プライマー、プライマーセット、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍｔｙｐｅ０２１Ｎ検出方法、ならびに、生物処理方法
【課題】糸状性バルキング原因細菌を正確に検出・定量することを可能とすることにより、本細菌の増殖を抑制し、固液分離障害を防止する。
【解決手段】特定の塩基配列を有しているフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって前記汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出する工程を実施することを特徴とする生物処理方法。
【解決手段】特定の塩基配列を有しているフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって前記汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出する工程を実施することを特徴とする生物処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅に用いられるプライマーやプライマーセットに関し、さらには、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ検出方法、ならびに、生物処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、活性汚泥などと呼ばれる生物学的な水処理に利用可能な細菌を含んだ汚泥が下水処理をはじめ食品工場や化学工場等の排水処理などに広く用いられている。
このような生物処理方法においては、下水や工場排水を被処理水として生物処理槽に導入し、該生物処理槽中に収容させた活性汚泥（以下、単に「汚泥」ともいう）と接触させて処理対象物質を分解させ、処理対象物質の低減された処理水を前記生物処理槽から流下させることが行われている。
生物処理槽においてこのような生物処理工程が実施された後の前記処理水には、前記汚泥が浮遊性の固形物（以下「ＳＳ」（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄ）ともいう）として含まれることが多く、この汚泥を除去するために、従来、生物処理槽から流下された前記処理水を沈殿槽に導入して前記汚泥を沈殿分離したり、前記処理水を限外ろ過膜等によって膜分離したりすることが行われている。
【０００３】
このような固液分離工程においては、糸状性細菌によるバルキングなどから固液分離障害が引き起こされることが従来知られている。
例えば、沈殿槽にいては、（１）Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１ＮやＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ ｎａｔａｎｓなどの糸状性細菌により引き起こされる糸状性バルキング、（２）浮上汚泥や腐敗汚泥、および、（３）凝集性が悪化した解体汚泥によって固液分離障害が引き起こされることが知られている（下記非特許文献１参照）。
【０００４】
一般的な生物処理方法において出現する糸状性細菌としては、二十数種類が知られているが、それらの内、沈殿槽で問題となる固液分離障害を起こす原因となるものはそれほど多くなく、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ ｐａｒｖｉｃｅｌｌａなどである。
その出現原因は種類により異なるため、糸状性細菌に起因する固液分離障害（糸状性バルキング）の対策には糸状性細菌の同定が必要となる（下記非特許文献２参照）。
【０００５】
従来、糸状性細菌の同定はＥｉｋｅｌｂｏｏｍが提案した形態学的特徴やその方法を基にＪｅｎｋｉｎｓ，Ｒｉｃｈａｒｄらが修正した分類・同定方法を基にした位相差顕微鏡を用いた観察が主流である。
しかし、この方法は熟練を要する上に、特徴が分かりにくい場合や出現環境によって形態が変わる場合もあることから、熟練者といえども正確に同定を行うことは容易ではない。
【０００６】
近年の分子生物学的手法の発達により、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」ともいう）や蛍光 ｉｎｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（以下「ＦＩＳＨ」ともいう）法等によって汚泥を構成する特定の細菌種を短時間で正確に検出したり、その存在数量を定量したりすることができるようになっている。
例えば、下記非特許文献３には、固液分離障害（糸状性バルキング）の主要な原因細菌の一つであるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出・定量のためのＰＣＲ用プライマーについて記載されている。
また、例えば、下記非特許文献４には、ＦＩＳＨ法によるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出について記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「最新環境浄化のための微生物学」 稲盛 悠平編、講談社サイエンティフィク、２００８年１２月１０日第１刷発行
【非特許文献２】「カラー図説排水処理の生物相診断」 西原環境テクノロジー著、産業用水調査会、２００８年１１月１１日第１版１刷発行
【非特許文献３】Ｈ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎ，Ｋ．Ｄｅ Ｗｉｌｄｅ，Ｊ．Ｍａｔｔｈｙｓ，Ｎ．Ｂｏｏｎ，Ｌ．Ｒａｓｋｉｎ，Ｗ．Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ （２００５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８：６９５−７０４
【非特許文献４】Ｔ．Ｋａｎａｇａｗａ，Ｙ．Ｋａｍａｇａｔａ，Ｓ．Ａｒｕｇａ，Ｔ．Ｋｏｈｎｏ，Ｍ．Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｗａｇｎｅｒ（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６ ： ５０４３−５０５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、上記非特許文献３に記載されているＰＣＲプライマーを使用して活性汚泥からＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を試みたところ、当該細菌以外にもアシネトバクター属の細菌などとも相同性の高い核酸が増幅されてしまい、その精度に問題を有していることを見出した。
【０００９】
すなわち、非特許文献３に記載のプライマーは、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを精度良く検出したり定量したりすることができるものであるとはいい難く、従来、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出や定量に適したプライマーが提供されていないという問題を有している。
そのため、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ検出方法においては、その精度を向上させることが難しい状況であり、生物処理方法においては固液分離障害に対する対策が立て難い状況となっている。
【００１０】
本発明は、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出に適したプライマーならびにプライマーセットを提供し、ひいては、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出精度の向上を図って、生物処理方法における固液分離障害の防止を図ることを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出に適したプライマーを見出し本発明の完成に到ったのである。
【００１２】
すなわち、プライマーに係る本発明は、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列を有していることを特徴としている。
【００１３】
また、プライマーセットに係る本発明は、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとが用いられてなることを特徴としている。
【００１４】
そして、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出方法に係る本発明は、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって試料中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を行うことを特徴としている。
【００１５】
さらに、生物処理方法に係る本発明は、汚泥を用いて被処理水を生物学的に処理する生物処理工程と、該生物処理工程後の処理水を固液分離して前記汚泥除去する固液分離工程とが実施される生物処理方法であって、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって前記汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出する工程がさらに実施されることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば生物処理方法において問題となる固液分離障害（糸状性バルキング）の主要な原因細菌の一つであるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを精度良く検出することができる。
したがって、当該細菌の増殖を抑制可能な条件となるように生物処理の条件（装置運転条件等）を変更することができ、固液分離障害の発生を抑制させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】従来のプライマーを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真。
【図２】本発明のプライマーを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施の形態について、下水や工場排水を被処理水として生物処理槽に導入し、該生物処理槽中に収容させた活性汚泥と接触させて処理対象物質を分解させる生物処理工程と、該生物処理工程後の処理水を沈殿槽に導入して前記活性汚泥を沈殿させるとともに上澄み液を沈殿槽から流下させる固液分離工程とを実施する生物処理方法を例に説明する。
【００１９】
本実施形態の生物処理方法においては、前記生物処理槽又は前記沈殿槽の汚泥をサンプリングし、該汚泥に対してＰＣＲによるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を行う工程を別途実施する。
このＰＣＲによるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出は、形態学的特徴に基づいた検出方法などのように熟練技術者でなくとも正確かつ簡単に糸状性バルキング原因細菌を検出・定量できるという利点を有する。
そして、汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を定期的に実施することでＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの増加・減少の傾向を把握することができる。
すなわち、糸状性バルキング原因細菌を正確に検出・定量することが可能となることで本細菌の増殖を抑制し、固液分離障害を防止することができる。
【００２０】
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの増加の原因として、腐敗水の流入、曝気槽の溶存酸素濃度不足、栄養塩（特に窒素）不足、高負荷運転などが考えられる。
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの存在比率が全細菌数の概ね１％以上になって、本細菌が糸状性バルキングの主原因になると考えられる場合は、先のような原因についてまず初めに調査して改善することがその対策方法として挙げられる。
なお、水力学的滞留時間（ＨＲＴ）が２時間から３時間になるように嫌気もしくは無酸素槽を設ける、あるいは、間欠曝気運転を行うことで、糸状性バルキング原因細菌であるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを減少させることができ、沈殿槽における固液分離障害を抑制させることができる。
早急に活性汚泥の沈降性を改善したい場合は、次亜塩素酸ナトリウムや市販のバルキング用製剤を投入し、本細菌を死滅させることにより改善される。
【００２１】
前記Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出は、リアルタイムＰＣＲなどによって実施可能である。
このリアルタイムＰＣＲとしては、蛍光を発する色素をインターカレートさせる方法や、蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法などを採用し得る。
また、例えば、このリアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）などのリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施することができる。
【００２２】
このリアルタイムＰＣＲには、フォアワードプライマーとして本発明者が設計したＥｉｋ０２１Ｎｆ１（配列番号１：５’−ＡＴＡＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴ−３’）又はＥｉｋ０２１Ｎｆ２（配列番号３：５’−ＡＴＧＣＡＴＡＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣ−３’）を用い、リバースプライマーとして本発明者が設計したＥｉｋ０２１Ｎｒ１（配列番号２：５’−ＴＡＡＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣ−３’）又はＥｉｋ０２１Ｎｒ２（配列番号４：５’−ＡＡＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣ−３’）を用いることが重要である。
上記プライマー（プライマーセット）を用いることにより、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１ＮのＤＮＡとの相同性の高いＤＮＡの増幅を他の核酸の増幅を抑制しつつ実施させることができる。
したがって、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出及び定量が従来のプライマーを用いた場合に比べて精度良く実施され得る。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
（検証方法）
１）既存のＰＣＲプライマーを用いたＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出
前記非特許文献３に記載されている、Ｈ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎらが考案したｇｒｏｕｐ ＩＩ Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出・定量するためのＰＣＲプライマー「２１Ｎｆ」（５’−ＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＴＡＡＧＴＣ（Ａ／Ｇ）ＧＡＴ−３’）と「２１Ｎｒ」（５’−ＣＣＧＡＣＧＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＡ−３’）とをそれぞれ用いて、下水の生物学的処理に用いられている汚泥に対してＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ菌の検出を試みた。
【００２５】
ＰＣＲは以下の条件で実施した。
すなわち、Ｆａｓｔ ＤＮＡ ＳＰＩＮ ｋｉｔ ｆｏｒ ＳＯＩＬ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を用いて下水処理場の汚泥から精製したＤＮＡ １ｎｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）および０．２５μＭのそれぞれのＰＣＲプライマーから構成される反応液を用いて、表１に示す反応条件で実施した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
２）Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出・定量するためのＰＣＲプライマーの設計
データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌやＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されているＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を基に新規ＰＣＲプライマーを設計した。
ＰＣＲプライマーの設計は、Ｐｒｉｍｅｒ ＢＬＡＳＴ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ？ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ＢｌａｓｔＤｅｓｃＡｄ）を用いて実施した。
【００２８】
３）新規ＰＣＲプライマーの検証
表３に示す４組のプライマーセットを用い、ＤＮＡを鋳型にしてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。
続いてそれぞれの増幅産物をクローニング後、塩基配列を決定し、データベースに登録されている既知の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と相同性解析を行い、増幅産物がＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子であること、つまり目的とする遺伝子だけが増幅され、目的外の細菌の遺伝子は増幅されないことを確認した。
すなわち、上記１）で精製したＤＮＡ １ｎｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）および０．２５μＭのそれぞれのＰＣＲプライマーセットから構成される反応液を用いて、表２のＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。
【００２９】
【表２】
【００３０】
続いて、これらの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて精製後、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社製）を用い、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし大腸菌を形質転換した。
得られた形質転換体を任意にそれぞれ１２個選択し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社製）を用いて組み換えプラスミドを精製した。
これらのプラスミドを鋳型にしてＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）上に登録されている既存の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
【００３１】
表３に示す４組の新規プライマーセットによる定量ＰＣＲの条件検討、および最適条件で定量ＰＣＲを行った際のＰＣＲ産物の既知の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と相同性解析を行い、増幅産物がＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子であること、つまり目的とする遺伝子だけが増幅され、目的外の細菌の遺伝子は増幅されないことを確認した。
【００３２】
４）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲの条件検討と検証
上記１）で精製したＤＮＡ １ｎｇ、それぞれ３００ｎＭのＦｏｒｗａｒｄプライマーとＲｅｖｅｒｓｅプライマーおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）から構成される反応液を用い、表４に示す条件により定量ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いて行った。
さらに、各プライマーセットで行ったＰＣＲ産物を上記３）と同じ方法で精製、クローニングし、得られた形質転換体を任意にそれぞれ２４個選択し、塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、上記３）と同様にデータベース上の既知の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と相同性を求めた。
【００３３】
【表３】
【００３４】
５）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲによる下水処理場活性汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの定量
表３に示す４組のプライマーセットを用い、下水処理場の活性汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出および存在数量の定量を行った。
すなわち、上記（ステップ１）で精製したＤＮＡ １ｎｇ、それぞれ３００ｎＭのＦｏｒｗａｒｄプライマーとＲｅｖｅｒｓｅプライマーおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）から構成される反応液を用い、表４に示す条件により定量ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いて行った。
【００３５】
【表４】
【００３６】
（検証結果）
１）既存のＰＣＲプライマーを用いたＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出
ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。
ｌａｎｅ１が１００ｂｐ分子量マーカー、ｌａｎｅ２がＤＮＡを含まない陰性対照のＰＣＲ増幅産物、そしてｌａｎｅ３が下水処理場の活性汚泥から精製したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を示す。
下水処理場の活性汚泥から精製したＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにおいて、予想される約２００ｂｐの増幅産物（矢印）が得られた。
そこで、このＰＣＲにより目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されているか否かを検証するために、ＰＣＲ産物をクローニングしその塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）上に登録されている既存の塩基配列と相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
表５に相同性検索の結果を示す。
【００３７】
【表５】
【００３８】
この表５にも示されているように、１１個のＰＣＲ産物のクローンのうち、目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎはわずか２クローンだけであり、その他は別の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が増幅されていた。
以上の結果より、前出のＨ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎらが考案したＰＣＲプライマーの精度は低く、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの精度良い検出・定量には適していないことが判明した。
【００３９】
２）Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出・定量するためのＰＣＲプライマーの設計
上述のように、Ｈ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎらが考案したＰＣＲプライマーの精度は低く、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ以外の細菌を間違って検出・定量するおそれがあることが判明した。
そこで、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌやＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されているＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を基に表６に示す新規ＰＣＲプライマーを設計した。
【００４０】
【表６】
【００４１】
３）新規ＰＣＲプライマーの検証
前述の表３に示す４組のＰＣＲプライマーセットを用いて増幅したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真を図２に示す。
ｌａｎｅ１が１００ｂｐ分子量マーカー、ｌａｎｅ２がＮｏ．１プライマーセット、ｌａｎｅ３がＮｏ．２プライマーセット、ｌａｎｅ４がＮｏ．３プライマーセット、ｌａｎｅ５がＮｏ．４プライマーセットを用いてＰＣＲを行った時のＰＣＲ増幅産物を示す。
全てのＰＣＲにおいて、予想される約１７０ｂｐの増幅産物（矢印）が得られた。
【００４２】
次に、これらのＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲにより、目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されていることを検証するために、ＰＣＲ産物をクローニングしその塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）上に登録されている既存の塩基配列との相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
表７に相同性検索の結果を示す。
【００４３】
【表７】
【００４４】
この表７に示すように、それぞれ８個のＰＣＲ産物のクローン全てが目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ（Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ ｅｉｋｅｌｂｏｏｍｉｉ）と９８％以上の相同性を持つ細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されていることを確認した。
以上の結果より、本発明に係るプライマー（プライマーセット）は、目的としている細菌だけを検出できる精度の高いプライマーであることが検証された。
【００４５】
４）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲの条件検討と検証
表８に示す条件でスタンダードサンプルを鋳型にして定量ＰＣＲを行った時の陰性対象の出現の有無、検量線のＲ2値、増幅効率、および定量下限値の結果を表９に示す。
【００４６】
【表８】
【００４７】
【表９】
【００４８】
この表にも示されているように、全てのプライマーセットを用いた定量ＰＣＲにおいて陰性対照の増幅は認められず、検量線のＲ2値は０．９９以上、増幅効率は９０％以上であった。
また、定量下限値は、それぞれ１２．８ｃｏｐｉｅｓ／反応と少ない量の当該細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能であった。
【００４９】
さらに、定量ＰＣＲ産物の塩基配列を、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ））上に登録されている既存の塩基配列と相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
その結果を表１０〜表１３に示す。
【００５０】
【表１０】
【００５１】
【表１１】
【００５２】
【表１２】
【００５３】
【表１３】
【００５４】
この表１０〜表１３に示されているように相同性解析した全ての定量ＰＣＲ産物が目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ（Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ ｅｉｋｅｌｂｏｏｍｉｉ）と９７％以上の相同性を持ち、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されていることを確認した。
以上の結果より、本発明のプライマーはＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの定量に有用な精度の高いプライマーであることが確認された。
【００５５】
５）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲによる下水処理場のＭＬＳＳ（Ｍｉｘｅｄ ｌｉｑｕｒｅ Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄ）中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの定量
表３に示す４組の新規ＰＣＲプライマーセットのうち、Ｎｏ．１（Ｅｉｋ０２１Ｎｆ１／Ｅｉｋ０２１Ｎｒ１）のプライマーセットを用いて表４の条件で下水処理場のＭＬＳＳ中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの存在数量を求めた。
その結果を表１４に示す。
【００５６】
【表１４】
【００５７】
以上のような具体的な事例からも、本発明によれば糸状性バルキングの原因細菌であるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出や定量に好適なプライマー（プライマーセット）が提供されうることが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅に用いられるプライマーやプライマーセットに関し、さらには、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ検出方法、ならびに、生物処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、活性汚泥などと呼ばれる生物学的な水処理に利用可能な細菌を含んだ汚泥が下水処理をはじめ食品工場や化学工場等の排水処理などに広く用いられている。
このような生物処理方法においては、下水や工場排水を被処理水として生物処理槽に導入し、該生物処理槽中に収容させた活性汚泥（以下、単に「汚泥」ともいう）と接触させて処理対象物質を分解させ、処理対象物質の低減された処理水を前記生物処理槽から流下させることが行われている。
生物処理槽においてこのような生物処理工程が実施された後の前記処理水には、前記汚泥が浮遊性の固形物（以下「ＳＳ」（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄ）ともいう）として含まれることが多く、この汚泥を除去するために、従来、生物処理槽から流下された前記処理水を沈殿槽に導入して前記汚泥を沈殿分離したり、前記処理水を限外ろ過膜等によって膜分離したりすることが行われている。
【０００３】
このような固液分離工程においては、糸状性細菌によるバルキングなどから固液分離障害が引き起こされることが従来知られている。
例えば、沈殿槽にいては、（１）Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１ＮやＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ ｎａｔａｎｓなどの糸状性細菌により引き起こされる糸状性バルキング、（２）浮上汚泥や腐敗汚泥、および、（３）凝集性が悪化した解体汚泥によって固液分離障害が引き起こされることが知られている（下記非特許文献１参照）。
【０００４】
一般的な生物処理方法において出現する糸状性細菌としては、二十数種類が知られているが、それらの内、沈殿槽で問題となる固液分離障害を起こす原因となるものはそれほど多くなく、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ ｐａｒｖｉｃｅｌｌａなどである。
その出現原因は種類により異なるため、糸状性細菌に起因する固液分離障害（糸状性バルキング）の対策には糸状性細菌の同定が必要となる（下記非特許文献２参照）。
【０００５】
従来、糸状性細菌の同定はＥｉｋｅｌｂｏｏｍが提案した形態学的特徴やその方法を基にＪｅｎｋｉｎｓ，Ｒｉｃｈａｒｄらが修正した分類・同定方法を基にした位相差顕微鏡を用いた観察が主流である。
しかし、この方法は熟練を要する上に、特徴が分かりにくい場合や出現環境によって形態が変わる場合もあることから、熟練者といえども正確に同定を行うことは容易ではない。
【０００６】
近年の分子生物学的手法の発達により、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」ともいう）や蛍光 ｉｎｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（以下「ＦＩＳＨ」ともいう）法等によって汚泥を構成する特定の細菌種を短時間で正確に検出したり、その存在数量を定量したりすることができるようになっている。
例えば、下記非特許文献３には、固液分離障害（糸状性バルキング）の主要な原因細菌の一つであるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出・定量のためのＰＣＲ用プライマーについて記載されている。
また、例えば、下記非特許文献４には、ＦＩＳＨ法によるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出について記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「最新環境浄化のための微生物学」 稲盛 悠平編、講談社サイエンティフィク、２００８年１２月１０日第１刷発行
【非特許文献２】「カラー図説排水処理の生物相診断」 西原環境テクノロジー著、産業用水調査会、２００８年１１月１１日第１版１刷発行
【非特許文献３】Ｈ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎ，Ｋ．Ｄｅ Ｗｉｌｄｅ，Ｊ．Ｍａｔｔｈｙｓ，Ｎ．Ｂｏｏｎ，Ｌ．Ｒａｓｋｉｎ，Ｗ．Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ （２００５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６８：６９５−７０４
【非特許文献４】Ｔ．Ｋａｎａｇａｗａ，Ｙ．Ｋａｍａｇａｔａ，Ｓ．Ａｒｕｇａ，Ｔ．Ｋｏｈｎｏ，Ｍ．Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｗａｇｎｅｒ（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６ ： ５０４３−５０５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、上記非特許文献３に記載されているＰＣＲプライマーを使用して活性汚泥からＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を試みたところ、当該細菌以外にもアシネトバクター属の細菌などとも相同性の高い核酸が増幅されてしまい、その精度に問題を有していることを見出した。
【０００９】
すなわち、非特許文献３に記載のプライマーは、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを精度良く検出したり定量したりすることができるものであるとはいい難く、従来、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出や定量に適したプライマーが提供されていないという問題を有している。
そのため、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ検出方法においては、その精度を向上させることが難しい状況であり、生物処理方法においては固液分離障害に対する対策が立て難い状況となっている。
【００１０】
本発明は、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出に適したプライマーならびにプライマーセットを提供し、ひいては、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出精度の向上を図って、生物処理方法における固液分離障害の防止を図ることを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出に適したプライマーを見出し本発明の完成に到ったのである。
【００１２】
すなわち、プライマーに係る本発明は、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列を有していることを特徴としている。
【００１３】
また、プライマーセットに係る本発明は、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとが用いられてなることを特徴としている。
【００１４】
そして、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出方法に係る本発明は、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって試料中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を行うことを特徴としている。
【００１５】
さらに、生物処理方法に係る本発明は、汚泥を用いて被処理水を生物学的に処理する生物処理工程と、該生物処理工程後の処理水を固液分離して前記汚泥除去する固液分離工程とが実施される生物処理方法であって、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって前記汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出する工程がさらに実施されることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば生物処理方法において問題となる固液分離障害（糸状性バルキング）の主要な原因細菌の一つであるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを精度良く検出することができる。
したがって、当該細菌の増殖を抑制可能な条件となるように生物処理の条件（装置運転条件等）を変更することができ、固液分離障害の発生を抑制させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】従来のプライマーを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真。
【図２】本発明のプライマーを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施の形態について、下水や工場排水を被処理水として生物処理槽に導入し、該生物処理槽中に収容させた活性汚泥と接触させて処理対象物質を分解させる生物処理工程と、該生物処理工程後の処理水を沈殿槽に導入して前記活性汚泥を沈殿させるとともに上澄み液を沈殿槽から流下させる固液分離工程とを実施する生物処理方法を例に説明する。
【００１９】
本実施形態の生物処理方法においては、前記生物処理槽又は前記沈殿槽の汚泥をサンプリングし、該汚泥に対してＰＣＲによるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を行う工程を別途実施する。
このＰＣＲによるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出は、形態学的特徴に基づいた検出方法などのように熟練技術者でなくとも正確かつ簡単に糸状性バルキング原因細菌を検出・定量できるという利点を有する。
そして、汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を定期的に実施することでＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの増加・減少の傾向を把握することができる。
すなわち、糸状性バルキング原因細菌を正確に検出・定量することが可能となることで本細菌の増殖を抑制し、固液分離障害を防止することができる。
【００２０】
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの増加の原因として、腐敗水の流入、曝気槽の溶存酸素濃度不足、栄養塩（特に窒素）不足、高負荷運転などが考えられる。
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの存在比率が全細菌数の概ね１％以上になって、本細菌が糸状性バルキングの主原因になると考えられる場合は、先のような原因についてまず初めに調査して改善することがその対策方法として挙げられる。
なお、水力学的滞留時間（ＨＲＴ）が２時間から３時間になるように嫌気もしくは無酸素槽を設ける、あるいは、間欠曝気運転を行うことで、糸状性バルキング原因細菌であるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを減少させることができ、沈殿槽における固液分離障害を抑制させることができる。
早急に活性汚泥の沈降性を改善したい場合は、次亜塩素酸ナトリウムや市販のバルキング用製剤を投入し、本細菌を死滅させることにより改善される。
【００２１】
前記Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出は、リアルタイムＰＣＲなどによって実施可能である。
このリアルタイムＰＣＲとしては、蛍光を発する色素をインターカレートさせる方法や、蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法などを採用し得る。
また、例えば、このリアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）などのリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施することができる。
【００２２】
このリアルタイムＰＣＲには、フォアワードプライマーとして本発明者が設計したＥｉｋ０２１Ｎｆ１（配列番号１：５’−ＡＴＡＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＴＣＡＧＴ−３’）又はＥｉｋ０２１Ｎｆ２（配列番号３：５’−ＡＴＧＣＡＴＡＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣ−３’）を用い、リバースプライマーとして本発明者が設計したＥｉｋ０２１Ｎｒ１（配列番号２：５’−ＴＡＡＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣ−３’）又はＥｉｋ０２１Ｎｒ２（配列番号４：５’−ＡＡＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＣ−３’）を用いることが重要である。
上記プライマー（プライマーセット）を用いることにより、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１ＮのＤＮＡとの相同性の高いＤＮＡの増幅を他の核酸の増幅を抑制しつつ実施させることができる。
したがって、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出及び定量が従来のプライマーを用いた場合に比べて精度良く実施され得る。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
（検証方法）
１）既存のＰＣＲプライマーを用いたＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出
前記非特許文献３に記載されている、Ｈ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎらが考案したｇｒｏｕｐ ＩＩ Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出・定量するためのＰＣＲプライマー「２１Ｎｆ」（５’−ＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＴＡＡＧＴＣ（Ａ／Ｇ）ＧＡＴ−３’）と「２１Ｎｒ」（５’−ＣＣＧＡＣＧＧＣＴＡＧＴＴＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＡ−３’）とをそれぞれ用いて、下水の生物学的処理に用いられている汚泥に対してＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ菌の検出を試みた。
【００２５】
ＰＣＲは以下の条件で実施した。
すなわち、Ｆａｓｔ ＤＮＡ ＳＰＩＮ ｋｉｔ ｆｏｒ ＳＯＩＬ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を用いて下水処理場の汚泥から精製したＤＮＡ １ｎｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）および０．２５μＭのそれぞれのＰＣＲプライマーから構成される反応液を用いて、表１に示す反応条件で実施した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
２）Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出・定量するためのＰＣＲプライマーの設計
データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌやＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されているＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を基に新規ＰＣＲプライマーを設計した。
ＰＣＲプライマーの設計は、Ｐｒｉｍｅｒ ＢＬＡＳＴ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ？ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ＢｌａｓｔＤｅｓｃＡｄ）を用いて実施した。
【００２８】
３）新規ＰＣＲプライマーの検証
表３に示す４組のプライマーセットを用い、ＤＮＡを鋳型にしてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。
続いてそれぞれの増幅産物をクローニング後、塩基配列を決定し、データベースに登録されている既知の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と相同性解析を行い、増幅産物がＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子であること、つまり目的とする遺伝子だけが増幅され、目的外の細菌の遺伝子は増幅されないことを確認した。
すなわち、上記１）で精製したＤＮＡ １ｎｇ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）および０．２５μＭのそれぞれのＰＣＲプライマーセットから構成される反応液を用いて、表２のＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。
【００２９】
【表２】
【００３０】
続いて、これらの増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて精製後、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社製）を用い、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし大腸菌を形質転換した。
得られた形質転換体を任意にそれぞれ１２個選択し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社製）を用いて組み換えプラスミドを精製した。
これらのプラスミドを鋳型にしてＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）上に登録されている既存の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
【００３１】
表３に示す４組の新規プライマーセットによる定量ＰＣＲの条件検討、および最適条件で定量ＰＣＲを行った際のＰＣＲ産物の既知の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と相同性解析を行い、増幅産物がＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子であること、つまり目的とする遺伝子だけが増幅され、目的外の細菌の遺伝子は増幅されないことを確認した。
【００３２】
４）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲの条件検討と検証
上記１）で精製したＤＮＡ １ｎｇ、それぞれ３００ｎＭのＦｏｒｗａｒｄプライマーとＲｅｖｅｒｓｅプライマーおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）から構成される反応液を用い、表４に示す条件により定量ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いて行った。
さらに、各プライマーセットで行ったＰＣＲ産物を上記３）と同じ方法で精製、クローニングし、得られた形質転換体を任意にそれぞれ２４個選択し、塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、上記３）と同様にデータベース上の既知の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と相同性を求めた。
【００３３】
【表３】
【００３４】
５）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲによる下水処理場活性汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの定量
表３に示す４組のプライマーセットを用い、下水処理場の活性汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出および存在数量の定量を行った。
すなわち、上記（ステップ１）で精製したＤＮＡ １ｎｇ、それぞれ３００ｎＭのＦｏｒｗａｒｄプライマーとＲｅｖｅｒｓｅプライマーおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）から構成される反応液を用い、表４に示す条件により定量ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いて行った。
【００３５】
【表４】
【００３６】
（検証結果）
１）既存のＰＣＲプライマーを用いたＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出
ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。
ｌａｎｅ１が１００ｂｐ分子量マーカー、ｌａｎｅ２がＤＮＡを含まない陰性対照のＰＣＲ増幅産物、そしてｌａｎｅ３が下水処理場の活性汚泥から精製したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を示す。
下水処理場の活性汚泥から精製したＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにおいて、予想される約２００ｂｐの増幅産物（矢印）が得られた。
そこで、このＰＣＲにより目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されているか否かを検証するために、ＰＣＲ産物をクローニングしその塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）上に登録されている既存の塩基配列と相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
表５に相同性検索の結果を示す。
【００３７】
【表５】
【００３８】
この表５にも示されているように、１１個のＰＣＲ産物のクローンのうち、目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎはわずか２クローンだけであり、その他は別の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が増幅されていた。
以上の結果より、前出のＨ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎらが考案したＰＣＲプライマーの精度は低く、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの精度良い検出・定量には適していないことが判明した。
【００３９】
２）Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出・定量するためのＰＣＲプライマーの設計
上述のように、Ｈ．Ｖｅｒｖａｅｒｅｎらが考案したＰＣＲプライマーの精度は低く、Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ以外の細菌を間違って検出・定量するおそれがあることが判明した。
そこで、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌやＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に登録されているＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を基に表６に示す新規ＰＣＲプライマーを設計した。
【００４０】
【表６】
【００４１】
３）新規ＰＣＲプライマーの検証
前述の表３に示す４組のＰＣＲプライマーセットを用いて増幅したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真を図２に示す。
ｌａｎｅ１が１００ｂｐ分子量マーカー、ｌａｎｅ２がＮｏ．１プライマーセット、ｌａｎｅ３がＮｏ．２プライマーセット、ｌａｎｅ４がＮｏ．３プライマーセット、ｌａｎｅ５がＮｏ．４プライマーセットを用いてＰＣＲを行った時のＰＣＲ増幅産物を示す。
全てのＰＣＲにおいて、予想される約１７０ｂｐの増幅産物（矢印）が得られた。
【００４２】
次に、これらのＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲにより、目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されていることを検証するために、ＰＣＲ産物をクローニングしその塩基配列を決定した。
決定した塩基配列は、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）上に登録されている既存の塩基配列との相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
表７に相同性検索の結果を示す。
【００４３】
【表７】
【００４４】
この表７に示すように、それぞれ８個のＰＣＲ産物のクローン全てが目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ（Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ ｅｉｋｅｌｂｏｏｍｉｉ）と９８％以上の相同性を持つ細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されていることを確認した。
以上の結果より、本発明に係るプライマー（プライマーセット）は、目的としている細菌だけを検出できる精度の高いプライマーであることが検証された。
【００４５】
４）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲの条件検討と検証
表８に示す条件でスタンダードサンプルを鋳型にして定量ＰＣＲを行った時の陰性対象の出現の有無、検量線のＲ2値、増幅効率、および定量下限値の結果を表９に示す。
【００４６】
【表８】
【００４７】
【表９】
【００４８】
この表にも示されているように、全てのプライマーセットを用いた定量ＰＣＲにおいて陰性対照の増幅は認められず、検量線のＲ2値は０．９９以上、増幅効率は９０％以上であった。
また、定量下限値は、それぞれ１２．８ｃｏｐｉｅｓ／反応と少ない量の当該細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出可能であった。
【００４９】
さらに、定量ＰＣＲ産物の塩基配列を、データベース（ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ））上に登録されている既存の塩基配列と相同性を求めることにより、増幅されたＰＣＲ産物がどの細菌種に由来するかを推定した。
その結果を表１０〜表１３に示す。
【００５０】
【表１０】
【００５１】
【表１１】
【００５２】
【表１２】
【００５３】
【表１３】
【００５４】
この表１０〜表１３に示されているように相同性解析した全ての定量ＰＣＲ産物が目的とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎ（Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ ｅｉｋｅｌｂｏｏｍｉｉ）と９７％以上の相同性を持ち、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子だけが増幅されていることを確認した。
以上の結果より、本発明のプライマーはＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの定量に有用な精度の高いプライマーであることが確認された。
【００５５】
５）新規ＰＣＲプライマーを用いた定量ＰＣＲによる下水処理場のＭＬＳＳ（Ｍｉｘｅｄ ｌｉｑｕｒｅ Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｓｏｌｉｄ）中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの定量
表３に示す４組の新規ＰＣＲプライマーセットのうち、Ｎｏ．１（Ｅｉｋ０２１Ｎｆ１／Ｅｉｋ０２１Ｎｒ１）のプライマーセットを用いて表４の条件で下水処理場のＭＬＳＳ中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの存在数量を求めた。
その結果を表１４に示す。
【００５６】
【表１４】
【００５７】
以上のような具体的な事例からも、本発明によれば糸状性バルキングの原因細菌であるＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出や定量に好適なプライマー（プライマーセット）が提供されうることが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列を有していることを特徴とするプライマー。
【請求項２】
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとが用いられてなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって試料中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を行うことを特徴とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出方法。
【請求項４】
汚泥を用いて被処理水を生物学的に処理する生物処理工程と、該生物処理工程後の処理水を固液分離して前記汚泥除去する固液分離工程とが実施される生物処理方法であって、
配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって前記汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出する工程がさらに実施されることを特徴とする生物処理方法。
【請求項１】
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列を有していることを特徴とするプライマー。
【請求項２】
Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸の増幅に用いられ、配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとが用いられてなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって試料中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出を行うことを特徴とするＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの検出方法。
【請求項４】
汚泥を用いて被処理水を生物学的に処理する生物処理工程と、該生物処理工程後の処理水を固液分離して前記汚泥除去する固液分離工程とが実施される生物処理方法であって、
配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有しているフォワードプライマーと配列番号２又は配列番号４の塩基配列を有しているリバースプライマーとを用いてＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎの核酸を増幅させることによって前記汚泥中のＥｉｋｅｌｂｏｏｍ ｔｙｐｅ０２１Ｎを検出する工程がさらに実施されることを特徴とする生物処理方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−４５２９７（Ｐ２０１１−４５２９７Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９６８９２（Ｐ２００９−１９６８９２）
【出願日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（０００１９２５９０）株式会社神鋼環境ソリューション (534)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（０００１９２５９０）株式会社神鋼環境ソリューション (534)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]