マイクロリアクタ
【課題】 マイクロポンプによって複数の試薬をそれぞれの試薬収容部から下流側へ送出し、これらの試薬を合流させて混合し、得られた混合試薬をそのさらに下流において試料と合流させて反応部で反応を行う際に、混合比率が安定した混合試薬のみを後続する工程へ送出可能なマイクロリアクタを提供する。
【解決手段】 本発明のマイクロリアクタは、初期混合試薬を反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えている。好ましい態様では、複数の試薬を混合する流路であって混合試薬７ｃの流れが停止される下流末端８が設けられた混合流路５ｃと、混合流路５ｃの中間部において分岐され、反応部へ混合試薬７ｃを送出する送出流路５ｄと、から前記送出防止機構が構成されており、初期混合試薬７ｄは、混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容されて送出流路５ｄから反応部への送出が防止される。
【解決手段】 本発明のマイクロリアクタは、初期混合試薬を反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えている。好ましい態様では、複数の試薬を混合する流路であって混合試薬７ｃの流れが停止される下流末端８が設けられた混合流路５ｃと、混合流路５ｃの中間部において分岐され、反応部へ混合試薬７ｃを送出する送出流路５ｄと、から前記送出防止機構が構成されており、初期混合試薬７ｄは、混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容されて送出流路５ｄから反応部への送出が防止される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、遺伝子増幅反応、抗原抗体反応などによる生体物質の検査・分析、その他の化学物質の検査・分析、有機合成等による目的化合物の化学合成などに用いられるマイクロリアクタに関するものであり、特に、複数の試薬を混合した混合試薬と試料とを混合して反応させる際に、安定した混合比率の混合試薬を後続する工程へ送出する技術の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、セ
ンサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている（特許文献
１）。これは、μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・
オン・チップ（Lab-on-chips）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。現実には遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
【０００３】
各種の分析、検査ではこれらの分析用チップにおける分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。そのためにはシンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題である。精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムおよびその制御方法を本発明者らはすでに提案している（特許文献２〜４）。
【０００４】
微細流路内で各成分の反応を行う上記のような分析用チップでは、微細流路内でこれらの成分を合流させて混合する工程が必要となる（特許文献５）。例えば、分析対象の試料と反応させる試薬が複数である場合には、予め複数の試薬を微細流路内で合流させて混合試薬を得る必要がある。
【特許文献１】特開２００４−２８５８９号公報
【特許文献２】特開２００１−３２２０９９号公報
【特許文献３】特開２００４−１０８２８５号公報
【特許文献４】特開２００４−２７０５３７号公報
【特許文献５】特開２００５−６６４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、複数の試薬を合流させて混合する際に、マイクロポンプによって各試薬を合流部へ同じタイミングで送り出したとしても、タイミングが高精度に合っていない限り、液の先頭部分では各試薬の混合比率を安定させることが難しい。この先頭部分の初期混合試薬を下流において試料と合流させて反応を行うと、この先頭部分では混合比率が安定していないので不具合が生じる場合が多い。
【０００６】
本発明は、マイクロポンプによって複数の試薬をそれぞれの試薬収容部から下流側へ送出し、これらの試薬を合流させて混合し、得られた混合試薬をそのさらに下流において試料と合流させて反応部で反応を行う際に、混合比率が安定した混合試薬のみを後続する工程へ送出可能なマイクロリアクタを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のマイクロリアクタは、板状のチップと、
複数の試薬が個別に収容される収容室からなる複数の試薬収容部と、
前記複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
外部から試料を注入するための注入口を有する試料受容部と、
前記試薬混合部から送出される混合試薬と、前記試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部と、を備え、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は、前記チップ内に組み込まれて流路により互いに連通され、
前記試薬混合部において生成された混合試薬のうち、初期に混合された初期混合試薬を前記反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えることを特徴とする。
【０００８】
上記の発明における好ましい態様では、前記試薬混合部は、前記複数の試薬を混合する流路であって混合試薬の流れが停止される下流末端が設けられた混合流路からなり、
該混合流路の中間部において、前記反応部へ混合試薬を送出する送出流路が分岐され、
前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路とから構成されており、
前記初期混合試薬は、前記混合流路の中間部と下流末端との間に収容されて前記送出流路から前記反応部への送出が防止される。
【０００９】
この場合、前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路との接続部に、混合流路内の圧力が所定圧以上となった際に送出流路へ混合試薬を送出する送液制御部を備えることが好ましい。
【００１０】
このような送液制御部は、前記混合流路と送出流路との接続部における送出流路側に設けられた、送出流路の断面積よりも小さい断面積を有する細流路で構成することができる。
【００１１】
上記の発明では、混合当初の初期混合試薬を混合流路の下流末端側へトラップして切り捨てるようにしたので、試薬同士の合流のタイミングが多少ずれていても、混合比率が安定した混合試薬のみを後続する工程へ送り出すことができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、試薬同士の合流のタイミングが多少ずれていても、混合比率が安定した混合試薬のみを後続する工程へ送り出すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明について詳細に説明する。本発明のマイクロリアクタは、板状のチップ内に設けられた微細流路または構造部において、各種の検査、化学分析、化学合成、試料の処理・分離などの目的で試料と試薬との反応を行うものである。
【００１４】
本発明のマイクロリアクタの用途には、例えば、遺伝子増幅反応、抗原抗体反応などによる生体物質の検査・分析、その他の化学物質の検査・分析、有機合成などによる目的化合物の化学合成、薬効スクリーニング、薬品抽出、金属錯体の形成・分離などが含まれる。
【００１５】
本発明のマイクロリアクタは、板状のチップ内に、
（i）複数の試薬が個別に収容される収容室からなる複数の試薬収容部
（ii）前記複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部
（iii）外部から試料を注入するための注入口を有する試料受容部
（iv）前記試薬混合部から送出される混合試薬と、前記試薬受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部
を備えている。
【００１６】
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は、前記チップ内に組み込まれて流路により互いに連通されている。
上記の各部の他、チップ内には、必要に応じて、各種の機能をもつ構造部が設けられる。このような構造部の具体例としては、送液を制御するための部位、試料および試薬以外の処理液を収容するための収容部、生体試料等に含まれる不要成分を除去するために試薬との反応に先立って前処理を行うための前処理部、反応後の液に含まれる標的物質等を検出するための検出部、廃液を貯留するための廃液貯留部、液を送出するためのマイクロポンプなどが挙げられる。
【００１７】
送液を制御するための部位の具体例としては、逆止弁、能動弁のような弁部などが挙げられる。
各処理液を収容するための収容部の具体例としては、流路壁、ビーズ等の担体などに必要物質を吸着させた状態で洗浄を行うための洗浄液の収容部、試薬と試料との反応を停止させる反応停止液の収容部、反応生成物を検出に適するように変性させるための変性処理液の収容部、光学的検出のために反応生成物を蛍光物質等で標識するための標識用試薬の収容部、その他、抽出液、溶離液、溶菌試薬、溶血試薬等の収容部などが挙げられる。
【００１８】
検出部は、マイクロリアクタ内における反応生成物を光学的に検出する場合には、例えば、光透過性の部材を用いて形成された流路部位または液溜状の部位から構成される。
前処理部は、試料に含まれる分析対象物の濃縮、分離、溶菌等を行う部位であり、例えば、生体試料に含まれるタンパク質やイオン性物質等の除去が行われる。このような処理は、例えば、フィルター、ビーズ、ゲル、メンブレンなどの担体を流路内に配置し、この担体に生体物質等を吸着させて該流路内に溶菌試薬、溶血試薬等を流し、次いで洗浄液を流すことにより行うことができる。
【００１９】
廃液貯留部は、例えば、所要の大きさをもつ凹部が形成された基材を、流路用の基材の下部側に貼り合わせることによって設けられた、流路と連通する空間により構成される。必要に応じて、該空間にはスポンジ等の廃液吸収用の多孔体が収納される。
【００２０】
マイクロポンプは、試薬収容部に収容された各試薬、他の収容部に収容された液などの各液を流路下流側へ送出する。マイクロポンプは通常、送出すべき液に対応して複数個が設置され、それぞれのマイクロポンプは水性または油性の駆動液を下流側へ送出し、試料や試薬等の液を駆動液で下流側へ押し出して送液を行う。
【００２１】
マイクロポンプは、マイクロリアクタに直接形成する場合もあるが、マイクロリアクタとは別途に、すなわち板状のチップとは独立して設置することができる。例えば、マイクロポンプおよびその制御装置、反応検出用の光学検出装置、温度制御装置、駆動液を収容した駆動液タンクなどを備えた装置本体と、予め試薬を封入したマイクロリアクタと、から試料検査装置を構成する場合が挙げられる。
【００２２】
この場合、マイクロリアクタの試料受容部に試料を注入した後、このマイクロリアクタを装置本体に装着して、装置本体側の複数のマイクロポンプと、これらのマイクロポンプに対応するマイクロリアクタの各流路とを連通させる。この状態で、駆動液タンクからの駆動液をマイクロポンプによりマイクロリアクタの流路へ送り出し、これによって流路内の液、例えば試薬収容部の試薬、試料受容部の試料などを下流側へ押し出して試薬同士の
混合、試薬と試料との混合などを行う。
【００２３】
マイクロポンプは、フォトリソグラフィ技術などにより作製され、特開２００１−３２２０９９号公報、特開２００４−１０８２８５号公報に記載されたピエゾ素子により駆動するマイクロポンプ、アクチュエータを設けた弁室の流出入孔に逆止弁を設けた逆止弁型のマイクロポンプなど各種のものが使用できる。なお、上記のピエゾ素子により駆動するマイクロポンプは、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、第１流路および第２流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるピエゾアクチュエータとを備えており、このアクチュエータを別途の制御装置により電圧で駆動することにより正逆方向への送液ができるようになっている。
【００２４】
マイクロリアクタは、板状の基材を用いて、フォトリソグラフィ技術などの微細加工技術を適用して作製される。通常は、流路および構造部となる凹部を１または２以上の基材に形成した後、複数枚の基材を貼り合わせることによってマイクロリアクタを作製する。
【００２５】
マイクロリアクタを構成する基材の材料には、目的に応じて各種のものが使用される。その具体例としては、ポリスチレンなどのプラスチック樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのゴム系材料、各種の無機ガラス、シリコン、セラミックス、金属などが挙げられる。また、流路壁面に対して、目的に応じて疎水化処理、親水化処理などの各種の表面処理を行ってもよい。
【００２６】
マイクロリアクタにおける流路幅のサイズは、マイクロスケール空間の利点、流路抵抗などを考慮して適宜に設計されるが、例えば、幅が数十〜数百μｍ、好ましくは５０〜２００μｍであり、深さが２５〜３００μｍ、好ましくは５０〜１００μｍである。マイクロリアクタのチップ全体の縦横サイズは、用途等にもよるが、典型的には数十ｍｍ、その高さは典型的には数ｍｍ程度である。
【００２７】
本発明のマイクロリアクタにおける試料受容部は、試料を一時収容する収容室と、外部から収容室へ試料を注入するための注入口とを備えている。この収容室は、流路形状、液溜形状など各種の形状であってよい。
【００２８】
試料受容部の注入口は、例えば、チップ上面から微量試料を注入できるように構成されている。外部への漏失、汚染、生体試料を使用する場合の感染などを防ぎ、密封性を確保するために、ゴム状材質などの弾性体からなる栓が注入口に形成されているか、あるいはポリジメチルシロキサンなどのゴム材、強化フィルム等で注入口が覆われていることが望ましい。例えば、ゴム材質の栓に突き刺したニードルまたは蓋付き細孔に通したニードルでシリンジ内の試料を注入する。前者の場合、ニードルを抜くとその針穴が直ちに塞がることが好ましい。また、これら以外の試料注入機構を設置してもよい。
【００２９】
試料受容部の上流側は、マイクロポンプに連通される流路に連通し、その下流側は、試薬との混合部に連通している。試料受容部に注入された試料は、マイクロポンプによって供給された駆動液により下流側へ押し出され、必要に応じて前処理された後、試薬と混合される。
【００３０】
試料受容部に注入される試料は、目的に応じて各種のものが対象となる。例えば、生体物質の検査・分析を行う場合には、生体由来のアナライト含有試料、例えば全血、血漿、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰などが挙げられる。遺伝子検査の場合、増幅反応の鋳型となる核酸として遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡがアナライトである。また、このような核酸を含む可能性のある試料から調製または単離したものを試料としてもよい
。他のアナライトとしては、各種の代謝物質、ホルモン、タンパク質（酵素、抗原なども含む）などが挙げられる。
【００３１】
その他、化学合成を目的とする場合には、試薬と反応させる原料化合物が試料となり、薬効スクリーニング、薬品抽出、金属錯体の形成・分離などを目的とする場合には、それらを行うために試薬と反応させる対象が試料となる。
【００３２】
本発明のマイクロリアクタにおける試薬収容部は、試薬を収容する収容室から構成されている。この収容室は、流路形状、液溜形状など各種の形状であってよい。試薬収容部の上流側は、マイクロポンプに連通される流路に連通し、その下流側は、他の試薬との混合部に連通している。試薬収容部に収容された試薬は、マイクロポンプによって供給された駆動液により下流側へ押し出され、他の試薬と合流して混合される。
【００３３】
試薬は、目的に応じて各種のものが対象となる。例えば、ＰＣＲ法により検体中に含まれる遺伝子を増幅する場合における試薬には、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸のほか、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Vent ＤＮＡポリメラーゼまたはPfu ＤＮ
Ａポリメラーゼが含まれる。
【００３４】
また、特許第３４３３９２９号に記載されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法により検体中に含まれる遺伝子を増幅する場
合における試薬には、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸、検出したい遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼのＲＮaseが含まれる。
【００３５】
その他、化学合成を目的とする場合には、試料と反応させる原料化合物などが試薬となり、薬効スクリーニング、薬品抽出、金属錯体の形成・分離などを目的とする場合には、それらを行うために試料と反応させる物質などが試薬となる。
【００３６】
遺伝子検査などの用途では、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、試薬収容部に予め試薬が収容されていることが望ましい。この場合、内蔵される試薬の蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、試薬収容部の上流側および下流側を封止することが好ましい。
【００３７】
試薬収容部の封止は、封止剤により行うことができる。この封止剤は、使用前にマイクロリアクタが保管される冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となるものである。例えば、油脂、ゼラチンの水溶液などを使用することができる。
【００３８】
また、試薬収容部の収容室の上流側端部または下流側端部、あるいはこれらの両方に、後述する図４の撥水バルブを設けてもよい。これによって、マイクロリアクタの保管時における試薬の外部への流出を有効に防止できると共に、使用時には、マイクロポンプによって容易に試薬を外部へ押し出すことができる。
【００３９】
反応部では、試料と混合試薬との混合液が導入された後、例えば、昇温などにより反応が開始される。反応部は、液溜形状、流路形状など各種の形状であってよく、例えば試料と混合試薬とを液溜に貯留して反応を行う態様、試料と混合試薬とを微細流路内に合流させて、合流液の送液方向をマイクロポンプにより切り替えて、合流液を微細流路内で繰り返し前後動させながら反応させる態様など、試料と試薬の種類等に応じて適宜の反応形態とすることができる。
【００４０】
以上に説明したマイクロリアクタにおいて、マイクロポンプによって複数の試薬をそれぞれの試薬収容部から下流側へ送出し、これらの試薬を合流させて混合し、得られた混合試薬をそのさらに下流において試料と合流させて反応部で反応を行うのであるが、複数の試薬を合流させて混合する際に、各試薬を合流部へ同じタイミングで送り出したとしても、タイミングが高精度に合っていない限り、液の先頭部分では各試薬の混合比率を安定させることが難しい。この先頭部分の初期混合試薬を下流において試料と合流させて反応を行うと、この先頭部分では混合比率が安定していないので不具合が生じる場合が多い。そのため、混合比率が安定してから混合試薬を次工程へ送り出すことが望ましい。
【００４１】
そこで本発明では、複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部において生成された混合試薬のうち、初期に混合された初期混合試薬を前記反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えている。以下、図１〜図３および図５〜図７を参照しながら初期混合試薬の送出防止機構について説明する。
【００４２】
図１は、本発明の一実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図である。本実施例では、試薬７ａと試薬７ｂとの２種類の試薬により混合試薬７ｃを得る場合を示している。
【００４３】
同図において、５ａは試薬７ａが送出される流路であり、その上流側は、試薬７ａが収容される試薬収容部（図示せず）に連通している。
５ｂは、試薬７ｂが送出される流路であり、その上流側は、試薬７ｂが収容される試薬収容部（図示せず）に連通している。
【００４４】
５ｃは、試薬７ａと試薬７ｂとを混合して混合試薬７ｃを生成する混合流路（試薬混合部）であり、流路５ａと流路５ｂとの合流部６から、混合試薬７ｃの流れが停止される下流末端８までの流路で構成されている。
【００４５】
混合流路５ｃの中間部では、下流の反応部（図示せず）へ混合試薬７ｃを送出する送出流路５ｄが分岐されている。送出流路５ｄは、混合流路５ｃとの分岐点から先の流路で構成されている。
【００４６】
混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部における送出流路５ｄ側には、撥水バルブ５１ａが設けられている。この撥水バルブ（送液制御部）は、図４に示した構造を備えている。同図の撥水バルブ５１は、細径の送液制御通路５２を備えている。送液制御通路５２は、その断面積（流路に対して垂直な断面の断面積）が、上流側の流路５３ａおよび下流側の流路５３ｂの断面積よりも小さい細流路である。
【００４７】
流路壁がプラスチック樹脂などの疎水性の材質で形成されている場合には、送液制御通路５２に接する液５４は、流路壁との表面張力の差によって、下流側の流路５３ｂへ通過することが規制される。
【００４８】
下流側の流路５３ｂへ液５４を流出させる際には、マイクロポンプによって所定圧以上の送液圧力を加え、これによって表面張力に抗して液５４を送液制御通路５２から下流側の流路５３ｂへ押し出す。液５４が流路５３ｂへ流出した後は、液５４の先端部を下流側の流路５３ｂへ押し出すのに要する送液圧力を維持せずとも液が下流側の流路５３ｂへ流れていく。すなわち、上流側から下流側への正方向への送液圧力が所定圧力に達するまで送液制御通路５２から先への液の通過が遮断され、所定圧以上の送液圧力が加わることにより液５４は送液制御通路５２を通過する。
【００４９】
流路壁がガラスなどの親水性の材質で形成されている場合には、少なくとも送液制御通
路５２の内面に、撥水性のコーティング、例えばフッ素系のコーティングを施す必要がある。
【００５０】
図１において、初期混合試薬７ｄは、以下に説明する作用により、混合流路５ｃの送出流路５ｄとの分岐点において、下流末端８側へ選択的に送り出され、混合流路５ｃの下流側にトラップされる。これにより、初期混合試薬７ｄが送出流路５ｄ側へ流出することが防止される。
【００５１】
図１に示したように、マイクロポンプにより試薬収容部から流路５ａへ送り出された試薬７ａと、別途のマイクロポンプにより他の試薬収容部から流路５ｂへ送り出された試薬７ｂとは、合流部６で合流し、混合流路５ｃで混合される。
【００５２】
この際、マイクロポンプによる混合試薬７ｃの送液圧力を、初期混合試薬７ｄおよび混合試薬７ｃが撥水バルブ５１ａを通過可能な圧力よりも小さな圧力として混合流路５ｃ内の混合試薬７ｃを送液する。これにより、図２に示したように、混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部において、初期混合試薬７ｄは送出流路５ｄ側には流出せずに混合流路５ｃの下流末端８側へ送り出される。
【００５３】
そして、初期混合試薬７ｄが混合流路５ｃの下流末端８に達した後、マイクロポンプによる混合試薬７ｃの送液圧力を、混合試薬７ｃが撥水バルブ５１ａを通過可能な圧力以上の圧力とする。これにより、図３に示したように、混合流路５ｃ内の混合試薬７ｃは、撥水バルブ５１ａを通過し、混合試薬７ｃは送出流路５ｄに流出する。
【００５４】
以上のようにマイクロポンプによる送液圧力を制御することで、初期混合試薬７ｄは混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容され、送出流路５ｄには、初期混合試薬７ｄが切り捨てられた混合試薬７ｃのみが送出される。すなわち、混合比率が安定した混合試薬だけを後続する工程へ供給することができる。
【００５５】
なお、本実施例では、混合流路５ｃの下流末端８にも撥水バルブ５１ｂを設けている。この撥水バルブ５１ｂは、初期混合試薬７ｄが下流側の流路へ通過可能な送液圧力が、撥水バルブ５１ａにおいて混合試薬７ｃが送出流路５ｄ側へ通過可能な送液圧力よりも大きい撥水バルブである。
【００５６】
したがって、初期混合試薬７ｄが混合流路５ｃの下流末端８に達した後、マイクロポンプによる混合試薬７ｃの送液圧力を、混合試薬７ｃが撥水バルブ５１ａを通過可能であり、且つ、初期混合試薬７ｄが撥水バルブ５１ｂを通過できない圧力とすることで、図３に示したように、混合試薬７ｃを撥水バルブ５１ａの先へ通過させると共に、混合流路５ｃの下流末端８において初期混合試薬７ｄが撥水バルブ５１ｂの先へ通過することを防止できる。
【００５７】
例えば、撥水バルブ５１ａにおける送液制御通路（図４の符号５２）の断面積を、撥水バルブ５１ｂにおける送液制御通路の断面積よりも大きくすることによって、これらの送液制御通路を液が通過可能な送液圧力に差をもたせることができる。この他、場合によっては、撥水バルブ５１ａと撥水バルブ５１ｂとの間で、液と送液制御通路の流路壁との表面張力差を相違させることで、液が通過可能な送液圧力に差をもたせることも考えられる。
【００５８】
例えば、撥水バルブ５１ｂよりも先の流路は、廃液貯留部に連通される。この場合、全ての反応、検出工程を終えた後などの適切な時期に、混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容された初期混合試薬７ｄおよび混合試薬７ｃを、マイクロポンプの送液圧力
を上げることによって撥水バルブ５１ｂよりも先の流路へ押し出し、その先の廃液貯留部に収容する。
【００５９】
なお、本実施例では混合流路５ｃの下流末端８にこのような撥水バルブ５１ｂを設けたが、下流末端８に撥水バルブ５１ｂを設けずに、下流末端８完全に封止する構造としてもよい。
【００６０】
図５は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図である。なお、図１〜図３と対応する構成要素は同一の符号で示しその詳細な説明を省略する。
【００６１】
本実施例では、基本的な構成は上述した実施例と同様であるが、混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部における送出流路５ｄ側に、能動弁９が設けられている。初期混合試薬７ｄは、以下に説明する作用によって、混合流路５ｃの送出流路５ｄとの分岐点において、選択的に下流末端８側へ送り出され、混合流路５ｃの下流側にトラップされる。これにより、初期混合試薬７ｄが送出流路５ｄ側へ流出することが防止される。
【００６２】
図５に示したように、マイクロポンプにより試薬収容部から流路５ａへ送り出された試薬７ａと、別途のマイクロポンプにより他の試薬収容部から流路５ｂへ送り出された試薬７ｂとは、合流部６で合流し、混合流路５ｃで混合される。
【００６３】
この際、能動弁９は閉止した状態になっており、図６に示したように、混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部において、初期混合試薬７ｄは送出流路５ｄ側には流出せずに混合流路５ｃの下流末端８側へ送り出される。
【００６４】
そして、初期混合試薬７ｄが混合流路５ｃと送出流路５ｄとの分岐点を通過した後、能動弁９を開放する。これにより、図７に示したように、混合流路５ｃ内の混合試薬７ｃは、能動弁９を通過し、混合試薬７ｃは送出流路５ｄに流出する。
【００６５】
以上のように能動弁９を制御することで、初期混合試薬７ｄは混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容され、送出流路５ｄには、初期混合試薬７ｄが切り捨てられた混合試薬７ｃのみが送出される。すなわち、混合比率が安定した混合試薬だけを後続する工程へ供給することができる。
【００６６】
なお、能動弁９として、公知である各種の構造のものをマイクロリアクタに形成することができる。例えば、空気圧ピストン、油圧ピストン、水圧ピストン、圧電アクチュエータ、形状記憶合金アクチュエータなどにより、柔軟な材質からなる基材を上方から押圧して、この基材の下方に配置された開口を覆って流路を塞ぐ構造の能動弁、弁体としてバイメタルを使用し、通電加熱により弁体を変形させて流路を塞ぐ構造の能動弁、弁体として形状記憶合金を使用し、通電加熱により弁体を変形させて流路を塞ぐ構造の能動弁などが使用できる。弁の開閉制御は、外部の制御装置による電圧駆動などによって行う。
【００６７】
以上に説明した、本発明のマイクロリアクタが備える初期混合試薬の送出防止機構は、混合流路と送出流路とから構成されており、初期混合試薬は、混合流路の中間部と下流末端との間に収容されて送出流路から反応部への送出が防止される。
【００６８】
このような初期混合試薬の送出防止機構を備えた２つの実施例について説明したが、この他、例えば混合流路の断面積と、送出流路の断面積とを相違させることにより、毛細管力によって初期混合試薬を選択的に混合流路の流路末端側へ導くことで、初期混合試薬の送出流路側への送出を防止できる。
【００６９】
あるいは、混合流路の流路壁の表面張力と、送出流路の流路壁の表面張力とを、流路材質または流路壁の表面処理等により相違させ、表面張力によって初期混合試薬を選択的に混合流路の流路末端側へ導くことで、初期混合試薬の送出流路側への送出を防止できる。
【００７０】
図８は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図であり、試料との混合部よりも上流側の流路構成を示している。
３種類の各試薬は、試薬収容部３３ｈ、３３ｉ、３３ｊのそれぞれに収容され、各試薬収容部の上流側には、マイクロリアクタとは別途の装置に内蔵されたマイクロポンプ１２ｈ，１２ｉ，１２ｊがポンプ接続部３１で接続され、各試薬収容部から下流側の混合流路５ｃへこれらのマイクロポンプにより試薬が送液される。
【００７１】
混合流路５ｃと、混合流路５ｃから分岐した送出流路５ｄと、撥水バルブ５１ａ、５１ｂは、図１と同様な初期混合試薬の送出防止機構を構成しており、試薬収容部３３ｈ、３３ｉ、３３ｊから送出され混合流路５ｃで合流した各試薬の混合液の先端部を切り捨て、混合状態が安定した後に混合試薬を次工程へ送出するようにしている。
【００７２】
図９は、本発明のマイクロリアクタの他の実施例を示した平面図である。本実施例のマイクロリアクタ１には、試薬の収容室である流路状の試薬収容部３３ａ、３３ｂ、３３ｃのそれぞれに３種類の試薬が収容されている。これらの試薬収容部の両端部（試薬収容部３３ａでは上流側の端部３４ａおよび下流側の端部３４ｂ）には、図４に示した構造の撥水バルブが設けられ、これらの撥水バルブの間の流路に試薬が封入されている。
【００７３】
なお、詳細な説明は省略するが、図９のマイクロリアクタ１の微細流路には、試薬収容部３３ａ〜３３ｃの両端部以外の位置にも図４の撥水バルブが設けられており、例えば、混合試薬と試料との合流部３８における混合試薬の入口と試料の入口などにも上記の撥水バルブが設けられており、この撥水バルブによってその先の流路への送液開始のタイミングが制御される。
【００７４】
図９の試薬収容部３３ａ〜３３ｃの上流側には、マイクロリアクタ１の一方の面から外部へ開放された開口３２ｃ〜３２ｅが設けられている。これらの開口３２ｃ〜３２ｅは、マイクロリアクタ１を後述するマイクロポンプユニットに重ね合わせて接続した際に、マイクロポンプユニットの接続面に設けられた流路開口と位置合わせされてマイクロポンプに連通される。
【００７５】
なお、開口３２ａ，３２ｂおよび３２ｆ〜３２ｋも同様に、マイクロリアクタ１とマイクロポンプユニットとの接続によってマイクロポンプに連通される。これらの開口３２ａ〜３２ｋを含むチップ面によってポンプ接続部が構成され、ポンプ接続部をマイクロポンプユニットの接続面に密着させることによってマイクロリアクタ１とマイクロポンプユニットとが接続される。
【００７６】
このポンプ接続部は、必要なシール性を確保して駆動液の漏出を防止するために、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン樹脂などの柔軟性（弾性、形状追随性）をもつ樹脂によって密着面が形成されることが好ましい。このような柔軟性を有する密着面は、例えばマイクロリアクタの構成基材自体によるものであってもよく、また、ポンプ接続部における流路開口の周囲に貼着された柔軟性を有する別途の部材によるものであってもよい。
【００７７】
試薬収容部３３ａ〜３３ｃに収容された試薬は、開口３２ｃ〜３２ｅに連通するそれぞれ別途のマイクロポンプによって、試薬収容部３３ａ〜３３ｃの下流側端部に設けられた撥水バルブ（図示せず）を通過して合流部３５へ流れ込み、その先に続く流路である混合
流路５ｃ（試薬混合部３６）で３種類の各試薬が混合される。
【００７８】
なお、この混合流路５ｃと、送出流路５ｄとを含む流路系によって、図１または図５の実施例に示したような初期混合試薬の送出防止機構が構成されており、初期混合試薬を混合流路５ｃの流路末端８にトラップするようにしている。
【００７９】
混合流路５ｃで混合され送出流路５ｄに送り出された混合試薬は、試料受容部３７に収容された試料と合流部３８で合流する。なお、混合試薬は開口３２ｂに連通したマイクロポンプによって駆動液で下流へ押し出され、試料は開口３２ａに連通したマイクロポンプによって駆動液で下流へ押し出される。混合試薬と試料との混合液は、反応部３９へ収容され加熱等によって反応が開始される。
【００８０】
反応後の液は、検出部４０へ送液され、例えば光学的な検出方法などによって標的物質が検出される。なお、開口３２ｆ〜３２ｊに連通するそれぞれ別途のマイクロポンプによって、これらの開口から先の流路に予め収容された各試薬（例えば混合試薬と試料との反応を停止させる液、検出対象の物質に対して標識などの必要な処理を行うための液、洗浄液など）を所定のタイミングで下流へ押し出して送液するようにしている。
【００８１】
図１０は、図９のマイクロリアクタに使用されるマイクロポンプユニットの斜視図、図１１は、その断面図である。このマイクロポンプユニット１１は、シリコン製の基板１７と、その上のガラス製の基板１８と、その上のガラス製の基板１９との３つの基板から構成されている。基板１７と基板１８、および基板１８と基板１９はそれぞれ、陽極接合によって接合されている。
【００８２】
シリコン製の基板１７と、その上に陽極接合によって貼り合わされたガラス製の基板１８との間の内部空間によってマイクロポンプ１２（ピエゾポンプ）が構成されている。
基板１７は、シリコンウエハをフォトリソグラフィ技術により所定の形状に加工したものである。例えば、シリコン基板面への酸化膜の形成、レジスト塗布、レジストの露光および現像、酸化膜のエッチング、ＩＣＰ（高周波誘導結合型プラズマ、Inductively Coupled Plasma）などによるシリコンのエッチング等を含む微細加工によって、加圧室２２、第１流路２３、第１液室２５、第２流路２４、および第２液室２６が形成されている。
【００８３】
加圧室２２の位置では、シリコン基板がダイヤフラムに加工され、その外側表面には、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）セラミックスなどからなる圧電素子２１が貼着されている。
【００８４】
このマイクロポンプ１２は、圧電素子２１への制御電圧によって次のように駆動される。印加された所定波形の電圧により圧電素子２１が振動すると共に、加圧室２２の位置におけるシリコンダイヤフラムが振動し、これによって加圧室２２の体積が増減する。第１流路２３と第２流路２４とは、幅および深さが同じで、長さが第１流路２３よりも第２流路２４の方が長くなっている。第１流路２３では、差圧が大きくなると、流路内で乱流が発生し、流路抵抗が増加する。一方、第２流路２４では、流路幅が長いので差圧が大きくなっても層流になり易く、第１流路２３に比べて差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が小さくなる。
【００８５】
例えば、圧電素子２１に対する制御電圧を調整することにより、加圧室２２の内部へ向かう方向へ素早くシリコンダイヤフラムを変位させて大きい差圧を与えながら加圧室２２の体積を減少させ、次いで加圧室２２からその外側へ向かう方向へゆっくりシリコンダイヤフラムを変位させて小さい差圧を与えながら加圧室２２の体積を増加させると、駆動液は図１１において左から右へ向かう方向へ正方向に送液される。
【００８６】
これとは反対に、加圧室２２からその外側へ向かう方向へ素早くシリコンダイヤフラムを変位させて大きい差圧を与えながら加圧室２２の体積を増加させ、次いで加圧室２２の内部へ向かう方向へゆっくりシリコンダイヤフラムを変位させて小さい差圧を与えながら加圧室２２の体積を減少させると、駆動液は図１１の右から左へ逆方向に送液される。
【００８７】
なお、第１流路２３と第２流路２４における、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合の相違は、必ずしも流路の長さの違いによる必要はなく、他の形状的な相違に基づくものであってもよい。
【００８８】
マイクロポンプ１２による流量の制御は、圧電素子２１に印加する電圧を調整することにより行うことができる。
基板１９には、流路２０がパターニングされている。一例として、流路２０の寸法および形状は、幅が１５０μｍ程度、深さが３００μｍ程度の断面矩形状である。流路２０の下流側には、図９のマイクロリアクタの開口３２ａ〜３２ｋに位置合わせすることによりマイクロポンプ１２を検査チップの微細流路に連通させるための開口１５が設けられている。
【００８９】
流路２０の上流側は、基板１８の貫通孔１６ｂを介して、基板１７に設けられた流路を通りマイクロポンプ１２に連通されている。また、マイクロポンプ１２の上流側は、基板１７に設けられた流路から基板１８の貫通孔１６ａを介して、ガラス製の基板１９に設けられた開口１４に連通されている。この開口１４は不図示の駆動液タンクに接続されている。開口１４は、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）のパッキンを介して駆動液タンクに接続される。
【００９０】
開口１５ａ，１５ｂ，１５ｃはそれぞれ、図９のマイクロリアクタの開口３２ｃ，３２ｄ，３２ｅと連通される（なお、図１０ではマイクロポンプユニット全体のうち一部分のみ示している）。マイクロポンプ１２によって、流路２０、開口１５ａ、開口３２ｃを通じて駆動液を送液して試薬収容部３３ａに収容された試薬を下流へ押し出し、流路２０、開口１５ｂ、開口３２ｄを通じて駆動液を送液して試薬収容部３３ｂに収容された試薬を下流へ押し出し、流路２０、開口１５ｃ、開口３２ｅを通じて駆動液を送液して試薬収容部３３ｃに収容された試薬を下流へ押し出す。
【００９１】
マイクロリアクタは、例えば、別途のシステム本体に装着することにより反応と分析が行われる。このシステム本体とマイクロリアクタとによりマイクロ総合分析システムが構成される。このマイクロ総合分析システムの一例を以下に説明する。図１２は、マイクロ総合分析システムの一例を示した斜視図、図１３は、このマイクロ総合分析システムにおけるシステム本体の内部構成を示した図である。
【００９２】
このマイクロ総合分析システム２のシステム本体３は、分析のための各装置を収納する筺体状の収納体６２を備えている。この収納体６２の内部には、マイクロリアクタ１に連通させるための流路開口を有するチップ接続部１３と、複数のマイクロポンプ（図示せず）とが設けられたマイクロポンプユニット１１が配置されている。
【００９３】
さらに収納体６２の内部には、マイクロリアクタ１における反応を検出するための検出処理装置（ＬＥＤ、光電子増倍菅、ＣＣＤカメラ等の光源６８および、可視分光法、蛍光測光法などによる光学的な検出を行う検出器６９）と、この検出処理装置とマイクロポンプユニット１１とを制御する制御装置（図示せず）とが設けられている。この制御装置によって、マイクロポンプによる送液の制御、光学的手段等によりマイクロリアクタ１における反応を検出する検出処理装置の制御の他、後述する加熱・冷却ユニットによるマイク
ロリアクタ１の温度制御、マイクロリアクタ１における反応の制御、データの収集（測定）および処理等を行う。マイクロポンプの制御は、予め送液順序、流量、タイミングなどに関する諸条件が設定されたプログラムに従って、それに応じた駆動電圧をマイクロポンプに印加することによって行う。
【００９４】
このマイクロ総合分析システム２では、マイクロリアクタ１の微細流路の上流側（例えば試薬収容部、試料受容部などの上流側）に設けられた流路開口およびその周囲のチップ面からなるポンプ接続部３１と、マイクロポンプユニット１１のチップ接続部１３とを液密に密着させた状態でマイクロリアクタ１を収納体６２の内部に装着した後、マイクロリアクタ１において検体中の標的物質が分析される。マイクロリアクタ１は、搬送トレイ６５に載置されて挿入口６３から収納体６２の内部に導入される。しかし、マイクロリアクタがマイクロポンプユニットに対して加圧された状態でマイクロリアクタを収納体６２の内部に固定できるのであれば、必ずしも搬送トレイを用いる必要はない。
【００９５】
収納体６２の内部には、所定位置に装着されたマイクロリアクタ１を局所的に加熱もしくは冷却するための加熱・冷却ユニット（ペルチェ素子６６、ヒーター６７）が設けられている。例えば、マイクロリアクタ１における試薬収容部の領域にペルチェ素子６６を圧接することにより試薬収容部を選択的に冷却し、これによって試薬の変質等を防止するとともに、反応部を構成する流路の領域にヒーター６７を圧接することにより反応部を選択的に加熱し、これによって反応部を反応に適した温度にする。
【００９６】
マイクロポンプユニット１１は１つの駆動液タンク６１に接続され、マイクロポンプの上流側はこの駆動液タンク６１に連通している。一方、マイクロポンプの下流側は、マイクロポンプユニット１１の片面に設けられた流路開口に連通されており、それぞれのマイクロポンプに連通したそれぞれの流路開口と、マイクロリアクタ１のポンプ接続部３１に設けられたそれぞれの流路開口とが連結するようにマイクロリアクタ１がマイクロポンプユニット１１に対して接続される。
【００９７】
マイクロポンプによって、駆動液タンク６１に収容された鉱物油などのオイル系あるいは水系の駆動液を、ポンプ接続部３１を経由してマイクロリアクタ１における各液の収容部に送り出し、駆動液によって各収容部の液をマイクロリアクタ１の下流側へ押し出して送液する。
【００９８】
測定試料である検体の前処理、反応および検出の一連の分析工程は、マイクロポンプ、検出処理装置および制御装置が一体化されたシステム本体２に、マイクロリアクタ１を装着した状態で行なわれる。好ましくは、試料および試薬の送液、前処理、混合に基づく所定の反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される。図１２では、分析の結果が収納体６２の表示部６４に表示されるようになっている。
【００９９】
以下に、本発明のマイクロリアクタを用いた試料（検体）と試薬との反応およびその検出の具体的な例を示す。マイクロリアクタの好ましい一態様では、一つのチップ内において、
検体もしくは検体から抽出したアナライト（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子）が注入される試料受容部と、
検体の前処理を行う検体前処理部と、
プローブ結合反応、検出反応（遺伝子増幅反応または抗原抗体反応なども含む）などに用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ（例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイズさせるプローブ）が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部と、が設けられている。
【０１００】
このマイクロリアクタには、ポンプ接続部を介してマイクロポンプが接続され、試料受容部に注入された検体もしくは検体から抽出した生体物質（例えばＤＮＡまたはそれ以外の生体物質）と、試薬収容部に収容された試薬とを下流の流路へ送液し、微細流路の反応部、例えば遺伝子増幅反応（タンパク質の場合、抗原抗体反応など）を行う反応部で混合して反応させる。次いで、その下流側流路にある検出部へ、この反応液を処理した処理液と、プローブ収容部に収容されたプローブとを送液し、流路内で混合してプローブと結合（またはハイブリダイゼーション）させ、この反応生成物に基づいて生体物質の検出を行う。
【０１０１】
また、ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに収容されたネガティブコントロールについても同様に上記反応および検出を行う。
【０１０２】
試料受容部に注入された検体は、必要に応じて、試薬との混合前に、予め流路に設けられた検体前処理部にて、例えば検体と処理液とを混合することによって前処理される。この検体前処理部は、分離フィルター、吸着用樹脂、ビーズなどを含んでいてもよい。好ましい検体前処理としては、アナライトの分離または濃縮、除タンパクなどが挙げられる。例えば、１％ＳＤＳ混合液などの溶菌剤を用いて溶菌処理・ＤＮＡ抽出処理を行なう。この過程では、細胞内部からＤＮＡが放出され、ビーズまたはフィルターの膜面に吸着する。
【０１０３】
マイクロリアクタの試薬収容部には、必要な試薬が予め所定の量だけ封入されている。したがって使用時にその都度試薬を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。検体中の生体物質を分析する場合、測定に必要な試薬類は、通常それぞれ公知である。例えば、検体に存在する抗原を分析する場合、それに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬が使用される。抗体は、好ましくはビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。
【０１０４】
遺伝子検査用のマイクロリアクタに予め収容される試薬類には、遺伝子増幅に用いられる各種試薬の他、検出に使用されるプローブ類、発色試薬、前記の検体前処理に使用する前処理試薬などがある。
【０１０５】
マイクロポンプから駆動液を供給することにより、各試薬収容部から試薬を押し出してこれらを合流させることによって、混合試薬を生成する。この際、図１〜図３などに示した初期混合試薬の送出機構によって初期混合試薬を切り捨て、混合比率が安定した混合試薬のみを下流へ送り出す。
【０１０６】
その後、マイクロポンプから駆動液を供給することにより、試料受容部から検体を押し出し、混合比率が安定した混合試薬と合流させることによって、反応部にて、遺伝子増幅反応、アナライトのトラップまたは抗原抗体反応といった分析に必要な反応が開始される。
【０１０７】
ＤＮＡ増幅方法としては、改良点も含めて各種文献などに記載され、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。ＰＣＲ増幅法においては、３つの温
度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開２００４−１０８２８５号）。このデバイスシステムを本発明のチップの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業で行う従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。
【０１０８】
最近開発されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid
amplification）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できるため（特許第３４３３９２９号）、本発明システムにおいても好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明のシステムにおいては、１０〜２０分、好ましくは１５分で解析まで終わる。
【０１０９】
マイクロリアクタの微細流路における反応部よりも下流側には、アナライト、例えば増幅された遺伝子を検出するための検出部が設けられている。少なくともその検出部分は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。
【０１１０】
微細流路上の検出部に吸着されたビオチン親和性タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン）は、プローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと特異的に結合する。これにより、ビオチンで標識されたプローブまたは増幅された遺伝子が本検出部位でトラップされる。
【０１１１】
分離されたアナライトまたは増幅された目的遺伝子のＤＮＡを検出する方法は特に限定されないが、好ましい態様として基本的には以下の工程で行われる。
（１ａ） 検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、５’位置でビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。
【０１１２】
反応部の微細流路内で遺伝子増幅反応を行った後、微細流路内で増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合して、増幅された遺伝子を変性処理により一本鎖にし、これと末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡと
をハイブリダイズさせる。
【０１１３】
次いで、ビオチン親和性タンパク質を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、前記増幅遺伝子を微細流路内の検出部位にトラップする（増幅遺伝子を検出部位でトラップした後に蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせてもよい。）。
（１ｂ） 検体に存在する抗原、代謝物質、ホルモンなどのアナライトに対する特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬を検体と混合する。その場合、抗体は、ビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。したがって抗原抗体反応により得られる生成物は、ビオチンおよびＦＩＴＣを有する。これをビオチン親和性タンパク質（好ましくはストレプトアビジン）を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、ビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合を介して該検出部位に固定化する。
（２） 上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化したアナライト・抗体反応物のＦＩＴＣに、あるいは遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
（３） 上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
【０１１４】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定される
ことはなく、その要旨を逸脱しない範囲内において各種の変形、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、本発明の一実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図であり、２つの試薬が合流して混合流路５ｃで混合された状態を示している。
【図２】図２は、図１の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端側へ通過した状態を示した図である。
【図３】図３は、図１の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端に達した後、混合試薬が送出流路へ流出した状態を示した図である。
【図４】図４は、撥水バルブを示した図である。
【図５】図５は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図であり、２つの試薬が合流して混合流路５ｃで混合された状態を示している。
【図６】図６は、図５の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端側へ通過した状態を示した図である。
【図７】図７は、図５の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端に達した後、混合試薬が送出流路へ流出した状態を示した図である。
【図８】図８は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図であり、試料との混合部よりも上流側の流路構成を示している。
【図９】図９は、本発明のマイクロリアクタの他の実施例を示した平面図である。
【図１０】図１０は、図９のマイクロリアクタに使用されるマイクロポンプユニットの斜視図である。
【図１１】図１１は、図１０のマイクロポンプユニットの断面図である。
【図１２】図１２は、マイクロ総合分析システムの一例を示した斜視図である。
【図１３】図１３は、このマイクロ総合分析システムにおけるシステム本体の内部構成を示した図である。
【符号の説明】
【０１１６】
１ マイクロリアクタ
２ マイクロ総合分析システム
３ システム本体
５ａ 流路
５ｂ 流路
５ｃ 混合流路
５ｄ 送出流路
６ 合流部
７ａ 試薬
７ｂ 試薬
７ｃ 混合試薬
７ｄ 初期混合試薬
８ 下流末端
９ 能動弁
１１ マイクロポンプユニット
１２，１２ｈ〜１２ｊ マイクロポンプ
１３ チップ接続部
１４ 開口
１５，１５ａ〜１５ｃ 開口
１６ａ 貫通孔
１６ｂ 貫通孔
１７ 基板
１８ 基板
１９ 基板
２０ 流路
２１ 圧電素子
２２ 加圧室
２３ 第１流路
２４ 第２流路
２５ 第１液室
２６ 第２液室
３１ ポンプ接続部
３２ａ〜３２ｋ 開口
３３ａ〜３３ｃ，３３ｈ〜３３ｊ 試薬収容部
３４ａ,３４ｂ 端部
３５ 合流部
３６ 試薬混合部
３７ 試料受容部
３８ 合流部
３９ 反応部
４０ 検出部
５１，５１ａ〜５１ｅ 撥水バルブ
５２ 送液制御通路
５３ａ，５３ｂ 流路
５４ 液
６１ 駆動液タンク
６２ 収納体
６３ 挿入口
６４ 表示部
６５ 搬送トレイ
６６ ペルチェ素子
６７ ヒーター
６８ 光源
６９ 検出器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、遺伝子増幅反応、抗原抗体反応などによる生体物質の検査・分析、その他の化学物質の検査・分析、有機合成等による目的化合物の化学合成などに用いられるマイクロリアクタに関するものであり、特に、複数の試薬を混合した混合試薬と試料とを混合して反応させる際に、安定した混合比率の混合試薬を後続する工程へ送出する技術の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、セ
ンサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている（特許文献
１）。これは、μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・
オン・チップ（Lab-on-chips）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。現実には遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
【０００３】
各種の分析、検査ではこれらの分析用チップにおける分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。そのためにはシンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題である。精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマイクロポンプシステムおよびその制御方法を本発明者らはすでに提案している（特許文献２〜４）。
【０００４】
微細流路内で各成分の反応を行う上記のような分析用チップでは、微細流路内でこれらの成分を合流させて混合する工程が必要となる（特許文献５）。例えば、分析対象の試料と反応させる試薬が複数である場合には、予め複数の試薬を微細流路内で合流させて混合試薬を得る必要がある。
【特許文献１】特開２００４−２８５８９号公報
【特許文献２】特開２００１−３２２０９９号公報
【特許文献３】特開２００４−１０８２８５号公報
【特許文献４】特開２００４−２７０５３７号公報
【特許文献５】特開２００５−６６４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、複数の試薬を合流させて混合する際に、マイクロポンプによって各試薬を合流部へ同じタイミングで送り出したとしても、タイミングが高精度に合っていない限り、液の先頭部分では各試薬の混合比率を安定させることが難しい。この先頭部分の初期混合試薬を下流において試料と合流させて反応を行うと、この先頭部分では混合比率が安定していないので不具合が生じる場合が多い。
【０００６】
本発明は、マイクロポンプによって複数の試薬をそれぞれの試薬収容部から下流側へ送出し、これらの試薬を合流させて混合し、得られた混合試薬をそのさらに下流において試料と合流させて反応部で反応を行う際に、混合比率が安定した混合試薬のみを後続する工程へ送出可能なマイクロリアクタを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のマイクロリアクタは、板状のチップと、
複数の試薬が個別に収容される収容室からなる複数の試薬収容部と、
前記複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
外部から試料を注入するための注入口を有する試料受容部と、
前記試薬混合部から送出される混合試薬と、前記試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部と、を備え、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は、前記チップ内に組み込まれて流路により互いに連通され、
前記試薬混合部において生成された混合試薬のうち、初期に混合された初期混合試薬を前記反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えることを特徴とする。
【０００８】
上記の発明における好ましい態様では、前記試薬混合部は、前記複数の試薬を混合する流路であって混合試薬の流れが停止される下流末端が設けられた混合流路からなり、
該混合流路の中間部において、前記反応部へ混合試薬を送出する送出流路が分岐され、
前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路とから構成されており、
前記初期混合試薬は、前記混合流路の中間部と下流末端との間に収容されて前記送出流路から前記反応部への送出が防止される。
【０００９】
この場合、前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路との接続部に、混合流路内の圧力が所定圧以上となった際に送出流路へ混合試薬を送出する送液制御部を備えることが好ましい。
【００１０】
このような送液制御部は、前記混合流路と送出流路との接続部における送出流路側に設けられた、送出流路の断面積よりも小さい断面積を有する細流路で構成することができる。
【００１１】
上記の発明では、混合当初の初期混合試薬を混合流路の下流末端側へトラップして切り捨てるようにしたので、試薬同士の合流のタイミングが多少ずれていても、混合比率が安定した混合試薬のみを後続する工程へ送り出すことができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、試薬同士の合流のタイミングが多少ずれていても、混合比率が安定した混合試薬のみを後続する工程へ送り出すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明について詳細に説明する。本発明のマイクロリアクタは、板状のチップ内に設けられた微細流路または構造部において、各種の検査、化学分析、化学合成、試料の処理・分離などの目的で試料と試薬との反応を行うものである。
【００１４】
本発明のマイクロリアクタの用途には、例えば、遺伝子増幅反応、抗原抗体反応などによる生体物質の検査・分析、その他の化学物質の検査・分析、有機合成などによる目的化合物の化学合成、薬効スクリーニング、薬品抽出、金属錯体の形成・分離などが含まれる。
【００１５】
本発明のマイクロリアクタは、板状のチップ内に、
（i）複数の試薬が個別に収容される収容室からなる複数の試薬収容部
（ii）前記複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部
（iii）外部から試料を注入するための注入口を有する試料受容部
（iv）前記試薬混合部から送出される混合試薬と、前記試薬受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部
を備えている。
【００１６】
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は、前記チップ内に組み込まれて流路により互いに連通されている。
上記の各部の他、チップ内には、必要に応じて、各種の機能をもつ構造部が設けられる。このような構造部の具体例としては、送液を制御するための部位、試料および試薬以外の処理液を収容するための収容部、生体試料等に含まれる不要成分を除去するために試薬との反応に先立って前処理を行うための前処理部、反応後の液に含まれる標的物質等を検出するための検出部、廃液を貯留するための廃液貯留部、液を送出するためのマイクロポンプなどが挙げられる。
【００１７】
送液を制御するための部位の具体例としては、逆止弁、能動弁のような弁部などが挙げられる。
各処理液を収容するための収容部の具体例としては、流路壁、ビーズ等の担体などに必要物質を吸着させた状態で洗浄を行うための洗浄液の収容部、試薬と試料との反応を停止させる反応停止液の収容部、反応生成物を検出に適するように変性させるための変性処理液の収容部、光学的検出のために反応生成物を蛍光物質等で標識するための標識用試薬の収容部、その他、抽出液、溶離液、溶菌試薬、溶血試薬等の収容部などが挙げられる。
【００１８】
検出部は、マイクロリアクタ内における反応生成物を光学的に検出する場合には、例えば、光透過性の部材を用いて形成された流路部位または液溜状の部位から構成される。
前処理部は、試料に含まれる分析対象物の濃縮、分離、溶菌等を行う部位であり、例えば、生体試料に含まれるタンパク質やイオン性物質等の除去が行われる。このような処理は、例えば、フィルター、ビーズ、ゲル、メンブレンなどの担体を流路内に配置し、この担体に生体物質等を吸着させて該流路内に溶菌試薬、溶血試薬等を流し、次いで洗浄液を流すことにより行うことができる。
【００１９】
廃液貯留部は、例えば、所要の大きさをもつ凹部が形成された基材を、流路用の基材の下部側に貼り合わせることによって設けられた、流路と連通する空間により構成される。必要に応じて、該空間にはスポンジ等の廃液吸収用の多孔体が収納される。
【００２０】
マイクロポンプは、試薬収容部に収容された各試薬、他の収容部に収容された液などの各液を流路下流側へ送出する。マイクロポンプは通常、送出すべき液に対応して複数個が設置され、それぞれのマイクロポンプは水性または油性の駆動液を下流側へ送出し、試料や試薬等の液を駆動液で下流側へ押し出して送液を行う。
【００２１】
マイクロポンプは、マイクロリアクタに直接形成する場合もあるが、マイクロリアクタとは別途に、すなわち板状のチップとは独立して設置することができる。例えば、マイクロポンプおよびその制御装置、反応検出用の光学検出装置、温度制御装置、駆動液を収容した駆動液タンクなどを備えた装置本体と、予め試薬を封入したマイクロリアクタと、から試料検査装置を構成する場合が挙げられる。
【００２２】
この場合、マイクロリアクタの試料受容部に試料を注入した後、このマイクロリアクタを装置本体に装着して、装置本体側の複数のマイクロポンプと、これらのマイクロポンプに対応するマイクロリアクタの各流路とを連通させる。この状態で、駆動液タンクからの駆動液をマイクロポンプによりマイクロリアクタの流路へ送り出し、これによって流路内の液、例えば試薬収容部の試薬、試料受容部の試料などを下流側へ押し出して試薬同士の
混合、試薬と試料との混合などを行う。
【００２３】
マイクロポンプは、フォトリソグラフィ技術などにより作製され、特開２００１−３２２０９９号公報、特開２００４−１０８２８５号公報に記載されたピエゾ素子により駆動するマイクロポンプ、アクチュエータを設けた弁室の流出入孔に逆止弁を設けた逆止弁型のマイクロポンプなど各種のものが使用できる。なお、上記のピエゾ素子により駆動するマイクロポンプは、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、第１流路および第２流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるピエゾアクチュエータとを備えており、このアクチュエータを別途の制御装置により電圧で駆動することにより正逆方向への送液ができるようになっている。
【００２４】
マイクロリアクタは、板状の基材を用いて、フォトリソグラフィ技術などの微細加工技術を適用して作製される。通常は、流路および構造部となる凹部を１または２以上の基材に形成した後、複数枚の基材を貼り合わせることによってマイクロリアクタを作製する。
【００２５】
マイクロリアクタを構成する基材の材料には、目的に応じて各種のものが使用される。その具体例としては、ポリスチレンなどのプラスチック樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのゴム系材料、各種の無機ガラス、シリコン、セラミックス、金属などが挙げられる。また、流路壁面に対して、目的に応じて疎水化処理、親水化処理などの各種の表面処理を行ってもよい。
【００２６】
マイクロリアクタにおける流路幅のサイズは、マイクロスケール空間の利点、流路抵抗などを考慮して適宜に設計されるが、例えば、幅が数十〜数百μｍ、好ましくは５０〜２００μｍであり、深さが２５〜３００μｍ、好ましくは５０〜１００μｍである。マイクロリアクタのチップ全体の縦横サイズは、用途等にもよるが、典型的には数十ｍｍ、その高さは典型的には数ｍｍ程度である。
【００２７】
本発明のマイクロリアクタにおける試料受容部は、試料を一時収容する収容室と、外部から収容室へ試料を注入するための注入口とを備えている。この収容室は、流路形状、液溜形状など各種の形状であってよい。
【００２８】
試料受容部の注入口は、例えば、チップ上面から微量試料を注入できるように構成されている。外部への漏失、汚染、生体試料を使用する場合の感染などを防ぎ、密封性を確保するために、ゴム状材質などの弾性体からなる栓が注入口に形成されているか、あるいはポリジメチルシロキサンなどのゴム材、強化フィルム等で注入口が覆われていることが望ましい。例えば、ゴム材質の栓に突き刺したニードルまたは蓋付き細孔に通したニードルでシリンジ内の試料を注入する。前者の場合、ニードルを抜くとその針穴が直ちに塞がることが好ましい。また、これら以外の試料注入機構を設置してもよい。
【００２９】
試料受容部の上流側は、マイクロポンプに連通される流路に連通し、その下流側は、試薬との混合部に連通している。試料受容部に注入された試料は、マイクロポンプによって供給された駆動液により下流側へ押し出され、必要に応じて前処理された後、試薬と混合される。
【００３０】
試料受容部に注入される試料は、目的に応じて各種のものが対象となる。例えば、生体物質の検査・分析を行う場合には、生体由来のアナライト含有試料、例えば全血、血漿、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰などが挙げられる。遺伝子検査の場合、増幅反応の鋳型となる核酸として遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡがアナライトである。また、このような核酸を含む可能性のある試料から調製または単離したものを試料としてもよい
。他のアナライトとしては、各種の代謝物質、ホルモン、タンパク質（酵素、抗原なども含む）などが挙げられる。
【００３１】
その他、化学合成を目的とする場合には、試薬と反応させる原料化合物が試料となり、薬効スクリーニング、薬品抽出、金属錯体の形成・分離などを目的とする場合には、それらを行うために試薬と反応させる対象が試料となる。
【００３２】
本発明のマイクロリアクタにおける試薬収容部は、試薬を収容する収容室から構成されている。この収容室は、流路形状、液溜形状など各種の形状であってよい。試薬収容部の上流側は、マイクロポンプに連通される流路に連通し、その下流側は、他の試薬との混合部に連通している。試薬収容部に収容された試薬は、マイクロポンプによって供給された駆動液により下流側へ押し出され、他の試薬と合流して混合される。
【００３３】
試薬は、目的に応じて各種のものが対象となる。例えば、ＰＣＲ法により検体中に含まれる遺伝子を増幅する場合における試薬には、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸のほか、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Vent ＤＮＡポリメラーゼまたはPfu ＤＮ
Ａポリメラーゼが含まれる。
【００３４】
また、特許第３４３３９２９号に記載されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification ）法により検体中に含まれる遺伝子を増幅する場
合における試薬には、少なくとも２'−デオキシヌクレオシド５'−三リン酸、検出したい遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできるキメラプライマー、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼのＲＮaseが含まれる。
【００３５】
その他、化学合成を目的とする場合には、試料と反応させる原料化合物などが試薬となり、薬効スクリーニング、薬品抽出、金属錯体の形成・分離などを目的とする場合には、それらを行うために試料と反応させる物質などが試薬となる。
【００３６】
遺伝子検査などの用途では、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、試薬収容部に予め試薬が収容されていることが望ましい。この場合、内蔵される試薬の蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、試薬収容部の上流側および下流側を封止することが好ましい。
【００３７】
試薬収容部の封止は、封止剤により行うことができる。この封止剤は、使用前にマイクロリアクタが保管される冷蔵条件下では、固化もしくはゲル化しており、使用時、室温にすると融解し流動状態となるものである。例えば、油脂、ゼラチンの水溶液などを使用することができる。
【００３８】
また、試薬収容部の収容室の上流側端部または下流側端部、あるいはこれらの両方に、後述する図４の撥水バルブを設けてもよい。これによって、マイクロリアクタの保管時における試薬の外部への流出を有効に防止できると共に、使用時には、マイクロポンプによって容易に試薬を外部へ押し出すことができる。
【００３９】
反応部では、試料と混合試薬との混合液が導入された後、例えば、昇温などにより反応が開始される。反応部は、液溜形状、流路形状など各種の形状であってよく、例えば試料と混合試薬とを液溜に貯留して反応を行う態様、試料と混合試薬とを微細流路内に合流させて、合流液の送液方向をマイクロポンプにより切り替えて、合流液を微細流路内で繰り返し前後動させながら反応させる態様など、試料と試薬の種類等に応じて適宜の反応形態とすることができる。
【００４０】
以上に説明したマイクロリアクタにおいて、マイクロポンプによって複数の試薬をそれぞれの試薬収容部から下流側へ送出し、これらの試薬を合流させて混合し、得られた混合試薬をそのさらに下流において試料と合流させて反応部で反応を行うのであるが、複数の試薬を合流させて混合する際に、各試薬を合流部へ同じタイミングで送り出したとしても、タイミングが高精度に合っていない限り、液の先頭部分では各試薬の混合比率を安定させることが難しい。この先頭部分の初期混合試薬を下流において試料と合流させて反応を行うと、この先頭部分では混合比率が安定していないので不具合が生じる場合が多い。そのため、混合比率が安定してから混合試薬を次工程へ送り出すことが望ましい。
【００４１】
そこで本発明では、複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部において生成された混合試薬のうち、初期に混合された初期混合試薬を前記反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えている。以下、図１〜図３および図５〜図７を参照しながら初期混合試薬の送出防止機構について説明する。
【００４２】
図１は、本発明の一実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図である。本実施例では、試薬７ａと試薬７ｂとの２種類の試薬により混合試薬７ｃを得る場合を示している。
【００４３】
同図において、５ａは試薬７ａが送出される流路であり、その上流側は、試薬７ａが収容される試薬収容部（図示せず）に連通している。
５ｂは、試薬７ｂが送出される流路であり、その上流側は、試薬７ｂが収容される試薬収容部（図示せず）に連通している。
【００４４】
５ｃは、試薬７ａと試薬７ｂとを混合して混合試薬７ｃを生成する混合流路（試薬混合部）であり、流路５ａと流路５ｂとの合流部６から、混合試薬７ｃの流れが停止される下流末端８までの流路で構成されている。
【００４５】
混合流路５ｃの中間部では、下流の反応部（図示せず）へ混合試薬７ｃを送出する送出流路５ｄが分岐されている。送出流路５ｄは、混合流路５ｃとの分岐点から先の流路で構成されている。
【００４６】
混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部における送出流路５ｄ側には、撥水バルブ５１ａが設けられている。この撥水バルブ（送液制御部）は、図４に示した構造を備えている。同図の撥水バルブ５１は、細径の送液制御通路５２を備えている。送液制御通路５２は、その断面積（流路に対して垂直な断面の断面積）が、上流側の流路５３ａおよび下流側の流路５３ｂの断面積よりも小さい細流路である。
【００４７】
流路壁がプラスチック樹脂などの疎水性の材質で形成されている場合には、送液制御通路５２に接する液５４は、流路壁との表面張力の差によって、下流側の流路５３ｂへ通過することが規制される。
【００４８】
下流側の流路５３ｂへ液５４を流出させる際には、マイクロポンプによって所定圧以上の送液圧力を加え、これによって表面張力に抗して液５４を送液制御通路５２から下流側の流路５３ｂへ押し出す。液５４が流路５３ｂへ流出した後は、液５４の先端部を下流側の流路５３ｂへ押し出すのに要する送液圧力を維持せずとも液が下流側の流路５３ｂへ流れていく。すなわち、上流側から下流側への正方向への送液圧力が所定圧力に達するまで送液制御通路５２から先への液の通過が遮断され、所定圧以上の送液圧力が加わることにより液５４は送液制御通路５２を通過する。
【００４９】
流路壁がガラスなどの親水性の材質で形成されている場合には、少なくとも送液制御通
路５２の内面に、撥水性のコーティング、例えばフッ素系のコーティングを施す必要がある。
【００５０】
図１において、初期混合試薬７ｄは、以下に説明する作用により、混合流路５ｃの送出流路５ｄとの分岐点において、下流末端８側へ選択的に送り出され、混合流路５ｃの下流側にトラップされる。これにより、初期混合試薬７ｄが送出流路５ｄ側へ流出することが防止される。
【００５１】
図１に示したように、マイクロポンプにより試薬収容部から流路５ａへ送り出された試薬７ａと、別途のマイクロポンプにより他の試薬収容部から流路５ｂへ送り出された試薬７ｂとは、合流部６で合流し、混合流路５ｃで混合される。
【００５２】
この際、マイクロポンプによる混合試薬７ｃの送液圧力を、初期混合試薬７ｄおよび混合試薬７ｃが撥水バルブ５１ａを通過可能な圧力よりも小さな圧力として混合流路５ｃ内の混合試薬７ｃを送液する。これにより、図２に示したように、混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部において、初期混合試薬７ｄは送出流路５ｄ側には流出せずに混合流路５ｃの下流末端８側へ送り出される。
【００５３】
そして、初期混合試薬７ｄが混合流路５ｃの下流末端８に達した後、マイクロポンプによる混合試薬７ｃの送液圧力を、混合試薬７ｃが撥水バルブ５１ａを通過可能な圧力以上の圧力とする。これにより、図３に示したように、混合流路５ｃ内の混合試薬７ｃは、撥水バルブ５１ａを通過し、混合試薬７ｃは送出流路５ｄに流出する。
【００５４】
以上のようにマイクロポンプによる送液圧力を制御することで、初期混合試薬７ｄは混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容され、送出流路５ｄには、初期混合試薬７ｄが切り捨てられた混合試薬７ｃのみが送出される。すなわち、混合比率が安定した混合試薬だけを後続する工程へ供給することができる。
【００５５】
なお、本実施例では、混合流路５ｃの下流末端８にも撥水バルブ５１ｂを設けている。この撥水バルブ５１ｂは、初期混合試薬７ｄが下流側の流路へ通過可能な送液圧力が、撥水バルブ５１ａにおいて混合試薬７ｃが送出流路５ｄ側へ通過可能な送液圧力よりも大きい撥水バルブである。
【００５６】
したがって、初期混合試薬７ｄが混合流路５ｃの下流末端８に達した後、マイクロポンプによる混合試薬７ｃの送液圧力を、混合試薬７ｃが撥水バルブ５１ａを通過可能であり、且つ、初期混合試薬７ｄが撥水バルブ５１ｂを通過できない圧力とすることで、図３に示したように、混合試薬７ｃを撥水バルブ５１ａの先へ通過させると共に、混合流路５ｃの下流末端８において初期混合試薬７ｄが撥水バルブ５１ｂの先へ通過することを防止できる。
【００５７】
例えば、撥水バルブ５１ａにおける送液制御通路（図４の符号５２）の断面積を、撥水バルブ５１ｂにおける送液制御通路の断面積よりも大きくすることによって、これらの送液制御通路を液が通過可能な送液圧力に差をもたせることができる。この他、場合によっては、撥水バルブ５１ａと撥水バルブ５１ｂとの間で、液と送液制御通路の流路壁との表面張力差を相違させることで、液が通過可能な送液圧力に差をもたせることも考えられる。
【００５８】
例えば、撥水バルブ５１ｂよりも先の流路は、廃液貯留部に連通される。この場合、全ての反応、検出工程を終えた後などの適切な時期に、混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容された初期混合試薬７ｄおよび混合試薬７ｃを、マイクロポンプの送液圧力
を上げることによって撥水バルブ５１ｂよりも先の流路へ押し出し、その先の廃液貯留部に収容する。
【００５９】
なお、本実施例では混合流路５ｃの下流末端８にこのような撥水バルブ５１ｂを設けたが、下流末端８に撥水バルブ５１ｂを設けずに、下流末端８完全に封止する構造としてもよい。
【００６０】
図５は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図である。なお、図１〜図３と対応する構成要素は同一の符号で示しその詳細な説明を省略する。
【００６１】
本実施例では、基本的な構成は上述した実施例と同様であるが、混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部における送出流路５ｄ側に、能動弁９が設けられている。初期混合試薬７ｄは、以下に説明する作用によって、混合流路５ｃの送出流路５ｄとの分岐点において、選択的に下流末端８側へ送り出され、混合流路５ｃの下流側にトラップされる。これにより、初期混合試薬７ｄが送出流路５ｄ側へ流出することが防止される。
【００６２】
図５に示したように、マイクロポンプにより試薬収容部から流路５ａへ送り出された試薬７ａと、別途のマイクロポンプにより他の試薬収容部から流路５ｂへ送り出された試薬７ｂとは、合流部６で合流し、混合流路５ｃで混合される。
【００６３】
この際、能動弁９は閉止した状態になっており、図６に示したように、混合流路５ｃと送出流路５ｄとの接続部において、初期混合試薬７ｄは送出流路５ｄ側には流出せずに混合流路５ｃの下流末端８側へ送り出される。
【００６４】
そして、初期混合試薬７ｄが混合流路５ｃと送出流路５ｄとの分岐点を通過した後、能動弁９を開放する。これにより、図７に示したように、混合流路５ｃ内の混合試薬７ｃは、能動弁９を通過し、混合試薬７ｃは送出流路５ｄに流出する。
【００６５】
以上のように能動弁９を制御することで、初期混合試薬７ｄは混合流路５ｃの中間部と下流末端８との間に収容され、送出流路５ｄには、初期混合試薬７ｄが切り捨てられた混合試薬７ｃのみが送出される。すなわち、混合比率が安定した混合試薬だけを後続する工程へ供給することができる。
【００６６】
なお、能動弁９として、公知である各種の構造のものをマイクロリアクタに形成することができる。例えば、空気圧ピストン、油圧ピストン、水圧ピストン、圧電アクチュエータ、形状記憶合金アクチュエータなどにより、柔軟な材質からなる基材を上方から押圧して、この基材の下方に配置された開口を覆って流路を塞ぐ構造の能動弁、弁体としてバイメタルを使用し、通電加熱により弁体を変形させて流路を塞ぐ構造の能動弁、弁体として形状記憶合金を使用し、通電加熱により弁体を変形させて流路を塞ぐ構造の能動弁などが使用できる。弁の開閉制御は、外部の制御装置による電圧駆動などによって行う。
【００６７】
以上に説明した、本発明のマイクロリアクタが備える初期混合試薬の送出防止機構は、混合流路と送出流路とから構成されており、初期混合試薬は、混合流路の中間部と下流末端との間に収容されて送出流路から反応部への送出が防止される。
【００６８】
このような初期混合試薬の送出防止機構を備えた２つの実施例について説明したが、この他、例えば混合流路の断面積と、送出流路の断面積とを相違させることにより、毛細管力によって初期混合試薬を選択的に混合流路の流路末端側へ導くことで、初期混合試薬の送出流路側への送出を防止できる。
【００６９】
あるいは、混合流路の流路壁の表面張力と、送出流路の流路壁の表面張力とを、流路材質または流路壁の表面処理等により相違させ、表面張力によって初期混合試薬を選択的に混合流路の流路末端側へ導くことで、初期混合試薬の送出流路側への送出を防止できる。
【００７０】
図８は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図であり、試料との混合部よりも上流側の流路構成を示している。
３種類の各試薬は、試薬収容部３３ｈ、３３ｉ、３３ｊのそれぞれに収容され、各試薬収容部の上流側には、マイクロリアクタとは別途の装置に内蔵されたマイクロポンプ１２ｈ，１２ｉ，１２ｊがポンプ接続部３１で接続され、各試薬収容部から下流側の混合流路５ｃへこれらのマイクロポンプにより試薬が送液される。
【００７１】
混合流路５ｃと、混合流路５ｃから分岐した送出流路５ｄと、撥水バルブ５１ａ、５１ｂは、図１と同様な初期混合試薬の送出防止機構を構成しており、試薬収容部３３ｈ、３３ｉ、３３ｊから送出され混合流路５ｃで合流した各試薬の混合液の先端部を切り捨て、混合状態が安定した後に混合試薬を次工程へ送出するようにしている。
【００７２】
図９は、本発明のマイクロリアクタの他の実施例を示した平面図である。本実施例のマイクロリアクタ１には、試薬の収容室である流路状の試薬収容部３３ａ、３３ｂ、３３ｃのそれぞれに３種類の試薬が収容されている。これらの試薬収容部の両端部（試薬収容部３３ａでは上流側の端部３４ａおよび下流側の端部３４ｂ）には、図４に示した構造の撥水バルブが設けられ、これらの撥水バルブの間の流路に試薬が封入されている。
【００７３】
なお、詳細な説明は省略するが、図９のマイクロリアクタ１の微細流路には、試薬収容部３３ａ〜３３ｃの両端部以外の位置にも図４の撥水バルブが設けられており、例えば、混合試薬と試料との合流部３８における混合試薬の入口と試料の入口などにも上記の撥水バルブが設けられており、この撥水バルブによってその先の流路への送液開始のタイミングが制御される。
【００７４】
図９の試薬収容部３３ａ〜３３ｃの上流側には、マイクロリアクタ１の一方の面から外部へ開放された開口３２ｃ〜３２ｅが設けられている。これらの開口３２ｃ〜３２ｅは、マイクロリアクタ１を後述するマイクロポンプユニットに重ね合わせて接続した際に、マイクロポンプユニットの接続面に設けられた流路開口と位置合わせされてマイクロポンプに連通される。
【００７５】
なお、開口３２ａ，３２ｂおよび３２ｆ〜３２ｋも同様に、マイクロリアクタ１とマイクロポンプユニットとの接続によってマイクロポンプに連通される。これらの開口３２ａ〜３２ｋを含むチップ面によってポンプ接続部が構成され、ポンプ接続部をマイクロポンプユニットの接続面に密着させることによってマイクロリアクタ１とマイクロポンプユニットとが接続される。
【００７６】
このポンプ接続部は、必要なシール性を確保して駆動液の漏出を防止するために、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン樹脂などの柔軟性（弾性、形状追随性）をもつ樹脂によって密着面が形成されることが好ましい。このような柔軟性を有する密着面は、例えばマイクロリアクタの構成基材自体によるものであってもよく、また、ポンプ接続部における流路開口の周囲に貼着された柔軟性を有する別途の部材によるものであってもよい。
【００７７】
試薬収容部３３ａ〜３３ｃに収容された試薬は、開口３２ｃ〜３２ｅに連通するそれぞれ別途のマイクロポンプによって、試薬収容部３３ａ〜３３ｃの下流側端部に設けられた撥水バルブ（図示せず）を通過して合流部３５へ流れ込み、その先に続く流路である混合
流路５ｃ（試薬混合部３６）で３種類の各試薬が混合される。
【００７８】
なお、この混合流路５ｃと、送出流路５ｄとを含む流路系によって、図１または図５の実施例に示したような初期混合試薬の送出防止機構が構成されており、初期混合試薬を混合流路５ｃの流路末端８にトラップするようにしている。
【００７９】
混合流路５ｃで混合され送出流路５ｄに送り出された混合試薬は、試料受容部３７に収容された試料と合流部３８で合流する。なお、混合試薬は開口３２ｂに連通したマイクロポンプによって駆動液で下流へ押し出され、試料は開口３２ａに連通したマイクロポンプによって駆動液で下流へ押し出される。混合試薬と試料との混合液は、反応部３９へ収容され加熱等によって反応が開始される。
【００８０】
反応後の液は、検出部４０へ送液され、例えば光学的な検出方法などによって標的物質が検出される。なお、開口３２ｆ〜３２ｊに連通するそれぞれ別途のマイクロポンプによって、これらの開口から先の流路に予め収容された各試薬（例えば混合試薬と試料との反応を停止させる液、検出対象の物質に対して標識などの必要な処理を行うための液、洗浄液など）を所定のタイミングで下流へ押し出して送液するようにしている。
【００８１】
図１０は、図９のマイクロリアクタに使用されるマイクロポンプユニットの斜視図、図１１は、その断面図である。このマイクロポンプユニット１１は、シリコン製の基板１７と、その上のガラス製の基板１８と、その上のガラス製の基板１９との３つの基板から構成されている。基板１７と基板１８、および基板１８と基板１９はそれぞれ、陽極接合によって接合されている。
【００８２】
シリコン製の基板１７と、その上に陽極接合によって貼り合わされたガラス製の基板１８との間の内部空間によってマイクロポンプ１２（ピエゾポンプ）が構成されている。
基板１７は、シリコンウエハをフォトリソグラフィ技術により所定の形状に加工したものである。例えば、シリコン基板面への酸化膜の形成、レジスト塗布、レジストの露光および現像、酸化膜のエッチング、ＩＣＰ（高周波誘導結合型プラズマ、Inductively Coupled Plasma）などによるシリコンのエッチング等を含む微細加工によって、加圧室２２、第１流路２３、第１液室２５、第２流路２４、および第２液室２６が形成されている。
【００８３】
加圧室２２の位置では、シリコン基板がダイヤフラムに加工され、その外側表面には、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）セラミックスなどからなる圧電素子２１が貼着されている。
【００８４】
このマイクロポンプ１２は、圧電素子２１への制御電圧によって次のように駆動される。印加された所定波形の電圧により圧電素子２１が振動すると共に、加圧室２２の位置におけるシリコンダイヤフラムが振動し、これによって加圧室２２の体積が増減する。第１流路２３と第２流路２４とは、幅および深さが同じで、長さが第１流路２３よりも第２流路２４の方が長くなっている。第１流路２３では、差圧が大きくなると、流路内で乱流が発生し、流路抵抗が増加する。一方、第２流路２４では、流路幅が長いので差圧が大きくなっても層流になり易く、第１流路２３に比べて差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が小さくなる。
【００８５】
例えば、圧電素子２１に対する制御電圧を調整することにより、加圧室２２の内部へ向かう方向へ素早くシリコンダイヤフラムを変位させて大きい差圧を与えながら加圧室２２の体積を減少させ、次いで加圧室２２からその外側へ向かう方向へゆっくりシリコンダイヤフラムを変位させて小さい差圧を与えながら加圧室２２の体積を増加させると、駆動液は図１１において左から右へ向かう方向へ正方向に送液される。
【００８６】
これとは反対に、加圧室２２からその外側へ向かう方向へ素早くシリコンダイヤフラムを変位させて大きい差圧を与えながら加圧室２２の体積を増加させ、次いで加圧室２２の内部へ向かう方向へゆっくりシリコンダイヤフラムを変位させて小さい差圧を与えながら加圧室２２の体積を減少させると、駆動液は図１１の右から左へ逆方向に送液される。
【００８７】
なお、第１流路２３と第２流路２４における、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合の相違は、必ずしも流路の長さの違いによる必要はなく、他の形状的な相違に基づくものであってもよい。
【００８８】
マイクロポンプ１２による流量の制御は、圧電素子２１に印加する電圧を調整することにより行うことができる。
基板１９には、流路２０がパターニングされている。一例として、流路２０の寸法および形状は、幅が１５０μｍ程度、深さが３００μｍ程度の断面矩形状である。流路２０の下流側には、図９のマイクロリアクタの開口３２ａ〜３２ｋに位置合わせすることによりマイクロポンプ１２を検査チップの微細流路に連通させるための開口１５が設けられている。
【００８９】
流路２０の上流側は、基板１８の貫通孔１６ｂを介して、基板１７に設けられた流路を通りマイクロポンプ１２に連通されている。また、マイクロポンプ１２の上流側は、基板１７に設けられた流路から基板１８の貫通孔１６ａを介して、ガラス製の基板１９に設けられた開口１４に連通されている。この開口１４は不図示の駆動液タンクに接続されている。開口１４は、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）のパッキンを介して駆動液タンクに接続される。
【００９０】
開口１５ａ，１５ｂ，１５ｃはそれぞれ、図９のマイクロリアクタの開口３２ｃ，３２ｄ，３２ｅと連通される（なお、図１０ではマイクロポンプユニット全体のうち一部分のみ示している）。マイクロポンプ１２によって、流路２０、開口１５ａ、開口３２ｃを通じて駆動液を送液して試薬収容部３３ａに収容された試薬を下流へ押し出し、流路２０、開口１５ｂ、開口３２ｄを通じて駆動液を送液して試薬収容部３３ｂに収容された試薬を下流へ押し出し、流路２０、開口１５ｃ、開口３２ｅを通じて駆動液を送液して試薬収容部３３ｃに収容された試薬を下流へ押し出す。
【００９１】
マイクロリアクタは、例えば、別途のシステム本体に装着することにより反応と分析が行われる。このシステム本体とマイクロリアクタとによりマイクロ総合分析システムが構成される。このマイクロ総合分析システムの一例を以下に説明する。図１２は、マイクロ総合分析システムの一例を示した斜視図、図１３は、このマイクロ総合分析システムにおけるシステム本体の内部構成を示した図である。
【００９２】
このマイクロ総合分析システム２のシステム本体３は、分析のための各装置を収納する筺体状の収納体６２を備えている。この収納体６２の内部には、マイクロリアクタ１に連通させるための流路開口を有するチップ接続部１３と、複数のマイクロポンプ（図示せず）とが設けられたマイクロポンプユニット１１が配置されている。
【００９３】
さらに収納体６２の内部には、マイクロリアクタ１における反応を検出するための検出処理装置（ＬＥＤ、光電子増倍菅、ＣＣＤカメラ等の光源６８および、可視分光法、蛍光測光法などによる光学的な検出を行う検出器６９）と、この検出処理装置とマイクロポンプユニット１１とを制御する制御装置（図示せず）とが設けられている。この制御装置によって、マイクロポンプによる送液の制御、光学的手段等によりマイクロリアクタ１における反応を検出する検出処理装置の制御の他、後述する加熱・冷却ユニットによるマイク
ロリアクタ１の温度制御、マイクロリアクタ１における反応の制御、データの収集（測定）および処理等を行う。マイクロポンプの制御は、予め送液順序、流量、タイミングなどに関する諸条件が設定されたプログラムに従って、それに応じた駆動電圧をマイクロポンプに印加することによって行う。
【００９４】
このマイクロ総合分析システム２では、マイクロリアクタ１の微細流路の上流側（例えば試薬収容部、試料受容部などの上流側）に設けられた流路開口およびその周囲のチップ面からなるポンプ接続部３１と、マイクロポンプユニット１１のチップ接続部１３とを液密に密着させた状態でマイクロリアクタ１を収納体６２の内部に装着した後、マイクロリアクタ１において検体中の標的物質が分析される。マイクロリアクタ１は、搬送トレイ６５に載置されて挿入口６３から収納体６２の内部に導入される。しかし、マイクロリアクタがマイクロポンプユニットに対して加圧された状態でマイクロリアクタを収納体６２の内部に固定できるのであれば、必ずしも搬送トレイを用いる必要はない。
【００９５】
収納体６２の内部には、所定位置に装着されたマイクロリアクタ１を局所的に加熱もしくは冷却するための加熱・冷却ユニット（ペルチェ素子６６、ヒーター６７）が設けられている。例えば、マイクロリアクタ１における試薬収容部の領域にペルチェ素子６６を圧接することにより試薬収容部を選択的に冷却し、これによって試薬の変質等を防止するとともに、反応部を構成する流路の領域にヒーター６７を圧接することにより反応部を選択的に加熱し、これによって反応部を反応に適した温度にする。
【００９６】
マイクロポンプユニット１１は１つの駆動液タンク６１に接続され、マイクロポンプの上流側はこの駆動液タンク６１に連通している。一方、マイクロポンプの下流側は、マイクロポンプユニット１１の片面に設けられた流路開口に連通されており、それぞれのマイクロポンプに連通したそれぞれの流路開口と、マイクロリアクタ１のポンプ接続部３１に設けられたそれぞれの流路開口とが連結するようにマイクロリアクタ１がマイクロポンプユニット１１に対して接続される。
【００９７】
マイクロポンプによって、駆動液タンク６１に収容された鉱物油などのオイル系あるいは水系の駆動液を、ポンプ接続部３１を経由してマイクロリアクタ１における各液の収容部に送り出し、駆動液によって各収容部の液をマイクロリアクタ１の下流側へ押し出して送液する。
【００９８】
測定試料である検体の前処理、反応および検出の一連の分析工程は、マイクロポンプ、検出処理装置および制御装置が一体化されたシステム本体２に、マイクロリアクタ１を装着した状態で行なわれる。好ましくは、試料および試薬の送液、前処理、混合に基づく所定の反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される。図１２では、分析の結果が収納体６２の表示部６４に表示されるようになっている。
【００９９】
以下に、本発明のマイクロリアクタを用いた試料（検体）と試薬との反応およびその検出の具体的な例を示す。マイクロリアクタの好ましい一態様では、一つのチップ内において、
検体もしくは検体から抽出したアナライト（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子）が注入される試料受容部と、
検体の前処理を行う検体前処理部と、
プローブ結合反応、検出反応（遺伝子増幅反応または抗原抗体反応なども含む）などに用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ（例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイズさせるプローブ）が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部と、が設けられている。
【０１００】
このマイクロリアクタには、ポンプ接続部を介してマイクロポンプが接続され、試料受容部に注入された検体もしくは検体から抽出した生体物質（例えばＤＮＡまたはそれ以外の生体物質）と、試薬収容部に収容された試薬とを下流の流路へ送液し、微細流路の反応部、例えば遺伝子増幅反応（タンパク質の場合、抗原抗体反応など）を行う反応部で混合して反応させる。次いで、その下流側流路にある検出部へ、この反応液を処理した処理液と、プローブ収容部に収容されたプローブとを送液し、流路内で混合してプローブと結合（またはハイブリダイゼーション）させ、この反応生成物に基づいて生体物質の検出を行う。
【０１０１】
また、ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティブコントロールに収容されたネガティブコントロールについても同様に上記反応および検出を行う。
【０１０２】
試料受容部に注入された検体は、必要に応じて、試薬との混合前に、予め流路に設けられた検体前処理部にて、例えば検体と処理液とを混合することによって前処理される。この検体前処理部は、分離フィルター、吸着用樹脂、ビーズなどを含んでいてもよい。好ましい検体前処理としては、アナライトの分離または濃縮、除タンパクなどが挙げられる。例えば、１％ＳＤＳ混合液などの溶菌剤を用いて溶菌処理・ＤＮＡ抽出処理を行なう。この過程では、細胞内部からＤＮＡが放出され、ビーズまたはフィルターの膜面に吸着する。
【０１０３】
マイクロリアクタの試薬収容部には、必要な試薬が予め所定の量だけ封入されている。したがって使用時にその都度試薬を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。検体中の生体物質を分析する場合、測定に必要な試薬類は、通常それぞれ公知である。例えば、検体に存在する抗原を分析する場合、それに対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬が使用される。抗体は、好ましくはビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。
【０１０４】
遺伝子検査用のマイクロリアクタに予め収容される試薬類には、遺伝子増幅に用いられる各種試薬の他、検出に使用されるプローブ類、発色試薬、前記の検体前処理に使用する前処理試薬などがある。
【０１０５】
マイクロポンプから駆動液を供給することにより、各試薬収容部から試薬を押し出してこれらを合流させることによって、混合試薬を生成する。この際、図１〜図３などに示した初期混合試薬の送出機構によって初期混合試薬を切り捨て、混合比率が安定した混合試薬のみを下流へ送り出す。
【０１０６】
その後、マイクロポンプから駆動液を供給することにより、試料受容部から検体を押し出し、混合比率が安定した混合試薬と合流させることによって、反応部にて、遺伝子増幅反応、アナライトのトラップまたは抗原抗体反応といった分析に必要な反応が開始される。
【０１０７】
ＤＮＡ増幅方法としては、改良点も含めて各種文献などに記載され、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ増幅法を使用することができる。ＰＣＲ増幅法においては、３つの温
度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開２００４−１０８２８５号）。このデバイスシステムを本発明のチップの増幅用流路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、ＤＮＡ増幅は、手作業で行う従来の方式よりはるかに短時間で行うことができる。
【０１０８】
最近開発されたＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid
amplification）法は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できるため（特許第３４３３９２９号）、本発明システムにおいても好適な増幅技術である。手作業では、１時間かかる本法は、本発明のシステムにおいては、１０〜２０分、好ましくは１５分で解析まで終わる。
【０１０９】
マイクロリアクタの微細流路における反応部よりも下流側には、アナライト、例えば増幅された遺伝子を検出するための検出部が設けられている。少なくともその検出部分は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。
【０１１０】
微細流路上の検出部に吸着されたビオチン親和性タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン）は、プローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと特異的に結合する。これにより、ビオチンで標識されたプローブまたは増幅された遺伝子が本検出部位でトラップされる。
【０１１１】
分離されたアナライトまたは増幅された目的遺伝子のＤＮＡを検出する方法は特に限定されないが、好ましい態様として基本的には以下の工程で行われる。
（１ａ） 検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、５’位置でビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。
【０１１２】
反応部の微細流路内で遺伝子増幅反応を行った後、微細流路内で増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合して、増幅された遺伝子を変性処理により一本鎖にし、これと末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡと
をハイブリダイズさせる。
【０１１３】
次いで、ビオチン親和性タンパク質を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、前記増幅遺伝子を微細流路内の検出部位にトラップする（増幅遺伝子を検出部位でトラップした後に蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせてもよい。）。
（１ｂ） 検体に存在する抗原、代謝物質、ホルモンなどのアナライトに対する特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬を検体と混合する。その場合、抗体は、ビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。したがって抗原抗体反応により得られる生成物は、ビオチンおよびＦＩＴＣを有する。これをビオチン親和性タンパク質（好ましくはストレプトアビジン）を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、ビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合を介して該検出部位に固定化する。
（２） 上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化したアナライト・抗体反応物のＦＩＴＣに、あるいは遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
（３） 上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
【０１１４】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定される
ことはなく、その要旨を逸脱しない範囲内において各種の変形、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、本発明の一実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図であり、２つの試薬が合流して混合流路５ｃで混合された状態を示している。
【図２】図２は、図１の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端側へ通過した状態を示した図である。
【図３】図３は、図１の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端に達した後、混合試薬が送出流路へ流出した状態を示した図である。
【図４】図４は、撥水バルブを示した図である。
【図５】図５は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタが備える、初期混合試薬の送出防止機構の構成を示した図であり、２つの試薬が合流して混合流路５ｃで混合された状態を示している。
【図６】図６は、図５の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端側へ通過した状態を示した図である。
【図７】図７は、図５の送出防止機構において、混合試薬の先端部が混合流路の下流末端に達した後、混合試薬が送出流路へ流出した状態を示した図である。
【図８】図８は、本発明の他の実施例におけるマイクロリアクタの流路構成を示した図であり、試料との混合部よりも上流側の流路構成を示している。
【図９】図９は、本発明のマイクロリアクタの他の実施例を示した平面図である。
【図１０】図１０は、図９のマイクロリアクタに使用されるマイクロポンプユニットの斜視図である。
【図１１】図１１は、図１０のマイクロポンプユニットの断面図である。
【図１２】図１２は、マイクロ総合分析システムの一例を示した斜視図である。
【図１３】図１３は、このマイクロ総合分析システムにおけるシステム本体の内部構成を示した図である。
【符号の説明】
【０１１６】
１ マイクロリアクタ
２ マイクロ総合分析システム
３ システム本体
５ａ 流路
５ｂ 流路
５ｃ 混合流路
５ｄ 送出流路
６ 合流部
７ａ 試薬
７ｂ 試薬
７ｃ 混合試薬
７ｄ 初期混合試薬
８ 下流末端
９ 能動弁
１１ マイクロポンプユニット
１２，１２ｈ〜１２ｊ マイクロポンプ
１３ チップ接続部
１４ 開口
１５，１５ａ〜１５ｃ 開口
１６ａ 貫通孔
１６ｂ 貫通孔
１７ 基板
１８ 基板
１９ 基板
２０ 流路
２１ 圧電素子
２２ 加圧室
２３ 第１流路
２４ 第２流路
２５ 第１液室
２６ 第２液室
３１ ポンプ接続部
３２ａ〜３２ｋ 開口
３３ａ〜３３ｃ，３３ｈ〜３３ｊ 試薬収容部
３４ａ,３４ｂ 端部
３５ 合流部
３６ 試薬混合部
３７ 試料受容部
３８ 合流部
３９ 反応部
４０ 検出部
５１，５１ａ〜５１ｅ 撥水バルブ
５２ 送液制御通路
５３ａ，５３ｂ 流路
５４ 液
６１ 駆動液タンク
６２ 収納体
６３ 挿入口
６４ 表示部
６５ 搬送トレイ
６６ ペルチェ素子
６７ ヒーター
６８ 光源
６９ 検出器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
板状のチップと、
複数の試薬が個別に収容される収容室からなる複数の試薬収容部と、
前記複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
外部から試料を注入するための注入口を有する試料受容部と、
前記試薬混合部から送出される混合試薬と、前記試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部と、を備え、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は、前記チップ内に組み込まれて流路により互いに連通され、
前記試薬混合部において生成された混合試薬のうち、初期に混合された初期混合試薬を前記反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えることを特徴とするマイクロリアクタ。
【請求項２】
前記試薬混合部は、前記複数の試薬を混合する流路であって混合試薬の流れが停止される下流末端が設けられた混合流路からなり、
該混合流路の中間部において、前記反応部へ混合試薬を送出する送出流路が分岐され、
前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路とから構成されており、
前記初期混合試薬は、前記混合流路の中間部と下流末端との間に収容されて前記送出流路から前記反応部への送出が防止されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロリアクタ。
【請求項３】
前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路との接続部に、混合流路内の圧力が所定圧以上となった際に送出流路へ混合試薬を送出する送液制御部を備えることを特徴とする請求項２に記載のマイクロリアクタ。
【請求項４】
前記送液制御部は、前記混合流路と送出流路との接続部における送出流路側に設けられた、送出流路の断面積よりも小さい断面積を有する細流路であることを特徴とする請求項３に記載のマイクロリアクタ。
【請求項１】
板状のチップと、
複数の試薬が個別に収容される収容室からなる複数の試薬収容部と、
前記複数の試薬収容部から送出される複数の試薬を混合して混合試薬を生成する試薬混合部と、
外部から試料を注入するための注入口を有する試料受容部と、
前記試薬混合部から送出される混合試薬と、前記試料受容部から送出される試料とを混合して反応させる反応部と、を備え、
前記複数の試薬収容部、試薬混合部、試料受容部および反応部は、前記チップ内に組み込まれて流路により互いに連通され、
前記試薬混合部において生成された混合試薬のうち、初期に混合された初期混合試薬を前記反応部に送出することを防止する送出防止機構を備えることを特徴とするマイクロリアクタ。
【請求項２】
前記試薬混合部は、前記複数の試薬を混合する流路であって混合試薬の流れが停止される下流末端が設けられた混合流路からなり、
該混合流路の中間部において、前記反応部へ混合試薬を送出する送出流路が分岐され、
前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路とから構成されており、
前記初期混合試薬は、前記混合流路の中間部と下流末端との間に収容されて前記送出流路から前記反応部への送出が防止されることを特徴とする請求項１に記載のマイクロリアクタ。
【請求項３】
前記送出防止機構は、前記混合流路と送出流路との接続部に、混合流路内の圧力が所定圧以上となった際に送出流路へ混合試薬を送出する送液制御部を備えることを特徴とする請求項２に記載のマイクロリアクタ。
【請求項４】
前記送液制御部は、前記混合流路と送出流路との接続部における送出流路側に設けられた、送出流路の断面積よりも小さい断面積を有する細流路であることを特徴とする請求項３に記載のマイクロリアクタ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００７−８３１９０（Ｐ２００７−８３１９０Ａ）
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２７６７９８（Ｐ２００５−２７６７９８）
【出願日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（３０３０００４２０）コニカミノルタエムジー株式会社 (2,950)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（３０３０００４２０）コニカミノルタエムジー株式会社 (2,950)
【Ｆターム（参考）】
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