レーザー走査型顕微鏡
【課題】偏光異方性の高い検出能力を備えたレーザー走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明の上記課題は、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、前記、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することで解決される。
【解決手段】本発明の上記課題は、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、前記、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することで解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡の技術分野に係り、特にHomo-FRET (Homo-Fluorescence resonance energy transfer)などによる偏光異方性を検出する顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の顕微鏡観察では、標本の形状のみならず、生きた状態の標本における生体反応の観察が主流となりつつある。この観察の一つの例として、Homo-FRET (Homo-Fluorescence Resonance Energy Transfer)を利用した蛍光観察法が知られている。
【０００３】
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）とは、蛍光分子である２つの供与体（Donor）分子と受容体（Acceptor）分子によって起こされる現象であり、励起光によって励起された供与体分子が、近接している受容体分子にむけて励起エネルギーを移動させ、基底状態にある受容体分子が励起され蛍光を放射するという現象である。このFRETが起こる為には、供与体と受容体が近接している事（1〜10nm程度）などの条件を満たす必要がある。そこで、この条件と標本内の生体反応を結びつけることで標本の生体活動を観察することができる。
【０００４】
例えば、カルシウムイオンのような生体活動に密接な物質と反応し、供与体（Donor）分子と受容体（Acceptor）分子の距離が変化する試薬を用いることでカルシウムイオンの存在、分布、変化などをとおして生体活動を観察することができる。
【０００５】
この供与体と受容体が、互いに異なる蛍光分子で構成した場合を「Hetero-FRET」、互いに同じ蛍光分子で構成した場合を「Homo-FRET」と呼んで区別する。「Hetero-FRET」と「Homo-FRET」は観察手法という観点から見ても大きく異なる。
【０００６】
Hetero-FRETでは、互いに異なる蛍光分子間のエネルギー転移が起こり、放射される蛍光のスペクトルが異なる。つまり、供与体（Donor）の持っている発光波長の代わりに受容体（Acceptor）の発光波長が検出される。そこで、供与体（Donor）からの蛍光と受容体（Acceptor）からの蛍光を波長によって区別することができ、その蛍光の発光量を調べることによってHetero-FRETが起きているかどうかを観察することができる。
【０００７】
しかし、Homo-FRETでは、供与体（Donor）と受容体（Acceptor）が同じ種類の蛍光分子であり蛍光波長が同じであるために波長の違いによって観察をすることができない。
そこでHomo-FRETの観測は、偏光異方性を利用することで行われる。直線偏光の励起光を用いて蛍光分子を励起すると、射出される蛍光も同じ偏光異方性を持つという性質がある。しかし、励起から蛍光を射出する間にFRETが起こると偏光異方性が崩れる。したがって、直線偏光の入射に対して射出される蛍光の偏光の保存のされ方を観察することでHomo-FRETを観察することができる。
【０００８】
通常の偏光異方性の観察には、入射側の直線偏光と平行な直線偏光に対して垂直な直線偏光を観察し、その比をもって偏光異方性の崩れた度合いを測る。そのために従来の偏光異方性の観測では、蛍光の光路中に偏光ビームスプリッターを備えることによって平行な直線偏光と垂直な直線偏光とを分離して観測している。
【０００９】
しかしながら、Homo-FRETの偏光異方性の観察には高いSN比が求められ、従来の構成では十分な観測ができなかった。また、LSM（レーザー走査型顕微鏡）では特に高い精度の偏光異方性の検出が必要となる。
【非特許文献１】Biophysical Journal Volume 80 June 2001 3000-3008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明では、上記の技術的問題に鑑み、偏光異方性の高い検出能力を備えたレーザー走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の上記課題は、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、前記偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することで解決される。
【００１２】
また、前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には第一のファイバーケーブルと第二のファイバーケーブルが備えられ、前記互いに直交する角度の直線偏光が互いに異なるファイバーケーブルを通過する構成とする。
【００１３】
さらに、前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には１本のファイバーケーブルが備えられ、前記互いに直交する角度の直線偏光が同一のファイバーケーブルを通過する構成とする。
【００１４】
そして、前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記第一のファイバーケーブルに導き、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光のうちで前記第一の直線偏光と直交するものを前記第二のファイバーケーブルに導く構成とすることが好ましい。
【００１５】
また、前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記ファイバーケーブルに導き、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光のうちで前記第一の直線偏光と直交するものを前記ファイバーケーブルに導く構成とすることが望ましい。
【００１６】
ここで、前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長フィルターであることが望ましい。また、前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長素子であることも可能である。前記偏光分離光学素子はホログラフィック格子であることも考えられる。
【００１７】
本発明の別の実施形態としては、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、互いに直交する角度の直線偏光をピクセル毎に切り換えることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明のさらなる実施形態としては、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、互いに直交する角度の直線偏光をフレーム毎に切り換えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、互いに直交した直線偏光を照射することで偏光異方性の高い検出能力を備える。
また、本発明は従来のレーザー走査型顕微鏡の構成を大幅に変更することがなく実施できる。
【００２０】
さらに、直線偏光を高速に切り換えることができるので、生体反応が速い試料内の分子運動の影響を減らすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のレーザー走査型顕微鏡およびレーザー走査方法の実施形態を図面を参照しながら説明する。
最初に、Homo-FRETによって偏光異方性が崩れることに関する説明をする。
【００２２】
典型的なHomo-FRETの観察方法としては、２つの蛍光分子をリンカーで結びつけて利用する方法がある。図１では蛍光分子の例としてGFP（Green Fluorescence Protein）のリンカーを示している。このリンカーは調べたい対象の生体内物質と反応しやすく、その生体内物質と反応して形状を変えるような試薬となるように調製する。そして、この試薬と反応する生体内物質があれば２つの蛍光分子が近づきHomo-FRETを起こすようになる。
【００２３】
次に、図１の（ａ）と（ｂ）を参照してHomo-FRETが起きた時の偏光異方性の違いを説明する。
蛍光分子には吸光特性があり、光を吸収しやすい直線偏光の角度がある。さらに、励起して射出される蛍光は直線偏光の角度を継承する。図１では吸収する直線偏光の角度をθ1とし、放射される直線偏光をθ2として示している。ここで、図１の（ａ）は、２つのＧＦＰが離れている為にHomo-FRETが起こらない。つまり、この状態ではθ1＝θ2である。一方、図１の（ｂ）は、２つのＧＦＰが近接している為にHomo-FRETが起こる。この時はθ1≠θ2となる。そして、このθ1とθ2の差がHomo-FRETの観察対象となる。
【００２４】
図２は、Homo-FRETを起こすリンカーを含んだ試薬が試料内に多数あった状態を示している。実際の生体試料の中では、Homo-FRETを起こす試薬がランダムな位置にランダムな方向を向いて分布している。そして、その生体試料に直線偏光を入射したときに射出される蛍光を観察する。
【００２５】
図２の（ａ）は、リンカーの２つの蛍光分子が離れている状態に直線偏光が入射された様子を表した模式図である。このとき、吸光特性と直線偏光が一致するかそれに近い状態の蛍光分子が直線偏光によって励起される。同図においては励起される蛍光分子に両矢印を付して表している。これらの蛍光分子はHomo-FRETを起こさずにそのまま蛍光を射出するので、蛍光は振動面の角度がほぼ変わらない直線偏光となって検出される。この検出された蛍光を入射した直線偏光と平行な成分Iparaと垂直な成分Iperに分解してグラフ化したものがグラフ１である。グラフ１は、直線偏光がほとんど振動面を変えずに蛍光に変換されていることを示している。
【００２６】
図２の（ｂ）は、リンカーの２つの蛍光分子が近接している状態で直線偏光が入射され様子を表した模式図である。このときも吸光特性と直線偏光が一致するかそれに近い状態の蛍光分子が励起されるが、蛍光を射出する蛍光分子は近接しているもう一つの蛍光分子である。同図においては励起される蛍光分子に両矢印を付し、蛍光を射出する蛍光分子に破線両矢印を付して表している。
【００２７】
この場合、蛍光を射出する蛍光分子は励起された蛍光分子と異なるので、直線偏光の振動面は保存されない。この射出される蛍光を入射した直線偏光と平行な成分Iparaと垂直な成分Iperに分解してグラフ化したものがグラフ２である。グラフ２は、直線偏光の振動面が保存されていない様子を示している。
【００２８】
グラフ１とグラフ２の違いからも解るように、偏光異方性の観察は直線偏光の平行成分Iparaと垂直成分Iperの比により観察される。このときには、単なる比を使わずに、
【００２９】
【数１】
【００３０】
をもって偏光異方性ｒを測定するのが一般的である。
図３は、従来のレーザー走査型顕微鏡の模式図である。同図における顕微鏡本体１は、対物レンズ４を使ってステージ２上の試料３を観察する。そして顕微鏡本体１にはスキャンユニット５が接続され、スキャンユニット５にはレーザーユニット６からファイバーケーブル７を通してレーザーが導入され内部でレーザー走査が行われる。また、偏光異方性を検出する構成ではファイバーケーブル７は偏波面保存ファイバーを使い、直線偏光を崩さずにスキャンユニット５へ導く。そして、スキャンユニット５やレーザーユニット６に接続されるコンピュータ端末８が備えられ、スキャンユニット５やレーザーユニット６の制御によって得られた検出された光の可視化に利用される。
【００３１】
図４は、偏光異方性を観察する際の従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成を示している概略図である。通常のレーザー走査型顕微鏡ではレーザー光源として、例えばアルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅグリーンレーザー（５４３ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）などの複数のレーザー光源９を搭載し、ダイクロイックミラー１０やミラー１１を組み合わせることによって同一光路に合成することで一つのレーザーユニット６を構成する。一つの光路に合成されたレーザーは、ＡＯＴＦ（Acousto-optic tunable filters）１２によって光量調節などを行った後にファイバーカップリング機構１３を経由してファイバーケーブル７に導入される。後述するようにＡＯＴＦ１２を流用することによって従来のレーザー走査型顕微鏡に大幅な変更をすることなく本発明を実施することができる。
【００３２】
ファイバーケーブル７からスキャンユニット５に導入されたレーザーは、ミラー１４を介してダイクロイックミラー１５によって対物レンズ４方向へ反射される。その光路の途中にはガルバノミラー１６、瞳投影レンズ１７、結像レンズ１８、ミラー１９が配置され、レーザーを走査する機能が備えられている。
【００３３】
試料からの蛍光は逆の光路を通り、ダイクロイックミラー１５を通過して検出光路に導かれる。検出光路には結像レンズ２０が配置され、蛍光は共焦点ピンホール２１に結像され、これを通過した蛍光は偏光ビームスプリッター２２によって平行成分Iparaと垂直成分Iperに分離される。分離された蛍光のそれぞれの直線偏光は、２つの検出器（例えば、フォトマルチプライヤ）２４によって検出される。
【００３４】
なお、図中の符号１１、１４、１９、２３は光路を曲げるためのミラーである。
図５は、従来のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ（Acousto-optic tunable filters）１２の使用法を説明するための概略図である。ＡＯＴＦ１２は圧電トランスドゥーサー２５によって発生させた超音波によって光学素子内に回折格子と同様な機能を持たせることができる光学素子である。ＡＯＴＦ１２は入射された光線を回折現象によって０次光と１次光に分解し、さらに圧電トランスドゥーサー２５を制御することで分解の比率を変えることができる。
【００３５】
上記の従来のレーザー走査型顕微鏡ではＡＯＴＦ１２にレーザー光源９からレーザーを入射し、０次光２６と１次光２７に分解して、１次光のみをファイバーカップリング機構１３に導く。つまり、０次光は利用しない。なお、０次光は入射されるレーザーと同じ振動面の直線偏光であり、１次光は入射されるレーザーと直交した振動面の直線偏光である。
【実施例１】
【００３６】
図６は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２の使用法を説明するための概略図である。本発明では、ＡＯＴＦ１２にレーザー光源９からのレーザーを入射し、０次光２６と１次光２７に分解して、それぞれを異なるファイバーケーブル７を有するファイバーカップリング機構１３へ導く。つまり、従来とは違い０次光２６も利用する。
【００３７】
ここで留意されたいのは、０次光２６と１次光２７は振動面が直交した直線偏光となることである。ここでは、ＡＯＴＦ１２からの０次光２６と１次光２７の両方を、圧電トランスドゥーサー２５を制御することで励起光の偏光を高速に切り替えることができる。このことにより、従来のHomo-FRET観測では励起光の偏光を切り替えなかった為に十分なＳＮ比を得ることができなかったが、本発明では切り替えを行うことでＳＮ比を向上させることができる。
【００３８】
なお、本発明の実施にはＡＯＴＦだけではなく、ＡＯＭ（Acousto-optic tunable modulators）やＥＯＨＧ（Electro-Optic Holographic Gratings）を使っても同様に本発明を実施できる。以下では実施の偏光分離光学素子としてＡＯＴＦを使って説明するが、本発明のこれに限定するものではない。ただし、ＡＯＴＦの方が複数波長の偏光を扱う点でアドバンテージを持つ。
【００３９】
図７は、本発明のレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。本発明のレーザー走査型顕微鏡も、図４の従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成とほぼ同様の構成を持つ。しかしながら、図４におけるＡＯＴＦ１２からダイクロイックミラー１５までの光路が異なる。本発明のレーザー走査型顕微鏡では、ＡＯＴＦ１２からの０次光と１次光の両方を利用するために０次光と１次光のそれぞれを２本のファイバーケーブル７を用いてスキャンユニット５に導入する。その後レーザー光合成素子２８によって二つの光路を結合する。ここでレーザー光合成素子２８とは、ハーフミラーもしくは偏光ビームスプリッターを指す。残りの光路は図４と同様であるので省略する。
【実施例２】
【００４０】
図８は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２周辺部の別の構成を説明するための概略図である。実施例２では、レーザー光源９から入射されたレーザーは０次光２６と１次光２７に分離され、それをファイバーカップリング機構１３の手前で結合する。そのために同図の例ではハーフミラー２８とミラー２９を組み合わせることで０次光２６と１次光２７を結合している。
【００４１】
図９は、図８に示されたＡＯＴＦ１２周辺部の構成を組み込んだレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。図９と図４とを比較すると解るように、両構成の違いはレーザーユニット６の内部構成だけである。
【００４２】
本実施例の構成では複数のレーザー光源９からのレーザーをダイクロイックミラー１０で同一光路に結合して、一つの光線になったレーザーをＡＯＴＦ１２に導く。ＡＯＴＦ１２に入射されたレーザーは０次光と１次光に分解され射出されるが、ハーフミラー２８とミラー２９によって再び同一光路に結合される。その後、ファイバーカップリング機構１３によってファイバーケーブル７へ導入される。
【実施例３】
【００４３】
図１０は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２の別の使用法を説明する為の概略図である。従来のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦの使用法は光量の調節が目的であったが、本実施例では光量の調節をしながら偏光の切り替えもできるような構成としている。
【００４４】
レーザー光源９からＡＯＴＦ１２に入射されたレーザーは０次光２６と１次光２７に分離されて射出される。その後、０次光２６と１次光２７のどちらか一方の直線偏光をファイバーカップリング機構１３に導入する。そして、もう一方の直線偏光を新たなＡＯＴＦ３０に入射する。それから、ＡＯＴＦ３０で、さらに０次光と１次光に分離して、一方のみ光をファイバーカップリング機構１３に導入する。ＡＯＴＦ３０は０次光と１次光を分解するだけではなくその比率も変えることが出来るので、本構成によれば光量の調節をしながら偏光の切り替えを行うことができる。
【００４５】
なお、本実施例におけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成は、図７によって説明された内部構成のＡＯＴＦ１２の単純な置き換えである為に説明は省略する。
【実施例４】
【００４６】
図１１は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２のさらなる使用法を説明する為の概略図である。本構成例は実施例２におけるＡＯＴＦの構成と実施例３におけるＡＯＴＦの構成の組み合わせである。
【００４７】
レーザー光源９からＡＯＴＦ１２に入射されたレーザーは０次光２６と１次光２７に分離されて射出される。その後、０次光２６と１次光２７のどちらか一方の直線偏光を新たなＡＯＴＦ３０に入射する。そしてＡＯＴＦ１２で、さらに０次光と１次光に分離して、一方の光のみを使用する。そして、残された２つの直線偏光をハーフミラー２８とミラー２９によって結合した後に、同一のファイバーカップリング機構１３に導入する。このようにすることで光量の調節をしながら偏光の切り替えを行うことができる。
【実施例５】
【００４８】
図１２は、本発明のレーザー走査型顕微鏡の別の構成を示す概略図である。本発明のレーザー走査型顕微鏡も、図４のレーザー走査型顕微鏡の内部構成とほぼ同様の構成を持つ。しかしながら、本発明では、波長の同じレーザー光源9のそれぞれを２本のファイバーケーブル７を用いてスキャンユニット５に導入する。ここでは、それぞれのレーザーを操作するシャッター３１が設けられており、画像ごとに切り替え可能となっている。シャッター３１はメカニカルシャッターでも良いし、ＡＯＴＦやＡＯＭのような非線形光学素子でも良い。そして、スキャンユニット５に導入されたレーザー光の偏光は互いに直交する。その後、レーザー光合成素子２８によって二つの光路を結合する。ここでレーザー光合成素子とはハーフミラーもしくは偏光ビームスプリッターを指す。残りの光路は図４と同様であるので省略する。
【００４９】
また２つのレーザーを用いずに、一つのレーザー光源9からの光線を分割し、それぞれを２本のファイバーケーブル７をつかってスキャンユニット５に導入しても良い。
なおスキャニングユニット5のレーザー光合成素子２８に偏光ビームスプリッターを使うことで少ない光量損失で同じもしくは極めて近い波長のレーザー光を合成することができる極めて優れたレーザー走査型顕微鏡となる。つまりHomo-FRETのみではなくさまざまなアプリケーションに対応できるレーザー走査型顕微鏡となる。例えば同じもしくは極めて近い波長のＣＷレーザーとパルスレーザーを組み合わせることにより、煩雑なレーザー切り替え作業や取替え作業を伴わずに一般的な顕微鏡観察とFLIM（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy）と呼ばれる蛍光寿命のイメージングが一台のレーザー走査型顕微鏡にて可能となる。
【００５０】
以下では、本発明のレーザー走査型顕微鏡による走査方法の説明をする。
図１３は、本発明のレーザー走査型顕微鏡で試料面を走査する方法を示している概略図である。試料面の走査は、試料面を格子状に分割したピクセルを一列ごとに走査したものを結合させることによって行う。そして、本発明の実施では試料の励起光の偏光である励起偏光を切り換えながら蛍光の偏光の直交成分と平行成分を計測する。
【００５１】
以下の説明では、励起偏光をIperとIparaとし、励起偏光に直交した蛍光の偏光をそれぞれIperperとIparaperとして平行な蛍光の偏光をそれぞれIperparaとIparaparaとする。
図１４は、本発明のレーザー走査型顕微鏡による励起偏光の切り換えと走査のピクセル移動の順序を表しているフローチャートを示している。
【００５２】
図１４の（ａ）は、本発明の励起偏光の切り替えをピクセル毎に行う方法である。
本実施例では、はじめのピクセルに対して蛍光の偏光の直交成分Iperperと平行成分Iperparaを取得する（Ｓ１）。その後、励起偏光を切り換える（Ｓ２）。この状態で取得される蛍光は直交成分Iparaperと平行成分Iparaparaである（Ｓ３）。この段階でこのピクセルでのすべての４つのデータがすべてそろったので次のピクセルへ移動する（Ｓ４）。そして励起光の偏光状態を元に戻すためにまた励起偏光の切り替えを行う（Ｓ５）。上記のフローを全てのピクセルに対して繰り返す。
【００５３】
この方法によれば、各ピクセルに対して正確な観察が行える。従来は本発明のように高速に偏光を切り換える手段がなかった為に上記のようにピクセル毎に偏光を切り替えることができなかった。
【００５４】
図１４の（ｂ）は、本発明の励起偏光の切り替えをフレーム毎に行う方法である。本実施形態では図１４の（ａ）のフローよりもフレームあたりの取得時間が短い。つまり、フレームを時系列で取得する際などにフレーム間での時間差を短くしながら正確な観測が行える。なお、ここでのフレームとは、試料全体を含むピクセル全体を指している。
【００５５】
本実施形態では、はじめのピクセルに対して蛍光の偏光の直交成分Iperperと平行成分Iperparaを取得する（Ｓ６）。その後、次のピクセルに移動する（Ｓ７）。そしてこの操作を全てのピクセルに対して実行する。その後、励起偏光の切り替えを行う（Ｓ８）。そして、はじめのピクセルから蛍光の偏光の直交成分Iparaperと平行成分Iparaparaを取得する（Ｓ９）。その後、次のピクセルに移動する（Ｓ１０）。そして、この操作を全てのピクセルに対して実行する。このようにして全てのピクセルに対して４つのデータを得ることができる。
【００５６】
以上のように、本発明によれば偏光異方性の高い検出能力を備えたレーザー走査型顕微鏡が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】Homo-FRETにより偏光異方性が崩れる原理を説明する為の図である。
【図２】Homo-FRETを観察する原理を説明する為の図である。
【図３】従来のレーザー走査型顕微鏡の構成の概略図である。
【図４】従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図５】従来のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図６】本発明の実施例１におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図７】本発明の実施例１におけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図８】本発明の実施例２におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図９】本発明の実施例２におけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図１０】本発明の実施例３におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図１１】本発明の実施例４におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図１２】本発明の実施例５のおけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図１３】本発明のレーザー走査型顕微鏡における走査方法を例示している概略図である。
【図１４】本発明のレーザー走査型顕微鏡における走査方法を示すフローチャートを示している図である。
【符号の説明】
【００５８】
１・・・顕微鏡本体
２・・・ステージ
３・・・試料
４・・・対物レンズ
５・・・スキャンユニット
６・・・レーザーユニット
７・・・ファイバーケーブル
８・・・コンピュータ端末
９・・・レーザー光源
１０・・・ダイクロイックミラー
１１・・・ミラー
１２・・・ＡＯＴＦ
１３・・・ファイバーカップリング機構
１４・・・ミラー
１５・・・ダイクロイックミラー
１６・・・ガルバノミラー
１７・・・瞳投影レンズ
１８・・・結像レンズ
１９・・・ミラー
２０・・・結像レンズ
２１・・・共焦点ピンホール
２２・・・偏光ビームスプリッター
２３・・・ミラー
２４・・・検出器
２５・・・圧電トランスドゥーサー
２６・・・０次光
２７・・・１次光
２８・・・レーザー光合成素子
２９・・・ミラー
３０・・・ＡＯＴＦ
３１・・・シャッター
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡の技術分野に係り、特にHomo-FRET (Homo-Fluorescence resonance energy transfer)などによる偏光異方性を検出する顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の顕微鏡観察では、標本の形状のみならず、生きた状態の標本における生体反応の観察が主流となりつつある。この観察の一つの例として、Homo-FRET (Homo-Fluorescence Resonance Energy Transfer)を利用した蛍光観察法が知られている。
【０００３】
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）とは、蛍光分子である２つの供与体（Donor）分子と受容体（Acceptor）分子によって起こされる現象であり、励起光によって励起された供与体分子が、近接している受容体分子にむけて励起エネルギーを移動させ、基底状態にある受容体分子が励起され蛍光を放射するという現象である。このFRETが起こる為には、供与体と受容体が近接している事（1〜10nm程度）などの条件を満たす必要がある。そこで、この条件と標本内の生体反応を結びつけることで標本の生体活動を観察することができる。
【０００４】
例えば、カルシウムイオンのような生体活動に密接な物質と反応し、供与体（Donor）分子と受容体（Acceptor）分子の距離が変化する試薬を用いることでカルシウムイオンの存在、分布、変化などをとおして生体活動を観察することができる。
【０００５】
この供与体と受容体が、互いに異なる蛍光分子で構成した場合を「Hetero-FRET」、互いに同じ蛍光分子で構成した場合を「Homo-FRET」と呼んで区別する。「Hetero-FRET」と「Homo-FRET」は観察手法という観点から見ても大きく異なる。
【０００６】
Hetero-FRETでは、互いに異なる蛍光分子間のエネルギー転移が起こり、放射される蛍光のスペクトルが異なる。つまり、供与体（Donor）の持っている発光波長の代わりに受容体（Acceptor）の発光波長が検出される。そこで、供与体（Donor）からの蛍光と受容体（Acceptor）からの蛍光を波長によって区別することができ、その蛍光の発光量を調べることによってHetero-FRETが起きているかどうかを観察することができる。
【０００７】
しかし、Homo-FRETでは、供与体（Donor）と受容体（Acceptor）が同じ種類の蛍光分子であり蛍光波長が同じであるために波長の違いによって観察をすることができない。
そこでHomo-FRETの観測は、偏光異方性を利用することで行われる。直線偏光の励起光を用いて蛍光分子を励起すると、射出される蛍光も同じ偏光異方性を持つという性質がある。しかし、励起から蛍光を射出する間にFRETが起こると偏光異方性が崩れる。したがって、直線偏光の入射に対して射出される蛍光の偏光の保存のされ方を観察することでHomo-FRETを観察することができる。
【０００８】
通常の偏光異方性の観察には、入射側の直線偏光と平行な直線偏光に対して垂直な直線偏光を観察し、その比をもって偏光異方性の崩れた度合いを測る。そのために従来の偏光異方性の観測では、蛍光の光路中に偏光ビームスプリッターを備えることによって平行な直線偏光と垂直な直線偏光とを分離して観測している。
【０００９】
しかしながら、Homo-FRETの偏光異方性の観察には高いSN比が求められ、従来の構成では十分な観測ができなかった。また、LSM（レーザー走査型顕微鏡）では特に高い精度の偏光異方性の検出が必要となる。
【非特許文献１】Biophysical Journal Volume 80 June 2001 3000-3008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明では、上記の技術的問題に鑑み、偏光異方性の高い検出能力を備えたレーザー走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の上記課題は、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離しかつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、前記偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することで解決される。
【００１２】
また、前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には第一のファイバーケーブルと第二のファイバーケーブルが備えられ、前記互いに直交する角度の直線偏光が互いに異なるファイバーケーブルを通過する構成とする。
【００１３】
さらに、前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には１本のファイバーケーブルが備えられ、前記互いに直交する角度の直線偏光が同一のファイバーケーブルを通過する構成とする。
【００１４】
そして、前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記第一のファイバーケーブルに導き、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光のうちで前記第一の直線偏光と直交するものを前記第二のファイバーケーブルに導く構成とすることが好ましい。
【００１５】
また、前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記ファイバーケーブルに導き、前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光のうちで前記第一の直線偏光と直交するものを前記ファイバーケーブルに導く構成とすることが望ましい。
【００１６】
ここで、前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長フィルターであることが望ましい。また、前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長素子であることも可能である。前記偏光分離光学素子はホログラフィック格子であることも考えられる。
【００１７】
本発明の別の実施形態としては、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、互いに直交する角度の直線偏光をピクセル毎に切り換えることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明のさらなる実施形態としては、レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、互いに直交する角度の直線偏光をフレーム毎に切り換えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、互いに直交した直線偏光を照射することで偏光異方性の高い検出能力を備える。
また、本発明は従来のレーザー走査型顕微鏡の構成を大幅に変更することがなく実施できる。
【００２０】
さらに、直線偏光を高速に切り換えることができるので、生体反応が速い試料内の分子運動の影響を減らすことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のレーザー走査型顕微鏡およびレーザー走査方法の実施形態を図面を参照しながら説明する。
最初に、Homo-FRETによって偏光異方性が崩れることに関する説明をする。
【００２２】
典型的なHomo-FRETの観察方法としては、２つの蛍光分子をリンカーで結びつけて利用する方法がある。図１では蛍光分子の例としてGFP（Green Fluorescence Protein）のリンカーを示している。このリンカーは調べたい対象の生体内物質と反応しやすく、その生体内物質と反応して形状を変えるような試薬となるように調製する。そして、この試薬と反応する生体内物質があれば２つの蛍光分子が近づきHomo-FRETを起こすようになる。
【００２３】
次に、図１の（ａ）と（ｂ）を参照してHomo-FRETが起きた時の偏光異方性の違いを説明する。
蛍光分子には吸光特性があり、光を吸収しやすい直線偏光の角度がある。さらに、励起して射出される蛍光は直線偏光の角度を継承する。図１では吸収する直線偏光の角度をθ1とし、放射される直線偏光をθ2として示している。ここで、図１の（ａ）は、２つのＧＦＰが離れている為にHomo-FRETが起こらない。つまり、この状態ではθ1＝θ2である。一方、図１の（ｂ）は、２つのＧＦＰが近接している為にHomo-FRETが起こる。この時はθ1≠θ2となる。そして、このθ1とθ2の差がHomo-FRETの観察対象となる。
【００２４】
図２は、Homo-FRETを起こすリンカーを含んだ試薬が試料内に多数あった状態を示している。実際の生体試料の中では、Homo-FRETを起こす試薬がランダムな位置にランダムな方向を向いて分布している。そして、その生体試料に直線偏光を入射したときに射出される蛍光を観察する。
【００２５】
図２の（ａ）は、リンカーの２つの蛍光分子が離れている状態に直線偏光が入射された様子を表した模式図である。このとき、吸光特性と直線偏光が一致するかそれに近い状態の蛍光分子が直線偏光によって励起される。同図においては励起される蛍光分子に両矢印を付して表している。これらの蛍光分子はHomo-FRETを起こさずにそのまま蛍光を射出するので、蛍光は振動面の角度がほぼ変わらない直線偏光となって検出される。この検出された蛍光を入射した直線偏光と平行な成分Iparaと垂直な成分Iperに分解してグラフ化したものがグラフ１である。グラフ１は、直線偏光がほとんど振動面を変えずに蛍光に変換されていることを示している。
【００２６】
図２の（ｂ）は、リンカーの２つの蛍光分子が近接している状態で直線偏光が入射され様子を表した模式図である。このときも吸光特性と直線偏光が一致するかそれに近い状態の蛍光分子が励起されるが、蛍光を射出する蛍光分子は近接しているもう一つの蛍光分子である。同図においては励起される蛍光分子に両矢印を付し、蛍光を射出する蛍光分子に破線両矢印を付して表している。
【００２７】
この場合、蛍光を射出する蛍光分子は励起された蛍光分子と異なるので、直線偏光の振動面は保存されない。この射出される蛍光を入射した直線偏光と平行な成分Iparaと垂直な成分Iperに分解してグラフ化したものがグラフ２である。グラフ２は、直線偏光の振動面が保存されていない様子を示している。
【００２８】
グラフ１とグラフ２の違いからも解るように、偏光異方性の観察は直線偏光の平行成分Iparaと垂直成分Iperの比により観察される。このときには、単なる比を使わずに、
【００２９】
【数１】
【００３０】
をもって偏光異方性ｒを測定するのが一般的である。
図３は、従来のレーザー走査型顕微鏡の模式図である。同図における顕微鏡本体１は、対物レンズ４を使ってステージ２上の試料３を観察する。そして顕微鏡本体１にはスキャンユニット５が接続され、スキャンユニット５にはレーザーユニット６からファイバーケーブル７を通してレーザーが導入され内部でレーザー走査が行われる。また、偏光異方性を検出する構成ではファイバーケーブル７は偏波面保存ファイバーを使い、直線偏光を崩さずにスキャンユニット５へ導く。そして、スキャンユニット５やレーザーユニット６に接続されるコンピュータ端末８が備えられ、スキャンユニット５やレーザーユニット６の制御によって得られた検出された光の可視化に利用される。
【００３１】
図４は、偏光異方性を観察する際の従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成を示している概略図である。通常のレーザー走査型顕微鏡ではレーザー光源として、例えばアルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅグリーンレーザー（５４３ｎｍ）とＨｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）などの複数のレーザー光源９を搭載し、ダイクロイックミラー１０やミラー１１を組み合わせることによって同一光路に合成することで一つのレーザーユニット６を構成する。一つの光路に合成されたレーザーは、ＡＯＴＦ（Acousto-optic tunable filters）１２によって光量調節などを行った後にファイバーカップリング機構１３を経由してファイバーケーブル７に導入される。後述するようにＡＯＴＦ１２を流用することによって従来のレーザー走査型顕微鏡に大幅な変更をすることなく本発明を実施することができる。
【００３２】
ファイバーケーブル７からスキャンユニット５に導入されたレーザーは、ミラー１４を介してダイクロイックミラー１５によって対物レンズ４方向へ反射される。その光路の途中にはガルバノミラー１６、瞳投影レンズ１７、結像レンズ１８、ミラー１９が配置され、レーザーを走査する機能が備えられている。
【００３３】
試料からの蛍光は逆の光路を通り、ダイクロイックミラー１５を通過して検出光路に導かれる。検出光路には結像レンズ２０が配置され、蛍光は共焦点ピンホール２１に結像され、これを通過した蛍光は偏光ビームスプリッター２２によって平行成分Iparaと垂直成分Iperに分離される。分離された蛍光のそれぞれの直線偏光は、２つの検出器（例えば、フォトマルチプライヤ）２４によって検出される。
【００３４】
なお、図中の符号１１、１４、１９、２３は光路を曲げるためのミラーである。
図５は、従来のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ（Acousto-optic tunable filters）１２の使用法を説明するための概略図である。ＡＯＴＦ１２は圧電トランスドゥーサー２５によって発生させた超音波によって光学素子内に回折格子と同様な機能を持たせることができる光学素子である。ＡＯＴＦ１２は入射された光線を回折現象によって０次光と１次光に分解し、さらに圧電トランスドゥーサー２５を制御することで分解の比率を変えることができる。
【００３５】
上記の従来のレーザー走査型顕微鏡ではＡＯＴＦ１２にレーザー光源９からレーザーを入射し、０次光２６と１次光２７に分解して、１次光のみをファイバーカップリング機構１３に導く。つまり、０次光は利用しない。なお、０次光は入射されるレーザーと同じ振動面の直線偏光であり、１次光は入射されるレーザーと直交した振動面の直線偏光である。
【実施例１】
【００３６】
図６は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２の使用法を説明するための概略図である。本発明では、ＡＯＴＦ１２にレーザー光源９からのレーザーを入射し、０次光２６と１次光２７に分解して、それぞれを異なるファイバーケーブル７を有するファイバーカップリング機構１３へ導く。つまり、従来とは違い０次光２６も利用する。
【００３７】
ここで留意されたいのは、０次光２６と１次光２７は振動面が直交した直線偏光となることである。ここでは、ＡＯＴＦ１２からの０次光２６と１次光２７の両方を、圧電トランスドゥーサー２５を制御することで励起光の偏光を高速に切り替えることができる。このことにより、従来のHomo-FRET観測では励起光の偏光を切り替えなかった為に十分なＳＮ比を得ることができなかったが、本発明では切り替えを行うことでＳＮ比を向上させることができる。
【００３８】
なお、本発明の実施にはＡＯＴＦだけではなく、ＡＯＭ（Acousto-optic tunable modulators）やＥＯＨＧ（Electro-Optic Holographic Gratings）を使っても同様に本発明を実施できる。以下では実施の偏光分離光学素子としてＡＯＴＦを使って説明するが、本発明のこれに限定するものではない。ただし、ＡＯＴＦの方が複数波長の偏光を扱う点でアドバンテージを持つ。
【００３９】
図７は、本発明のレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。本発明のレーザー走査型顕微鏡も、図４の従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成とほぼ同様の構成を持つ。しかしながら、図４におけるＡＯＴＦ１２からダイクロイックミラー１５までの光路が異なる。本発明のレーザー走査型顕微鏡では、ＡＯＴＦ１２からの０次光と１次光の両方を利用するために０次光と１次光のそれぞれを２本のファイバーケーブル７を用いてスキャンユニット５に導入する。その後レーザー光合成素子２８によって二つの光路を結合する。ここでレーザー光合成素子２８とは、ハーフミラーもしくは偏光ビームスプリッターを指す。残りの光路は図４と同様であるので省略する。
【実施例２】
【００４０】
図８は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２周辺部の別の構成を説明するための概略図である。実施例２では、レーザー光源９から入射されたレーザーは０次光２６と１次光２７に分離され、それをファイバーカップリング機構１３の手前で結合する。そのために同図の例ではハーフミラー２８とミラー２９を組み合わせることで０次光２６と１次光２７を結合している。
【００４１】
図９は、図８に示されたＡＯＴＦ１２周辺部の構成を組み込んだレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。図９と図４とを比較すると解るように、両構成の違いはレーザーユニット６の内部構成だけである。
【００４２】
本実施例の構成では複数のレーザー光源９からのレーザーをダイクロイックミラー１０で同一光路に結合して、一つの光線になったレーザーをＡＯＴＦ１２に導く。ＡＯＴＦ１２に入射されたレーザーは０次光と１次光に分解され射出されるが、ハーフミラー２８とミラー２９によって再び同一光路に結合される。その後、ファイバーカップリング機構１３によってファイバーケーブル７へ導入される。
【実施例３】
【００４３】
図１０は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２の別の使用法を説明する為の概略図である。従来のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦの使用法は光量の調節が目的であったが、本実施例では光量の調節をしながら偏光の切り替えもできるような構成としている。
【００４４】
レーザー光源９からＡＯＴＦ１２に入射されたレーザーは０次光２６と１次光２７に分離されて射出される。その後、０次光２６と１次光２７のどちらか一方の直線偏光をファイバーカップリング機構１３に導入する。そして、もう一方の直線偏光を新たなＡＯＴＦ３０に入射する。それから、ＡＯＴＦ３０で、さらに０次光と１次光に分離して、一方のみ光をファイバーカップリング機構１３に導入する。ＡＯＴＦ３０は０次光と１次光を分解するだけではなくその比率も変えることが出来るので、本構成によれば光量の調節をしながら偏光の切り替えを行うことができる。
【００４５】
なお、本実施例におけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成は、図７によって説明された内部構成のＡＯＴＦ１２の単純な置き換えである為に説明は省略する。
【実施例４】
【００４６】
図１１は、本発明のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦ１２のさらなる使用法を説明する為の概略図である。本構成例は実施例２におけるＡＯＴＦの構成と実施例３におけるＡＯＴＦの構成の組み合わせである。
【００４７】
レーザー光源９からＡＯＴＦ１２に入射されたレーザーは０次光２６と１次光２７に分離されて射出される。その後、０次光２６と１次光２７のどちらか一方の直線偏光を新たなＡＯＴＦ３０に入射する。そしてＡＯＴＦ１２で、さらに０次光と１次光に分離して、一方の光のみを使用する。そして、残された２つの直線偏光をハーフミラー２８とミラー２９によって結合した後に、同一のファイバーカップリング機構１３に導入する。このようにすることで光量の調節をしながら偏光の切り替えを行うことができる。
【実施例５】
【００４８】
図１２は、本発明のレーザー走査型顕微鏡の別の構成を示す概略図である。本発明のレーザー走査型顕微鏡も、図４のレーザー走査型顕微鏡の内部構成とほぼ同様の構成を持つ。しかしながら、本発明では、波長の同じレーザー光源9のそれぞれを２本のファイバーケーブル７を用いてスキャンユニット５に導入する。ここでは、それぞれのレーザーを操作するシャッター３１が設けられており、画像ごとに切り替え可能となっている。シャッター３１はメカニカルシャッターでも良いし、ＡＯＴＦやＡＯＭのような非線形光学素子でも良い。そして、スキャンユニット５に導入されたレーザー光の偏光は互いに直交する。その後、レーザー光合成素子２８によって二つの光路を結合する。ここでレーザー光合成素子とはハーフミラーもしくは偏光ビームスプリッターを指す。残りの光路は図４と同様であるので省略する。
【００４９】
また２つのレーザーを用いずに、一つのレーザー光源9からの光線を分割し、それぞれを２本のファイバーケーブル７をつかってスキャンユニット５に導入しても良い。
なおスキャニングユニット5のレーザー光合成素子２８に偏光ビームスプリッターを使うことで少ない光量損失で同じもしくは極めて近い波長のレーザー光を合成することができる極めて優れたレーザー走査型顕微鏡となる。つまりHomo-FRETのみではなくさまざまなアプリケーションに対応できるレーザー走査型顕微鏡となる。例えば同じもしくは極めて近い波長のＣＷレーザーとパルスレーザーを組み合わせることにより、煩雑なレーザー切り替え作業や取替え作業を伴わずに一般的な顕微鏡観察とFLIM（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy）と呼ばれる蛍光寿命のイメージングが一台のレーザー走査型顕微鏡にて可能となる。
【００５０】
以下では、本発明のレーザー走査型顕微鏡による走査方法の説明をする。
図１３は、本発明のレーザー走査型顕微鏡で試料面を走査する方法を示している概略図である。試料面の走査は、試料面を格子状に分割したピクセルを一列ごとに走査したものを結合させることによって行う。そして、本発明の実施では試料の励起光の偏光である励起偏光を切り換えながら蛍光の偏光の直交成分と平行成分を計測する。
【００５１】
以下の説明では、励起偏光をIperとIparaとし、励起偏光に直交した蛍光の偏光をそれぞれIperperとIparaperとして平行な蛍光の偏光をそれぞれIperparaとIparaparaとする。
図１４は、本発明のレーザー走査型顕微鏡による励起偏光の切り換えと走査のピクセル移動の順序を表しているフローチャートを示している。
【００５２】
図１４の（ａ）は、本発明の励起偏光の切り替えをピクセル毎に行う方法である。
本実施例では、はじめのピクセルに対して蛍光の偏光の直交成分Iperperと平行成分Iperparaを取得する（Ｓ１）。その後、励起偏光を切り換える（Ｓ２）。この状態で取得される蛍光は直交成分Iparaperと平行成分Iparaparaである（Ｓ３）。この段階でこのピクセルでのすべての４つのデータがすべてそろったので次のピクセルへ移動する（Ｓ４）。そして励起光の偏光状態を元に戻すためにまた励起偏光の切り替えを行う（Ｓ５）。上記のフローを全てのピクセルに対して繰り返す。
【００５３】
この方法によれば、各ピクセルに対して正確な観察が行える。従来は本発明のように高速に偏光を切り換える手段がなかった為に上記のようにピクセル毎に偏光を切り替えることができなかった。
【００５４】
図１４の（ｂ）は、本発明の励起偏光の切り替えをフレーム毎に行う方法である。本実施形態では図１４の（ａ）のフローよりもフレームあたりの取得時間が短い。つまり、フレームを時系列で取得する際などにフレーム間での時間差を短くしながら正確な観測が行える。なお、ここでのフレームとは、試料全体を含むピクセル全体を指している。
【００５５】
本実施形態では、はじめのピクセルに対して蛍光の偏光の直交成分Iperperと平行成分Iperparaを取得する（Ｓ６）。その後、次のピクセルに移動する（Ｓ７）。そしてこの操作を全てのピクセルに対して実行する。その後、励起偏光の切り替えを行う（Ｓ８）。そして、はじめのピクセルから蛍光の偏光の直交成分Iparaperと平行成分Iparaparaを取得する（Ｓ９）。その後、次のピクセルに移動する（Ｓ１０）。そして、この操作を全てのピクセルに対して実行する。このようにして全てのピクセルに対して４つのデータを得ることができる。
【００５６】
以上のように、本発明によれば偏光異方性の高い検出能力を備えたレーザー走査型顕微鏡が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】Homo-FRETにより偏光異方性が崩れる原理を説明する為の図である。
【図２】Homo-FRETを観察する原理を説明する為の図である。
【図３】従来のレーザー走査型顕微鏡の構成の概略図である。
【図４】従来のレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図５】従来のレーザー走査型顕微鏡におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図６】本発明の実施例１におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図７】本発明の実施例１におけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図８】本発明の実施例２におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図９】本発明の実施例２におけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図１０】本発明の実施例３におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図１１】本発明の実施例４におけるＡＯＴＦの使用法を説明する為の図である。
【図１２】本発明の実施例５のおけるレーザー走査型顕微鏡の内部構成の概略図である。
【図１３】本発明のレーザー走査型顕微鏡における走査方法を例示している概略図である。
【図１４】本発明のレーザー走査型顕微鏡における走査方法を示すフローチャートを示している図である。
【符号の説明】
【００５８】
１・・・顕微鏡本体
２・・・ステージ
３・・・試料
４・・・対物レンズ
５・・・スキャンユニット
６・・・レーザーユニット
７・・・ファイバーケーブル
８・・・コンピュータ端末
９・・・レーザー光源
１０・・・ダイクロイックミラー
１１・・・ミラー
１２・・・ＡＯＴＦ
１３・・・ファイバーカップリング機構
１４・・・ミラー
１５・・・ダイクロイックミラー
１６・・・ガルバノミラー
１７・・・瞳投影レンズ
１８・・・結像レンズ
１９・・・ミラー
２０・・・結像レンズ
２１・・・共焦点ピンホール
２２・・・偏光ビームスプリッター
２３・・・ミラー
２４・・・検出器
２５・・・圧電トランスドゥーサー
２６・・・０次光
２７・・・１次光
２８・・・レーザー光合成素子
２９・・・ミラー
３０・・・ＡＯＴＦ
３１・・・シャッター
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、
前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離し、かつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、
前記偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には第一のファイバーケーブルと第二のファイバーケーブルが備えられ、
前記互いに直交する角度の直線偏光が、互いに異なるファイバーケーブルを通過することを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には１本のファイバーケーブルが備えられ、
前記互いに直交する角度の直線偏光が、同一のファイバーケーブルを通過することを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記第一のファイバーケーブルに導き、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、
前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光で前記第一の直線偏光と直交する偏光を前記第二のファイバーケーブルに導くことを特徴とする請求項２に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記ファイバーケーブルに導き、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、
前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光で前記第一の直線偏光と直交する偏光を前記ファイバーケーブルに導くことを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項６】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、
互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長フィルターであることを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長素子であることを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記偏光分離光学素子はホログラフィック格子であることを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項１０】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、
互いに直交する角度の直線偏光をピクセル毎に切り換えることを特徴とするレーザー走査方法。
【請求項１１】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、
互いに直交する角度の直線偏光をフレーム毎に切り換えることを特徴とするレーザー走査方法。
【請求項１】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、
前記レーザー光源と前記試料の間の光路中に、入射光の偏光成分を分離し、かつ外部信号により偏光成分の配分を制御する偏光分離光学素子を備え、
前記偏光分離光学素子から射出される互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には第一のファイバーケーブルと第二のファイバーケーブルが備えられ、
前記互いに直交する角度の直線偏光が、互いに異なるファイバーケーブルを通過することを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記偏光分離光学素子と前記試料の間の光路には１本のファイバーケーブルが備えられ、
前記互いに直交する角度の直線偏光が、同一のファイバーケーブルを通過することを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記第一のファイバーケーブルに導き、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、
前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光で前記第一の直線偏光と直交する偏光を前記第二のファイバーケーブルに導くことを特徴とする請求項２に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記偏光分離光学素子は第一の偏光分離光学素子と第二の偏光分離光学素子から構成され、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第一の直線偏光を前記ファイバーケーブルに導き、
前記第一の偏光分離光学素子から射出される第二の直線偏光を前記第二の偏光分離光学素子に導き、
前記第二の偏光分離光学素子から射出される直線偏光で前記第一の直線偏光と直交する偏光を前記ファイバーケーブルに導くことを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項６】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査型顕微鏡において、
互いに直交する角度の直線偏光を前記試料に交互に照射することを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長フィルターであることを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記偏光分離光学素子は音響光学可変波長素子であることを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項９】
前記偏光分離光学素子はホログラフィック格子であることを特徴とする請求項１から請求項６の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
【請求項１０】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、
互いに直交する角度の直線偏光をピクセル毎に切り換えることを特徴とするレーザー走査方法。
【請求項１１】
レーザー光源からの直線偏光を試料に照射して、試料から発せられた蛍光の前記直線偏光と直交した偏光成分と、前記直線偏光と平行な偏光成分とを計測するレーザー走査方法おいて、
互いに直交する角度の直線偏光をフレーム毎に切り換えることを特徴とするレーザー走査方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１】
【図１３】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−２２５０１３（Ｐ２００８−２２５０１３Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６２６３５（Ｐ２００７−６２６３５）
【出願日】平成１９年３月１２日（２００７．３．１２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１２日（２００７．３．１２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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