総油画分中１０％を超えるアラキドン酸（ＡＲＡ、ω−６多価不飽和脂肪酸）を生成できる油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の遺伝子操作された菌株について述べられる。これらの株は、異種デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼを発現する様々なキメラ遺伝子を含んでなり、場合によって様々な天然デサチュラーゼおよびアシルトランスフェラーゼノックアウトを含んでなり、ＡＲＡの合成および高蓄積を可能にする。生成宿主細胞が特許請求され、前記宿主細胞内でＡＲＡを生成する方法もまた特許請求される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ_{１８／２０}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
【請求項２】
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞。
【請求項３】
遺伝子プールが、場合によりΔ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
【請求項４】
背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている請求項３に記載の組換え生産宿主。
【請求項５】
前記ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも１つが、配列番号１５８〜１６８および３６４よりなる群から選択される核酸配列を有するプロモーター配列の制御下にある請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
【請求項６】
前記Δ１２デサチュラーゼが、配列番号２４、２６、２８、３０、３１、３２、３４、３６、３８、３５８、３５９、３６１、３６２および３６３よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載の組換え生産宿主。
【請求項７】
前記Δ６デサチュラーゼが配列番号２および５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Ｃ_{１８／２０}エロンガーゼが配列番号１８および２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の組換え生産宿主細胞。
【請求項８】
前記Δ９エロンガーゼが配列番号４０および１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Δ８デサチュラーゼが配列番号４５、４７、および４９よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項２に記載の組換え生産宿主細胞。
【請求項９】
前記Δ５デサチュラーゼが、配列番号７、９、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主細胞。
【請求項１０】
遺伝子プールが、場合により
ａ）Δ９デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）Ｃ_{１４／１６}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
よりなる群から選択されるω−３／ω−６脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる請求項１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主。
【請求項１１】
前記Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼが配列番号５１、５４および６２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Ｃ_{１４／１６}エロンガーゼが配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有する請求項１０に記載の組換え生産宿主。
【請求項１２】
遺伝子プールが、場合により
ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）、
ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、
ｃ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、
ｄ）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
ｅ）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、および
ｆ）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
よりなる群から選択されるアシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる請求項１または２のいずれかに記載の組換え生産宿主。
【請求項１３】
前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）が配列番号８２および８４〜８８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）が配列番号９０、９２、９４、および９６よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）が配列番号７７に記載のアミノ酸配列を有し、前記グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）が配列番号９８に記載のアミノ酸配列を有し、前記リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）が配列番号６８、７０、７２、および７５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）が配列番号８０に記載のアミノ酸配列を有する請求項１２に記載の組換え生産宿主。
【請求項１４】
ｅ）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｆ）Ｃ_{１８／２０}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｈ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなるアラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
【請求項１５】
ｆ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｇ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｈ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｉ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｊ）Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。
【請求項１６】
ａ）（１）Δ６デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびＣ_{１８／２０}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
（２）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、およびΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
よりなる群から選択される少なくとも一組の遺伝子
ｂ）（１）Δ１２デサチュラーゼ、
（２）Δ９デサチュラーゼ、
（３）Ｃ_{１４／１６}エロンガーゼ、
（４）Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼ
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｃ）ｉ．）ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＰＤＡＴよりなる群から選択されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、
ｉｉ．）アシル−ＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、
ｉｉｉ．）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｉｖ．）リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、
ｖ．）ホスホリパーゼＣ、および
ｖｉ．）ホスホリパーゼＡ_２
よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種を含んでなる、アラキドン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、
（１）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いており、
（２）背景ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種が、リパーゼ１（Ｌｉｐ１−）、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼＡＣＯ３（Ｐｏｘ３−）、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ２（Ｐｏｘ２−）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Ｕｒａ３−）、サッカロピンデヒドロゲナーゼ（Ｌｙｓ５−）、リパーゼ２（Ｌｉｐ２−）、およびイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕ２−）よりなる群から選択される酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている、組換え生産宿主細胞。
【請求項１７】
宿主が全脂肪酸の％として少なくとも約５％のアラキドン酸を含んでなる微生物油を生成する請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
【請求項１８】
宿主がアラキドン酸を含んでなる微生物油を生成し、微生物油があらゆるγ−リノール酸を欠いている請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。
【請求項１９】
ａ）請求項１または２のいずれかに記載の生産宿主を培養して、アラキドン酸を含んでなる微生物油が生成され、そして、
ｂ）場合によりステップ（ａ）の微生物油を回収すること
を含んでなるアラキドン酸を含んでなる微生物油の生成方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって生成される微生物油。
【請求項２１】
油が少なくとも約５％のアラキドン酸を含有する請求項２０に記載の微生物油。
【請求項２２】
油がリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選択される脂肪酸を含んでなる請求項２０に記載の混合油。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる食品。
【請求項２４】
類似食品、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品、および乳製品よりなる群から選択される請求項２３に記載の食品。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる、メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品。
【請求項２６】
請求項１９に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる動物飼料。
【請求項２７】
ペットフード、反芻動物飼料、家禽飼料、および水産養殖飼料よりなる群から選択される請求項２６に記載の動物飼料。
【請求項２８】
有効量の微生物油を含んでなり、場合により請求項１または２のいずれか一項に記載の組換え宿主を含んでなる、酵母バイオマスを含んでなる動物飼料。
【請求項２９】
酵母バイオマスが、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸よりなる群から選択される飼料栄養素を含んでなる請求項２８に記載の動物飼料。
【請求項３０】
請求項１９に記載の方法によって生成される微生物油と食品とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で栄養強化された食品の製造方法。
【請求項３１】
メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品の製造方法であって、請求項１９に記載の方法によって生成される微生物油と製品とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で製品が栄養強化される方法。
【請求項３２】
請求項１９に記載の方法によって生成される微生物油と動物飼料とを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸で栄養強化された動物飼料の製造方法。
【請求項３３】
請求項２６に記載の動物飼料と飼料栄養素を含んでなる酵母バイオマスとを組み合わせることを含んでなる、アラキドン酸を含んでなる動物飼料を飼料栄養素で栄養強化する方法。
【請求項３４】
飼料栄養素が、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸よりなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ヒトまたは動物によって消費可能または使用可能な形態でアラキドン酸を含有する請求項１９に記載の方法によって生成される微生物油を提供することを含んでなる、アラキドン酸で強化された栄養補助食品をヒト、動物または水産養殖生物に提供する方法。
【請求項３６】
ＡＴＣＣ名称ＡＴＣＣ を有する、アラキドン酸生成に有用な組換え生産宿主ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０４７。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図８Ｅ】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１１Ｄ】

【図１１Ｅ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１２Ｄ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１３Ｃ】

【図１３Ｄ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１４Ｄ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１５Ｄ】

【図１６】

【図１７】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１８Ｄ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図１９Ｄ】

【図１９Ｅ】

【公表番号】特表２００８−５１８６２８（Ｐ２００８−５１８６２８Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０１３９（Ｐ２００７−５４０１３９）
【出願日】平成１７年１１月３日（２００５．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０３０６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５５３２２
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲＳ　ＡＮＤ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】