三量体ＩＬ−１Ｒａ
三量体形成ドメインとＩＬ−１Ｒａポリペプチド配列とを有する融合タンパク質を含むインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）。この融合タンパク質は、ＩＬ−１により媒介される疾患を治療するための医薬組成物に使用される三量体複合体の一部である。リウマチ様関節炎および糖尿病などの炎症性疾患の効果的治療を記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照としてその全体が本明細書に援用される２００８年１０月８日出願の米国仮出願番号第６０／９７８，２５４号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、インターロイキン１により媒介される疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、このような疾患の治療に有用なインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＩＬ−１ファミリーは、自然免疫系の重要な一部分を担っており、適応免疫系の調節物質でもある。局所組織におけるＩＬ−１とＩＬ−１Ｒａとの間のバランスは、炎症性疾患の発症可能性およびそれに起因する構造的損傷に影響を与える。過剰量のＩＬ−１存在下では、関節、肺、胃腸管、中枢神経系（ＣＮＳ）または血管に、炎症性疾患および自己免疫疾患が発症し得る。ＩＬ−１Ｒａによるヒト疾患の治療は、組換えＩＬ−１Ｒａの注入により、または遺伝子療法アプローチにより実施される。組換えＩＬ−１Ｒａによる治療はリウマチ様関節炎（ＲＡ）に対して承認されており、変形性関節炎（ＯＡ）に対しては第二相試験が進行中である。
【０００４】
多くのヒト疾患におけるＩＬ−１の重要な炎症誘発性の役割が、ここ１０年間にわたって記載されている。ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒａとの間のバランスは、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、変形性関節炎（ＯＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肉芽腫性および線維性肺障害、腎疾患、肝臓疾患および膵疾患、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、白血病、癌、骨粗しょう症、糖尿病、中枢神経系疾患、感染症および動脈疾患などの多様な動物疾患モデルにおいて広範に研究されている。これら疾患の各々において、局所のＩＬ−１の過剰産生および／またはＩＬ−１Ｒａの産生不足が、被験体に疾患を発症し易くさせる。ＩＬ−１Ｒａの治療的投与は、組織損傷の予防に有効であることが示されている（非特許文献１を参照）。
【０００５】
ＩＬ−１ファミリーは、２つのアゴニストであるＩＬ−１αとＩＬ−１β；特異的な受容体アンタゴニストであるＩＬ−１Ｒａ；ならびに３つの異なる受容体であるＩＬ−１ＲタイプＩ（ＩＬ−１ＲＩ）、ＩＬ−１ＲタイプＩＩ（ＩＬ−１ＲＩＩ）およびＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰ）からなる。ＩＬ−１ＲＩは、２１５残基の長い細胞質ドメインを有する８０ｋＤａのタンパク質である。生物学的に不活性なＩＬ−１ＲＩＩは、２９残基の短い細胞質ドメインを有する６０ｋＤａのタンパク質である。ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰは、一本鎖のＩＬ−１ＲＩにＩＬ−１αまたはＩＬ−１βが結合した後に、その複合体に動員される。ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの細胞質ドメイン近傍で活性化されるシグナル伝達経路としては、ＮＦ−κＢ経路、ＪＮＫ／ＡＰ−１経路、およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路が挙げられる。ＩＬ−１ＲＩＩは、細胞膜上で双方のＩＬ−１を結合するデコイ受容体として、また体液相中の可溶性受容体として機能し、そのことによってＩＬ−１が機能的なＩＬ−１ＲＩと相互作用することを防ぐ。
【０００６】
ＩＬ−１ファミリーにおける第三のリガンド、ＩＬ−１Ｒａは、双方のＩＬ−１Ｒに結合するが細胞を活性化することはできない、ＩＬ−１の構造的な変異体である。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１αに１８％のアミノ酸相同性を有し、ＩＬ−１βに２６％のアミノ酸相同性を有する、１７ｋＤａのタンパク質である。元々イソ型と記載されていたＩＬ−１Ｒａは、単球、マクロファージ、好中球、および他の細胞から分泌され、現在ではｓＩＬ−１Ｒａと称されている。現在まで、ＩＬ−１Ｒａのさらに３つの細胞内イソ型が記載されている。上流のエキソンから別の転写スプライス機構によって作出されるＩＬ−１Ｒａの１８ｋＤａ体はｉｃＩＬ−１Ｒａ１と称され、ケラチノサイトおよび他の上皮細胞、単球、組織マクロファージ、線維芽細胞および内皮細胞中に見られる。ヒト白血球からクローン化されたＩＬ−１ＲａのｃＤＮＡは、そのｃＤＮＡの５’領域に挿入断片として、さらに６３ｂｐの配列を含有する。ｉｃＩＬ−１Ｒａ３と称されるＩＬ−１Ｒａの１５ｋＤａのイソ型は、単球、マクロファージ、好中球および肝細胞中に見られ、別の転写スプライスと別の翻訳開始の双方により作出され得る。
【０００７】
可溶性のＩＬ−１ＲａとｉｃＩＬ−１Ｒａ１は双方ともＩＬ−１Ｒに等しく良好に結合するが、ｉｃＩＬ−１Ｒａ３は受容体との弱い結合性を示す。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１ＲＩに結合するが、ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰとＩＬ−１ＲＩとの結合を防ぐことにより特異的な受容体アンタゴニストとして機能し、その結果、シグナル伝達経路を開始できない。
【０００８】
デコイ受容体ＩＬ−１ＲＩＩは、細胞膜上および可溶性受容体として体液相中の両方でＩＬ−１と結合し、ＩＬ−１が機能的なＩＬ−１ＲＩと相互作用するのを防ぐ。したがって、可溶性のＩＬ−１ＲＩＩおよびＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１を協同的に阻害することができる。可溶性のＩＬ−ＲＩは、ＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒａに結合することができるが、ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒａとの間のバランスにより、可溶性のＩＬ−１ＲＩは炎症誘発剤として作用するようである。
【０００９】
ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、Ａｍｇｅｎからの大腸菌産生ＩＬ−１Ｒａであり、進行性のリウマチ様関節炎患者に利益を与えることが示されている。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、１日１回皮下注射する必要がある。皮下注射で、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、４時間から６時間の範囲の半減期を有し、静脈内注射では、半減期はおよそ２．５時間である。ＩＬ−１Ｒａは腎クリアランスにより除去される。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）はメチオニン基の存在により、天然のＩＬ−１受容体アンタゴニストとは異なるＩＬ−１の特異的受容体アンタゴニストである。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、単独でまたはメトトレキサートと組み合わせて投与すると、臨床的徴候および症状における改善、Ｘ線撮影上での進行の減少、患者の機能、痛みおよび疲労における改善により評価される利益を患者に与えることが示されている。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、臨床試験で実証されたように、好ましい安全性プロファイルを有している。
【００１０】
ＩＬ−１Ｒａの薬物動態不良を改善するために幾つかの試みがなされた。ＩＬ−１ベータのみを標的にする抗体が開発された。しかしながら、ＩＬ−１Ｒａとは対照的に、これはＩＬ−１ベータのみをブロックし、ＩＬ−１αの作用はブロックしない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】W.P. Arend, Cytokine & Growth Factor Reviews, 13 (2002) pp. 323-240
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＩＬ−１Ｒａ分子のより長い半減期および好ましい安全性プロファイルを提供する、ＩＬ−１Ｒａに関する改善された送達法に対する当分野における必要性を、本発明者らは認めた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、三量体形成ドメインおよびＩＬ−１活性を阻害するＩＬ−１Ｒａポリペプチド配列を含む融合タンパク質を提供する。一実施形態において、この融合タンパク質は、ＩＬ−１活性を阻害する配列番号３８の変異体または断片を含むＩＬ−１Ｒａ配列を含む。さらなる実施形態において、この融合タンパク質は、配列番号３８に少なくとも８５％同一性があるＩＬ−１Ｒａポリペプチド配列を含む。この融合タンパク質は、ポリエチレングリコールを含み得る。この融合タンパク質の三量体形成ドメインは、テトラネクチンから誘導できる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の３つの融合タンパク質を含む三量体複合体も提供する。一実施形態において、この三量体複合体は、テトラネクチン三量体形成構造エレメント（ＴＴＳＥ）である三量体形成ドメインを含む。一実施形態において、この三量体複合体は、配列番号１に少なくとも６６％同一性がある三量体形成ドメインを含む。さらなる実施形態において、この三量体複合体は、ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号３９）；ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４０）；ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４１）；ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４２）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４３）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４４）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４５）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１Ｒａ（配列番号５５）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５７）；およびＶ１７−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ１Ｒａ（配列番号５８）からなる群から選択される融合タンパク質のうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、三量体および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
さらに本発明は、インターロイキン１に媒介される疾患を治療するための方法に関する。この方法は、この方法を必要とする患者に、本発明の医薬組成物を投与することを含む。この疾患は、リウマチ様関節炎または糖尿病などの炎症性疾患であり得る。この方法はまた、抗炎症剤を患者に同時にまたは連続的に投与することを含む。
【００１６】
本発明はまた、当該融合タンパク質に共有結合した抗炎症剤をさらに含む融合タンパク質を提供する。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記にさらに詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】テトラネクチンタンパク質ファミリーの三量体形成構造エレメントのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヒト・テトラネクチンのエキソン２およびエキソン３の最初の３個の残基を含む残基Ｖ１７からＫ５２（１文字コード）に相当するアミノ酸配列（配列番号５９）；マウス・テトラネクチン（配列番号６０）；リーフシャークの軟骨から単離されたテトラネクチンの相同タンパク質（配列番号６１）；およびウシ軟骨から単離されたテトラネクチンの相同タンパク質（配列番号６２）。７残基反復（heptad repeat）のａ位およびｄ位の残基を太字で記載する。テトラネクチンタンパク質ファミリーの三量体形成構造エレメントに見られる共通配列は、この領域中の他の保存された残基に加えて、図１に示された７残基反復中のａ位およびｄ位に存在する残基を含む。「ｈｙ」は、脂肪族の疎水性残基を示す。
【図２】透析によるＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａのリフォールディング結果を示す図である。
【図３】ＮｉＮＴＡ上でのＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａの捕捉を示す図である。
【図４】Ｕ９３７細胞におけるＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害するＧＧ−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ）およびＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ）の能力を示すグラフである。
【図５】非ペグ化ＴｒｉｐＴおよびＴｒｉｐＶおよびＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）と比較した、Ｕ９３７細胞におけるＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害するペグ化ＴｒｉｐＴおよびＴｒｉｐＶの能力を示すグラフである。
【図６】ＰＫ試験に用いられたＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ＲａのＵ９３７細胞におけるＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害する能力を示すグラフである。
【図７】ラットにおける１００ｍｇ／ｋｇの静脈内注射後、ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、およびＶ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａの血中濃度を示すグラフである。
【図８】複数のバッチであるＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ＬＭ０２２およびＬＭ０２３）およびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ＣＦ０１９およびＣＦ０２０）のタンパク質収量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図９】Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１ＲａおよびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１Ｒａタンパク質収量のＳＥＣ分析結果を示す図である。
【図１０】ラットのＣＩＡ試験結果を示す図である。ＩＩ型コラーゲン関節炎を有するメスのルイスラットの足首の直径は、媒体（１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４）、または単量体ＩＬ−１Ｒａ（１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））、もしくは三量体化ＩＬ−１Ｒａ（１２０ｍｇ／ｋｇのＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ、または１２０ｍｇ／ｋｇのＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ）を投与する等モル量のＩＬ−１Ｒａによる処置後に測定した。
【図１１】媒体処置された疾患対照動物と比較して、ラットをＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）、Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ ＱＤ、またはＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ ＱＤで処置した場合の最終的な足重量の減少試験を示す図である。
【図１２】Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１−ＲａまたはＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）による毎日の腹腔内投与後に見られた血中グルコース濃度の減少を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ＩＬ−１により媒介される疾患を治療するための化合物および方法に関する。一態様において、本発明は、三量体形成ドメインまたは多量体形成ドメインと融合したＩＬ−１Ｒａポリペプチド配列の融合タンパク質に関する。ＩＬ−１Ｒａ単独よりも高い安定性および改善された薬物動態特性を提供する組成物を提供し、かつ好ましい安全性プロファイルを提供するために、３つ以上の融合タンパク質を三量体化または多量体化することができる。
【００２０】
さらなる態様において本発明は、上記ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を提供し、ならびに特異的な発現および回収を可能にする条件下での上記ポリペプチドを調製する方法を提供する。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、有効量の医薬組成物を被験体に投与することにより、炎症性疾患の治療方法など、ＩＬ−１により媒介される病態を有する被験体の治療に使用するための医薬組成物の調製に使用できる。
【００２２】
本明細書に用いられる疾患または医学的状態は、自然発生的または実験的な疾患または医学的状態が体液中または組織中のＩＬ−１のレベル上昇に関連している場合、または身体から採取した細胞または組織が培養物中にＩＬ−１の上昇レベルを産生する場合、「インターロイキン１媒介疾患」または「インターロイキン１により媒介される疾患」と考えられる。多くの場合、このようなインターロイキン１媒介疾患はまた、以下のさらなる２つの条件によって認識される：（１）この疾患または医学的状態に関連する病理的所見が、ＩＬ−１の投与により、動物において実験的に模倣することができる；（２）この疾患または医学的状態の実験動物モデルに誘発させた病態が、ＩＬ−１の作用を阻害する薬剤による治療によって阻止または消滅させることができる。たいていのＩＬ−１媒介疾患において、これら３つの条件のうちの少なくとも２つが当てはまり、多くのＩＬ−１媒介疾患において、これら３つの条件の全てが当てはまる。急性および慢性のＩＬ−１媒介炎症性疾患の非排他的リストとして、限定はしないが、以下が挙げられる：痛風、急性膵炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；悪液質／食欲不振症；喘息；アテローム硬化症；慢性疲労症候群；発熱；糖尿病（例えば、インスリン糖尿病）；糸球体腎炎；移植片対宿主拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏症；炎症性腸疾患；変形性関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節炎およびリウマチ様関節炎などの関節の炎症性病態；脳虚血（例えば、外傷、てんかん、出血または脳卒中の結果の脳傷害、それらの各々は神経変性に至る可能性がある）などの虚血性傷害；肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）；多発性骨髄腫；多発性硬化症；骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬおよびＣＭＬ）および他の白血病；筋疾患（例えば、特に敗血症における筋タンパク質の代謝）；骨粗しょう症；パーキンソン病；疼痛；早期分娩；乾癬；再灌流傷害；敗血症ショック；放射線療法による副作用、一時的な顎関節症、腫瘍転移；または、挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染症または他の疾患過程から生じる炎症性病態、およびマックル−ウェルズ症候群、家族性感冒自己炎症性症候群および新生児期発症多臓器炎症性疾患などのクライオピリン関連周期熱症候群。
【００２３】
本明細書に用いられる用語「多量体形成ドメイン」とは、２つ以上の他のアミノ酸配列と結合して、三量体複合体または他の多量体複合体を形成することのできる機能を有するアミノ酸配列を意味する。一例において、融合タンパク質は、他の２つの三量体形成ドメインを伴って三量体複合体を形成する三量体形成ドメインであるアミノ酸配列を含有する。三量体形成ドメインは、他の同一のアミノ酸配列の三量体形成ドメインと結合する（ホモ三量体）か、または異なるアミノ酸配列の三量体形成ドメインと結合する（ヘテロ三量体）ことができる。このような相互作用は、三量体形成ドメイン成分間の共有結合によって、また、水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力および塩架橋によって生じ得る。したがって、本発明の種々の実施形態において、多量体形成は、二量体形成ドメイン、三量体形成ドメイン、四量体形成ドメイン、五量体形成ドメインなどである。これらのドメインは、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の本発明の融合タンパク質からなるポリペプチド複合体を形成することができる。
【００２４】
本発明の融合タンパク質の三量体形成ドメインは、米国出願公開番号第２００７／０１５４９０１号（'901 Application）（参照としてその全体が本明細書に援用される）に記載されているように、テトラネクチンから誘導できる。全長ヒト・テトラネクチンポリペプチド配列は、本明細書において配列番号６３として提供されている。テトラネクチン三量体形成ドメインの例としては、配列番号６３のアミノ酸１７から４９、１７から５０、１７から５１および１７から５２が挙げられ、これらは、ヒト・テトラネクチン遺伝子のエキソン２によってコードされるアミノ酸、さらに任意に、この遺伝子のエキソン３によってコードされる最初の１個、２個または３個のアミノ酸を含む。他の例としては、アミノ酸１から４９、１から５０、１から５１および１から５２が挙げられ、これらは、この遺伝子のエキソン１およびエキソン２の全体、さらに任意に、この遺伝子のエキソン３によりコードされる最初の１個、２個または３個のアミノ酸を含む。あるいは、エキソン１によりコードされるアミノ酸配列の一部のみが三量体形成ドメインに含まれる。具体的には、三量体形成ドメインのＮ末端は、配列番号６３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７番目の残基のいずれからでも始めることができる。特定の実施形態において、Ｎ末端は、Ｉ１０またはＶ１７であり、Ｃ末端は、Ｑ４７、Ｔ４８、Ｖ４９、Ｃ（Ｓ）５０、Ｌ５１またはＫ５２（配列番号６３に従う番号付け）である。
【００２５】
本発明の一態様において、三量体形成ドメインは、米国出願公開番号第２００７／００１５４９０１号にさらに十分に記載されているテトラネクチンファミリー三量体形成構造エレメントの共通配列である、配列番号１のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体形成構造エレメント（「ＴＴＳＥ」）である。図１に示されているように、ＴＴＳＥは、タンパク質のテトラネクチンファミリーの天然メンバーの変異体、特に、αコイルドコイル三量体を形成するＴＴＳＥの能力にいかようにも実質的な程度の不利な影響を与えないアミノ酸配列における改変を有する変異体を包含する。本発明の種々の態様において、本発明による三量体ポリペプチドは、配列番号１の共通配列に、少なくとも６６％のアミノ酸配列同一性（確定された残基（Ｘａａではない）のみを計数する）；例えば、配列番号１の共通配列に、少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８６％または少なくとも９２％の配列同一性を有する三量体形成ドメインとしてのＴＴＳＥを含む。言い換えると、配列番号１の確定されたアミノ酸の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個を置換することができる。
【００２６】
特定の一実施形態において、配列番号６３における５０位のシステイン（Ｃ５０）は、望ましくない多量体形成に至り得る望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を避けるために、セリン、トレオニン、メチオニンまたは他の任意のアミノ酸残基へ有利に変異誘発することができる。他の公知の変異体は、アミノ酸残基番号（配列番号６３に従う番号付け）、６、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３５、３９、４１、および４２番目のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むが、これらのアミノ酸残基は、らせんを破壊しない任意のアミノ酸残基により置換することができる。これらの残基は、天然のテトラネクチン単量体の３つのＴＴＳＥ間の三量体複合体を安定化する分子間相互作用には直接関与していないことが示されている。図１に示された一態様において、ＴＴＳＥは、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（Ｎ端からＣ端へ）で示される７残基反復を有し、式中、残基ａおよびｄ、すなわち２６位、３３位、３７位、４０位、４４位、４７位、５１位は任意の疎水性アミノ酸であってよい（配列番号６３に従う番号付け）。
【００２７】
さらなる実施形態において、ＴＴＳＥ三量体形成ドメインは、ポリヒスチジン配列および／またはプロテアーゼ開裂部位、例えば、血液凝集因子ＸａまたはＧｒａｎｚｙｍｅＢの開裂部位（本明細書に援用される米国出願公開番号第２００５／０１９９２５１号を参照のこと）の組込みによって、またＣ末端ＫＧまたはＫＧＳ配列を含めることによって改変することができる。また、精製を助けるために、２位のプロリンをグリシンによって置換してもよい。
【００２８】
ＴＴＳＥの切断体および変異体の特定の非限定的な例は、以下の表１に示されている。
【００２９】
【表１−１】
【００３０】
【表１−２】
【００３１】
三量体形成ドメインの他の例は、米国特許第６，１９０，８８６号に開示されており（その全体が本明細書に援用される）、これには、コレクションネック（collectin neck）領域を含むポリペプチドが記載されている。次いで、コレクションネック領域のアミノ酸配列を含む３つのポリペプチドにより、適切な条件下で三量体を作製することができる。
【００３２】
三量体形成ドメインの他の例は、参照としてその全体が本明細書に援用される２００７年１１月９日に本出願の譲受人により出願された米国仮出願番号第６０／９９６，２８８号に記載されているＭＢＰ三量体形成ドメインである。この三量体形成ドメインは、さらにオリゴマー化して、高次の多量体複合体を作出することができる。
【００３３】
本発明のＩＬ−１Ｒａポリペプチドは、三量体形成ドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基のいずれにも連結できる。フレキシブルな分子リンカーを任意に、ＩＬ−１Ｒａであるポリペプチドと三量体形成ドメインとの間に組み込み、共有結合により連結することができる。このリンカーは約１個から２０個、２個から１０個、または３個から７個のアミノ酸残基のポリペプチド配列であることが好ましい。さらなる実施形態において、このリンカーは、非免疫原性であり、容易にはタンパク質分解により開裂せず、他の残基と相互作用することが知られているアミノ酸残基（例えばシステイン残基）を含まない。
【００３４】
本明細書に用いられる「ＩＬ−１Ｒａ」とは、下記：
【化１】
に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。
【００３５】
また、「ＩＬ−１Ｒａ」の定義には、ＩＬ−１Ｒに対するＩＬ−１Ｒａの結合を示す、好ましくはＩＬ−１Ｒ阻害活性を示す配列番号３８の変異体および断片が含まれる。このような断片は、全長の天然ＩＬ−１Ｒａタンパク質と比較して、ＩＬ−１ＲａのＮ末端またはＣ末端において切断されていてもよいし、または、内部残基を欠損していてもよい。特定の断片は、本発明による三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質の所望の生物学的活性にとって必須ではないアミノ酸残基が欠損され得る。例えば、Evans, et al. （J.Biol.Chem. 1995、19:11477-11483）は、部位特異的変異誘発により、ＩＬ−１Ｒに対する結合にとってＴｒｐ１６、Ｇｌｎ２０、Ｔｙｒ３４、Ｇｌｎ３６およびＴｙｒ１４７だけが必須であり、機能的分子を維持しつつ他のアミノ酸位置を変更できることが示されている。さらに、Dahlen, et al. （J.Immunotoxicology 5:189-199 (2008)）により示されるように、ＩＬ−１Ｒａとその受容体とのループ相互作用を増大させるために、結合領域の外側のアミノ酸を変異させ、それにより、ＩＬ−１Ｒａのその受容体に対する親和性を改善することができる。これは、ＩＬ−１Ｒａ受容体結合領域の外側のアミノ酸の変異、具体的には、例えば、Ｄ４７Ｎ、Ｅ５２Ｒ、Ｅ９０Ｙ、Ｐ３８Ｙ、Ｈ５４Ｒ、Ｑ１２９ＬおよびＭ１３６Ｎ（同上）によって達成できる。さらに、天然のＩＬ−１Ｒａ変異体が存在し、そのいずれも使用することができる。上流エキソンからの別の転写スプライス機構によって作出されたＩＬ−１Ｒａの１８ｋＤａ体は、ｉｃＩＬ−１Ｒａ１と称され、ケラチノサイト、ならびに他の上皮細胞、単球、組織マクロファージ、線維芽細胞および内皮細胞の内部に見られる。ヒト白血球からクローン化されたＩＬ−１Ｒａ ｃＤＮＡは、そのｃＤＮＡの５’領域に挿入断片としてさらに６３ｂｐの配列を含有する。ｉｃＩＬ−１Ｒａ３と称される、ＩＬ−１Ｒａの１５ｋＤａイソ型は、単球、マクロファージ、好中球、および肝細胞の中に見られ、別の転写スプライスと別の翻訳開始の双方によって作出することができる。
【００３６】
本発明の融合タンパク質にとって有用なＩＬ−１Ｒａペプチドは、配列番号３８に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一性があるポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３８に、少なくとも８５％同一性があり、ＩＬ−１Ｒ結合活性、好ましくはＩＬ−１Ｒａ阻害活性を有するＩＬ−１Ｒａペプチド配列を含む。別の特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３８に、少なくとも９５％同一性があり、ＩＬ−１Ｒ結合活性、好ましくはＩＬ−１Ｒａ阻害活性を有するＩＬ−１Ｒａペプチド配列を含む。これらの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３８の番号付けによるＴｒｐ１６、Ｇｌｎ２０、Ｔｙｒ３４、Ｇｌｎ３６およびＴｙｒ１４７を含む。これらのポリペプチドはさらに、１つまたは複数のアミノ酸置換、Ｄ４７Ｎ、Ｅ５２Ｒ、Ｅ９０Ｙ、Ｐ３８Ｙ、Ｈ５４Ｒ、Ｑ１２９ＬおよびＭ１３６Ｎ（配列番号３８の番号付けによる）を含む。さらに、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドの変異体は、１つまたは複数のアミノ酸を、同様な構造特性または化学特性を有する別のアミノ酸、例えば保存的アミノ酸置換体によって置換することにより達成することができる。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明による融合タンパク質は、以下から選択されるＩＬ−１受容体アンタゴニストから選択される：
【化２】
【化３】
式中、下線部は、三量体形成単位を示し、太字部はＩＬ−１Ｒａ部分を示す。
【００３８】
融合タンパク質の作製
本発明の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質は、化学的に合成することもできるし、または何らかの好適な標準的タンパク質発現系に発現させることもできる。タンパク質発現系は、そこから所望のタンパク質が容易に単離でき、インビトロでリフォールディングできる系であることが好ましい。原核生物の発現系は、高収量のタンパク質を得ることができ、また効率的な精製とリフォールディングの方法が利用できることから好ましい。真核生物の発現系もまた使用できる。したがって、適切な発現系の選択は、十分に当業者の能力と裁量の範囲内にある。同様に、本発明の融合タンパク質のアミノ酸の一次配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内へのプロテイナーゼ開裂部位の導入などの要因を考慮に入れて、所望のタンパク質をコードする適切な組換えＤＮＡ構築物を容易に設計することができる。これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択された宿主に適切な多くの発現ベクターのいずれかの内にインフレームで挿入することができる。発現ベクターは、組換え構築物の発現を駆動するために、強力なプロモーターを含むことが好ましい。
【００３９】
本発明の融合タンパク質は、その融合タンパク質が発現される条件下で、本融合タンパク質をコードするベクターによって形質転換した宿主を培養することにより、任意の好適な標準的タンパク質発現系において発現させることができる。この発現系は、そこから所望のタンパク質が容易に単離でき、インビトロでリフォールディングできる系であることが好ましい。一般に、原核生物の発現系が、高収量のタンパク質を得ることができ、また効率的な精製とリフォールディングの方法が利用できることから好ましい。したがって、適切な発現系の選択（ベクターおよび細胞型を含めて）は、当業者の知識の範囲内にある。同様に、本発明の融合タンパク質のアミノ酸の一次配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ開裂部位の導入などの要因を考慮に入れて、所望のアミノ酸配列をコードする適切な組換えＤＮＡ構築物を容易に設計することができる。
【００４０】
一実施形態において、単離ポリヌクレオチドが、本発明の融合タンパク質をコードする。別の実施形態において、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドおよび三量体形成ドメインは、連続していないポリヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、いくつかの実施形態において、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドおよび三量体形成ドメインは、別々のポリペプチドとして発現され、単離および精製されてから共に融合されて、本発明の融合タンパク質が形成される。
【００４１】
これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択された宿主に適切な多くの発現ベクターのいずれかの内にインフレームで挿入することができる。一定の実施形態において、発現ベクターは、組換え融合タンパク質構築物の発現を制御する強力なプロモーターを含む。本発明の融合タンパク質を作出するために組換え発現法を用いた場合、得られた融合タンパク質は、当分野に周知の好適な標準的操作を用いて、単離し精製することができ、任意に、例えば、凍結乾燥などのさらなる処理に供することができる。
【００４２】
組換えＤＮＡ分子、タンパク質および融合タンパク質産生のために、また組織培養および細胞の形質転換のために、標準的な技法を使用することができる。例えば、Sambrook, et al.（下記）またはCurrent Protocol in Molecular Biology（Ausubel, et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons、1994）を参照されたい。精製法は一般に、製造元の指示に従って実施されるか、またはSambrook, et al.（Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY（1989）に記載されているような慣例的な手順を用いて当分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載されているとおりに実施される。特に定義が与えられない限り、実験上の手順、ならびに本明細書に記載された分子生物学、生化学、分析化学、および薬剤／製薬化学に関連する技法に関連して利用される命名法は、当分野で周知の一般的なものである。生化学的合成、生化学的分析、薬学的調製、製剤、ならびに送達、および患者の処置に関しては、標準的な技法を使用することができる
【００４３】
当然のことながら、フレキシブルな分子リンカーは、任意に、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドと三量体形成ドメインとの間に組み込んで、共有結合により連結することができる。一定の実施形態において、リンカーは、約１個から２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列である。リンカーは、１０個未満のアミノ酸であってよく、最も好ましくは、５個、４個、３個、２個、または１個のアミノ酸であってよい。ある場合には、９個、８個、７個、または６個のアミノ酸が好適であり得る。有用な実施形態において、リンカーは本質的に非免疫原性であり、容易にタンパク質分解により開裂することはなく、他の残基と相互作用することが知られているアミノ酸残基（例えばシステイン残基）を含まない。
【００４４】
以下の記述はまた、１つまたは複数の化学基に共有結合している（以下「コンジュゲートしている」）融合タンパク質、および三量体複合体を作製する方法に関する。このようなコンジュゲートにおける使用に好適な化学基は、有意に毒性または免疫原性がないことが好ましい。この化学基は任意に、保存でき、かつ保存に好適な条件下で使用できるコンジュゲートを作製するために選択される。ポリペプチドにコンジュゲートできる種々の代表的な化学基が当分野で知られており、例えば、糖タンパク質上に自然に生じる炭水化物などの炭水化物、ポリグルタメート、およびポリオール類などの非タンパク様ポリマーが挙げられる（例えば、米国特許第６，２４５，９０１号を参照）。
【００４５】
ポリオールは、例えば、上記の国際公開第ＷＯ９３／００１０９号に開示されているように、リシン残基を含む、１つまたは複数のアミノ酸残基において、本発明の融合タンパク質とコンジュゲートすることができる。使用されるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、線状鎖または分枝状鎖を有していてよい。好適なポリオールとしては、１つまたは複数のヒドロキシル位において、１個から４個の間の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換されたものが挙げられる。一般に、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であり、かくして、残りの議論は例示的な実施形態に関連しており、記述の容易のため、そこでは、使用されるポリオールはＰＥＧであり、ポリペプチドにポリオールをコンジュゲートする過程を「ペグ化」と称する。しかしながら、ＰＥＧに関して本明細書に記載したコンジュゲートのための技法を用いて、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリオール類が使用できることを、当業者は認識している。
【００４６】
ＩＬ−１Ｒａのペグ化に使用されるＰＥＧの平均分子量は変わる可能性があり、一般に、約５００ダルトン（Ｄ）から約３０，０００Ｄの範囲であり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約１，０００Ｄから約２５，０００Ｄ、より好ましくは約１，０００Ｄから約５，０００Ｄである。一実施形態において、ペグ化は、約１，０００Ｄの平均分子量を有するＰＥＧによって実施される。任意に、ＰＥＧホモポリマーは非置換であるが、その一端がアルキル基により置換されていてもよい。アルキル基はＣ１〜Ｃ４アルキル基であることが好ましく、メチル基であることが最も好ましい。ＰＥＧ製剤は市販品として入手できるが、一般に、本発明における使用に好適なＰＥＧ製剤は、平均分子量により販売された不均一製剤である。例えば、市販品として入手できるＰＥＧ（５０００）製剤は一般に、分子量がわずかに、通常は±５００Ｄ異なる分子を含有する。小型分子化合物（例えば化学療法剤）へのコンジュゲート；シグナル分子（例えば蛍光体）へのコンジュゲート；特異的結合ペア（例えばビオチン／ストレプトアビジン、抗体／抗原）の分子へのコンジュゲート；またはグリコシル化、ＰＥＧ化もしくは安定化ドメイン（例えばＦｃドメイン）へのさらなる融合による安定化などの当分野に公知の技法を用いて、本発明の融合タンパク質をさらに改変することができる。
【００４７】
タンパク質ペグ化のための種々の方法が当分野において知られている。ＰＥＧにコンジュゲートさせたタンパク質を作製する特定の方法としては、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，９３５，４６５号および米国特許第５，８４９，５３５号に記載された方法が挙げられる。一般にタンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量などに依って、ポリマー上の末端の反応基に対しタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸残基を介して共有結合される。（複数の）反応基を有するポリマーは、本明細書において活性化ポリマーと称される。反応基は、タンパク質上のフリーのアミノ基または他の反応基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは、ランダムなまたは部位特異的な様式で、タンパク質上のアミノ基または他の反応基と結合することができる。しかし、最適な結果を得るために、選択される反応基のタイプおよび量、ならびに使用されるポリマーのタイプは、反応基がタンパク質上のあまりにも多くの特定の活性基と反応することを避けるために使用される特定のタンパク質またはタンパク質変異体に依存することは理解されたい。これは完全に避けることが不可能かもしれないので、タンパク質濃度に依り、一般にタンパク質１モル当たり、約０．１モルから約１０００モル、好ましくは２モルから２００モルの活性化ポリマーを使用することが推奨される。タンパク質１モル当たり活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持すると同時に、可能な場合は、タンパク質の循環半減期を最適化しつつ、調整する。
【００４８】
本明細書に用いられる場合、用語「ポリオール」とは、広く多価アルコール化合物のことである。ポリオールは、例えば、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、直鎖または分枝鎖を有していてもよい。好ましいポリオールとしては、１つまたは複数のヒドロキシル位を、１つ〜４つの間の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換したものが挙げられる。一般にポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかしながら、ＰＥＧに関して本明細書に記載したコンジュゲートのための技法を用いて、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリオール類が使用できることを、当業者は認識している。本発明のポリオールには、当分野に周知のもの、および市販品として入手可能な供給源などから公的に入手できるものが含まれる。
【００４９】
さらに、血清アルブミン結合ペプチド、ＦｃＲｎ結合ペプチドまたはＩｇＧ結合ペプチドなどの他の半減期延長性の分子（half-life extending molecule）を、三量体形成ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合させることができる。
【００５０】
一実施形態において、本発明の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質を、大腸菌などの原核宿主細胞内に発現させ、さらに第三のポリペプチド、すなわち第三の融合の相手に結合させる。したがって、このような第三の融合の相手を、本発明の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質に付加させることによって、高収量の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質を得ることができると考えられる。第三の融合相手は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドまたはヘキサペプチドなど、任意の好適なペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ある場合には、融合相手は単独のアミノ酸であり得る。融合相手は、タンパク質分解性の分解に対して融合タンパク質をより抵抗性にするように、融合タンパク質の発現および分泌の増大が促進されるように、可溶性が改善されるように、および／または融合タンパク質の後のアフィニティー精製が可能となるように選択できる。
【００５１】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質（すなわち、ＩＬ−１Ｒａ部分および三量体形成ドメイン）とユビキチンなどの第三の融合相手との間の接合領域は、グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位、例えば米国出願公開番号第２００５／０１９９２５１号に記載されているヒトグランザイムＢ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．７９）開裂部位を含む。
【００５２】
第三の融合相手は、さらなる実施形態において、アフィニティータグと結合されてよい。このようなアフィニティータグは、アフィニティー樹脂上での融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティードメインであり得る。アフィニティータグは、ヘキサヒスタグなどのポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｓタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼタグ、またはマルトース結合タンパク質であり得る。
【００５３】
上記のアフィニティータグシステムの使用により固定化された融合タンパク質の酵素による開裂によって形成される三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質を単離する単離ステップにも、本発明の方法は及びうる。この単離ステップは、イオン交換およびサイズによる分画の使用など、当分野に公知のタンパク質単離のための任意の好適な手段によって実施することができ、その選択は、融合タンパク質の性質に依存する。一実施形態において、第三の融合相手と三量体形成ドメインおよびＩＬ−１Ｒａを含む領域との間の領域を、ヒトセリンプロテアーゼ・グランザイムＢによりつなぎ、グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位で融合タンパク質を開裂させ、本発明の融合タンパク質が得られる。
【００５４】
本発明はまた、少なくとも１つの上記の核酸を含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットを提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および要すれば他の配列などの適切な調節配列を含む好適なベクターを選択するか、または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウィルス、ファージ、またはファージミドであり得る（Molecular Cloning:a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００５５】
本発明はまた、本発明の１つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、細菌系、哺乳動物細胞系、酵母系およびバキュロウィルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現に利用できる哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラー細胞、仔ハムスター腎細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞および他の多数のものが挙げられる。好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００５６】
医薬組成物
さらに別の態様において、本発明は、薬学的に許容できる担体または賦形剤と共に、本発明の融合タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物に関する。本明細書に用いられる「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤ならびに抗真菌剤、等張化剤ならびに吸収遅延剤などのいずれかおよび全てが含まれる。薬学的に許容できる担体または薬学的に許容できる賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つまたは複数、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、前記組成物中に、等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。湿潤剤などの薬学的に許容できる物質、または湿潤剤または乳化剤などの微量の補助的物質、抗体または抗体部分の使用期限または有効性を増強する保存剤または緩衝剤もまた含めることができる。任意に、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩などの崩壊剤を含めることができる。賦形剤に追加して、医薬組成物は、以下の１つまたは複数を含むことができる：血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝剤、結合剤、甘味剤および他の風味剤；着色剤およびポリエチレングリコール。
【００５７】
これらの組成物は、例えば、溶液剤（例えば、注射用液剤および注入用液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム剤および座剤など、液体、半固体および固体の剤形など、種々の形態であり得る。好ましい形態は、意図される投与経路および治療適用に依る。一実施形態において、これらの組成物は、注射用液剤または注入用液剤の形態であり、例えば、抗体によるヒトの受動的免疫化に用いられるものと同様の組成物である。一実施形態において、投与様式は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。一実施形態において、融合タンパク質（または三量体複合体）は、静脈内注入または静脈内注射により投与される。別の実施形態において、融合タンパク質または三量体複合体は、筋内注射または皮下注射により投与される。
【００５８】
医薬組成物投与の他の好適な経路としては、限定はしないが、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜または経腸投与が挙げられる。
【００５９】
治療用組成物は一般に滅菌状態であり、製造および貯蔵の条件下で安定である。組成物は、高薬剤濃度に好適な液剤、ミクロ乳剤、分散剤、リポソーム剤、または他の指示された構造に製剤化することができる。滅菌注射用液剤は、必要量の活性剤（すなわち、融合タンパク質または三量体複合体）を、必要ならば上記に挙げた成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に組み入れた後に、ろ過滅菌することによって調製することができる。一般に分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒ならびに他の上記に挙げた成分からの必要な成分を含有する滅菌媒体内へ組み入れることによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥、および活性成分の散剤と、先の滅菌ろ過されたその液剤から任意の所望の追加成分とが得られる凍結乾燥である。液剤の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合は必要な粒径の維持により、また界面活性剤の使用により維持することができる。注射用組成物の吸収延長は、この組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００６０】
本明細書に記載された障害の治療に有用な治療薬を含有するキットなどの製造品は、少なくとも１つの容器と１つのラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、種々の材料から形成することができる。容器の上の、または容器に結合したラベルは、この製剤が、選択された病態の治療に用いられることを指示する。この製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース液などの薬学的に許容できる緩衝液を含む容器をさらに含み得る。この製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明のついた添付文書など、商業的な、および使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含み得る。この製造品は、上記の別の活性剤を有する容器も含み得る。
【００６１】
一般に、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容できる塩が製剤中に用いられる。薬学的に許容できる担体の例としては、生理食塩水、リンガー液およびデキストロース液が挙げられる。製剤のｐＨは、好ましくは約６から約９、より好ましくは、約７から約７．５である。例えば、投与経路および治療薬の濃度に依り、一定の担体がより好ましいと考えられることは当業者には明らかであろう。
【００６２】
治療用組成物は、凍結乾燥製剤、水性液剤、または水性懸濁剤の形態で、任意の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A. ed.（1980））と共に、適切な純度を有する所望の分子を混合することにより調製することができる。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度において、レシピエントに対して無毒であることが好ましく、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド類；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン類などの親水性ポリマー類；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸類；グルコース、マンノース、またはデキストリン類などの単糖類、二糖類、および他の糖質；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が含まれる。
【００６３】
このような担体のさらなる例としては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩類、または硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムなどの電解質、コロイダルシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、およびセルロースベースの物質が挙げられる。局所用またはゲルベースの形態に対する担体としては、カルボキシメチルセルロースンナトリウムまたはメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート類、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、および木材ワックスアルコール類が挙げられる。全ての投与で、慣例的なデポー形態は好適に用いられる。このような形態としては、例えば、ミクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、および徐放製剤が挙げられる。
【００６４】
インビボ投与に用いられる製剤は滅菌状態でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌ろ過膜を通してろ過することによって容易に達成される。製剤は全身投与される場合は、凍結乾燥形態で、または溶液で保存できる。凍結乾燥形態の場合、一般に、使用時に適切な希釈剤と共に再構成するために他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の一例は、皮下注射用の単回投与バイアルに充填された滅菌、清澄、無色の非保存液剤である。
【００６５】
治療用製剤は一般に、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、静脈内用液剤バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な密栓を有するバイアルの中に入れられる。製剤は、反復される静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋内（ｉ．ｍ．）の注射剤もしくは注入剤として、または鼻腔内もしくは肺内の送達に好適なエアロゾル製剤として投与されることが好ましい（肺内送達に関しては、例えば、EP 257,956を参照）。
【００６６】
本明細書に開示された分子は、徐放製剤の形態で投与することもできる。徐放製剤の好適な例としては、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、形状化製品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、Langer et al., J.Biomed.Mater.Res.、15:167-277（1981）およびLanger、Chem.Tech.、12:98-105（1982）に記載されているポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー類（Sidman et al., Biopolymers、22:547-556（1983））、非分解性エチレン−ビニルアセテート（Langer et al.,上記）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）が挙げられる。
【００６７】
治療方法
本発明の他の態様は、ＩＬ−１Ｒａに媒介される疾患を治療する方法に関する。この方法は、本発明の医薬組成物の治療的有効量により、このような疾患に罹っている被験体を治療することを含む。
【００６８】
本発明の他の態様は併用療法に関する。治療薬を含む製剤もまた本発明により提供される。このような製剤は、貯蔵にとって、ならびに治療的投与にとって特に好適であると考えられる。これらの製剤は公知の技法によって調製できる。例えばこれらの製剤は、ゲルろ過カラム上の緩衝液交換によって調製できる。
【００６９】
これらの医薬組成物は、ボーラスとしての静脈内投与などの公知の方法により、または一定時間にわたる連続的注入により、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、脊髄内、経口、局所、または吸入経路により投与することができる。任意に、市販品として入手できる種々の装置を用いたミニポンプ注入により、投与を行うことができる。
【００７０】
三量体ＩＬ−１Ｒａを投与するための有効な投与量と投与スケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定は当分野の範囲内にある。単回投与または複数回投与を用いることができる。現在、単独で用いられる三量体ＩＬ−１Ｒａの有効な投与量または量は、１日当り体重１ｋｇにつき約１μｇから約１００ｍｇの範囲またはそれ以上であり得ると考えられている。投与量の種間換算は、例えば、Mordenti et al., Pharmaceut. Res.、8: 1351 (1991)に開示されるように、当分野に知られた様式で実施することができる。
【００７１】
ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質のインビボ投与が用いられる場合、通常の投与量は、投与経路に依って、１日当り哺乳動物の体重１ｋｇにつき約１０ｎｇから約１００ｍｇまでまたはそれ以上、好ましくは、約１μｇ／ｋｇ／日から５０ｍｇ／ｋｇ／日まで変わり得る。具体的な投与量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されている（例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；米国特許第５，２０６，３４４号；または米国特許第５，２２５，２１２号を参照）。種々の製剤が、種々の治療用化合物および種々の障害にとって有効であること、１つの臓器または１つの組織を標的とする投与が、例えば、別の臓器または組織への送達様式とは異なる送達様式を必要とし得ることを当業者は認識するであろう。投与しなければならない三量体ＩＬ−１Ｒａの投与量が、例えば、三量体ＩＬ−１Ｒａが与えられる哺乳動物、投与経路、および哺乳動物に投与されている他の薬物または治療法に依って変わり得ることを当業者は理解するであろう。
【００７２】
三量体複合体と他の治療剤（１つまたは複数の他の治療法）とを、並行に（同時に）または連続的に投与することができる。特定の実施形態において、融合タンパク質または三量体複合体と治療剤とは、並行投与される。別の実施形態において、融合タンパク質または三量体複合体は、治療剤の投与前に投与される。別の実施形態において、治療剤は、融合タンパク質または三量体複合体の前に投与される。投与後、処置した細胞をインビトロで分析することができる。インビボ治療が行われた場合、治療を受けた哺乳動物を、熟練医師によく知られている種々の方法でモニターすることができる。例えば、血清中サイトカイン応答を分析することができる。
【００７３】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療または予防目的で１つまたは複数のＴＮＦ阻害剤と併用して（治療前、治療後、または並行治療で）、限定はしないが、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）など）を含む可溶性ＴＮＦ受容体の全ての形態、ならびに単量体または多量体ｐ７５および／またはｐ５５ＴＮＦ受容体分子およびそれらの断片；限定はしないが、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）など）、およびＤ２Ｅ７（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）など）などの抗ヒトＴＮＦ抗体など、使用することができる。このようなＴＮＦ阻害剤としては、ＴＮＦのインビボ合成または細胞外放出をブロックする化合物およびタンパク質が挙げられる。具体的な実施形態において、本発明は、以下のＴＮＦ阻害剤：ＴＮＦ結合タンパク質（本明細書に定義された可溶性ＴＮＦ受容体タイプ−Ｉおよび可溶性ＴＮＦ受容体タイプ−ＩＩ（「ｓＴＮＦＲｓ」））、抗ＴＮＦ抗体、顆粒球コロニー刺激因子；サリドマイド；ＢＮ５０７３０；テニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）;Ｅ５５３１；ｔｉａｐａｆａｎｔＰＣＡ４２４８；ニメスリド；パナビル；ロリプラム；ＲＰ７３４０１；ペプチドＴ；ＭＤＬ２０１、４４９Ａ；（１Ｒ，３Ｓ）−シス−１−［９−（２，６−ジアミノプリニル）］−３−ヒドロキシ−４−シクロペンテン塩酸塩；（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−（９−（２，６−ジアミノ）プリン）−３−アセトキシシクロペンタン；（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−（９−アデニル）−３−アジドシクロペンタン塩酸塩；および（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−（６−ヒドロキシ−プリン−９−イル）−３−アジドシクロペンタンの１つまたは複数のいずれかと併用した（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１７ＲＡ ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。ＴＮＦ結合タンパク質は、当分野に開示されている（ＥＰ３０８ ３７８、ＥＰ４２２ ３３９、ＧＢ２ ２１８ １０１、ＥＰ３９３ ４３８、国際公開第ＷＯ９０／１３５７５号、ＥＰ３９８ ３２７、ＥＰ４１２ ４８６、国際公開第ＷＯ９１／０３５５３号、ＥＰ４１８ ０１４、特開ＪＰ１２７，８００／１９９１号公報、ＥＰ４３３ ９００、米国特許第５，１３６，０２１号、ＧＢ２ ２４６ ５６９、ＥＰ４６４ ５３３、国際公開第ＷＯ９２／０１００２号、国際公開第ＷＯ９２／１３０９５号、国際公開第ＷＯ９２／１６２２１号、ＥＰ５１２ ５２８、ＥＰ５２６ ９０５、国際公開第ＷＯ９３／０７８６３号、ＥＰ５６８ ９２８、国際公開第ＷＯ９３／２１９４６号、国際公開第ＷＯ９３／１９７７７号、ＥＰ４１７ ５６３、国際公開第ＷＯ９４／０６４７６号および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４）。
【００７４】
例えば、ＥＰ３９３ ４３８およびＥＰ４２２ ３３９では、一緒くたに「ｓＴＮＦＲｓ」と称される、可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩ（「ｓＴＮＦＲ−Ｉ」または「３０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤」としても知られている）および可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩＩ（「ｓＴＮＦＲ−ＩＩ」または「４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤」としても知られている）、ならびにそれらの修飾形態（例えば、断片、機能性誘導体および変異体）のアミノ酸配列および核酸配列を教示している。ＥＰ３９３ ４３８およびＥＰ４２２ ３３９はまた、阻害剤のコードを担っている遺伝子を単離する方法、好適なベクターと細胞型において遺伝子をクローン化する方法および遺伝子を発現させて阻害剤を産生する方法を開示している。さらにｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩの多価形態（すなわち、２つ以上の活性部分を含む分子）もまた開示している。一実施形態において、この多価形態は、少なくとも１つのＴＮＦ阻害剤および別の部分を任意の臨床的に許容できるリンカー、例えば、ポリエチレングリコールを用いて化学的に結合させることにより（国際公開第ＷＯ９２／１６２２１号および国際公開第ＷＯ９５／３４３２６号）、ペプチドリンカー（Neve et al. (1996)、Cytokine、8(5):365-370）により、ビオチンへ化学的に結合させ、次いでアビジンへ結合させることにより（国際公開第ＷＯ９１／０３５５３号）、最後にキメラ抗体分子を組み合わせることにより（米国特許第５，１１６，９６４号、国際公開第ＷＯ８９／０９６２２号、国際公開第ＷＯ９１／１６４３７号およびＥＰ３１５０６２）作製することができる。
【００７５】
抗ＴＮＦ抗体としては、ＭＡＫ １９５Ｆ Ｆａｂ抗体（Holler et al. (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147）；ＣＤＰ ５７１抗ＴＮＦモノクローナル抗体（Rankin et al. (1995)、British Journal of Rheumatology, 34:334-342）；ＢＡＹ Ｘ １３５１マウスの抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体（Kieft et al. (1995)、7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases、page 9)；ＣｅｎＴＮＦ ｃＡ２抗ＴＮＦモノクローナル抗体（Elliott et al. (1994)、Lancet, 344:1125-1127およびElliott et al. (1994)、Lancet, 344:1105-1110）が挙げられる。
【００７６】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、ＩＬ−１７阻害剤（例えば、抗ＩＬ１７受容体抗体、Ａｍｇｅｎ；抗ＩＬ−１７Ａ、抗ＩＬ１７Ｆ）、ＲＯＲｃ阻害剤の全ての形態と併用して使用することができる。
【００７７】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、限定はしないが、アバタセプト（例えば、ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））など、ＣＤ２８阻害剤の全ての形態と併用して使用することができる。
【００７８】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、限定はしないが、トシリズマブ（例えば、ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））など、ＩＬ−６およびＩＬ−６受容体阻害剤の全ての形態と併用して使用することができる。
【００７９】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰまたは誘導体、ＩＬ−１８ｔｒａｐ、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ−１８Ｒ１、または抗ＩＬ−１８ＲＡｃＰなど、抗ＩＬ−１８化合物の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８０】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ＩＬ−２２または抗ＩＬ−２２Ｒなど、抗ＩＬ−２２の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８１】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ｐ１９、抗ｐ４０（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、抗ＩＬ−２３Ｒなど、抗ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８２】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ＩＬ−２１または抗ＩＬ−２１Ｒなど、抗ＩＬ−２１の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８３】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ＴＧＦ−ベータの全ての形態と併用して使用することができる。
【００８４】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、１つまたは複数のサイトカイン類、リンホカイン類、造血因子（類）、および／または抗炎症剤と併用して使用することができる。
【００８５】
本明細書に挙げられた疾患および障害の治療には、本明細書に提供されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の１つまたは複数による治療と併用して（治療前、治療後、または並行治療）痛みおよび炎症の制御に最初に使用される薬物使用を含むことができる。これらの薬物は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として分類される。二次的治療としては、コルチコステロイド、遅効性抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤ）、または疾患改質薬（ＤＭ）が挙げられる。以下の化合物に関する情報はThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Sixteenth Edition, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, N.J. (1992)および、ＰＪＢ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社のファーマプロジェクツに見ることができる。
【００８６】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、本明細書に挙げられた疾患および障害を治療する目的で任意の１つまたは複数のＮＳＡＩＤと併用して使用することができる。ＮＳＡＩＤは、少なくとも部分的にプロスタグランジン合成の阻害により、これらの抗炎症作用を発揮する（Goodman and Gilman in "The Pharmacological Basis of Therapeutics," MacMillan 7th Edition (1985)）。ＮＳＡＩＤは、以下の少なくとも９つのグループに特徴づけることができる：（１）サリチル酸誘導体；（２）プロピオン酸誘導体；（３）酢酸誘導体；（４）フェナム酸誘導体；（５）カルボン酸誘導体；（６）酪酸誘導体；（７）オキシカム類；（８）ピラゾール類および（９）ピラゾロン類。
【００８７】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、１つまたは複数のサリチル酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用して（治療前、治療後、または並行治療）使用することができる。このようなサリチル酸誘導体、プロドラッグエステル類および薬学的に許容できるそれらの塩類は：アセトアミノサロール、アロキシプリン、アスピリン、ベノリレート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、トリサリチル酸コリンマグネシウム、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸コリン、ジフルシナル、エテルサレート、フェンドサル、ゲンチシン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リシン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸１−ナフチル、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドＯ−酢酸、サルサレート、サリチル酸ナトリウムおよびスルファサラジンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するサリチル酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００８８】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のプロピオン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらのプロピオン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、デキシンドプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、ピリドキシプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するプロピオン酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００８９】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数の酢酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらの酢酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アセメタシン、アルクロフェナック、アムフェナック、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラック、デルメタシン、ジクロフェナックカリウム、ジクロフェナックナトリウム、エトドラック、フェルビナック、フェンクロフェナック、フェンクロラック、フェンクロジン酸、フェンチアザック、フロフェナック、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラック、イソキセパック、ロナゾラック、メチアジン酸、オキサメタシン、オクスピナック、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダック、タルメタシン、チアラミド、チオピナック、トルメチン、トルメチンナトリウム、ジドメタシンおよびゾメピラックを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連する酢酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９０】
別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のフェナム酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらのフェナム酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：エンフェナム酸、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、メドフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸、タルニフルメート、テロフェナメート、トルフェナム酸およびウフェナメートを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するフェナム酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９１】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のカルボン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。使用できるこれらのカルボン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：クリダマック、ジフルニサル、フルフェニサル、イノリジン、ケトロラックおよびチノリジンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するカルボン酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９２】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数の酪酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらの酪酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェンおよびキセンブシンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連する酪酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９３】
別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のオキシカム類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらのオキシカム類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカムおよび４−ヒドロキシル−１，２−ベンゾチアジン１，１−ジオキシド４−（Ｎ−フェニル）−カルボキサミドを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するオキシカム類また、このグループに包含されることが意図されている。
【００９４】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のピラゾール類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。使用し得るこれらのピラゾール類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：ジフェナミゾールおよびエピリゾールを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するピラゾール類もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９５】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のピラゾロン類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。使用し得るこれらのピラゾロン類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スクシブゾンおよびチアゾリノブタゾンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するピラゾロン類もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９６】
別の具体的な実施形態において、本発明は、以下の１つまたは複数のＮＳＡＩＤのいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する：ε−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシル−メチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザック、ベンダザックリシネート、ベンジダミン、ベプロジン、ブロペラモール、ブコローム、ブフェゾラック、シプロクアゾン、クロキシメート、ダジダミン、デボキサメット、デトミジン、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｉｒａｍｉｄｅ）、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｙｒａｍｉｄｅ）、ジフィサラミン、ジタゾール、エモルファゾン、メシル酸ファネチゾール、フェンフルミゾール、フロクタフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロクアゾン、ホピルトリン、ホスホサル、グアイメサル、グアイアゾレン、イソニキシン、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リシンクロニキシネート、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロール、オキサパドール、パラニリン、ペリソキサール、クエン酸ペリソキサール、ピホキシム、ピプロキセン、ピラゾラック、ピルフェニドン、プロクアゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプタミドならびに４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ１２１、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１およびＷＹ４１７７０などの会社コード番号により称されるもの。このＮＳＡＩＤと同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するＮＳＡＩＤもまた、このグループに包含するように意図されている。
【００９７】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、リウマチ様疾患、移植片対宿主疾患および多発性硬化症などの急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療を目的とした１つまたは複数のコルチコステロイド類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。コルチコステロイド類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類としては、ヒドロコルチゾン、および２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノミド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デゾニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルシノロンアセトニド、フルニゾリド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、ヘキサン酸フルオコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、テブト酸ヒドロコルチゾン、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、２１−ジエドリアミノ酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ｍ−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、テブト酸プレドニゾロン、２１−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、２１−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサセトニドなどのヒドロコルチゾンから誘導される化合物が挙げられる。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するコルチコステロイド類もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９８】
別の具体的な実施形態において、本発明は、リウマチ様疾患、移植片対宿主疾患および多発性硬化症などの急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療を目的とした１つまたは複数の遅効性抗リウマチ薬類（ＳＡＡＲＤ）または疾患改質抗リウマチ薬類（ＤＭＡＲＤ）、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。ＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤ、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アロクプレイドナトリウム、オーラノフィン、オーロチオグルコース、オーロチオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナールナトリウム、ブシラミン、３−オーロチオ−２−プロパノールスルホン酸カルシウム、クロラムブシル、クロロキン、クロブザリット、クプロキソリン、シクロ−ホスファミド、シクロスポリン、ダプゾン、１５−デオキシスペルグアリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩類（例えば、クロロキン金塩、チオリンゴ酸金ナトリウム塩、チオ硫酸金ナトリウム塩）、ヒドロキシクロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾール、ロベンザリット、メリッチン、６−メルカプトプリン、メトトレサート、ミゾリビン、ミコフェノレートモフェチル、ミオラール、ナイトロジェンマスタード、Ｄ−ペニシラミン、ＳＫＮＦ８６００２およびＳＢ２０３５８０などのピリジノールイミダゾール類、ラパマイシン、チオール類、サイモポエチンおよびビンクリスチンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤもまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９９】
別の具体的な実施形態において、本発明は、急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療を目的とした、１つまたは複数のＣＯＸ２阻害剤、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。ＣＯＸ２阻害剤、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類の例としては、例えば、セレコキシブが挙げられる。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するＣＯＸ２阻害剤もまた、このグループに包含されることが意図されている。ＣＯＸ−２選択的阻害剤の例としては、限定はしないが、エトリコキシブ、バルデコキシブ、セレコキシブ、リコフェロン、ルミラコキシブ、ロフェコキシブなどが挙げられる。
【０１００】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療目的で、１つまたは複数の抗菌剤、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。抗菌剤としては、例えば、広範なクラスのペニシリン類、セファロスポリン類および他のベータ−ラクタム類、アミノグリコシド類、アゾール類、キノロン類、マクロライド類、リファマイシン類、テトラサイクリン類、スルホンアミド類、リンコサミド類およびポリミキシン類が挙げられる。ペニシリン類としては、限定はしないが、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラネート、ヘタシリン、シクラシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、チカルシリン／クラブラネート、アゾロシリン、メジオシリン、ペペラシリン、およびメシリナムが挙げられる。セファロスポリン類および他のベータ−ラクタム類としては、限定はしないが、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セファゾリン、セファドロキシル、セファクロール、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セルロキシム、セフォニシド、セフォラジン、セフィキシム、セフォタキシム、モキサラクタム、セフチゾキシム、セトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、イミペネムおよびアズトレオナムが挙げられる。アミノグリコシド類としては、限定はしないが、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびネオマイシンが挙げられる。アゾール類としては、限定はしないが、フルコナゾールが挙げられる。キノロン類としては、限定はしないが、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシンが挙げられる。マクロライド類としては、限定はしないが、エリスロマイシン、スピラマイシンおよびアジトロマイシンが挙げられる。リファマイシン類としては、限定はしないが、リファンピンが挙げられる。テトラサイクリン類としては、限定はしないが、スピサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、デオキシサイクリン、グアメサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、セノサイクリンおよびテトラサイクリンが挙げられる。スルホンアミド類としては、限定はしないが、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフィソキサゾールおよびコ−トリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）が挙げられる。リンコサミド類としては、限定はしないが、クリンダマイシンおよびリンコマイシンが挙げられる。ポリミキシン類（ポリペプチド類）としては、限定はしないが、ポリミキシンＢおよびコリスチンが挙げられる。
【０１０１】
当然のことながら、本明細書において、章の見出しは、編成のみを目的としたものであって、決して記載された内容を限定するものとして解釈すべきではない。引用された全ての文献は、全ての目的のために参照としてそれらの全体が本明細書に援用される。
【０１０２】
以下の実施例は、本発明の一定の実施形態を単に例示するものであり、添付された特許請求の範囲により定義される本発明を限定するものとして解釈してはならない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：三量体ＩＬ−１Ｒａの様式、産生および精製
ＩＬ−１Ｒａは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）において組換えタンパク質として産生できることが以前に示されている（Steinkasserer et al 1992. FEBS 310:63-65）。このタンパク質は、極めて安定であり、効率的にリフォールディングする。そのＮ末端に追加のアミノ酸を有するＩＬ−１Ｒａのイソ型もまた記載されている（Haskill et al 1991, PNAS 88：3681-3685；Muzio et al 1995, JEM 182、623-628）。これらの分子は、ＩＬ−１Ｒならびにその成熟分泌体と結合したので、受容体への結合を損なうことなくアンタゴニストのＮ末端に追加ペプチドの融合が可能なことを示している。ＩＬ−１ＲａとＩＬ−１Ｒとの相互作用の結晶構造分析もまた、Ｎ末端の改変がＩＬ１Ｒとの相互作用に影響を及ぼさないことを裏付けている（Schreuder et al 1997, Nature 386: 190-194）。ＩＬ−１Ｒａは、骨髄および／またはヒト胎盤に由来するヒトｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。
【０１０４】
三量体ＩＬ−１Ｒａは、Ｔｒｉｐ三量体形成単位に対するＣ末端融合体として設計された。８つの異なる融合タンパク質を設計し、その４つは全長の三量体形成単位を有し（Ｔｒｉｐ）、残りの４つは９個のアミノ酸が切断された三量体形成単位を有する（Ｉ１０Ｔｒｉｐ）。次いでＩＬ−１Ｒａを、４つの異なるＣ末端融合体を用いていずれかの三量体形成単位にも融合させた。ＴｒｉｐＶ、ＴｒｉｐＴ、ＴｒｉｐＱおよびＴｒｉｐＫと称するＣ末端変異体は、三量体形成ドメイン上のＣＴＬＤドメインのユニークな提示が考えられる。ＴｒｉｐＫ変異体は、最長の構築物であり、ＣＴＬＤと三量体形成ドメインとの間に最長かつ最もフレキシブルなリンカーを含有する。ＴｒｉｐＶ、ＴｒｉｐＴ、ＴｒｉｐＱは、構造的にフレキシブルでない三量体形成モジュール上への直接的なＣＴＬＤ分子の融合を表すが、ＣＴＬＤ分子は、ＴｒｉｐＶからＴｒｉｐＴへ、およびＴｒｉｐＴからＴｒｉｐＱへと１／３回転している。これは、これらのアミノ酸の各々が、αヘリックスターンしているが、完全な回転には３．２ａａが必要であるという事実による。
【０１０５】
以下のタンパク質は、以下のグランザイムＢ開裂融合タンパク質としてＢＬ２１ＡＩ細菌において産生させた。下線部分は三量体単位を示し、太字部分はＩＬ−１Ｒａ部分を示す：
【化４】
【化５】
【化６】
【０１０６】
全ての構成物を、ＮｉＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）上で捕捉し、リフォールディングし、さらにＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）上で精製した。三量体ＩＬ１−Ｒａの振とうフラスコ内または発酵槽での発現から、封入体を精製した。一塊の細胞ペレットを、溶解用緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｗ／ｖ％のショ糖、１ｍＭのＥＤＴＡ）中、音波処理によりホモジナイズした（溶解用緩衝液１００ｍＬ当り５０ｇのウェット細胞ペレット）。次いで、溶解用緩衝液１００ｍＬ当り１００ｍｇのリゾチームを添加し、混合してから、サンプルを１５分間室温に放置した。次にこのサンプルを、混合しながら２〜５分間音波処理した。洗浄用緩衝液（０．２ＭのＮａＣｌ、１ｗ／ｖ％のデオキシコレート、Ｎａ塩、１ｗ／ｖ％のノニデットＰ４０、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、サンプルを混合し、再度音波処理した。封入体を、４℃、８，０００ｒｐｍで２５分間の遠心分離により回収した。上澄液を、４℃で保存し、このペレットを、元の細胞ペレット５０ｇ当り１００ｍＬのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００緩衝液（０，５ｗ／ｖ％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁させた。封入体を、４℃、８，０００ｒｐｍで２５分間の遠心分離により回収し、上澄液を、４℃で保存した。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００緩衝液洗浄をもう一度繰り返し、封入体を、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収した。
【０１０７】
封入体を、細胞ペースト１グラム当り３０ｍＬの変性用緩衝液（６Ｍの尿素、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのトリス／ＨＣｌおよび２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０）中、２８℃で２時間再懸濁した。この懸濁液を、７５００ｇで１５分間遠心分離して、不溶性物質を除去した。この後、ＣａＣｌ２を加えて２０ｍＭの最終濃度にし、この溶液を、ＮＴＡ緩衝液（８Ｍの尿素；１０００ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．０；５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）中で平衡にした１００ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムに適用し、安定なベースラインが得られるまで洗浄した。さらに２５０ｍＬのグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールにより洗浄し、次いで１００ｍＬの緩衝液ＮＴＡにより洗浄した。
【０１０８】
２つのリフォールディング法、すなわち透析リフォールディングおよびカラム上のリフォールディングを用い、双方から純粋な可溶性のタンパク質を得た。透析リフォールディングでは、再懸濁した封入体を用いて、直接、３Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含有する１×ＰＢＳ中で一晩かけて透析した。翌日、０Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含有する１×ＰＢＳ中で透析を続けた。
【０１０９】
カラム上のリフォールディングでは、タンパク質を結合させた洗浄Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムの樹脂を、３Ｍの尿素、ｐＨ７．２を含有する４ＣＶｍｌの１×ＰＢＳで洗浄してから、３Ｍの尿素、ｐＨ７．２を含有する１０ＣＶの１×ＰＢＳ、そして０Ｍの尿素、ｐＨ７．２を含有する１０ＣＶの１×ＰＢＳの直線勾配で操作した。リフォールディングされた三量体ＩＬ−１Ｒａを回収するために、このカラムを１×ＰＢＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０で溶出させ、フラクションを集めた。
【０１１０】
リフォールディング後、溶出液中のｐＨをＮａＯＨにより７．５に調整してから、組換えグランザイムＢを１：５００（グランザイム／タンパク質）の比率で添加し、２５℃で一晩インキュベートすることによって、組換えヒトグランザイムＢによる開裂を実施した。この進行をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより追跡した。
【０１１１】
最後に、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カチオン交換ステップを用いて、開裂タンパク質を精製した。約５０ｍＬのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを詰め、安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ａ（１×ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ５．５）中で平衡にした。この開裂反応物を、緩衝液Ａにより１：３に希釈し、カラム上に装填し、次いで安定なベースラインがモニターされるまで緩衝液Ａで洗浄した。１０ＣＶの緩衝液Ａから１０ＣＶの緩衝液Ｂ（１×ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ＋０．５ＭのＮａＣｌ ｐＨ５．５）までの勾配を設定して、フラクションを５ｍＬずつ集めた。タンパク質を含有するフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してからタンパク質産物をプールした。
【０１１２】
あるいは、上記封入体調製物からの上澄液を用いてタンパク質を精製した。上澄液中の可溶性三量体ＩＬ−１Ｒａを、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＬ、５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ８．０）で平衡にしたＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム上で精製した。封入体精製からの洗浄液をプールし、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離してから、ＣａＣｌ２を５ｍＭに、およびトリス−ＨＣｌを２０ｍＭに加えて、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調整した。このプールをカラムに装填し、安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ａで洗浄した。安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ａ＋１ＭのＮａＣｌで洗浄後、結合したタンパク質を、緩衝液Ａ＋２０ｍＭのＥＤＴＡで溶出させ、フラクションを集めた。その後、タンパク質プールを、グランザイムＢにより開裂し、上記のとおりＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム上で精製した。３Ｌ発現培養物からのＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＧＧ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａの可溶性フラクションから、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）の捕捉後、約２５０ｍｇのＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａについで最終収量が９５ｍｇのＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａが得られた。可溶性フラクションからのタンパク質の収率と純度が、リフォールディングを実施することよりも有意に良好であったことから、この経路が、最初の構成物試験後に選択された。
【０１１３】
リフォールディングされたタンパク質のＩＬ−１受容体１に結合する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）上で分析した。この分析には、マウスＩＬ１−ＲＩ／ＦｃをＣＭ５センサーチップに結合させ、ＩＬ−１ＲＩタンパク質に対する可溶性ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａの結合を測定した。透析による未開裂のＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａリフォールディングの結果を図２に示し、未開裂のＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａのカラム上のＮｉＮＴＡリフォールディングを図３に示す。開裂アッセイおよび精製アッセイにより、配列番号４７−５４の三量体ＩＬ−１Ｒａ化合物を作製した。
【０１１４】
実施例２：Ｕ９３７細胞内でのＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害する三量体ＩＬ−１Ｒａ化合物の能力
Ｕ９３７細胞内でのＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害する能力に関して、ＧＧ−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＶ−ＩＬ１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＫ−ＩＬ１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＴ−ＩＬ１Ｒａ）およびＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＱ−ＩＬ１Ｒａ）をさらに分析した。結果を図４に示す。
【０１１５】
これらの化合物は、その応答をブロックする効果が本質的に等しく、これら全てがＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）と同様に効果的であると思われる（ｗ／ｗで比較した場合）。このアッセイにおける緩衝液効果のため、使用される最高のタンパク質濃度（１００μｇ／ｍＬ）におけるＩＬ−８の産生は、さらに減少するのではなくて増加する。幾つかのインビトロでの有効性検定ならびにＢｉａｃｏｒｅアッセイに基づいて、ＴｒｉｐＴ ＩＬ１Ｒａは、ブロッキングおよび結合の有効性ならびに産生収率に基づき最良の化合物であると判定した。
【０１１６】
実施例３：ペグ化三量体ＩＬ−１Ｒａ化合物
ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の有効性において、そのインビボでの半減期が重要なパラメータである（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）のヒトでの半減期は、わずか４−６時間であり、したがって毎日１回適用する必要がある）ことから、Ｎ末端ペグ化によりＴｒｉｐＴ ＩＬ１Ｒａをペグ化する能力を試験した。三量体ＩＬ１−ＲａをＮ末端においてペグ化する。上記の精製法の最終ステップ後の三量体ＩＬ１−Ｒａアンタゴニストタンパク質を、ペグ化の出発点として用いた。ペグ化反応用に、このタンパク質の緩衝液をＰＢＳ緩衝液ｐＨ６．０に変えた。反応中のタンパク質濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬと３．５ｍｇ／ｍＬとの間であり、２０ｍＭのシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３）で補足した５〜１０モル過剰のｍＰｅｇ５Ｋ−アルデヒドまたはｍＰｅｇ２０Ｋ−アルデヒド（Ｎｅｋｔａｒ）を用いた。反応は、２０℃で１６時間実施した。次いでこの反応混合物をＳｏｕｒｃｅ１５Ｓカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）に適用して、モノペグ化体を精製した。図５に示すように、非ペグ化タンパク質と比較して、このペグ化体のアンタゴニスト活性は減少した。しかしながら、このペグ化タンパク質は、依然として良好なＩＬ１ブロック効力を有している。
【０１１７】
実施例４：オスのルイスラットにおける静脈内注射後の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質の薬物動態学的分析
先の実施例に記載された３種の三量体ＩＬ−１Ｒａポリペプチドを、薬物動態学的分析用に選択した。これらの構築物の違いは、三量体形成ドメインのＮ末端にあり、すなわち全長（ＦＬ）、最初の９個のアミノ酸が切断されている（Ｉ１０）および最初の１６個のアミノ酸が切断されている（Ｖ１７）という違いであった。Ｉ１０構築物は、三量体形成ドメインの天然の欠失変異体を表し、Ｔｈｒ４においてＯ−グリコシル化部位を欠いている。Ｖ１７誘導体は、三量体形成ドメインをコードする最初のエキソンの欠失を表し、特徴的なヘパリン結合部位を欠いている。この部位はまた、Ｉ１０構築物において部分的に除去されている。図６に示されるように、ＩＬ−１Ｒａ分子のインビトロ有効性は、Ｕ９３７細胞アッセイにおいて立証された。
【０１１８】
これら３種の構築物ポリペプチドの薬物動態学的プロファイルを、ルイスラットにおける静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に分析した。得られたプロファイルを、同一の実験におけるＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の薬物動態学的プロファイルと比較した。薬物動態学的試験は、１群当りオスのルイスラット４匹を用いて実施し、使用した構築物は、ＦＬＩＬ−１Ｒａ、Ｉ１０ＩＬ−１Ｒａ、Ｖ１７ＩＬ−１ＲａおよびＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）であった。１００ｍｇ／ｋｇの単回用量を動物に静脈内投与した。試験化合物を、媒体（４．４ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、９３．８ｍＭのＮａＣｌ、０．３３ｍＭのＥＤＴＡ、０．７ｇのＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）に溶解し、尾静脈（正中仙骨静脈）または後足静脈（伏在静脈）を介して投与した。
【０１１９】
次に血液を、ベースライン（ゼロ時間）ならびに投与後０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間の時点で、１時点当り４匹の動物から採取した。およそ１００μｌの血液サンプルを、尾の先端からＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒｓ（商標）中に採取した。血漿を採取し、ポリプロピレンチューブに移した。次に測定が実施されるまで、血漿サンプルを≦７０℃で保存した。次いで、ＣＯ２吸入により動物を殺処理し、これらの死体を、病理学的検査をせずに廃棄した。次に血漿中のＩＬ−１Ｒａ化合物濃度およびＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）濃度を、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１２０】
各ラットの平均体重は、２５０グラムであった。ラットの平均血液量が１６．５ｍＬであるとすれば、静脈内注射後の化合物の理論的な最高の初期濃度は、１，５００，０００ｎｇ／ｍＬと算出される。これらの濃度を図７に示す。この初期濃度を、分析の出発値として用いた。動物に副作用または健康状態の変化は見られなかった。
【０１２１】
上記時点での血液サンプルの採取後、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、血液サンプル中の注射されたタンパク質を測定した。これらのＥＬＩＳＡ結果に基づき、薬物曝露の尺度として曲線下面積（ＡＵＣ）を用い、また標準的なソフトウェアを用いて血漿中の半減期を算出した。この曲線下面積を表２に示し、血漿中タンパク質の半減期を表３に示してある。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
これらの静脈内データより、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）と比較して三量体化合物の方が、優れた血漿中半減期を有することが示されている。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の半減期は、約１．２分であり、一方、静脈内注射後のＶ１７ ＩＬ１Ｒａ三量体タンパク質の半減期は、約６９分である。分析に用いられた評価基準に依ると、ＡＵＣの相対的増加は、ＦＬ ＩＬ１Ｒａ三量体に関する２倍とＶ１７ ＩＬ１Ｒａ三量体に関する５倍との間にあり、これは、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）に比較して、三量体化された変異体を用いた薬物曝露は実質的に改善することを示すものである。
【０１２５】
実施例５：Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａおよびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａの産生ならびにラットＣＩＡモデル
双方の分子は、２×ＴＹ培地（Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ）または化学的に規定された最少培地（ＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ）を用いて１０Ｌの発酵槽操作でＢＬ２１ ＡＩ細菌により産生された。５８８７×ｇで２０分間の遠心分離により細胞ペレットが得られ、次に１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６中に再懸濁させた。Ｍｅｔ−Ｉ０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａについては、高圧ホモジネート（２×１７，０００ｐｓｉ）に次いで、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離により目的のタンパク質を含有する可溶性の細胞フラクションを得た。上澄液を、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．４で希釈し、ＡＫＴＡ ｆＰＬＣを用いて、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（カチオン交換、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、次いでＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アニオン交換、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。最終ステップにおいて、タンパク質は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルター（Ｐａｌｌ）を通過させてエンドトキシンを除去し、次いで緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７．４に交換し、濃度を５０ｍｇ／ｍＬにした。ＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａタンパク質は、Ｎ末端ブースタードメイン、ファージＣＩＩタンパク質、続いてヒトグランザイムＢ開裂部位を含む融合タンパク質として発現した。ＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａは、リゾチームを含有する溶解用緩衝液中でのホモジネートに次いで、８０００ｒｐｍで２５分間遠心分離することにより、発酵細胞ペレットから精製した。次に上澄液は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤキレート（Ｍ）カラム（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）を通過させ、溶出液の緩衝液を、２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌに交換した。次にこのタンパク質フラクションを、ヒト組換えグランザイムＢ（社内作製、特許参照）で消化した。ＰＢＳ ｐＨ６で希釈した後、タンパク質は、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、次いでＭｕｓｔａｎｇＥろ過および流動様式のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤキレート（Ｍ）カラムを用いて精製し、融合タグおよびヒトグランザイムＢを除去した。最後に、タンパク質の緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７．４に交換し、５０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａおよびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ双方のタンパク質に関する収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８）、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＳにより判定すると、３ｇ〜５ｇ／Ｌ、純度＞９５％であった。ＬＡＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ）を用いて判定すると、エンドトキシン濃度は、＜３ＥＵ／ｍｇであった。分析ＳＥＣにより判定すると、凝集体は、＜０．５％であり（図９）、宿主細胞タンパク質は、＜６ｎｇ／ｍＬであった。Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａの２つのバッチ（ＬＭ０２２、ＬＭ０２３）およびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａの２つのバッチ（ＣＦ０１９、ＣＦ０２０）を、上記アッセイにより試験した。
【０１２６】
４日確立の（4-day established）ＩＩ型コラーゲン関節炎のメスのルイスラットを、１日〜３日の関節炎に対して毎日（ＱＤ）、媒体（１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４）により、あるいは単量体ＩＬ−１Ｒａ（１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））または三量体化ＩＬ−１Ｒａ（１２０ｍｇ／ｋｇのＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａもしくは１２０ｍｇ／ｋｇのＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ）を投与する等モル量のＩＬ−１Ｒａにより、皮下（ＳＣ）処置した。対照を１セットのみとするため、ＱＤ群における全てのラットに、第二回目と第三回目の投与に際してそれぞれの媒体（１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４、またはＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）についてはクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５）を投与し、操作を一定に保った。動物は、関節炎４日目で殺処理した。効力の評価は、曲線下面積（ＡＵＣ）で表される足首のカリパス測定、最後の後足の重量および体重に基づいた（Bendele et al 2000, Arthritis + Rheumatism 43:2648-2659）。動物は全て試験終了まで生存した。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）またはその媒体（ＣＳＥＰ）を注射されたラットは、注射処置時に鳴いたことから、皮下炎症が生じたことを示唆する。他のものを用いた注射では鳴かなかった。
【０１２７】
１ケージ当り４匹の飼育動物（関節炎群につき８匹、正常群につき４匹）に、イソフルランで麻酔をかけ、０日目および６日目に、尾のつけねと２箇所の背中とに２ｍｇ／ｍｌのウシＩＩ型コラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オーウェンスビレ、ミズーリ州）を含有する３００μｌのフロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、デトロイト、ミシガン州）を皮下／皮内（ＳＣ／ＩＤ）注射した。皮下経路による投与（２４時間の間隔で毎日）を、関節炎１日目に開始し、３日目まで継続した。実験群は表４に示すとおりである。
【０１２８】
【表４】
【０１２９】
関節炎の０日目〜４日目にラットの体重を量り、足首のカリパス測定を関節炎０日目から開始して毎日行った（試験９日目）。最後の体重測定後に、動物を安楽死させ、後足を、内くるぶしと外くるぶしの面で切断し、（一対で）重量を量った。
【０１３０】
１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（３日目〜４日目）処置、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（２日目〜４日目）処置、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（３日目〜４日目）処置されたラットは、媒体処置された疾患対照動物と比較して、足首の直径の有意な減少が見られた。媒体処置された疾患対照動物と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置（３４％）、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（５４％）処置、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（４９％）処置されたラットでは、足首の直径のＡＵＣが有意に減少した。毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置は、毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置と比較して足首の直径のＡＵＣが有意に減少する試験結果となった（試験の終了時においてｐ＜０．０３５）。また、試験の終了時における毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置と比較して、毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置により、足首の直径のＡＵＣが有意に減少する試験結果となった（ｐ＜０．００１）（図１０）。
【０１３１】
媒体処置の疾患対照動物と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置（６１％）、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（７９％）、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（９１％）されたラットでは、最終的な足重量が有意に減少した。毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置と比較して、毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置により最終的な足重量が有意に減少する試験結果となった（ｐ＜０．００６）（図１１）。
【０１３２】
媒体処置された疾患対照動物と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置（５４％）、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（４９％）、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（６５％）されたラットの体重の変化は、正常値へと有意に増加した。
【０１３３】
実施例６：ストレプトゾシン（ＳＴＺ）誘導型糖尿病モデル
絶食させたＣ５７ＢＬ／６Ｊオスのマウスに、ＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０ｍｇ／ｋｇを、連続５日間、毎日１回、腹腔内投与した。マウスは、１日目から４日目にかけて血中グルコース濃度が徐々に増していった。この血中グルコース濃度は、ＳＴＺ誘導期間中に、６．９ｎｍｏｌ／Ｌから１３．１ｎｍｏｌ／Ｌまで上昇した。５日間（４日目）の最後のＳＴＺ投与後に、良好な状態の１０匹のマウスをそれぞれが含む１０個の処置群に、マウスを無作為に分配した。糖尿病の発症前のこの日に処置を開始し、発症後も処置を継続した。処置群は表５に示すとおりである。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
試験期間は２８日であり、処置期間中、マウスの体重を週１回量った。糖尿病の発症をモニターするために、血中グルコース濃度を、試験期間中、１日おきに測定した。尾静脈からの出血により、全血から液滴で採血し、Ａｓｃｅｎｓｉａ ＥＬＩＴＥ（登録商標）の血中グルコース試験ストリップ上に乗せて、Ａｓｃｅｎｓｉａ ＥＬＩＴＥ（登録商標）の血中グルコース計測器（Ｂａｙｅｒ）で分析した。これらの値を記録し、処置開始時の濃度と比較して、処置群におけるｘ倍の増加を算出した。臨床的症状は、反対の症状が生じた群において毎日または適宜観察した。
【０１３６】
図１２に示されるように、１００ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ双方でのＩ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１−ＲａまたはＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）のいずれの毎日の腹腔内投与後にも、血中グルコース濃度の著しい減少が見られた。さらに、１００ｍｇ／ｋｇでのＩ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１Ｒａの週２回の投与では、１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の毎日の投与と効果が等しかった。これらのデータは、三量体化ＩＬ−１Ｒａが、実験的に誘導した糖尿病の治療に有効であることを実際に示している。
【０１３７】
上記に示した実施例は、単に例示を目的としたものであり、本発明の全ての可能な実施形態、適用または修飾の網羅的な列挙であること意味するものではない。したがって、本発明の範囲と意図から逸脱することなく、本発明の記載された方法およびシステムの種々の修飾と変更は、当業者にとって明らかとなろう。本発明を、具体的な実施形態に関連して記載したが、当然のことながら、特許請求された本発明は、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきものではない。具体的には、分子生物学、免疫学、化学、生化学または関連分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための記載された様式に関する種々の修飾は、添付された請求項の範囲内にあることが意図される。
【０１３８】
本発明は、当然のことながら、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、当業者に認識されるように、これらを変えることができる。また本明細書に用いられる用語は、当然のことながら、特定の実施形態の説明だけを目的として使用されており、本発明の範囲を限定する意図はない。また、本明細書および添付された特許請求の範囲に用いられる単数形「ある、その／この（ａ、ａｎ、およびｔｈｅ）」は、文脈により明確に別様に規定されない限り、複数系への言及を含んでいることに注意すべきである。したがって、例えば、「あるリンカー（a linker）」に対する言及は、当業者には既知の１つまたは複数のリンカーおよびそれらの均等物に対する言及である。
【０１３９】
別様に規定されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明に関係する当業者により一般に理解される用語と同じ意味を有する。本発明の実施形態およびその種々の特徴および利点は、非限定的な実施形態を参照してより十分に説明され、また添付の図面に例示され、そして明細書において詳述されている。図面に例示された特徴は、必ずしも縮尺どおりに描かれておらず、一実施形態の特徴は、たとえ本明細書に明白に述べられていなくても当業者が認識できるはずの他の実施形態で実施できる。
【０１４０】
本明細書に挙げられた数値はいずれも、任意の下限値と任意の上限値との間にある少なくとも２つの構成単位を分離できる１つの構成単位の増分の下限値から上限値にある全ての値を含む。例として、例えば、成分濃度または例えば、サイズ、角度の大きさ、圧力、時間などの処理変数の値が、例えば、１から９０、具体的には２０から８０、より具体的には３０から７０であると述べられている場合、それは、１５から８５まで、２２から６８まで、４３から５１まで、３０から３２までなどの値が本明細書において明確に示されていることを意図するものである。１未満の値については、１つの構成単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であると考えられる。これらは、単に具体的に意図される数値の例であり、示された数値の下限値と上限値との間の数値の可能な全ての組合せが、同様の様式で本明細書に明確に言及されていると考えるべきである。
【０１４１】
特定の方法、装置、および材料が記載されているが、本明細書に記載されたものと類似のまたは均等な方法および材料のいずれも、本発明の実施または試験に使用することができる。これまでに引用された全ての報文および参考文献および刊行物の開示は、各々が個々に参照として組み込まれているのと同程度に、それらの全体が参照として明確に本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照としてその全体が本明細書に援用される２００８年１０月８日出願の米国仮出願番号第６０／９７８，２５４号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、インターロイキン１により媒介される疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、このような疾患の治療に有用なインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＩＬ−１ファミリーは、自然免疫系の重要な一部分を担っており、適応免疫系の調節物質でもある。局所組織におけるＩＬ−１とＩＬ−１Ｒａとの間のバランスは、炎症性疾患の発症可能性およびそれに起因する構造的損傷に影響を与える。過剰量のＩＬ−１存在下では、関節、肺、胃腸管、中枢神経系（ＣＮＳ）または血管に、炎症性疾患および自己免疫疾患が発症し得る。ＩＬ−１Ｒａによるヒト疾患の治療は、組換えＩＬ−１Ｒａの注入により、または遺伝子療法アプローチにより実施される。組換えＩＬ−１Ｒａによる治療はリウマチ様関節炎（ＲＡ）に対して承認されており、変形性関節炎（ＯＡ）に対しては第二相試験が進行中である。
【０００４】
多くのヒト疾患におけるＩＬ−１の重要な炎症誘発性の役割が、ここ１０年間にわたって記載されている。ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒａとの間のバランスは、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、変形性関節炎（ＯＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肉芽腫性および線維性肺障害、腎疾患、肝臓疾患および膵疾患、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、白血病、癌、骨粗しょう症、糖尿病、中枢神経系疾患、感染症および動脈疾患などの多様な動物疾患モデルにおいて広範に研究されている。これら疾患の各々において、局所のＩＬ−１の過剰産生および／またはＩＬ−１Ｒａの産生不足が、被験体に疾患を発症し易くさせる。ＩＬ−１Ｒａの治療的投与は、組織損傷の予防に有効であることが示されている（非特許文献１を参照）。
【０００５】
ＩＬ−１ファミリーは、２つのアゴニストであるＩＬ−１αとＩＬ−１β；特異的な受容体アンタゴニストであるＩＬ−１Ｒａ；ならびに３つの異なる受容体であるＩＬ−１ＲタイプＩ（ＩＬ−１ＲＩ）、ＩＬ−１ＲタイプＩＩ（ＩＬ−１ＲＩＩ）およびＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰ）からなる。ＩＬ−１ＲＩは、２１５残基の長い細胞質ドメインを有する８０ｋＤａのタンパク質である。生物学的に不活性なＩＬ−１ＲＩＩは、２９残基の短い細胞質ドメインを有する６０ｋＤａのタンパク質である。ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰは、一本鎖のＩＬ−１ＲＩにＩＬ−１αまたはＩＬ−１βが結合した後に、その複合体に動員される。ＩＬ−１ＲＩおよびＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの細胞質ドメイン近傍で活性化されるシグナル伝達経路としては、ＮＦ−κＢ経路、ＪＮＫ／ＡＰ−１経路、およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路が挙げられる。ＩＬ−１ＲＩＩは、細胞膜上で双方のＩＬ−１を結合するデコイ受容体として、また体液相中の可溶性受容体として機能し、そのことによってＩＬ−１が機能的なＩＬ−１ＲＩと相互作用することを防ぐ。
【０００６】
ＩＬ−１ファミリーにおける第三のリガンド、ＩＬ−１Ｒａは、双方のＩＬ−１Ｒに結合するが細胞を活性化することはできない、ＩＬ−１の構造的な変異体である。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１αに１８％のアミノ酸相同性を有し、ＩＬ−１βに２６％のアミノ酸相同性を有する、１７ｋＤａのタンパク質である。元々イソ型と記載されていたＩＬ−１Ｒａは、単球、マクロファージ、好中球、および他の細胞から分泌され、現在ではｓＩＬ−１Ｒａと称されている。現在まで、ＩＬ−１Ｒａのさらに３つの細胞内イソ型が記載されている。上流のエキソンから別の転写スプライス機構によって作出されるＩＬ−１Ｒａの１８ｋＤａ体はｉｃＩＬ−１Ｒａ１と称され、ケラチノサイトおよび他の上皮細胞、単球、組織マクロファージ、線維芽細胞および内皮細胞中に見られる。ヒト白血球からクローン化されたＩＬ−１ＲａのｃＤＮＡは、そのｃＤＮＡの５’領域に挿入断片として、さらに６３ｂｐの配列を含有する。ｉｃＩＬ−１Ｒａ３と称されるＩＬ−１Ｒａの１５ｋＤａのイソ型は、単球、マクロファージ、好中球および肝細胞中に見られ、別の転写スプライスと別の翻訳開始の双方により作出され得る。
【０００７】
可溶性のＩＬ−１ＲａとｉｃＩＬ−１Ｒａ１は双方ともＩＬ−１Ｒに等しく良好に結合するが、ｉｃＩＬ−１Ｒａ３は受容体との弱い結合性を示す。ＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１ＲＩに結合するが、ＩＬ−１Ｒ ＡｃＰとＩＬ−１ＲＩとの結合を防ぐことにより特異的な受容体アンタゴニストとして機能し、その結果、シグナル伝達経路を開始できない。
【０００８】
デコイ受容体ＩＬ−１ＲＩＩは、細胞膜上および可溶性受容体として体液相中の両方でＩＬ−１と結合し、ＩＬ−１が機能的なＩＬ−１ＲＩと相互作用するのを防ぐ。したがって、可溶性のＩＬ−１ＲＩＩおよびＩＬ−１Ｒａは、ＩＬ−１を協同的に阻害することができる。可溶性のＩＬ−ＲＩは、ＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒａに結合することができるが、ＩＬ−１とＩＬ−１Ｒａとの間のバランスにより、可溶性のＩＬ−１ＲＩは炎症誘発剤として作用するようである。
【０００９】
ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、Ａｍｇｅｎからの大腸菌産生ＩＬ−１Ｒａであり、進行性のリウマチ様関節炎患者に利益を与えることが示されている。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、１日１回皮下注射する必要がある。皮下注射で、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、４時間から６時間の範囲の半減期を有し、静脈内注射では、半減期はおよそ２．５時間である。ＩＬ−１Ｒａは腎クリアランスにより除去される。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）はメチオニン基の存在により、天然のＩＬ−１受容体アンタゴニストとは異なるＩＬ−１の特異的受容体アンタゴニストである。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、単独でまたはメトトレキサートと組み合わせて投与すると、臨床的徴候および症状における改善、Ｘ線撮影上での進行の減少、患者の機能、痛みおよび疲労における改善により評価される利益を患者に与えることが示されている。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）は、臨床試験で実証されたように、好ましい安全性プロファイルを有している。
【００１０】
ＩＬ−１Ｒａの薬物動態不良を改善するために幾つかの試みがなされた。ＩＬ−１ベータのみを標的にする抗体が開発された。しかしながら、ＩＬ−１Ｒａとは対照的に、これはＩＬ−１ベータのみをブロックし、ＩＬ−１αの作用はブロックしない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】W.P. Arend, Cytokine & Growth Factor Reviews, 13 (2002) pp. 323-240
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＩＬ−１Ｒａ分子のより長い半減期および好ましい安全性プロファイルを提供する、ＩＬ−１Ｒａに関する改善された送達法に対する当分野における必要性を、本発明者らは認めた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、三量体形成ドメインおよびＩＬ−１活性を阻害するＩＬ−１Ｒａポリペプチド配列を含む融合タンパク質を提供する。一実施形態において、この融合タンパク質は、ＩＬ−１活性を阻害する配列番号３８の変異体または断片を含むＩＬ−１Ｒａ配列を含む。さらなる実施形態において、この融合タンパク質は、配列番号３８に少なくとも８５％同一性があるＩＬ−１Ｒａポリペプチド配列を含む。この融合タンパク質は、ポリエチレングリコールを含み得る。この融合タンパク質の三量体形成ドメインは、テトラネクチンから誘導できる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の３つの融合タンパク質を含む三量体複合体も提供する。一実施形態において、この三量体複合体は、テトラネクチン三量体形成構造エレメント（ＴＴＳＥ）である三量体形成ドメインを含む。一実施形態において、この三量体複合体は、配列番号１に少なくとも６６％同一性がある三量体形成ドメインを含む。さらなる実施形態において、この三量体複合体は、ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号３９）；ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４０）；ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４１）；ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４２）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４３）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４４）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４５）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号４６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１Ｒａ（配列番号５５）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５７）；およびＶ１７−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ１Ｒａ（配列番号５８）からなる群から選択される融合タンパク質のうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、三量体および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
さらに本発明は、インターロイキン１に媒介される疾患を治療するための方法に関する。この方法は、この方法を必要とする患者に、本発明の医薬組成物を投与することを含む。この疾患は、リウマチ様関節炎または糖尿病などの炎症性疾患であり得る。この方法はまた、抗炎症剤を患者に同時にまたは連続的に投与することを含む。
【００１６】
本発明はまた、当該融合タンパク質に共有結合した抗炎症剤をさらに含む融合タンパク質を提供する。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記にさらに詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】テトラネクチンタンパク質ファミリーの三量体形成構造エレメントのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ヒト・テトラネクチンのエキソン２およびエキソン３の最初の３個の残基を含む残基Ｖ１７からＫ５２（１文字コード）に相当するアミノ酸配列（配列番号５９）；マウス・テトラネクチン（配列番号６０）；リーフシャークの軟骨から単離されたテトラネクチンの相同タンパク質（配列番号６１）；およびウシ軟骨から単離されたテトラネクチンの相同タンパク質（配列番号６２）。７残基反復（heptad repeat）のａ位およびｄ位の残基を太字で記載する。テトラネクチンタンパク質ファミリーの三量体形成構造エレメントに見られる共通配列は、この領域中の他の保存された残基に加えて、図１に示された７残基反復中のａ位およびｄ位に存在する残基を含む。「ｈｙ」は、脂肪族の疎水性残基を示す。
【図２】透析によるＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａのリフォールディング結果を示す図である。
【図３】ＮｉＮＴＡ上でのＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａの捕捉を示す図である。
【図４】Ｕ９３７細胞におけるＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害するＧＧ−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ）およびＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ｔｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ）の能力を示すグラフである。
【図５】非ペグ化ＴｒｉｐＴおよびＴｒｉｐＶおよびＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）と比較した、Ｕ９３７細胞におけるＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害するペグ化ＴｒｉｐＴおよびＴｒｉｐＶの能力を示すグラフである。
【図６】ＰＫ試験に用いられたＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ＲａのＵ９３７細胞におけるＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害する能力を示すグラフである。
【図７】ラットにおける１００ｍｇ／ｋｇの静脈内注射後、ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ、およびＶ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａの血中濃度を示すグラフである。
【図８】複数のバッチであるＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ＬＭ０２２およびＬＭ０２３）およびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（ＣＦ０１９およびＣＦ０２０）のタンパク質収量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図９】Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１ＲａおよびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｐＴ−ＩＬ−１Ｒａタンパク質収量のＳＥＣ分析結果を示す図である。
【図１０】ラットのＣＩＡ試験結果を示す図である。ＩＩ型コラーゲン関節炎を有するメスのルイスラットの足首の直径は、媒体（１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４）、または単量体ＩＬ−１Ｒａ（１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））、もしくは三量体化ＩＬ−１Ｒａ（１２０ｍｇ／ｋｇのＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ、または１２０ｍｇ／ｋｇのＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ）を投与する等モル量のＩＬ−１Ｒａによる処置後に測定した。
【図１１】媒体処置された疾患対照動物と比較して、ラットをＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）、Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ ＱＤ、またはＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ ＱＤで処置した場合の最終的な足重量の減少試験を示す図である。
【図１２】Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１−ＲａまたはＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）による毎日の腹腔内投与後に見られた血中グルコース濃度の減少を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ＩＬ−１により媒介される疾患を治療するための化合物および方法に関する。一態様において、本発明は、三量体形成ドメインまたは多量体形成ドメインと融合したＩＬ−１Ｒａポリペプチド配列の融合タンパク質に関する。ＩＬ−１Ｒａ単独よりも高い安定性および改善された薬物動態特性を提供する組成物を提供し、かつ好ましい安全性プロファイルを提供するために、３つ以上の融合タンパク質を三量体化または多量体化することができる。
【００２０】
さらなる態様において本発明は、上記ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を提供し、ならびに特異的な発現および回収を可能にする条件下での上記ポリペプチドを調製する方法を提供する。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、有効量の医薬組成物を被験体に投与することにより、炎症性疾患の治療方法など、ＩＬ−１により媒介される病態を有する被験体の治療に使用するための医薬組成物の調製に使用できる。
【００２２】
本明細書に用いられる疾患または医学的状態は、自然発生的または実験的な疾患または医学的状態が体液中または組織中のＩＬ−１のレベル上昇に関連している場合、または身体から採取した細胞または組織が培養物中にＩＬ−１の上昇レベルを産生する場合、「インターロイキン１媒介疾患」または「インターロイキン１により媒介される疾患」と考えられる。多くの場合、このようなインターロイキン１媒介疾患はまた、以下のさらなる２つの条件によって認識される：（１）この疾患または医学的状態に関連する病理的所見が、ＩＬ−１の投与により、動物において実験的に模倣することができる；（２）この疾患または医学的状態の実験動物モデルに誘発させた病態が、ＩＬ−１の作用を阻害する薬剤による治療によって阻止または消滅させることができる。たいていのＩＬ−１媒介疾患において、これら３つの条件のうちの少なくとも２つが当てはまり、多くのＩＬ−１媒介疾患において、これら３つの条件の全てが当てはまる。急性および慢性のＩＬ−１媒介炎症性疾患の非排他的リストとして、限定はしないが、以下が挙げられる：痛風、急性膵炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；悪液質／食欲不振症；喘息；アテローム硬化症；慢性疲労症候群；発熱；糖尿病（例えば、インスリン糖尿病）；糸球体腎炎；移植片対宿主拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏症；炎症性腸疾患；変形性関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節炎およびリウマチ様関節炎などの関節の炎症性病態；脳虚血（例えば、外傷、てんかん、出血または脳卒中の結果の脳傷害、それらの各々は神経変性に至る可能性がある）などの虚血性傷害；肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）；多発性骨髄腫；多発性硬化症；骨髄性白血病（例えば、ＡＭＬおよびＣＭＬ）および他の白血病；筋疾患（例えば、特に敗血症における筋タンパク質の代謝）；骨粗しょう症；パーキンソン病；疼痛；早期分娩；乾癬；再灌流傷害；敗血症ショック；放射線療法による副作用、一時的な顎関節症、腫瘍転移；または、挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染症または他の疾患過程から生じる炎症性病態、およびマックル−ウェルズ症候群、家族性感冒自己炎症性症候群および新生児期発症多臓器炎症性疾患などのクライオピリン関連周期熱症候群。
【００２３】
本明細書に用いられる用語「多量体形成ドメイン」とは、２つ以上の他のアミノ酸配列と結合して、三量体複合体または他の多量体複合体を形成することのできる機能を有するアミノ酸配列を意味する。一例において、融合タンパク質は、他の２つの三量体形成ドメインを伴って三量体複合体を形成する三量体形成ドメインであるアミノ酸配列を含有する。三量体形成ドメインは、他の同一のアミノ酸配列の三量体形成ドメインと結合する（ホモ三量体）か、または異なるアミノ酸配列の三量体形成ドメインと結合する（ヘテロ三量体）ことができる。このような相互作用は、三量体形成ドメイン成分間の共有結合によって、また、水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力および塩架橋によって生じ得る。したがって、本発明の種々の実施形態において、多量体形成は、二量体形成ドメイン、三量体形成ドメイン、四量体形成ドメイン、五量体形成ドメインなどである。これらのドメインは、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の本発明の融合タンパク質からなるポリペプチド複合体を形成することができる。
【００２４】
本発明の融合タンパク質の三量体形成ドメインは、米国出願公開番号第２００７／０１５４９０１号（'901 Application）（参照としてその全体が本明細書に援用される）に記載されているように、テトラネクチンから誘導できる。全長ヒト・テトラネクチンポリペプチド配列は、本明細書において配列番号６３として提供されている。テトラネクチン三量体形成ドメインの例としては、配列番号６３のアミノ酸１７から４９、１７から５０、１７から５１および１７から５２が挙げられ、これらは、ヒト・テトラネクチン遺伝子のエキソン２によってコードされるアミノ酸、さらに任意に、この遺伝子のエキソン３によってコードされる最初の１個、２個または３個のアミノ酸を含む。他の例としては、アミノ酸１から４９、１から５０、１から５１および１から５２が挙げられ、これらは、この遺伝子のエキソン１およびエキソン２の全体、さらに任意に、この遺伝子のエキソン３によりコードされる最初の１個、２個または３個のアミノ酸を含む。あるいは、エキソン１によりコードされるアミノ酸配列の一部のみが三量体形成ドメインに含まれる。具体的には、三量体形成ドメインのＮ末端は、配列番号６３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７番目の残基のいずれからでも始めることができる。特定の実施形態において、Ｎ末端は、Ｉ１０またはＶ１７であり、Ｃ末端は、Ｑ４７、Ｔ４８、Ｖ４９、Ｃ（Ｓ）５０、Ｌ５１またはＫ５２（配列番号６３に従う番号付け）である。
【００２５】
本発明の一態様において、三量体形成ドメインは、米国出願公開番号第２００７／００１５４９０１号にさらに十分に記載されているテトラネクチンファミリー三量体形成構造エレメントの共通配列である、配列番号１のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体形成構造エレメント（「ＴＴＳＥ」）である。図１に示されているように、ＴＴＳＥは、タンパク質のテトラネクチンファミリーの天然メンバーの変異体、特に、αコイルドコイル三量体を形成するＴＴＳＥの能力にいかようにも実質的な程度の不利な影響を与えないアミノ酸配列における改変を有する変異体を包含する。本発明の種々の態様において、本発明による三量体ポリペプチドは、配列番号１の共通配列に、少なくとも６６％のアミノ酸配列同一性（確定された残基（Ｘａａではない）のみを計数する）；例えば、配列番号１の共通配列に、少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８６％または少なくとも９２％の配列同一性を有する三量体形成ドメインとしてのＴＴＳＥを含む。言い換えると、配列番号１の確定されたアミノ酸の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個を置換することができる。
【００２６】
特定の一実施形態において、配列番号６３における５０位のシステイン（Ｃ５０）は、望ましくない多量体形成に至り得る望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を避けるために、セリン、トレオニン、メチオニンまたは他の任意のアミノ酸残基へ有利に変異誘発することができる。他の公知の変異体は、アミノ酸残基番号（配列番号６３に従う番号付け）、６、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３５、３９、４１、および４２番目のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含むが、これらのアミノ酸残基は、らせんを破壊しない任意のアミノ酸残基により置換することができる。これらの残基は、天然のテトラネクチン単量体の３つのＴＴＳＥ間の三量体複合体を安定化する分子間相互作用には直接関与していないことが示されている。図１に示された一態様において、ＴＴＳＥは、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（Ｎ端からＣ端へ）で示される７残基反復を有し、式中、残基ａおよびｄ、すなわち２６位、３３位、３７位、４０位、４４位、４７位、５１位は任意の疎水性アミノ酸であってよい（配列番号６３に従う番号付け）。
【００２７】
さらなる実施形態において、ＴＴＳＥ三量体形成ドメインは、ポリヒスチジン配列および／またはプロテアーゼ開裂部位、例えば、血液凝集因子ＸａまたはＧｒａｎｚｙｍｅＢの開裂部位（本明細書に援用される米国出願公開番号第２００５／０１９９２５１号を参照のこと）の組込みによって、またＣ末端ＫＧまたはＫＧＳ配列を含めることによって改変することができる。また、精製を助けるために、２位のプロリンをグリシンによって置換してもよい。
【００２８】
ＴＴＳＥの切断体および変異体の特定の非限定的な例は、以下の表１に示されている。
【００２９】
【表１−１】
【００３０】
【表１−２】
【００３１】
三量体形成ドメインの他の例は、米国特許第６，１９０，８８６号に開示されており（その全体が本明細書に援用される）、これには、コレクションネック（collectin neck）領域を含むポリペプチドが記載されている。次いで、コレクションネック領域のアミノ酸配列を含む３つのポリペプチドにより、適切な条件下で三量体を作製することができる。
【００３２】
三量体形成ドメインの他の例は、参照としてその全体が本明細書に援用される２００７年１１月９日に本出願の譲受人により出願された米国仮出願番号第６０／９９６，２８８号に記載されているＭＢＰ三量体形成ドメインである。この三量体形成ドメインは、さらにオリゴマー化して、高次の多量体複合体を作出することができる。
【００３３】
本発明のＩＬ−１Ｒａポリペプチドは、三量体形成ドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基のいずれにも連結できる。フレキシブルな分子リンカーを任意に、ＩＬ−１Ｒａであるポリペプチドと三量体形成ドメインとの間に組み込み、共有結合により連結することができる。このリンカーは約１個から２０個、２個から１０個、または３個から７個のアミノ酸残基のポリペプチド配列であることが好ましい。さらなる実施形態において、このリンカーは、非免疫原性であり、容易にはタンパク質分解により開裂せず、他の残基と相互作用することが知られているアミノ酸残基（例えばシステイン残基）を含まない。
【００３４】
本明細書に用いられる「ＩＬ−１Ｒａ」とは、下記：
【化１】
に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。
【００３５】
また、「ＩＬ−１Ｒａ」の定義には、ＩＬ−１Ｒに対するＩＬ−１Ｒａの結合を示す、好ましくはＩＬ−１Ｒ阻害活性を示す配列番号３８の変異体および断片が含まれる。このような断片は、全長の天然ＩＬ−１Ｒａタンパク質と比較して、ＩＬ−１ＲａのＮ末端またはＣ末端において切断されていてもよいし、または、内部残基を欠損していてもよい。特定の断片は、本発明による三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質の所望の生物学的活性にとって必須ではないアミノ酸残基が欠損され得る。例えば、Evans, et al. （J.Biol.Chem. 1995、19:11477-11483）は、部位特異的変異誘発により、ＩＬ−１Ｒに対する結合にとってＴｒｐ１６、Ｇｌｎ２０、Ｔｙｒ３４、Ｇｌｎ３６およびＴｙｒ１４７だけが必須であり、機能的分子を維持しつつ他のアミノ酸位置を変更できることが示されている。さらに、Dahlen, et al. （J.Immunotoxicology 5:189-199 (2008)）により示されるように、ＩＬ−１Ｒａとその受容体とのループ相互作用を増大させるために、結合領域の外側のアミノ酸を変異させ、それにより、ＩＬ−１Ｒａのその受容体に対する親和性を改善することができる。これは、ＩＬ−１Ｒａ受容体結合領域の外側のアミノ酸の変異、具体的には、例えば、Ｄ４７Ｎ、Ｅ５２Ｒ、Ｅ９０Ｙ、Ｐ３８Ｙ、Ｈ５４Ｒ、Ｑ１２９ＬおよびＭ１３６Ｎ（同上）によって達成できる。さらに、天然のＩＬ−１Ｒａ変異体が存在し、そのいずれも使用することができる。上流エキソンからの別の転写スプライス機構によって作出されたＩＬ−１Ｒａの１８ｋＤａ体は、ｉｃＩＬ−１Ｒａ１と称され、ケラチノサイト、ならびに他の上皮細胞、単球、組織マクロファージ、線維芽細胞および内皮細胞の内部に見られる。ヒト白血球からクローン化されたＩＬ−１Ｒａ ｃＤＮＡは、そのｃＤＮＡの５’領域に挿入断片としてさらに６３ｂｐの配列を含有する。ｉｃＩＬ−１Ｒａ３と称される、ＩＬ−１Ｒａの１５ｋＤａイソ型は、単球、マクロファージ、好中球、および肝細胞の中に見られ、別の転写スプライスと別の翻訳開始の双方によって作出することができる。
【００３６】
本発明の融合タンパク質にとって有用なＩＬ−１Ｒａペプチドは、配列番号３８に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一性があるポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３８に、少なくとも８５％同一性があり、ＩＬ−１Ｒ結合活性、好ましくはＩＬ−１Ｒａ阻害活性を有するＩＬ−１Ｒａペプチド配列を含む。別の特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３８に、少なくとも９５％同一性があり、ＩＬ−１Ｒ結合活性、好ましくはＩＬ−１Ｒａ阻害活性を有するＩＬ−１Ｒａペプチド配列を含む。これらの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３８の番号付けによるＴｒｐ１６、Ｇｌｎ２０、Ｔｙｒ３４、Ｇｌｎ３６およびＴｙｒ１４７を含む。これらのポリペプチドはさらに、１つまたは複数のアミノ酸置換、Ｄ４７Ｎ、Ｅ５２Ｒ、Ｅ９０Ｙ、Ｐ３８Ｙ、Ｈ５４Ｒ、Ｑ１２９ＬおよびＭ１３６Ｎ（配列番号３８の番号付けによる）を含む。さらに、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドの変異体は、１つまたは複数のアミノ酸を、同様な構造特性または化学特性を有する別のアミノ酸、例えば保存的アミノ酸置換体によって置換することにより達成することができる。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明による融合タンパク質は、以下から選択されるＩＬ−１受容体アンタゴニストから選択される：
【化２】
【化３】
式中、下線部は、三量体形成単位を示し、太字部はＩＬ−１Ｒａ部分を示す。
【００３８】
融合タンパク質の作製
本発明の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質は、化学的に合成することもできるし、または何らかの好適な標準的タンパク質発現系に発現させることもできる。タンパク質発現系は、そこから所望のタンパク質が容易に単離でき、インビトロでリフォールディングできる系であることが好ましい。原核生物の発現系は、高収量のタンパク質を得ることができ、また効率的な精製とリフォールディングの方法が利用できることから好ましい。真核生物の発現系もまた使用できる。したがって、適切な発現系の選択は、十分に当業者の能力と裁量の範囲内にある。同様に、本発明の融合タンパク質のアミノ酸の一次配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内へのプロテイナーゼ開裂部位の導入などの要因を考慮に入れて、所望のタンパク質をコードする適切な組換えＤＮＡ構築物を容易に設計することができる。これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択された宿主に適切な多くの発現ベクターのいずれかの内にインフレームで挿入することができる。発現ベクターは、組換え構築物の発現を駆動するために、強力なプロモーターを含むことが好ましい。
【００３９】
本発明の融合タンパク質は、その融合タンパク質が発現される条件下で、本融合タンパク質をコードするベクターによって形質転換した宿主を培養することにより、任意の好適な標準的タンパク質発現系において発現させることができる。この発現系は、そこから所望のタンパク質が容易に単離でき、インビトロでリフォールディングできる系であることが好ましい。一般に、原核生物の発現系が、高収量のタンパク質を得ることができ、また効率的な精製とリフォールディングの方法が利用できることから好ましい。したがって、適切な発現系の選択（ベクターおよび細胞型を含めて）は、当業者の知識の範囲内にある。同様に、本発明の融合タンパク質のアミノ酸の一次配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ開裂部位の導入などの要因を考慮に入れて、所望のアミノ酸配列をコードする適切な組換えＤＮＡ構築物を容易に設計することができる。
【００４０】
一実施形態において、単離ポリヌクレオチドが、本発明の融合タンパク質をコードする。別の実施形態において、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドおよび三量体形成ドメインは、連続していないポリヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、いくつかの実施形態において、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドおよび三量体形成ドメインは、別々のポリペプチドとして発現され、単離および精製されてから共に融合されて、本発明の融合タンパク質が形成される。
【００４１】
これらの組換えＤＮＡ構築物は、選択された宿主に適切な多くの発現ベクターのいずれかの内にインフレームで挿入することができる。一定の実施形態において、発現ベクターは、組換え融合タンパク質構築物の発現を制御する強力なプロモーターを含む。本発明の融合タンパク質を作出するために組換え発現法を用いた場合、得られた融合タンパク質は、当分野に周知の好適な標準的操作を用いて、単離し精製することができ、任意に、例えば、凍結乾燥などのさらなる処理に供することができる。
【００４２】
組換えＤＮＡ分子、タンパク質および融合タンパク質産生のために、また組織培養および細胞の形質転換のために、標準的な技法を使用することができる。例えば、Sambrook, et al.（下記）またはCurrent Protocol in Molecular Biology（Ausubel, et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons、1994）を参照されたい。精製法は一般に、製造元の指示に従って実施されるか、またはSambrook, et al.（Molecular Cloning:A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY（1989）に記載されているような慣例的な手順を用いて当分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載されているとおりに実施される。特に定義が与えられない限り、実験上の手順、ならびに本明細書に記載された分子生物学、生化学、分析化学、および薬剤／製薬化学に関連する技法に関連して利用される命名法は、当分野で周知の一般的なものである。生化学的合成、生化学的分析、薬学的調製、製剤、ならびに送達、および患者の処置に関しては、標準的な技法を使用することができる
【００４３】
当然のことながら、フレキシブルな分子リンカーは、任意に、ＩＬ−１Ｒａポリペプチドと三量体形成ドメインとの間に組み込んで、共有結合により連結することができる。一定の実施形態において、リンカーは、約１個から２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列である。リンカーは、１０個未満のアミノ酸であってよく、最も好ましくは、５個、４個、３個、２個、または１個のアミノ酸であってよい。ある場合には、９個、８個、７個、または６個のアミノ酸が好適であり得る。有用な実施形態において、リンカーは本質的に非免疫原性であり、容易にタンパク質分解により開裂することはなく、他の残基と相互作用することが知られているアミノ酸残基（例えばシステイン残基）を含まない。
【００４４】
以下の記述はまた、１つまたは複数の化学基に共有結合している（以下「コンジュゲートしている」）融合タンパク質、および三量体複合体を作製する方法に関する。このようなコンジュゲートにおける使用に好適な化学基は、有意に毒性または免疫原性がないことが好ましい。この化学基は任意に、保存でき、かつ保存に好適な条件下で使用できるコンジュゲートを作製するために選択される。ポリペプチドにコンジュゲートできる種々の代表的な化学基が当分野で知られており、例えば、糖タンパク質上に自然に生じる炭水化物などの炭水化物、ポリグルタメート、およびポリオール類などの非タンパク様ポリマーが挙げられる（例えば、米国特許第６，２４５，９０１号を参照）。
【００４５】
ポリオールは、例えば、上記の国際公開第ＷＯ９３／００１０９号に開示されているように、リシン残基を含む、１つまたは複数のアミノ酸残基において、本発明の融合タンパク質とコンジュゲートすることができる。使用されるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、線状鎖または分枝状鎖を有していてよい。好適なポリオールとしては、１つまたは複数のヒドロキシル位において、１個から４個の間の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換されたものが挙げられる。一般に、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であり、かくして、残りの議論は例示的な実施形態に関連しており、記述の容易のため、そこでは、使用されるポリオールはＰＥＧであり、ポリペプチドにポリオールをコンジュゲートする過程を「ペグ化」と称する。しかしながら、ＰＥＧに関して本明細書に記載したコンジュゲートのための技法を用いて、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリオール類が使用できることを、当業者は認識している。
【００４６】
ＩＬ−１Ｒａのペグ化に使用されるＰＥＧの平均分子量は変わる可能性があり、一般に、約５００ダルトン（Ｄ）から約３０，０００Ｄの範囲であり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約１，０００Ｄから約２５，０００Ｄ、より好ましくは約１，０００Ｄから約５，０００Ｄである。一実施形態において、ペグ化は、約１，０００Ｄの平均分子量を有するＰＥＧによって実施される。任意に、ＰＥＧホモポリマーは非置換であるが、その一端がアルキル基により置換されていてもよい。アルキル基はＣ１〜Ｃ４アルキル基であることが好ましく、メチル基であることが最も好ましい。ＰＥＧ製剤は市販品として入手できるが、一般に、本発明における使用に好適なＰＥＧ製剤は、平均分子量により販売された不均一製剤である。例えば、市販品として入手できるＰＥＧ（５０００）製剤は一般に、分子量がわずかに、通常は±５００Ｄ異なる分子を含有する。小型分子化合物（例えば化学療法剤）へのコンジュゲート；シグナル分子（例えば蛍光体）へのコンジュゲート；特異的結合ペア（例えばビオチン／ストレプトアビジン、抗体／抗原）の分子へのコンジュゲート；またはグリコシル化、ＰＥＧ化もしくは安定化ドメイン（例えばＦｃドメイン）へのさらなる融合による安定化などの当分野に公知の技法を用いて、本発明の融合タンパク質をさらに改変することができる。
【００４７】
タンパク質ペグ化のための種々の方法が当分野において知られている。ＰＥＧにコンジュゲートさせたタンパク質を作製する特定の方法としては、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，９３５，４６５号および米国特許第５，８４９，５３５号に記載された方法が挙げられる。一般にタンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量などに依って、ポリマー上の末端の反応基に対しタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸残基を介して共有結合される。（複数の）反応基を有するポリマーは、本明細書において活性化ポリマーと称される。反応基は、タンパク質上のフリーのアミノ基または他の反応基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは、ランダムなまたは部位特異的な様式で、タンパク質上のアミノ基または他の反応基と結合することができる。しかし、最適な結果を得るために、選択される反応基のタイプおよび量、ならびに使用されるポリマーのタイプは、反応基がタンパク質上のあまりにも多くの特定の活性基と反応することを避けるために使用される特定のタンパク質またはタンパク質変異体に依存することは理解されたい。これは完全に避けることが不可能かもしれないので、タンパク質濃度に依り、一般にタンパク質１モル当たり、約０．１モルから約１０００モル、好ましくは２モルから２００モルの活性化ポリマーを使用することが推奨される。タンパク質１モル当たり活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持すると同時に、可能な場合は、タンパク質の循環半減期を最適化しつつ、調整する。
【００４８】
本明細書に用いられる場合、用語「ポリオール」とは、広く多価アルコール化合物のことである。ポリオールは、例えば、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであってよく、直鎖または分枝鎖を有していてもよい。好ましいポリオールとしては、１つまたは複数のヒドロキシル位を、１つ〜４つの間の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換したものが挙げられる。一般にポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。しかしながら、ＰＥＧに関して本明細書に記載したコンジュゲートのための技法を用いて、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリオール類が使用できることを、当業者は認識している。本発明のポリオールには、当分野に周知のもの、および市販品として入手可能な供給源などから公的に入手できるものが含まれる。
【００４９】
さらに、血清アルブミン結合ペプチド、ＦｃＲｎ結合ペプチドまたはＩｇＧ結合ペプチドなどの他の半減期延長性の分子（half-life extending molecule）を、三量体形成ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合させることができる。
【００５０】
一実施形態において、本発明の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質を、大腸菌などの原核宿主細胞内に発現させ、さらに第三のポリペプチド、すなわち第三の融合の相手に結合させる。したがって、このような第三の融合の相手を、本発明の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質に付加させることによって、高収量の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質を得ることができると考えられる。第三の融合相手は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドまたはヘキサペプチドなど、任意の好適なペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ある場合には、融合相手は単独のアミノ酸であり得る。融合相手は、タンパク質分解性の分解に対して融合タンパク質をより抵抗性にするように、融合タンパク質の発現および分泌の増大が促進されるように、可溶性が改善されるように、および／または融合タンパク質の後のアフィニティー精製が可能となるように選択できる。
【００５１】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質（すなわち、ＩＬ−１Ｒａ部分および三量体形成ドメイン）とユビキチンなどの第三の融合相手との間の接合領域は、グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位、例えば米国出願公開番号第２００５／０１９９２５１号に記載されているヒトグランザイムＢ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．７９）開裂部位を含む。
【００５２】
第三の融合相手は、さらなる実施形態において、アフィニティータグと結合されてよい。このようなアフィニティータグは、アフィニティー樹脂上での融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティードメインであり得る。アフィニティータグは、ヘキサヒスタグなどのポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｓタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼタグ、またはマルトース結合タンパク質であり得る。
【００５３】
上記のアフィニティータグシステムの使用により固定化された融合タンパク質の酵素による開裂によって形成される三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質を単離する単離ステップにも、本発明の方法は及びうる。この単離ステップは、イオン交換およびサイズによる分画の使用など、当分野に公知のタンパク質単離のための任意の好適な手段によって実施することができ、その選択は、融合タンパク質の性質に依存する。一実施形態において、第三の融合相手と三量体形成ドメインおよびＩＬ−１Ｒａを含む領域との間の領域を、ヒトセリンプロテアーゼ・グランザイムＢによりつなぎ、グランザイムＢプロテアーゼ開裂部位で融合タンパク質を開裂させ、本発明の融合タンパク質が得られる。
【００５４】
本発明はまた、少なくとも１つの上記の核酸を含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットを提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および要すれば他の配列などの適切な調節配列を含む好適なベクターを選択するか、または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウィルス、ファージ、またはファージミドであり得る（Molecular Cloning:a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００５５】
本発明はまた、本発明の１つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、細菌系、哺乳動物細胞系、酵母系およびバキュロウィルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現に利用できる哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラー細胞、仔ハムスター腎細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞および他の多数のものが挙げられる。好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【００５６】
医薬組成物
さらに別の態様において、本発明は、薬学的に許容できる担体または賦形剤と共に、本発明の融合タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物に関する。本明細書に用いられる「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤ならびに抗真菌剤、等張化剤ならびに吸収遅延剤などのいずれかおよび全てが含まれる。薬学的に許容できる担体または薬学的に許容できる賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つまたは複数、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、前記組成物中に、等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。湿潤剤などの薬学的に許容できる物質、または湿潤剤または乳化剤などの微量の補助的物質、抗体または抗体部分の使用期限または有効性を増強する保存剤または緩衝剤もまた含めることができる。任意に、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩などの崩壊剤を含めることができる。賦形剤に追加して、医薬組成物は、以下の１つまたは複数を含むことができる：血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝剤、結合剤、甘味剤および他の風味剤；着色剤およびポリエチレングリコール。
【００５７】
これらの組成物は、例えば、溶液剤（例えば、注射用液剤および注入用液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム剤および座剤など、液体、半固体および固体の剤形など、種々の形態であり得る。好ましい形態は、意図される投与経路および治療適用に依る。一実施形態において、これらの組成物は、注射用液剤または注入用液剤の形態であり、例えば、抗体によるヒトの受動的免疫化に用いられるものと同様の組成物である。一実施形態において、投与様式は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。一実施形態において、融合タンパク質（または三量体複合体）は、静脈内注入または静脈内注射により投与される。別の実施形態において、融合タンパク質または三量体複合体は、筋内注射または皮下注射により投与される。
【００５８】
医薬組成物投与の他の好適な経路としては、限定はしないが、経口、経直腸、経皮、経膣、経粘膜または経腸投与が挙げられる。
【００５９】
治療用組成物は一般に滅菌状態であり、製造および貯蔵の条件下で安定である。組成物は、高薬剤濃度に好適な液剤、ミクロ乳剤、分散剤、リポソーム剤、または他の指示された構造に製剤化することができる。滅菌注射用液剤は、必要量の活性剤（すなわち、融合タンパク質または三量体複合体）を、必要ならば上記に挙げた成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に組み入れた後に、ろ過滅菌することによって調製することができる。一般に分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒ならびに他の上記に挙げた成分からの必要な成分を含有する滅菌媒体内へ組み入れることによって調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥、および活性成分の散剤と、先の滅菌ろ過されたその液剤から任意の所望の追加成分とが得られる凍結乾燥である。液剤の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合は必要な粒径の維持により、また界面活性剤の使用により維持することができる。注射用組成物の吸収延長は、この組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００６０】
本明細書に記載された障害の治療に有用な治療薬を含有するキットなどの製造品は、少なくとも１つの容器と１つのラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、種々の材料から形成することができる。容器の上の、または容器に結合したラベルは、この製剤が、選択された病態の治療に用いられることを指示する。この製造品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース液などの薬学的に許容できる緩衝液を含む容器をさらに含み得る。この製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明のついた添付文書など、商業的な、および使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含み得る。この製造品は、上記の別の活性剤を有する容器も含み得る。
【００６１】
一般に、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容できる塩が製剤中に用いられる。薬学的に許容できる担体の例としては、生理食塩水、リンガー液およびデキストロース液が挙げられる。製剤のｐＨは、好ましくは約６から約９、より好ましくは、約７から約７．５である。例えば、投与経路および治療薬の濃度に依り、一定の担体がより好ましいと考えられることは当業者には明らかであろう。
【００６２】
治療用組成物は、凍結乾燥製剤、水性液剤、または水性懸濁剤の形態で、任意の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A. ed.（1980））と共に、適切な純度を有する所望の分子を混合することにより調製することができる。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度において、レシピエントに対して無毒であることが好ましく、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド類；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン類などの親水性ポリマー類；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸類；グルコース、マンノース、またはデキストリン類などの単糖類、二糖類、および他の糖質；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が含まれる。
【００６３】
このような担体のさらなる例としては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩類、または硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムなどの電解質、コロイダルシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、およびセルロースベースの物質が挙げられる。局所用またはゲルベースの形態に対する担体としては、カルボキシメチルセルロースンナトリウムまたはメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート類、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、および木材ワックスアルコール類が挙げられる。全ての投与で、慣例的なデポー形態は好適に用いられる。このような形態としては、例えば、ミクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、および徐放製剤が挙げられる。
【００６４】
インビボ投与に用いられる製剤は滅菌状態でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌ろ過膜を通してろ過することによって容易に達成される。製剤は全身投与される場合は、凍結乾燥形態で、または溶液で保存できる。凍結乾燥形態の場合、一般に、使用時に適切な希釈剤と共に再構成するために他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の一例は、皮下注射用の単回投与バイアルに充填された滅菌、清澄、無色の非保存液剤である。
【００６５】
治療用製剤は一般に、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、静脈内用液剤バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な密栓を有するバイアルの中に入れられる。製剤は、反復される静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋内（ｉ．ｍ．）の注射剤もしくは注入剤として、または鼻腔内もしくは肺内の送達に好適なエアロゾル製剤として投与されることが好ましい（肺内送達に関しては、例えば、EP 257,956を参照）。
【００６６】
本明細書に開示された分子は、徐放製剤の形態で投与することもできる。徐放製剤の好適な例としては、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、形状化製品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、Langer et al., J.Biomed.Mater.Res.、15:167-277（1981）およびLanger、Chem.Tech.、12:98-105（1982）に記載されているポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー類（Sidman et al., Biopolymers、22:547-556（1983））、非分解性エチレン−ビニルアセテート（Langer et al.,上記）、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）が挙げられる。
【００６７】
治療方法
本発明の他の態様は、ＩＬ−１Ｒａに媒介される疾患を治療する方法に関する。この方法は、本発明の医薬組成物の治療的有効量により、このような疾患に罹っている被験体を治療することを含む。
【００６８】
本発明の他の態様は併用療法に関する。治療薬を含む製剤もまた本発明により提供される。このような製剤は、貯蔵にとって、ならびに治療的投与にとって特に好適であると考えられる。これらの製剤は公知の技法によって調製できる。例えばこれらの製剤は、ゲルろ過カラム上の緩衝液交換によって調製できる。
【００６９】
これらの医薬組成物は、ボーラスとしての静脈内投与などの公知の方法により、または一定時間にわたる連続的注入により、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、脊髄内、経口、局所、または吸入経路により投与することができる。任意に、市販品として入手できる種々の装置を用いたミニポンプ注入により、投与を行うことができる。
【００７０】
三量体ＩＬ−１Ｒａを投与するための有効な投与量と投与スケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定は当分野の範囲内にある。単回投与または複数回投与を用いることができる。現在、単独で用いられる三量体ＩＬ−１Ｒａの有効な投与量または量は、１日当り体重１ｋｇにつき約１μｇから約１００ｍｇの範囲またはそれ以上であり得ると考えられている。投与量の種間換算は、例えば、Mordenti et al., Pharmaceut. Res.、8: 1351 (1991)に開示されるように、当分野に知られた様式で実施することができる。
【００７１】
ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質のインビボ投与が用いられる場合、通常の投与量は、投与経路に依って、１日当り哺乳動物の体重１ｋｇにつき約１０ｎｇから約１００ｍｇまでまたはそれ以上、好ましくは、約１μｇ／ｋｇ／日から５０ｍｇ／ｋｇ／日まで変わり得る。具体的な投与量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されている（例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；米国特許第５，２０６，３４４号；または米国特許第５，２２５，２１２号を参照）。種々の製剤が、種々の治療用化合物および種々の障害にとって有効であること、１つの臓器または１つの組織を標的とする投与が、例えば、別の臓器または組織への送達様式とは異なる送達様式を必要とし得ることを当業者は認識するであろう。投与しなければならない三量体ＩＬ−１Ｒａの投与量が、例えば、三量体ＩＬ−１Ｒａが与えられる哺乳動物、投与経路、および哺乳動物に投与されている他の薬物または治療法に依って変わり得ることを当業者は理解するであろう。
【００７２】
三量体複合体と他の治療剤（１つまたは複数の他の治療法）とを、並行に（同時に）または連続的に投与することができる。特定の実施形態において、融合タンパク質または三量体複合体と治療剤とは、並行投与される。別の実施形態において、融合タンパク質または三量体複合体は、治療剤の投与前に投与される。別の実施形態において、治療剤は、融合タンパク質または三量体複合体の前に投与される。投与後、処置した細胞をインビトロで分析することができる。インビボ治療が行われた場合、治療を受けた哺乳動物を、熟練医師によく知られている種々の方法でモニターすることができる。例えば、血清中サイトカイン応答を分析することができる。
【００７３】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療または予防目的で１つまたは複数のＴＮＦ阻害剤と併用して（治療前、治療後、または並行治療で）、限定はしないが、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）など）を含む可溶性ＴＮＦ受容体の全ての形態、ならびに単量体または多量体ｐ７５および／またはｐ５５ＴＮＦ受容体分子およびそれらの断片；限定はしないが、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）など）、およびＤ２Ｅ７（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）など）などの抗ヒトＴＮＦ抗体など、使用することができる。このようなＴＮＦ阻害剤としては、ＴＮＦのインビボ合成または細胞外放出をブロックする化合物およびタンパク質が挙げられる。具体的な実施形態において、本発明は、以下のＴＮＦ阻害剤：ＴＮＦ結合タンパク質（本明細書に定義された可溶性ＴＮＦ受容体タイプ−Ｉおよび可溶性ＴＮＦ受容体タイプ−ＩＩ（「ｓＴＮＦＲｓ」））、抗ＴＮＦ抗体、顆粒球コロニー刺激因子；サリドマイド；ＢＮ５０７３０；テニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）;Ｅ５５３１；ｔｉａｐａｆａｎｔＰＣＡ４２４８；ニメスリド；パナビル；ロリプラム；ＲＰ７３４０１；ペプチドＴ；ＭＤＬ２０１、４４９Ａ；（１Ｒ，３Ｓ）−シス−１−［９−（２，６−ジアミノプリニル）］−３−ヒドロキシ−４−シクロペンテン塩酸塩；（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−（９−（２，６−ジアミノ）プリン）−３−アセトキシシクロペンタン；（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−（９−アデニル）−３−アジドシクロペンタン塩酸塩；および（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−（６−ヒドロキシ−プリン−９−イル）−３−アジドシクロペンタンの１つまたは複数のいずれかと併用した（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１７ＲＡ ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。ＴＮＦ結合タンパク質は、当分野に開示されている（ＥＰ３０８ ３７８、ＥＰ４２２ ３３９、ＧＢ２ ２１８ １０１、ＥＰ３９３ ４３８、国際公開第ＷＯ９０／１３５７５号、ＥＰ３９８ ３２７、ＥＰ４１２ ４８６、国際公開第ＷＯ９１／０３５５３号、ＥＰ４１８ ０１４、特開ＪＰ１２７，８００／１９９１号公報、ＥＰ４３３ ９００、米国特許第５，１３６，０２１号、ＧＢ２ ２４６ ５６９、ＥＰ４６４ ５３３、国際公開第ＷＯ９２／０１００２号、国際公開第ＷＯ９２／１３０９５号、国際公開第ＷＯ９２／１６２２１号、ＥＰ５１２ ５２８、ＥＰ５２６ ９０５、国際公開第ＷＯ９３／０７８６３号、ＥＰ５６８ ９２８、国際公開第ＷＯ９３／２１９４６号、国際公開第ＷＯ９３／１９７７７号、ＥＰ４１７ ５６３、国際公開第ＷＯ９４／０６４７６号および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２２４４）。
【００７４】
例えば、ＥＰ３９３ ４３８およびＥＰ４２２ ３３９では、一緒くたに「ｓＴＮＦＲｓ」と称される、可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩ（「ｓＴＮＦＲ−Ｉ」または「３０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤」としても知られている）および可溶性ＴＮＦ受容体タイプＩＩ（「ｓＴＮＦＲ−ＩＩ」または「４０ｋＤａ ＴＮＦ阻害剤」としても知られている）、ならびにそれらの修飾形態（例えば、断片、機能性誘導体および変異体）のアミノ酸配列および核酸配列を教示している。ＥＰ３９３ ４３８およびＥＰ４２２ ３３９はまた、阻害剤のコードを担っている遺伝子を単離する方法、好適なベクターと細胞型において遺伝子をクローン化する方法および遺伝子を発現させて阻害剤を産生する方法を開示している。さらにｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩの多価形態（すなわち、２つ以上の活性部分を含む分子）もまた開示している。一実施形態において、この多価形態は、少なくとも１つのＴＮＦ阻害剤および別の部分を任意の臨床的に許容できるリンカー、例えば、ポリエチレングリコールを用いて化学的に結合させることにより（国際公開第ＷＯ９２／１６２２１号および国際公開第ＷＯ９５／３４３２６号）、ペプチドリンカー（Neve et al. (1996)、Cytokine、8(5):365-370）により、ビオチンへ化学的に結合させ、次いでアビジンへ結合させることにより（国際公開第ＷＯ９１／０３５５３号）、最後にキメラ抗体分子を組み合わせることにより（米国特許第５，１１６，９６４号、国際公開第ＷＯ８９／０９６２２号、国際公開第ＷＯ９１／１６４３７号およびＥＰ３１５０６２）作製することができる。
【００７５】
抗ＴＮＦ抗体としては、ＭＡＫ １９５Ｆ Ｆａｂ抗体（Holler et al. (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147）；ＣＤＰ ５７１抗ＴＮＦモノクローナル抗体（Rankin et al. (1995)、British Journal of Rheumatology, 34:334-342）；ＢＡＹ Ｘ １３５１マウスの抗腫瘍壊死因子モノクローナル抗体（Kieft et al. (1995)、7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases、page 9)；ＣｅｎＴＮＦ ｃＡ２抗ＴＮＦモノクローナル抗体（Elliott et al. (1994)、Lancet, 344:1125-1127およびElliott et al. (1994)、Lancet, 344:1105-1110）が挙げられる。
【００７６】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、ＩＬ−１７阻害剤（例えば、抗ＩＬ１７受容体抗体、Ａｍｇｅｎ；抗ＩＬ−１７Ａ、抗ＩＬ１７Ｆ）、ＲＯＲｃ阻害剤の全ての形態と併用して使用することができる。
【００７７】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、限定はしないが、アバタセプト（例えば、ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））など、ＣＤ２８阻害剤の全ての形態と併用して使用することができる。
【００７８】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、限定はしないが、トシリズマブ（例えば、ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））など、ＩＬ−６およびＩＬ−６受容体阻害剤の全ての形態と併用して使用することができる。
【００７９】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰまたは誘導体、ＩＬ−１８ｔｒａｐ、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ−１８Ｒ１、または抗ＩＬ−１８ＲＡｃＰなど、抗ＩＬ−１８化合物の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８０】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ＩＬ−２２または抗ＩＬ−２２Ｒなど、抗ＩＬ−２２の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８１】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ｐ１９、抗ｐ４０（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、抗ＩＬ−２３Ｒなど、抗ＩＬ−２３および／またはＩＬ−１２の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８２】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ＩＬ−２１または抗ＩＬ−２１Ｒなど、抗ＩＬ−２１の全ての形態と併用して使用することができる。
【００８３】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、抗ＴＧＦ−ベータの全ての形態と併用して使用することができる。
【００８４】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、１つまたは複数のサイトカイン類、リンホカイン類、造血因子（類）、および／または抗炎症剤と併用して使用することができる。
【００８５】
本明細書に挙げられた疾患および障害の治療には、本明細書に提供されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の１つまたは複数による治療と併用して（治療前、治療後、または並行治療）痛みおよび炎症の制御に最初に使用される薬物使用を含むことができる。これらの薬物は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として分類される。二次的治療としては、コルチコステロイド、遅効性抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤ）、または疾患改質薬（ＤＭ）が挙げられる。以下の化合物に関する情報はThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Sixteenth Edition, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, N.J. (1992)および、ＰＪＢ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社のファーマプロジェクツに見ることができる。
【００８６】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、本明細書に挙げられた疾患および障害を治療する目的で任意の１つまたは複数のＮＳＡＩＤと併用して使用することができる。ＮＳＡＩＤは、少なくとも部分的にプロスタグランジン合成の阻害により、これらの抗炎症作用を発揮する（Goodman and Gilman in "The Pharmacological Basis of Therapeutics," MacMillan 7th Edition (1985)）。ＮＳＡＩＤは、以下の少なくとも９つのグループに特徴づけることができる：（１）サリチル酸誘導体；（２）プロピオン酸誘導体；（３）酢酸誘導体；（４）フェナム酸誘導体；（５）カルボン酸誘導体；（６）酪酸誘導体；（７）オキシカム類；（８）ピラゾール類および（９）ピラゾロン類。
【００８７】
本明細書に記載されたＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質は、１つまたは複数のサリチル酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用して（治療前、治療後、または並行治療）使用することができる。このようなサリチル酸誘導体、プロドラッグエステル類および薬学的に許容できるそれらの塩類は：アセトアミノサロール、アロキシプリン、アスピリン、ベノリレート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、トリサリチル酸コリンマグネシウム、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸コリン、ジフルシナル、エテルサレート、フェンドサル、ゲンチシン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リシン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸１−ナフチル、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドＯ−酢酸、サルサレート、サリチル酸ナトリウムおよびスルファサラジンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するサリチル酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００８８】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のプロピオン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらのプロピオン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、デキシンドプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、ピリドキシプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するプロピオン酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００８９】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数の酢酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらの酢酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アセメタシン、アルクロフェナック、アムフェナック、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラック、デルメタシン、ジクロフェナックカリウム、ジクロフェナックナトリウム、エトドラック、フェルビナック、フェンクロフェナック、フェンクロラック、フェンクロジン酸、フェンチアザック、フロフェナック、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラック、イソキセパック、ロナゾラック、メチアジン酸、オキサメタシン、オクスピナック、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダック、タルメタシン、チアラミド、チオピナック、トルメチン、トルメチンナトリウム、ジドメタシンおよびゾメピラックを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連する酢酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９０】
別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のフェナム酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらのフェナム酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：エンフェナム酸、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、メドフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸、タルニフルメート、テロフェナメート、トルフェナム酸およびウフェナメートを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するフェナム酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９１】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のカルボン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。使用できるこれらのカルボン酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：クリダマック、ジフルニサル、フルフェニサル、イノリジン、ケトロラックおよびチノリジンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するカルボン酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９２】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数の酪酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらの酪酸誘導体、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェンおよびキセンブシンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連する酪酸誘導体もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９３】
別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のオキシカム類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。これらのオキシカム類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカムおよび４−ヒドロキシル−１，２−ベンゾチアジン１，１−ジオキシド４−（Ｎ−フェニル）−カルボキサミドを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するオキシカム類また、このグループに包含されることが意図されている。
【００９４】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のピラゾール類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。使用し得るこれらのピラゾール類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：ジフェナミゾールおよびエピリゾールを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するピラゾール類もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９５】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、１つまたは複数のピラゾロン類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。使用し得るこれらのピラゾロン類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スクシブゾンおよびチアゾリノブタゾンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するピラゾロン類もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９６】
別の具体的な実施形態において、本発明は、以下の１つまたは複数のＮＳＡＩＤのいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する：ε−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシル−メチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザック、ベンダザックリシネート、ベンジダミン、ベプロジン、ブロペラモール、ブコローム、ブフェゾラック、シプロクアゾン、クロキシメート、ダジダミン、デボキサメット、デトミジン、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｉｒａｍｉｄｅ）、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｙｒａｍｉｄｅ）、ジフィサラミン、ジタゾール、エモルファゾン、メシル酸ファネチゾール、フェンフルミゾール、フロクタフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロクアゾン、ホピルトリン、ホスホサル、グアイメサル、グアイアゾレン、イソニキシン、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リシンクロニキシネート、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロール、オキサパドール、パラニリン、ペリソキサール、クエン酸ペリソキサール、ピホキシム、ピプロキセン、ピラゾラック、ピルフェニドン、プロクアゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプタミドならびに４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ１２１、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１およびＷＹ４１７７０などの会社コード番号により称されるもの。このＮＳＡＩＤと同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するＮＳＡＩＤもまた、このグループに包含するように意図されている。
【００９７】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、リウマチ様疾患、移植片対宿主疾患および多発性硬化症などの急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療を目的とした１つまたは複数のコルチコステロイド類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。コルチコステロイド類、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類としては、ヒドロコルチゾン、および２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノミド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、酪酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デゾニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルシノロンアセトニド、フルニゾリド、フルオシノニド、フルオロシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、ヘキサン酸フルオコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、テブト酸ヒドロコルチゾン、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロン酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、２１−ジエドリアミノ酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ｍ−スルホ安息香酸プレドニゾロンナトリウム、２１−ステアログリコール酸プレドニゾロンナトリウム、テブト酸プレドニゾロン、２１−トリメチル酢酸プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバル、プレドニリデン、２１−ジエチルアミノ酢酸プレドニリデン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニドおよびトリアムシノロンヘキサセトニドなどのヒドロコルチゾンから誘導される化合物が挙げられる。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するコルチコステロイド類もまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９８】
別の具体的な実施形態において、本発明は、リウマチ様疾患、移植片対宿主疾患および多発性硬化症などの急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療を目的とした１つまたは複数の遅効性抗リウマチ薬類（ＳＡＡＲＤ）または疾患改質抗リウマチ薬類（ＤＭＡＲＤ）、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。ＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤ、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類は：アロクプレイドナトリウム、オーラノフィン、オーロチオグルコース、オーロチオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナールナトリウム、ブシラミン、３−オーロチオ−２−プロパノールスルホン酸カルシウム、クロラムブシル、クロロキン、クロブザリット、クプロキソリン、シクロ−ホスファミド、シクロスポリン、ダプゾン、１５−デオキシスペルグアリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩類（例えば、クロロキン金塩、チオリンゴ酸金ナトリウム塩、チオ硫酸金ナトリウム塩）、ヒドロキシクロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾール、ロベンザリット、メリッチン、６−メルカプトプリン、メトトレサート、ミゾリビン、ミコフェノレートモフェチル、ミオラール、ナイトロジェンマスタード、Ｄ−ペニシラミン、ＳＫＮＦ８６００２およびＳＢ２０３５８０などのピリジノールイミダゾール類、ラパマイシン、チオール類、サイモポエチンおよびビンクリスチンを含む。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤもまた、このグループに包含されることが意図されている。
【００９９】
別の具体的な実施形態において、本発明は、急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療を目的とした、１つまたは複数のＣＯＸ２阻害剤、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。ＣＯＸ２阻害剤、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類の例としては、例えば、セレコキシブが挙げられる。同様の鎮痛性および抗炎症性を有する構造的に関連するＣＯＸ２阻害剤もまた、このグループに包含されることが意図されている。ＣＯＸ−２選択的阻害剤の例としては、限定はしないが、エトリコキシブ、バルデコキシブ、セレコキシブ、リコフェロン、ルミラコキシブ、ロフェコキシブなどが挙げられる。
【０１００】
さらに別の具体的な実施形態において、本発明は、急性炎症および慢性炎症など、本明細書に挙げられた疾患および障害の治療目的で、１つまたは複数の抗菌剤、プロドラッグエステル類または薬学的に許容できるそれらの塩類のいずれかと併用する（治療前、治療後、または並行治療）ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質の使用に関する。抗菌剤としては、例えば、広範なクラスのペニシリン類、セファロスポリン類および他のベータ−ラクタム類、アミノグリコシド類、アゾール類、キノロン類、マクロライド類、リファマイシン類、テトラサイクリン類、スルホンアミド類、リンコサミド類およびポリミキシン類が挙げられる。ペニシリン類としては、限定はしないが、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラネート、ヘタシリン、シクラシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、チカルシリン／クラブラネート、アゾロシリン、メジオシリン、ペペラシリン、およびメシリナムが挙げられる。セファロスポリン類および他のベータ−ラクタム類としては、限定はしないが、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セファゾリン、セファドロキシル、セファクロール、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セルロキシム、セフォニシド、セフォラジン、セフィキシム、セフォタキシム、モキサラクタム、セフチゾキシム、セトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、イミペネムおよびアズトレオナムが挙げられる。アミノグリコシド類としては、限定はしないが、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびネオマイシンが挙げられる。アゾール類としては、限定はしないが、フルコナゾールが挙げられる。キノロン類としては、限定はしないが、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシンが挙げられる。マクロライド類としては、限定はしないが、エリスロマイシン、スピラマイシンおよびアジトロマイシンが挙げられる。リファマイシン類としては、限定はしないが、リファンピンが挙げられる。テトラサイクリン類としては、限定はしないが、スピサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、デオキシサイクリン、グアメサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、セノサイクリンおよびテトラサイクリンが挙げられる。スルホンアミド類としては、限定はしないが、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフィソキサゾールおよびコ−トリモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）が挙げられる。リンコサミド類としては、限定はしないが、クリンダマイシンおよびリンコマイシンが挙げられる。ポリミキシン類（ポリペプチド類）としては、限定はしないが、ポリミキシンＢおよびコリスチンが挙げられる。
【０１０１】
当然のことながら、本明細書において、章の見出しは、編成のみを目的としたものであって、決して記載された内容を限定するものとして解釈すべきではない。引用された全ての文献は、全ての目的のために参照としてそれらの全体が本明細書に援用される。
【０１０２】
以下の実施例は、本発明の一定の実施形態を単に例示するものであり、添付された特許請求の範囲により定義される本発明を限定するものとして解釈してはならない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：三量体ＩＬ−１Ｒａの様式、産生および精製
ＩＬ−１Ｒａは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）において組換えタンパク質として産生できることが以前に示されている（Steinkasserer et al 1992. FEBS 310:63-65）。このタンパク質は、極めて安定であり、効率的にリフォールディングする。そのＮ末端に追加のアミノ酸を有するＩＬ−１Ｒａのイソ型もまた記載されている（Haskill et al 1991, PNAS 88：3681-3685；Muzio et al 1995, JEM 182、623-628）。これらの分子は、ＩＬ−１Ｒならびにその成熟分泌体と結合したので、受容体への結合を損なうことなくアンタゴニストのＮ末端に追加ペプチドの融合が可能なことを示している。ＩＬ−１ＲａとＩＬ−１Ｒとの相互作用の結晶構造分析もまた、Ｎ末端の改変がＩＬ１Ｒとの相互作用に影響を及ぼさないことを裏付けている（Schreuder et al 1997, Nature 386: 190-194）。ＩＬ−１Ｒａは、骨髄および／またはヒト胎盤に由来するヒトｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。
【０１０４】
三量体ＩＬ−１Ｒａは、Ｔｒｉｐ三量体形成単位に対するＣ末端融合体として設計された。８つの異なる融合タンパク質を設計し、その４つは全長の三量体形成単位を有し（Ｔｒｉｐ）、残りの４つは９個のアミノ酸が切断された三量体形成単位を有する（Ｉ１０Ｔｒｉｐ）。次いでＩＬ−１Ｒａを、４つの異なるＣ末端融合体を用いていずれかの三量体形成単位にも融合させた。ＴｒｉｐＶ、ＴｒｉｐＴ、ＴｒｉｐＱおよびＴｒｉｐＫと称するＣ末端変異体は、三量体形成ドメイン上のＣＴＬＤドメインのユニークな提示が考えられる。ＴｒｉｐＫ変異体は、最長の構築物であり、ＣＴＬＤと三量体形成ドメインとの間に最長かつ最もフレキシブルなリンカーを含有する。ＴｒｉｐＶ、ＴｒｉｐＴ、ＴｒｉｐＱは、構造的にフレキシブルでない三量体形成モジュール上への直接的なＣＴＬＤ分子の融合を表すが、ＣＴＬＤ分子は、ＴｒｉｐＶからＴｒｉｐＴへ、およびＴｒｉｐＴからＴｒｉｐＱへと１／３回転している。これは、これらのアミノ酸の各々が、αヘリックスターンしているが、完全な回転には３．２ａａが必要であるという事実による。
【０１０５】
以下のタンパク質は、以下のグランザイムＢ開裂融合タンパク質としてＢＬ２１ＡＩ細菌において産生させた。下線部分は三量体単位を示し、太字部分はＩＬ−１Ｒａ部分を示す：
【化４】
【化５】
【化６】
【０１０６】
全ての構成物を、ＮｉＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）上で捕捉し、リフォールディングし、さらにＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）上で精製した。三量体ＩＬ１−Ｒａの振とうフラスコ内または発酵槽での発現から、封入体を精製した。一塊の細胞ペレットを、溶解用緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｗ／ｖ％のショ糖、１ｍＭのＥＤＴＡ）中、音波処理によりホモジナイズした（溶解用緩衝液１００ｍＬ当り５０ｇのウェット細胞ペレット）。次いで、溶解用緩衝液１００ｍＬ当り１００ｍｇのリゾチームを添加し、混合してから、サンプルを１５分間室温に放置した。次にこのサンプルを、混合しながら２〜５分間音波処理した。洗浄用緩衝液（０．２ＭのＮａＣｌ、１ｗ／ｖ％のデオキシコレート、Ｎａ塩、１ｗ／ｖ％のノニデットＰ４０、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、サンプルを混合し、再度音波処理した。封入体を、４℃、８，０００ｒｐｍで２５分間の遠心分離により回収した。上澄液を、４℃で保存し、このペレットを、元の細胞ペレット５０ｇ当り１００ｍＬのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００緩衝液（０，５ｗ／ｖ％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁させた。封入体を、４℃、８，０００ｒｐｍで２５分間の遠心分離により回収し、上澄液を、４℃で保存した。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００緩衝液洗浄をもう一度繰り返し、封入体を、４℃、１２，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収した。
【０１０７】
封入体を、細胞ペースト１グラム当り３０ｍＬの変性用緩衝液（６Ｍの尿素、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのトリス／ＨＣｌおよび２０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０）中、２８℃で２時間再懸濁した。この懸濁液を、７５００ｇで１５分間遠心分離して、不溶性物質を除去した。この後、ＣａＣｌ２を加えて２０ｍＭの最終濃度にし、この溶液を、ＮＴＡ緩衝液（８Ｍの尿素；１０００ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．０；５ｍＭのβ−メルカプトエタノール）中で平衡にした１００ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムに適用し、安定なベースラインが得られるまで洗浄した。さらに２５０ｍＬのグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールにより洗浄し、次いで１００ｍＬの緩衝液ＮＴＡにより洗浄した。
【０１０８】
２つのリフォールディング法、すなわち透析リフォールディングおよびカラム上のリフォールディングを用い、双方から純粋な可溶性のタンパク質を得た。透析リフォールディングでは、再懸濁した封入体を用いて、直接、３Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含有する１×ＰＢＳ中で一晩かけて透析した。翌日、０Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含有する１×ＰＢＳ中で透析を続けた。
【０１０９】
カラム上のリフォールディングでは、タンパク質を結合させた洗浄Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムの樹脂を、３Ｍの尿素、ｐＨ７．２を含有する４ＣＶｍｌの１×ＰＢＳで洗浄してから、３Ｍの尿素、ｐＨ７．２を含有する１０ＣＶの１×ＰＢＳ、そして０Ｍの尿素、ｐＨ７．２を含有する１０ＣＶの１×ＰＢＳの直線勾配で操作した。リフォールディングされた三量体ＩＬ−１Ｒａを回収するために、このカラムを１×ＰＢＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０で溶出させ、フラクションを集めた。
【０１１０】
リフォールディング後、溶出液中のｐＨをＮａＯＨにより７．５に調整してから、組換えグランザイムＢを１：５００（グランザイム／タンパク質）の比率で添加し、２５℃で一晩インキュベートすることによって、組換えヒトグランザイムＢによる開裂を実施した。この進行をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより追跡した。
【０１１１】
最後に、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カチオン交換ステップを用いて、開裂タンパク質を精製した。約５０ｍＬのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを詰め、安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ａ（１×ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ５．５）中で平衡にした。この開裂反応物を、緩衝液Ａにより１：３に希釈し、カラム上に装填し、次いで安定なベースラインがモニターされるまで緩衝液Ａで洗浄した。１０ＣＶの緩衝液Ａから１０ＣＶの緩衝液Ｂ（１×ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ＋０．５ＭのＮａＣｌ ｐＨ５．５）までの勾配を設定して、フラクションを５ｍＬずつ集めた。タンパク質を含有するフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してからタンパク質産物をプールした。
【０１１２】
あるいは、上記封入体調製物からの上澄液を用いてタンパク質を精製した。上澄液中の可溶性三量体ＩＬ−１Ｒａを、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＬ、５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ８．０）で平衡にしたＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム上で精製した。封入体精製からの洗浄液をプールし、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離してから、ＣａＣｌ２を５ｍＭに、およびトリス−ＨＣｌを２０ｍＭに加えて、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを６．０に調整した。このプールをカラムに装填し、安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ａで洗浄した。安定なベースラインが得られるまで緩衝液Ａ＋１ＭのＮａＣｌで洗浄後、結合したタンパク質を、緩衝液Ａ＋２０ｍＭのＥＤＴＡで溶出させ、フラクションを集めた。その後、タンパク質プールを、グランザイムＢにより開裂し、上記のとおりＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム上で精製した。３Ｌ発現培養物からのＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＧＧ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａの可溶性フラクションから、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ）の捕捉後、約２５０ｍｇのＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａについで最終収量が９５ｍｇのＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａが得られた。可溶性フラクションからのタンパク質の収率と純度が、リフォールディングを実施することよりも有意に良好であったことから、この経路が、最初の構成物試験後に選択された。
【０１１３】
リフォールディングされたタンパク質のＩＬ−１受容体１に結合する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）上で分析した。この分析には、マウスＩＬ１−ＲＩ／ＦｃをＣＭ５センサーチップに結合させ、ＩＬ−１ＲＩタンパク質に対する可溶性ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａの結合を測定した。透析による未開裂のＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａリフォールディングの結果を図２に示し、未開裂のＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａのカラム上のＮｉＮＴＡリフォールディングを図３に示す。開裂アッセイおよび精製アッセイにより、配列番号４７−５４の三量体ＩＬ−１Ｒａ化合物を作製した。
【０１１４】
実施例２：Ｕ９３７細胞内でのＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害する三量体ＩＬ−１Ｒａ化合物の能力
Ｕ９３７細胞内でのＩＬ−１誘導性のＩＬ−８を阻害する能力に関して、ＧＧ−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＶ−ＩＬ１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＫ−ＩＬ１Ｒａ）、ＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＴ−ＩＬ１Ｒａ）およびＣＩＩ−Ｈ６−ＧｒＢ−ＧＧ−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ（ｔｒｉｐＱ−ＩＬ１Ｒａ）をさらに分析した。結果を図４に示す。
【０１１５】
これらの化合物は、その応答をブロックする効果が本質的に等しく、これら全てがＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）と同様に効果的であると思われる（ｗ／ｗで比較した場合）。このアッセイにおける緩衝液効果のため、使用される最高のタンパク質濃度（１００μｇ／ｍＬ）におけるＩＬ−８の産生は、さらに減少するのではなくて増加する。幾つかのインビトロでの有効性検定ならびにＢｉａｃｏｒｅアッセイに基づいて、ＴｒｉｐＴ ＩＬ１Ｒａは、ブロッキングおよび結合の有効性ならびに産生収率に基づき最良の化合物であると判定した。
【０１１６】
実施例３：ペグ化三量体ＩＬ−１Ｒａ化合物
ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の有効性において、そのインビボでの半減期が重要なパラメータである（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）のヒトでの半減期は、わずか４−６時間であり、したがって毎日１回適用する必要がある）ことから、Ｎ末端ペグ化によりＴｒｉｐＴ ＩＬ１Ｒａをペグ化する能力を試験した。三量体ＩＬ１−ＲａをＮ末端においてペグ化する。上記の精製法の最終ステップ後の三量体ＩＬ１−Ｒａアンタゴニストタンパク質を、ペグ化の出発点として用いた。ペグ化反応用に、このタンパク質の緩衝液をＰＢＳ緩衝液ｐＨ６．０に変えた。反応中のタンパク質濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬと３．５ｍｇ／ｍＬとの間であり、２０ｍＭのシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３）で補足した５〜１０モル過剰のｍＰｅｇ５Ｋ−アルデヒドまたはｍＰｅｇ２０Ｋ−アルデヒド（Ｎｅｋｔａｒ）を用いた。反応は、２０℃で１６時間実施した。次いでこの反応混合物をＳｏｕｒｃｅ１５Ｓカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）に適用して、モノペグ化体を精製した。図５に示すように、非ペグ化タンパク質と比較して、このペグ化体のアンタゴニスト活性は減少した。しかしながら、このペグ化タンパク質は、依然として良好なＩＬ１ブロック効力を有している。
【０１１７】
実施例４：オスのルイスラットにおける静脈内注射後の三量体ＩＬ−１Ｒａタンパク質の薬物動態学的分析
先の実施例に記載された３種の三量体ＩＬ−１Ｒａポリペプチドを、薬物動態学的分析用に選択した。これらの構築物の違いは、三量体形成ドメインのＮ末端にあり、すなわち全長（ＦＬ）、最初の９個のアミノ酸が切断されている（Ｉ１０）および最初の１６個のアミノ酸が切断されている（Ｖ１７）という違いであった。Ｉ１０構築物は、三量体形成ドメインの天然の欠失変異体を表し、Ｔｈｒ４においてＯ−グリコシル化部位を欠いている。Ｖ１７誘導体は、三量体形成ドメインをコードする最初のエキソンの欠失を表し、特徴的なヘパリン結合部位を欠いている。この部位はまた、Ｉ１０構築物において部分的に除去されている。図６に示されるように、ＩＬ−１Ｒａ分子のインビトロ有効性は、Ｕ９３７細胞アッセイにおいて立証された。
【０１１８】
これら３種の構築物ポリペプチドの薬物動態学的プロファイルを、ルイスラットにおける静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に分析した。得られたプロファイルを、同一の実験におけるＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の薬物動態学的プロファイルと比較した。薬物動態学的試験は、１群当りオスのルイスラット４匹を用いて実施し、使用した構築物は、ＦＬＩＬ−１Ｒａ、Ｉ１０ＩＬ−１Ｒａ、Ｖ１７ＩＬ−１ＲａおよびＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）であった。１００ｍｇ／ｋｇの単回用量を動物に静脈内投与した。試験化合物を、媒体（４．４ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、９３．８ｍＭのＮａＣｌ、０．３３ｍＭのＥＤＴＡ、０．７ｇのＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）に溶解し、尾静脈（正中仙骨静脈）または後足静脈（伏在静脈）を介して投与した。
【０１１９】
次に血液を、ベースライン（ゼロ時間）ならびに投与後０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間の時点で、１時点当り４匹の動物から採取した。およそ１００μｌの血液サンプルを、尾の先端からＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒｓ（商標）中に採取した。血漿を採取し、ポリプロピレンチューブに移した。次に測定が実施されるまで、血漿サンプルを≦７０℃で保存した。次いで、ＣＯ２吸入により動物を殺処理し、これらの死体を、病理学的検査をせずに廃棄した。次に血漿中のＩＬ−１Ｒａ化合物濃度およびＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）濃度を、ＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１２０】
各ラットの平均体重は、２５０グラムであった。ラットの平均血液量が１６．５ｍＬであるとすれば、静脈内注射後の化合物の理論的な最高の初期濃度は、１，５００，０００ｎｇ／ｍＬと算出される。これらの濃度を図７に示す。この初期濃度を、分析の出発値として用いた。動物に副作用または健康状態の変化は見られなかった。
【０１２１】
上記時点での血液サンプルの採取後、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、血液サンプル中の注射されたタンパク質を測定した。これらのＥＬＩＳＡ結果に基づき、薬物曝露の尺度として曲線下面積（ＡＵＣ）を用い、また標準的なソフトウェアを用いて血漿中の半減期を算出した。この曲線下面積を表２に示し、血漿中タンパク質の半減期を表３に示してある。
【０１２２】
【表２】
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
これらの静脈内データより、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）と比較して三量体化合物の方が、優れた血漿中半減期を有することが示されている。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の半減期は、約１．２分であり、一方、静脈内注射後のＶ１７ ＩＬ１Ｒａ三量体タンパク質の半減期は、約６９分である。分析に用いられた評価基準に依ると、ＡＵＣの相対的増加は、ＦＬ ＩＬ１Ｒａ三量体に関する２倍とＶ１７ ＩＬ１Ｒａ三量体に関する５倍との間にあり、これは、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）に比較して、三量体化された変異体を用いた薬物曝露は実質的に改善することを示すものである。
【０１２５】
実施例５：Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａおよびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａの産生ならびにラットＣＩＡモデル
双方の分子は、２×ＴＹ培地（Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ）または化学的に規定された最少培地（ＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ）を用いて１０Ｌの発酵槽操作でＢＬ２１ ＡＩ細菌により産生された。５８８７×ｇで２０分間の遠心分離により細胞ペレットが得られ、次に１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６中に再懸濁させた。Ｍｅｔ−Ｉ０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａについては、高圧ホモジネート（２×１７，０００ｐｓｉ）に次いで、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離により目的のタンパク質を含有する可溶性の細胞フラクションを得た。上澄液を、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．４で希釈し、ＡＫＴＡ ｆＰＬＣを用いて、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（カチオン交換、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、次いでＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アニオン交換、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。最終ステップにおいて、タンパク質は、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｅフィルター（Ｐａｌｌ）を通過させてエンドトキシンを除去し、次いで緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７．４に交換し、濃度を５０ｍｇ／ｍＬにした。ＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａタンパク質は、Ｎ末端ブースタードメイン、ファージＣＩＩタンパク質、続いてヒトグランザイムＢ開裂部位を含む融合タンパク質として発現した。ＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａは、リゾチームを含有する溶解用緩衝液中でのホモジネートに次いで、８０００ｒｐｍで２５分間遠心分離することにより、発酵細胞ペレットから精製した。次に上澄液は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤキレート（Ｍ）カラム（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）を通過させ、溶出液の緩衝液を、２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌに交換した。次にこのタンパク質フラクションを、ヒト組換えグランザイムＢ（社内作製、特許参照）で消化した。ＰＢＳ ｐＨ６で希釈した後、タンパク質は、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、次いでＭｕｓｔａｎｇＥろ過および流動様式のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤキレート（Ｍ）カラムを用いて精製し、融合タグおよびヒトグランザイムＢを除去した。最後に、タンパク質の緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７．４に交換し、５０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａおよびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａ双方のタンパク質に関する収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８）、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＳにより判定すると、３ｇ〜５ｇ／Ｌ、純度＞９５％であった。ＬＡＬアッセイ（Ｌｏｎｚａ）を用いて判定すると、エンドトキシン濃度は、＜３ＥＵ／ｍｇであった。分析ＳＥＣにより判定すると、凝集体は、＜０．５％であり（図９）、宿主細胞タンパク質は、＜６ｎｇ／ｍＬであった。Ｍｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａの２つのバッチ（ＬＭ０２２、ＬＭ０２３）およびＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１ｒａの２つのバッチ（ＣＦ０１９、ＣＦ０２０）を、上記アッセイにより試験した。
【０１２６】
４日確立の（4-day established）ＩＩ型コラーゲン関節炎のメスのルイスラットを、１日〜３日の関節炎に対して毎日（ＱＤ）、媒体（１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４）により、あるいは単量体ＩＬ−１Ｒａ（１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））または三量体化ＩＬ−１Ｒａ（１２０ｍｇ／ｋｇのＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａもしくは１２０ｍｇ／ｋｇのＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ）を投与する等モル量のＩＬ−１Ｒａにより、皮下（ＳＣ）処置した。対照を１セットのみとするため、ＱＤ群における全てのラットに、第二回目と第三回目の投与に際してそれぞれの媒体（１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．４、またはＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）についてはクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５）を投与し、操作を一定に保った。動物は、関節炎４日目で殺処理した。効力の評価は、曲線下面積（ＡＵＣ）で表される足首のカリパス測定、最後の後足の重量および体重に基づいた（Bendele et al 2000, Arthritis + Rheumatism 43:2648-2659）。動物は全て試験終了まで生存した。ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）またはその媒体（ＣＳＥＰ）を注射されたラットは、注射処置時に鳴いたことから、皮下炎症が生じたことを示唆する。他のものを用いた注射では鳴かなかった。
【０１２７】
１ケージ当り４匹の飼育動物（関節炎群につき８匹、正常群につき４匹）に、イソフルランで麻酔をかけ、０日目および６日目に、尾のつけねと２箇所の背中とに２ｍｇ／ｍｌのウシＩＩ型コラーゲン（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オーウェンスビレ、ミズーリ州）を含有する３００μｌのフロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、デトロイト、ミシガン州）を皮下／皮内（ＳＣ／ＩＤ）注射した。皮下経路による投与（２４時間の間隔で毎日）を、関節炎１日目に開始し、３日目まで継続した。実験群は表４に示すとおりである。
【０１２８】
【表４】
【０１２９】
関節炎の０日目〜４日目にラットの体重を量り、足首のカリパス測定を関節炎０日目から開始して毎日行った（試験９日目）。最後の体重測定後に、動物を安楽死させ、後足を、内くるぶしと外くるぶしの面で切断し、（一対で）重量を量った。
【０１３０】
１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（３日目〜４日目）処置、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（２日目〜４日目）処置、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（３日目〜４日目）処置されたラットは、媒体処置された疾患対照動物と比較して、足首の直径の有意な減少が見られた。媒体処置された疾患対照動物と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置（３４％）、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（５４％）処置、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ（４９％）処置されたラットでは、足首の直径のＡＵＣが有意に減少した。毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置は、毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置と比較して足首の直径のＡＵＣが有意に減少する試験結果となった（試験の終了時においてｐ＜０．０３５）。また、試験の終了時における毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置と比較して、毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置により、足首の直径のＡＵＣが有意に減少する試験結果となった（ｐ＜０．００１）（図１０）。
【０１３１】
媒体処置の疾患対照動物と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置（６１％）、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（７９％）、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（９１％）されたラットでは、最終的な足重量が有意に減少した。毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置と比較して、毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置により最終的な足重量が有意に減少する試験結果となった（ｐ＜０．００６）（図１１）。
【０１３２】
媒体処置された疾患対照動物と比較して、１００ｍｇ／ｋｇの毎日のＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）処置（５４％）、１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＭｅｔ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（４９％）、または１２０ｍｇ／ｋｇの毎日のＧＧ−Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１ｒａ処置（６５％）されたラットの体重の変化は、正常値へと有意に増加した。
【０１３３】
実施例６：ストレプトゾシン（ＳＴＺ）誘導型糖尿病モデル
絶食させたＣ５７ＢＬ／６Ｊオスのマウスに、ＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０ｍｇ／ｋｇを、連続５日間、毎日１回、腹腔内投与した。マウスは、１日目から４日目にかけて血中グルコース濃度が徐々に増していった。この血中グルコース濃度は、ＳＴＺ誘導期間中に、６．９ｎｍｏｌ／Ｌから１３．１ｎｍｏｌ／Ｌまで上昇した。５日間（４日目）の最後のＳＴＺ投与後に、良好な状態の１０匹のマウスをそれぞれが含む１０個の処置群に、マウスを無作為に分配した。糖尿病の発症前のこの日に処置を開始し、発症後も処置を継続した。処置群は表５に示すとおりである。
【０１３４】
【表５】
【０１３５】
試験期間は２８日であり、処置期間中、マウスの体重を週１回量った。糖尿病の発症をモニターするために、血中グルコース濃度を、試験期間中、１日おきに測定した。尾静脈からの出血により、全血から液滴で採血し、Ａｓｃｅｎｓｉａ ＥＬＩＴＥ（登録商標）の血中グルコース試験ストリップ上に乗せて、Ａｓｃｅｎｓｉａ ＥＬＩＴＥ（登録商標）の血中グルコース計測器（Ｂａｙｅｒ）で分析した。これらの値を記録し、処置開始時の濃度と比較して、処置群におけるｘ倍の増加を算出した。臨床的症状は、反対の症状が生じた群において毎日または適宜観察した。
【０１３６】
図１２に示されるように、１００ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ双方でのＩ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１−ＲａまたはＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）のいずれの毎日の腹腔内投与後にも、血中グルコース濃度の著しい減少が見られた。さらに、１００ｍｇ／ｋｇでのＩ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ１Ｒａの週２回の投与では、１００ｍｇ／ｋｇのＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）の毎日の投与と効果が等しかった。これらのデータは、三量体化ＩＬ−１Ｒａが、実験的に誘導した糖尿病の治療に有効であることを実際に示している。
【０１３７】
上記に示した実施例は、単に例示を目的としたものであり、本発明の全ての可能な実施形態、適用または修飾の網羅的な列挙であること意味するものではない。したがって、本発明の範囲と意図から逸脱することなく、本発明の記載された方法およびシステムの種々の修飾と変更は、当業者にとって明らかとなろう。本発明を、具体的な実施形態に関連して記載したが、当然のことながら、特許請求された本発明は、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきものではない。具体的には、分子生物学、免疫学、化学、生化学または関連分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための記載された様式に関する種々の修飾は、添付された請求項の範囲内にあることが意図される。
【０１３８】
本発明は、当然のことながら、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、当業者に認識されるように、これらを変えることができる。また本明細書に用いられる用語は、当然のことながら、特定の実施形態の説明だけを目的として使用されており、本発明の範囲を限定する意図はない。また、本明細書および添付された特許請求の範囲に用いられる単数形「ある、その／この（ａ、ａｎ、およびｔｈｅ）」は、文脈により明確に別様に規定されない限り、複数系への言及を含んでいることに注意すべきである。したがって、例えば、「あるリンカー（a linker）」に対する言及は、当業者には既知の１つまたは複数のリンカーおよびそれらの均等物に対する言及である。
【０１３９】
別様に規定されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明に関係する当業者により一般に理解される用語と同じ意味を有する。本発明の実施形態およびその種々の特徴および利点は、非限定的な実施形態を参照してより十分に説明され、また添付の図面に例示され、そして明細書において詳述されている。図面に例示された特徴は、必ずしも縮尺どおりに描かれておらず、一実施形態の特徴は、たとえ本明細書に明白に述べられていなくても当業者が認識できるはずの他の実施形態で実施できる。
【０１４０】
本明細書に挙げられた数値はいずれも、任意の下限値と任意の上限値との間にある少なくとも２つの構成単位を分離できる１つの構成単位の増分の下限値から上限値にある全ての値を含む。例として、例えば、成分濃度または例えば、サイズ、角度の大きさ、圧力、時間などの処理変数の値が、例えば、１から９０、具体的には２０から８０、より具体的には３０から７０であると述べられている場合、それは、１５から８５まで、２２から６８まで、４３から５１まで、３０から３２までなどの値が本明細書において明確に示されていることを意図するものである。１未満の値については、１つの構成単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であると考えられる。これらは、単に具体的に意図される数値の例であり、示された数値の下限値と上限値との間の数値の可能な全ての組合せが、同様の様式で本明細書に明確に言及されていると考えるべきである。
【０１４１】
特定の方法、装置、および材料が記載されているが、本明細書に記載されたものと類似のまたは均等な方法および材料のいずれも、本発明の実施または試験に使用することができる。これまでに引用された全ての報文および参考文献および刊行物の開示は、各々が個々に参照として組み込まれているのと同程度に、それらの全体が参照として明確に本明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三量体形成ドメインとＩＬ−１活性を阻害するＩＬ−１Ｒａポリペプチドとを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
ＩＬ−１Ｒａポリペプチドが、保存的アミノ酸置換の結果、配列番号３８に対して少なくとも８５％同一性があって、Ｔｒｐ１６、Ｇｌｎ２０、Ｔｙｒ３４、Ｇｌｎ３６およびＴｙｒ１４７を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＩＬ−１Ｒａポリペプチドが、配列番号３８に対して少なくとも９５％同一性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｄ４７Ｎ、Ｅ５２Ｒ、Ｅ９０Ｙ、Ｐ３８Ｙ、Ｈ５４Ｒ、Ｑ１２９ＬおよびＭ１３６Ｎからなる群から選択される変異を少なくとも１つさらに含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
三量体形成ドメインが、ヒト・テトラネクチンに由来する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
三量体形成ドメインが、テトラネクチンの三量体形成構造エレメントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
三量体形成ドメインが、配列番号１に対して少なくとも６６％同一性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
同一または別の請求項５に記載の融合タンパク質を３個含む、三量体複合体。
【請求項９】
同一または別の請求項６に記載の融合タンパク質を３個含む、三量体複合体。
【請求項１０】
ポリエチレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＩＬ−１Ｒａポリペプチドと三量体形成ドメインとの間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
３個の融合タンパク質を含む三量体複合体であって、各融合タンパク質が請求項１に記載の融合タンパク質を含み、そのうち少なくとも１個の融合タンパク質が、ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号３９）；ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４０）；ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４１）；ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４２）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４３）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４４）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４５）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５５）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５７）；およびＶ１７−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５８）からなる群から選択される、三量体複合体。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載の融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項７に記載の三量体複合体および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
インターロイキン１により媒介される疾患の治療を必要とする患者に、請求項１７に記載の医薬組成物を投与することを含む、インターロイキン１により媒介される疾患を治療する方法。
【請求項１９】
疾患が、炎症性疾患である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性疾患が、リウマチ様関節炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性疾患が、糖尿病である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
抗炎症剤を、該患者に同時にまたは連続的に投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
該融合タンパク質に共有結合した抗炎症剤をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
少なくとも１個の該融合タンパク質が、抗炎症剤と共有結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の融合タンパク質を少なくとも２個含む、ポリペプチド複合体。
【請求項２６】
前記融合タンパク質を少なくとも４個含む、請求項２５に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１】
三量体形成ドメインとＩＬ−１活性を阻害するＩＬ−１Ｒａポリペプチドとを含む、融合タンパク質。
【請求項２】
ＩＬ−１Ｒａポリペプチドが、保存的アミノ酸置換の結果、配列番号３８に対して少なくとも８５％同一性があって、Ｔｒｐ１６、Ｇｌｎ２０、Ｔｙｒ３４、Ｇｌｎ３６およびＴｙｒ１４７を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＩＬ−１Ｒａポリペプチドが、配列番号３８に対して少なくとも９５％同一性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｄ４７Ｎ、Ｅ５２Ｒ、Ｅ９０Ｙ、Ｐ３８Ｙ、Ｈ５４Ｒ、Ｑ１２９ＬおよびＭ１３６Ｎからなる群から選択される変異を少なくとも１つさらに含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
三量体形成ドメインが、ヒト・テトラネクチンに由来する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
三量体形成ドメインが、テトラネクチンの三量体形成構造エレメントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
三量体形成ドメインが、配列番号１に対して少なくとも６６％同一性がある、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
同一または別の請求項５に記載の融合タンパク質を３個含む、三量体複合体。
【請求項９】
同一または別の請求項６に記載の融合タンパク質を３個含む、三量体複合体。
【請求項１０】
ポリエチレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＩＬ−１Ｒａポリペプチドと三量体形成ドメインとの間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
３個の融合タンパク質を含む三量体複合体であって、各融合タンパク質が請求項１に記載の融合タンパク質を含み、そのうち少なくとも１個の融合タンパク質が、ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号３９）；ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４０）；ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４１）；ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４２）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４３）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４４）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４５）；Ｉ１０−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号４６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＴ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５５）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＫ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５６）；Ｖ１７−ＴｒｉｐＶ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５７）；およびＶ１７−ＴｒｉｐＱ−ＩＬ−１Ｒａ（配列番号５８）からなる群から選択される、三量体複合体。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載の融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項７に記載の三量体複合体および少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
インターロイキン１により媒介される疾患の治療を必要とする患者に、請求項１７に記載の医薬組成物を投与することを含む、インターロイキン１により媒介される疾患を治療する方法。
【請求項１９】
疾患が、炎症性疾患である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炎症性疾患が、リウマチ様関節炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性疾患が、糖尿病である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
抗炎症剤を、該患者に同時にまたは連続的に投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
該融合タンパク質に共有結合した抗炎症剤をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
少なくとも１個の該融合タンパク質が、抗炎症剤と共有結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の融合タンパク質を少なくとも２個含む、ポリペプチド複合体。
【請求項２６】
前記融合タンパク質を少なくとも４個含む、請求項２５に記載のポリペプチド複合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１０−５３９９９５（Ｐ２０１０−５３９９９５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９００６（Ｐ２０１０−５２９００６）
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９２１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４８９６１
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０８２５３６２７）アナフォア インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ａｎａｐｈｏｒｅ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月８日（２００８．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９２１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４８９６１
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０８２５３６２７）アナフォア インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ａｎａｐｈｏｒｅ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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