抗体。インタクト（intact）抗体またはその機能性断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ）を用いることができる。
【００３３】
例えば、候補オリゴヌクレオチドの検出のためのインビトロ手法としては、ノーザンまたはサザンブロットハイブリダイゼーションおよびインサイチュー（in situ）ハイブリダイゼーションが挙げられる。候補タンパク質の検出のためのインビトロ手法としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈澱および免疫蛍光が挙げられる。
【００３４】
アンチセンスは、ネトリン−１コード配列のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、またはその相補性配列に特異的にハイブリダイズする長さが少なくとも１０、１５または２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであることができる。ネトリン−１コード配列の対応する断片と少なくとも９５％、９８％、９９％および１００％の同一性を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３５】
干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がその相補性配列を有する遺伝子の発現を特異的に抑制する現象である。ＲＮＡｉは、従って多くの生物の有用な研究手段となっている。ｄｓＲＮＡにより遺伝子発現を抑制する機構は完全には理解されていないが、実験データは重要な識見を提供している。この手法は、哺乳類細胞における遺伝子機能を研究する手段として大きな可能性を有しており、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）に基づく薬剤の開発へと導くことができる。
【００３６】
好ましくは、本発明の化合物において、ネトリン−１受容体またはその断片の前記細胞外ドメインは、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂからなる群から選択され、更に好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５ＢおよびＵＮＣ５Ｃの群から選択される。ＵＮＣ５Ｂが、さらにより好ましい。
【００３７】
もう一つの態様では、本発明は、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含む腫瘍に罹っている患者を治療するための癌の進行を阻害することを目的とする医薬組成物の調製のための本発明による化合物に関する。
【００３８】
好ましくは、前記癌は、乳癌、結直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性脊髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌、膵腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、肝腺癌および直腸腺癌からなる群から選択される。
【００３９】
好ましくは、前記癌は転移性または侵攻性癌である。
【００４０】
本発明の化合物を患者に投与するときには、場合によっては薬学上許容可能なビヒクルを含んでなる組成物の成分として投与するのが好ましい。この組成物は、経口または任意の他の好都合な経路によって投与することができ、別の生物活性剤と共に投与してもよい。投与は、全身または局所的であることができる。例えば、リポソームでのカプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルなどの様々な送達系が知られており、選択された本発明の化合物またはその薬学上許容可能な塩を投与するのに用いることができる。
【００４１】
投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、経口、舌下、鼻内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または局所的投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与様式は、現場実務者の裁量に任される。ほとんどの場合に、投与によって、化合物は血流中にまたは直接原発性腫瘍に放出される。
【００４２】
本発明による、または本発明による方法によって選択された化合物を含んでなる組成物も、本発明の部分を形成する。これらの組成物は、薬学上許容可能なビヒクルの適量をさらに含んでなり、患者に適正に投与するための形態を提供するようにすることもできる。「薬学上許容可能な」という用語は、規制当局によって認可され、または動物、哺乳類、更に詳細にはヒトで使用するための国定または承認された薬局方に記載されていることを意味する。「ビヒクル」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはキャリヤーであって、これによって本発明の化合物を投与するものを表す。このような薬学ビヒクルは、水および油のような液体であり、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など石油、動物、植物または合成起源のものであることができる。薬学ビヒクルは、塩水、ゼラチン、澱粉などであることができる。更に、補助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤および着色料を用いてもよい。食塩溶液、水性デキストロースおよびグリセロール溶液を、特に注射溶液の液体ビヒクルとして用いることもできる。適当な薬学ビヒクルとしては、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水などの賦形剤も挙げられる。試験化合物の組成物は、所望ならば、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。本発明の組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体を含むカプセル、散剤、徐放性処方物、座薬、エマルション、エアゾール、スプレー、懸濁液の形態、または使用に適当な任意の他の形態を採ることができる。前記組成物は、通常は経口投与または静脈内投与の目的でヒトに適合させた医薬組成物として常法に準じて処方される。活性化合物の量または治療に有効となる量は、標準的臨床手法によって決定することができる。更に、インビトロまたはインビボ（in vivo）アッセイを場合によって用いて、最適用量範囲を確認しやすくすることができる。用いられる正確な用量は投与経路および疾病の重篤度によって変化し、現場実務者の判断およびそれぞれの患者の環境によって決定されるべきである。しかしながら、経口、鼻内、皮内または静脈内投与は、通常は約０．０１〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重／日、更に好ましくは約０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００４３】
第三の態様では、本発明は、内皮細胞、好ましくは血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのキットであって、
ネトリン−１タンパク質またはネトリン−１受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるその断片、および
ネトリン−１受容体、好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂからなる群から選択され、更に好ましくは受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞
を含んでなる、キットに関する。
【００４４】
好ましい態様では、前記キットは、内皮細胞ＨＵＶＥＣまたはＨＵＡＥＣ細胞を含んでなる。
【００４５】
本発明を上記態様に関して説明してきたが、上記説明および下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内における他の態様、利点および変更は、本発明が関係する当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｈ：ネトリン−１は、恐らくはＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスを阻害することにより内皮細胞アポトーシスを防止する。 図１Ａ：ヒト臍帯静脈／動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ）はＵＮＣ５ＡおよびＵＮＣ５Ｂ依存性受容体を発現するが、ネトリン−１を発現しない。定量ＲＴ−ＰＣＲは、実験手順に記載の通りに行った。
【図１Ｂ】図１Ｂ：ネトリン−１投与は、トリパンブルー排除によって測定される血清飢餓時に見られるＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ細胞死を阻害する。少なくとも１００個の細胞／条件を計数した。相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として示す。＊:ｐ値＜０．００５；＊＊：ｐ値＜０．０００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｃ】図１Ｃ：ネトリン−１は、ＴＵＮＥＬ染色によって測定したＨＵＶＥＣにおけるアポトーシスを防止する。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍである（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｄ】図１Ｄ：ネトリン−１投与により、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるカスパーゼ−３活性が減少する。カスパーゼ−３活性の相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として表される。開裂したカスパーゼ−３陽性細胞の免疫染色および相対指数（平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ）が示される（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｅ】図１Ｅ：ネトリン−１投与により、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるカスパーゼ−３活性が減少する。カスパーゼ−３活性の相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）として表される。開裂したカスパーゼ−３陽性細胞の免疫染色および相対指数（平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ）が示される（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｆ】図１Ｆ：ｓｉＲＮＡによる、ＵＮＣ５Ａではなく、ＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、カスパーゼ−３活性の減少と関連している。値は、平均値およびｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）である。総て、ｐ＜０．０５（コントロール条件におけるレベルと比較したＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｇ】図１Ｇ：ＤＡＰキナーゼは、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスを介在する。ＤＡＰキナーゼΔＣａＭ（ＤＡＰキナーゼの構成性の活性突然変異体型）およびＤＡＰキナーゼＤＤ（ＤＡＰキナーゼのドミナントネガティブ型）の強制発現後の内皮細胞における細胞死（Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔ）。値は平均値およびｓ．ｅ．ｍ．である。総て、ｐ＜０．００１（コントロール条件におけるレベルと比較したＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図１Ｈ】図１Ｈ：ネトリン−１投与により、ＤＡＰキナーゼリン酸化が誘発される。抗ホスホ−ＤＡＰキナーゼを用いて、酵素活性のレベルを測定した。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆ：カスパーゼ阻害剤およびＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、新生血管形成におけるネトリン−１効果に似ている。 図２Ａ：ネトリン−１またはカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＢＡＦは、エクスビボでのネズミ大動脈リングマトリゲルアッセイにおける微小血管形成を促進する。少なくとも８種類のマウスから切除された大動脈リングを、条件毎に示す。微小血管全長（ピクセル単位）の定量は、実験手順に記載の通りに行った。総てのｐ値を示す（χ２検定）。
【図２Ｂ】図２Ｂ：ネトリン−１またはカスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＢＡＦは、エクスビボでのネズミ大動脈リングマトリゲルアッセイにおける微小血管形成を促進する。少なくとも８種類のマウスから切除された大動脈リングを、条件毎に示す。微小血管全長（ピクセル単位）の定量は、実験手順に記載の通りに行った。総てのｐ値を示す（χ２検定）。
【図２Ｃ】図２Ｃ：ネトリン−１およびカスパーゼ阻害剤は、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を誘発する。ＣＡＭモデルは、材料および方法に記載の通りに処理した８日齢のヒナドリ胚（ｎ≧１０）を用いて調製した。メチルセルロースディスクに輪郭を描く。デノボ（de novo）血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ≧１３フィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。＊：ｐ値＜０．０２；＊＊：ｐ値＜０．０００５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図２Ｄ】図２Ｄ：ネトリン−１およびカスパーゼ阻害剤は、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を誘発する。ＣＡＭモデルは、材料および方法に記載の通りに処理した８日齢のヒナドリ胚（ｎ≧１０）を用いて調製した。メチルセルロースディスクに輪郭を描く。デノボ血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ≧１３フィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。＊：ｐ値＜０．０２；＊＊：ｐ値＜０．０００５（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図２Ｅ】図２Ｅ：ｓｉＲＮＡによるＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を増加する。実験手順に記載の通りに３回のｓｉＲＮＡ注射をＥ．５とＥ．９との間に行った。スクランブルｓｉＲＮＡを、コントロールとして用いた。デノボ血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ＞３０異なるフィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。Ｐ値＝０．００９（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図２Ｆ】図２Ｆ：ｓｉＲＮＡによるＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、ＣＡＭアッセイにおける新生血管形成を増加する。実験手順に記載の通りに３回のｓｉＲＮＡ注射をＥ．５とＥ．９との間に行った。スクランブルｓｉＲＮＡを、コントロールとして用いた。デノボ血管形成は、分岐点の数として表す（ｎ＞３０異なるフィールド／条件）。平均値は、直線によって示す。Ｐ値＝０．００９（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定）。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃ：ノックダウンネトリン−１ａゼブラフィッシュ胚の表現型は、アポトーシスの阻害によって救済される。 ｆｌｉ：ｅｇｆｐゼブラフィッシュ胚を、１〜４細胞期でコントロール（ｃｔｌ）、スプライス（ｓｐｌ）または翻訳（ｔｓｌ）遮断ネトリン１ａ、ＵＮＣ５ＢおよびＤＡＰキナーゼモルホリノと共に単独でまたは組み合わせて投与した。表現型を、２４〜５４ｈｐｆに分析した。主要血管構造の典型的なイメージを示す。左が先。カスパーゼ阻害剤ＢＡＦは、ネトリン−１ａ ｓｐｌモルホリノを投与したゼブラフィッシュ胚では傍脊索血管形成（星印）を回復し（図３Ａ）、ネトリン−１ａ ｔｓｌモルホリノを投与したゼブラフィッシュ胚ではＩＳＶ形成を回復する（図３Ｂ）。同様の表現型の救済は、ゼブラフィッシュ胚におけるＵＮＣ５ＢまたはＤＡＰキナーゼおよびネトリン１ａ ｔｓｌ遮断モルホリノの同時投与によって観察された（図３Ｂ）。 図３Ａ：定量を示す。ｐ値を示す（χ２検定）。
【図３Ｂ】図３Ｂ：定量を示す。ｐ値を示す（χ２検定）。
【図３Ｃ】図３Ｃ：ＢＡＦ処理またはＵＮＣ５Ｂ遮断モルホリノ投与は、ＴＵＮＥＬ染色（左パネル）またはカスパーゼ−３活性（右パネル）によって示されるようにゼブラフィッシュ胚におけるネトリン１ａ ｔｓｌ遮断モルホリノ投与後に観察されるアポトーシスの増加を阻害する。カスパーゼ−３活性は、ネトリン−１ａ ｔｓｌモルホリノのみを投与した胚に関する相対指数として表される。平均値およびｓ．ｅ．ｍ．は、３回の独立した実験から計算される。ｐ値を示す（Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｇ：ネトリン−１は、ＵＮＣ５Ｂによって引き起こされる内皮細胞アポトーシスを防止する。 図４Ａ〜４Ｂ：ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞におけるネトリン−１発現の評価。 図４Ａ：特異的ネトリン−１抗体を用いる免疫蛍光を用いた。ネトリン−１標識は、ＭＲＣ−５肺繊維芽細胞系とは反対に、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞では検出されなかった。
【図４Ｂ】図４Ｂ：培地に分泌されたネトリン−１の定量は、Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のネトリン−１（ヒト）ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。
【図４Ｃ】図４Ｃ：ネトリン−１処理により、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣにおけるカスパーゼ−３活性は用量依存的に減少する。カスパーゼ−３活性の相対指数は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍと表される（ｎ＝３）。＊：ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００２５（コントロール条件におけるレベルと比較したＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図４Ｄ】図４Ｄ：ネトリン−１処理により、５０μＭエトポシドで一晩処理したときに見られたＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ細胞死が阻害される。細胞死は、実験手順に記載のＴｏｘｉｌｉｇｈｔアッセイを用いて評価する。相対指数は、平均値およびｓ．ｅ．ｍである（ｎ＝３）（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定）。
【図４Ｅ】図４Ｅ：ラットＵＮＣ５Ｈ２の細胞外ドメインに対応する組換えタンパク質の添加により、ネトリン−１によって介在される細胞死阻害が防止される。結果は、それぞれの場合にコントロールに対する相対指数として表される（平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ，ｎ＝３、ｔ検定）。
【図４Ｆ】図４Ｆ：スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたコントロール細胞と比較したＵＮＣ５ＢｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞におけるＵＮＣ５Ｂ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。トランスフェクションの効率を示す、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞におけるＧＦＰ発現の典型的画像。
【図４Ｇ】図４Ｇ：スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたコントロール細胞と比較したＵＮＣ５ＡｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞におけるＵＮＣ５Ａ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃ：エクスビボセッティングにおけるＵＮＣ５Ｂの発現。 図５Ａ：大動脈リングでのＵＮＣ５Ｂ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図５Ｂ】図５Ｂ：ＣＡＭでの定量ＲＴ−ＰＣＲによるネトリン−１、ＵＮＣ５Ｈ２（マウスＵＮＣ５Ｂ）およびＤＡＰキナーゼ発現の分析。ネトリン−１とは反対に、ＵＮＣ５Ｈ２およびその下流エフェクターが発現する。
【図５Ｃ】図５Ｃ：ＣＡＭでのＵＮＣ５Ｂ発現の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析、およびスクランブルｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクションしたコントロールと比較したＣＡＭでのＵＮＣ５Ｂ発現に対する血液循環に投与したＵＮＣ５ＢｓｉＲＮＡの効果。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄ：ゼブラフィッシュ胚におけるネトリン−１ａおよびＵＮＣ５Ｂモルホリノの効果。 図６Ａ：ネトリン−１ｂは、ゼブラフィッシュにおける発生上の血管形成に関与しているとは思われない。翻訳遮断ネトリン−１ｂモルホリノは、発生上の血管形成に対して重大な欠損を持っていない。欠損のない胚の割合および分析した胚の総数を示す。ネトリン−１オーソログ(otholog)遺伝子の系統発生的研究。１００ブートストラップ複製を用いるＪＴＴモデルでのタンパク質配列に関するＭＬ。ゼブラフィッシュにおけるネトリン−１オーソログであるネトリン−１ａおよびネトリン−１ｂには、下線を付けている。
【図６Ｂ】図６Ｂ：ゼブラフィッシュ胚におけるネトリン−１ａおよびＵＮＣ５Ｂ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図６Ｃ】図６Ｃ：第三のネトリン−１ａ遮断モルホリノは、図３Ａ〜３Ｃに記載のものと同様な血管の欠損を生じる。ＩＳＶ欠損を有する胚の割合および分析した胚の総数を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄ：ネトリン−１ａサイレンシングは、全ゼブラフィッシュ胚のカスパーゼ−３活性を増加させる。カスパーゼ−３活性は、コントロールＭＯを投与した胚に関する相対指数として表される。平均値およびｓ．ｅ．ｍ．は、３回の独立した実験から計算される。
【図７】ＤＣＣ−５Ｆｂｎデコイペプチドは、内皮細胞に対するネトリン生存効果を逆転させる。ＨＵＶＥＣにおけるネトリン−１によるカスパーゼ−３活性化の減少は、ＤＣＣの第五の細胞外免疫グロブリンドメインに対応するデコイペプチドＤＣＣ−５Ｆｂｎによる細胞の同時処理によって減少する。カスパーゼ−３活性の相対的減少割合は、平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍとして表される（ｎ＝３）。Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定：ｐ＜０．０１５。
【００４７】
材料および方法
Ａ）内皮細胞培養およびトランスフェクション
内皮細胞培養およびトランスフェクション：
ヒト臍帯静脈および動脈細胞（Promocell，継代数＜８）を、２％血清（キット、Promocell）を補足した内皮細胞成長培地（ECGM,Promocell）で８０％コンフルエンスに達するまで培養した。ＨＵＶＥＣを、ＡＭＡＸＡ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを用いて製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。簡単に説明すれば、５００，０００個の細胞を１００μｌのＨＵＶＥＣ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁し、１μｇｓｉＲＮＡまたは１．５μｇプラスミドＤＮＡおよび０．５μｇＧＦＰコードコントロールプラスミドを用いてトランスフェクションした。ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５ＢおよびスクランブルｓｉＲＮＡは、Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏによってデザインされた。突然変異体ＤＡＰキナーゼ（ＤＡＰキナーゼΔＣａｍおよびＤＡＰキナーゼＤＤ）をコードするプラスミドは、以前に記載された（Llambi et al.,2005）。トランスフェクション後、細胞を１％成長培地で培養し、２４時間後に回収した。
【００４８】
Ｂ）細胞死アッセイ
細胞死アッセイは、上記に記載の通りに行った。簡単に説明すれば、内皮細胞を、１０，０００個／ｃｍ２を完全培地に１６時間播種した。細胞死は、無血清培地（内皮細胞基礎培地、Promocell）での飢餓によりまたは５０μＭエトポシドに暴露することにより誘発した。ネトリン−１は、Ａｘｘｏｒａ−Ａｐｏｔｅｃｈから購入した。細胞死は、上記の通りにトリパンブルー排除アッセイによって評価した。ＤＮＡ断片化を検出するため、カバーグラス上で培養した処理済み細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に２０分間固定し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）を、３００Ｕ／ｍｌＴＵＮＥＬ酵素（３００Ｕ／ｍｌ）および６μＭビオチニル化ｄＵＴＰ(Roche Diagnostics)で行った。カスパーゼ−３活性を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（米国）製ＡｐｏＡｌｅｒｔ ＣＰＰ３２キットを用いて、文献記載の抗活性カスパーゼ−３抗体（Cell signaling）を用いる固定細胞での免疫染色によって測定した（Llambi et al.,2005; Tauszig-Delamasure et al.,2007）。Ｔｏｘｉｌｉｇｈｔアッセイは、製造業者の指示に従って行った(Lonza)。ネトリン−１滴定実験のため、ラット組換えＵＮＣ５Ｈ２−Ｆｃ(R&D)を１μｇ／ｍｌで用いた。
【００４９】
Ｃ）ウェスタンブロット分析および免疫蛍光
１０，０００個／ｃｍ２で播種し、無血清培地（内皮細胞基礎培地，Promocell）中でネトリン−１と共に２４時間処理したまたは処理しなかった内皮細胞を回収して、プロテアーゼ阻害剤の存在下にて５０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１２５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＮＰ−４０緩衝液中で溶解した。タンパク質抽出物を、抗ＤＡＰ−キナーゼおよび抗ホスホ−ＤＡＰキナーゼ抗体(Sigma)で免疫ブロットした。免疫蛍光分析のため、細胞をＬａｂＴｅｋチャンバースライド上に播種し、４％ＰＦＡで１５分間固定した。抗ネトリン−１ラットモノクローナル抗体（R&D）を１／１５０の希釈倍率で用い、特異的二次抗体（Alexa488 Donkey anti-Rat,Molecular Probes-Invitrogen）を用いて可視化した。
【００５０】
Ｄ）定量ＲＴ−ＰＣＲ
ＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ、大動脈リング、ＣＡＭおよびゼブラフィッシュ胚におけるネトリン−１、依存性受容体、ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ａ−Ｄ、およびＤＡＰキナーゼ発現を評価するため、総ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡＩＩキット(Macherey-Nagel)を用いて抽出し、１μｇをｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット(BioRad)を用いて逆転写した。リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＦａｓｔＳｔａｒｔＤＮＡＭａｓｔｅｒＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩキット(Roche)を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０装置(Roche)上で行った。総ての最適増幅のための反応条件並びにプライマー選択は、上記の通りに決定した。プライマーの配列は、必要であれば入手可能である。
【００５１】
Ｅ）大動脈リングアッセイ
大動脈リングアッセイは、Ｎｉｃｏｓｉａと共同研究者らによって記載されている方法によって行った（Nicosia and Ottinetti,1990）。大動脈は６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスから切除し、外膜周囲の脂肪および結合組織を除去し、ＥＣＧＭで２回洗浄し、１〜１．５ｍｍの長さのリングに切断した。成長因子減少マトリゲル（Growth factor reduced Matrigel; BD Biosciences）１００μｌを、４８穴組織培養プレート(Costar)のそれぞれのウェルに添加し、３７°Ｃで３０分間固化させた。大動脈リングをマトリックス層に置き、Ｍａｔｒｉｇｅｌ１００μｌに埋設し、完全成長培地(ECGM,Promocell)で２４時間回復させた。次いで、それらをネトリン−１（１５０ｎｇ／ｍｌ）、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Tebu；２０ｎＭ）、ＢＡＦ（Sigma；２０ｎＭ）またはＶＥＧＦ（Sigma；１３ｎｇ／ｍｌ）で処理しまたは処理せずに、４日目に位相差顕微鏡で写真を撮った。微小血管生長の全長は、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎＲｅｌｅａｓｅ４．６ソフトウェアを用いて計算した。
【００５２】
Ｆ）ＣＡＭアッセイ
ヒナドリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイは、上記に記載の通りに行った。白色レグホンの卵を、加湿雰囲気下にて３７°Ｃでインキュベーションした。７２時間インキュベーションした後、３ｍｌの卵白を除去し、四角い窓を殻に開けた。開口部は、８日目までセロテープで閉じた。次いで、ネトリン−１（１５０ｎｇ／ｍｌ）、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Tebu；２０ｎＭ）、ＢＡＦ（Sigma；２０ｎＭ）またはＶＥＧＦ（Sigma）をＰＢＳで希釈し、等容のオートクレーブ処理した１％メチルセルロース溶液と混合した。コントロールは、ビヒクルのみで調製した。それぞれの試料溶液（１０μｌ）をパラフィルムに滴下して乾燥した。メチルセルロースディスクをパラフィルムから外して、８日齢ヒナドリ胚のＣＡＭ上に置いた。３日後、ＣＡＭを撮影して、血管形成応答をＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎＲｅｌｅａｓｅ４．６ソフトウェアを用いてメチルセルロースディスク下で二次異所性血管芽の数を測定することによって評価した。ＣＡＭにおけるＵＮＣ５Ｂサイレンシングは、Ｅ．５、Ｅ．７およびＥ．９でのＣＡＭ血液循環中でＳｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏによってデザインされた特異的ｓｉＲＮＡを投与することによって行った。分析は、Ｅ．１１で行った。
【００５３】
Ｇ）ゼブラフィッシュ胚のモルホリノノックダウン
トランスジェニックｆｌｉ：ｅｇｆｐゼブラフィッシュをＺｅｂｒａｆｉｓｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ(オレゴン大学)から入手し、２８°Ｃで標準的飼育条件下に保持した(Lawson and Weinstein,2002)。胚をプロナーゼ酵素処理を用いてコリオン除去し、６ｎｇのスプライス／翻訳遮断ネトリン−１、ＵＮＣ５Ｂおよび予めデザインして特性決定したコントロールモルホリノを、単独でまたは組み合わせて１〜４細胞期の胚の高卵黄に投与した。第三のスプライス遮断モルホリノ特異ターゲッティングネトリン−１ａをデザインし(GeneTools)、同じ用量で胚に投与した。最後に、ＤＡＰキナーゼ(GeneTools)の翻訳遮断モルホリノターゲッティングゼブラフィッシュオーソログ３ｎｇを投与し、コントロールと比較してノックダウン胚におけるＤＡＰキナーゼｍＲＮＡ発現を３５％減少させた。モルホリノの配列は、必要であれば入手可能である。胚を０．００３％フェニルチオ尿素を補足したＥ３培地で培養し、色素形成を阻害した。ネトリン−１ａサイレンシングによって誘発される表現型の救済を、モルホリノ投与の４時間後にＥ３培地に４０ｎＭＢＡＦを加えることによって試験した。ＴＵＮＥＬ染色のため、胚を４％ＰＦＡ中で４８ｈｐｆで４°Ｃにて一晩固定した。次いで、それらをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％（ＰＢＳＴ）で１０分間洗浄し、連続的メタノール槽（２５、５０、７５および１００％）で累進的に脱水した。再水和（７５、５０および２５％メタノール系）の後、胚をＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ(Roche)で５分間処理し、ＰＢＳＴで再度洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ１％中で３０分間インキュベーションした。ＴＵＮＥＬ標識は、予め上記したとおりに行い、Ｃｙ３結合−ストレプトアビジン（１／４００；Jackson Immunoresearch）を用いて可視化した。カスパーゼ−３活性アッセイは、２４時間発生時に胚全体について上記の通りに行った。微速度撮影実験のため、ゼブラフィッシュ胚を０．０１６％トリカインを含む３％メチルセルロース溶液に埋設し、運動を抑制した(Isogai et al.,Development and Disease,2003)。透過ビデオ顕微鏡画像化を、Ｔｉｍｅｌａｐｓｅ Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００Ｍ(PLATIM,ENS Lyon)を用いて行った。
【００５４】
ＤＣＣ−５Ｆｂｎ産生：ＤＣＣ−５Ｆｂｎ産生は、標準的手順を用いて行うことができる。簡単に説明すれば、ＢＬ２１細胞をイミダゾールに応じてＤＣＣ−５Ｆｂｎを強制的に発現させ、ＢＬ２１溶解物をＦｌａｇ−アガロース(Sigma)を用いてアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
【実施例】
【００５５】
本発明者らは、本明細書において、これらの２つの明らかに対立する観察を、ネトリン−１の未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体によって誘発されるアポトーシスを遮断することにより、血管形成中に内皮細胞の生存を促進するネトリン−１の能力を説明することができるかどうかを検討した。実際に、ネトリン−１は、いわゆる依存性受容体ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ａ−Ｄについてのリガンドとして作用することによって上皮細胞死を予防し、それらのリガンドの存在下および非存在下のいずれにおいても活性な機能特性を共有しており、リガンド結合は正のシグナル伝達を誘発するが、依存性受容体は別のシグナル伝達カスケードを誘発し、それらの栄養リガンドから解放されたときに細胞死を生じる（Llambi et al.,2001; Mehlen et al.,1998; Tanikawa et al.,2003）（Bredesen et al.,2005; Mehlen and Bredesen,2004）。このスキームでは、ＵＮＣ５Ｂの喪失、すなわちアポトーシス促進シグナル伝達の喪失は、実際に血管数の増加と関連している（Lu et al.,2004）。一方、ネトリン−１の喪失、すなわちアポトーシス促進シグナル伝達の増加は、血管消失と関係していると予想される（Wilson et al.,2006）。このような内皮細胞生存とアポトーシスとの間の動的バランスは、血管の完全性の保持を助長する可能性があり、これはまた、以前に報告されているように血管発生および病理学的血管形成の際の血管ホメオスタシスにも重要である（Alavi et al.,2003; Carmeliet,2005; Duval et al.,2003; Santoro et al.,2007; Winn et al.,2005）。
【００５６】
例１：ネトリン−１はその未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体によって誘発される内皮細胞アポトーシスを遮断する
ネトリン−１がその未結合ＵＮＣＢ受容体によって誘発されるアポトーシスを遮断するかどうかを決定するため、どのネトリン−１依存性受容体、すなわちＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄが、ヒト臍帯静脈／動脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ／ＨＵＡＥＣ）で発現するかを最初に決定した。定量ＲＴ−ＰＣＲによって示されているように、ＵＮＣ５ＡおよびＵＮＣ５Ｂは、いずれもＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣで発現するが（図１Ａ）、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５ＤおよびＤＣＣを検出することはできなかった（データは示さず）。ネトリン−１は、これらの細胞では、ＲＮＡ（図１Ａ）またはタンパク質レベル（図４Ａ〜４Ｂ）でも発現しなかった。次いで、ネトリン−１が内皮細胞の生存因子として働くかどうかを、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣが血清飢餓下で経験する細胞死の自発的傾向を遮断するその能力を分析することによって検討した。ネトリンは、５０ｎｇ／ｍｌの用量が、生理学的かつ機能的であることが以前に報告されているので、総てのインビトロ実験でこの用量を用いた（(Serafini et al.,1996; Serafini et al.,1994）および図４Ｃ）。図１Ｂに示されているように、ネトリン−１は、ＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ両方の細胞死を阻害した（ｐ＜０．００５）。同様な結果は、エトポシドによって引き起こされる細胞死についても得られた（図４Ｄ）。ネトリン−１は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞数の減少（図１Ｃ）およびカスパーゼ−３活性の減少（図１Ｄ〜１Ｅ）によって示されるように、内皮細胞のアポトーシスを防止した（ＨＵＶＥＣについては３０％までおよびＨＵＡＥＣについては４０％まで；総てｐ＜０．００５）。ＵＮＣ５Ｈ２の細胞外ドメインに対応する組換えタンパク質の添加により、ネトリン−１によって介在される細胞死の阻害が防止され、生存効果はネトリン−１に特異的であるという結論を支持していた（図４Ｅ）。従って、ネトリン−１は、内皮細胞に対して生存因子として働く。
【００５７】
ＵＮＣ５Ｂおよび／またはＵＮＣ５Ａが内皮細胞のアポトーシスを誘発するかどうかを決定するため、ｓｉＲＮＡ法を用いてそれらの発現を一過的にサイレンシングした（図１Ｆおよび図４Ｆ〜４Ｇ）。ＵＮＣ５Ｂサイレンシングにより、カスパーゼ−３活性は減少したが、ＵＮＣ５Ａ ｓｉＲＮＡはカスパーゼ−３活性に対して全く効果を示さなかった（図１Ｆ；総てｐ＜０．０５）。更に、ＵＮＣ５Ｂサイレンシングと一緒のネトリン−１の添加は、追加的生存効果と関連しなかった（図１Ｆ）。従って、内皮細胞に対するネトリン−１生存効果は、ＵＮＣ５Ｂ発現、および別の状況では未結合ＵＮＣ５Ｂによって誘発されるアポトーシスの阻害からの同様な結果によって変化する。ＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスはＤＡＰキナーゼによって介在されることが示されているので、最初にＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞で構成性の活性ＤＡＰキナーゼＤＡＰＫΔＣａＭを発現させた（Shohat et al.,2001）。図１Ｇに示されるように、ＤＡＰキナーゼの構成性の活性形態の発現により、細胞死が引き起こされた（総てｐ＜０．０００１）。次に、ＤＡＰキナーゼのドミナントネガティブ突然変異体ＤＡＰＫ ＤＤを強制発現させた（Llambi et al.,2005）。ネトリン−１処理と同様に、ＤＡＰＫ ＤＤは細胞死誘発を防止した。更に、ＵＮＣ５Ｂアポトーシス促進シグナル伝達は、ＤＡＰキナーゼ自動リン酸化の阻害を介するＤＡＰキナーゼの活性化によって介在されるので（Llambi et al.,2005）、次にＤＡＰキナーゼリン酸化レベルを測定した。図１Ｈに示されるように、ネトリン−１処理により、恐らくはＵＮＣ５Ｂアポトーシス促進シグナル伝達カスケードの遮断によってＨＵＶＥＣにおけるＤＡＰキナーゼリン酸化が増加した。ＵＮＣ５Ｂ突然変異体胚における血管数の増加が見られたことと一緒に（Lu et al.,2004）、これらのインビトロデータは、ネトリン−１が血管形成の際にＵＮＣ５Ｂによって引き起こされるアポトーシスを遮断することができるという考察を支持している。
【００５８】
例２：ネトリン−１の血管形成促進効果は、カスパーゼ阻害およびＵＮＣ５Ｂサイレンシングに似ている
次に、ネトリン−１の血管形成促進活性が、細胞生存を促進するその能力に関するという概念を、新血管形成のエクスビボモデルを用いて検討した。最初に、マウス大動脈リングアッセイを用いて、大動脈外植片におけるＵＮＣ５ＢのネズミオーソログであるＵＮＣ５Ｈ２の発現を評価した（図５Ａ）。ネトリン−１は、外植片において発現されることは見られなかった（データは示さず）。ＶＥＧＦで観察されたのと同様に、ネトリン−１処理では、コントロール条件と比較してマトリゲルに埋設した大動脈リングから毛細血管の出芽が増大し（図２Ａ〜２Ｂ；ｐ＜０．００１）、ネトリン−１の血管形成促進活性を支持していた。興味深いことには、カスパーゼ阻害薬ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＢＡＦも新毛細血管形成を誘発し、ネトリン−１の効果に似ていた（図２Ａ〜２Ｂ；ｐ＜０．００２）。同じ結果は、ヒナドリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイで得られた（図２Ｃ〜２Ｄ、および発現分析についての図５Ｂ）。実際に、ＶＥＧＦ、ネトリン−１、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋまたはＢＡＦで浸漬したメチルセルロースディスク付近では、新血管形成の有意な増加が観察された（図２Ｃ〜２Ｄ；ｐ＜０．０２）。従って、これらのエクスビボ生理学的モデルでは、アポトーシスの阻害はネトリン−１の効果に十分似ていると思われる。更に、ＣＡＭでのｓｉＲＮＡによるＵＮＣ５Ｂサイレンシングにより新血管分枝が増加し（図５Ｃ）、ネトリン−１およびその受容体ＵＮＣ５Ｂは、血管形成過程中に拮抗的に作用する（図２Ｅ〜２Ｆ；ｐ＝０．００９）。
【００５９】
例３:ゼブラフィッシュ発生中のネトリン−１ａサイレンシングは、カスパーゼ阻害およびＵＮＣ５Ｂ／ＤＡＰキナーゼサイレンシングによって救済される血管欠損を生じる
ネトリン−１の血管形成促進および抗アポトーシス活性の間の原因と結果の関係をインビボで更に調査するため、抗アポトーシス処理がゼブラフィッシュ発生中にネトリン−１崩壊によって誘発される血管欠損を救済することができるかどうかを検討した。２種類のネトリン−１遺伝子オーソログであるネトリン−１ａおよびネトリン−１ｂは、ゼブラフィッシュで特性決定されている（Lauderdale et al.,1997; Strahle et al.,1997）。ネトリン−１ｂサイレンシングは血管発生に対して何ら明らかな効果を持たないが（図６Ａ）、ＥｉｃｈｍａｎのグループおよびＬｉのグループはそれぞれ異なるネトリン−１ａモルホリノを用いて、ネトリン−１ａのサイレンシングが血管発生欠損と関連していることを示した（Lu et al.,2004; Wilson et al.,2006）。スプライス遮断モルホリノ（ｓｐｌ−ネトリン−１ａ）を用いるネトリン−１ａサイレンシングは、傍脊索血管（parachordal vessels：ＰＡＶ）の形成を防止することが示されている（Wilson et al.,2006）。ｆｌｉ：ｅｇｆｐトランスジェニックゼブラフィッシュ、血管において特異的にＧＦＰの発現をターゲッティングするトランスジェニックモデル（Lawson and Weinstein,2002）を用いて、受精から５０〜５４時間後（ｈｐｆ）に、このようなｓｐｌ−ネトリン−１ａモルホリノを投与した胚の５７．３％がＰＡＶを欠いており（ｎ＝７５）、節間血管（intersegmental vessels：ＩＳＶ）および背側縦吻合血管（dorsal longitudinal anastomotic vessels：ＤＬＡＶ）の発生は正常である（図３Ａ）ことを観察した。ｓｐｌ−ネトリン−１ａを投与した胚を汎用カスパーゼ阻害剤ＢＡＦで処理すると、ＰＡＶ形成は、未処理胚での４２．７％と比較して処理済み胚の９２．６％（ｎ＝５４）で見られたので、この表現型を良好に逆転した（図３Ａ；ｐ＜０．０００１）。以前に報告されているように（Wilson et al.,2006）、翻訳遮断モルホリノ（ｔｓｌ−ネトリン−１ａ、図６Ｂ）並びに第三のネトリン−１ａ遮断モルホリノ（図６Ｃ）を用いるネトリン−１ａサイレンシングにより、ＩＳＶの組織崩壊、背側吻合血管（ＤＬＡＶ）の非存在（図３Ｂ）および発生上の欠損を生じた。ＩＳＶ発生の微速度撮影分析により、ＩＳＶの非存在または未熟成長停止（premature growth arrest）を確かめた（例４参照）。同様の欠損は、アポトーシスタンパク質スルビビンの小阻害剤についてノックダウンしたゼブラフィッシュ胚に以前に報告されていた（Ma et al.,2007）。更に、カスパーゼ−３活性の増加が、ネトリン−１ａノックダウン胚で観察された（図６Ｄ）。これらの胚のＢＡＦによる処理は、コントロールでの２３．０％と比較して処理済み胚の５４．５％が少なくとも部分的ＩＳＶを示したので（図３Ｂ；ｐ＜０．００１）、ＩＳＶ形成の救済に十分であった。依存性受容体概念に従って、ＵＮＣ５Ｂモルホリノの同時投与（図６Ｂ）は、胚の７９．６％（ｎ＝５４）においてｔｓｌ−ネトリン−１ａモルホリノ投与によって誘発される欠損を修正することもできた（図３Ｂ；ｐ＜０．０００１）。同様の救済は、ｔｓｌ−ネトリン−１ａ遮断モルホリノとモルホリノターゲッティングＤＡＰキナーゼの共投与によって得られた（図３Ｂ；ｐ＜０．０００１）。
【００６０】
ＢＡＦ処理またはＵＮＣ５Ｂモルホリノ投与は、ＴＵＮＥＬ免疫染色アッセイおよびカスパーゼ−３活性アッセイ（図３Ｃ）によって測定されるように、ネトリン−１ａサイレンシング後の胚で観察される細胞死の増加を救済し、ネトリン−１ａによって阻害された内皮細胞死は、血管発生中にＵＮＣ５Ｂによって特異的に介在されるという考えを更に支持する。
【００６１】
例４：ｆｌｉ−ＥＧＦＰゼブラフィッシュ胚における主要血管発生に対するネトリン−１ａモルホリノ効果の微速度撮影分析
ｆｌｉ−ＥＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュにおける血管動力学の微速度撮影画像を得ることができる。従って、節間血管（ＩＳＶ）の最初の出現は、３分間の時点間隔で収集した時点によって示すことができる。
【００６２】
これらの微速度撮影画像（データは示さず）は、ＩＳＶおよび背側縦吻合血管（ＤＬＡＶ）形成は、通常はコントロールモルホリノを投与したｆｌｉ−ＥＧＦＰゼブラフィッシュ胚で起こることを示している。翻訳遮断ネトリン−１ａモルホリノを投与したｆｌｉ−ＥＧＦＰゼブラフィッシュ胚では、ＩＳＶは未熟成長停止（premature growth arrest）を形成または提示することができず、ＤＬＡＶは存在しない。
【００６３】
本発明者らは、本明細書において、ネトリン−１が内皮細胞の生存を制御し、かつ、その未結合ＵＮＣ５Ｂ受容体によって誘発されるアポトーシスを遮断することによって少なくとも部分的に血管形成を促進することを示した。この機能の調節緩和(deregulation)は、本発明者らおよび第三者が観察した血管形成の調節を説明することができる（Lu et al.,2004; Wilson et al.,2006）。このことは、発生および病理学的血管形成中の細胞死調節の重要性を記載している証拠の成長線と一致する（Birdsey et al.,2008; O'Connor et al.,2000; Santoro et al.,2007）。
【００６４】
ネトリン−１依存性受容体は、別の状況では栄養リガンドの利用できないことのセッティングにおいて発生する上皮細胞のアポトーシスを誘発することによって腫瘍サプレッサーとして作用することが最近提案された（Grady,2007; Mehlen and Puisieux,2006）。従って、その依存性受容体のアポトーシス促進活性の喪失は、結直腸癌におけるＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｃ発現の頻繁な喪失によって例示されるように、腫瘍細胞についての選択的利点を表している（Bernet et al.,2007; Mazelin et al.,2004）。相補的に、ネトリン−１発現の利得は、腫瘍細胞についての同様な選択的利点を表しており、この現象は、転移性乳癌や肺癌などの幾つかの種類の侵攻性癌で実際に観察される（Delloye et al.,2008; Fitamant et al.,2008）。本明細書に示された結果を考慮して、本発明者らは、腫瘍上皮細胞における発現のこのオートクラインネトリン−１利得が２つの付加的効果を有することがあることを提案する。第一には、報告されているように、依存性受容体によって引き起こされる細胞死を阻害することによって上皮腫瘍細胞についての選択的利点を付与する（Fitamant et al.,2008）。第二には、それは、潜在的に血管保持および／または発生にも有利であり、従って癌の進行を促進する可能性がある。従って、ネトリン−１受容体との相互作用の滴定または阻害によるネトリン−１の機能の崩壊に基づく抗癌法は、腫瘍上皮細胞だけでなく腫瘍血管形成血管をも根絶するものであり、従って癌における決定的なターゲットとしてのネトリン−１の位置を更に強化する。
【００６５】
例５：ＤＣＣ−５Ｆｂｎデコイペプチドは、内皮細胞に対するネトリン−１生存効果を防止する
ＤＣＣの第五の免疫グロブリンドメインに対応するデコイペプチドＤＣＣ−５Ｆｂｎでの処理は、ネトリン−１受容体多量体化を阻害することによってネトリン−１生存効果を逆転することが以前に示された（Mille et al.,2009）。
【００６６】
このようなペプチドが内皮細胞に対するネトリン−１効果を遮断できるかどうかを決定するため、内皮細胞をネトリン−１のみまたはネトリン−１およびＤＣＣ−５Ｆｂｎで処理したときのカスパーゼ−３活性の相対的減少を比較した。ＤＣＣ−５Ｆｂｎを添加すると、カスパーゼ−３活性に対するネトリン−１効果は１／２に減少し、従って内皮細胞に対するその生存効果を強力に減少する（図７，ｐ＜０．０１５）。
【００６７】
文献
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Winn et al.(2005). J Thromb Haemost 3,1815-1824.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）ネトリン−１、またはその断片、および内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、
ｃ）前記内皮細胞死を測定し、および
ｄ）段階ｃ）における測定が前記化合物の存在下にて内皮細胞死の有意な誘発を示しているときに、前記化合物を選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、および
ｃ）前記の試験する化合物のこのネトリン−１受容体のアポトーシス促進活性を促進する能力を測定し、
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物が、このネトリン−１受容体の、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてこのネトリン−１受容体の、アポトーシス促進活性を有意に促進することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項３】
段階ｃ）の測定が、試験する化合物の細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の活性化を誘発する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にて細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の有意な活性化を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する、
請求項２に記載の内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法。
【請求項４】
段階ｃ）の測定が、試験する化合物のＤＡＰＫリン酸化を阻害する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてＤＡＰＫリン酸化の有意な阻害を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する、
請求項２に記載の内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法。
【請求項５】
内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、かつ前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインがネトリン−１の存在下にて二量体化または多量体化することができ、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、培地が更にネトリン−１、またはネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるその断片を含み、
ｃ）前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化が前記の試験する化合物の存在下で阻害されるかどうかを決定し、および
ｄ）段階ｃ）における決定が、前記内皮細胞の前記ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化または多量体化を有意に阻害することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項６】
血管または新生血管の死を誘発することができる化合物を選択するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
段階ａ）において、前記内皮細胞が、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｅ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択される少なくとも１種類のネトリン−１受容体、好ましくはＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階ａ）において、前記内皮細胞が、ネトリン−１受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階ａ）において、前記内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）からなる群から選択される内皮細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ネトリン−１と前記ネトリン−１受容体との相互作用を特異的に阻害することができるネトリン−１受容体またはその断片の細胞外ドメインを含んでなる化合物、
ネトリン−１またはネトリン−１受容体に対して特異的な、特に前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインまたは前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるネトリン−１断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
ネトリン−１タンパク質をコードする核酸に特異的なアンチセンスおよびＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）オリゴヌクレオチドからなる群から選択されるネトリン−１発現を阻害することができる化合物
からなる群から選択される、内皮細胞死の誘導物質としての、化合物。
【請求項１１】
血管または新生血管の死を誘発する目的で使用するための、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
腫瘍の血管または新生血管の死を誘発する目的で使用するための、請求項１０または１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記腫瘍の腫瘍細胞がネトリン−１を発現または過剰発現する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
内皮細胞、好ましくは血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのキットであって、
ネトリン−１タンパク質またはネトリン−１受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるその断片、および
ネトリン−１受容体、好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂからなる群から選択され、更に好ましくはネトリン−１受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞
を含んでなる、キット。
【請求項１５】
前記内皮細胞がＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞の群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１】
内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）ネトリン−１、またはその断片、および内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、
ｃ）前記内皮細胞死を測定し、および
ｄ）段階ｃ）における測定が前記化合物の存在下にて内皮細胞死の有意な誘発を示しているときに、前記化合物を選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
内皮細胞死を誘発することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、および
ｃ）前記の試験する化合物のこのネトリン−１受容体のアポトーシス促進活性を促進する能力を測定し、
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物が、このネトリン−１受容体の、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてこのネトリン−１受容体の、アポトーシス促進活性を有意に促進することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項３】
段階ｃ）の測定が、試験する化合物の細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の活性化を誘発する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にて細胞死関連タンパク質キナーゼ（ＤＡＰＫ）のキナーゼ活性の有意な活性化を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する、
請求項２に記載の内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法。
【請求項４】
段階ｃ）の測定が、試験する化合物のＤＡＰＫリン酸化を阻害する能力を測定することにあり、および
ｄ）段階ｃ）における測定が、前記化合物の存在下にて、好ましくは更にネトリン−１の存在下にてＤＡＰＫリン酸化の有意な阻害を示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する、
請求項２に記載の内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法。
【請求項５】
内皮細胞死を誘発することができる化合物の選択方法であって、
ａ）少なくとも１種類のネトリン−１受容体を発現する内皮細胞を含む培地を有し、かつ前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインがネトリン−１の存在下にて二量体化または多量体化することができ、
ｂ）前記培地を、試験する化合物と接触させ、培地が更にネトリン−１、またはネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるその断片を含み、
ｃ）前記ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化が前記の試験する化合物の存在下で阻害されるかどうかを決定し、および
ｄ）段階ｃ）における決定が、前記内皮細胞の前記ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化または多量体化を有意に阻害することを示しているときに、前記化合物を内皮細胞死の誘導物質として選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項６】
血管または新生血管の死を誘発することができる化合物を選択するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
段階ａ）において、前記内皮細胞が、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｅ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択される少なくとも１種類のネトリン−１受容体、好ましくはＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階ａ）において、前記内皮細胞が、ネトリン−１受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階ａ）において、前記内皮細胞が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）からなる群から選択される内皮細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ネトリン−１と前記ネトリン−１受容体との相互作用を特異的に阻害することができるネトリン−１受容体またはその断片の細胞外ドメインを含んでなる化合物、
ネトリン−１またはネトリン−１受容体に対して特異的な、特に前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインまたは前記ネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用することができるネトリン−１断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および
ネトリン−１タンパク質をコードする核酸に特異的なアンチセンスおよびＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）オリゴヌクレオチドからなる群から選択されるネトリン−１発現を阻害することができる化合物
からなる群から選択される、内皮細胞死の誘導物質としての、化合物。
【請求項１１】
血管または新生血管の死を誘発する目的で使用するための、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
腫瘍の血管または新生血管の死を誘発する目的で使用するための、請求項１０または１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記腫瘍の腫瘍細胞がネトリン−１を発現または過剰発現する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
内皮細胞、好ましくは血管または新生血管由来の内皮細胞の死を誘発することができる化合物を選択するためのキットであって、
ネトリン−１タンパク質またはネトリン−１受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成することができるその断片、および
ネトリン−１受容体、好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ａ、ＵＮＣ５Ｂ、ＵＮＣ５ＣおよびＵＮＣ５Ｄ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂからなる群から選択され、更に好ましくはネトリン−１受容体ＵＮＣ５Ｂを発現する内皮細胞
を含んでなる、キット。
【請求項１５】
前記内皮細胞がＨＵＶＥＣおよびＨＵＡＥＣ細胞の群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【図５Ａ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５１４４６４（Ｐ２０１２−５１４４６４Ａ）
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４８８４（Ｐ２０１１−５４４８８４）
【出願日】平成２２年１月１１日（２０１０．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０２３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９２３０
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．セロテープ
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【出願人】（５０４２１７０６３）
【出願人】（５１０３０７２２２）
【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＮＯＲＭＡＬＥ ＳＵＰＥＲＩＥＵＲＥ ＤＥ ＬＹＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１１日（２０１０．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０２３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９２３０
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．セロテープ
【出願人】（５９４０１６８７２）サントル、ナショナール、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク、（セーエヌエルエス） (83)
【出願人】（５０４２１７０６３）
【出願人】（５１０３０７２２２）
【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＮＯＲＭＡＬＥ ＳＵＰＥＲＩＥＵＲＥ ＤＥ ＬＹＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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