リン酸カルシウムナノ粒子のコア、生体分子および胆汁酸を含む粒子、ならびにそれらの製造方法および治療用途
本発明は、生物学的に活性なマクロ分子と共にカプセル化されたリン酸カルシウムナノ粒子を提供する。該粒子は、マクロ分子の送達用の生物学的に活性なマクロ分子の担体として用いることができる。また、本発明は該粒子を製造し、および用いる方法も提供する。本発明は、ａ）リン酸カルシウムナノ粒子のコア；ｂ）コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子；およびｃ）コア粒子にカプセル化された胆汁酸を含む表面修飾剤を含む粒子を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参考としてその全体を援用される、２００４年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５４４，６９３号に関する。
【０００２】
（連邦政府により補助された研究または開発に関する陳述）
適用無し
発明の分野
本発明は、新規なリン酸カルシウム粒子、その製法、および生物学的に活性なマクロ分子の送達用の担体としてのそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
蛋白質、ペプチド、多糖、核酸、脂質またはその組合せを含めたマクロ分子医薬は、種々の医学的疾患を治療するための益々重要性が増大するクラスの薬物である。マクロ分子医薬を投与するための主な経路は注射であり、これは不快であり、高価であり、しばしば、貧弱な患者コンプライアンスをもたらす。経口送達は医薬を投与するための好ましい経路である。しかしながら、マクロ分子薬物は腸を通じて吸収されにくく、胃酸および胃腸酵素によって容易に破壊され得る。経口マクロ分子送達のためのバリアーを克服するための有望なアプローチは、ナノ粒子を用いることであり、これは、分解からの保護を供することができ、マクロ分子薬物の吸収を可能とする。
【０００４】
インスリンが負荷されたナノ粒子を用いて、生物活性インスリンを動物に送達することができると報告されている。例えば、無水フマル酸はおよび鉄酸化物添加剤を含むポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ナノ粒子に負荷されたインスリンによる血漿グルコース上昇の阻害は示されている（非特許文献１）。キトサンナノ粒子へのインスリンの経口送達のもう１つの例は、非特許文献２によって供される。加えて、ポリアルキルシアノアクリレートナノカプセルもまた、糖尿病動物におけるインスリンの経口送達用の効果的な担体であると報告されている（非特許文献３）。胃腸経路による特定の物質の摂取は記載されており、リンパのペイヤーパッチが関連する（非特許文献４）。
【０００５】
粒子の吸収に影響する要因の中での、粒子のサイズは主な要因のように見える。例えば、非特許文献５は、ラットにおいて種々のサイズのポリスチレン粒子の腸吸収を研究した。ポリスチレン粒子の吸収効率は明らかにサイズに依存している。１００ｎｍ未満の粒子は有意な吸収を示し、他方、大きな粒子（５００ｎｍ以上）は中程度ないし低い吸収を示したにすぎなかった。
【０００６】
粒子の腸吸収に対するサイズ依存性もまた、非特許文献６によってポリ（ラクチド−コ−グリコリド）またはＰＬＧＡ粒子によって観察されている。この研究においては、５００ｎｍよりも大きなＰＬＧＡ粒子は腸管を介する実質的な摂取を示しておらず、１００ｎｍのＰＬＧＡ粒子の３６％が吸収された。
【０００７】
ナノメータースケールの粒子が、蛋白質および核酸のような生物学的マクロ分子のための担体粒子として用いるために提案されている（特許文献１〜９を参照）。
【０００８】
リン酸カルシウム粒子は生体−接着性／生体適合性であって、イン・ビトロにて核酸を細胞内区画に送達するのに日常的に担体として用いられてきた（非特許文献７〜１０）。加えて、リン酸カルシウムは、イン・ビボにて大きな核酸を送達するための遺伝子治療用の担体として試験もされてきた（非特許文献１１）。
【０００９】
治療用リン酸カルシウム粒子は記載されている。（特許文献１０〜２０、非特許文献１２）。インスリン負荷リン酸カルシウム粒子の経口処方の効果は糖尿病マウスで試験され、血中グルコースの制御が示されている（非特許文献１３）。開示されたリン酸カルシウム粒子は３００ｎｍないし１０ｕｍの間の粒子サイズを有する。動物実験は平均して２ないし４ｕｍの範囲の粒子サイズを用いた。これらの粒子サイズは明らかに最適ではない。
【００１０】
所望のサイズを持つリン酸カルシウム粒子を作成するためには、広範な音波処理が必要であり（非特許文献１４および１５））、これはカプセル化されたマクロ分子薬物を損傷しかねず、共沈殿手法に適合しない。
【００１１】
さらに、マクロ粒子のリン酸カルシウムの粒子へのカプセル化効率はしばしば低い。例えば、特許文献２１は、もしインスリンを予め形成されたリン酸カルシウム粒子に加えたならば約４０％；もしインスリンを粒子形成の間に混合したならば、約８９％の吸収効率を開示する。
【特許文献１】米国特許第５，１７８，８８２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２１９，５７７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３０６，５０８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，３３４，３９４号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４６０，８３０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４６０，８３１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４６２，７５０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４６４，６３４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，３５５，２７１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，３５５，２７１号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，１８３，８０３号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００４／０２５８７６３号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００２／００５４９１４号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２０００／００６８０９０号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００３／０１８５８９２号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００１／００４８９２５号明細書
【特許文献１７】国際公開第０２／０６４１１２号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第０３／０５１３９４号パンフレット
【特許文献１９】国際公開第００／４６１４７号パンフレット
【特許文献２０】国際公開第２００４／０５００６５号パンフレット
【特許文献２１】米国特許第６，３５５，２７１号明細書
【非特許文献１】Ｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５：２６１、（２０００）
【非特許文献２】Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２４９：１３９（２００２）
【非特許文献３】Ｄａｍｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７：２４６（１９８８）
【非特許文献４】Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５０：１０７，（２００１）
【非特許文献５】Ｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：８２１，１９９０）
【非特許文献６】Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：１８３８，１９９６）
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２，（１９８７）
【非特許文献８】Ｗｅｌｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．１４：２２１３−２２１７（２００４）
【非特許文献９】Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：５９６−６０１（１９９６）
【非特許文献１０】Ｌｏｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１３９：２２３−２３４（１９８２）
【非特許文献１１】Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２５０：２５、（２００３）
【非特許文献１２】Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｉｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２６：４５９−４６３（２０００）
【非特許文献１３】Ｍｏｒｃｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２７７；９１，（２００４）
【非特許文献１４】Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍａｃｙ，２６：４５９，２０００
【非特許文献１５】Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２５０：２５，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これらの報告された方法は最適でないサイズを持つ粒子をもたらすが、あるいはマクロ粒子処方に適合しない拡大された音波処理のような厳しい条件を必要とする。従って、高度に効果的であって、低コストで容易に作成される経口マクロ分子送達系に対する要望が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の簡単な要旨
本発明は、ａ）リン酸カルシウムナノ粒子のコア；ｂ）コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子；およびｃ）コア粒子にカプセル化された胆汁酸を含む表面修飾剤を含む粒子を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、コア粒子の直径は約１０００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、または約２００ｎｍ未満である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、胆汁酸は、コレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソロデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、およびケノデオキシコレートよりなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、粒子は、さらに、腸溶コーティングを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子は蛋白質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、脂質、および炭水化物よりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、蛋白質またはポリペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、および顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）よりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子は家塵ダニ、動物フケ、黴、花粉、ブタクサ、ラテックス、スズメバチ毒および昆虫−由来アレルゲン、およびそのいずれかの組合せよりなる群から選択されるアレルゲンである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、該粒子はエアロゾルの形態で適合される。いくつかの実施形態において、該粒子は生物学的に活性なマクロ分子を粘膜表面に送達するように適合される。いくつかの実施形態において、該粒子は、生物学的に活性なマクロ分子を、目の障害の治療のためにそれを必要とする対象の目表面に送達するように適合される。
【００１９】
また、本発明は、本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００２０】
本発明は、リン酸カルシウムの１以上の粒子を作成する方法を提供し、該方法はａ）胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下でカルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させ；ｂ）所望のサイズのリン酸カルシウム粒子が得られるまで溶液を混合し；次いで、ｃ）粒子を回収することを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、カルシウム塩の濃度は約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である。いくつかの実施形態において、リン酸塩の濃度は約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で、カルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させる前に、生物学的に活性なマクロ分子をリン酸塩の水溶液またはカルシウム塩の水溶液に加えることを含み、それにより、リン酸カルシウム粒子はマクロ粒子と共結晶化される。
【００２３】
また、本発明は、生物学的に活性なマクロ分子を必要とする対象を治療する方法を提供し、該方法は本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は経口経路によって投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は粘膜表面に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は目表面に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、生物学的に活性なマクロ分子でカプセル化された新規なリン酸カルシウムナノ粒子、該ナノ粒子の製法、および生物学的に活性なマクロ分子の投与を必要とする医学的疾患を治療するためのナノ粒子を用いる方法を提供する。本明細書中で用いるように、「カプセル化された」、「包埋された」または「配合された」は、物質によって複合体化された、入れられた、結合された、関連する、被覆された、層状化された、または包まれた、を意味する。かくして、粒子中にカプセル化された物質は、該物質が粒子構造に一体化され、または粒子の表面に被覆または付着されまたはその双方である。
【００２５】
他の定義がない限り、本明細書中で用いた全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で言及された全ての特許、出願、公開された出願および他の刊行物はここに引用してその全体を援用する。本セクションに記載された定義がもしここに引用して援用する特許、出願、公開された出願および他の刊行物に記載された定義に反し、またはそうでなければ合致しないならば、本セクションに記載された定義がここに引用して援用する定義よりも優先する。
【００２６】
本明細書中で用いるように、「ある（「ａ」または「ａｎ」）」は「少なくとも１つ」または「１以上」を意味する。
【００２７】
（Ａ．カプセル化された生物学的活性マクロ分子を持つリン酸カルシウムナノ粒子）
本発明は、ａ）リン酸カルシウムナノ粒子のコア；ｂ）該コア粒子中にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子；およびｃ）該コア粒子中にカプセル化された胆汁酸を含む表面修飾剤を含むリン酸カルシウムナノ粒子を提供する。
【００２８】
本発明のリン酸カルシウムコア粒子は約８０００ｎｍ未満、約１０００ｎｍ未満、より好ましくは、約３００ｎｍ未満の平均粒子サイズ（直径）を有する。該粒子は約５０ｎｍおよび約８０００ｎｍの間、約１００ｎｍおよび約３０００ｎｍの間、または約１００ｎｍおよび約１０００ｎｍの間の直径を有することができる。いくつかの実施形態において、平均粒子サイズは２００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態において、該平均粒子サイズは１００ｎｍ未満である。
【００２９】
本発明のコア粒子は、一般的にかつ実質的に形状が球形である形態を一般的に有し、ナノ粒子のサイズが実質的に単分散である。単分散とは、例えば、サイズが約２０％、約３０％、約４０％または約５０％の差の範囲内の、これらのナノ粒子で観察される狭いサイズ分布をいう。粒子の表面は実質的に平滑とすることができる。
【００３０】
用語「実質的に球形」とは、本明細書中においては、形状が実質的に丸いまたは卵型である粒子をいうように用いられ、面がなく平滑である、または非常に少数の面を有する粒子、ならびにいくつかまたは多数の面を有する多面体である粒子を含む。用語「実質的に平滑」は、本明細書中においては、実質的に表面特徴がない、または１００ｎｍ以上のサイズを有する凹凸を意味する。コア粒子は面があっても、または角張っていてもよく、面が前記したタイプの多くの表面凹凸を含有しない限り、依然として本定義内に入る。
【００３１】
図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中に記載された方法に従って調製されたナノ粒子の例の走査型電子顕微鏡イメージを示す。図３Ａは、約２００ｎｍの平均直径で被覆または分散されたマクロ分子無しのブランクナノ粒子を示す。図３Ｂは、約７０ｎｍの平均直径を持つナノ粒子内に分散されたマクロ分子インスリンを持つナノ粒子を示す。これらのナノ粒子は球形および狭いサイズ分布を示す。
【００３２】
本発明におけるリン酸カルシウムナノ粒子は、デュアル機能を有する胆汁酸を含む表面修飾剤を含有する。実施例１に示されるように、リン酸カルシウムナノ粒子への生物学的に活性なマクロ分子のカプセル化は、粒子が胆汁酸の存在下で形成される場合に増強される。胆汁酸はナノ粒子の生物−接着性を増強させ、ナノ粒子のサイズに影響することもできる。いずれの胆汁酸を用いてもよい。胆汁酸の例としては、限定されるものではないが、コレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、およびケノデオキシコレートが挙げられる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明のリン酸カルシウムナノ粒子は、さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。該ＰＥＧは約５００ダルトンないし約２０，０００ダルトン、例えば、約５００、約１０００、約５０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００ダルトンの分子量を有することができる。
【００３４】
いずれの生物学的に活性なマクロ分子もコアリン酸カルシウムナノ粒子にカプセル化することができる。そのような生物学的に活性なマクロ分子としては、限定されるものではないが、蛋白質、ポリペプチド、多糖、核酸、脂質、炭水化物、およびその組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子はインスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、または顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子は、アレルゲンまたは抗原性物質である。アレルゲンの例は、家塵ダニ、動物フケ、黴、花粉、ブタクサ、ラテックス、スズメバチ毒および昆虫−由来アレルゲン、およびそのいずれかの組合せである。
【００３５】
生物学的に活性なマクロ分子には、アルファ−１−抗トリプシン、ステロイド、骨粗鬆症を治療するための薬物、血液凝固因子、抗癌薬物、抗生物質、治療抗体、リパーゼ、ベータ−ブロッカー、抗−喘息、アンチセンスオリゴヌクレオチド、呼吸器系および他の障害のためのＤＮａｓｅ酵素、抗炎症薬剤、抗−ウイルス、抗−高血圧、抗−不整脈薬剤のような心臓治療剤、および遺伝子治療、利尿剤、ヘパリンのような抗−凝固化学物質、ならびにその組合せのようないずれの治療剤が挙げられる。該剤は天然単離体、または合成、化学または生物剤であり得る。
【００３６】
リン酸カルシウムナノ粒子は、さらに、コーティングを含むことができる。例えば、生物学的に活性なマクロ分子で被覆されたおよび／または含浸されたナノ粒子は、さらに、セルロースアセテートフタレート、オイドラギット、およびアクアテリックのような腸溶ポリマーで被覆される。腸溶コーティングのプロセスは先行技術によく記載されており、文献はここに引用して援用される。Ｂｅｙｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７５：５７３−５７８（１９８６）；Ｍａｈａｒａｊ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７３：３９−４２（１９８４）。
【００３７】
また、本発明は、リン酸カルシウムナノ粒子のコア、および該コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子を含むリン酸カルシウムナノ粒子を提供し、ここに、コア粒子の平均粒子サイズ（直径）は約３００ｎｍ未満であり、但し、生物学的に活性なマクロ分子は核酸、ポリヌクレオチド、蛋白質またはポリペプチドではないものとする。また、本発明は、リン酸カルシウムナノ粒子のコア、および該コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子を含むリン酸カルシウム−ナノ粒子を提供し、ここに、コア粒子の平均粒子サイズ（直径）は約３００ｎｍ未満であり、ここに、生物学的に活性なマクロ分子は抗体である。
【００３８】
また、本発明は、本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。適当な担体およびそれらの処方は当該分野で知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０００に記載されている。医薬組成物は、溶液、カプセル、錠剤、粉末およびエアロゾルの形態に処方することができ；経口送達、粘膜送達、または目表面への送達に適した形態に処方することができる。該組成物は、緩衝剤、保存剤、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、エモリエント、滑沢剤、および等張剤のような他の成分を含むことができる。該組成物は、マクロ分子につき制御された放出を達成するように処方することができる。
【００３９】
（Ｂ．リン酸カルシウムナノ粒子の方法）
また、本発明はリン酸カルシウムの１以上の粒子の製法を提供し、該方法は、ａ）胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で、カルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させ；ｂ）所望のサイズのリン酸カルシウム粒子が得られるまで溶液を混合し；次いで、ｃ）粒子を回収することを含む。
【００４０】
本発明のリン酸カルシウムナノ粒子は、典型的には、可溶性カルシウム塩を可溶性リン酸塩と、好ましくは、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で接触させることによって水性媒体中の懸濁液として調製される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、約１ｍＭおよび約１００ｍＭの間の濃度を有する二塩基性リン酸ナトリウムの蒸留水溶液、および０．０１ないし１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するデオキシコレートのような表面修飾剤を調製し、溶液中で混合する。いくつかの実施形態において、１ないし３０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するポリエチレングリコールのような他の賦形剤も含まれる。
【００４２】
溶液のｐＨはリン酸緩衝液系によって制御される。ｐＨ値はナノ粒子のサイズに影響し、カプセル化すべきマクロ分子の安定性要件に適合すべきである。ｐＨ値は約４．０ないし約９．０の間、またはより好ましくは約５．０ないし約８．０の間とすることができる。
【００４３】
粒子サイズは、カルシウム、ホスフェート、およびマクロ分子を含めた種々の成分の濃度によって影響される。一般に、カルシウムまたはホスフェートの濃度が高くなれば、ナノ粒子はより大きくなる。
【００４４】
ナノ粒子を生じさせるためには、１ｍＭおよび約１００ｍＭの間の濃度を有する塩化カルシウムのようなカルシウム塩の水溶液を、前記したホスフェートの水溶液と混合する。濁りが直ちに形成され、これは、リン酸カルシウムナノ粒子の形成を示す。混合は、一般には、１分ないし１時間、またはそれよりも長く（例えば、２ないし４８時間）さえ継続する。粒子のサイズは、混合スピードを上昇させることによって、または音波処理によって低下させることができる。
【００４５】
生じたリン酸カルシウムナノ粒子は、さらに、回収されおよび／または精製される。いくつかの実施形態において、カプセル化されたマクロ分子を有する形成されたリン酸カルシウムナノ粒子は遠心によって回収される。溶液は３０００ないし１０００ｘｇにおいて５ないし１５分間遠心され、収集されたナノ粒子は真空下で乾燥される。いくつかの実施形態において、カプセル化されたマクロ分子を有する形成されたリン酸カルシウムナノ粒子は濾過によって回収される。溶液を真空でのブッフェル漏斗のような濾過デバイスに加えられる。２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）のような濾過膜を用いて、ナノ粒子を回収することができ、これはさらに真空下で乾燥される。
【００４６】
本発明の粒子は、生物学的に活性な物質の捕獲の効率を増大させるために、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で形成される。本発明で用いることができる胆汁酸の例はコレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、またはケノデオキシコレートである。胆汁酸の濃度は一般には０．０１％ないし５％である。一般に、この手法の結果、粒子の被覆または含浸の実質的により高い効果がもたらされる。例えば、表面修飾剤の存在下におけるインスリン負荷効率は１００％に近づくことができ、他方、同一条件下で表面修飾剤の存在下において５０ないし６０％に過ぎない。
【００４７】
生物学的に活性なマクロ分子のナノ粒子への負荷は、好ましくは、胆汁酸および賦形剤の存在下でリン酸溶液と組み合わせ、それと混合するに先立って、カルシウム塩水溶液を一体化させるべき生物学的に活性なマクロ分子と混合し、あるいは胆汁酸および賦形剤の存在下でカルシウム塩溶液と組み合わせ、それと混合するに先立って、リン酸塩水溶液を一体化させるべき生物学的に活性なマクロ分子と混合することによって行われる。一体化させるべき生物学的に活性なマクロ分子は約０．１ないし２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有することができる。ナノ粒子は適当な時間の間、一般には、１分ないし１時間の間維持される。ナノ粒子は、遠心または濾過のいずれかによって懸濁液から分離し、次いで、真空下で乾燥することができる。
【００４８】
本発明のナノ粒子は、さらに、例えば、腸溶コーティングでコートすることができる。腸溶コーティングのプロセスおよび材料は周知であり、当該分野で実施される。異なる腸溶ポリマーの選択の結果、胃腸管の標的化面積およびマクロ分子の薬物動態学的挙動の変化をもたらし得ることはよく認識される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子でカプセル化されたリン酸カルシウムナノ粒子は腸溶ポリマー溶液に懸濁される。最も普通に使用される溶媒はアセトン、エタノールまたは組合せである。例えば、ナノ粒子は１０ないし１００ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁させることができる。コーティングポリマーおよびコアナノ粒子の比は３：１ないし０．５：１、好ましくは２：１ないし１：１の間とすることができる。ナノ粒子は軽い音波処理によって分散でき、１ないし５×容量パラフィン油を混合物に加えることができる。ボルテックスおよび音波処理による完全な混合の後、２ないし１０×容量のクロロホルムを加えて、コーティングポリマーを固化させることができる。コートされた粒子はＷｈａｔｍａｎ Ｃｈｒ ３ＭＭのような濾紙、およびにクロロホルムでの洗浄によって回収することができる。回収された生成物はさらに真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、リン酸カルシウムナノ粒子は、２０ないし１００ｍｇ／ｍＬの間の濃度を有する腸溶ポリマー溶液に懸濁させ、ナノ粒子に対するコーティングポリマーの比率は２：１ないし１：１の間である。懸濁液を軽く音波処理し、腸溶ポリマーを溶解させず、腸溶ポリマーを溶解させるべき溶媒と混和性でない溶媒に直接加える。混合物および分散溶媒の間の容量比率は１：１０ないし５００：１である。粒子は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｈｒ ３ＭＭのような濾紙への濾過によって回収される。粒子は真空下で乾燥させ、均一なサイズまで粉砕される。
【００５１】
本発明の粒子は、さらに、他の表面修飾剤でコートし、または含浸させることができ、あるいは双方が可能である。本発明で用いるのに適したそのような表面修飾剤は、マクロ分子を変性することなく、生物学的に活性なマクロ分子の粒子用の結合、またはその捕獲を容易とする物質を含む。適当な表面修飾剤の例は米国特許第５，４６０，８３０号、第５，４６２，７５１号、第５，４６０，８３１号および第５，２１９，５７７号に記載されている。適当な表面修飾剤の他の例は、米国特許第５，２１９，５７７号に記載されたセロビオースまたはオリゴヌクレオチドのような塩基性または修飾された糖を含むことができる。適当な表面修飾剤は、例えば、米国特許第５，４６０，８３０号に記載された、炭水化物、炭水化物誘導体、および−ＯＨ側鎖基の豊富さによって特徴付けられる炭水化物−様成分との他のマクロ分子を含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は特に適当な表面修飾剤である。
【００５２】
リン酸カルシウム粒子のコーティングは、セロビオースまたはＰＥＧ（例えば、２９２ｍＭ前後）のような表面修飾剤のストック溶液をリン酸カルシウムコア粒子の懸濁液へ、約２０ｍＬの粒子懸濁液に対する約１ｍＬのストック溶液の比率にて加えることによって調製することができる。混合物を攪拌し（ｓｗｉｒｌ）、一晩放置して、少なくとも部分的にコートされたコア粒子を形成することができる。一般には、いくつかの部分的にコートされたまたはコートされていない粒子を存在させることもできるが、この手法は粒子の実質的に完全なコーティングをもたらすであろう。
【００５３】
（Ｃ．リン酸カルシウムナノ粒子を用いる方法）
本発明は、生物学的に活性なマクロ分子を必要とする対照を治療する方法も提供し、該方法は、本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００５４】
本発明の組成物の投与は、経口、静脈内、皮下、吸入を介する、動脈内、筋肉内、心臓内、心室内、非経口、クモ膜下腔内、および腹腔内を含めた当該分野で知られたいずれの手段によることもできる。投与は、全身、例えば静脈内または局所にて行うものとする。
【００５５】
本発明のナノ粒子および医薬組成物は、それを必要とする対象に投与することができる。「対象」は哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定されるものではないが、（ウシのような）家畜、スポーツ動物、（ネコ、イヌ、ウマのような）ペット、霊長類、マウスおよびラットを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、医薬組成物のリン酸カルシウムナノ粒子は腸溶コーティングを含む。腸溶コート粒子は適当には経口経路によって投与することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物はインスリンを含んでカプセル化された腸溶コートリン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、糖尿病または高血糖症を治療するために、溶液、カプセル、錠剤および粉末の形態で経口により対象に投与することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、医薬組成物はインターフェロンを含んでカプセル化された腸溶コートリン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、ウイルス感染、癌、自己免疫疾患を治療するために、溶液、カプセル、錠剤および粉末の形態で経口により対象に投与することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、エリスロポエチンを含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、貧血を治療するために、または赤血球細胞レベルを上昇させるために、溶液、カプセル、錠剤または粉末の形態で対象に経口投与することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、Ｇ−ＣＳＦを含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、化学療法または他の理由によって引き起こされた好中球減少症を治療するために、溶液、カプセル、錠剤または粉末の形態で対象に経口投与することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ヒト成長ホルモンを含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、小人症、成人成長ホルモン欠乏、るいそう、およびひどい負傷のような成長ホルモンの補充を必要とする疾患を治療するために、溶液、カプセル、錠剤または粉末の形態で対象に経口投与することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウム粒子を含む。医薬組成物は、溶液、カプセル、錠剤および粉末の形態で対象に経口投与することができる。経口ＰＴＨ組成物は、骨粗鬆症、またはＰＴＨ投与を必要とする他の障害を治療するのに用いることができる。
【００６３】
本発明の粒子は、アレルゲンまたは他の抗原性物質を送達するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、アレルゲンまたは抗原を含んでカプセル化されたリン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、対象において免疫応答を誘導し、対象へのアレルゲンの制御された放出を供するために、または対象においてアレルギー性脱感作を誘導するために、対象に投与することができる。粒子は吸入を介して、または粘膜を横切って皮下投与することができる。粒子は、スプレイ、エアロゾル、軟膏、点眼剤、ゲル、懸濁液、カプセル、坐薬、含浸タンポン、またはその組合せとして送達することができる。
【００６４】
本発明の粒子は、粘膜免疫保護、粘膜ワクチン送達、または粘膜薬物送達のために粘膜表面へ生物学的に活性なマクロ分子を送達するのに用いることができる。生物学的に活性なマクロ分子の非限定的な例としては、以下：抗原性物質、天然免疫増強因子、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド物質、インスリンのような治療薬物、または粘膜表面に投与された場合に治療効果を有することができるいずれかの他の組成物の１以上が挙げられる。粒子はいずれかの生物学的に許容できる賦形剤と複合体化することができ、経口、肺内、鼻腔内、直腸、眼内のような粘膜表面を介して投与することができる。
【００６５】
本発明の粒子は、目の障害を治療するために、生物学的に活性なマクロ分子を目の表面に送達するのに用いることができる。例えば、治療蛋白質もしくはペプチド、または治療効果を有することができる他の成分を粒子中にカプセル化し、目の表面に投与することができる。治療することができる目の障害または疾患は、限定されるものではないが、緑内障、ブドウ膜炎、色素性網膜炎、黄斑変性、網膜障害、網膜血管病、および他の血管異常、眼内炎、感染症、炎症性であるが感染性でない障害、目の虚血性症候群、末梢網膜変性、網膜変性、脈絡膜障害および腫瘍、ガラス体障害、および炎症性光学神経障害が挙げられる。
【００６６】
以下の実施例は説明目的のためだけに含めるものであり、本発明の範囲を限定する意図のものではない。リン酸カルシウムナノ粒子は、本出願で詳細に説明された種々の実施形態で調製することができる。以下の非限定的例は、種々の実施形態の典型的な結果を示す。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
音波処理でのリン酸カルシウム粒子の調製
２００ミリグラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、２３．２ｍｇのＢＳＡ、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、（１．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭグルコース、２７５ｍＭ ＮａＣｌ、および４０ｍＭ ＢＥＳ、ｐＨ６．９６４を含有する）３ｍＬのＢＢＳ溶液を２０ｍＬの水溶液に溶解させた。該溶液は０．６１５のＯＤ２８０を有した。攪拌下で、０．３ｍＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。
【００６８】
沈殿が直ちに観察され、攪拌を室温にて一晩継続した。混合物を１５分間音波処理し、８０００ｒｐｍにおいて１５分間スピンダウンした。収集した粒子を真空下で乾燥し、回収を測定した。上清のＯＤ２８０は０．０８４であった。捕獲効率は以下の方程式によって見積もった：
効率（％）＝［１−上清のＯＤ２８０／出発溶液のＯＤ２８０］×１００
この場合、捕獲効率は８６％であった。
【００６９】
リン酸カルシウム粒子からのＢＳＡ放出を評価した。２０．６ｍｇのＢＳＡを負荷したリン酸カルシウム粒子を２０ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた。混合した後、２２ミクロ−遠心管を各々０．８ｍＬアリコットに設定した。全てのアリコットを３７℃にて揺動させた。以下の表１に示された各時点において、アリコットの３チューブを採取し、１４０００ｒｐｍにおいて１０分間スピンダウンさせた。上清を除去し、ＯＤ２８０を測定し、データを表１に示す。リン酸カルシウム粒子からのＢＳＡ放出は、ＰＢＳにおいて、４ないし８時間以内に実質的に完了した。
【００７０】
【表１】
音波処理無しでのＢＳＡ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子の調製
２００ミリグラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１０ｍｇのＢＳＡ、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｍＬのＢＢＳ溶液を２０ｍＬの水溶液に溶解させた。該溶液は０．３５０のＯＤ２８０を有した。攪拌下で、０．３ｍＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。
【００７１】
沈殿が直ちに観察され、８０００ｒｐｍにおいて１５分間スピンダウンすることによって粒子を回収した。収集された粒子を真空下で乾燥した。上清のＯＤ２８０は０．２２４であって、見積もられた捕獲効率は３６％であった。
【００７２】
デオキシコレートの存在下でのＢＳＡ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子の調製
２００ミリグラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１０ｍｇのＢＳＡ、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｍＬのＢＢＳ溶液および４０ｍｇデオキシコレートを２０ｍＬの水溶液に溶解させた。ＯＤ２８０は０．２９６であった。攪拌下で０．３ｍＬの２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を加えた。
【００７３】
沈殿が直ちに観察され、８０００ｒｐｍにおいて１５分間スピンアウトすることによって粒子を回収した。収集された粒子を真空下で乾燥した。上清のＯＤ２８０は０．０８４であり、見積もられた捕獲効率は７２％であった。
【００７４】
これらの２つの例は、デオキシコレートが同一条件下でカプセル化効率を実質的に上昇させることを示す。
【００７５】
濾過によるＢＳＡ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子の調製
１グラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、４０ｍｇのＢＳＡ、１２ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６、および１６０ｍｇのデオキシコール酸ナトリウムを２０ｍＬの水に溶解させた。添加前に、デオキシコレートを１ｍＬのエタノールに溶解させた。ＯＤ２８０は１．３４９であった。攪拌下で、２０ｍＬの７２ｍＭ ＣａＣｌ２を加えた。２分後に、混合物を真空下で２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ膜に濾過した。膜を真空下で乾燥し、カルシウムナノ粒子を回収した。濾液のＯＤ２８０は０．１４２であって、捕獲効率は８２％であった。
【００７６】
（実施例２）
エリスロポエチン（ＥＰＯ）負荷腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子の製造
ＥＰＯ試料（１．２ｍｇ／ｍＬの１ｍＬ）を１Ｌの水に対して４℃にて一晩透析し、最終容量は１．３ｍＬであった。４００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１．３ｍＬのＥＰＯ、６ｍＬのＢＢＳ、ｐＨ６．９６４、および２ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を合計４０ｍＬの溶液に混合した。ＯＤ２８０は０．０７０であった。攪拌下で、６０ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。沈殿が直ちに観察され、攪拌を室温にて１時間継続した。
【００７７】
溶液を８０００ｇにおいて、１０分間スピンダウンして、粒子を収集した。溶液のＯＤ２８０は０．０３３と測定され、全ての粒子を真空下で乾燥した。捕獲効率は５３％と見積もられた。
【００７８】
ＥＰＯ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子をセルロースアセテートフタレートで被覆した。３０ｍｇのＥＰＯ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子を、アセトン：エタノール（９５：５）中の０．５ｍＬの１０％セルロースアセテートフタレートに懸濁させた。１．５ｍＬのパラフィン油を加え、攪拌し、続いて、６ｍＬのクロロホルムを加えることによって混合した。粒子をＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）で回収し、クロロホルムで洗浄した。粒子を真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕した。
【００７９】
１ｍｇ粒子被覆リン酸カルシウムナノ粒子を採取することによってＥＰＯ負荷を測定し、室温にて４時間で０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させた。１４０００ｒｐｍにおいてスピンダウンした後、上清中のＥＰＯ濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）で測定した。ＥＰＯ負荷は３６００ＩＵ／ｍｇであった。
【００８０】
（実施例３）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口エリスロポエチン（ＥＰＯ）のイン・ビボの活性
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口ＥＰＯの活性を、ヘマトクリットを測定することによって正常なＢａｌＢ／ｃマウスにおいて評価した。
【００８１】
動物。９匹の６ないし８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に与えた。光サイクルを１２時間毎に設定した。
【００８２】
処理。マウスを、３匹のマウスを各群に入るように、３つの群に任意に分けた。ビヒクル群を０．５ｍＬビヒクル溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）で毎日１回５日間胃管栄養に付した。皮下（ＳＣ）注射群にビヒクル中の５０ＩＵ ＥＰＯを毎日１回５日間注射した。経口群は０．５ｍＬのビヒクル溶液中の１０００ＩＵ ＥＰＯで毎日１回５日間胃管栄養に付した（ｇａｒｖａｇｅｄ）。２日に、全てのマウスに１０ｍｇ鉄デキストランの腹腔内注射を与えた。
【００８３】
１０日に、血液試料を眼球後ろ穿刺から吸い取り、ヘパリン処理したキャピラリチューブを用いて、血液試料を収集した。キャピラリチューブを３０００ｒｐｍにおいて２０分間スピンダウンし、全血中の赤血球細胞画分の比率によってヘマトクリット（ＨＣＴ）を計算した。結果を以下の表２に示す。両側および不均等偏差ｔ−検定を、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートプログラムにおいて形成関数で行った。
【００８４】
【表２】
データは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口送達されたＥＰＯが活性であり、ＨＣＴ値を有意に増大させたことを示唆する。
【００８５】
（実施例４）
腸溶被覆顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
カプセル化および生物学的効果に対するデオキシコレートのデュアル効果を次の２つの試料で説明する。
【００８６】
デオキシコレートの不存在下におけるＧ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
１．９ｍｇ／ｍＬ試料の２０ｍＬのＧ−ＣＳＦを３Ｌの水に対して４℃にて一晩透析し、最終Ｇ−ＣＳＦ濃度は１．５ｍｇ／ｍＬであった。２００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、２．５ｍＬのＧ−ＣＳＦ、３ｍＬのＢＢＳ、ｐＨ６．９６４、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を混合し、蒸留水中に２０ｍＬに調製した。ＯＤ２８０は０．１４５であった。攪拌下、３００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、沈殿が直ちに観察された。攪拌を１０分間継続し、粒子はポリトロンホモゲナイザーで１０分間ホモゲナイズし、８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンすることによって回収した。上清のＯＤ２８０は０．０３３であって、捕獲効率は７７％であった。粒子を真空下で乾燥した。
【００８７】
Ｇ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を腸溶ポリマーのセルロースアセテートフタレートで被覆した。１７ｍｇの粒子を４００ｕＬの、９５：５アセトン：エタノール中の１０％セルロースアセテートフタレートに懸濁させた。ボルテックスによって混合した後、攪拌しつつ２０ｍＬのパラフィン油を加え、１分後に７．５ｍＬのクロロホルムを加えた。被覆した粒子を濾過によってＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）に回収し、クロロホルムで洗浄した。被覆粒子を真空下で乾燥し、粉砕した。
【００８８】
デオキシコレートの存在下でのＧ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウム粒子の製造
２００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、２．５ｍＬのＧＣＳＦ、６５．９ｍｇのデオキシコレート、３ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、および１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を溶解させ、２０ｍＬに調整した。デオキシコレートを添加前に１ｍＬエタノールに溶解させた。ＯＤ２８０は０．１０６であった。攪拌下に、３００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、沈殿が直ちに観察された。攪拌を１０分間継続し、粒子をポリトロンホモゲナイザーで５分間ホモゲナイズし、８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンすることによって回収した。上清のＯＤ２８０は０．００８であった。カプセル化効率は９２％であった。粒子を真空下で乾燥した。
【００８９】
Ｇ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を腸溶ポリマーのセルロースアセテートフタレートで被覆した。５８ｍｇの粒子を、１．２ｍＬの、９５：５アセトン：エタノール中の５％セルロースアセテートフタレートに懸濁した。渦巻かせることによって混合させた後、攪拌しつつ２０ｍＬのパラフィン油を加え、１分後に７．５ｍＬのクロロホルムを加えた。被覆された粒子が濾過によってＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）に回収され、クロロホルムで洗浄した。被覆された粒子を真空下で乾燥し、粉砕した。
【００９０】
該実施例は、もし粒子がデオキシコレートの存在下で調製されるならば捕獲効率は有意に改良することができることを示す。
【００９１】
（実施例５）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦのイン・ビボ活性
経口Ｇ−ＣＳＦの活性を、正常なＢａｌｂ／Ｃマウスにおける処理の後に、白血球細胞の数をカウントすることによって測定した。
【００９２】
動物。１８匹の６ないし８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に与えた。光サイクルは１２時間毎に設定した。
【００９３】
処理。マウスを任意に４つの群に分けた。ビヒクルおよびＳＣＧ群は４匹のマウスを有し、ＣＡＰおよびＣＡＰＤ群が、各々、５匹のマウスを有した。ビヒクル群を０．５ｍＬの１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．０で処理した。ビヒクル中の１００ｕｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦの０．１ｍＬ皮下注射でＳＣＧを処理した。ＣＡＰ群を、２ｍｇ／ｋｇＧ−ＣＳＦにて、１ｍＬのビヒクル中の腸溶被覆リン酸カルシウム粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦで処理した。ＣＡＰＤは、デオキシコレートの存在下で調製された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦであった。用量はＣＡＰ群と同一であった。
【００９４】
マウスを毎日４日間処理し、血液試料を５日に吸い取って、全白血球細胞カウントを決定した。赤血球細胞を溶解させ、顕微鏡を用いて全白血球細胞カウントを測定した。ｔ−検定の形成関数にてＥｘｃｅｌスプレッドシートプログラムを用いてデータを解析した。
【００９５】
【表３】
データは、注射された、および経口送達されたＧ−ＣＳＦがより高い白血球細胞カウントを有意に達成したことを示唆する。加えて、デオキシコレートの存在下で調製されたリン酸カルシウムナノ粒子がより大きなＧ−ＣＳＦ活性を送達し、デオキシコレート無しのそれよりもより高い白血球細胞カウントを達成した。
【００９６】
（実施例６）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦの生物−同等性
動物。１０匹の８ないし１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルは１２時間毎に設定した。
【００９７】
処理。ラットを任意に３つの群に分け、２匹のラットはビヒクル群（Ｖ）、４匹のラットは注射（Ｇ）および経口Ｇ−ＣＳＦ処理（Ｄ）群とした。処理スケジュールは以下の表４にリストする。Ｖは１０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．０のビヒクルであった。Ｇは皮下注射群であった。Ｄは、デオキシコレートの存在下で調製された腸溶被覆リン酸カルシウム粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦであった。
【００９８】
【表４】
ラットを処理し、血液試料を０、４、８、１２および２６時間における所定の時点で吸い取った。赤血球細胞を溶解させ、顕微鏡を用いて全白血球細胞カウントを決定した。
【００９９】
図１は各時点における白血球細胞のカウントを示す。注射された、および経口送達されたＧ−ＣＳＦについての曲線下面積を見積もり、経口送達されたＧ−ＣＳＦの生物−同等性は皮下経路の８．５％と見積もられた。
【０１００】
（実施例７）
腸溶被覆インターフェロンアルファ（ＩＦＮ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
４００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１．３ｍＬのＩＦＮ、６ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、および２ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を合計４０ｍＬの水溶液中で混合した。ＯＤ２８０は０．０８２であった。攪拌下で、６００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、沈殿が直ちに観察された。攪拌を１０分間継続し、粒子を１５分間音波処理し、８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンした。上清のＯＤ２８０は０．０３３であった。捕獲効率は６０％であった。真空下での乾燥の後、３５．２ｍｇ粒子が回収された。
【０１０１】
ＩＦＮ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を腸溶ポリマーのセルロースアセテートフタレートで被覆した。３２ｍｇの粒子を、６４０ｕＬの、９５：５アセトン：エタノール中の５％セルロースアセテートフタレートに懸濁した。ボルテックスによって混合した後、２０ｍＬパラフィン油を攪拌しつつ加え、１分後に７．５ｍＬのクロロホルムを加えた。被覆された粒子をＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）への濾過によって回収し、クロロホルムで洗浄した。被覆された粒子を真空下で乾燥し、粉砕した。
【０１０２】
（実施例８）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子における経口ＩＦＮの生物学的利用性
動物。２匹の８ないし１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルは１２時間毎に設定した。
【０１０３】
処理。１匹のマウスを、１００ｕＬの１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．０中の皮下注射を介して１６０万ＩＵ ＩＦＮで処理した。他のラットを、１ｍＬのビヒクル溶液中のリン酸カルシウム粒子中の１６００万ＩＵ ＩＦＮでの胃管栄養に付した。
【０１０４】
血液試料を−０．５、０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４時間の所定の時点で吸い取った。血清をＥＬＩＳＡ分析のために貯蔵した。
【０１０５】
図２は各時点において血清ＩＦＮレベルを示す。注射された、および経口送達されたＩＦＮについての曲線下面積を見積もり、経口送達されたＩＦＮの生物学的利用性は皮下経路の１０．２％と見積もられた。
【０１０６】
（実施例９）
腸溶被覆インスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
フミリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）を薬局で購入した。１８０ｍＬのインスリン試料（６４２ｍｇ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（４．６ｃｍ×１００ｃｍ、１．７Ｌのベッド容量）にて蒸留水に交換した。ＯＤ２８０をモニターし、第一のピークを収集した。全３００ｍＬ試料を回収し、ＯＤ２８０は２．０２２であった。
【０１０７】
５ｇのＰＥＧ（ＭＷ １００００、Ｆｌｕｋａ）、６００ｍｇのインスリン、１．６ｇのデオキシコレート、４０ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、１９．２ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を混合し、蒸留水で４００ｍＬに調整した。デオキシコレートを添加前に１０ｍＬのエタノールに溶解させた。ＯＤ２８０は１．８６８であった。攪拌下で、４００ｍＬの３６ｍＭ ＣａＣｌ２を混合し、形成された粒子を直ちに２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ膜に濾過した。濾液のＯＤ２８０は０．０２２であって、カプセル化効率は９８．２％であった。粒子を真空下で乾燥し、回収された粒子の全量は１．８ｇであった。
【０１０８】
蛋白質成分を省略した以外は同一の手法により、ブランクのナノ粒子を調製した。インスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子およびブランクのリン酸カルシウムナノ粒子双方を、Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｌａｂｓによる走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）調査に付した。ＳＥＭのイメージは図３Ａおよび３Ｂに示す。ブランクのリン酸カルシウムナノ粒子は、平均直径が２００ｎｍである球形の単分散かつ中空形態を呈した（図３Ａ）。対照的に、インスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍの、球形および単分散形態を示した（図３Ｂ）。
【０１０９】
腸溶コーティングでは、０．５ｇのインスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子を、０．５ｇセルロースアセテートフタレートを含有する５ｍＬのアセトン：エタノール（９５：５）に懸濁させた。混合した後、１５ｍＬのパラフィン油を加え、混合し、続いて、５０ｍＬのクロロホルムを加えた。粒子をＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）への濾過によって集め、クロロホルムで洗浄した。粒子を真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕した。１ｍｇ粒子からの放出インスリンを室温にて３時間１ｍＬＰＢＳ中に採取することによって、インスリン含有量を測定した。標準としてのインスリンでのＬｏｗｒｙ蛋白質アッセイを用いて、放出媒体中のインスリン濃度を測定した。
【０１１０】
（実施例１０）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンの生物−同等性
動物モデル。３５匹の８ないし１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルを１２時間毎に設定した。
【０１１１】
ラットを２０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ４．５中の６０ｍｇ／ｋｇストレプトゾシンで腹腔内注射した。ストレプトゾシンから８時間後に、１ｍＬの５％グルコースを腹腔内投与した。２週間後に、絶食血中グルコースレベルを測定した。絶食血中グルコースは２４匹のラットにおいて＞３００ｍｇ／Ｄ１であり、これを引き続いての試験で用いた。
【０１１２】
処理。１６匹のラットを任意に３つの群に分けた。インスリン溶液（ＯＩ−５０、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）、およびインスリン注射（ＳＣＩ−５、「注射」）群は共に、各々、４匹の糖尿病ラットを有した。処理群（ＰＯ−５０、「Ｏｒａｌ」）を８匹のラットを有した。対照群には０．５ｍＬのビヒクル溶液中の５０ＩＵインスリン／ｋｇを経口にて与えた。注射群は０．５ｍＬビヒクル中の５ＩＵインスリン／ｋｇでの皮下注射を受けた。他の群には０．５ｍＬビヒクル溶液中の腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中に処方した５０ＩＵインスリン／ｋｇを経口で与えた。ビヒクル溶液は１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．０中の２％カルボキシメチル−セルロースであった。
【０１１３】
【表５−１】
一晩絶食させた後、ラットを処理し、０、１、３、６、１２および２４時間の時点で尾静脈を介して血液試料を吸い取った。血中グルコースをグルコメーター（ＳｕｒｅＳｔｅｐ）で測定した。
【０１１４】
図４は、糖尿病ラットにおける経口または皮下インスリンでの処理の後における各時点のパーセント血中グルコース変化を示す。皮下インスリンは血中グルコースレベルを迅速に降下させ、１２時間以内に正常に戻した。リン酸カルシウム粒子を送達した経口インスリンは、より徐々にかつ延長された血中グルコース低下効果を示した。傾向インスリンの生物−同等性は皮下インスリンと比べて１２％であった。
【０１１５】
（実施例１１）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンによる健康なボランティアでの血中グルコースの低下
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンの効果を評価するために、２人の健康なヒトボランティアを試験した。標準グルコース許容性試験を行った。各ボランティアを１２時間を超えて絶食させ、６８ｇのグルコースを摂取させた。血中グルコースを、グルコース摂取に関して、−３０、０、３０、６０、９０、１２０、１５０および１８０分においてＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターで測定した。測定の２つのサイクルを各ボランティアに対して行った。第一のサイクルはベースラインを確立するための標準グルコース許容性試験であった。各ボランティアは、第二のサイクルの間に、−３０分において腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の２００Ｕ経口インスリンを摂取した。
【０１１６】
第一のボランティアにおける血中グルコース変化を図５Ａに示す。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を介して送達された経口インスリンはピークおよびトラフ血中グルコースレベルを共に低下させた。
【０１１７】
第二のボランティアにおけるパーセント血中グルコース変化を図５Ｂに示す。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を介して送達された経口インスリンはピーク血中グルコースレベルを低下させ、測定期間を通じて血中グルコース曲線を降下させた。
【０１１８】
この実験は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンがヒト対象において活性であり、血中グルコースを低下させることを示す。測定の間に有害反応は記録されなかった。
【０１１９】
（実施例１２）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンによる糖尿病患者の絶食血中グルコースの制御
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンの可能性を、さらに、糖尿病患者で評価した。その血中測定レベルを制御するために規則的にインスリン処置を受けた１９人のＩＩ型糖尿病患者を実験のために募った。３サイクルの評価を各患者で行った。
【０１２０】
第一のサイクルにおいては、各患者を１２時間を超えて絶食した。血中グルコースレベルを３０分毎に翌朝測定した。ＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターを用いて、血中グルコースレベルを測定した。ベースラインを確立させるためにこのサイクルにおいて処理は行わなかった。
【０１２１】
第二のサイクルにおいて、各患者を１２時間を超えて絶食させた。翌朝３０分毎に血中グルコースレベルを測定した。ＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターを用いて、血中グルコースレベルを測定した。各患者にはこのサイクルにおいては時間０で１０ＩＵフムリン皮下注射を与えた。
【０１２２】
第三のサイクルにおいては、各患者を１２時間を超えて絶食させた。血中グルコースレベルを翌朝３０分毎に測定した。ＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターを用いて、血中グルコースレベルを測定した。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の１００ＩＵまたは２００ＩＵ経口インスリンいずれかをこのサイクルにおいて時間０に各患者に与えた。
【０１２３】
各患者についての測定の順序は任意であり、次のサイクル前で経口インスリン測定後に４８時間の洗浄期間があった。実験の後に、ベースライン測定のための１７の使用可能な患者データがあり、インスリン注射について１９の患者データがあり、１００ＩＵ経口インスリン処理について６つの患者データがあり、２００ＩＵ経口インスリン処理について１１の患者データがある。
【０１２４】
測定の各サイクルにおけるパーセント血中グルコース変化を図６に示す。処理なくして、血中グルコースレベルを上昇させ、観察期間の間に比較的安定に維持された。インスリン注射が血中グルコースの劇的な低下を生じた。事実、７名の患者は低血糖症を発症し、その血中グルコースレベルは５０ｍｇ／ｄＬ未満まで降下し、経口グルコースで処理しなければならなかった。対照的に、１００ＩＵまたは２００ＩＵ経口インスリンを摂取した患者は、ベースラインと比較して徐々ではあるが統計学的に有意な血中グルコースレベルの低下を示した。加えて、２００ＩＵ経口インスリンで処理した患者は血中グルコースのより大きな低下を示した。
【０１２５】
本実験は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンが、糖尿病患者において血中グルコースレベルを効果的にかつ用量−依存的に制御できることを示す。
【０１２６】
（実施例１３）
腸溶被覆ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
ｈＧＨ試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５脱塩カラムにて、蒸留水に交換した。ｈＧＨの量をＯＤ２８０測定および０．６８の光学係数にて計算した。２００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、８４ｍｇのｈＧＨ、１２ｍＭホスフェート、および３２０ｍｇのデオキシコレートを４０ｍＬの溶液に溶解させた。ＯＤ２８０は１．３０７と測定された。攪拌下で、４０ｍＬの７２ｍＭ ＣａＣｌ２を混合し、沈殿を直ちに２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ膜（Ｗｈａｔｍａｎ）に濾過した。濾液のＯＤ２８０は０．０３９であった。粒子を真空下で乾燥し、捕獲効率は、粒子形成の前および後でのＯＤ２８０測定に基づいて９５％であった。
【０１２７】
腸溶被覆のために、３００ｍｇのｈＧＨ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を、４ｍＬの、９５：５アセトン：エタノール中の１０％セルロースアセテートフタレートに懸濁させた。混合の後に、６ｍＬのパラフィン油を加え、混合し、続いて１８ｍＬのクロロホルムを加えた。粒子をＷｈａｔｍａｎ紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）に濾過し、クロロホルムで洗浄した。粒子を真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕した。
【０１２８】
１ｍｇの粒子を１ｍＬのＰＢＳに加え、室温にて３時間インキュベートすることによって、ｈＧＨ含有量を測定した。標準としてのｈＧＨでのＬｏｗｒｙ蛋白質アッセイを用いて、放出媒体中のｇＧＨの濃度を測定した。
【０１２９】
（実施例１４）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口ヒト成長ホルモンによる体重増加の促進
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口ｈＧＨ活性を下垂体切除ラットで試験し、これは成長ホルモン活性についての標準的なアッセイである。
【０１３０】
動物モデル。下垂体切除外科的処置を受けた２０匹の６週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）を換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルを１２時間毎に設定した。各ラットの体重を毎日モニターした。
【０１３１】
処理。２０匹のラットを任意に３つの群に分けた。各々、ビヒクルおよび注射群に４匹の動物とした。処理群は１２匹のラットを有した。ビヒクル群をパラフィン油で処理した。ラットを毎朝処理し、体重を毎夕方測定した。
【０１３２】
【表５−２】
図７は、下垂体切除ラットにおける経口または皮下ｈＧＨでの処理の後における正味の体重増加を示す。皮下ｈＧＨの結果、実質的に正味の体重増加が得られ、他方、ビヒクル処理は体重のわずかな低下を生じる。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子で送達された経口ｈＧＨは有意な体重を生じ、これは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子における経口ｈＧＨが生物学的に活性であることを示す。
【０１３３】
（実施例１５）
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
副甲状腺ホルモン１−３４（ＰＴＨ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５脱塩カラムにて、蒸留水に交換した。４００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ １００００、Ｆｌｕｋａ）、６ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、および２ｍＬの１２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を４０ｍＬの溶液中で混合した。ＯＤ２８０は０．０８２として測定された。攪拌下で、６００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。沈殿が直ちに観察され、粒子を８０００ｇにて１０分間スピンダウンした。上清のＯＤ２８０は０．０３３であった。粒子を真空下で乾燥した。捕獲効率は、粒子形成の前および後におけるＯＤ２８０測定に基づいて５９％と見積もられた。
【０１３４】
（実施例１６）
ＢＣＧ負荷リン酸カルシウムナノ粒子の多糖＆核酸抽出物の製造
Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ−ＰＳＮ）の多糖および核酸抽出物は免疫変調活性を有する。ＢＣＧ−ＰＳＮは多糖および核酸を共に含有し、これを用いて、化合物のこのクラスにおけるリン酸カルシウムナノ粒子の利用性を示す。
【０１３５】
ＢＣＧ−ＰＳＮはＣｈｅｎｇｄｕ Ｒｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．（Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｃｈｉｎａ）から粉末形態を得られた。１ｍｇのＢＣＧ−ＰＳＮ、５０ｍｇのＰＥＧ（Ｆｌｕｋａ、ＭＷ１００００）０．２５ｍＬのＢＢＳ、ｐＨ６．９６４、および０．７５ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を２０ｍＬの溶液に混合した。ＯＤ２６０は０．２２であって、多糖含有量はＡｎｔｈｒｏｎｅ方法によって測定した。
【０１３６】
攪拌下で、７５ｕＬの５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、室温にて１時間、攪拌を継続した。粒子を８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンした。上清のＯＤ２６０は０．０であって、多糖の濃度は２２．１ｕｇ／ｍＬであった。カプセル化効率は核酸成分については１００％であって、多糖成分については約６３％であった。粒子を真空下で乾燥した。
【０１３７】
前記実施例は説明目的のためだけに含め、本発明の範囲を限定する意図のものではない。前記したものに対する多くの変形は可能である。前記した実施例に対する修飾および変形は当業者に明らかであるため、本発明は添付の請求の範囲の範囲によってのみ制限されることを意図する。
【０１３８】
【表６−１】
【０１３９】
【表６−２】
【０１４０】
【表６−３】
【０１４１】
【表６−４】
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「Ｄ」）中のビヒクル（「Ｖ」）、Ｇ−ＣＳＦ ｓｃ注射（「Ｇ」）または経口Ｇ−ＣＳＦで処理されたラットにおける白血球細胞カウントを示すグラフである。
【図２】図２は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「Ｏ１６Ｍ」）中のインターフェロンｓｃ注射（「ＳＣ１．６Ｍ」）または経口インターフェロンでの処理の後における、ラットでの血清中インターフェロン濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、走査型電子顕微鏡下でのリン酸カルシウムナノ粒子のイメージを示す。図３Ａは、５０００倍率におけるブランクリン酸カルシウムナノ粒子のイメージを示す。図３Ｂは、５０００倍率におけるインスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子のイメージを示す。
【図４】図４は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「Ｏｒａｌ」）中の経口インスリン溶液（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）、皮下インスリン注射（「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」）および経口インスリンで処理された糖尿病ラットにおけるパーセント血中グルコース変化を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の２００ＩＵを含む（「Ｏｒａｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ」）または含まない（「Ｎｏ Ｒｘ」）６８ｇ経口グルコース摂取後の健康なボランティア１での血中グルコース変化を示すグラフである。図５Ｂは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の２００ＩＵ経口インスリンを含む（「Ｏｒａｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ」）または含まない（「Ｎｏ Ｒｘ」）６８ｇ経口グルコース摂取後における健康なボランティア２でのパーセント血中グルコース変化を示すグラフである。
【図６】図６は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の処理無し（「Ｂｌａｎｋ」）、１０ ＩＵインスリン注射（「ＳＣ１０」）、または１００ＩＵ（「ＰＯ１００」）または２００ＩＵ（「ＰＯ２００」）経口インスリンを受けた糖尿病を持つボランティアでのパーセント血中グルコースを示すグラフである。
【図７】図７は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「ＰＯ５０」）中のビヒクル（「Ｖ」）、成長ホルモン注射（「ＳＣ２０」）または経口成長ホルモンで処理された下垂体切除ラットでの正味の体重増加を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参考としてその全体を援用される、２００４年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５４４，６９３号に関する。
【０００２】
（連邦政府により補助された研究または開発に関する陳述）
適用無し
発明の分野
本発明は、新規なリン酸カルシウム粒子、その製法、および生物学的に活性なマクロ分子の送達用の担体としてのそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
蛋白質、ペプチド、多糖、核酸、脂質またはその組合せを含めたマクロ分子医薬は、種々の医学的疾患を治療するための益々重要性が増大するクラスの薬物である。マクロ分子医薬を投与するための主な経路は注射であり、これは不快であり、高価であり、しばしば、貧弱な患者コンプライアンスをもたらす。経口送達は医薬を投与するための好ましい経路である。しかしながら、マクロ分子薬物は腸を通じて吸収されにくく、胃酸および胃腸酵素によって容易に破壊され得る。経口マクロ分子送達のためのバリアーを克服するための有望なアプローチは、ナノ粒子を用いることであり、これは、分解からの保護を供することができ、マクロ分子薬物の吸収を可能とする。
【０００４】
インスリンが負荷されたナノ粒子を用いて、生物活性インスリンを動物に送達することができると報告されている。例えば、無水フマル酸はおよび鉄酸化物添加剤を含むポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ナノ粒子に負荷されたインスリンによる血漿グルコース上昇の阻害は示されている（非特許文献１）。キトサンナノ粒子へのインスリンの経口送達のもう１つの例は、非特許文献２によって供される。加えて、ポリアルキルシアノアクリレートナノカプセルもまた、糖尿病動物におけるインスリンの経口送達用の効果的な担体であると報告されている（非特許文献３）。胃腸経路による特定の物質の摂取は記載されており、リンパのペイヤーパッチが関連する（非特許文献４）。
【０００５】
粒子の吸収に影響する要因の中での、粒子のサイズは主な要因のように見える。例えば、非特許文献５は、ラットにおいて種々のサイズのポリスチレン粒子の腸吸収を研究した。ポリスチレン粒子の吸収効率は明らかにサイズに依存している。１００ｎｍ未満の粒子は有意な吸収を示し、他方、大きな粒子（５００ｎｍ以上）は中程度ないし低い吸収を示したにすぎなかった。
【０００６】
粒子の腸吸収に対するサイズ依存性もまた、非特許文献６によってポリ（ラクチド−コ−グリコリド）またはＰＬＧＡ粒子によって観察されている。この研究においては、５００ｎｍよりも大きなＰＬＧＡ粒子は腸管を介する実質的な摂取を示しておらず、１００ｎｍのＰＬＧＡ粒子の３６％が吸収された。
【０００７】
ナノメータースケールの粒子が、蛋白質および核酸のような生物学的マクロ分子のための担体粒子として用いるために提案されている（特許文献１〜９を参照）。
【０００８】
リン酸カルシウム粒子は生体−接着性／生体適合性であって、イン・ビトロにて核酸を細胞内区画に送達するのに日常的に担体として用いられてきた（非特許文献７〜１０）。加えて、リン酸カルシウムは、イン・ビボにて大きな核酸を送達するための遺伝子治療用の担体として試験もされてきた（非特許文献１１）。
【０００９】
治療用リン酸カルシウム粒子は記載されている。（特許文献１０〜２０、非特許文献１２）。インスリン負荷リン酸カルシウム粒子の経口処方の効果は糖尿病マウスで試験され、血中グルコースの制御が示されている（非特許文献１３）。開示されたリン酸カルシウム粒子は３００ｎｍないし１０ｕｍの間の粒子サイズを有する。動物実験は平均して２ないし４ｕｍの範囲の粒子サイズを用いた。これらの粒子サイズは明らかに最適ではない。
【００１０】
所望のサイズを持つリン酸カルシウム粒子を作成するためには、広範な音波処理が必要であり（非特許文献１４および１５））、これはカプセル化されたマクロ分子薬物を損傷しかねず、共沈殿手法に適合しない。
【００１１】
さらに、マクロ粒子のリン酸カルシウムの粒子へのカプセル化効率はしばしば低い。例えば、特許文献２１は、もしインスリンを予め形成されたリン酸カルシウム粒子に加えたならば約４０％；もしインスリンを粒子形成の間に混合したならば、約８９％の吸収効率を開示する。
【特許文献１】米国特許第５，１７８，８８２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２１９，５７７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３０６，５０８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，３３４，３９４号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４６０，８３０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４６０，８３１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４６２，７５０号明細書
【特許文献８】米国特許第５，４６４，６３４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，３５５，２７１号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，３５５，２７１号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，１８３，８０３号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００４／０２５８７６３号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００２／００５４９１４号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２０００／００６８０９０号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００３／０１８５８９２号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００１／００４８９２５号明細書
【特許文献１７】国際公開第０２／０６４１１２号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第０３／０５１３９４号パンフレット
【特許文献１９】国際公開第００／４６１４７号パンフレット
【特許文献２０】国際公開第２００４／０５００６５号パンフレット
【特許文献２１】米国特許第６，３５５，２７１号明細書
【非特許文献１】Ｃａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ６５：２６１、（２０００）
【非特許文献２】Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２４９：１３９（２００２）
【非特許文献３】Ｄａｍｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３７：２４６（１９８８）
【非特許文献４】Ｈｕｓｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５０：１０７，（２００１）
【非特許文献５】Ｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：８２１，１９９０）
【非特許文献６】Ｄｅｓａｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：１８３８，１９９６）
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２，（１９８７）
【非特許文献８】Ｗｅｌｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．１４：２２１３−２２１７（２００４）
【非特許文献９】Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：５９６−６０１（１９９６）
【非特許文献１０】Ｌｏｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１３９：２２３−２３４（１９８２）
【非特許文献１１】Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２５０：２５、（２００３）
【非特許文献１２】Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｉｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２６：４５９−４６３（２０００）
【非特許文献１３】Ｍｏｒｃｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２７７；９１，（２００４）
【非特許文献１４】Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍａｃｙ，２６：４５９，２０００
【非特許文献１５】Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２５０：２５，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これらの報告された方法は最適でないサイズを持つ粒子をもたらすが、あるいはマクロ粒子処方に適合しない拡大された音波処理のような厳しい条件を必要とする。従って、高度に効果的であって、低コストで容易に作成される経口マクロ分子送達系に対する要望が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の簡単な要旨
本発明は、ａ）リン酸カルシウムナノ粒子のコア；ｂ）コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子；およびｃ）コア粒子にカプセル化された胆汁酸を含む表面修飾剤を含む粒子を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、コア粒子の直径は約１０００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、または約２００ｎｍ未満である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、胆汁酸は、コレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソロデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、およびケノデオキシコレートよりなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、粒子は、さらに、腸溶コーティングを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子は蛋白質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、脂質、および炭水化物よりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、蛋白質またはポリペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、および顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）よりなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子は家塵ダニ、動物フケ、黴、花粉、ブタクサ、ラテックス、スズメバチ毒および昆虫−由来アレルゲン、およびそのいずれかの組合せよりなる群から選択されるアレルゲンである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、該粒子はエアロゾルの形態で適合される。いくつかの実施形態において、該粒子は生物学的に活性なマクロ分子を粘膜表面に送達するように適合される。いくつかの実施形態において、該粒子は、生物学的に活性なマクロ分子を、目の障害の治療のためにそれを必要とする対象の目表面に送達するように適合される。
【００１９】
また、本発明は、本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００２０】
本発明は、リン酸カルシウムの１以上の粒子を作成する方法を提供し、該方法はａ）胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下でカルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させ；ｂ）所望のサイズのリン酸カルシウム粒子が得られるまで溶液を混合し；次いで、ｃ）粒子を回収することを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、カルシウム塩の濃度は約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である。いくつかの実施形態において、リン酸塩の濃度は約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で、カルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させる前に、生物学的に活性なマクロ分子をリン酸塩の水溶液またはカルシウム塩の水溶液に加えることを含み、それにより、リン酸カルシウム粒子はマクロ粒子と共結晶化される。
【００２３】
また、本発明は、生物学的に活性なマクロ分子を必要とする対象を治療する方法を提供し、該方法は本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は経口経路によって投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は粘膜表面に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は目表面に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、生物学的に活性なマクロ分子でカプセル化された新規なリン酸カルシウムナノ粒子、該ナノ粒子の製法、および生物学的に活性なマクロ分子の投与を必要とする医学的疾患を治療するためのナノ粒子を用いる方法を提供する。本明細書中で用いるように、「カプセル化された」、「包埋された」または「配合された」は、物質によって複合体化された、入れられた、結合された、関連する、被覆された、層状化された、または包まれた、を意味する。かくして、粒子中にカプセル化された物質は、該物質が粒子構造に一体化され、または粒子の表面に被覆または付着されまたはその双方である。
【００２５】
他の定義がない限り、本明細書中で用いた全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中で言及された全ての特許、出願、公開された出願および他の刊行物はここに引用してその全体を援用する。本セクションに記載された定義がもしここに引用して援用する特許、出願、公開された出願および他の刊行物に記載された定義に反し、またはそうでなければ合致しないならば、本セクションに記載された定義がここに引用して援用する定義よりも優先する。
【００２６】
本明細書中で用いるように、「ある（「ａ」または「ａｎ」）」は「少なくとも１つ」または「１以上」を意味する。
【００２７】
（Ａ．カプセル化された生物学的活性マクロ分子を持つリン酸カルシウムナノ粒子）
本発明は、ａ）リン酸カルシウムナノ粒子のコア；ｂ）該コア粒子中にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子；およびｃ）該コア粒子中にカプセル化された胆汁酸を含む表面修飾剤を含むリン酸カルシウムナノ粒子を提供する。
【００２８】
本発明のリン酸カルシウムコア粒子は約８０００ｎｍ未満、約１０００ｎｍ未満、より好ましくは、約３００ｎｍ未満の平均粒子サイズ（直径）を有する。該粒子は約５０ｎｍおよび約８０００ｎｍの間、約１００ｎｍおよび約３０００ｎｍの間、または約１００ｎｍおよび約１０００ｎｍの間の直径を有することができる。いくつかの実施形態において、平均粒子サイズは２００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態において、該平均粒子サイズは１００ｎｍ未満である。
【００２９】
本発明のコア粒子は、一般的にかつ実質的に形状が球形である形態を一般的に有し、ナノ粒子のサイズが実質的に単分散である。単分散とは、例えば、サイズが約２０％、約３０％、約４０％または約５０％の差の範囲内の、これらのナノ粒子で観察される狭いサイズ分布をいう。粒子の表面は実質的に平滑とすることができる。
【００３０】
用語「実質的に球形」とは、本明細書中においては、形状が実質的に丸いまたは卵型である粒子をいうように用いられ、面がなく平滑である、または非常に少数の面を有する粒子、ならびにいくつかまたは多数の面を有する多面体である粒子を含む。用語「実質的に平滑」は、本明細書中においては、実質的に表面特徴がない、または１００ｎｍ以上のサイズを有する凹凸を意味する。コア粒子は面があっても、または角張っていてもよく、面が前記したタイプの多くの表面凹凸を含有しない限り、依然として本定義内に入る。
【００３１】
図３Ａおよび３Ｂは、本明細書中に記載された方法に従って調製されたナノ粒子の例の走査型電子顕微鏡イメージを示す。図３Ａは、約２００ｎｍの平均直径で被覆または分散されたマクロ分子無しのブランクナノ粒子を示す。図３Ｂは、約７０ｎｍの平均直径を持つナノ粒子内に分散されたマクロ分子インスリンを持つナノ粒子を示す。これらのナノ粒子は球形および狭いサイズ分布を示す。
【００３２】
本発明におけるリン酸カルシウムナノ粒子は、デュアル機能を有する胆汁酸を含む表面修飾剤を含有する。実施例１に示されるように、リン酸カルシウムナノ粒子への生物学的に活性なマクロ分子のカプセル化は、粒子が胆汁酸の存在下で形成される場合に増強される。胆汁酸はナノ粒子の生物−接着性を増強させ、ナノ粒子のサイズに影響することもできる。いずれの胆汁酸を用いてもよい。胆汁酸の例としては、限定されるものではないが、コレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、およびケノデオキシコレートが挙げられる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明のリン酸カルシウムナノ粒子は、さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。該ＰＥＧは約５００ダルトンないし約２０，０００ダルトン、例えば、約５００、約１０００、約５０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００ダルトンの分子量を有することができる。
【００３４】
いずれの生物学的に活性なマクロ分子もコアリン酸カルシウムナノ粒子にカプセル化することができる。そのような生物学的に活性なマクロ分子としては、限定されるものではないが、蛋白質、ポリペプチド、多糖、核酸、脂質、炭水化物、およびその組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子はインスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、または顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子は、アレルゲンまたは抗原性物質である。アレルゲンの例は、家塵ダニ、動物フケ、黴、花粉、ブタクサ、ラテックス、スズメバチ毒および昆虫−由来アレルゲン、およびそのいずれかの組合せである。
【００３５】
生物学的に活性なマクロ分子には、アルファ−１−抗トリプシン、ステロイド、骨粗鬆症を治療するための薬物、血液凝固因子、抗癌薬物、抗生物質、治療抗体、リパーゼ、ベータ−ブロッカー、抗−喘息、アンチセンスオリゴヌクレオチド、呼吸器系および他の障害のためのＤＮａｓｅ酵素、抗炎症薬剤、抗−ウイルス、抗−高血圧、抗−不整脈薬剤のような心臓治療剤、および遺伝子治療、利尿剤、ヘパリンのような抗−凝固化学物質、ならびにその組合せのようないずれの治療剤が挙げられる。該剤は天然単離体、または合成、化学または生物剤であり得る。
【００３６】
リン酸カルシウムナノ粒子は、さらに、コーティングを含むことができる。例えば、生物学的に活性なマクロ分子で被覆されたおよび／または含浸されたナノ粒子は、さらに、セルロースアセテートフタレート、オイドラギット、およびアクアテリックのような腸溶ポリマーで被覆される。腸溶コーティングのプロセスは先行技術によく記載されており、文献はここに引用して援用される。Ｂｅｙｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７５：５７３−５７８（１９８６）；Ｍａｈａｒａｊ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７３：３９−４２（１９８４）。
【００３７】
また、本発明は、リン酸カルシウムナノ粒子のコア、および該コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子を含むリン酸カルシウムナノ粒子を提供し、ここに、コア粒子の平均粒子サイズ（直径）は約３００ｎｍ未満であり、但し、生物学的に活性なマクロ分子は核酸、ポリヌクレオチド、蛋白質またはポリペプチドではないものとする。また、本発明は、リン酸カルシウムナノ粒子のコア、および該コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子を含むリン酸カルシウム−ナノ粒子を提供し、ここに、コア粒子の平均粒子サイズ（直径）は約３００ｎｍ未満であり、ここに、生物学的に活性なマクロ分子は抗体である。
【００３８】
また、本発明は、本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。適当な担体およびそれらの処方は当該分野で知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０００に記載されている。医薬組成物は、溶液、カプセル、錠剤、粉末およびエアロゾルの形態に処方することができ；経口送達、粘膜送達、または目表面への送達に適した形態に処方することができる。該組成物は、緩衝剤、保存剤、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、エモリエント、滑沢剤、および等張剤のような他の成分を含むことができる。該組成物は、マクロ分子につき制御された放出を達成するように処方することができる。
【００３９】
（Ｂ．リン酸カルシウムナノ粒子の方法）
また、本発明はリン酸カルシウムの１以上の粒子の製法を提供し、該方法は、ａ）胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で、カルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させ；ｂ）所望のサイズのリン酸カルシウム粒子が得られるまで溶液を混合し；次いで、ｃ）粒子を回収することを含む。
【００４０】
本発明のリン酸カルシウムナノ粒子は、典型的には、可溶性カルシウム塩を可溶性リン酸塩と、好ましくは、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で接触させることによって水性媒体中の懸濁液として調製される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、約１ｍＭおよび約１００ｍＭの間の濃度を有する二塩基性リン酸ナトリウムの蒸留水溶液、および０．０１ないし１％（ｗ／ｖ）の濃度を有するデオキシコレートのような表面修飾剤を調製し、溶液中で混合する。いくつかの実施形態において、１ないし３０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するポリエチレングリコールのような他の賦形剤も含まれる。
【００４２】
溶液のｐＨはリン酸緩衝液系によって制御される。ｐＨ値はナノ粒子のサイズに影響し、カプセル化すべきマクロ分子の安定性要件に適合すべきである。ｐＨ値は約４．０ないし約９．０の間、またはより好ましくは約５．０ないし約８．０の間とすることができる。
【００４３】
粒子サイズは、カルシウム、ホスフェート、およびマクロ分子を含めた種々の成分の濃度によって影響される。一般に、カルシウムまたはホスフェートの濃度が高くなれば、ナノ粒子はより大きくなる。
【００４４】
ナノ粒子を生じさせるためには、１ｍＭおよび約１００ｍＭの間の濃度を有する塩化カルシウムのようなカルシウム塩の水溶液を、前記したホスフェートの水溶液と混合する。濁りが直ちに形成され、これは、リン酸カルシウムナノ粒子の形成を示す。混合は、一般には、１分ないし１時間、またはそれよりも長く（例えば、２ないし４８時間）さえ継続する。粒子のサイズは、混合スピードを上昇させることによって、または音波処理によって低下させることができる。
【００４５】
生じたリン酸カルシウムナノ粒子は、さらに、回収されおよび／または精製される。いくつかの実施形態において、カプセル化されたマクロ分子を有する形成されたリン酸カルシウムナノ粒子は遠心によって回収される。溶液は３０００ないし１０００ｘｇにおいて５ないし１５分間遠心され、収集されたナノ粒子は真空下で乾燥される。いくつかの実施形態において、カプセル化されたマクロ分子を有する形成されたリン酸カルシウムナノ粒子は濾過によって回収される。溶液を真空でのブッフェル漏斗のような濾過デバイスに加えられる。２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）のような濾過膜を用いて、ナノ粒子を回収することができ、これはさらに真空下で乾燥される。
【００４６】
本発明の粒子は、生物学的に活性な物質の捕獲の効率を増大させるために、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で形成される。本発明で用いることができる胆汁酸の例はコレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、またはケノデオキシコレートである。胆汁酸の濃度は一般には０．０１％ないし５％である。一般に、この手法の結果、粒子の被覆または含浸の実質的により高い効果がもたらされる。例えば、表面修飾剤の存在下におけるインスリン負荷効率は１００％に近づくことができ、他方、同一条件下で表面修飾剤の存在下において５０ないし６０％に過ぎない。
【００４７】
生物学的に活性なマクロ分子のナノ粒子への負荷は、好ましくは、胆汁酸および賦形剤の存在下でリン酸溶液と組み合わせ、それと混合するに先立って、カルシウム塩水溶液を一体化させるべき生物学的に活性なマクロ分子と混合し、あるいは胆汁酸および賦形剤の存在下でカルシウム塩溶液と組み合わせ、それと混合するに先立って、リン酸塩水溶液を一体化させるべき生物学的に活性なマクロ分子と混合することによって行われる。一体化させるべき生物学的に活性なマクロ分子は約０．１ないし２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有することができる。ナノ粒子は適当な時間の間、一般には、１分ないし１時間の間維持される。ナノ粒子は、遠心または濾過のいずれかによって懸濁液から分離し、次いで、真空下で乾燥することができる。
【００４８】
本発明のナノ粒子は、さらに、例えば、腸溶コーティングでコートすることができる。腸溶コーティングのプロセスおよび材料は周知であり、当該分野で実施される。異なる腸溶ポリマーの選択の結果、胃腸管の標的化面積およびマクロ分子の薬物動態学的挙動の変化をもたらし得ることはよく認識される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性なマクロ分子でカプセル化されたリン酸カルシウムナノ粒子は腸溶ポリマー溶液に懸濁される。最も普通に使用される溶媒はアセトン、エタノールまたは組合せである。例えば、ナノ粒子は１０ないし１００ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁させることができる。コーティングポリマーおよびコアナノ粒子の比は３：１ないし０．５：１、好ましくは２：１ないし１：１の間とすることができる。ナノ粒子は軽い音波処理によって分散でき、１ないし５×容量パラフィン油を混合物に加えることができる。ボルテックスおよび音波処理による完全な混合の後、２ないし１０×容量のクロロホルムを加えて、コーティングポリマーを固化させることができる。コートされた粒子はＷｈａｔｍａｎ Ｃｈｒ ３ＭＭのような濾紙、およびにクロロホルムでの洗浄によって回収することができる。回収された生成物はさらに真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、リン酸カルシウムナノ粒子は、２０ないし１００ｍｇ／ｍＬの間の濃度を有する腸溶ポリマー溶液に懸濁させ、ナノ粒子に対するコーティングポリマーの比率は２：１ないし１：１の間である。懸濁液を軽く音波処理し、腸溶ポリマーを溶解させず、腸溶ポリマーを溶解させるべき溶媒と混和性でない溶媒に直接加える。混合物および分散溶媒の間の容量比率は１：１０ないし５００：１である。粒子は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｃｈｒ ３ＭＭのような濾紙への濾過によって回収される。粒子は真空下で乾燥させ、均一なサイズまで粉砕される。
【００５１】
本発明の粒子は、さらに、他の表面修飾剤でコートし、または含浸させることができ、あるいは双方が可能である。本発明で用いるのに適したそのような表面修飾剤は、マクロ分子を変性することなく、生物学的に活性なマクロ分子の粒子用の結合、またはその捕獲を容易とする物質を含む。適当な表面修飾剤の例は米国特許第５，４６０，８３０号、第５，４６２，７５１号、第５，４６０，８３１号および第５，２１９，５７７号に記載されている。適当な表面修飾剤の他の例は、米国特許第５，２１９，５７７号に記載されたセロビオースまたはオリゴヌクレオチドのような塩基性または修飾された糖を含むことができる。適当な表面修飾剤は、例えば、米国特許第５，４６０，８３０号に記載された、炭水化物、炭水化物誘導体、および−ＯＨ側鎖基の豊富さによって特徴付けられる炭水化物−様成分との他のマクロ分子を含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は特に適当な表面修飾剤である。
【００５２】
リン酸カルシウム粒子のコーティングは、セロビオースまたはＰＥＧ（例えば、２９２ｍＭ前後）のような表面修飾剤のストック溶液をリン酸カルシウムコア粒子の懸濁液へ、約２０ｍＬの粒子懸濁液に対する約１ｍＬのストック溶液の比率にて加えることによって調製することができる。混合物を攪拌し（ｓｗｉｒｌ）、一晩放置して、少なくとも部分的にコートされたコア粒子を形成することができる。一般には、いくつかの部分的にコートされたまたはコートされていない粒子を存在させることもできるが、この手法は粒子の実質的に完全なコーティングをもたらすであろう。
【００５３】
（Ｃ．リン酸カルシウムナノ粒子を用いる方法）
本発明は、生物学的に活性なマクロ分子を必要とする対照を治療する方法も提供し、該方法は、本明細書中に記載されたリン酸カルシウムナノ粒子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００５４】
本発明の組成物の投与は、経口、静脈内、皮下、吸入を介する、動脈内、筋肉内、心臓内、心室内、非経口、クモ膜下腔内、および腹腔内を含めた当該分野で知られたいずれの手段によることもできる。投与は、全身、例えば静脈内または局所にて行うものとする。
【００５５】
本発明のナノ粒子および医薬組成物は、それを必要とする対象に投与することができる。「対象」は哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定されるものではないが、（ウシのような）家畜、スポーツ動物、（ネコ、イヌ、ウマのような）ペット、霊長類、マウスおよびラットを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、医薬組成物のリン酸カルシウムナノ粒子は腸溶コーティングを含む。腸溶コート粒子は適当には経口経路によって投与することができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物はインスリンを含んでカプセル化された腸溶コートリン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、糖尿病または高血糖症を治療するために、溶液、カプセル、錠剤および粉末の形態で経口により対象に投与することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、医薬組成物はインターフェロンを含んでカプセル化された腸溶コートリン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、ウイルス感染、癌、自己免疫疾患を治療するために、溶液、カプセル、錠剤および粉末の形態で経口により対象に投与することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、エリスロポエチンを含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、貧血を治療するために、または赤血球細胞レベルを上昇させるために、溶液、カプセル、錠剤または粉末の形態で対象に経口投与することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、Ｇ−ＣＳＦを含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、化学療法または他の理由によって引き起こされた好中球減少症を治療するために、溶液、カプセル、錠剤または粉末の形態で対象に経口投与することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ヒト成長ホルモンを含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、小人症、成人成長ホルモン欠乏、るいそう、およびひどい負傷のような成長ホルモンの補充を必要とする疾患を治療するために、溶液、カプセル、錠剤または粉末の形態で対象に経口投与することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を含んでカプセル化された腸溶被覆リン酸カルシウム粒子を含む。医薬組成物は、溶液、カプセル、錠剤および粉末の形態で対象に経口投与することができる。経口ＰＴＨ組成物は、骨粗鬆症、またはＰＴＨ投与を必要とする他の障害を治療するのに用いることができる。
【００６３】
本発明の粒子は、アレルゲンまたは他の抗原性物質を送達するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、アレルゲンまたは抗原を含んでカプセル化されたリン酸カルシウムナノ粒子を含む。医薬組成物は、対象において免疫応答を誘導し、対象へのアレルゲンの制御された放出を供するために、または対象においてアレルギー性脱感作を誘導するために、対象に投与することができる。粒子は吸入を介して、または粘膜を横切って皮下投与することができる。粒子は、スプレイ、エアロゾル、軟膏、点眼剤、ゲル、懸濁液、カプセル、坐薬、含浸タンポン、またはその組合せとして送達することができる。
【００６４】
本発明の粒子は、粘膜免疫保護、粘膜ワクチン送達、または粘膜薬物送達のために粘膜表面へ生物学的に活性なマクロ分子を送達するのに用いることができる。生物学的に活性なマクロ分子の非限定的な例としては、以下：抗原性物質、天然免疫増強因子、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド物質、インスリンのような治療薬物、または粘膜表面に投与された場合に治療効果を有することができるいずれかの他の組成物の１以上が挙げられる。粒子はいずれかの生物学的に許容できる賦形剤と複合体化することができ、経口、肺内、鼻腔内、直腸、眼内のような粘膜表面を介して投与することができる。
【００６５】
本発明の粒子は、目の障害を治療するために、生物学的に活性なマクロ分子を目の表面に送達するのに用いることができる。例えば、治療蛋白質もしくはペプチド、または治療効果を有することができる他の成分を粒子中にカプセル化し、目の表面に投与することができる。治療することができる目の障害または疾患は、限定されるものではないが、緑内障、ブドウ膜炎、色素性網膜炎、黄斑変性、網膜障害、網膜血管病、および他の血管異常、眼内炎、感染症、炎症性であるが感染性でない障害、目の虚血性症候群、末梢網膜変性、網膜変性、脈絡膜障害および腫瘍、ガラス体障害、および炎症性光学神経障害が挙げられる。
【００６６】
以下の実施例は説明目的のためだけに含めるものであり、本発明の範囲を限定する意図のものではない。リン酸カルシウムナノ粒子は、本出願で詳細に説明された種々の実施形態で調製することができる。以下の非限定的例は、種々の実施形態の典型的な結果を示す。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
音波処理でのリン酸カルシウム粒子の調製
２００ミリグラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、２３．２ｍｇのＢＳＡ、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、（１．４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭグルコース、２７５ｍＭ ＮａＣｌ、および４０ｍＭ ＢＥＳ、ｐＨ６．９６４を含有する）３ｍＬのＢＢＳ溶液を２０ｍＬの水溶液に溶解させた。該溶液は０．６１５のＯＤ２８０を有した。攪拌下で、０．３ｍＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。
【００６８】
沈殿が直ちに観察され、攪拌を室温にて一晩継続した。混合物を１５分間音波処理し、８０００ｒｐｍにおいて１５分間スピンダウンした。収集した粒子を真空下で乾燥し、回収を測定した。上清のＯＤ２８０は０．０８４であった。捕獲効率は以下の方程式によって見積もった：
効率（％）＝［１−上清のＯＤ２８０／出発溶液のＯＤ２８０］×１００
この場合、捕獲効率は８６％であった。
【００６９】
リン酸カルシウム粒子からのＢＳＡ放出を評価した。２０．６ｍｇのＢＳＡを負荷したリン酸カルシウム粒子を２０ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた。混合した後、２２ミクロ−遠心管を各々０．８ｍＬアリコットに設定した。全てのアリコットを３７℃にて揺動させた。以下の表１に示された各時点において、アリコットの３チューブを採取し、１４０００ｒｐｍにおいて１０分間スピンダウンさせた。上清を除去し、ＯＤ２８０を測定し、データを表１に示す。リン酸カルシウム粒子からのＢＳＡ放出は、ＰＢＳにおいて、４ないし８時間以内に実質的に完了した。
【００７０】
【表１】
音波処理無しでのＢＳＡ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子の調製
２００ミリグラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１０ｍｇのＢＳＡ、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｍＬのＢＢＳ溶液を２０ｍＬの水溶液に溶解させた。該溶液は０．３５０のＯＤ２８０を有した。攪拌下で、０．３ｍＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。
【００７１】
沈殿が直ちに観察され、８０００ｒｐｍにおいて１５分間スピンダウンすることによって粒子を回収した。収集された粒子を真空下で乾燥した。上清のＯＤ２８０は０．２２４であって、見積もられた捕獲効率は３６％であった。
【００７２】
デオキシコレートの存在下でのＢＳＡ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子の調製
２００ミリグラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１０ｍｇのＢＳＡ、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｍＬのＢＢＳ溶液および４０ｍｇデオキシコレートを２０ｍＬの水溶液に溶解させた。ＯＤ２８０は０．２９６であった。攪拌下で０．３ｍＬの２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を加えた。
【００７３】
沈殿が直ちに観察され、８０００ｒｐｍにおいて１５分間スピンアウトすることによって粒子を回収した。収集された粒子を真空下で乾燥した。上清のＯＤ２８０は０．０８４であり、見積もられた捕獲効率は７２％であった。
【００７４】
これらの２つの例は、デオキシコレートが同一条件下でカプセル化効率を実質的に上昇させることを示す。
【００７５】
濾過によるＢＳＡ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子の調製
１グラムのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、４０ｍｇのＢＳＡ、１２ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６、および１６０ｍｇのデオキシコール酸ナトリウムを２０ｍＬの水に溶解させた。添加前に、デオキシコレートを１ｍＬのエタノールに溶解させた。ＯＤ２８０は１．３４９であった。攪拌下で、２０ｍＬの７２ｍＭ ＣａＣｌ２を加えた。２分後に、混合物を真空下で２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ膜に濾過した。膜を真空下で乾燥し、カルシウムナノ粒子を回収した。濾液のＯＤ２８０は０．１４２であって、捕獲効率は８２％であった。
【００７６】
（実施例２）
エリスロポエチン（ＥＰＯ）負荷腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子の製造
ＥＰＯ試料（１．２ｍｇ／ｍＬの１ｍＬ）を１Ｌの水に対して４℃にて一晩透析し、最終容量は１．３ｍＬであった。４００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１．３ｍＬのＥＰＯ、６ｍＬのＢＢＳ、ｐＨ６．９６４、および２ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を合計４０ｍＬの溶液に混合した。ＯＤ２８０は０．０７０であった。攪拌下で、６０ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。沈殿が直ちに観察され、攪拌を室温にて１時間継続した。
【００７７】
溶液を８０００ｇにおいて、１０分間スピンダウンして、粒子を収集した。溶液のＯＤ２８０は０．０３３と測定され、全ての粒子を真空下で乾燥した。捕獲効率は５３％と見積もられた。
【００７８】
ＥＰＯ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子をセルロースアセテートフタレートで被覆した。３０ｍｇのＥＰＯ−負荷リン酸カルシウムナノ粒子を、アセトン：エタノール（９５：５）中の０．５ｍＬの１０％セルロースアセテートフタレートに懸濁させた。１．５ｍＬのパラフィン油を加え、攪拌し、続いて、６ｍＬのクロロホルムを加えることによって混合した。粒子をＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）で回収し、クロロホルムで洗浄した。粒子を真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕した。
【００７９】
１ｍｇ粒子被覆リン酸カルシウムナノ粒子を採取することによってＥＰＯ負荷を測定し、室温にて４時間で０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁させた。１４０００ｒｐｍにおいてスピンダウンした後、上清中のＥＰＯ濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）で測定した。ＥＰＯ負荷は３６００ＩＵ／ｍｇであった。
【００８０】
（実施例３）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口エリスロポエチン（ＥＰＯ）のイン・ビボの活性
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口ＥＰＯの活性を、ヘマトクリットを測定することによって正常なＢａｌＢ／ｃマウスにおいて評価した。
【００８１】
動物。９匹の６ないし８週齢雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に与えた。光サイクルを１２時間毎に設定した。
【００８２】
処理。マウスを、３匹のマウスを各群に入るように、３つの群に任意に分けた。ビヒクル群を０．５ｍＬビヒクル溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）で毎日１回５日間胃管栄養に付した。皮下（ＳＣ）注射群にビヒクル中の５０ＩＵ ＥＰＯを毎日１回５日間注射した。経口群は０．５ｍＬのビヒクル溶液中の１０００ＩＵ ＥＰＯで毎日１回５日間胃管栄養に付した（ｇａｒｖａｇｅｄ）。２日に、全てのマウスに１０ｍｇ鉄デキストランの腹腔内注射を与えた。
【００８３】
１０日に、血液試料を眼球後ろ穿刺から吸い取り、ヘパリン処理したキャピラリチューブを用いて、血液試料を収集した。キャピラリチューブを３０００ｒｐｍにおいて２０分間スピンダウンし、全血中の赤血球細胞画分の比率によってヘマトクリット（ＨＣＴ）を計算した。結果を以下の表２に示す。両側および不均等偏差ｔ−検定を、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートプログラムにおいて形成関数で行った。
【００８４】
【表２】
データは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口送達されたＥＰＯが活性であり、ＨＣＴ値を有意に増大させたことを示唆する。
【００８５】
（実施例４）
腸溶被覆顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
カプセル化および生物学的効果に対するデオキシコレートのデュアル効果を次の２つの試料で説明する。
【００８６】
デオキシコレートの不存在下におけるＧ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
１．９ｍｇ／ｍＬ試料の２０ｍＬのＧ−ＣＳＦを３Ｌの水に対して４℃にて一晩透析し、最終Ｇ−ＣＳＦ濃度は１．５ｍｇ／ｍＬであった。２００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、２．５ｍＬのＧ−ＣＳＦ、３ｍＬのＢＢＳ、ｐＨ６．９６４、１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を混合し、蒸留水中に２０ｍＬに調製した。ＯＤ２８０は０．１４５であった。攪拌下、３００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、沈殿が直ちに観察された。攪拌を１０分間継続し、粒子はポリトロンホモゲナイザーで１０分間ホモゲナイズし、８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンすることによって回収した。上清のＯＤ２８０は０．０３３であって、捕獲効率は７７％であった。粒子を真空下で乾燥した。
【００８７】
Ｇ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を腸溶ポリマーのセルロースアセテートフタレートで被覆した。１７ｍｇの粒子を４００ｕＬの、９５：５アセトン：エタノール中の１０％セルロースアセテートフタレートに懸濁させた。ボルテックスによって混合した後、攪拌しつつ２０ｍＬのパラフィン油を加え、１分後に７．５ｍＬのクロロホルムを加えた。被覆した粒子を濾過によってＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）に回収し、クロロホルムで洗浄した。被覆粒子を真空下で乾燥し、粉砕した。
【００８８】
デオキシコレートの存在下でのＧ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウム粒子の製造
２００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、２．５ｍＬのＧＣＳＦ、６５．９ｍｇのデオキシコレート、３ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、および１ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を溶解させ、２０ｍＬに調整した。デオキシコレートを添加前に１ｍＬエタノールに溶解させた。ＯＤ２８０は０．１０６であった。攪拌下に、３００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、沈殿が直ちに観察された。攪拌を１０分間継続し、粒子をポリトロンホモゲナイザーで５分間ホモゲナイズし、８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンすることによって回収した。上清のＯＤ２８０は０．００８であった。カプセル化効率は９２％であった。粒子を真空下で乾燥した。
【００８９】
Ｇ−ＣＳＦ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を腸溶ポリマーのセルロースアセテートフタレートで被覆した。５８ｍｇの粒子を、１．２ｍＬの、９５：５アセトン：エタノール中の５％セルロースアセテートフタレートに懸濁した。渦巻かせることによって混合させた後、攪拌しつつ２０ｍＬのパラフィン油を加え、１分後に７．５ｍＬのクロロホルムを加えた。被覆された粒子が濾過によってＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）に回収され、クロロホルムで洗浄した。被覆された粒子を真空下で乾燥し、粉砕した。
【００９０】
該実施例は、もし粒子がデオキシコレートの存在下で調製されるならば捕獲効率は有意に改良することができることを示す。
【００９１】
（実施例５）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦのイン・ビボ活性
経口Ｇ−ＣＳＦの活性を、正常なＢａｌｂ／Ｃマウスにおける処理の後に、白血球細胞の数をカウントすることによって測定した。
【００９２】
動物。１８匹の６ないし８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に与えた。光サイクルは１２時間毎に設定した。
【００９３】
処理。マウスを任意に４つの群に分けた。ビヒクルおよびＳＣＧ群は４匹のマウスを有し、ＣＡＰおよびＣＡＰＤ群が、各々、５匹のマウスを有した。ビヒクル群を０．５ｍＬの１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．０で処理した。ビヒクル中の１００ｕｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦの０．１ｍＬ皮下注射でＳＣＧを処理した。ＣＡＰ群を、２ｍｇ／ｋｇＧ−ＣＳＦにて、１ｍＬのビヒクル中の腸溶被覆リン酸カルシウム粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦで処理した。ＣＡＰＤは、デオキシコレートの存在下で調製された腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦであった。用量はＣＡＰ群と同一であった。
【００９４】
マウスを毎日４日間処理し、血液試料を５日に吸い取って、全白血球細胞カウントを決定した。赤血球細胞を溶解させ、顕微鏡を用いて全白血球細胞カウントを測定した。ｔ−検定の形成関数にてＥｘｃｅｌスプレッドシートプログラムを用いてデータを解析した。
【００９５】
【表３】
データは、注射された、および経口送達されたＧ−ＣＳＦがより高い白血球細胞カウントを有意に達成したことを示唆する。加えて、デオキシコレートの存在下で調製されたリン酸カルシウムナノ粒子がより大きなＧ−ＣＳＦ活性を送達し、デオキシコレート無しのそれよりもより高い白血球細胞カウントを達成した。
【００９６】
（実施例６）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦの生物−同等性
動物。１０匹の８ないし１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルは１２時間毎に設定した。
【００９７】
処理。ラットを任意に３つの群に分け、２匹のラットはビヒクル群（Ｖ）、４匹のラットは注射（Ｇ）および経口Ｇ−ＣＳＦ処理（Ｄ）群とした。処理スケジュールは以下の表４にリストする。Ｖは１０ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．０のビヒクルであった。Ｇは皮下注射群であった。Ｄは、デオキシコレートの存在下で調製された腸溶被覆リン酸カルシウム粒子中の経口Ｇ−ＣＳＦであった。
【００９８】
【表４】
ラットを処理し、血液試料を０、４、８、１２および２６時間における所定の時点で吸い取った。赤血球細胞を溶解させ、顕微鏡を用いて全白血球細胞カウントを決定した。
【００９９】
図１は各時点における白血球細胞のカウントを示す。注射された、および経口送達されたＧ−ＣＳＦについての曲線下面積を見積もり、経口送達されたＧ−ＣＳＦの生物−同等性は皮下経路の８．５％と見積もられた。
【０１００】
（実施例７）
腸溶被覆インターフェロンアルファ（ＩＦＮ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
４００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、１．３ｍＬのＩＦＮ、６ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、および２ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を合計４０ｍＬの水溶液中で混合した。ＯＤ２８０は０．０８２であった。攪拌下で、６００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、沈殿が直ちに観察された。攪拌を１０分間継続し、粒子を１５分間音波処理し、８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンした。上清のＯＤ２８０は０．０３３であった。捕獲効率は６０％であった。真空下での乾燥の後、３５．２ｍｇ粒子が回収された。
【０１０１】
ＩＦＮ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を腸溶ポリマーのセルロースアセテートフタレートで被覆した。３２ｍｇの粒子を、６４０ｕＬの、９５：５アセトン：エタノール中の５％セルロースアセテートフタレートに懸濁した。ボルテックスによって混合した後、２０ｍＬパラフィン油を攪拌しつつ加え、１分後に７．５ｍＬのクロロホルムを加えた。被覆された粒子をＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）への濾過によって回収し、クロロホルムで洗浄した。被覆された粒子を真空下で乾燥し、粉砕した。
【０１０２】
（実施例８）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子における経口ＩＦＮの生物学的利用性
動物。２匹の８ないし１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルは１２時間毎に設定した。
【０１０３】
処理。１匹のマウスを、１００ｕＬの１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．０中の皮下注射を介して１６０万ＩＵ ＩＦＮで処理した。他のラットを、１ｍＬのビヒクル溶液中のリン酸カルシウム粒子中の１６００万ＩＵ ＩＦＮでの胃管栄養に付した。
【０１０４】
血液試料を−０．５、０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４時間の所定の時点で吸い取った。血清をＥＬＩＳＡ分析のために貯蔵した。
【０１０５】
図２は各時点において血清ＩＦＮレベルを示す。注射された、および経口送達されたＩＦＮについての曲線下面積を見積もり、経口送達されたＩＦＮの生物学的利用性は皮下経路の１０．２％と見積もられた。
【０１０６】
（実施例９）
腸溶被覆インスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
フミリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）を薬局で購入した。１８０ｍＬのインスリン試料（６４２ｍｇ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（４．６ｃｍ×１００ｃｍ、１．７Ｌのベッド容量）にて蒸留水に交換した。ＯＤ２８０をモニターし、第一のピークを収集した。全３００ｍＬ試料を回収し、ＯＤ２８０は２．０２２であった。
【０１０７】
５ｇのＰＥＧ（ＭＷ １００００、Ｆｌｕｋａ）、６００ｍｇのインスリン、１．６ｇのデオキシコレート、４０ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、１９．２ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を混合し、蒸留水で４００ｍＬに調整した。デオキシコレートを添加前に１０ｍＬのエタノールに溶解させた。ＯＤ２８０は１．８６８であった。攪拌下で、４００ｍＬの３６ｍＭ ＣａＣｌ２を混合し、形成された粒子を直ちに２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ膜に濾過した。濾液のＯＤ２８０は０．０２２であって、カプセル化効率は９８．２％であった。粒子を真空下で乾燥し、回収された粒子の全量は１．８ｇであった。
【０１０８】
蛋白質成分を省略した以外は同一の手法により、ブランクのナノ粒子を調製した。インスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子およびブランクのリン酸カルシウムナノ粒子双方を、Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｌａｂｓによる走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）調査に付した。ＳＥＭのイメージは図３Ａおよび３Ｂに示す。ブランクのリン酸カルシウムナノ粒子は、平均直径が２００ｎｍである球形の単分散かつ中空形態を呈した（図３Ａ）。対照的に、インスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍの、球形および単分散形態を示した（図３Ｂ）。
【０１０９】
腸溶コーティングでは、０．５ｇのインスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子を、０．５ｇセルロースアセテートフタレートを含有する５ｍＬのアセトン：エタノール（９５：５）に懸濁させた。混合した後、１５ｍＬのパラフィン油を加え、混合し、続いて、５０ｍＬのクロロホルムを加えた。粒子をＷｈａｔｍａｎ濾紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）への濾過によって集め、クロロホルムで洗浄した。粒子を真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕した。１ｍｇ粒子からの放出インスリンを室温にて３時間１ｍＬＰＢＳ中に採取することによって、インスリン含有量を測定した。標準としてのインスリンでのＬｏｗｒｙ蛋白質アッセイを用いて、放出媒体中のインスリン濃度を測定した。
【０１１０】
（実施例１０）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンの生物−同等性
動物モデル。３５匹の８ないし１０週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルを１２時間毎に設定した。
【０１１１】
ラットを２０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ４．５中の６０ｍｇ／ｋｇストレプトゾシンで腹腔内注射した。ストレプトゾシンから８時間後に、１ｍＬの５％グルコースを腹腔内投与した。２週間後に、絶食血中グルコースレベルを測定した。絶食血中グルコースは２４匹のラットにおいて＞３００ｍｇ／Ｄ１であり、これを引き続いての試験で用いた。
【０１１２】
処理。１６匹のラットを任意に３つの群に分けた。インスリン溶液（ＯＩ−５０、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）、およびインスリン注射（ＳＣＩ−５、「注射」）群は共に、各々、４匹の糖尿病ラットを有した。処理群（ＰＯ−５０、「Ｏｒａｌ」）を８匹のラットを有した。対照群には０．５ｍＬのビヒクル溶液中の５０ＩＵインスリン／ｋｇを経口にて与えた。注射群は０．５ｍＬビヒクル中の５ＩＵインスリン／ｋｇでの皮下注射を受けた。他の群には０．５ｍＬビヒクル溶液中の腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中に処方した５０ＩＵインスリン／ｋｇを経口で与えた。ビヒクル溶液は１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．０中の２％カルボキシメチル−セルロースであった。
【０１１３】
【表５−１】
一晩絶食させた後、ラットを処理し、０、１、３、６、１２および２４時間の時点で尾静脈を介して血液試料を吸い取った。血中グルコースをグルコメーター（ＳｕｒｅＳｔｅｐ）で測定した。
【０１１４】
図４は、糖尿病ラットにおける経口または皮下インスリンでの処理の後における各時点のパーセント血中グルコース変化を示す。皮下インスリンは血中グルコースレベルを迅速に降下させ、１２時間以内に正常に戻した。リン酸カルシウム粒子を送達した経口インスリンは、より徐々にかつ延長された血中グルコース低下効果を示した。傾向インスリンの生物−同等性は皮下インスリンと比べて１２％であった。
【０１１５】
（実施例１１）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンによる健康なボランティアでの血中グルコースの低下
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンの効果を評価するために、２人の健康なヒトボランティアを試験した。標準グルコース許容性試験を行った。各ボランティアを１２時間を超えて絶食させ、６８ｇのグルコースを摂取させた。血中グルコースを、グルコース摂取に関して、−３０、０、３０、６０、９０、１２０、１５０および１８０分においてＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターで測定した。測定の２つのサイクルを各ボランティアに対して行った。第一のサイクルはベースラインを確立するための標準グルコース許容性試験であった。各ボランティアは、第二のサイクルの間に、−３０分において腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の２００Ｕ経口インスリンを摂取した。
【０１１６】
第一のボランティアにおける血中グルコース変化を図５Ａに示す。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を介して送達された経口インスリンはピークおよびトラフ血中グルコースレベルを共に低下させた。
【０１１７】
第二のボランティアにおけるパーセント血中グルコース変化を図５Ｂに示す。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子を介して送達された経口インスリンはピーク血中グルコースレベルを低下させ、測定期間を通じて血中グルコース曲線を降下させた。
【０１１８】
この実験は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンがヒト対象において活性であり、血中グルコースを低下させることを示す。測定の間に有害反応は記録されなかった。
【０１１９】
（実施例１２）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンによる糖尿病患者の絶食血中グルコースの制御
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンの可能性を、さらに、糖尿病患者で評価した。その血中測定レベルを制御するために規則的にインスリン処置を受けた１９人のＩＩ型糖尿病患者を実験のために募った。３サイクルの評価を各患者で行った。
【０１２０】
第一のサイクルにおいては、各患者を１２時間を超えて絶食した。血中グルコースレベルを３０分毎に翌朝測定した。ＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターを用いて、血中グルコースレベルを測定した。ベースラインを確立させるためにこのサイクルにおいて処理は行わなかった。
【０１２１】
第二のサイクルにおいて、各患者を１２時間を超えて絶食させた。翌朝３０分毎に血中グルコースレベルを測定した。ＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターを用いて、血中グルコースレベルを測定した。各患者にはこのサイクルにおいては時間０で１０ＩＵフムリン皮下注射を与えた。
【０１２２】
第三のサイクルにおいては、各患者を１２時間を超えて絶食させた。血中グルコースレベルを翌朝３０分毎に測定した。ＳｕｒｅＳｔｅｐグルコメーターを用いて、血中グルコースレベルを測定した。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の１００ＩＵまたは２００ＩＵ経口インスリンいずれかをこのサイクルにおいて時間０に各患者に与えた。
【０１２３】
各患者についての測定の順序は任意であり、次のサイクル前で経口インスリン測定後に４８時間の洗浄期間があった。実験の後に、ベースライン測定のための１７の使用可能な患者データがあり、インスリン注射について１９の患者データがあり、１００ＩＵ経口インスリン処理について６つの患者データがあり、２００ＩＵ経口インスリン処理について１１の患者データがある。
【０１２４】
測定の各サイクルにおけるパーセント血中グルコース変化を図６に示す。処理なくして、血中グルコースレベルを上昇させ、観察期間の間に比較的安定に維持された。インスリン注射が血中グルコースの劇的な低下を生じた。事実、７名の患者は低血糖症を発症し、その血中グルコースレベルは５０ｍｇ／ｄＬ未満まで降下し、経口グルコースで処理しなければならなかった。対照的に、１００ＩＵまたは２００ＩＵ経口インスリンを摂取した患者は、ベースラインと比較して徐々ではあるが統計学的に有意な血中グルコースレベルの低下を示した。加えて、２００ＩＵ経口インスリンで処理した患者は血中グルコースのより大きな低下を示した。
【０１２５】
本実験は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口インスリンが、糖尿病患者において血中グルコースレベルを効果的にかつ用量−依存的に制御できることを示す。
【０１２６】
（実施例１３）
腸溶被覆ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
ｈＧＨ試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５脱塩カラムにて、蒸留水に交換した。ｈＧＨの量をＯＤ２８０測定および０．６８の光学係数にて計算した。２００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ１００００、Ｆｌｕｋａ）、８４ｍｇのｈＧＨ、１２ｍＭホスフェート、および３２０ｍｇのデオキシコレートを４０ｍＬの溶液に溶解させた。ＯＤ２８０は１．３０７と測定された。攪拌下で、４０ｍＬの７２ｍＭ ＣａＣｌ２を混合し、沈殿を直ちに２０ｎｍのＡｎｏｄｉｓｃ膜（Ｗｈａｔｍａｎ）に濾過した。濾液のＯＤ２８０は０．０３９であった。粒子を真空下で乾燥し、捕獲効率は、粒子形成の前および後でのＯＤ２８０測定に基づいて９５％であった。
【０１２７】
腸溶被覆のために、３００ｍｇのｈＧＨ負荷リン酸カルシウムナノ粒子を、４ｍＬの、９５：５アセトン：エタノール中の１０％セルロースアセテートフタレートに懸濁させた。混合の後に、６ｍＬのパラフィン油を加え、混合し、続いて１８ｍＬのクロロホルムを加えた。粒子をＷｈａｔｍａｎ紙（Ｃｈｒ ３ｍｍ）に濾過し、クロロホルムで洗浄した。粒子を真空下で乾燥し、均一なサイズまで粉砕した。
【０１２８】
１ｍｇの粒子を１ｍＬのＰＢＳに加え、室温にて３時間インキュベートすることによって、ｈＧＨ含有量を測定した。標準としてのｈＧＨでのＬｏｗｒｙ蛋白質アッセイを用いて、放出媒体中のｇＧＨの濃度を測定した。
【０１２９】
（実施例１４）
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口ヒト成長ホルモンによる体重増加の促進
腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の経口ｈＧＨ活性を下垂体切除ラットで試験し、これは成長ホルモン活性についての標準的なアッセイである。
【０１３０】
動物モデル。下垂体切除外科的処置を受けた２０匹の６週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）を換気された部屋に収容した。食物および水を自由に供給した。光サイクルを１２時間毎に設定した。各ラットの体重を毎日モニターした。
【０１３１】
処理。２０匹のラットを任意に３つの群に分けた。各々、ビヒクルおよび注射群に４匹の動物とした。処理群は１２匹のラットを有した。ビヒクル群をパラフィン油で処理した。ラットを毎朝処理し、体重を毎夕方測定した。
【０１３２】
【表５−２】
図７は、下垂体切除ラットにおける経口または皮下ｈＧＨでの処理の後における正味の体重増加を示す。皮下ｈＧＨの結果、実質的に正味の体重増加が得られ、他方、ビヒクル処理は体重のわずかな低下を生じる。腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子で送達された経口ｈＧＨは有意な体重を生じ、これは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子における経口ｈＧＨが生物学的に活性であることを示す。
【０１３３】
（実施例１５）
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）負荷リン酸カルシウムナノ粒子の製造
副甲状腺ホルモン１−３４（ＰＴＨ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５脱塩カラムにて、蒸留水に交換した。４００ｍｇのＰＥＧ（ＭＷ １００００、Ｆｌｕｋａ）、６ｍＬのＢＢＳ溶液、ｐＨ６．９６４、および２ｍＬの１２５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を４０ｍＬの溶液中で混合した。ＯＤ２８０は０．０８２として測定された。攪拌下で、６００ｕＬの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を加えた。沈殿が直ちに観察され、粒子を８０００ｇにて１０分間スピンダウンした。上清のＯＤ２８０は０．０３３であった。粒子を真空下で乾燥した。捕獲効率は、粒子形成の前および後におけるＯＤ２８０測定に基づいて５９％と見積もられた。
【０１３４】
（実施例１６）
ＢＣＧ負荷リン酸カルシウムナノ粒子の多糖＆核酸抽出物の製造
Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ−ＰＳＮ）の多糖および核酸抽出物は免疫変調活性を有する。ＢＣＧ−ＰＳＮは多糖および核酸を共に含有し、これを用いて、化合物のこのクラスにおけるリン酸カルシウムナノ粒子の利用性を示す。
【０１３５】
ＢＣＧ−ＰＳＮはＣｈｅｎｇｄｕ Ｒｏｎｇｓｈｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．（Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｃｈｉｎａ）から粉末形態を得られた。１ｍｇのＢＣＧ−ＰＳＮ、５０ｍｇのＰＥＧ（Ｆｌｕｋａ、ＭＷ１００００）０．２５ｍＬのＢＢＳ、ｐＨ６．９６４、および０．７５ｍＬの１２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を２０ｍＬの溶液に混合した。ＯＤ２６０は０．２２であって、多糖含有量はＡｎｔｈｒｏｎｅ方法によって測定した。
【０１３６】
攪拌下で、７５ｕＬの５Ｍ ＣａＣｌ２を加え、室温にて１時間、攪拌を継続した。粒子を８０００ｇにおいて１０分間スピンダウンした。上清のＯＤ２６０は０．０であって、多糖の濃度は２２．１ｕｇ／ｍＬであった。カプセル化効率は核酸成分については１００％であって、多糖成分については約６３％であった。粒子を真空下で乾燥した。
【０１３７】
前記実施例は説明目的のためだけに含め、本発明の範囲を限定する意図のものではない。前記したものに対する多くの変形は可能である。前記した実施例に対する修飾および変形は当業者に明らかであるため、本発明は添付の請求の範囲の範囲によってのみ制限されることを意図する。
【０１３８】
【表６−１】
【０１３９】
【表６−２】
【０１４０】
【表６−３】
【０１４１】
【表６−４】
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「Ｄ」）中のビヒクル（「Ｖ」）、Ｇ−ＣＳＦ ｓｃ注射（「Ｇ」）または経口Ｇ−ＣＳＦで処理されたラットにおける白血球細胞カウントを示すグラフである。
【図２】図２は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「Ｏ１６Ｍ」）中のインターフェロンｓｃ注射（「ＳＣ１．６Ｍ」）または経口インターフェロンでの処理の後における、ラットでの血清中インターフェロン濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、走査型電子顕微鏡下でのリン酸カルシウムナノ粒子のイメージを示す。図３Ａは、５０００倍率におけるブランクリン酸カルシウムナノ粒子のイメージを示す。図３Ｂは、５０００倍率におけるインスリン負荷リン酸カルシウムナノ粒子のイメージを示す。
【図４】図４は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「Ｏｒａｌ」）中の経口インスリン溶液（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）、皮下インスリン注射（「Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」）および経口インスリンで処理された糖尿病ラットにおけるパーセント血中グルコース変化を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の２００ＩＵを含む（「Ｏｒａｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ」）または含まない（「Ｎｏ Ｒｘ」）６８ｇ経口グルコース摂取後の健康なボランティア１での血中グルコース変化を示すグラフである。図５Ｂは、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の２００ＩＵ経口インスリンを含む（「Ｏｒａｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ」）または含まない（「Ｎｏ Ｒｘ」）６８ｇ経口グルコース摂取後における健康なボランティア２でのパーセント血中グルコース変化を示すグラフである。
【図６】図６は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子中の処理無し（「Ｂｌａｎｋ」）、１０ ＩＵインスリン注射（「ＳＣ１０」）、または１００ＩＵ（「ＰＯ１００」）または２００ＩＵ（「ＰＯ２００」）経口インスリンを受けた糖尿病を持つボランティアでのパーセント血中グルコースを示すグラフである。
【図７】図７は、腸溶被覆リン酸カルシウムナノ粒子（「ＰＯ５０」）中のビヒクル（「Ｖ」）、成長ホルモン注射（「ＳＣ２０」）または経口成長ホルモンで処理された下垂体切除ラットでの正味の体重増加を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）リン酸カルシウムナノ粒子のコア；
ｂ）該コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子；および
ｃ）該コア粒子にカプセル化された胆汁酸を含む表面修飾剤；
を含む粒子。
【請求項２】
該コア粒子の直径が約３００ｎｍ未満である請求項１記載の粒子である。
【請求項３】
該胆汁酸がコレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、およびケノデオキシコレートよりなる群から選択される請求項１記載の粒子。
【請求項４】
該粒子が、さらに、腸溶コーティングを含む請求項１記載の粒子。
【請求項５】
該生物学的に活性なマクロ分が、蛋白質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、脂質、および炭水化物よりなる群から選択される請求項１記載の粒子。
【請求項６】
該蛋白質または該ポリペプチドが、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、および顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）よりなる群から選択される請求項５記載の粒子。
【請求項７】
該生物学的に活性なマクロ分子が、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、およびＧ−ＣＳＦよりなる群から選択される請求項４記載の粒子。
【請求項８】
該生物学的に活性なマクロ分子が、家塵ダニ、動物フケ、黴、花粉、ブタクサ、ラテックス、スズメバチ毒および昆虫−由来アレルゲン、およびそのいずれかの組合せよりなる群から選択されるアレルゲンである請求項１記載の粒子。
【請求項９】
該粒子がエアロゾルの形態に適合される請求項１記載の粒子。
【請求項１０】
該粒子が、生物学的に活性なマクロ分子を粘膜表面に送達するように適合される請求項１記載の粒子。
【請求項１１】
該粒子が、目の障害の治療のためにそれを必要とする対象の目の表面に生物学的に活性なマクロ分子を送達するように適合される請求項１記載の粒子。
【請求項１２】
請求項１記載の粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項４記載の粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項７記載の粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
リン酸カルシウムの１以上の粒子の製造方法であって、該方法は：
ａ）胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下でカルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させ；
ｂ）所望のサイズのリン酸カルシウム粒子が得られるまで溶液を混合し；次いで、
ｃ）粒子を回収する；
ことを含む該製法。
【請求項１６】
該カルシウム塩の濃度が約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である請求項１５記載の製法。
【請求項１７】
該リン酸塩の濃度が約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該粒子が３００ｎｍ未満の直径を有する請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
さらに、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で、カルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させる前に、リン酸塩の水溶液またはカルシウム塩の水溶液に生物学的に活性なマクロ分子を加えることを含み、ここで、リン酸カルシウム粒子はマクロ分子と共結晶化される請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
該胆汁酸が、コレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、またはケノデオキシコレートよりなる群から選択される請求項１４記載の製法。
【請求項２１】
生物学的に活性なマクロ分子を必要とする対象を治療する方法であって、該方法は、請求項１記載の医薬組成物を対象に投与することを含む該方法。
【請求項１】
ａ）リン酸カルシウムナノ粒子のコア；
ｂ）該コア粒子にカプセル化された生物学的に活性なマクロ分子；および
ｃ）該コア粒子にカプセル化された胆汁酸を含む表面修飾剤；
を含む粒子。
【請求項２】
該コア粒子の直径が約３００ｎｍ未満である請求項１記載の粒子である。
【請求項３】
該胆汁酸がコレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、およびケノデオキシコレートよりなる群から選択される請求項１記載の粒子。
【請求項４】
該粒子が、さらに、腸溶コーティングを含む請求項１記載の粒子。
【請求項５】
該生物学的に活性なマクロ分が、蛋白質、ポリペプチド、多糖、核酸、ポリヌクレオチド、脂質、および炭水化物よりなる群から選択される請求項１記載の粒子。
【請求項６】
該蛋白質または該ポリペプチドが、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、および顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）よりなる群から選択される請求項５記載の粒子。
【請求項７】
該生物学的に活性なマクロ分子が、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロン、成長ホルモン、およびＧ−ＣＳＦよりなる群から選択される請求項４記載の粒子。
【請求項８】
該生物学的に活性なマクロ分子が、家塵ダニ、動物フケ、黴、花粉、ブタクサ、ラテックス、スズメバチ毒および昆虫−由来アレルゲン、およびそのいずれかの組合せよりなる群から選択されるアレルゲンである請求項１記載の粒子。
【請求項９】
該粒子がエアロゾルの形態に適合される請求項１記載の粒子。
【請求項１０】
該粒子が、生物学的に活性なマクロ分子を粘膜表面に送達するように適合される請求項１記載の粒子。
【請求項１１】
該粒子が、目の障害の治療のためにそれを必要とする対象の目の表面に生物学的に活性なマクロ分子を送達するように適合される請求項１記載の粒子。
【請求項１２】
請求項１記載の粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項４記載の粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項７記載の粒子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
リン酸カルシウムの１以上の粒子の製造方法であって、該方法は：
ａ）胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下でカルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させ；
ｂ）所望のサイズのリン酸カルシウム粒子が得られるまで溶液を混合し；次いで、
ｃ）粒子を回収する；
ことを含む該製法。
【請求項１６】
該カルシウム塩の濃度が約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である請求項１５記載の製法。
【請求項１７】
該リン酸塩の濃度が約５ｍＭおよび約２００ｍＭの間である請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
該粒子が３００ｎｍ未満の直径を有する請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
さらに、胆汁酸を含む表面修飾剤の存在下で、カルシウム塩の水溶液をリン酸塩の水溶液と接触させる前に、リン酸塩の水溶液またはカルシウム塩の水溶液に生物学的に活性なマクロ分子を加えることを含み、ここで、リン酸カルシウム粒子はマクロ分子と共結晶化される請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
該胆汁酸が、コレート、デオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、タウロデオキシコレート、ウルソデオキシコレート、タウロウルソデオキシコレート、またはケノデオキシコレートよりなる群から選択される請求項１４記載の製法。
【請求項２１】
生物学的に活性なマクロ分子を必要とする対象を治療する方法であって、該方法は、請求項１記載の医薬組成物を対象に投与することを含む該方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５２２２２８（Ｐ２００７−５２２２２８Ａ）
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５３２３２（Ｐ２００６−５５３２３２）
【出願日】平成１７年２月１１日（２００５．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４６３７
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０６２７４３０５）ノッド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１１日（２００５．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４６３７
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０６２７４３０５）ノッド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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