リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法
リポソームからの内包物の放出速度を調節する方法が開示されている。リポソームの膜構成成分が、少なくとも、リン脂質、ステロイド、及びリガンド結合部位を有する物質を含み、リガンドが前記リガンド結合部位に直接又はリンカーを介して結合されることによりリポソームの膜表面に直接または前記リンカーを介して結合されており、前記リガンドと該リガンドのレセプターとの相互作用によりリポソームから前記搬送目的物が放出される。この際の放出速度は、前記リガンドの密度を調節することにより調節される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法及びそれにより内包物の放出速度が調節されたリポソームに関する。該リポソームは、外部からの刺激なしに、自発的に搬送目的物を放出することができ、さらに、搬送目的物の放出速度をコントロールすることができるので、例えばドラッグ・デリバリー・システム、診断薬、センサー等として有用である。
【背景技術】
リポソームは、生体膜の構成成分であるリン脂質、コレステロールなどを主成分とし、生物は体内にこれらの成分を分解する系を持っている。従って、リポソームは、異物として働く可能性が低く、毒性も少ない。また、リポソームは、再構成膜であるため、構成脂質分子の種類や構成比、電荷やサイズを容易に変えることができ、目的に応じた最適条件のリポソームを得ることができる。さらに、水溶性物質をリポソーム内水相に、また脂溶性物質を膜内に含有させることができるため、このようなリポソームの性質を利用して、リポソームを用いたドラッグ・デリバリー・システムの研究が盛んになっている。
近年、薬物等の搬送目的物を、標的細胞に効率よく輸送させるため、リポソーム膜表面に、抗体、糖鎖などのリガンドを結合したリポソームが研究されている（例えば、フォーセン・イー（Ｆｏｒｓｓｅｎ Ｅ）、外１名，ターゲティング機能を有するリガンド結合リポソーム（Ｌｉｇａｎｄ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「アドバンスド ドラッグデリバリー レビュー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ）」，（オランダ），１９９８年、２９巻、ｐ２４９−２７１；丸山・ケイ（Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋ．）、外４名，長時間循環可能なリポソームに結合した蛋白質・ペプチド（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「バイオシミカ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．）」，（オランダ），１９９１年，１０７０巻，ｐ２４６−２５２；米国特許第５３６６９５８号参照）。しかしながら、該リポソームは、搬送目的物を徐々にリポソーム膜外に放出させるか、あるいは細胞等に貪食により搬送目的物を細胞内へ移送させるものであり、積極的に搬送目的物の放出を狙ったものではなかった。
一方、局所での搬送目的物の放出を目的としたリポソームの研究も知られている（例えば、トーチリン・ブイピー（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ＶＰ）、外２名，蛍光分光器により測定した、ｐＨ感受性のホスファチジルエタノールアミン−オレイン酸−コレステロール リポソームの温度依存性凝集（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．），「アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９９２年，２０７巻，ｐ１０９−１１３；ダス・シーアール（Ｄａｓｓ ＣＲ．）、外３名，特殊なリポソームによる抗癌治療効果の向上（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「ジャーナル オブ ファーマシー アンド ファーマコロジー（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）」，（英国），１９９７年，４９巻，ｐ９７２−９７５；コーン・ジー（Ｋｏｎｇ Ｇ）、外１名，高熱とリポソーム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ ａｎｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「インターナショナル ジャーナル オブ ハイパーサーミア（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ．）」，（英国），１９９９年，１５：巻，ｐ３４５−３７０参照）。これらのリポソームは、温度やｐＨに感受性を持ち、目的とする領域における、温度やｐＨ変化等の外部刺激に応じて、搬送目的物を放出することができる。しかしながら、局所的に温度やｐＨをコントロールすることは容易ではなく、利便性にも欠けるものであった。
これに対し、標的細胞への結合により、外部刺激を加えることなく、自発的に搬送目的物を放出する免疫リポソームも知られている（例えば、米国特許第４９５７７３５号参照）。該発明は、リポソーム膜が流動性を有し、リポソーム表面のリガンドが、そのリセプターと相互作用できる位置に自由度をもって移動することを利用したものである。該リポソームの主膜構成成分は、不飽和ホスファチジルエタノールアミン（９９．９５％）であるが、一般に、膜成分が不飽和ホスファチジルエタノールアミンのみでは、脂質２重膜を形成することはできない。同特許文献に記載されたリポソームは、抗体とパルミチン酸との複合体（ｐＩｇＧ）を、膜の両側（内側と外側）に加えることにより、安定な脂質２重膜を形成させたものである。該リポソームは、膜安定性を保つために、リポソーム１個に対して最低５個のｐＩｇＧが必要であり、また、９個以上のｐＩｇＧが存在するとリポソームは自己凝集する。従って、リポソーム膜上の抗体数を大きく変化させることはできず、また、搬送目的物の放出速度を自由にコントロールすることもできなかった。
【発明の開示】
本発明は、ドラッグ・デリバリー・システム、診断薬、センサー等に用いるリポソームに内包される搬送目的物を自発的に放出し、かつ、その搬送目的物の放出速度を自由にコントロールできる、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法及びそれにより内包物の放出速度が調節されたリポソームの提供を目的とする。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、リポソームの構成成分の１つとして、リガンド結合部位を有する物質を用い、該リガンド結合部位に直接又はリンカーを介して前記リガンドを結合することによりリポソームの膜表面に前記リガンドが結合されたリガンド結合リポソームと、該リガンドのレセプターとを結合させると、リポソームが破壊されて内包物が放出され、その際の放出速度が、リガンドの密度を調節することにより調節可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、リポソームの膜構成成分が、リガンド結合部位を有する物質を含み、リガンドが前記リガンド結合部位に直接又はリンカーを介して結合されることによりリポソームの膜表面に直接または前記リンカーを介して結合されており、前記リガンドと該リガンドのレセプターとの相互作用によりリポソームから前記搬送目的物が放出される、前記搬送目的物を内包するリポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法であって、該放出速度が、前記リガンドの密度を調節することにより調節される、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法によりリポソームからの搬送目的物の放出速度が調節されたリポソームを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のリポソームであって、搬送目的物として医薬を内包するリポソームを含有する医薬組成物を提供する。さらに本発明は、上記本発明のリポソームであって、搬送目的物として診断薬を内包するリポソームを含有する診断薬組成物を提供する。
本発明によれば、搬送目的物を特異的に標的組織あるいは細胞に輸送することができ、かつ、その標的組織あるいは細胞の近傍に搬送目的物を、調節された速度で放出することが可能となるため、安定性の低い薬物であっても効率よく搬送され、かつ、安全性の高いドラック・デリバリー・システムを提供できる。また、本発明によれば、リポソーム膜上のリガンドの種類やリガンドの密度を変化させることにより、搬送目的物の放出速度を外部からの刺激無しにコントロールできるので、即効性を要する薬物への利用から、徐放製剤まで、幅広く活用することができる。また、このようなリポソームをセンサーとして用いるならば、検出すべき物質の濃度に依存した搬送目的物の放出を見ることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、１５ａａペプチドの密度の逆数と、リポソームがコラーゲン上の活性化血小板と接触した場合のカルセインの放出速度との関係を示す図である。
図２は、ＲＧＤペプチドの密度の逆数と、リポソームがコラーゲン上の活性化血小板と接触した場合のカルセインの放出速度との関係を示す図である。
図３は、１５ａａペプチド又はＲＧＤペプチドの密度と、リポソームがコラーゲン上の活性化血小板と接触した場合のカルセインの放出速度との関係を示す図である。
図４は、１５ａａペプチドを結合したリポソームをコラーゲン上の活性化血小板表面と接触させた場合の、内包物であるカルセインの蛍光回復率、即ち、カルセインの放出の経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化された１５ａａペプチド数を２７０００から０まで変化させた。
図５は、１５ａａペプチド又はＲＧＤペプチドを結合したリポソームをコラーゲン上の活性化血小板表面と接触させた場合の、内包物であるカルセインの蛍光回復率、即ち、カルセインの放出の経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化させたペプチド数は２００００である。
図６は、１５ａａペプチド又はＲＧＤペプチドを結合した、脂質部分にＮ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−４−イル）ホスファチジルエタノールアミン及びＮ−（リサミン ローダミンＢスルフォニル）ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームをコラーゲン上の活性化血小板表面と接触させた場合の、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−４−イル）ホスファチジルエタノールアミンの蛍光回復率、即ち、ｌｉｐｉｄ−ｍｉｘｉｎｇの経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化させたペプチド数は２００００である。
図７は、ＲＧＤペプチドを結合したリポソームをＨＵＶＥＣと接触させた場合の、内包物であるカルセインの蛍光回復率、即ち、カルセインの放出の経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化させたＲＧＤペプチド数を１２００００から０まで変化させた。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）リポソーム膜構成成分
本発明のリポソーム膜構成成分は、少なくとも、リン脂質、ステロール類及びリガンド結合部位を有する物質を含むことが好ましいが、これらに限定されるものではなく、所望の膜特性を与えるために他の構成成分を付加的に含有しても良い。以下、各構成成分についてさらに詳細に説明する。
（１−１）リン脂質
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジン酸類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルイノシトール類、スフィンゴミエリン類、ジセチルホシフィート類、カルジオリピン類、及びリゾホスファチジルコリン類等が挙げられる。また、これらの脂質は、大豆油又は卵黄など天然の材料から抽出・精製したものでも、それらを水素添加して構成脂肪酸を飽和化したもの（水素添加リン脂質）でもよい。
リン脂質の構成脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、ヘプタデシル酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ペヘン酸、リグノセリン酸等の飽和脂肪酸、あるいは、ウンデシル酸、オレイン酸、エライジン酸、セトレイン酸、エルカ酸、ブラシジン酸、ソルビン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ステアロール酸等の不飽和脂肪酸であってもよい。この中で特に、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ステアロール酸等が好ましい。
さらに、具体的には、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、精製卵黄レシチン、水素添加精製大豆レシチン、卵黄由来ホスファチジルコリン等を挙げることができるが、特に、ジミリスチルホスファチジルコリンが好ましい。
リポソームを構成するリン脂質は、１種類でもよいし複数種類のリン脂質を組み合わせて用いることもできる。
（１−２）ステロイド
ステロイドとしては、ステロール、例えば、コレステロール類、エルゴステロール類、シトステロール類、スチグマステロール類、フコレステロール類等を挙げることができるが、特にコレステロール類が好ましい。コレステロール類としては、下記一般式［Ｉ］で表されるものを好ましい例として挙げることができる。
ただし、式中、Ｒ１は互いに独立に、アルキル、ベンジル、アルケニル、ヒドロキシ、アミノ、カルボニル、チオール又はシロキシルを示し、好ましくは、炭素数１〜２０の分岐状又は直鎖状のアルキル基若しくはアルケニル基を示す。一般式［Ｉ］で表されるコレステロール類の中でもコレステロールが最も好ましい。
（１−３）リガンド結合部位を有する物質
リガンド結合部位を有する物質としては、リガンドと結合可能な官能基である、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、水酸基等を有する物質が挙げられるが、リガンドと共有結合あるいは静電気結合を生じうるものであれば、特にこれらに限定されるものではない。
具体的には、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルチオエタノールアミン類、ホスファチジル−エチレングリコール類等が例示されるが、特に、ホスファチジルエタノールアミン類が好ましい。該ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−カプロイルアミン−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−ドデカニルアミン−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−マレイミドフェニルブチル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−サクシニル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−ドデカニル−ホスファチジルエタノールアミン等のように、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に、リガンドとの結合が可能な官能基を有する構造が結合したものを挙げることができる。
この中でも特に、ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンの化学構造を以下に示す。
ただし、式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に構成脂肪酸残基を示す。これを、−ＳＨ基を含有するリガンド又はリンカー（例えば、システインを含むペプチド等）と反応させると、ピリジンチオンが離脱し、リガンド又はリンカーが−Ｓ−Ｓ−結合を介して結合される。ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンは市販されているので、市販品を用いることができる。
なお、フォスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルチオエタノールアミン類、ホスファチジル−エチレングリコール類に含まれる構成脂肪酸の好ましい例としては、リン脂質の説明において上記した好ましい構成脂肪酸を挙げることができる。
（１−４）膜構成比
上記したリポソームの膜構成成分の配合比率としては、内部に水溶液を内包するリポソームが形成されるのであれば特に限定されないが、通常、リン脂質に対して、ステロール類が４０〜６０モル％、好ましくは、４５〜５５モル％、リガンド結合部位を有する物質が１２〜７５モル％、好ましくは１２〜２５モル％である。従って、好ましい態様である、リン脂質がホスファチジルコリン類、ステロール類がコレステロール類、リガンド結合部位を有する物質がホスファチジルエタノールアミン類である場合の構成比率は、通常、ホスファチジルコリン類に対して、コレステロール類が４０〜６０モル％、ホスファチジルエタノールアミン類が１２〜７５モル％であり、さらに好ましくは、ホスファチジルコリン類に対して、コレステロール類が４５〜５５モル％、ホスファチジルエタノールアミン類が１２〜２５モル％である。
リポソーム膜は、リポソームの形成を阻害しない範囲であれば、上記以外の他の成分を含んでいてもよく、例えば、トコフェロール又はその誘導体のような酸化防止剤を任意的に含んでいてもよい。このような任意成分の含有量は、リン脂質に対して、通常０〜１０モル％程度、好ましくは０〜５モル％程度である。
（２）リガンド
リガンドは、生体内に存在するレセプターと結合する性質を有するものであり、抗体、抗原、糖蛋白質、リポ蛋白質等を含む蛋白質類、ペプチド類、ハプテン、糖鎖、核酸、多糖類、脂質等が例示される。
リガンドがペプチド類である場合には、フィブリノゲンＣγ由来ドデカペプチド（配列番号１）、またはフィブリノゲンＣγ由来トリデカペプチド（配列番号２または配列番号３）、細胞接着性蛋白質に共通な最小活性単位（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含むペプチド、ウロキナーゼタイプ・プラスミノゲンアクティベータ・レセプター結合ペプチド（配列番号４または配列番号５）、インテグリン結合ペプチド、カドヘリン結合ペプチド、ＥＧＦ結合ペプチド、トロンボスポンジン由来ペプチド、ラミニン由来ペプチド、コラーゲン由来ペプチド、フィブロネクチン由来ペプチド等のアミノ酸５個〜５０個からなるペプチドを挙げることができる。より好ましいリガンドとしては、アミノ酸７個〜３０個からなるペプチドである。
その他のリガンドとしては、葉酸誘導体、トランスフェリン、シアル酸含有糖鎖（シアリルルイスＸ、シアリルルイスＡ等）、ヒアルロン酸、マンノース誘導体、グルコース誘導体、細胞特異的レクチン、ラクトシルセラミド、ステロイド誘導体、アルブミン誘導体を挙げることができる。
これらのリガンドは、内皮細胞、血管細胞、血小板膜、白血球膜、癌細胞上などに存在する、イムノグロブリン（Ｎ−ＣＡＭ，ＰＥＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２）、カドヘリン（Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン）、インテグリン、細胞外マトリックス、セレクチン（Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン）などのレセプターをターゲットとしており、これらに関わる疾患の治療・診断に用いることができる。
（３）リンカー
リンカーは、上記リガンド結合部位を有する物質のリガンド結合部位とリガンドとを連結する構造であり、単にスペーサーとして機能するだけであるから、上記リガンド結合部位を有する物質のリガンド結合部位と結合可能な官能基及び上記リガンドと結合可能な官能基を有していればその構造は何ら限定されるものではない。リンカーに用いる物質としては、官能基を有する化合物であれば、各種ペプチド（例えば、−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−）、プロピオン酸、カプリル酸、コハク酸等を挙げることができる。なお、リガンドがペプチドであり、リンカーもペプチドである場合、リガンドとリンカーとが融合した単一のペプチドが膜表面に結合されることになるが、この場合、融合ペプチド中の、レセプターと結合させたい領域がリガンドであり、リガンド結合部位を有する物質とリガンドとを結合させるために用いられる領域がリンカーである。例えば、下記実施例で用いられる１５ａａペプチド（配列番号６）は、配列番号１で示される１２アミノ酸残基から成るフィブリノゲンＣγ由来ドデカペプチドがリガンドであり、そのＣ末端に融合しているＳｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ領域がリンカーである。同様に配列番号７で示されるＲＧＤペプチドにおいても、Ｃ末端のＳｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ領域がリンカーであり、それよりも上流がリガンドである。
（４）搬送目的物
搬送目的物は、その目的に応じ、薬物学的に許容しえる薬理的活性物質、生理活性物質及び／または診断用物質を用いることができる。薬物の種類としては、
リポソームの形成を損なうものでなければ特に限定されない。
具体的には、止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、血栓溶解剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤、血管拡張剤、血小板凝集阻害剤、血管内被細胞の増殖促進または抑制剤、抗がん剤、抗生物質、酵素剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離阻害剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ阻害剤、ラジカルスカベンジャー、インスリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヒルゲン、ヒルロス、ヒルジン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、化学療法剤、ワクチン、糖蛋白、ホルモン、細菌性トキソイド、成長ホルモン、カルシトニン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−２）、ステロイド、レチノイド、オキシトシン、バソプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板促進因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、インシュリン、カルシトニン、シクロスポリンＡ、インターロイキン等のリンホカイン、インターフェロン等のサイトカイン類、蛋白質、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子治療剤、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
また、診断のための標識物質としては、酵素（好ましい例：グルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ）、蛍光物質（好ましい例：ウンベリフェリルリン酸、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、カルセイン、アミノナフタレン３硫酸とキシレンビスピリミジンブロミドの複合体、インドシアニングリーン）、Ｘ線造影剤、放射性同位元素（好ましい例：ヨウ素化合物であるｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ，ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）、標識核医学診断薬（好ましい例：テクネシウム、インジウム）、核磁気共鳴診断用診断薬等（好ましい例：鉄、ガドリニウム、マンガン、フッ素などを含む物質）が挙げられる。特に、近赤外蛍光物質を用いると、近赤外蛍光を用いた蛍光分子トモグラフィー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＦＭＴ）が可能になる。
（５）リポソームの調製方法（搬送目的物の内包化）
本発明のリポソームは、上記した膜構成成分及び内包する搬送目的物の水溶液を用いて、常法（例えば、野島庄七 外２名編「リポソーム」１９８８年９月１５日発行 南江堂）によって容易に得ることができる。例えば、逆相蒸留法、超音波法、界面活性剤除去法、水和法、凍結融解法、エタノール注入法、押出し法（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法）、高圧乳化法等を挙げることができるが、搬送目的物をリポソームの内水相へ内包させる方法として、特に逆相蒸留法が好ましく利用される。具体的には、上記膜構成成分の有機溶媒溶液に搬送目的物の水溶液を加えて超音波処理し、減圧下で有機溶媒を除いて得られたエマルジョンにさらに搬送目的物の水溶液を加え、減圧下で有機溶媒を完全に除去する方法をとる。この際用いられる有機溶媒の好ましい例としては、クロロホルム、エーテル及びそれらの混合溶媒を挙げることができる。下記実施例にその具体例が詳細に記載されている。なお、リポソームの粒子径は、約２５〜１０００ｎｍ、好ましくは１５０〜２５０ｎｍである。
（６）リガンドの調製方法
リガンドが、蛋白質の場合は、天然の抽出物、精製物、組換体、その他周知の方法で得られるものであればよい。ペプチド合成は、通常の液相または固相合成法を用いればよく、自動ペプチド合成装置を用いても合成してもよい。また、リガンドが、ハプテン・核酸等の場合も、天然の抽出物、精製物、合成品、その他周知の方法で得られるものであればよく、特に限定されない。
（７）リポソームとリガンドとの結合
リポソーム中のリガンドの結合部位を有する物質とリガンド（あるいはスペーサーを有するリガンド）との具体的な結合方法としては、−ＳＨ基と−ＳＨ基とをジスルフィド結合させる方法、アミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させる方法、アルデヒド基とアミノ基とをシッフベースで結合させ還元する方法等を挙げることができる。アミド結合は、公知の技術（ＤＣＣ法、アジド法、混合酸無水物法等）により行われる。また、静電相互作用でリポソームにリガンドを結合させることも可能である。これらは、常法により実施することができる。下記実施例の１つでは、リガンド結合部位を有する物質として上記ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンを用い、リガンド＋リンカーとして、システイン含有ペプチドを用い、両者を室温で混合するだけでリガンド＋リンカーをリポソームに結合している。
なお、リポソームとリガンドの結合は、先にリポソームを形成した後にリガンドを直接又はリンカーを介して結合してもよいし、リガンド結合部位を有する物質とリガンドを直接又はリンカーを介して結合したものを用いてリポソームを形成してもよい。また、リンカーを用いる場合には、予めリガンドとリンカーを結合したものをリガンド結合部位を有する物質と結合してもよいし、リガンド結合部位を有する物質にリンカーを結合し、その後、リンカーにリガンドを結合してもよい。
さらに、得られたリポソームは、親水性高分子の脂質誘導体で被覆してもよい。これは、リポソームのターゲッティング機能を損なうものでなければ特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、マンナン、ペクチン、カラギーナン、及びこれらの誘導体が挙げられる。中でもポリエチレングリコール及びポリエチレングリコール誘導体が望ましい。
（８）搬送目的物の放出
リポソームに内包された搬送目的物は、膜表面上のリガンドが、該リガンドに対応するレセプターと相互作用することにより、放出される。この場合、相互作用するとは、リガンドが、対応するレセプターと特異的に結合することをいい、該レセプターは、ある一定の大きさを有するマトリックス上（例えば、細胞膜、固相等）に複数存在している。
（９）搬送目的物の放出速度の調節
リポソームに内包される搬送目的物の放出速度は、リポソームに結合されたリガンドの密度に依存して変化し、所定の範囲内では、リガンドの密度が高いほど放出速度が大きくなる。なお、放出速度は、リガンドとレセプターの親和性によって異なり、親和性が大きいほど放出速度が大きくなるので、所望の放出速度を達成するリガンドの密度は、それぞれのリガンドにより異なる。各リガンドについての放出速度は、下記実施例に詳述する方法により測定することができるので、それに基づいて所望のリガンド密度を決定することができる。
リガンドの密度に依存して搬送目的物の放出速度を変化させるのに適した、該リガンドの密度の好ましい範囲は、リポソームの表面積を１．２６×１０−１３ｍ２とした場合、３．７×１０１６個／ｍ２〜２．４×１０１８個／ｍ２、さらに好ましくは、４．０×１０１６個／ｍ２〜１．６×１０１８個／ｍ２である。これは、リポソーム粒子１個当たりのリガンド数に換算すると、４．６×１０３個〜３．０×１０５個、さらに好ましくは５．０×１０３個〜２．０×１０５個であり、モル比へ換算すると０．１６モル％〜１０モル％、さらに好ましくは０．１７モル％〜６．９モル％、さらに重量比に換算すると、好ましくは０．５９ｗ／ｗ％〜３９ｗ／ｗ％、さらに好ましくは０．６４ｗ／ｗ％〜２６ｗ／ｗ％となる。
下記実施例において測定された、リガンド＋リンカーが１５ａａペプチド（配列番号６）又はＲＧＤペプチド（配列番号７）（上記の通り、各配列番号のＣ末端のＳｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓがリンカー）である場合のリガンドの密度を下記表１に示す。
ここで、搬送目的物の放出速度の測定は、一般に、カルセイン等の蛍光物質をリポソームに内包させ、放出された蛍光強度を測定する方法が用いられる。また、カルセインのように高濃度で自己消光する蛍光物質や、実験条件により放出された際に外部の物質と反応してその物性（ＵＶ／ＶＩＳや蛍光等）が変化する物質を用いて測定することも可能である。
リガンド密度の測定方法としては、リガンド特有のＵＶ／ＶＩＳ、蛍光、円偏向スペクトルの測定、ＥＬＩＳＡによるリガンド濃度の測定、リガンドと脂質の反応の際に放出される物質のスペクトルの測定等がある。
（１０）リポソーム膜におけるｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇ（膜融合または脂質移動）の測定
リポソーム膜における膜融合または脂質移動をリアルタイムで測定するには一般に、蛍光ラベルした２種類の脂質を組み込んだリポソームを用いるＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）法、または蛍光ラベルした１種類の脂質を組み込んだリポソームを用いるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｅｌｆ−Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ法が用いられる。例えば、Ｎ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ）とＮ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏ−４−ｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（Ｎ−ＮＢＤ−ＰＥ）を組み込んだリポソームを用いた場合、膜融合や脂質移動が起こらないときにはＮ−ＮＢＤ−ＰＥからＮ−Ｒｈ−ＰＥへの間のエネルギー移動により４６５ｎｍ励起による５３０ｎｍの蛍光は低い値に抑えられている。膜融合または脂質移動によりリポソーム内の脂質拡散が起こると、Ｎ−ＮＢＤ−ＰＥからＮ−Ｒｈ−ＰＥへのエネルギー移動の効率が著しく減少し、５３０ｎｍに於ける蛍光が増加する。Ｎ−Ｒｈ−ＰＥのみを組み込んだリポソームでは、膜融合または脂質移動が起こらないときには、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥの蛍光は自己消光により低い値を示すが、膜融合または脂質移動によりリポソーム内の脂質拡散がおこると、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥの蛍光は増加する。本発明のリポソームでは、ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇのレベルは低かった（実施例２（３））。
（１１）リポソームが細胞内に取り込まれる、または細胞と膜融合した後のａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇによるリポソーム内のｐＨ変化測定
リポソームが細胞内に取り込まれたり膜融合すると、細胞内のｐＨは６．０付近で生理的ｐＨ７．４より低いため、リポソーム内のｐＨも変化する。このｐＨ変化をリアルタイムで追跡するには、一般にｐＨ変化に敏感な蛍光試薬が用いられる。例えば、ピラニンは、ｐＨが低いときには４０３ｎｍ付近に、ｐＨが高いときには４５０ｎｍ付近に蛍光ピークを示すので、リポソームに内包されたピラニンの４０３ｎｍと４５０ｎｍのピーク比から、リポソーム内のｐＨ変化を測定することができる。本発明のリポソームでは、ａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇによるリポソーム内のｐＨ変化はほとんど起きなかった（実施例２（４））。以上より、本発明のリポソームからの搬送目的物の放出は、細胞によるリポソームの貪食や膜融合ではなく、細胞表面でリポソーム膜が崩壊して、内包物の放出が起きていることを示している。
（１２）医薬品組成物／診断薬／センサー
本発明のリポソームを含む医薬組成物としては、血小板代替物、血管障害、血管損傷、血栓形成部位の検査、及び血栓症等の予防・治療・診断等の医薬品、あるいは癌等に対する診断・治療用試薬等がある。また、診断薬として用いる場合には、診断対象物に対するリガンドをリポソーム膜上に結合させ、該リポソームに、酵素、蛍光物質、Ｘ線造影剤等を内包させることにより、診断対象物の測定診断試薬として用いることができる。さらに、該リポソームが速放性を有する場合には、センサーとしての利用も可能である。
本発明のリポソームを医薬組成物として利用するにあたっては、各種疾患に対応して、血管内投与法、腹腔内投与法、局所投与法などにより投与することができる。また、その投与量は、目的とする薬理作用、薬剤の種類等により、適宜調節することができる。
以下、本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を含むペプチドを表面に固定化し、カルセインを内包したリポソーム（以下、１５ａａ−Ｃ−リポソームという）の、脂質部分にローダミンとＮＢＤを含むリポソーム（以下、１５ａａ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームという）、ピラニンを内包したリポソーム（以下、１５ａａ−Ｐｙ−リポソームという）、及びＲＧＤを含むペプチドを表面に固定化し、カルセインを内包したリポソーム（以下、ＲＧＤ−Ｃ−リポソームという）、脂質部分にローダミンとＮＢＤを含むリポソーム（以下、ＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームという）、及びピラニンを内包したリポソーム（以下、ＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームという）の作製
（１）カルセインを内包したリポソームの作製
ジミリストイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）７ｍｇ、コレステロール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）２ｍｇ、Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニルホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ）１．３ｍｇをクロロホルム１ｍｌとエーテル２ｍｌに溶解させ、ついで１００ｍＭカルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）溶液１ｍｌを加え、Ｎ２下、浴槽型ソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて２０℃，５分間超音波処理した。生成するエマルジョンを減圧下（３５０−４００ｍｍＨｇ）でロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を除去すると試料はゲル状になり、ここに、さらに１ｍｌの１００ｍＭカルセインを加え、再び６８０−７００ｍｍＨｇの減圧下で残っている有機溶媒を除去した。得られたリポソームはポアサイズ２００ｎｍのミリポアフィルター（Ｗａｔｍａｎ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）を用いてサイズを一定（直径約２００ｎｍ）にし、封入されなかったカルセインをセファデックスＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で除いた。
（２）脂質部分にローダミンとＮＢＤを含むリポソームの作成
ジミリストイルホスファチジルコリン７ｍｇ，コレステロール２ｍｇ，Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニルホスファチジルエタノールアミン１．３ｍｇ，Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ１，３−ジアゾ−４−イル）ホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）０．１３ｍｇ，Ｎ−（リサミン ローダミンＢスルフォニル）ホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）０．１９ｍｇをクロロホルム１ｍｌとエーテル２ｍｌに溶解させ、ついで５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／アセテートバッファー（ｐＨ７．４）１ｍｌを加え、Ｎ２下、浴槽型ソニケータを用いて２０℃，５分間超音波処理した。生成するエマルジョンを減圧下（３５０−４００ｍｍＨｇ）でロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を除去すると資料はゲル状になり、ここに、さらに１ｍｌのＨＥＰＥＳ／アセテートバッファーを加え、再び６８０−７００ｍｍＨｇの減圧下で残っている有機溶媒を除去した。得られたリポソームはポアサイズ２００ｎｍのミリポアフィルターを用いてサイズを一定（直径２００ｎｍ）にした。
（３）ピラニンを内包したリポソームの作成
ジミリストイルホスファチジルコリン７ｍｇ，コレステロール２ｍｇ，Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニルホスファチジルエタノールアミン１．３ｍｇをクロロホルム１ｍｌとエーテル２ｍｌに溶解させ、ついで２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／７５ｍＭ ＮａＣｌバッファーｐＨ７．４に溶解させた３５ｍＭピラニン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）溶液１ｍｌを加え、Ｎ２下、浴槽型ソニケータを用いて２０℃，５分間超音波処理した。生成するエマルジョンを減圧下（３５０〜４００ｍｍＨｇ）でロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を除去すると試料はゲル状になり、ここに、さらに１ｍｌの３５ｍＭピラニンを加え、再び６８０−７００ｍｍＨｇの減圧下で残っている有機溶媒を除去した。得られたリポソームはポアサイズ２００ｎｍのミリポアフィルターを用いてサイズを一定（直径２００ｎｍ）にし、封入されなかったピラニンをセファデックスＧ−２５カラムで除いた。
（４）フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を含むペプチド、及びＲＧＤを含むペプチドの固定化
得られたリポソームに必要量の１５ａａペプチド（配列番号６）又はＲＧＤペプチド（配列番号７）を加え、室温でインキベートした後、反応しなかったペプチドをセファデックスＧ−２５カラムで除いた。リポソームに結合したペプチドの数は、反応の際に出てくるピリジン−２−チオン（３４３ｎｍにおいてｅ＝８．０８×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）の定量、リポソームの濃度は、リポソームサイズ及びリピド濃度から求めた。
【実施例２】
血小板との相互作用における、リガンドの表面密度に依存した１５ａａ−Ｃ−リポソームからのカルセイン放出速度
９６穴のマイクロプレートを３０μｇ／ｍｌタイプＩコラーゲン（新田ゼラチン、大阪、日本）でコーティングし、この上にＰｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ（以下、ＰＲＰという）２００μＬを加え室温で１時間放置した。コラーゲンに粘着しなかった血小板を除き、ここへ実施例１で作製した１５ａａ−Ｃ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で入れ、リポソームから放出されるカルセインの量を蛍光で測定した。測定はＳａｆｉｒｅ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、Ｅｘｃ／Ｅｍｉ：４９０ｎｍ／５２０ｎｍで行った。放出されるカルセインの量は、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）によって放出したカルセインの蛍光強度に対する割合として示した。ペプチドが表面に固定化されていないコントロールリポソームではカルセインの放出は起こらなかった（図４）。同様の実験を抗１５ａａペプチド抗体、フリーの１５ａａペプチド、又は、抗インテグリンα１１ｂβ３抗体存在下でおこなうと、１５ａａ−Ｃ−リポソームからのカルセインの放出は著しく減少した。コラーゲン表面と１５ａａ−Ｃ−リポソームとの相互作用では、カルセインの放出は見られなかった。カルセイン放出の半減期は、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（２７０００；リポソーム１個の表面に固定化されたペプチド数）では約３．５分，１５ａａ−Ｃ−リポソーム（１９０００）では約１時間、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（７５００）では約５時間、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（５９００）では約１８時間、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（４６００）では約２０時間であった（図１及び図３）。
（２）血小板との相互作用における、リガンドの種類に依存したリポソームからのカルセイン放出速度
リポソーム１個の表面に固定化するペプチドの数を２００００とし、血小板表面との相互作用における１５ａａ−Ｃ−リポソーム及びＲＧＤ−Ｃ−リポソームからのカルセイン放出速度を測定した。（１）と同様の方法でコラーゲン上に活性化血小板表面を作製し、ここへ実施例１で作製した１５ａａ−Ｃ−リポソーム、またはＲＧＤ−Ｃ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で加え、（１）と同様の方法でリポソームから放出されるカルセインの量を測定した。血小板表面に存在するインテグリンα１１ｂβ３に対して高い親和性を持つ１５ａａペプチドを固定化した１５ａａ−Ｃ−リポソームでは、速やかなカルセインの放出が起こるが、インテグリンα１１ｂβ３に対する親和性が低いＲＧＤを含むペプチドを固定化したＲＧＤ−Ｃ−リポソームでは、カルセイン放出のレベルは低かった（図５）。
（３）リガンドの種類に依存したリポソームと血小板とのｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇ（脂質交換または脂質移動）
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を２００００とし、リポソームと血小板との間のｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇを測定した。（１）と同様の方法で作製した活性化血小板表面上に、実施例１で作製した１５ａａ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソーム、またはＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で加え、ＮＢＤの蛍光強度変化測定をＳａｆｉｒｅを用いてＥｘｃ／Ｅｍｉ：４６５ｎｍ／５３０ｎｍで行った。Ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇのレベルは、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００によるＮＢＤの蛍光強度の増加に対する割合として示した。１５ａａ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームとＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームに対するｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇのレベルは低く、一時間のインキュベーション後、夫々１８％と１０％であった（図６）。
（４）リガンドの種類に依存したリポソームと血小板とのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇ
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を２００００とし、リポソームと血小板との間のａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇを測定した。（１）と同様の方法で作製した活性化血小板表面上に実施例１で作製した１５ａａ−Ｐｙ−リポソーム、またはＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で加え、４５１ｎｍと４０３ｎｍに於けるピラニンの蛍光強度比の変化に基づき、以下の式からａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇの割合を求めた。
１５ａａ−Ｐｙ−リポソームにおいてもＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームにおいても４５分間のインキュベーションによる４５１ｎｍ／４０３ｎｍの蛍光強度比の変化は１％以下で、リポソームと血小板とのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇはほとんど起こらなかった。
【実施例３】
フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を含むペプチドを表面に固定化し、ローダミンで蛍光ラベルしたリポソーム（１５ａａ−Ｒ−リポソーム）の作製
実施例１と同様のリポソームの脂質構成成分にＮ−（リサミン−ローダミンＢスルホニル）ホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ）０．１６ｍｇを加え、カルセインを含まない溶液を用いて実施例１と同様の方法でリポソームを作製した。
【実施例４】
流動状態下における活性化血小板へのリポソームの粘着
直径２．５ｃｍ、厚さ０．５ｍｍのガラス板を３０μｇ／ｍｌのタイプＩコラーゲン（新田ゼラチン）でコーティングし、この上に全血を３分間、ずり速度１１００ｓ−１で還流し、コラーゲンに粘着しなかった血液成分を除去した。コラーゲン表面で活性化し粘着した血小板上に、１５ａａ−Ｒ−リポソーム（４６００及び４２０００）を３．８×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度、ずり速度１１００ｓ−１（最小動脈における平均ずり速度）で３分間還流すると、コラーゲン表面にリポソームの粘着によるローダミンの強い蛍光が観察された。蛍光の観察はＥＧ−Ｌａｂｏ（ニコン，東京，日本）を用い、Ｅｘｃ／Ｅｍｉ：５５０／５９０ｎｍで行った。表面にペプチドを固定化していないコントロールリポソームを用いて同様の実験を行なった場合、コントロールリポソームはコラーゲン表面には粘着せず、コラーゲン表面でのローダミンの蛍光はほとんど見られなかった。
【実施例５】
（１）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との相互作用における、リガンドの表面密度に依存したＲＧＤ−リポソームからのカルセイン放出速度
９６穴のマイクロプレートを１０μｇ／ｍｌビトロネクチン（旭テクノグラス、東京）でコーティングし、この上にＨＵＶＥＣ（１×１０５／ｗｅｌｌ）を粘着させ、ここへ実施例１で作製したＲＧＤ−Ｃ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で入れ、リポソームから放出されるカルセインの量を、実施例２と同様の方法で測定した。コントロールリポソームを用いて同様の実験を行った場合、コントロールリポソームからのカルセインの放出はほとんど見られなかった（図７）。抗αｖβ３抗体存在下で同様の実験を行うと、ＲＧＤ−Ｃ−リポソームからのカルセインの放出は著しく減少した。カルセイン放出の半減期は、ＲＧＤ−Ｃ−（１６００００）では２５分、ＲＧＤ−Ｃ−リポソーム（１２００００）では３５分、ＲＧＤ−Ｃ−リポソーム（９３０００）では約８時間、ＲＧＤ−Ｃ−リポソーム（７００００）では約８．５時間であった（図２及び図３）。
（２）ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−リポソームとのｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇ
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を１２００００とし、ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームとのｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇを測定した。実施例５（１）と同様の方法でＨＵＶＥＣを粘着させ、ここへ実施例１で作製したＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームを加え、実施例２（３）と同様の方法でｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇを測定したが、ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇの割合は、１％以下であった。
（３）ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−リポソームとのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇ
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を１２００００とし、ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームとのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇを測定した。実施例５（１）と同様の方法でＨＵＶＥＣを粘着させ、ここへ実施例１で作製したＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームを加え、実施例２（４）と同様の方法でａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇを測定したが、４５１ｎｍ／４０３ｎｍの蛍光強度比は変化せず、リポソームとＨＵＶＥＣとのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇはほとんど起こらなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、搬送目的物を特異的に標的組織あるいは細胞に輸送することができ、かつ、その標的組織あるいは細胞の近傍に搬送目的物を放出することが可能となるため、安定性の低い薬物であっても効率よく搬送され、かつ、安全性の高いドラック・デリバリー・システムを提供できる。また、本発明によれば、リポソーム膜上のリガンドの種類やリガンドの密度を変化させることにより、搬送目的物の放出速度を外部からの刺激無しにコントロールできるので、即効性を要する薬物への利用から、徐放製剤まで、幅広く活用することができる。また、このようなリポソームをセンサーとして用いるならば、検出すべき物質の濃度に依存した搬送目的物の放出を見ることができる。さらに、最も新しいイメージング技術であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＦＭＴ）においてもリガンド固定化リポソームの応用が可能である。例えば、近赤外蛍光を用いたＦＭＴにより体表面から７−１４ｃｍまでの可視化が理論的には可能であることから、近赤外蛍光を内包したリガンド固定化リポソームを用いることにより、深部静脈中の血小板血栓をＦＭＴにより発見することが可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【技術分野】
本発明は、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法及びそれにより内包物の放出速度が調節されたリポソームに関する。該リポソームは、外部からの刺激なしに、自発的に搬送目的物を放出することができ、さらに、搬送目的物の放出速度をコントロールすることができるので、例えばドラッグ・デリバリー・システム、診断薬、センサー等として有用である。
【背景技術】
リポソームは、生体膜の構成成分であるリン脂質、コレステロールなどを主成分とし、生物は体内にこれらの成分を分解する系を持っている。従って、リポソームは、異物として働く可能性が低く、毒性も少ない。また、リポソームは、再構成膜であるため、構成脂質分子の種類や構成比、電荷やサイズを容易に変えることができ、目的に応じた最適条件のリポソームを得ることができる。さらに、水溶性物質をリポソーム内水相に、また脂溶性物質を膜内に含有させることができるため、このようなリポソームの性質を利用して、リポソームを用いたドラッグ・デリバリー・システムの研究が盛んになっている。
近年、薬物等の搬送目的物を、標的細胞に効率よく輸送させるため、リポソーム膜表面に、抗体、糖鎖などのリガンドを結合したリポソームが研究されている（例えば、フォーセン・イー（Ｆｏｒｓｓｅｎ Ｅ）、外１名，ターゲティング機能を有するリガンド結合リポソーム（Ｌｉｇａｎｄ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「アドバンスド ドラッグデリバリー レビュー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ）」，（オランダ），１９９８年、２９巻、ｐ２４９−２７１；丸山・ケイ（Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋ．）、外４名，長時間循環可能なリポソームに結合した蛋白質・ペプチド（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「バイオシミカ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．）」，（オランダ），１９９１年，１０７０巻，ｐ２４６−２５２；米国特許第５３６６９５８号参照）。しかしながら、該リポソームは、搬送目的物を徐々にリポソーム膜外に放出させるか、あるいは細胞等に貪食により搬送目的物を細胞内へ移送させるものであり、積極的に搬送目的物の放出を狙ったものではなかった。
一方、局所での搬送目的物の放出を目的としたリポソームの研究も知られている（例えば、トーチリン・ブイピー（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ＶＰ）、外２名，蛍光分光器により測定した、ｐＨ感受性のホスファチジルエタノールアミン−オレイン酸−コレステロール リポソームの温度依存性凝集（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．），「アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９９２年，２０７巻，ｐ１０９−１１３；ダス・シーアール（Ｄａｓｓ ＣＲ．）、外３名，特殊なリポソームによる抗癌治療効果の向上（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「ジャーナル オブ ファーマシー アンド ファーマコロジー（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）」，（英国），１９９７年，４９巻，ｐ９７２−９７５；コーン・ジー（Ｋｏｎｇ Ｇ）、外１名，高熱とリポソーム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ ａｎｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．），「インターナショナル ジャーナル オブ ハイパーサーミア（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ．）」，（英国），１９９９年，１５：巻，ｐ３４５−３７０参照）。これらのリポソームは、温度やｐＨに感受性を持ち、目的とする領域における、温度やｐＨ変化等の外部刺激に応じて、搬送目的物を放出することができる。しかしながら、局所的に温度やｐＨをコントロールすることは容易ではなく、利便性にも欠けるものであった。
これに対し、標的細胞への結合により、外部刺激を加えることなく、自発的に搬送目的物を放出する免疫リポソームも知られている（例えば、米国特許第４９５７７３５号参照）。該発明は、リポソーム膜が流動性を有し、リポソーム表面のリガンドが、そのリセプターと相互作用できる位置に自由度をもって移動することを利用したものである。該リポソームの主膜構成成分は、不飽和ホスファチジルエタノールアミン（９９．９５％）であるが、一般に、膜成分が不飽和ホスファチジルエタノールアミンのみでは、脂質２重膜を形成することはできない。同特許文献に記載されたリポソームは、抗体とパルミチン酸との複合体（ｐＩｇＧ）を、膜の両側（内側と外側）に加えることにより、安定な脂質２重膜を形成させたものである。該リポソームは、膜安定性を保つために、リポソーム１個に対して最低５個のｐＩｇＧが必要であり、また、９個以上のｐＩｇＧが存在するとリポソームは自己凝集する。従って、リポソーム膜上の抗体数を大きく変化させることはできず、また、搬送目的物の放出速度を自由にコントロールすることもできなかった。
【発明の開示】
本発明は、ドラッグ・デリバリー・システム、診断薬、センサー等に用いるリポソームに内包される搬送目的物を自発的に放出し、かつ、その搬送目的物の放出速度を自由にコントロールできる、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法及びそれにより内包物の放出速度が調節されたリポソームの提供を目的とする。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、リポソームの構成成分の１つとして、リガンド結合部位を有する物質を用い、該リガンド結合部位に直接又はリンカーを介して前記リガンドを結合することによりリポソームの膜表面に前記リガンドが結合されたリガンド結合リポソームと、該リガンドのレセプターとを結合させると、リポソームが破壊されて内包物が放出され、その際の放出速度が、リガンドの密度を調節することにより調節可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、リポソームの膜構成成分が、リガンド結合部位を有する物質を含み、リガンドが前記リガンド結合部位に直接又はリンカーを介して結合されることによりリポソームの膜表面に直接または前記リンカーを介して結合されており、前記リガンドと該リガンドのレセプターとの相互作用によりリポソームから前記搬送目的物が放出される、前記搬送目的物を内包するリポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法であって、該放出速度が、前記リガンドの密度を調節することにより調節される、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法によりリポソームからの搬送目的物の放出速度が調節されたリポソームを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のリポソームであって、搬送目的物として医薬を内包するリポソームを含有する医薬組成物を提供する。さらに本発明は、上記本発明のリポソームであって、搬送目的物として診断薬を内包するリポソームを含有する診断薬組成物を提供する。
本発明によれば、搬送目的物を特異的に標的組織あるいは細胞に輸送することができ、かつ、その標的組織あるいは細胞の近傍に搬送目的物を、調節された速度で放出することが可能となるため、安定性の低い薬物であっても効率よく搬送され、かつ、安全性の高いドラック・デリバリー・システムを提供できる。また、本発明によれば、リポソーム膜上のリガンドの種類やリガンドの密度を変化させることにより、搬送目的物の放出速度を外部からの刺激無しにコントロールできるので、即効性を要する薬物への利用から、徐放製剤まで、幅広く活用することができる。また、このようなリポソームをセンサーとして用いるならば、検出すべき物質の濃度に依存した搬送目的物の放出を見ることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、１５ａａペプチドの密度の逆数と、リポソームがコラーゲン上の活性化血小板と接触した場合のカルセインの放出速度との関係を示す図である。
図２は、ＲＧＤペプチドの密度の逆数と、リポソームがコラーゲン上の活性化血小板と接触した場合のカルセインの放出速度との関係を示す図である。
図３は、１５ａａペプチド又はＲＧＤペプチドの密度と、リポソームがコラーゲン上の活性化血小板と接触した場合のカルセインの放出速度との関係を示す図である。
図４は、１５ａａペプチドを結合したリポソームをコラーゲン上の活性化血小板表面と接触させた場合の、内包物であるカルセインの蛍光回復率、即ち、カルセインの放出の経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化された１５ａａペプチド数を２７０００から０まで変化させた。
図５は、１５ａａペプチド又はＲＧＤペプチドを結合したリポソームをコラーゲン上の活性化血小板表面と接触させた場合の、内包物であるカルセインの蛍光回復率、即ち、カルセインの放出の経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化させたペプチド数は２００００である。
図６は、１５ａａペプチド又はＲＧＤペプチドを結合した、脂質部分にＮ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−４−イル）ホスファチジルエタノールアミン及びＮ−（リサミン ローダミンＢスルフォニル）ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームをコラーゲン上の活性化血小板表面と接触させた場合の、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾ−４−イル）ホスファチジルエタノールアミンの蛍光回復率、即ち、ｌｉｐｉｄ−ｍｉｘｉｎｇの経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化させたペプチド数は２００００である。
図７は、ＲＧＤペプチドを結合したリポソームをＨＵＶＥＣと接触させた場合の、内包物であるカルセインの蛍光回復率、即ち、カルセインの放出の経時変化を示す図である。ここでは、リポソーム１個の表面に固定化させたＲＧＤペプチド数を１２００００から０まで変化させた。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）リポソーム膜構成成分
本発明のリポソーム膜構成成分は、少なくとも、リン脂質、ステロール類及びリガンド結合部位を有する物質を含むことが好ましいが、これらに限定されるものではなく、所望の膜特性を与えるために他の構成成分を付加的に含有しても良い。以下、各構成成分についてさらに詳細に説明する。
（１−１）リン脂質
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジン酸類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルイノシトール類、スフィンゴミエリン類、ジセチルホシフィート類、カルジオリピン類、及びリゾホスファチジルコリン類等が挙げられる。また、これらの脂質は、大豆油又は卵黄など天然の材料から抽出・精製したものでも、それらを水素添加して構成脂肪酸を飽和化したもの（水素添加リン脂質）でもよい。
リン脂質の構成脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、ヘプタデシル酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ペヘン酸、リグノセリン酸等の飽和脂肪酸、あるいは、ウンデシル酸、オレイン酸、エライジン酸、セトレイン酸、エルカ酸、ブラシジン酸、ソルビン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ステアロール酸等の不飽和脂肪酸であってもよい。この中で特に、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ステアロール酸等が好ましい。
さらに、具体的には、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、精製卵黄レシチン、水素添加精製大豆レシチン、卵黄由来ホスファチジルコリン等を挙げることができるが、特に、ジミリスチルホスファチジルコリンが好ましい。
リポソームを構成するリン脂質は、１種類でもよいし複数種類のリン脂質を組み合わせて用いることもできる。
（１−２）ステロイド
ステロイドとしては、ステロール、例えば、コレステロール類、エルゴステロール類、シトステロール類、スチグマステロール類、フコレステロール類等を挙げることができるが、特にコレステロール類が好ましい。コレステロール類としては、下記一般式［Ｉ］で表されるものを好ましい例として挙げることができる。
ただし、式中、Ｒ１は互いに独立に、アルキル、ベンジル、アルケニル、ヒドロキシ、アミノ、カルボニル、チオール又はシロキシルを示し、好ましくは、炭素数１〜２０の分岐状又は直鎖状のアルキル基若しくはアルケニル基を示す。一般式［Ｉ］で表されるコレステロール類の中でもコレステロールが最も好ましい。
（１−３）リガンド結合部位を有する物質
リガンド結合部位を有する物質としては、リガンドと結合可能な官能基である、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、水酸基等を有する物質が挙げられるが、リガンドと共有結合あるいは静電気結合を生じうるものであれば、特にこれらに限定されるものではない。
具体的には、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルチオエタノールアミン類、ホスファチジル−エチレングリコール類等が例示されるが、特に、ホスファチジルエタノールアミン類が好ましい。該ホスファチジルエタノールアミン類としては、ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−カプロイルアミン−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−ドデカニルアミン−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−マレイミドフェニルブチル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−サクシニル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−ドデカニル−ホスファチジルエタノールアミン等のように、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に、リガンドとの結合が可能な官能基を有する構造が結合したものを挙げることができる。
この中でも特に、ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンの化学構造を以下に示す。
ただし、式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に構成脂肪酸残基を示す。これを、−ＳＨ基を含有するリガンド又はリンカー（例えば、システインを含むペプチド等）と反応させると、ピリジンチオンが離脱し、リガンド又はリンカーが−Ｓ−Ｓ−結合を介して結合される。ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンは市販されているので、市販品を用いることができる。
なお、フォスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルチオエタノールアミン類、ホスファチジル−エチレングリコール類に含まれる構成脂肪酸の好ましい例としては、リン脂質の説明において上記した好ましい構成脂肪酸を挙げることができる。
（１−４）膜構成比
上記したリポソームの膜構成成分の配合比率としては、内部に水溶液を内包するリポソームが形成されるのであれば特に限定されないが、通常、リン脂質に対して、ステロール類が４０〜６０モル％、好ましくは、４５〜５５モル％、リガンド結合部位を有する物質が１２〜７５モル％、好ましくは１２〜２５モル％である。従って、好ましい態様である、リン脂質がホスファチジルコリン類、ステロール類がコレステロール類、リガンド結合部位を有する物質がホスファチジルエタノールアミン類である場合の構成比率は、通常、ホスファチジルコリン類に対して、コレステロール類が４０〜６０モル％、ホスファチジルエタノールアミン類が１２〜７５モル％であり、さらに好ましくは、ホスファチジルコリン類に対して、コレステロール類が４５〜５５モル％、ホスファチジルエタノールアミン類が１２〜２５モル％である。
リポソーム膜は、リポソームの形成を阻害しない範囲であれば、上記以外の他の成分を含んでいてもよく、例えば、トコフェロール又はその誘導体のような酸化防止剤を任意的に含んでいてもよい。このような任意成分の含有量は、リン脂質に対して、通常０〜１０モル％程度、好ましくは０〜５モル％程度である。
（２）リガンド
リガンドは、生体内に存在するレセプターと結合する性質を有するものであり、抗体、抗原、糖蛋白質、リポ蛋白質等を含む蛋白質類、ペプチド類、ハプテン、糖鎖、核酸、多糖類、脂質等が例示される。
リガンドがペプチド類である場合には、フィブリノゲンＣγ由来ドデカペプチド（配列番号１）、またはフィブリノゲンＣγ由来トリデカペプチド（配列番号２または配列番号３）、細胞接着性蛋白質に共通な最小活性単位（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含むペプチド、ウロキナーゼタイプ・プラスミノゲンアクティベータ・レセプター結合ペプチド（配列番号４または配列番号５）、インテグリン結合ペプチド、カドヘリン結合ペプチド、ＥＧＦ結合ペプチド、トロンボスポンジン由来ペプチド、ラミニン由来ペプチド、コラーゲン由来ペプチド、フィブロネクチン由来ペプチド等のアミノ酸５個〜５０個からなるペプチドを挙げることができる。より好ましいリガンドとしては、アミノ酸７個〜３０個からなるペプチドである。
その他のリガンドとしては、葉酸誘導体、トランスフェリン、シアル酸含有糖鎖（シアリルルイスＸ、シアリルルイスＡ等）、ヒアルロン酸、マンノース誘導体、グルコース誘導体、細胞特異的レクチン、ラクトシルセラミド、ステロイド誘導体、アルブミン誘導体を挙げることができる。
これらのリガンドは、内皮細胞、血管細胞、血小板膜、白血球膜、癌細胞上などに存在する、イムノグロブリン（Ｎ−ＣＡＭ，ＰＥＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２）、カドヘリン（Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン）、インテグリン、細胞外マトリックス、セレクチン（Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン）などのレセプターをターゲットとしており、これらに関わる疾患の治療・診断に用いることができる。
（３）リンカー
リンカーは、上記リガンド結合部位を有する物質のリガンド結合部位とリガンドとを連結する構造であり、単にスペーサーとして機能するだけであるから、上記リガンド結合部位を有する物質のリガンド結合部位と結合可能な官能基及び上記リガンドと結合可能な官能基を有していればその構造は何ら限定されるものではない。リンカーに用いる物質としては、官能基を有する化合物であれば、各種ペプチド（例えば、−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−）、プロピオン酸、カプリル酸、コハク酸等を挙げることができる。なお、リガンドがペプチドであり、リンカーもペプチドである場合、リガンドとリンカーとが融合した単一のペプチドが膜表面に結合されることになるが、この場合、融合ペプチド中の、レセプターと結合させたい領域がリガンドであり、リガンド結合部位を有する物質とリガンドとを結合させるために用いられる領域がリンカーである。例えば、下記実施例で用いられる１５ａａペプチド（配列番号６）は、配列番号１で示される１２アミノ酸残基から成るフィブリノゲンＣγ由来ドデカペプチドがリガンドであり、そのＣ末端に融合しているＳｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ領域がリンカーである。同様に配列番号７で示されるＲＧＤペプチドにおいても、Ｃ末端のＳｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ領域がリンカーであり、それよりも上流がリガンドである。
（４）搬送目的物
搬送目的物は、その目的に応じ、薬物学的に許容しえる薬理的活性物質、生理活性物質及び／または診断用物質を用いることができる。薬物の種類としては、
リポソームの形成を損なうものでなければ特に限定されない。
具体的には、止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、血栓溶解剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤、血管拡張剤、血小板凝集阻害剤、血管内被細胞の増殖促進または抑制剤、抗がん剤、抗生物質、酵素剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離阻害剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ阻害剤、ラジカルスカベンジャー、インスリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヒルゲン、ヒルロス、ヒルジン、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、化学療法剤、ワクチン、糖蛋白、ホルモン、細菌性トキソイド、成長ホルモン、カルシトニン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−２）、ステロイド、レチノイド、オキシトシン、バソプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板促進因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、インシュリン、カルシトニン、シクロスポリンＡ、インターロイキン等のリンホカイン、インターフェロン等のサイトカイン類、蛋白質、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子治療剤、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
また、診断のための標識物質としては、酵素（好ましい例：グルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ）、蛍光物質（好ましい例：ウンベリフェリルリン酸、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、カルセイン、アミノナフタレン３硫酸とキシレンビスピリミジンブロミドの複合体、インドシアニングリーン）、Ｘ線造影剤、放射性同位元素（好ましい例：ヨウ素化合物であるｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅ，ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）、標識核医学診断薬（好ましい例：テクネシウム、インジウム）、核磁気共鳴診断用診断薬等（好ましい例：鉄、ガドリニウム、マンガン、フッ素などを含む物質）が挙げられる。特に、近赤外蛍光物質を用いると、近赤外蛍光を用いた蛍光分子トモグラフィー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＦＭＴ）が可能になる。
（５）リポソームの調製方法（搬送目的物の内包化）
本発明のリポソームは、上記した膜構成成分及び内包する搬送目的物の水溶液を用いて、常法（例えば、野島庄七 外２名編「リポソーム」１９８８年９月１５日発行 南江堂）によって容易に得ることができる。例えば、逆相蒸留法、超音波法、界面活性剤除去法、水和法、凍結融解法、エタノール注入法、押出し法（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法）、高圧乳化法等を挙げることができるが、搬送目的物をリポソームの内水相へ内包させる方法として、特に逆相蒸留法が好ましく利用される。具体的には、上記膜構成成分の有機溶媒溶液に搬送目的物の水溶液を加えて超音波処理し、減圧下で有機溶媒を除いて得られたエマルジョンにさらに搬送目的物の水溶液を加え、減圧下で有機溶媒を完全に除去する方法をとる。この際用いられる有機溶媒の好ましい例としては、クロロホルム、エーテル及びそれらの混合溶媒を挙げることができる。下記実施例にその具体例が詳細に記載されている。なお、リポソームの粒子径は、約２５〜１０００ｎｍ、好ましくは１５０〜２５０ｎｍである。
（６）リガンドの調製方法
リガンドが、蛋白質の場合は、天然の抽出物、精製物、組換体、その他周知の方法で得られるものであればよい。ペプチド合成は、通常の液相または固相合成法を用いればよく、自動ペプチド合成装置を用いても合成してもよい。また、リガンドが、ハプテン・核酸等の場合も、天然の抽出物、精製物、合成品、その他周知の方法で得られるものであればよく、特に限定されない。
（７）リポソームとリガンドとの結合
リポソーム中のリガンドの結合部位を有する物質とリガンド（あるいはスペーサーを有するリガンド）との具体的な結合方法としては、−ＳＨ基と−ＳＨ基とをジスルフィド結合させる方法、アミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させる方法、アルデヒド基とアミノ基とをシッフベースで結合させ還元する方法等を挙げることができる。アミド結合は、公知の技術（ＤＣＣ法、アジド法、混合酸無水物法等）により行われる。また、静電相互作用でリポソームにリガンドを結合させることも可能である。これらは、常法により実施することができる。下記実施例の１つでは、リガンド結合部位を有する物質として上記ジチオピリジルプロピオニル−ホスファチジルエタノールアミンを用い、リガンド＋リンカーとして、システイン含有ペプチドを用い、両者を室温で混合するだけでリガンド＋リンカーをリポソームに結合している。
なお、リポソームとリガンドの結合は、先にリポソームを形成した後にリガンドを直接又はリンカーを介して結合してもよいし、リガンド結合部位を有する物質とリガンドを直接又はリンカーを介して結合したものを用いてリポソームを形成してもよい。また、リンカーを用いる場合には、予めリガンドとリンカーを結合したものをリガンド結合部位を有する物質と結合してもよいし、リガンド結合部位を有する物質にリンカーを結合し、その後、リンカーにリガンドを結合してもよい。
さらに、得られたリポソームは、親水性高分子の脂質誘導体で被覆してもよい。これは、リポソームのターゲッティング機能を損なうものでなければ特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、マンナン、ペクチン、カラギーナン、及びこれらの誘導体が挙げられる。中でもポリエチレングリコール及びポリエチレングリコール誘導体が望ましい。
（８）搬送目的物の放出
リポソームに内包された搬送目的物は、膜表面上のリガンドが、該リガンドに対応するレセプターと相互作用することにより、放出される。この場合、相互作用するとは、リガンドが、対応するレセプターと特異的に結合することをいい、該レセプターは、ある一定の大きさを有するマトリックス上（例えば、細胞膜、固相等）に複数存在している。
（９）搬送目的物の放出速度の調節
リポソームに内包される搬送目的物の放出速度は、リポソームに結合されたリガンドの密度に依存して変化し、所定の範囲内では、リガンドの密度が高いほど放出速度が大きくなる。なお、放出速度は、リガンドとレセプターの親和性によって異なり、親和性が大きいほど放出速度が大きくなるので、所望の放出速度を達成するリガンドの密度は、それぞれのリガンドにより異なる。各リガンドについての放出速度は、下記実施例に詳述する方法により測定することができるので、それに基づいて所望のリガンド密度を決定することができる。
リガンドの密度に依存して搬送目的物の放出速度を変化させるのに適した、該リガンドの密度の好ましい範囲は、リポソームの表面積を１．２６×１０−１３ｍ２とした場合、３．７×１０１６個／ｍ２〜２．４×１０１８個／ｍ２、さらに好ましくは、４．０×１０１６個／ｍ２〜１．６×１０１８個／ｍ２である。これは、リポソーム粒子１個当たりのリガンド数に換算すると、４．６×１０３個〜３．０×１０５個、さらに好ましくは５．０×１０３個〜２．０×１０５個であり、モル比へ換算すると０．１６モル％〜１０モル％、さらに好ましくは０．１７モル％〜６．９モル％、さらに重量比に換算すると、好ましくは０．５９ｗ／ｗ％〜３９ｗ／ｗ％、さらに好ましくは０．６４ｗ／ｗ％〜２６ｗ／ｗ％となる。
下記実施例において測定された、リガンド＋リンカーが１５ａａペプチド（配列番号６）又はＲＧＤペプチド（配列番号７）（上記の通り、各配列番号のＣ末端のＳｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓがリンカー）である場合のリガンドの密度を下記表１に示す。
ここで、搬送目的物の放出速度の測定は、一般に、カルセイン等の蛍光物質をリポソームに内包させ、放出された蛍光強度を測定する方法が用いられる。また、カルセインのように高濃度で自己消光する蛍光物質や、実験条件により放出された際に外部の物質と反応してその物性（ＵＶ／ＶＩＳや蛍光等）が変化する物質を用いて測定することも可能である。
リガンド密度の測定方法としては、リガンド特有のＵＶ／ＶＩＳ、蛍光、円偏向スペクトルの測定、ＥＬＩＳＡによるリガンド濃度の測定、リガンドと脂質の反応の際に放出される物質のスペクトルの測定等がある。
（１０）リポソーム膜におけるｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇ（膜融合または脂質移動）の測定
リポソーム膜における膜融合または脂質移動をリアルタイムで測定するには一般に、蛍光ラベルした２種類の脂質を組み込んだリポソームを用いるＦＲＥＴ（Ｆｏｒｓｔｅｒ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）法、または蛍光ラベルした１種類の脂質を組み込んだリポソームを用いるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｅｌｆ−Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ法が用いられる。例えば、Ｎ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ）とＮ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏ−４−ｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（Ｎ−ＮＢＤ−ＰＥ）を組み込んだリポソームを用いた場合、膜融合や脂質移動が起こらないときにはＮ−ＮＢＤ−ＰＥからＮ−Ｒｈ−ＰＥへの間のエネルギー移動により４６５ｎｍ励起による５３０ｎｍの蛍光は低い値に抑えられている。膜融合または脂質移動によりリポソーム内の脂質拡散が起こると、Ｎ−ＮＢＤ−ＰＥからＮ−Ｒｈ−ＰＥへのエネルギー移動の効率が著しく減少し、５３０ｎｍに於ける蛍光が増加する。Ｎ−Ｒｈ−ＰＥのみを組み込んだリポソームでは、膜融合または脂質移動が起こらないときには、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥの蛍光は自己消光により低い値を示すが、膜融合または脂質移動によりリポソーム内の脂質拡散がおこると、Ｎ−Ｒｈ−ＰＥの蛍光は増加する。本発明のリポソームでは、ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇのレベルは低かった（実施例２（３））。
（１１）リポソームが細胞内に取り込まれる、または細胞と膜融合した後のａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇによるリポソーム内のｐＨ変化測定
リポソームが細胞内に取り込まれたり膜融合すると、細胞内のｐＨは６．０付近で生理的ｐＨ７．４より低いため、リポソーム内のｐＨも変化する。このｐＨ変化をリアルタイムで追跡するには、一般にｐＨ変化に敏感な蛍光試薬が用いられる。例えば、ピラニンは、ｐＨが低いときには４０３ｎｍ付近に、ｐＨが高いときには４５０ｎｍ付近に蛍光ピークを示すので、リポソームに内包されたピラニンの４０３ｎｍと４５０ｎｍのピーク比から、リポソーム内のｐＨ変化を測定することができる。本発明のリポソームでは、ａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇによるリポソーム内のｐＨ変化はほとんど起きなかった（実施例２（４））。以上より、本発明のリポソームからの搬送目的物の放出は、細胞によるリポソームの貪食や膜融合ではなく、細胞表面でリポソーム膜が崩壊して、内包物の放出が起きていることを示している。
（１２）医薬品組成物／診断薬／センサー
本発明のリポソームを含む医薬組成物としては、血小板代替物、血管障害、血管損傷、血栓形成部位の検査、及び血栓症等の予防・治療・診断等の医薬品、あるいは癌等に対する診断・治療用試薬等がある。また、診断薬として用いる場合には、診断対象物に対するリガンドをリポソーム膜上に結合させ、該リポソームに、酵素、蛍光物質、Ｘ線造影剤等を内包させることにより、診断対象物の測定診断試薬として用いることができる。さらに、該リポソームが速放性を有する場合には、センサーとしての利用も可能である。
本発明のリポソームを医薬組成物として利用するにあたっては、各種疾患に対応して、血管内投与法、腹腔内投与法、局所投与法などにより投与することができる。また、その投与量は、目的とする薬理作用、薬剤の種類等により、適宜調節することができる。
以下、本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を含むペプチドを表面に固定化し、カルセインを内包したリポソーム（以下、１５ａａ−Ｃ−リポソームという）の、脂質部分にローダミンとＮＢＤを含むリポソーム（以下、１５ａａ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームという）、ピラニンを内包したリポソーム（以下、１５ａａ−Ｐｙ−リポソームという）、及びＲＧＤを含むペプチドを表面に固定化し、カルセインを内包したリポソーム（以下、ＲＧＤ−Ｃ−リポソームという）、脂質部分にローダミンとＮＢＤを含むリポソーム（以下、ＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームという）、及びピラニンを内包したリポソーム（以下、ＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームという）の作製
（１）カルセインを内包したリポソームの作製
ジミリストイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）７ｍｇ、コレステロール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）２ｍｇ、Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニルホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ）１．３ｍｇをクロロホルム１ｍｌとエーテル２ｍｌに溶解させ、ついで１００ｍＭカルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）溶液１ｍｌを加え、Ｎ２下、浴槽型ソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて２０℃，５分間超音波処理した。生成するエマルジョンを減圧下（３５０−４００ｍｍＨｇ）でロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を除去すると試料はゲル状になり、ここに、さらに１ｍｌの１００ｍＭカルセインを加え、再び６８０−７００ｍｍＨｇの減圧下で残っている有機溶媒を除去した。得られたリポソームはポアサイズ２００ｎｍのミリポアフィルター（Ｗａｔｍａｎ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）を用いてサイズを一定（直径約２００ｎｍ）にし、封入されなかったカルセインをセファデックスＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で除いた。
（２）脂質部分にローダミンとＮＢＤを含むリポソームの作成
ジミリストイルホスファチジルコリン７ｍｇ，コレステロール２ｍｇ，Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニルホスファチジルエタノールアミン１．３ｍｇ，Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ１，３−ジアゾ−４−イル）ホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）０．１３ｍｇ，Ｎ−（リサミン ローダミンＢスルフォニル）ホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）０．１９ｍｇをクロロホルム１ｍｌとエーテル２ｍｌに溶解させ、ついで５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／アセテートバッファー（ｐＨ７．４）１ｍｌを加え、Ｎ２下、浴槽型ソニケータを用いて２０℃，５分間超音波処理した。生成するエマルジョンを減圧下（３５０−４００ｍｍＨｇ）でロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を除去すると資料はゲル状になり、ここに、さらに１ｍｌのＨＥＰＥＳ／アセテートバッファーを加え、再び６８０−７００ｍｍＨｇの減圧下で残っている有機溶媒を除去した。得られたリポソームはポアサイズ２００ｎｍのミリポアフィルターを用いてサイズを一定（直径２００ｎｍ）にした。
（３）ピラニンを内包したリポソームの作成
ジミリストイルホスファチジルコリン７ｍｇ，コレステロール２ｍｇ，Ｎ−３−（２−ジチオピリジル）プロピオニルホスファチジルエタノールアミン１．３ｍｇをクロロホルム１ｍｌとエーテル２ｍｌに溶解させ、ついで２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／７５ｍＭ ＮａＣｌバッファーｐＨ７．４に溶解させた３５ｍＭピラニン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）溶液１ｍｌを加え、Ｎ２下、浴槽型ソニケータを用いて２０℃，５分間超音波処理した。生成するエマルジョンを減圧下（３５０〜４００ｍｍＨｇ）でロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を除去すると試料はゲル状になり、ここに、さらに１ｍｌの３５ｍＭピラニンを加え、再び６８０−７００ｍｍＨｇの減圧下で残っている有機溶媒を除去した。得られたリポソームはポアサイズ２００ｎｍのミリポアフィルターを用いてサイズを一定（直径２００ｎｍ）にし、封入されなかったピラニンをセファデックスＧ−２５カラムで除いた。
（４）フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を含むペプチド、及びＲＧＤを含むペプチドの固定化
得られたリポソームに必要量の１５ａａペプチド（配列番号６）又はＲＧＤペプチド（配列番号７）を加え、室温でインキベートした後、反応しなかったペプチドをセファデックスＧ−２５カラムで除いた。リポソームに結合したペプチドの数は、反応の際に出てくるピリジン−２−チオン（３４３ｎｍにおいてｅ＝８．０８×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）の定量、リポソームの濃度は、リポソームサイズ及びリピド濃度から求めた。
【実施例２】
血小板との相互作用における、リガンドの表面密度に依存した１５ａａ−Ｃ−リポソームからのカルセイン放出速度
９６穴のマイクロプレートを３０μｇ／ｍｌタイプＩコラーゲン（新田ゼラチン、大阪、日本）でコーティングし、この上にＰｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ（以下、ＰＲＰという）２００μＬを加え室温で１時間放置した。コラーゲンに粘着しなかった血小板を除き、ここへ実施例１で作製した１５ａａ−Ｃ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で入れ、リポソームから放出されるカルセインの量を蛍光で測定した。測定はＳａｆｉｒｅ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、Ｅｘｃ／Ｅｍｉ：４９０ｎｍ／５２０ｎｍで行った。放出されるカルセインの量は、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）によって放出したカルセインの蛍光強度に対する割合として示した。ペプチドが表面に固定化されていないコントロールリポソームではカルセインの放出は起こらなかった（図４）。同様の実験を抗１５ａａペプチド抗体、フリーの１５ａａペプチド、又は、抗インテグリンα１１ｂβ３抗体存在下でおこなうと、１５ａａ−Ｃ−リポソームからのカルセインの放出は著しく減少した。コラーゲン表面と１５ａａ−Ｃ−リポソームとの相互作用では、カルセインの放出は見られなかった。カルセイン放出の半減期は、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（２７０００；リポソーム１個の表面に固定化されたペプチド数）では約３．５分，１５ａａ−Ｃ−リポソーム（１９０００）では約１時間、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（７５００）では約５時間、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（５９００）では約１８時間、１５ａａ−Ｃ−リポソーム（４６００）では約２０時間であった（図１及び図３）。
（２）血小板との相互作用における、リガンドの種類に依存したリポソームからのカルセイン放出速度
リポソーム１個の表面に固定化するペプチドの数を２００００とし、血小板表面との相互作用における１５ａａ−Ｃ−リポソーム及びＲＧＤ−Ｃ−リポソームからのカルセイン放出速度を測定した。（１）と同様の方法でコラーゲン上に活性化血小板表面を作製し、ここへ実施例１で作製した１５ａａ−Ｃ−リポソーム、またはＲＧＤ−Ｃ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で加え、（１）と同様の方法でリポソームから放出されるカルセインの量を測定した。血小板表面に存在するインテグリンα１１ｂβ３に対して高い親和性を持つ１５ａａペプチドを固定化した１５ａａ−Ｃ−リポソームでは、速やかなカルセインの放出が起こるが、インテグリンα１１ｂβ３に対する親和性が低いＲＧＤを含むペプチドを固定化したＲＧＤ−Ｃ−リポソームでは、カルセイン放出のレベルは低かった（図５）。
（３）リガンドの種類に依存したリポソームと血小板とのｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇ（脂質交換または脂質移動）
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を２００００とし、リポソームと血小板との間のｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇを測定した。（１）と同様の方法で作製した活性化血小板表面上に、実施例１で作製した１５ａａ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソーム、またはＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で加え、ＮＢＤの蛍光強度変化測定をＳａｆｉｒｅを用いてＥｘｃ／Ｅｍｉ：４６５ｎｍ／５３０ｎｍで行った。Ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇのレベルは、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００によるＮＢＤの蛍光強度の増加に対する割合として示した。１５ａａ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームとＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームに対するｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇのレベルは低く、一時間のインキュベーション後、夫々１８％と１０％であった（図６）。
（４）リガンドの種類に依存したリポソームと血小板とのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇ
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を２００００とし、リポソームと血小板との間のａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇを測定した。（１）と同様の方法で作製した活性化血小板表面上に実施例１で作製した１５ａａ−Ｐｙ−リポソーム、またはＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で加え、４５１ｎｍと４０３ｎｍに於けるピラニンの蛍光強度比の変化に基づき、以下の式からａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇの割合を求めた。
１５ａａ−Ｐｙ−リポソームにおいてもＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームにおいても４５分間のインキュベーションによる４５１ｎｍ／４０３ｎｍの蛍光強度比の変化は１％以下で、リポソームと血小板とのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇはほとんど起こらなかった。
【実施例３】
フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を含むペプチドを表面に固定化し、ローダミンで蛍光ラベルしたリポソーム（１５ａａ−Ｒ−リポソーム）の作製
実施例１と同様のリポソームの脂質構成成分にＮ−（リサミン−ローダミンＢスルホニル）ホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ）０．１６ｍｇを加え、カルセインを含まない溶液を用いて実施例１と同様の方法でリポソームを作製した。
【実施例４】
流動状態下における活性化血小板へのリポソームの粘着
直径２．５ｃｍ、厚さ０．５ｍｍのガラス板を３０μｇ／ｍｌのタイプＩコラーゲン（新田ゼラチン）でコーティングし、この上に全血を３分間、ずり速度１１００ｓ−１で還流し、コラーゲンに粘着しなかった血液成分を除去した。コラーゲン表面で活性化し粘着した血小板上に、１５ａａ−Ｒ−リポソーム（４６００及び４２０００）を３．８×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度、ずり速度１１００ｓ−１（最小動脈における平均ずり速度）で３分間還流すると、コラーゲン表面にリポソームの粘着によるローダミンの強い蛍光が観察された。蛍光の観察はＥＧ−Ｌａｂｏ（ニコン，東京，日本）を用い、Ｅｘｃ／Ｅｍｉ：５５０／５９０ｎｍで行った。表面にペプチドを固定化していないコントロールリポソームを用いて同様の実験を行なった場合、コントロールリポソームはコラーゲン表面には粘着せず、コラーゲン表面でのローダミンの蛍光はほとんど見られなかった。
【実施例５】
（１）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との相互作用における、リガンドの表面密度に依存したＲＧＤ−リポソームからのカルセイン放出速度
９６穴のマイクロプレートを１０μｇ／ｍｌビトロネクチン（旭テクノグラス、東京）でコーティングし、この上にＨＵＶＥＣ（１×１０５／ｗｅｌｌ）を粘着させ、ここへ実施例１で作製したＲＧＤ−Ｃ−リポソームを４．５×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌの濃度で入れ、リポソームから放出されるカルセインの量を、実施例２と同様の方法で測定した。コントロールリポソームを用いて同様の実験を行った場合、コントロールリポソームからのカルセインの放出はほとんど見られなかった（図７）。抗αｖβ３抗体存在下で同様の実験を行うと、ＲＧＤ−Ｃ−リポソームからのカルセインの放出は著しく減少した。カルセイン放出の半減期は、ＲＧＤ−Ｃ−（１６００００）では２５分、ＲＧＤ−Ｃ−リポソーム（１２００００）では３５分、ＲＧＤ−Ｃ−リポソーム（９３０００）では約８時間、ＲＧＤ−Ｃ−リポソーム（７００００）では約８．５時間であった（図２及び図３）。
（２）ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−リポソームとのｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇ
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を１２００００とし、ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームとのｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇを測定した。実施例５（１）と同様の方法でＨＵＶＥＣを粘着させ、ここへ実施例１で作製したＲＧＤ−Ｒ−ＮＢＤ−リポソームを加え、実施例２（３）と同様の方法でｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇを測定したが、ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｉｎｇの割合は、１％以下であった。
（３）ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−リポソームとのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇ
リポソーム１個の表面に固定化するリガンドの数を１２００００とし、ＨＵＶＥＣとＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームとのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇを測定した。実施例５（１）と同様の方法でＨＵＶＥＣを粘着させ、ここへ実施例１で作製したＲＧＤ−Ｐｙ−リポソームを加え、実施例２（４）と同様の方法でａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇを測定したが、４５１ｎｍ／４０３ｎｍの蛍光強度比は変化せず、リポソームとＨＵＶＥＣとのａｑｕｅｏｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｉｘｉｎｇはほとんど起こらなかった。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、搬送目的物を特異的に標的組織あるいは細胞に輸送することができ、かつ、その標的組織あるいは細胞の近傍に搬送目的物を放出することが可能となるため、安定性の低い薬物であっても効率よく搬送され、かつ、安全性の高いドラック・デリバリー・システムを提供できる。また、本発明によれば、リポソーム膜上のリガンドの種類やリガンドの密度を変化させることにより、搬送目的物の放出速度を外部からの刺激無しにコントロールできるので、即効性を要する薬物への利用から、徐放製剤まで、幅広く活用することができる。また、このようなリポソームをセンサーとして用いるならば、検出すべき物質の濃度に依存した搬送目的物の放出を見ることができる。さらに、最も新しいイメージング技術であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＦＭＴ）においてもリガンド固定化リポソームの応用が可能である。例えば、近赤外蛍光を用いたＦＭＴにより体表面から７−１４ｃｍまでの可視化が理論的には可能であることから、近赤外蛍光を内包したリガンド固定化リポソームを用いることにより、深部静脈中の血小板血栓をＦＭＴにより発見することが可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームの膜構成成分が、リガンド結合部位を有する物質を含み、リガンドが前記リガンド結合部位に直接又はリンカーを介して結合されることによりリポソームの膜表面に直接または前記リンカーを介して結合されており、前記リガンドと該リガンドのレセプターとの相互作用によりリポソームから前記搬送目的物が放出される、前記搬送目的物を内包するリポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法であって、該放出速度が、前記リガンドの密度を調節することにより調節される、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法。
【請求項２】
前記リポソームの膜構成成分が、少なくとも、リン脂質、ステロイド、及びリガンド結合部位を有する物質を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドは、前記膜表面に共有結合により結合される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記リガンド結合部位を有する物質がホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルチオエタノールアミン類及びホスファチジル−エチレングリコール類から選ばれる少なくとも１種である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンド結合部位を有する物質がホスファチジルエタノールアミン類である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、抗体、抗原、糖蛋白質、若しくはリポ蛋白質を含む蛋白質類、ペプチド類、ハプテン、糖鎖、核酸、多糖類、または、脂質である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、５個〜５０個のアミノ酸からなるペプチドである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を有するペプチドである請求項８記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むペプチドである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法によりリポソームからの搬送目的物の放出速度が調節されたリポソーム。
【請求項１１】
請求項１０記載のリポソームであって、搬送目的物として医薬を内包するリポソームを含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載のリポソームであって、搬送目的物として診断のための標識物質を内包するリポソームを含有する診断薬。
【請求項１】
リポソームの膜構成成分が、リガンド結合部位を有する物質を含み、リガンドが前記リガンド結合部位に直接又はリンカーを介して結合されることによりリポソームの膜表面に直接または前記リンカーを介して結合されており、前記リガンドと該リガンドのレセプターとの相互作用によりリポソームから前記搬送目的物が放出される、前記搬送目的物を内包するリポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法であって、該放出速度が、前記リガンドの密度を調節することにより調節される、リポソームからの搬送目的物の放出速度調節方法。
【請求項２】
前記リポソームの膜構成成分が、少なくとも、リン脂質、ステロイド、及びリガンド結合部位を有する物質を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドは、前記膜表面に共有結合により結合される請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記リガンド結合部位を有する物質がホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルチオエタノールアミン類及びホスファチジル−エチレングリコール類から選ばれる少なくとも１種である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンド結合部位を有する物質がホスファチジルエタノールアミン類である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、抗体、抗原、糖蛋白質、若しくはリポ蛋白質を含む蛋白質類、ペプチド類、ハプテン、糖鎖、核酸、多糖類、または、脂質である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、５個〜５０個のアミノ酸からなるペプチドである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、フィブリノゲンＣγ由来のアミノ酸配列を有するペプチドである請求項８記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含むペプチドである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法によりリポソームからの搬送目的物の放出速度が調節されたリポソーム。
【請求項１１】
請求項１０記載のリポソームであって、搬送目的物として医薬を内包するリポソームを含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載のリポソームであって、搬送目的物として診断のための標識物質を内包するリポソームを含有する診断薬。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７１０６
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４１６５（Ｐ２００５−５０４１６５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３７６５
【国際出願日】平成１６年３月１９日（２００４．３．１９）
【出願人】（０００２３７２０４）みらかホールディングス株式会社 (11)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３７６５
【国際出願日】平成１６年３月１９日（２００４．３．１９）
【出願人】（０００２３７２０４）みらかホールディングス株式会社 (11)
【Ｆターム（参考）】
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