メラノサイト用の培地
【課題】 メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に適したメラノサイト用の培地を提供する。
【解決手段】 培地中のｂ−ＦＧＦの濃度を０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌにする。
【解決手段】 培地中のｂ−ＦＧＦの濃度を０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌにする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に適したメラノサイト用の培地、およびそのような培地を用いた抗白髪物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の黒色は、毛包内に存在するメラノサイトにより合成される黒色色素であるメラニンによって提供され、毛包内のメラノサイトのメラニン合成活性の低下が白髪の発生の１つの重要な原因であることが分かっている。従って、従来の抗白髪物質のスクリーニング方法は、例えば、メラニン合成に関与するチロシナーゼ活性の測定や、メラニン生成量の視感判定等により、メラノサイトのメラニン合成活性を指標として行ってきた（例えば、特許文献１および２）。
【０００３】
しかしながら、白髪の発生は、メラノサイトのメラニン合成活性の低下のみならず、ヘアサイクルの転換時でのメラノサイトの増殖不全、再配置不全等、様々な要因が関与していると考えられている。従って、単にメラニン合成活性の促進効果のみを指標として化合物をスクリーニングしても、実際に白髪防止効果を有する化合物を効率的に特定することはできなかった。そこで、メラニン合成活性のみならず、メラノサイトの活性を総合的に評価できる指標を用いたスクリーニング方法が強く望まれていた。
【０００４】
ＭＩＴＦ遺伝子は、メラノサイトの色素合成に関わるチロシナーゼならびにＴＲＰ１およびＴＲＰ２の転写制御を行う制御遺伝子であるが、単に色素合成に関わるのみならず、メラノサイトの分化、増殖、配置等、メラノサイトの活性全般に関与するマスター遺伝子として機能することが知られている（非特許文献１）。また、ＭＩＴＦ遺伝子に変異を有するマウスやヒトにおいて白髪化が生じることも知られている。
【０００５】
さらに、ＭＩＴＦ遺伝子に変異を有するビチリゴマウス（C57BL/6 Mitfmi-vit）を用いて、候補物質投与後の体毛重量あたりのメラニン量を測定することによって抗白髪薬剤をスクリーニングする方法が提案されている（特許文献３）。しかしながら、特許文献３記載のスクリーニング方法はin vivo法であるため、労力、経費、時間等の観点から、多数の物質を評価するのには適さなかった。また、特許文献３には、毛包を構成する細胞等に被験物質を接触させた際の遺伝子発現量またはタンパク質発現量等に関する情報を用いたin vitroでのスクリーニング方法が提案されており、ＭＩＴＦに関してもその発現量の低下と白髪との関連性が示唆されているが、具体的にその発現量を指標としてin vitroで物質をスクリーニングすることについては全く記載されていない。実際に、通常メラノサイトの培養に用いられている市販の培地を用いた培養系では、ＭＩＴＦの発現量の変化を測定できなかった。
【特許文献１】特開平９−２６３５４０号公報
【特許文献２】特開平１１−５７２０号公報
【特許文献３】特開２００３−１７１２４０号公報
【非特許文献１】松本二郎、溝口昌子著，「色素細胞」慶応義塾大学出版会，２００１年１０月２０日，第６章
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような事情に鑑み、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に適したメラノサイト用の培地を提供することを目的とするものである。また、本発明は、そのような培地を用いて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを指標として抗白髪物質をin vitroでスクリーニングする方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）の濃度を０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌに下げた培地中でメラノサイトを培養することによって、被験物質を添加することによるメラノサイトにおけるＭＩＴＦの発現レベルの変化を評価できることの発見に基づくものである。ｂ−ＦＧＦは天然に存在するメラノサイトの増殖因子であり、通常メラノサイトの培養に用いられている培地は、その増殖を促進および維持するためにｂ−ＦＧＦを３ｎｇ／ｍｌ程度の濃度で含有している。したがって、そのような高濃度のｂ−ＦＧＦの存在によってＭＩＴＦの発現レベルが亢進されて、従来の方法では、被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果が隠れてしまって観察できなかったと考えられる。
【０００８】
本発明のメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に用いるためのメラノサイト用の培地は、培地中のｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする。より好ましくは、培地中のｂ−ＦＧＦの濃度は０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌである。かかる低濃度のｂ−ＦＧＦを含有する培地を用いることによって、メラノサイトの増殖を維持でき、かつ被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果を評価することが可能である。
【０００９】
本発明の抗白髪物質のスクリーニング方法は、被験物質を含まないｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第１の培地と、被験物質を含むｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第２の培地のそれぞれにおいて、メラノサイトを培養し、前記メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを検出し、前記第１の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルと比較して、前記第２の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルが上昇した被験物質を抗白髪物質として特定することを特徴とする。第１の培地および第２の培地中のｂ−ＦＧＦの濃度は、より好ましくは０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌである。低濃度のｂ−ＦＧＦを含有する培地を用いることによって、被験物質を含まない場合におけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルと比較して、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを上昇させることができる被験物質を特定することが可能である。
【００１０】
尚、本明細書において、「第１の培地」とは、評価対象である被験物質を含まずかつ上記の濃度のｂ−ＦＧＦを含有する培地を意味し、一方、「第２の培地」とは、前記の「第１の培地」に被験物質を添加した培地を意味する。それら培地は、本願発明の目的を達成できる限り、他の任意の成分を含んでいて差し支えないが、被験物質の有無を除いて両培地は同一組成でなければならない。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のメラノサイト用の培地は、ｂ−ＦＧＦを０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌの低濃度で含有するため、メラノサイトの増殖を維持でき、かつ被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果を評価することを可能にする。
【００１２】
また、本発明の抗白髪物質のスクリーニング方法は、メラノサイトの色素合成のみならず、分化、増殖、配置等、メラノサイトの活性全般に関与するマスター遺伝子として働くＭＩＴＦの発現レベルを指標とするため、メラノサイトの活性促進効果を総合的に評価でき、より精度の高い結果をもたらすことができる。また、in vitro法であるため、多数の物質を簡便かつ効率的に評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のメラノサイト用の培地、または本発明のスクリーニング方法で用いる培地の組成は、上記の濃度のｂ−ＦＧＦを含有し、かつ本発明の目的を達成できる限り特に限定されず、例えば、Ｍ１５４Ｓ・ＨＭＧＳ培地（Cascade Biologics, Inc.）のような市販のメラノサイト増殖用の培地を基礎培地として用いて、上記の濃度のｂ−ＦＧＦを添加することによって作成することができる。さらに、必要に応じて、エンドセリン１（ＥＴ１）やα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）等のメラノサイトの増殖に適した他の任意の成分を、本発明の目的を達成できる限り添加して差し支えない。本発明の培地中のｂ−ＦＧＦの濃度は、０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌである。ｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１ｎｇ／ｍｌ未満であると、メラノサイトの増殖速度が遅くなりすぎて、ＭＩＴＦ遺伝子発現レベルの測定が困難になり、また０．５ｎｇ／ｍｌを超えると、被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの変化が隠れてしまい、検出できなくなる。
【００１４】
ＭＩＴＦ（microphtalmia-associated transcription factor）にはＮ末端領域のみが異なる少なくとも５種のアイソフォームが存在し、それらの中でメラノサイトにおいて特異的に発現されているＭＩＴＦ−Ｍがメラノサイトの分化過程においてマスター遺伝子的に機能する。したがって、本明細書において、「ＭＩＴＦ」とは、特に指定がない限りＭＩＴＦ−Ｍを意味するものであり、「ＭＩＴＦ遺伝子の発現」とはＭＩＴＦ−Ｍに関するものを意味する。
【００１５】
ＭＩＴＦ遺伝子の発現の評価または検出の方法は、特に限定されず、例えば、ＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロット法等を用いてＭＩＴＦのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを増幅および／または測定してもよいし、あるいはＥＬＩＳＡやウェスタンブロット法等を用いてＭＩＴＦタンパク質を検出および／または測定してもよい。さらに、例えばグルコース酸リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＦ）のような、細胞あたりの発現量が一定である任意のハウスキーピング遺伝子の発現量を同時に同様の方法で測定し、その発現量を基準としてＭＩＴＦ遺伝子の発現量を標準化することができる。
【００１６】
例えば、ＭＩＴＦ特異的な以下の配列番号１および／または配列番号２の配列をそれぞれフォワード側またはリバース側のプライマーとして用いることによって、ＭＩＴＦのｍＲＮＡを増幅および／または測定することができる：
ＭＩＴＦ−Ｆ（フォワード）：ＣＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＴ（配列番号１）
ＭＩＴＦ−Ｒ（リバース） ：ＡＧＡＣＣＣＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＡＧ（配列番号２）
上述したように、ＭＩＴＦには５種のアイソフォームが存在しており、従って、メラノサイトで特異的に発現されているＭＩＴＦ−Ｍを特異的に検出できる系を用いることがより好ましい。ＭＩＴＦ−Ｍは他の４種のアイソフォームとは異なる固有のＮ末領域を有しており、従って、そのＮ末端をコードするエキソンに特異的な配列を有するプライマーを用いることによって、ＭＩＴＦ−Ｍを特異的に検出できる。例えば、以下の配列番号３および／または配列番号４の配列をそれぞれフォワード側またはリバース側のプライマーとして用いることによって、ＭＩＴＦ−Ｍを特異的に検出できる：
ＭＩＴＦ−Ｍ−Ｆ（フォワード）：ＡＣＣＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号３）
ＭＩＴＦ−Ｍ−Ｒ（リバース） ：ＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧ（配列番号４）
本発明のスクリーニング方法で用いるメラノサイトは特に限定はされず、例えば、外科的に切除したヒトの頭皮切片から単離した毛包を用いて調製した毛包メラノサイトや、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社から市販されている正常皮膚メラノサイト等を用いることができる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００１８】
ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの測定
ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの測定は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて行った。培養した細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標））を用いてｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号３および４の配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の途中経過は、サイバーグリーンの取り込みによって上昇する蛍光強度を指標に、ロシュ・ダイアグノスティックス社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）を用いてモニターした。モニターにより得られた増幅曲線を元に、ｍＲＮＡ中のＭＩＴＦｍＲＮＡ量を計算した。反応産物を回収し、アガロースゲル電気泳動によってシングルバンドであることを確認した。同様に、細胞あたりの発現量が一定であるハウスキーピング遺伝子のＧ３ＰＤＨの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにより増幅および検出した。Ｇ３ＰＤＨの発現レベルを基準とし、ＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨとして、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを標準化した。
【００１９】
培地中のｂ−ＦＧＦ濃度の検討
皮膚メラノサイト（ＮＨＥＭ２４８６：白人皮膚由来、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社より入手）を用いて検討した。メラノサイト対数増殖期にある皮膚メラノサイト（ＮＨＥＭ２４８６）を約５×１０5 ／２５cm2 フラスコの濃度で播種し、Ｍ１５４Ｓ・ＨＭＧＳ培地（Cascade Biologics, Inc.）に各濃度のｂ−ＦＧＦを添加した培地中で２４時間予備培養した。抗白髪効果があることが分かっているホップ抽出物を陽性被験物質として用いた。ホップ抽出物は、ホップ（雌花穂 乾燥物）を５０％エタノールに室温で１週間浸漬し、抽出液から溶媒を留去して調製した。予備培養後、１ｘ１０−６質量％のホップ抽出物を添加し、または添加していないで、さらに２４時間培養した。培養後の細胞を用いて、上述した方法に基づいて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを測定した。結果は、それぞれのｂ−ＦＧＦ濃度において、ホップ抽出物を添加しなかった試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨに対する、ホップ抽出物を添加した試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨの割合（％）として表した。
【００２０】
ｂ−ＦＧＦを０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地中でメラノサイトを培養することによって、陽性被験物質であるホップ抽出物によるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの上昇を検出することができた。一方、ｂ−ＦＧＦを０．５ｎｇ／ｍｌより高い濃度で含有する培地でメラノサイトを培養すると、ホップ抽出物の添加によるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの上昇を検出することはできなかった。
【００２１】
図１に、ｂ−ＦＧＦを３．０ｎｇ／ｍｌまたは０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地での結果を示す。
【００２２】
抗白髪物質のスクリーニング
陽性被験物質としてホップ抽出物（1ｘ１０−６質量％）を用い、サンショウ抽出物（１ｘ１０−５質量％）、またはホップ抽出物（１ｘ１０−６質量％）＋サンショウ抽出物（１ｘ１０−６質量％）について、ＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果を評価した。サンショウ抽出物は、サンショウの果皮を室温で１週間エタノール浸漬し、抽出液からエタノールを留去して調製した。Ｍ１５４Ｓ・ＨＭＧＳ培地（Cascade Biologics, Inc.）に０．１ｎｇ／ｍｌのｂ−ＦＧＦを添加した培地を用いた。上記と同様の方法を用いて、被験物質を添加しない培地、または各被験物質を添加した培地において、メラノサイトを培養し、培養細胞でのＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを測定した。結果は、被験物質を添加しなかった試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨに対する、被験物質を添加した試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨの割合（％）として表した。
【００２３】
結果を図２に示す。ホップ抽出物（1ｘ１０−６質量％）と同様に、サンショウ抽出物（１ｘ１０−５質量％）においてもＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果が認められた。さらに、ホップ抽出物（１ｘ１０−６質量％）とサンショウ抽出物（１ｘ１０−６質量％）とを組合せて添加することによって、相乗的に高められたＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果が認められた。
【００２４】
累積塗布によるヒトにおける白髪防止効果試験
＜試験方法＞
ホップ抽出物、サンショウ抽出物、またはホップ抽出物およびサンショウ抽出物を配合したローション、あるいはホップ抽出物もサンショウ抽出物も配合していないローション（対照）を、試料ごとに白髪のある４０〜６０歳の男女２０名に、１日２回（朝、夜）連続４カ月間、ハーフヘッド法で左右頭皮に別々に使用させ、塗布部位の状態を試験前後で比較し、白髪防止効果を検討した。塗布開始前及び塗布開始後６カ月における側頭部の毛髪１，０００本あたりの白髪の本数を数えた。
【００２５】
＜判定基準＞
＋＋＋（特に著効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、７０％未満の被験者が５０％以上
＋＋（著効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、８０％未満の被験者が５０％以上
＋（有効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、９０％未満の被験者が５０％以上
±（やや有効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、１００％未満の被験者が５０％以上
−（無効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、１００％未満の被験者が５０％未満
＜試料＞
本試験では、以下の配合組成により各種白髪防止ローションを調製し、その累積塗布による、白髪防止効果について調べた：
処方例１（ホップ抽出物）
配合成分 配合量（質量％）
ホップ抽出物 １．０
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
処方例２（サンショウ抽出物）
配合成分 配合量（質量％）
サンショウ抽出物 １．０
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
処方例３（ホップ抽出物＋サンショウ抽出物）
配合成分 配合量（質量％）
ホップ抽出物 ０．５
サンショウ抽出物 ０．５
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
対照例
配合成分 配合量（質量％）
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
製法
９５％エタノールに各植物抽出物、ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル、香料を加えて均一に溶解した。これに、あらかじめ混合しておいた水層部（精製水、グリセリン）を添加して溶解した。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法においてＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果を示したホップ抽出物およびサンショウ抽出物を配合したローションはいずれも高い白髪防止効果を示した。さらに、本発明のスクリーニング方法においてＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果が特に高かった、ホップ抽出物とサンショウ抽出物との組合せを配合することによって、より高い白髪の予防、改善効果が認められた。
【００２７】
以上の通り、本発明のスクリーニング方法によるＭＩＴＦ遺伝子発現促進活性と、抗白髪効果とはよく相関しており、本発明の方法により抗白髪物質のスクリーニングが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】培地中のｂ−ＦＧＦ濃度の検討結果を示すグラフ
【図２】抗白髪物質のスクリーニング結果を示すグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に適したメラノサイト用の培地、およびそのような培地を用いた抗白髪物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の黒色は、毛包内に存在するメラノサイトにより合成される黒色色素であるメラニンによって提供され、毛包内のメラノサイトのメラニン合成活性の低下が白髪の発生の１つの重要な原因であることが分かっている。従って、従来の抗白髪物質のスクリーニング方法は、例えば、メラニン合成に関与するチロシナーゼ活性の測定や、メラニン生成量の視感判定等により、メラノサイトのメラニン合成活性を指標として行ってきた（例えば、特許文献１および２）。
【０００３】
しかしながら、白髪の発生は、メラノサイトのメラニン合成活性の低下のみならず、ヘアサイクルの転換時でのメラノサイトの増殖不全、再配置不全等、様々な要因が関与していると考えられている。従って、単にメラニン合成活性の促進効果のみを指標として化合物をスクリーニングしても、実際に白髪防止効果を有する化合物を効率的に特定することはできなかった。そこで、メラニン合成活性のみならず、メラノサイトの活性を総合的に評価できる指標を用いたスクリーニング方法が強く望まれていた。
【０００４】
ＭＩＴＦ遺伝子は、メラノサイトの色素合成に関わるチロシナーゼならびにＴＲＰ１およびＴＲＰ２の転写制御を行う制御遺伝子であるが、単に色素合成に関わるのみならず、メラノサイトの分化、増殖、配置等、メラノサイトの活性全般に関与するマスター遺伝子として機能することが知られている（非特許文献１）。また、ＭＩＴＦ遺伝子に変異を有するマウスやヒトにおいて白髪化が生じることも知られている。
【０００５】
さらに、ＭＩＴＦ遺伝子に変異を有するビチリゴマウス（C57BL/6 Mitfmi-vit）を用いて、候補物質投与後の体毛重量あたりのメラニン量を測定することによって抗白髪薬剤をスクリーニングする方法が提案されている（特許文献３）。しかしながら、特許文献３記載のスクリーニング方法はin vivo法であるため、労力、経費、時間等の観点から、多数の物質を評価するのには適さなかった。また、特許文献３には、毛包を構成する細胞等に被験物質を接触させた際の遺伝子発現量またはタンパク質発現量等に関する情報を用いたin vitroでのスクリーニング方法が提案されており、ＭＩＴＦに関してもその発現量の低下と白髪との関連性が示唆されているが、具体的にその発現量を指標としてin vitroで物質をスクリーニングすることについては全く記載されていない。実際に、通常メラノサイトの培養に用いられている市販の培地を用いた培養系では、ＭＩＴＦの発現量の変化を測定できなかった。
【特許文献１】特開平９−２６３５４０号公報
【特許文献２】特開平１１−５７２０号公報
【特許文献３】特開２００３−１７１２４０号公報
【非特許文献１】松本二郎、溝口昌子著，「色素細胞」慶応義塾大学出版会，２００１年１０月２０日，第６章
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような事情に鑑み、メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に適したメラノサイト用の培地を提供することを目的とするものである。また、本発明は、そのような培地を用いて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを指標として抗白髪物質をin vitroでスクリーニングする方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）の濃度を０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌに下げた培地中でメラノサイトを培養することによって、被験物質を添加することによるメラノサイトにおけるＭＩＴＦの発現レベルの変化を評価できることの発見に基づくものである。ｂ−ＦＧＦは天然に存在するメラノサイトの増殖因子であり、通常メラノサイトの培養に用いられている培地は、その増殖を促進および維持するためにｂ−ＦＧＦを３ｎｇ／ｍｌ程度の濃度で含有している。したがって、そのような高濃度のｂ−ＦＧＦの存在によってＭＩＴＦの発現レベルが亢進されて、従来の方法では、被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果が隠れてしまって観察できなかったと考えられる。
【０００８】
本発明のメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に用いるためのメラノサイト用の培地は、培地中のｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする。より好ましくは、培地中のｂ−ＦＧＦの濃度は０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌである。かかる低濃度のｂ−ＦＧＦを含有する培地を用いることによって、メラノサイトの増殖を維持でき、かつ被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果を評価することが可能である。
【０００９】
本発明の抗白髪物質のスクリーニング方法は、被験物質を含まないｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第１の培地と、被験物質を含むｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第２の培地のそれぞれにおいて、メラノサイトを培養し、前記メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを検出し、前記第１の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルと比較して、前記第２の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルが上昇した被験物質を抗白髪物質として特定することを特徴とする。第１の培地および第２の培地中のｂ−ＦＧＦの濃度は、より好ましくは０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌである。低濃度のｂ−ＦＧＦを含有する培地を用いることによって、被験物質を含まない場合におけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルと比較して、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを上昇させることができる被験物質を特定することが可能である。
【００１０】
尚、本明細書において、「第１の培地」とは、評価対象である被験物質を含まずかつ上記の濃度のｂ−ＦＧＦを含有する培地を意味し、一方、「第２の培地」とは、前記の「第１の培地」に被験物質を添加した培地を意味する。それら培地は、本願発明の目的を達成できる限り、他の任意の成分を含んでいて差し支えないが、被験物質の有無を除いて両培地は同一組成でなければならない。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のメラノサイト用の培地は、ｂ−ＦＧＦを０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌの低濃度で含有するため、メラノサイトの増殖を維持でき、かつ被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果を評価することを可能にする。
【００１２】
また、本発明の抗白髪物質のスクリーニング方法は、メラノサイトの色素合成のみならず、分化、増殖、配置等、メラノサイトの活性全般に関与するマスター遺伝子として働くＭＩＴＦの発現レベルを指標とするため、メラノサイトの活性促進効果を総合的に評価でき、より精度の高い結果をもたらすことができる。また、in vitro法であるため、多数の物質を簡便かつ効率的に評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のメラノサイト用の培地、または本発明のスクリーニング方法で用いる培地の組成は、上記の濃度のｂ−ＦＧＦを含有し、かつ本発明の目的を達成できる限り特に限定されず、例えば、Ｍ１５４Ｓ・ＨＭＧＳ培地（Cascade Biologics, Inc.）のような市販のメラノサイト増殖用の培地を基礎培地として用いて、上記の濃度のｂ−ＦＧＦを添加することによって作成することができる。さらに、必要に応じて、エンドセリン１（ＥＴ１）やα−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）等のメラノサイトの増殖に適した他の任意の成分を、本発明の目的を達成できる限り添加して差し支えない。本発明の培地中のｂ−ＦＧＦの濃度は、０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌである。ｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１ｎｇ／ｍｌ未満であると、メラノサイトの増殖速度が遅くなりすぎて、ＭＩＴＦ遺伝子発現レベルの測定が困難になり、また０．５ｎｇ／ｍｌを超えると、被験物質によるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの変化が隠れてしまい、検出できなくなる。
【００１４】
ＭＩＴＦ（microphtalmia-associated transcription factor）にはＮ末端領域のみが異なる少なくとも５種のアイソフォームが存在し、それらの中でメラノサイトにおいて特異的に発現されているＭＩＴＦ−Ｍがメラノサイトの分化過程においてマスター遺伝子的に機能する。したがって、本明細書において、「ＭＩＴＦ」とは、特に指定がない限りＭＩＴＦ−Ｍを意味するものであり、「ＭＩＴＦ遺伝子の発現」とはＭＩＴＦ−Ｍに関するものを意味する。
【００１５】
ＭＩＴＦ遺伝子の発現の評価または検出の方法は、特に限定されず、例えば、ＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロット法等を用いてＭＩＴＦのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを増幅および／または測定してもよいし、あるいはＥＬＩＳＡやウェスタンブロット法等を用いてＭＩＴＦタンパク質を検出および／または測定してもよい。さらに、例えばグルコース酸リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＦ）のような、細胞あたりの発現量が一定である任意のハウスキーピング遺伝子の発現量を同時に同様の方法で測定し、その発現量を基準としてＭＩＴＦ遺伝子の発現量を標準化することができる。
【００１６】
例えば、ＭＩＴＦ特異的な以下の配列番号１および／または配列番号２の配列をそれぞれフォワード側またはリバース側のプライマーとして用いることによって、ＭＩＴＦのｍＲＮＡを増幅および／または測定することができる：
ＭＩＴＦ−Ｆ（フォワード）：ＣＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＴ（配列番号１）
ＭＩＴＦ−Ｒ（リバース） ：ＡＧＡＣＣＣＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＴＡＡＧ（配列番号２）
上述したように、ＭＩＴＦには５種のアイソフォームが存在しており、従って、メラノサイトで特異的に発現されているＭＩＴＦ−Ｍを特異的に検出できる系を用いることがより好ましい。ＭＩＴＦ−Ｍは他の４種のアイソフォームとは異なる固有のＮ末領域を有しており、従って、そのＮ末端をコードするエキソンに特異的な配列を有するプライマーを用いることによって、ＭＩＴＦ−Ｍを特異的に検出できる。例えば、以下の配列番号３および／または配列番号４の配列をそれぞれフォワード側またはリバース側のプライマーとして用いることによって、ＭＩＴＦ−Ｍを特異的に検出できる：
ＭＩＴＦ−Ｍ−Ｆ（フォワード）：ＡＣＣＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＴ（配列番号３）
ＭＩＴＦ−Ｍ−Ｒ（リバース） ：ＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧ（配列番号４）
本発明のスクリーニング方法で用いるメラノサイトは特に限定はされず、例えば、外科的に切除したヒトの頭皮切片から単離した毛包を用いて調製した毛包メラノサイトや、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社から市販されている正常皮膚メラノサイト等を用いることができる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００１８】
ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの測定
ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの測定は、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて行った。培養した細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標））を用いてｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号３および４の配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の途中経過は、サイバーグリーンの取り込みによって上昇する蛍光強度を指標に、ロシュ・ダイアグノスティックス社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）を用いてモニターした。モニターにより得られた増幅曲線を元に、ｍＲＮＡ中のＭＩＴＦｍＲＮＡ量を計算した。反応産物を回収し、アガロースゲル電気泳動によってシングルバンドであることを確認した。同様に、細胞あたりの発現量が一定であるハウスキーピング遺伝子のＧ３ＰＤＨの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにより増幅および検出した。Ｇ３ＰＤＨの発現レベルを基準とし、ＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨとして、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを標準化した。
【００１９】
培地中のｂ−ＦＧＦ濃度の検討
皮膚メラノサイト（ＮＨＥＭ２４８６：白人皮膚由来、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社より入手）を用いて検討した。メラノサイト対数増殖期にある皮膚メラノサイト（ＮＨＥＭ２４８６）を約５×１０5 ／２５cm2 フラスコの濃度で播種し、Ｍ１５４Ｓ・ＨＭＧＳ培地（Cascade Biologics, Inc.）に各濃度のｂ−ＦＧＦを添加した培地中で２４時間予備培養した。抗白髪効果があることが分かっているホップ抽出物を陽性被験物質として用いた。ホップ抽出物は、ホップ（雌花穂 乾燥物）を５０％エタノールに室温で１週間浸漬し、抽出液から溶媒を留去して調製した。予備培養後、１ｘ１０−６質量％のホップ抽出物を添加し、または添加していないで、さらに２４時間培養した。培養後の細胞を用いて、上述した方法に基づいて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを測定した。結果は、それぞれのｂ−ＦＧＦ濃度において、ホップ抽出物を添加しなかった試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨに対する、ホップ抽出物を添加した試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨの割合（％）として表した。
【００２０】
ｂ−ＦＧＦを０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地中でメラノサイトを培養することによって、陽性被験物質であるホップ抽出物によるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの上昇を検出することができた。一方、ｂ−ＦＧＦを０．５ｎｇ／ｍｌより高い濃度で含有する培地でメラノサイトを培養すると、ホップ抽出物の添加によるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの上昇を検出することはできなかった。
【００２１】
図１に、ｂ−ＦＧＦを３．０ｎｇ／ｍｌまたは０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地での結果を示す。
【００２２】
抗白髪物質のスクリーニング
陽性被験物質としてホップ抽出物（1ｘ１０−６質量％）を用い、サンショウ抽出物（１ｘ１０−５質量％）、またはホップ抽出物（１ｘ１０−６質量％）＋サンショウ抽出物（１ｘ１０−６質量％）について、ＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果を評価した。サンショウ抽出物は、サンショウの果皮を室温で１週間エタノール浸漬し、抽出液からエタノールを留去して調製した。Ｍ１５４Ｓ・ＨＭＧＳ培地（Cascade Biologics, Inc.）に０．１ｎｇ／ｍｌのｂ−ＦＧＦを添加した培地を用いた。上記と同様の方法を用いて、被験物質を添加しない培地、または各被験物質を添加した培地において、メラノサイトを培養し、培養細胞でのＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを測定した。結果は、被験物質を添加しなかった試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨに対する、被験物質を添加した試料におけるＭＩＴＦ／Ｇ３ＰＤＨの割合（％）として表した。
【００２３】
結果を図２に示す。ホップ抽出物（1ｘ１０−６質量％）と同様に、サンショウ抽出物（１ｘ１０−５質量％）においてもＭＩＴＦ遺伝子の発現促進効果が認められた。さらに、ホップ抽出物（１ｘ１０−６質量％）とサンショウ抽出物（１ｘ１０−６質量％）とを組合せて添加することによって、相乗的に高められたＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果が認められた。
【００２４】
累積塗布によるヒトにおける白髪防止効果試験
＜試験方法＞
ホップ抽出物、サンショウ抽出物、またはホップ抽出物およびサンショウ抽出物を配合したローション、あるいはホップ抽出物もサンショウ抽出物も配合していないローション（対照）を、試料ごとに白髪のある４０〜６０歳の男女２０名に、１日２回（朝、夜）連続４カ月間、ハーフヘッド法で左右頭皮に別々に使用させ、塗布部位の状態を試験前後で比較し、白髪防止効果を検討した。塗布開始前及び塗布開始後６カ月における側頭部の毛髪１，０００本あたりの白髪の本数を数えた。
【００２５】
＜判定基準＞
＋＋＋（特に著効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、７０％未満の被験者が５０％以上
＋＋（著効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、８０％未満の被験者が５０％以上
＋（有効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、９０％未満の被験者が５０％以上
±（やや有効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、１００％未満の被験者が５０％以上
−（無効）：塗布開始前の白髪の本数に対して塗布後の本数が、１００％未満の被験者が５０％未満
＜試料＞
本試験では、以下の配合組成により各種白髪防止ローションを調製し、その累積塗布による、白髪防止効果について調べた：
処方例１（ホップ抽出物）
配合成分 配合量（質量％）
ホップ抽出物 １．０
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
処方例２（サンショウ抽出物）
配合成分 配合量（質量％）
サンショウ抽出物 １．０
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
処方例３（ホップ抽出物＋サンショウ抽出物）
配合成分 配合量（質量％）
ホップ抽出物 ０．５
サンショウ抽出物 ０．５
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
対照例
配合成分 配合量（質量％）
香 料 適 量
９５％エタノール ６０．０
ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル ０．５
グリセリン ２．０
精製水 残 余
製法
９５％エタノールに各植物抽出物、ＰＯＥ６０モル硬化ヒマシ油エーテル、香料を加えて均一に溶解した。これに、あらかじめ混合しておいた水層部（精製水、グリセリン）を添加して溶解した。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法においてＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果を示したホップ抽出物およびサンショウ抽出物を配合したローションはいずれも高い白髪防止効果を示した。さらに、本発明のスクリーニング方法においてＭＩＴＦ遺伝子発現促進効果が特に高かった、ホップ抽出物とサンショウ抽出物との組合せを配合することによって、より高い白髪の予防、改善効果が認められた。
【００２７】
以上の通り、本発明のスクリーニング方法によるＭＩＴＦ遺伝子発現促進活性と、抗白髪効果とはよく相関しており、本発明の方法により抗白髪物質のスクリーニングが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】培地中のｂ−ＦＧＦ濃度の検討結果を示すグラフ
【図２】抗白髪物質のスクリーニング結果を示すグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に用いるためのメラノサイト用の培地であって、該培地中のｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする培地。
【請求項２】
前記ｂ−ＦＧＦの濃度が０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１記載の培地
【請求項３】
被験物質を含まないｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第１の培地と、被験物質を含むｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第２の培地のそれぞれにおいて、メラノサイトを培養し、
前記メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを検出し、
前記第１の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルと比較して、前記第２の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルが上昇した被験物質を抗白髪物質として特定することを特徴とする、抗白髪物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第１の培地および前記第２の培地中のｂ−ＦＧＦの濃度が０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルの評価に用いるためのメラノサイト用の培地であって、該培地中のｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする培地。
【請求項２】
前記ｂ−ＦＧＦの濃度が０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１記載の培地
【請求項３】
被験物質を含まないｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第１の培地と、被験物質を含むｂ−ＦＧＦの濃度が０．００１〜０．５ｎｇ／ｍｌである第２の培地のそれぞれにおいて、メラノサイトを培養し、
前記メラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルを検出し、
前記第１の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルと比較して、前記第２の培地中で培養したメラノサイトにおけるＭＩＴＦ遺伝子の発現レベルが上昇した被験物質を抗白髪物質として特定することを特徴とする、抗白髪物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第１の培地および前記第２の培地中のｂ−ＦＧＦの濃度が０．０１〜０．２５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項３記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−６２０１（Ｐ２００６−６２０１Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１８８０４５（Ｐ２００４−１８８０４５）
【出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２５日（２００４．６．２５）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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