ポリペプチド
本発明者らは、非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、ＰＳ４変異体ポリペプチドは配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）への３０７位におけるアミノ酸置換を含む上記ポリペプチドを記載する。好ましくは、ＰＳ４変異体ポリペプチドは更に７０位におけるアミノ酸置換、好ましくはＧ７０Ｄを含む。配列の２７２位及び３０３位におけるアミノ酸は好ましくはヒスチジン（Ｈ）及びグリシン（Ｇ）である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）への３０７位におけるアミノ酸置換を含む、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２】
エキソアミラーゼ活性、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能な請求項１記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項３】
３０７位におけるアミノ酸置換がリジンへの置換（３０７Ｋ）、好ましくはＨ３０７Ｋ、又はアルギニンへの置換（３０７Ｒ）、好ましくはＨ３０７Ｒである、請求項１記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項４】
７０位におけるアミノ酸置換を更に含む請求項１、２又は３に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項５】
７０位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換（７０Ｄ）、好ましくはＧ７０Ｄである前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項６】
ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の２７２位におけるアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）である前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項７】
ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の３０３位におけるアミノ酸がグリシン（Ｇ）である前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項８】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位よりなる群から選択される突然変異１つ以上をさらに含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項９】
ＰＳ４変異体ポリペプチドにおける追加的突然変異が３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ａ３０９Ｐ及びＳ３３４Ｐよりなる群から選択される、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｋ、Ａ３０９Ｐ及びＳ３３４Ｐを含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｒ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｒ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含む、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１５】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２５（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１６】
親ポリペプチドが非マルトース生成性エキソアミラーゼ、好ましくはグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
親ポリペプチドがシュードモナス種、好ましくはシュードモナス・サッカロフィリア又はシュードモナス・スツッゼリーであるか、又はそれから誘導可能な、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
親ポリペプチドが配列番号１又は配列番号５に示す配列を有するシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１又は配列番号５に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
親ポリペプチドが配列番号７又は配列番号１１に示す配列を有するシュードモナス・
スツッゼリー由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、請求項１〜８の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号７又は配列番号１１に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜８又は１１の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２２】
発明の詳細な説明、請求項又は図面に記載した配列を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）、及び配列番号２５（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）よりなる群から選択される配列を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２４】
同じ条件下で試験した場合、ＰＳ４変異体ポリペプチドが親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して、高値の熱安定性を有する、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２５】
好ましくは６０℃における半減期（ｔ１／２）が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと相対比較して１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上増大している、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２６】
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、以下の特性、即ち：（ａ）低値の堅固性；（ｂ）高値の復元力；（ｃ）高値の凝集性；（ｄ）低値の易崩壊性；及び（ｅ）高値の折畳性の何れか１つ以上、好ましくは全てを有する、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２７】
食料品の復元力、凝集性又は折畳性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上独立して増大している、請求項２６記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２８】
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の復元力、凝集性及び折畳性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して増大している、請求項２６又は２７記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２９】
食料品の堅固性又は易崩壊性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と相対比較して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上独立して低下している、請求項２６記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項３０】
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の堅固性及び易崩壊性の各々が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して低下している、請求項２６又は２９記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項３１】
ポリペプチドが非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの少なくとも２０残基のフラグメントを含む、ポリペプチド。
【請求項３２】
ＰＳ４変異体ポリペプチド配列の残基１つ以上における突然変異により前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドから誘導可能なポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ＰＳ４変異体ポリペプチドの親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して高値の熱安定性又は高値のエキソ特異性又は両方を有するか、又は、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、以下の特性、即ち：（ａ）低値の堅固性；（ｂ）高値の復元力；（ｃ）高値の凝集性；（ｄ）低値の易崩壊性；または（ｅ）高値の折畳性の何れか１つ以上、好ましくは全てを有する、ポリペプチド。
【請求項３３】
食料品又は飼料添加物としての前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
【請求項３４】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドに澱粉を接触させること、及び、該ポリペプチドに澱粉から線状生成物１つ以上を形成させることを含む、澱粉を処理するための方法。
【請求項３５】
食料品又は飼料製品の製造における請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３６】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを食料品又は飼料成分に添加混合することを含む食料品又は飼料製品の製造プロセス。
【請求項３７】
食料品がドウ又はドウ製品、好ましくはプロセシングされたドウ製品を含む、請求項３５記載の使用又は請求項３６記載のプロセス。
【請求項３８】
前記食料品がベーカリー製品である請求項３５〜３７の何れかに記載の使用またはプロセス。
【請求項３９】
（ａ）澱粉媒体を準備すること；（ｂ）澱粉媒体に請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを添加すること；及び（ｃ）工程（ｂ）の最中又は後に澱粉媒体に熱を適用することによりベーカリー製品を製造すること、を含むベーカリー製品を作成するためのプロセス。
【請求項４０】
請求項３５〜３９の何れかに記載のプロセスにより得られる食料品、飼料製品、ドウ製品又はベーカリー製品。
【請求項４１】
ドウのための向上剤組成物であって、向上剤組成物が請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチド及び少なくとも１つの追加のドウ成分又はドウ添加物を含む上記組成物。
【請求項４２】
穀物粉及び請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項４３】
ドウ製品の劣化、好ましくは有害な劣化を遅延又は低減するための、ドウ製品における請求項１〜４２の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
【請求項４４】
ドウ製品の堅固性、復元力、凝集性、易崩壊性又は折畳性の何れか１つ以上を向上させるための、ドウ製品における請求項１〜４２の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
【請求項４５】
下記成分：
（ａ）バチルス・ステアロサーモフィルス由来の、１，４−α−マルトヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）とも称されるマルトース生成性アルファアミラーゼ、又はマルトース生成性アルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；
（ｂ）バチルス種、アスペルギルス種、サーモマイセス種、又はトリコデルマ種由来のベーカリーキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；
（ｃ）バチルス・アミロリクファシエンス由来のα−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）、又はアルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；及び、
（ｄ）フサリウム・ヘテロスポラム由来のグリコリパーゼのようなリパーゼ；
の何れか１つ以上との、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの複合物。
【請求項４６】
前期請求項の何れかに記載の用途のための請求項４５記載の複合物の使用。
【請求項４７】
請求項３１記載の複合物を用いた処理により製造される食料品又は飼料製品。
【請求項４８】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸。
【請求項４９】
配列番号６及び配列番号１２に少なくとも７５％同一である核酸配列を有する、請求項４８記載の核酸。
【請求項５０】
非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる請求項４８又は４９記載の核酸の少なくとも６０残基のフラグメントを含む核酸。
【請求項５１】
親配列から誘導可能な核酸配列であって、親配列は非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードすることができ、その核酸配列が、３０７位におけるリジン（Ｒ）又はアルギニン（Ｋ）残基を核酸がコードするような残基１つ以上における置換を、場合により配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択される残基１つ以上を核酸がコードするような別の突然変異１個以上と共に、含んでいる、核酸配列。
【請求項５２】
ヌクレオチド残基１つ以上の置換により非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、請求項４８〜５２の何れかに記載のＰＳ４核酸配列。
【請求項５３】
配列番号２２（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、配列番号２４（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）、及び配列番号２６（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）よりなる群から選択される請求項４８〜５２の何れかに記載の核酸配列。
【請求項５４】
請求項４８〜５３の何れかに記載のＰＳ４核酸を含むプラスミド。
【請求項５５】
請求項４８〜５４の何れかに記載のＰＳ４核酸を含むか、又は請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを発現することができる発現ベクター。
【請求項５６】
請求項５４記載のプラスミド又は請求項５５記載の発現ベクターを含む、好ましくはこれにより形質転換された宿主細胞。
【請求項５７】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを発現することができる細胞。
【請求項５８】
細菌、真菌、又は酵母の細胞である請求項５６記載の宿主細胞、又は請求項５７記載の細胞。
【請求項５９】
ＰＳ４変異体ポリペプチドを発現する方法であって、請求項５６、５７又は５８記載の宿主細胞又は細胞を得ること、及び細胞又は宿主細胞からポリペプチドを発現させること、及び場合によりポリペプチドを精製することを含む、方法。
【請求項６０】
場合により７０位における塩基性又は正荷電の残基へのアミノ酸置換を導入することを、場合により非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内への３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐ（配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照）よりなる群から選択される追加の突然変異１つ以上とともに行うことにより、ポリペプチド、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼの配列を改変する方法。
【請求項６１】
塩基性又は正荷電の残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を改変することにより、非マルトース生成性エキソアミラーゼの配列を改編する、請求項６０又は６１記載の方法。
【請求項６３】
ＰＳ４ポリペプチド変異体を製造する方法であって、該方法が非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入することを含み、該アミノ酸置換は配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｋ／Ｒ／Ｈ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択される、方法。
【請求項６４】
親ポリペプチドをコードする核酸の配列がアミノ酸置換を導入するように改変されている、請求項６２又は６３記載の方法。
【請求項６５】
非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を改変する方法であって、該方法は配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｋ／Ｒ／Ｈ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを配列内に導入することを含む、方法。
【請求項６６】
ポリペプチドの熱安定性又はエキソ特異性又は両方を増大させる方法であって、該方法が請求項５８〜６５の何れかに記載の工程を含む、方法。
【請求項６７】
ポリペプチドが単離又は精製、又は両方に付される請求項５８〜６６の何れかに記載の方法。
【請求項６８】
請求項５８〜６７の何れかに記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項６９】
請求項５８〜６８の何れかに記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項７０】
添付図面を参照しながら、そしてそれに示される通り、実質的に上記において説明されたＰＳ４変異体ポリペプチド、使用、プロセス、食料品、飼料製品、ドウ製品、ベーカリー製品、向上剤組成物、組成物、核酸、ベクター又は宿主細胞。
【請求項１】
アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）への３０７位におけるアミノ酸置換を含む、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２】
エキソアミラーゼ活性、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能な請求項１記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項３】
３０７位におけるアミノ酸置換がリジンへの置換（３０７Ｋ）、好ましくはＨ３０７Ｋ、又はアルギニンへの置換（３０７Ｒ）、好ましくはＨ３０７Ｒである、請求項１記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項４】
７０位におけるアミノ酸置換を更に含む請求項１、２又は３に記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項５】
７０位におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸への置換（７０Ｄ）、好ましくはＧ７０Ｄである前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項６】
ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の２７２位におけるアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）である前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項７】
ＰＳ４変異体ポリペプチドの配列の３０３位におけるアミノ酸がグリシン（Ｇ）である前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項８】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、３０９、又は３３４位よりなる群から選択される突然変異１つ以上をさらに含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項９】
ＰＳ４変異体ポリペプチドにおける追加的突然変異が３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ａ３０９Ｐ及びＳ３３４Ｐよりなる群から選択される、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｋ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｋ、Ａ３０９Ｐ及びＳ３３４Ｐを含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０７Ｒ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ３０７Ｒ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能なＰＳ４変異体ポリペプチドであって、該ＰＳ４変異体ポリペプチドが、配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列と相対比較して、以下の置換、即ち：３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐ、好ましくはＮ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ａ３０９Ｐ、Ｓ３３４Ｐを含む、ＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１５】
ＰＳ４変異体ポリペプチドが配列番号２５（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１６】
親ポリペプチドが非マルトース生成性エキソアミラーゼ、好ましくはグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
親ポリペプチドがシュードモナス種、好ましくはシュードモナス・サッカロフィリア又はシュードモナス・スツッゼリーであるか、又はそれから誘導可能な、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
親ポリペプチドが配列番号１又は配列番号５に示す配列を有するシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１又は配列番号５に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
親ポリペプチドが配列番号７又は配列番号１１に示す配列を有するシュードモナス・
スツッゼリー由来の非マルトース生成性エキソアミラーゼである、請求項１〜８の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号７又は配列番号１１に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜８又は１１の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２２】
発明の詳細な説明、請求項又は図面に記載した配列を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２１（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、配列番号２３（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）、及び配列番号２５（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）よりなる群から選択される配列を含む、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２４】
同じ条件下で試験した場合、ＰＳ４変異体ポリペプチドが親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して、高値の熱安定性を有する、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２５】
好ましくは６０℃における半減期（ｔ１／２）が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと相対比較して１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上増大している、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２６】
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、以下の特性、即ち：（ａ）低値の堅固性；（ｂ）高値の復元力；（ｃ）高値の凝集性；（ｄ）低値の易崩壊性；及び（ｅ）高値の折畳性の何れか１つ以上、好ましくは全てを有する、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２７】
食料品の復元力、凝集性又は折畳性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上独立して増大している、請求項２６記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２８】
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の復元力、凝集性及び折畳性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して増大している、請求項２６又は２７記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項２９】
食料品の堅固性又は易崩壊性が、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と相対比較して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上独立して低下している、請求項２６記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項３０】
ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理されている食料品の堅固性及び易崩壊性の各々が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して低下している、請求項２６又は２９記載のＰＳ４変異体ポリペプチド。
【請求項３１】
ポリペプチドが非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの少なくとも２０残基のフラグメントを含む、ポリペプチド。
【請求項３２】
ＰＳ４変異体ポリペプチド配列の残基１つ以上における突然変異により前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドから誘導可能なポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ＰＳ４変異体ポリペプチドの親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドと比較して高値の熱安定性又は高値のエキソ特異性又は両方を有するか、又は、ＰＳ４変異体ポリペプチドで処理された食料品が親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドで処理されている食料品と比較して、以下の特性、即ち：（ａ）低値の堅固性；（ｂ）高値の復元力；（ｃ）高値の凝集性；（ｄ）低値の易崩壊性；または（ｅ）高値の折畳性の何れか１つ以上、好ましくは全てを有する、ポリペプチド。
【請求項３３】
食料品又は飼料添加物としての前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
【請求項３４】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドに澱粉を接触させること、及び、該ポリペプチドに澱粉から線状生成物１つ以上を形成させることを含む、澱粉を処理するための方法。
【請求項３５】
食料品又は飼料製品の製造における請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドの使用。
【請求項３６】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを食料品又は飼料成分に添加混合することを含む食料品又は飼料製品の製造プロセス。
【請求項３７】
食料品がドウ又はドウ製品、好ましくはプロセシングされたドウ製品を含む、請求項３５記載の使用又は請求項３６記載のプロセス。
【請求項３８】
前記食料品がベーカリー製品である請求項３５〜３７の何れかに記載の使用またはプロセス。
【請求項３９】
（ａ）澱粉媒体を準備すること；（ｂ）澱粉媒体に請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを添加すること；及び（ｃ）工程（ｂ）の最中又は後に澱粉媒体に熱を適用することによりベーカリー製品を製造すること、を含むベーカリー製品を作成するためのプロセス。
【請求項４０】
請求項３５〜３９の何れかに記載のプロセスにより得られる食料品、飼料製品、ドウ製品又はベーカリー製品。
【請求項４１】
ドウのための向上剤組成物であって、向上剤組成物が請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチド及び少なくとも１つの追加のドウ成分又はドウ添加物を含む上記組成物。
【請求項４２】
穀物粉及び請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項４３】
ドウ製品の劣化、好ましくは有害な劣化を遅延又は低減するための、ドウ製品における請求項１〜４２の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
【請求項４４】
ドウ製品の堅固性、復元力、凝集性、易崩壊性又は折畳性の何れか１つ以上を向上させるための、ドウ製品における請求項１〜４２の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの使用。
【請求項４５】
下記成分：
（ａ）バチルス・ステアロサーモフィルス由来の、１，４−α−マルトヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）とも称されるマルトース生成性アルファアミラーゼ、又はマルトース生成性アルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；
（ｂ）バチルス種、アスペルギルス種、サーモマイセス種、又はトリコデルマ種由来のベーカリーキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）；
（ｃ）バチルス・アミロリクファシエンス由来のα−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）、又はアルファアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、又は突然変異体；及び、
（ｄ）フサリウム・ヘテロスポラム由来のグリコリパーゼのようなリパーゼ；
の何れか１つ以上との、前期請求項の何れかに記載のＰＳ４変異体ポリペプチドの複合物。
【請求項４６】
前期請求項の何れかに記載の用途のための請求項４５記載の複合物の使用。
【請求項４７】
請求項３１記載の複合物を用いた処理により製造される食料品又は飼料製品。
【請求項４８】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸。
【請求項４９】
配列番号６及び配列番号１２に少なくとも７５％同一である核酸配列を有する、請求項４８記載の核酸。
【請求項５０】
非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることができる請求項４８又は４９記載の核酸の少なくとも６０残基のフラグメントを含む核酸。
【請求項５１】
親配列から誘導可能な核酸配列であって、親配列は非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードすることができ、その核酸配列が、３０７位におけるリジン（Ｒ）又はアルギニン（Ｋ）残基を核酸がコードするような残基１つ以上における置換を、場合により配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択される残基１つ以上を核酸がコードするような別の突然変異１個以上と共に、含んでいる、核酸配列。
【請求項５２】
ヌクレオチド残基１つ以上の置換により非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、請求項４８〜５２の何れかに記載のＰＳ４核酸配列。
【請求項５３】
配列番号２２（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２）、配列番号２４（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｒ）、及び配列番号２６（ｐＳａｃ−ｐＭＳ３８２Ｈ）よりなる群から選択される請求項４８〜５２の何れかに記載の核酸配列。
【請求項５４】
請求項４８〜５３の何れかに記載のＰＳ４核酸を含むプラスミド。
【請求項５５】
請求項４８〜５４の何れかに記載のＰＳ４核酸を含むか、又は請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを発現することができる発現ベクター。
【請求項５６】
請求項５４記載のプラスミド又は請求項５５記載の発現ベクターを含む、好ましくはこれにより形質転換された宿主細胞。
【請求項５７】
請求項１〜３２の何れかに記載のポリペプチドを発現することができる細胞。
【請求項５８】
細菌、真菌、又は酵母の細胞である請求項５６記載の宿主細胞、又は請求項５７記載の細胞。
【請求項５９】
ＰＳ４変異体ポリペプチドを発現する方法であって、請求項５６、５７又は５８記載の宿主細胞又は細胞を得ること、及び細胞又は宿主細胞からポリペプチドを発現させること、及び場合によりポリペプチドを精製することを含む、方法。
【請求項６０】
場合により７０位における塩基性又は正荷電の残基へのアミノ酸置換を導入することを、場合により非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内への３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐ（配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照）よりなる群から選択される追加の突然変異１つ以上とともに行うことにより、ポリペプチド、好ましくは非マルトース生成性エキソアミラーゼの配列を改変する方法。
【請求項６１】
塩基性又は正荷電の残基がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を改変することにより、非マルトース生成性エキソアミラーゼの配列を改編する、請求項６０又は６１記載の方法。
【請求項６３】
ＰＳ４ポリペプチド変異体を製造する方法であって、該方法が非マルトース生成性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入することを含み、該アミノ酸置換は配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｋ／Ｒ／Ｈ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択される、方法。
【請求項６４】
親ポリペプチドをコードする核酸の配列がアミノ酸置換を導入するように改変されている、請求項６２又は６３記載の方法。
【請求項６５】
非マルトース生成性エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を改変する方法であって、該方法は配列番号１に示すシュードモナス・サッカロフィリアエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングを参照して３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｋ／Ｒ／Ｈ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｈ、３０３Ｇ、３０９Ｐ、３３４Ｐよりなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを配列内に導入することを含む、方法。
【請求項６６】
ポリペプチドの熱安定性又はエキソ特異性又は両方を増大させる方法であって、該方法が請求項５８〜６５の何れかに記載の工程を含む、方法。
【請求項６７】
ポリペプチドが単離又は精製、又は両方に付される請求項５８〜６６の何れかに記載の方法。
【請求項６８】
請求項５８〜６７の何れかに記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項６９】
請求項５８〜６８の何れかに記載の方法により得られるポリペプチド。
【請求項７０】
添付図面を参照しながら、そしてそれに示される通り、実質的に上記において説明されたＰＳ４変異体ポリペプチド、使用、プロセス、食料品、飼料製品、ドウ製品、ベーカリー製品、向上剤組成物、組成物、核酸、ベクター又は宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００９−５４０８１８（Ｐ２００９−５４０８１８Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５９８９（Ｐ２００９−５１５９８９）
【出願日】平成１９年６月１９日（２００７．６．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００２０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４８２２４
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１９日（２００７．６．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００２０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４８２２４
【国際公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【出願人】（３９７０６０５８８）ダニスコ エイ／エス (67)
【Ｆターム（参考）】
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