光を調節可能に変化させるための方法および装置
【課題】照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して調節可能に変化させるための方法および装置を提供する。
【解決手段】本方法および装置では、第１偏光手段（Ｐｏｌ１）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が実施され、第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）によって、少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が行われ、スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態が変えられ、照明光および／または検出光の反射が実施される。
【解決手段】本方法および装置では、第１偏光手段（Ｐｏｌ１）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が実施され、第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）によって、少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が行われ、スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態が変えられ、照明光および／または検出光の反射が実施される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に生物学的試料、プレパラート、および付属の構成要素を検査するための顕微鏡検査、特に蛍光顕微鏡検査、レーザ走査型顕微鏡検査、蛍光相関スペクトル顕微鏡検査、および走査近接場顕微鏡検査における方法および構成に関する。作用物質のスクリーニングのための蛍光検出に基づく方法（高速高感度スクリーニング）ならびに流出細胞測定法もこれに含まれる。それと共に、複数の試料点における試料の同時照明によってリアルタイムで複数蛍光体を有する試料を同時検査することは、重なり合う蛍光スペクトルの場合に密な試料の空間構造においても可能になる。
【背景技術】
【０００２】
生物学的プレパラートを検査するための光学顕微鏡検査の典型的な適用分野は、蛍光顕微鏡検査である（例えば、非特許文献１参照）。これに関して、特定の色素が細胞部分の特有のマーキングのために適用される。
【０００３】
ある一定のエネルギーの放射される光子は、吸収されることによって色素分子を励起し、基底状態から励起状態にする。この励起はたいてい一光子吸収と呼ばれる。このように励起された色素分子を、さまざまな方法で基底状態に戻すことができる。蛍光顕微鏡検査では、蛍光光子の放射の下での移行が最も重要である。放出された光子の波長は、ストークス・シフトに基づいて励起放射と比較して一般に赤方にずれており、したがって大きな波長を有する。ストークス・シフトは励起放射からの蛍光放射の分離を可能にする。
【０００４】
蛍光光は、ブロック・フィルタと組み合わせた適切な二色性光線分割器によって励起放射から分割され、別々に観察される。これによって、さまざまな色素によって染色された個別の細胞部分の表示が可能になる。しかしながら、基本的に、プレパラートの複数の部分も同時にさまざまな個別に付加される色素によって染色することが可能である（多重蛍光）。さらにまた、個々の色素から送出された蛍光信号を区別するために、専用の二色性光線分割器が適用される。
【０００５】
高いエネルギーを有する１つの光子による色素分子の励起（一光子吸収）の他に、より低いエネルギーを有する複数の光子による励起も可能である。この場合、個別光子のエネルギーの総和は、高いエネルギーを有する１つの光子のエネルギーのほぼ何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と呼ばれる（例えば、非特許文献２参照）。それでも色素放出は、この種の励起によって影響されない。すなわち放出スペクトルは多光子吸収の際に負のストークス・シフトを受けるので、励起放射と比較して短い波長を有する。励起放射の放出放射からの分離は、一光子吸収の場合と同様な流儀で行われる。
【０００６】
次に、従来技術を、例として共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）を用いて以下に説明する（図１）。
ＬＳＭは本質的に４つのモジュール、すなわち光源、走査モジュール、検出ユニット、および顕微鏡に区分される。これらのモジュールを以下にさらに詳しく説明する。これについてはさらに特許文献１を参照されたい。
【０００７】
プレパラートにおけるさまざまな色素を個別に励起するために、ＬＳＭにはさまざまな波長のレーザが備えられている。励起波長の選択は、検査しようとする色素の吸収特性に左右される。励起放射は光源モジュールの中で作られる。この際、さまざまなレーザ（例えば気体レーザ：アルゴン、アルゴン・クリプトン、固体レーザ：ＴｉＳａレーザ、ダイオード）が使用される。さらに光源モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強度の調節が、例えば、音響光学結晶の使用によって行われる。続いて、レーザ放射はファイバまたは適切なミラー配置を通じて走査モジュールに達する。
【０００８】
光源の中で生成されたレーザ放射は、対物レンズによって回折を制限されてスキャナ、走査レンズ、および鏡胴レンズを通じてプレパラートに集束される。スキャナは試料をｘ−ｙ方向に点状に走査する。試料を走査する場合、画素滞留時間はたいてい、マイクロ秒未満から数秒の範囲にある。
【０００９】
蛍光光の共焦点検出（走査検出）の場合、焦点面（試験片）からおよびその上とその下にある平面から放出される光は、スキャナを経て二色性光線分割器（ＭＤＢ）に伝わる。二色性光線分割器は蛍光光を励起光から分離する。続いて、蛍光光は絞り（共焦点絞り／ピンホール）の上に集束され、この絞りは正に焦点面に結合された平面の中にある。これによって、蛍光光成分は焦点の外側で抑制される。絞りの大きさを変化させることによって、顕微鏡の光学的分解能を調節することができる。絞りの背後にさらに１つの二色性ブロック・フィルタ（ＥＦ）があり、これは再度励起放射を抑制する。ブロック・フィルタを通過した後、蛍光光は点検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【００１０】
多光子吸収を適用する場合には、励起強度が特に高い小さな容積の中で色素蛍光の励起が行われる。この範囲は、共焦点配置の適用における検出された範囲よりも僅かに大きいだけである。したがって、共焦点絞りの使用を省略することができ、検出を対物レンズによって直接行うことができる（非走査検出）。
【００１１】
多光子吸収によって励起された色素蛍光を検出するためのさらに別の構成では、やはり走査検出が行われるが、ここでは対物レンズの瞳が検出ユニットの中に形成される（非共焦点走査検出）。
【００１２】
三次元照明された画像から、対応する一光子もしくは多光子吸収に関連する両検出配置を通じて、対物レンズの焦点面にある平面（光学断面）のみが再現される。試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面における複数の光学断面を描くことによって、次いでコンピュータの支援によって試料の三次元画像を生成することができる。
【００１３】
これによって、ＬＳＭは厚いプレパラートの検査に適している。励起波長は、適用される特定の吸収特性を有する色素によって決定される。色素の発光特性に合った二色性フィルタによって、それぞれの色素から出される蛍光光が点検出器によって測定されることを保証する。
【００１４】
生物医学的適用例においては現在、複数のさまざまな細胞領域がさまざまな色素によって同時マーキングされる（多重蛍光）。従来技術では、個別の色素をさまざまな吸収特性もしくは発光特性（スペクトル）に基づいて別々に実証することができる。
【００１５】
別々の実証のために、蛍光光の複数の色素からの近接光分離器（ＤＢＳ）による追加分割およびさまざまな点検出器（ＰＭＴ１〜４）における個別色素発光の別々の検出が行われる。
【００１６】
流出細胞計算器は、細胞およびその他の粒子の検査と分類の働きをする。このため、細胞は流体の中で解放された状態にあり、毛細管を通じてポンプ搬送される。細胞を検査するために、レーザ光を側面から毛細管の中に集束させる。細胞をさまざまな色素または蛍光生体分子によって染色する。励起された蛍光光と逆散乱した励起光が測定される。試料の蛍光信号の励起光からの分離は、二色性光線分割器によって行われる（図１のＭＤＢを参照）。
【００１７】
逆散乱した信号から細胞の大きさを決定することができる。個別細胞の蛍光のスペクトル特性を用いて、さまざまな細胞を分離／分類もしくは分別して計数することができる。細胞の分類はさまざまな毛細管における静電界によって行われる。この成果、すなわち、例えば色素Ｂを有する細胞と比較して色素Ａを有する細胞の数がしばしばヒストグラムとして表示される。
【００１８】
流出速度は一般的に数１０〜数１００ｃｍ／秒である。したがって感度の高い検出が必要になる。検出容積を制限するために、従来技術によれば共焦点検出が行われる。
従来技術によれば、点スキャナの代わりにいわゆるリニア・スキャナも適用される（例えば、非特許文献２参照）。原理的な構造は本質的に図１のＬＳＭの構造に対応する。ただし点焦点の代わりに試料（３）の中に１本の線が形成され、検査しようとする試料は一方向（ｘまたはｙ）にのみ走査される。１点の代わりに１本の線を走査することによって、結像速度を大幅に高速化することができる。こうして、この走査方法を、急速に進む工程をリアルタイムで観察（リアルタイム顕微鏡検査）するために適用することができる。
【００１９】
従来技術によるリアルタイム顕微鏡検査のためのさらに別の配置では、検査しようとする領域全体が、広がった光源によって照明される。しかし、走査しようとする領域全体の特定の点見本のみが、高速回転する円板によって解放される。この方法は文献ではニポウディスク法と呼ばれることが多い（例えば、非特許文献２参照）。
【００２０】
例えばいわゆるチップリーダにおけるような色素のスクリーニングのための配置は、その光学的構造がレーザ走査型顕微鏡に似ている。しかし、これは巨視的試料の検査、例えばバイオチップにおける作用物質のスクリーニングのための明らかにより大きなイメージ・フィールドを走査する。走査領域の辺長はこの場合数１０ｍｍである。この走査領域は、例えばガルバノスキャナの走査角度を拡大するか、顕微鏡配置の中間画像の中に試料を配置するか、あるいは中間画像を試料に応じて拡大して表示する特殊な対物レンズ配置（マクロ対物レンズ）を用いることによって、達成することができる。
【００２１】
試料から放出された光からの励起光の分離は、従来技術によれば、ストークス・シフトの利用によるスペクトル分離、試料照明／検出のために適用される光学系の開口数の制限、またはさまざまな偏光方向の分割によって行われる。
【００２２】
試料から放出された光からの励起光のスペクトル分離のために、専用の二色性光線分割器が適用される。これはたいてい図２ａに示すように、できるだけ効率よく励起光を反射して、試料から放出された光からできるだけ効率よく伝送するように設計されている。反射角度（反射能）と波長との関係が図示されている。偏光された励起光を適用する場合には、反射した波長範囲の最低スペクトル帯域幅（ｓ）は約１０ｎｍであり、この場合カットオフ特性（ｆ）はたいてい＞５ｎｍである。したがって、従来技術では励起波長を適用する場合に二色性光線分割器によって、試料から放出された光を効率よく分離することができる。それでも、たいてい励起光と放出された光とのスペクトル重複に至るので、複数の波長による複数の色素の同時励起の場合（多重蛍光型顕微鏡検査）には効率は悪くなる。さらに、異なる吸収特性を有するさまざまな色素を適用する場合には、その度に専用の光線分割器を作らなければならない。広視野顕微鏡では、たいてい白色光源の光による試料の広帯域励起が行われ、この場合、励起放射と放出された放射はスペクトルで部分的に重複する。したがって、従来技術による二色性光線分割器を適用する場合には、励起光と放出された光との分離効率は悪くなる。
【００２３】
試料照明光学系の開口数（図２ｂの４）の制限による励起光と放出された光との分離は、軸に近い光線（１）のみが試料（２）の方向に来るように、例えば制限された開口による試料の照明によって実施可能である。放出はすべての空間方向に行われるので、残っている開口領域においてこの試料（２）の光を集めることができる。次いで、励起光の放出された光からの分離は、部分的に完全な鏡になっている（黒い領域の）平板（３）によって行われる。試料から放出された光の検出は放射方向（５）に行われる。従来技術（例えば、特許文献２）から知られている開口数の分離法では、開口の制限によって一方では検出の効率が、他方ではその配置の光学的分解能が悪くなるという欠点がある。この場合この両パラメータは互いに結合している。例えば高い分離効率を達成しようと望めば、光学的分解能は悪くなる。
【００２４】
従来技術によるこれまで述べた方法にはすべて、試料から放出された光からの励起光の分離が波長に依存し、すなわち柔軟に調節できず、または必要なスペクトル特性と照明光線の数に依存して一般的には７０％〜９０％という制限された効率を有する、という欠点がある。
【００２５】
特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６には、機械的構成要素を動かすことなくスペクトル的に柔軟に励起光からの検出光の調節可能な分離を行うことができる光学的装置を記載している（図３）。この構成では、ＭＤＢは音響光学変調器ＡＯＴＦ（１７，４）に代わっている。これは試料の方向から来る観察光（５，１２）を、検出器（１５）の方向になるように伝達する。励起光（３，９）は（１２）に対してある角度で進み、ＡＯＴＦを通って共通の試料光線経路（５）に回折される。この場合、ＡＯＴＦの周波数は、励起光線経路と検出光線経路が共直線的に進むように調節される必要がある。これが保証されなければ、励起スポットはさまざまな波長を適用する場合に重なり合わないので、特に共焦点検出の場合に検出効率の低下となるか、もしくは画像のアーチファクトになる。専用の補償装置が特許文献７に記載されている。この配置の場合、伝達全体を悪化させる多数の互いに同調する光学的構成要素が必要であるという欠点がある。
【００２６】
特許文献８には、広視野顕微鏡もしくは線形走査顕微鏡における励起光からの検出光の無彩色分離を行うことができる方法および光学装置が記載されている。この場合、試料において励起および／または逆散乱された、および／または試料から反射された光放射が分離され、試料照明は、試料面と把握面との間の光線経路の瞳面および／または瞳面の近くに集束され、この平面の中に検出光からの照明光の空間的分離のための手段が備えられている。
【００２７】
特許文献９（図３）には、照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して調節可能に変化させるための方法および構成が記載されており、この場合、第１偏光手段（Ｐ１，Ｐ３）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が行われ、第１分散手段（Ｄ１）によって少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が実施され、スペクトル・空間的に分割された成分はエレメントＳの上に写像され（Ｌ１）、スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態はエレメントＳの作用によって変更され、第２写像手段（Ｌ２）と偏光手段（Ｐ２，Ｐ４）を通じて、異なる偏光の放射成分の空間的分離および／または集結が実施され、その際、空間的集結が、偏光状態に関して変更および変更されない放射成分によって第２分散手段（Ｄ２）を通じて生じることは有利である。この構成の場合、スペクトル・空間的分割のための光学的構成要素の数によって、この構成の効率が低下することは欠点である。その上、要素Ｓにおけるスペクトル成分の偏光状態の操作が線形アレイによって行われる。このアレイは、所定のスペクトル分解能に応じて電子的配線に関する高い経費を必要とする。その上、空間光変調器を適用する場合には速度は制限され、数１０ｍｓになる。従来技術の特許文献９（図３）では、各２つの光分割キューブ（Ｐ２とＰ１もしくはＰ４とＰ３）２の間に、光放射を空間スペクトル的にＹ座標に沿って分割するか、もしくは再び集める分散要素（例えばプリズムまたは格子）Ｄ１およびＤ２が配置されている。光学系Ｌ１およびＬ２は、それぞれその焦点距離ｆの間隔にあり、この焦点距離はまた光学系について分散要素Ｄ１もしくはＤ２と偏光回転用要素、例えば空間光変調器（ＳＬＭ）Ｓとの間で異なることができる。光学系Ｌ１およびＬ２は分散要素Ｄ１およびＤ２と共同でＳＬＭ Ｓの個所におけるスペクトル・フーリエ平面の生成のために働く。この平面で、方向２または方向１から来る光のスペクトル成分が空間的にｙ座標に沿って分離される。ＳＬＭ（例えばイェノプティク社（Ｆｉｒｍａ Ｊｅｎｏｐｔｉｋ）ＳＬＭ６４０［ドイツ所在］）は、個別に方向制御可能な一連のストライプ（ＳＬＭ６４０の場合は６４０個のストライプ）から成っている。それぞれの画素の方向制御に応じて、貫通する光の偏光方向を変えることができる。ＳＬＭは、従来技術によればいわゆるパルス整形器の中にはめ込まれている（例えば、非特許文献３参照）。この場合、分散要素と組み合わせたＳＬＭの作用によって、光源のスペクトル成分の位相遅延および／または振幅変更が行われる。このために、光源は下記の構成とは反対に線形に偏光されなければならない。そのわけは、さもなければエネルギー損失が起こるからである。特許文献１０には、スペクトル分割された照明光がミラー支持体（ＳＴ）を通じて選択的に反射され、分散要素において再び集められる配置が記載されている。試料光も同様に分散要素を通じて空間的にスペクトル分割され、次に専用のくさび型ガラス・プリズム（ＧＫ）を通じて、対応して分離された検出チャネルへと偏向される。水平くさび移動によってチャネル位置が、垂直くさび移動によって帯域幅が変化する。この変形例は上述のさらに別の構成よりも有利である。ミラー・システム（ＳＴ，ＧＫ）およびこの方向制御は確かに複雑で、ある限られたフレキシビリティのみを示す。特に、試料光のチャネル分割は、ガラスくさびの数と形状によって予め決められたやり方によって行われる。
【特許文献１】独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書
【特許文献２】欧州特許第１３５３２０９号明細書
【特許文献３】米国特許第６５１０００１号明細書
【特許文献４】米国特許第６６５４１６５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１３３１８９号明細書
【特許文献６】独国特許発明第１９９３６５７３号明細書
【特許文献７】独国特許発明第１０１３７１５５号明細書
【特許文献８】独国特許発明第１０２５７２３７号明細書
【特許文献９】独国特許発明第１０２４１４７２号明細書
【特許文献１０】独国特許発明第１９８４２２８８号明細書
【特許文献１１】独国特許出願公開第１００３３１８０号明細書
【特許文献１２】独国特許出願公開第１０２４１４７２号明細書
【非特許文献１】ポーリー（Ｐａｗｌｅｙ），“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”；Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５年
【非特許文献２】コール（Ｃｏｒｌｅ），キノ（Ｋｉｎｏ）；“Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６年
【非特許文献３】ストブラワら（Ｓｔｏｂｒａｗａ ｅｔ ａｌ．），Ａｐｌ．Ｐｈｙ．Ｂ７２，６２７−６３０（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して調節可能に変化させるための方法および装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本方法および装置では、第１偏光手段（Ｐｏｌ１）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が実施され、第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）によって、少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が行われ、スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態が変えられ、照明光および／または検出光の反射が実施される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
図４は、反射における本発明による構成を示す。
図４ａでは、結合ポートＫＰ２を通じて本質的に非偏光光が試料から極分割器Ｐに至り、これから互いに垂直に交わる偏光成分（矢印もしくは点）に分割され、一成分は直接分散要素Ｄに達し、他の成分は分割器Ｐにおいて反射し、ミラーＭを通じて要素Ｄに至り、ここでスペクトル分割される。
【００３１】
放射は、レンズＬを通じてＳＬＭＳとミラーＭ１の平面Ｓ／Ｍ１に集束され、こうして波長に応じてその偏光において異なった影響を受け、これによって、再び極分割器Ｐの方向に到る光の個別のスペクトル成分の偏光を変えることができる。
【００３２】
Ｓの平面では、単一または複数のスペクトル成分がその偏光において、偏光平面が正確に９０度または９０度から外れた値だけ回転されるように影響を受ける。さらに、偏光平面がスペクトル構成部分によって影響されないままになるように、Ｓを切り替えることが可能である。角度εだけ傾いたミラーＭ１の上に、この目的のためにＳＬＭ（空間光変調器）が装着され（ＳＬＭの後側は鏡になっている）、ＳＬＭはミラーＭ１において反射したスペクトル分割した放射成分に影響する。
【００３３】
図示した場合では、ある可能な実施形態においては試料光に対して影響がないので、検出方向には影響せず、スペクトル分離検出のためのさらに別の手段を準備することができる（例えば、特許文献１１参照）。
【００３４】
反射成分は再び分散要素を越えて、そこで集められ、ミラーＭもしくは極分割器Ｐの裏側を通じて結合ポートＫＰ４（異なる場所）に到る。その他は、特許文献１２を参照されたい。
【００３５】
図４ｂは、照明光の影響を示しており、照明光は結合ポートＫＰ１とミラーＭ２を経て極分割器Ｐに至り、ここで両偏光成分に分割され、分散要素Ｄ、レンズＬ、およびＳＬＭ／ミラーＭ１を経て、結合ポート２の方向に到る。
【００３６】
異なる偏光方向が分散要素とＳＬＭとの異なる場所に達し、こうして、ＫＰ２において分割器Ｐを通じて再び統合される前にＳＬＭによって異なった影響を受けることができる。
【００３７】
この際、照明光の場合にはＳＬＭを通じて調節可能に、成分の偏光平面がそれぞれの垂直方向へ回転し、これによって極分割器Ｐの後で再び統合される（試料の方向）。
図５には、本発明による構成が詳細に側面図で示され、この場合、異なる偏光方向を有する異なる波長ＩおよびＩＩの光が示されている。要素Ｄにおける分離によって、励起光もしくは検出光はＳＬＭにおいて偏光の回転によって異なる影響を受け、異なる出口に向けられ、もしくは完全または部分的にしだいに減光される。
【００３８】
図６は、ミラーＭ１の傾斜がある場合とない場合の光線経路の相違を示す。極分割器ＰにおけるミラーＭ１の傾斜（図６ｂを参照）を通じて、光源（１）と試料光（２）との光経路の相互変位Ｖが存在することが明らかになる。さらに検出（４）は分離される。３つのポート（ＫＰ１，２，および４）が必要であり、これによって蛍光顕微鏡では励起光は方向（１）から来て試料方向（２）に導かれ、試料光は（２）から来て検出器方向（４）に分離されることが可能である。Ｍ１の傾斜がなければ、ポート（２）および（１）は共通の光線経路を形成するので、これは不可能である。これによって、励起光の試料への結合は不可能である（図６ａを参照）。
【００３９】
図７は、ＳＬＭＳがミラーＭ１の前に、ある間隔で分離して置かれた配置を示す。
図８は、ＳＬＭによるミラー・マスクＳＭを示し、これは図９ａに詳しく図示されている。これは鏡面化された部分と鏡面化されていない部分とを有する（暗い部分ＡＡは鏡面化されていない）。
【００４０】
図９ｂには、鏡面化されない領域に３つの層を有することが有利であるこの種のミラー・マスクの部分断面があり、この場合、層ｃは反射性であり、ｂは偏光回転のための層であり（１／４波長板）、ａは暗い部分ＡＡでは透過性である。
【００４１】
したがって、ＳＭの透過性個所において放射は偏光回転を受ける。ＳＭがＸに沿って（垂直に）変位すると、空間的さまざまな透過性領域が、スペクトル分割された光経路に達し、これによって他の波長成分がそれぞれ影響を受ける。したがって、ＳＭは調節可能な反射器として作用し、特定の領域において特定のスペクトル成分のために偏向が回転される。
【００４２】
ＳＭを通じて照明光が調節可能にそのスペクトル構成において影響されることは有利である。
要素ＳＭの別の実施形態を図１０に示す。この場合、ミラー・マスクを有する層ａと反射性層ｃとは互いに僅かな角度αで傾いている。これによって、マスクを通過して層ｃによって反射される光線は、層ａにおいて反射した光線に対して２αの角度の相互変位を受ける。層ｂは偏向光学的性質を示さず、したがって層ｂを、空気、または（望ましくない境界面反射による損失を避けるため）ミラー・マスクａの基板において屈折率が適合していることが有利である媒体とすることができる。
【００４３】
図１１は、図１０の要素ＳＭを適用する２つ構成を示す。この場合、すべての要素は上述の図におけると同様な機能と説明によって同じ方法で図示されている。この場合、図１１Ａは偏光光学要素を有する変形を示し、したがって２つの偏光光線分割器Ｐ１およびＰ２が使用される。この構成では、試料から放出された光（ＫＰ２）の偏光方向が直接Ｐ２およびＰ１を通じて検出ポートＫＰ４に達し、これによってこの光のために損失が最小限に抑えられることが有利である。他の偏光方向（励起光に平行に偏光される）のための励起と検出の分離は、ＳＭにおける光線のスペクトルに応じた傾斜を通じて行われる。試料における多重散乱を通じてその偏光方向に回転した励起光も同様に、Ｐ２およびＰ１を通じてＫＰ４に達する。この励起光のとりわけ非常に僅かな成分は、蛍光撮像を実施する場合には、検出の前にフィルタによって遮断される必要がある。一方では、対応する遮断が行われる場合には、この光は照明（散乱光）の中での撮像を可能にする。励起と検出の幾何学的分離によって、図１１Ｂに示すように偏光光学的構成要素に依拠しない実施形態も可能になる。この場合、Ｐ１およびＰ２はミラーＭ１およびＭ２に代わっている。これによって、この分離は光の偏光に（およびこれによって、散乱による励起光の偏光の、場合によっては存在する回転にも）依存しない。さらにこの分離は、もっと簡単な構成部分の適用による構造を簡略化する。
【００４４】
図９および１０に示すような要素ＳＭの代わりに、図１１における配置では、図１２に概略的に示すようにミラー・アレイを使用することもできる。この場合、それぞれの小さなミラー要素ＳＥは少なくとも２つの離散個所で個別に傾斜可能であるから、ｙ軸に沿ったどの個所で光線がＳＭに落ちるかによって、光線は１または２のように偏向される。この場合、ミラーの大きさは、完全なフレキシビリティを可能にするために、分散要素の分解と続くレンズに適合させるべきである。
【００４５】
図１３は、検出器配置ＤＥ１およびＤＥ２ならびに光源ＬＱおよび（影響されない）光源ＬＱ２を有し、さらに従来技術による試料ＰＲの方向における結像レンズを有する全体構成図である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】従来技術による共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）を説明する図。
【図２】従来技術による二色性光線分割器（ＭＤＢ）を説明する概略図。
【図３】従来技術によってスペクトル的に柔軟に励起光からの検出光の調節可能な分離を行うことができる光学的方法を示す図。
【図４】反射における本発明による配置を示す図。
【図５】本発明による配置の詳細側面図。
【図６】ミラーＭ１の傾斜がある場合とない場合の光線経路の相違を示す図。
【図７】ＳＬＭ（Ｓ）がミラーＭ１のミラーの前にある間隔で分離して置かれた配置を示す図。
【図８】ＳＬＭによるミラー・マスクＳＭを示す図。
【図９】図８のミラー・マスクの詳細図。
【図１０】要素ＳＭの別の実施形態を示す図。
【図１１】図１０の要素ＳＭを適用する２つの配置を示す図。
【図１２】ミラー・アレイを使用する図１１における配置を示す図。
【図１３】検出器配置ＤＥ１およびＤＥ２ならびに光源Ｑ１および（影響されない）光源ＬＱ２を有し、さらに従来技術による試料ＰＲの方向における結像レンズを有する全体配置図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に生物学的試料、プレパラート、および付属の構成要素を検査するための顕微鏡検査、特に蛍光顕微鏡検査、レーザ走査型顕微鏡検査、蛍光相関スペクトル顕微鏡検査、および走査近接場顕微鏡検査における方法および構成に関する。作用物質のスクリーニングのための蛍光検出に基づく方法（高速高感度スクリーニング）ならびに流出細胞測定法もこれに含まれる。それと共に、複数の試料点における試料の同時照明によってリアルタイムで複数蛍光体を有する試料を同時検査することは、重なり合う蛍光スペクトルの場合に密な試料の空間構造においても可能になる。
【背景技術】
【０００２】
生物学的プレパラートを検査するための光学顕微鏡検査の典型的な適用分野は、蛍光顕微鏡検査である（例えば、非特許文献１参照）。これに関して、特定の色素が細胞部分の特有のマーキングのために適用される。
【０００３】
ある一定のエネルギーの放射される光子は、吸収されることによって色素分子を励起し、基底状態から励起状態にする。この励起はたいてい一光子吸収と呼ばれる。このように励起された色素分子を、さまざまな方法で基底状態に戻すことができる。蛍光顕微鏡検査では、蛍光光子の放射の下での移行が最も重要である。放出された光子の波長は、ストークス・シフトに基づいて励起放射と比較して一般に赤方にずれており、したがって大きな波長を有する。ストークス・シフトは励起放射からの蛍光放射の分離を可能にする。
【０００４】
蛍光光は、ブロック・フィルタと組み合わせた適切な二色性光線分割器によって励起放射から分割され、別々に観察される。これによって、さまざまな色素によって染色された個別の細胞部分の表示が可能になる。しかしながら、基本的に、プレパラートの複数の部分も同時にさまざまな個別に付加される色素によって染色することが可能である（多重蛍光）。さらにまた、個々の色素から送出された蛍光信号を区別するために、専用の二色性光線分割器が適用される。
【０００５】
高いエネルギーを有する１つの光子による色素分子の励起（一光子吸収）の他に、より低いエネルギーを有する複数の光子による励起も可能である。この場合、個別光子のエネルギーの総和は、高いエネルギーを有する１つの光子のエネルギーのほぼ何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と呼ばれる（例えば、非特許文献２参照）。それでも色素放出は、この種の励起によって影響されない。すなわち放出スペクトルは多光子吸収の際に負のストークス・シフトを受けるので、励起放射と比較して短い波長を有する。励起放射の放出放射からの分離は、一光子吸収の場合と同様な流儀で行われる。
【０００６】
次に、従来技術を、例として共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）を用いて以下に説明する（図１）。
ＬＳＭは本質的に４つのモジュール、すなわち光源、走査モジュール、検出ユニット、および顕微鏡に区分される。これらのモジュールを以下にさらに詳しく説明する。これについてはさらに特許文献１を参照されたい。
【０００７】
プレパラートにおけるさまざまな色素を個別に励起するために、ＬＳＭにはさまざまな波長のレーザが備えられている。励起波長の選択は、検査しようとする色素の吸収特性に左右される。励起放射は光源モジュールの中で作られる。この際、さまざまなレーザ（例えば気体レーザ：アルゴン、アルゴン・クリプトン、固体レーザ：ＴｉＳａレーザ、ダイオード）が使用される。さらに光源モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強度の調節が、例えば、音響光学結晶の使用によって行われる。続いて、レーザ放射はファイバまたは適切なミラー配置を通じて走査モジュールに達する。
【０００８】
光源の中で生成されたレーザ放射は、対物レンズによって回折を制限されてスキャナ、走査レンズ、および鏡胴レンズを通じてプレパラートに集束される。スキャナは試料をｘ−ｙ方向に点状に走査する。試料を走査する場合、画素滞留時間はたいてい、マイクロ秒未満から数秒の範囲にある。
【０００９】
蛍光光の共焦点検出（走査検出）の場合、焦点面（試験片）からおよびその上とその下にある平面から放出される光は、スキャナを経て二色性光線分割器（ＭＤＢ）に伝わる。二色性光線分割器は蛍光光を励起光から分離する。続いて、蛍光光は絞り（共焦点絞り／ピンホール）の上に集束され、この絞りは正に焦点面に結合された平面の中にある。これによって、蛍光光成分は焦点の外側で抑制される。絞りの大きさを変化させることによって、顕微鏡の光学的分解能を調節することができる。絞りの背後にさらに１つの二色性ブロック・フィルタ（ＥＦ）があり、これは再度励起放射を抑制する。ブロック・フィルタを通過した後、蛍光光は点検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【００１０】
多光子吸収を適用する場合には、励起強度が特に高い小さな容積の中で色素蛍光の励起が行われる。この範囲は、共焦点配置の適用における検出された範囲よりも僅かに大きいだけである。したがって、共焦点絞りの使用を省略することができ、検出を対物レンズによって直接行うことができる（非走査検出）。
【００１１】
多光子吸収によって励起された色素蛍光を検出するためのさらに別の構成では、やはり走査検出が行われるが、ここでは対物レンズの瞳が検出ユニットの中に形成される（非共焦点走査検出）。
【００１２】
三次元照明された画像から、対応する一光子もしくは多光子吸収に関連する両検出配置を通じて、対物レンズの焦点面にある平面（光学断面）のみが再現される。試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面における複数の光学断面を描くことによって、次いでコンピュータの支援によって試料の三次元画像を生成することができる。
【００１３】
これによって、ＬＳＭは厚いプレパラートの検査に適している。励起波長は、適用される特定の吸収特性を有する色素によって決定される。色素の発光特性に合った二色性フィルタによって、それぞれの色素から出される蛍光光が点検出器によって測定されることを保証する。
【００１４】
生物医学的適用例においては現在、複数のさまざまな細胞領域がさまざまな色素によって同時マーキングされる（多重蛍光）。従来技術では、個別の色素をさまざまな吸収特性もしくは発光特性（スペクトル）に基づいて別々に実証することができる。
【００１５】
別々の実証のために、蛍光光の複数の色素からの近接光分離器（ＤＢＳ）による追加分割およびさまざまな点検出器（ＰＭＴ１〜４）における個別色素発光の別々の検出が行われる。
【００１６】
流出細胞計算器は、細胞およびその他の粒子の検査と分類の働きをする。このため、細胞は流体の中で解放された状態にあり、毛細管を通じてポンプ搬送される。細胞を検査するために、レーザ光を側面から毛細管の中に集束させる。細胞をさまざまな色素または蛍光生体分子によって染色する。励起された蛍光光と逆散乱した励起光が測定される。試料の蛍光信号の励起光からの分離は、二色性光線分割器によって行われる（図１のＭＤＢを参照）。
【００１７】
逆散乱した信号から細胞の大きさを決定することができる。個別細胞の蛍光のスペクトル特性を用いて、さまざまな細胞を分離／分類もしくは分別して計数することができる。細胞の分類はさまざまな毛細管における静電界によって行われる。この成果、すなわち、例えば色素Ｂを有する細胞と比較して色素Ａを有する細胞の数がしばしばヒストグラムとして表示される。
【００１８】
流出速度は一般的に数１０〜数１００ｃｍ／秒である。したがって感度の高い検出が必要になる。検出容積を制限するために、従来技術によれば共焦点検出が行われる。
従来技術によれば、点スキャナの代わりにいわゆるリニア・スキャナも適用される（例えば、非特許文献２参照）。原理的な構造は本質的に図１のＬＳＭの構造に対応する。ただし点焦点の代わりに試料（３）の中に１本の線が形成され、検査しようとする試料は一方向（ｘまたはｙ）にのみ走査される。１点の代わりに１本の線を走査することによって、結像速度を大幅に高速化することができる。こうして、この走査方法を、急速に進む工程をリアルタイムで観察（リアルタイム顕微鏡検査）するために適用することができる。
【００１９】
従来技術によるリアルタイム顕微鏡検査のためのさらに別の配置では、検査しようとする領域全体が、広がった光源によって照明される。しかし、走査しようとする領域全体の特定の点見本のみが、高速回転する円板によって解放される。この方法は文献ではニポウディスク法と呼ばれることが多い（例えば、非特許文献２参照）。
【００２０】
例えばいわゆるチップリーダにおけるような色素のスクリーニングのための配置は、その光学的構造がレーザ走査型顕微鏡に似ている。しかし、これは巨視的試料の検査、例えばバイオチップにおける作用物質のスクリーニングのための明らかにより大きなイメージ・フィールドを走査する。走査領域の辺長はこの場合数１０ｍｍである。この走査領域は、例えばガルバノスキャナの走査角度を拡大するか、顕微鏡配置の中間画像の中に試料を配置するか、あるいは中間画像を試料に応じて拡大して表示する特殊な対物レンズ配置（マクロ対物レンズ）を用いることによって、達成することができる。
【００２１】
試料から放出された光からの励起光の分離は、従来技術によれば、ストークス・シフトの利用によるスペクトル分離、試料照明／検出のために適用される光学系の開口数の制限、またはさまざまな偏光方向の分割によって行われる。
【００２２】
試料から放出された光からの励起光のスペクトル分離のために、専用の二色性光線分割器が適用される。これはたいてい図２ａに示すように、できるだけ効率よく励起光を反射して、試料から放出された光からできるだけ効率よく伝送するように設計されている。反射角度（反射能）と波長との関係が図示されている。偏光された励起光を適用する場合には、反射した波長範囲の最低スペクトル帯域幅（ｓ）は約１０ｎｍであり、この場合カットオフ特性（ｆ）はたいてい＞５ｎｍである。したがって、従来技術では励起波長を適用する場合に二色性光線分割器によって、試料から放出された光を効率よく分離することができる。それでも、たいてい励起光と放出された光とのスペクトル重複に至るので、複数の波長による複数の色素の同時励起の場合（多重蛍光型顕微鏡検査）には効率は悪くなる。さらに、異なる吸収特性を有するさまざまな色素を適用する場合には、その度に専用の光線分割器を作らなければならない。広視野顕微鏡では、たいてい白色光源の光による試料の広帯域励起が行われ、この場合、励起放射と放出された放射はスペクトルで部分的に重複する。したがって、従来技術による二色性光線分割器を適用する場合には、励起光と放出された光との分離効率は悪くなる。
【００２３】
試料照明光学系の開口数（図２ｂの４）の制限による励起光と放出された光との分離は、軸に近い光線（１）のみが試料（２）の方向に来るように、例えば制限された開口による試料の照明によって実施可能である。放出はすべての空間方向に行われるので、残っている開口領域においてこの試料（２）の光を集めることができる。次いで、励起光の放出された光からの分離は、部分的に完全な鏡になっている（黒い領域の）平板（３）によって行われる。試料から放出された光の検出は放射方向（５）に行われる。従来技術（例えば、特許文献２）から知られている開口数の分離法では、開口の制限によって一方では検出の効率が、他方ではその配置の光学的分解能が悪くなるという欠点がある。この場合この両パラメータは互いに結合している。例えば高い分離効率を達成しようと望めば、光学的分解能は悪くなる。
【００２４】
従来技術によるこれまで述べた方法にはすべて、試料から放出された光からの励起光の分離が波長に依存し、すなわち柔軟に調節できず、または必要なスペクトル特性と照明光線の数に依存して一般的には７０％〜９０％という制限された効率を有する、という欠点がある。
【００２５】
特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６には、機械的構成要素を動かすことなくスペクトル的に柔軟に励起光からの検出光の調節可能な分離を行うことができる光学的装置を記載している（図３）。この構成では、ＭＤＢは音響光学変調器ＡＯＴＦ（１７，４）に代わっている。これは試料の方向から来る観察光（５，１２）を、検出器（１５）の方向になるように伝達する。励起光（３，９）は（１２）に対してある角度で進み、ＡＯＴＦを通って共通の試料光線経路（５）に回折される。この場合、ＡＯＴＦの周波数は、励起光線経路と検出光線経路が共直線的に進むように調節される必要がある。これが保証されなければ、励起スポットはさまざまな波長を適用する場合に重なり合わないので、特に共焦点検出の場合に検出効率の低下となるか、もしくは画像のアーチファクトになる。専用の補償装置が特許文献７に記載されている。この配置の場合、伝達全体を悪化させる多数の互いに同調する光学的構成要素が必要であるという欠点がある。
【００２６】
特許文献８には、広視野顕微鏡もしくは線形走査顕微鏡における励起光からの検出光の無彩色分離を行うことができる方法および光学装置が記載されている。この場合、試料において励起および／または逆散乱された、および／または試料から反射された光放射が分離され、試料照明は、試料面と把握面との間の光線経路の瞳面および／または瞳面の近くに集束され、この平面の中に検出光からの照明光の空間的分離のための手段が備えられている。
【００２７】
特許文献９（図３）には、照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して調節可能に変化させるための方法および構成が記載されており、この場合、第１偏光手段（Ｐ１，Ｐ３）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が行われ、第１分散手段（Ｄ１）によって少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が実施され、スペクトル・空間的に分割された成分はエレメントＳの上に写像され（Ｌ１）、スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態はエレメントＳの作用によって変更され、第２写像手段（Ｌ２）と偏光手段（Ｐ２，Ｐ４）を通じて、異なる偏光の放射成分の空間的分離および／または集結が実施され、その際、空間的集結が、偏光状態に関して変更および変更されない放射成分によって第２分散手段（Ｄ２）を通じて生じることは有利である。この構成の場合、スペクトル・空間的分割のための光学的構成要素の数によって、この構成の効率が低下することは欠点である。その上、要素Ｓにおけるスペクトル成分の偏光状態の操作が線形アレイによって行われる。このアレイは、所定のスペクトル分解能に応じて電子的配線に関する高い経費を必要とする。その上、空間光変調器を適用する場合には速度は制限され、数１０ｍｓになる。従来技術の特許文献９（図３）では、各２つの光分割キューブ（Ｐ２とＰ１もしくはＰ４とＰ３）２の間に、光放射を空間スペクトル的にＹ座標に沿って分割するか、もしくは再び集める分散要素（例えばプリズムまたは格子）Ｄ１およびＤ２が配置されている。光学系Ｌ１およびＬ２は、それぞれその焦点距離ｆの間隔にあり、この焦点距離はまた光学系について分散要素Ｄ１もしくはＤ２と偏光回転用要素、例えば空間光変調器（ＳＬＭ）Ｓとの間で異なることができる。光学系Ｌ１およびＬ２は分散要素Ｄ１およびＤ２と共同でＳＬＭ Ｓの個所におけるスペクトル・フーリエ平面の生成のために働く。この平面で、方向２または方向１から来る光のスペクトル成分が空間的にｙ座標に沿って分離される。ＳＬＭ（例えばイェノプティク社（Ｆｉｒｍａ Ｊｅｎｏｐｔｉｋ）ＳＬＭ６４０［ドイツ所在］）は、個別に方向制御可能な一連のストライプ（ＳＬＭ６４０の場合は６４０個のストライプ）から成っている。それぞれの画素の方向制御に応じて、貫通する光の偏光方向を変えることができる。ＳＬＭは、従来技術によればいわゆるパルス整形器の中にはめ込まれている（例えば、非特許文献３参照）。この場合、分散要素と組み合わせたＳＬＭの作用によって、光源のスペクトル成分の位相遅延および／または振幅変更が行われる。このために、光源は下記の構成とは反対に線形に偏光されなければならない。そのわけは、さもなければエネルギー損失が起こるからである。特許文献１０には、スペクトル分割された照明光がミラー支持体（ＳＴ）を通じて選択的に反射され、分散要素において再び集められる配置が記載されている。試料光も同様に分散要素を通じて空間的にスペクトル分割され、次に専用のくさび型ガラス・プリズム（ＧＫ）を通じて、対応して分離された検出チャネルへと偏向される。水平くさび移動によってチャネル位置が、垂直くさび移動によって帯域幅が変化する。この変形例は上述のさらに別の構成よりも有利である。ミラー・システム（ＳＴ，ＧＫ）およびこの方向制御は確かに複雑で、ある限られたフレキシビリティのみを示す。特に、試料光のチャネル分割は、ガラスくさびの数と形状によって予め決められたやり方によって行われる。
【特許文献１】独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書
【特許文献２】欧州特許第１３５３２０９号明細書
【特許文献３】米国特許第６５１０００１号明細書
【特許文献４】米国特許第６６５４１６５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１３３１８９号明細書
【特許文献６】独国特許発明第１９９３６５７３号明細書
【特許文献７】独国特許発明第１０１３７１５５号明細書
【特許文献８】独国特許発明第１０２５７２３７号明細書
【特許文献９】独国特許発明第１０２４１４７２号明細書
【特許文献１０】独国特許発明第１９８４２２８８号明細書
【特許文献１１】独国特許出願公開第１００３３１８０号明細書
【特許文献１２】独国特許出願公開第１０２４１４７２号明細書
【非特許文献１】ポーリー（Ｐａｗｌｅｙ），“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”；Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５年
【非特許文献２】コール（Ｃｏｒｌｅ），キノ（Ｋｉｎｏ）；“Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６年
【非特許文献３】ストブラワら（Ｓｔｏｂｒａｗａ ｅｔ ａｌ．），Ａｐｌ．Ｐｈｙ．Ｂ７２，６２７−６３０（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して調節可能に変化させるための方法および装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本方法および装置では、第１偏光手段（Ｐｏｌ１）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が実施され、第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）によって、少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が行われ、スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態が変えられ、照明光および／または検出光の反射が実施される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
図４は、反射における本発明による構成を示す。
図４ａでは、結合ポートＫＰ２を通じて本質的に非偏光光が試料から極分割器Ｐに至り、これから互いに垂直に交わる偏光成分（矢印もしくは点）に分割され、一成分は直接分散要素Ｄに達し、他の成分は分割器Ｐにおいて反射し、ミラーＭを通じて要素Ｄに至り、ここでスペクトル分割される。
【００３１】
放射は、レンズＬを通じてＳＬＭＳとミラーＭ１の平面Ｓ／Ｍ１に集束され、こうして波長に応じてその偏光において異なった影響を受け、これによって、再び極分割器Ｐの方向に到る光の個別のスペクトル成分の偏光を変えることができる。
【００３２】
Ｓの平面では、単一または複数のスペクトル成分がその偏光において、偏光平面が正確に９０度または９０度から外れた値だけ回転されるように影響を受ける。さらに、偏光平面がスペクトル構成部分によって影響されないままになるように、Ｓを切り替えることが可能である。角度εだけ傾いたミラーＭ１の上に、この目的のためにＳＬＭ（空間光変調器）が装着され（ＳＬＭの後側は鏡になっている）、ＳＬＭはミラーＭ１において反射したスペクトル分割した放射成分に影響する。
【００３３】
図示した場合では、ある可能な実施形態においては試料光に対して影響がないので、検出方向には影響せず、スペクトル分離検出のためのさらに別の手段を準備することができる（例えば、特許文献１１参照）。
【００３４】
反射成分は再び分散要素を越えて、そこで集められ、ミラーＭもしくは極分割器Ｐの裏側を通じて結合ポートＫＰ４（異なる場所）に到る。その他は、特許文献１２を参照されたい。
【００３５】
図４ｂは、照明光の影響を示しており、照明光は結合ポートＫＰ１とミラーＭ２を経て極分割器Ｐに至り、ここで両偏光成分に分割され、分散要素Ｄ、レンズＬ、およびＳＬＭ／ミラーＭ１を経て、結合ポート２の方向に到る。
【００３６】
異なる偏光方向が分散要素とＳＬＭとの異なる場所に達し、こうして、ＫＰ２において分割器Ｐを通じて再び統合される前にＳＬＭによって異なった影響を受けることができる。
【００３７】
この際、照明光の場合にはＳＬＭを通じて調節可能に、成分の偏光平面がそれぞれの垂直方向へ回転し、これによって極分割器Ｐの後で再び統合される（試料の方向）。
図５には、本発明による構成が詳細に側面図で示され、この場合、異なる偏光方向を有する異なる波長ＩおよびＩＩの光が示されている。要素Ｄにおける分離によって、励起光もしくは検出光はＳＬＭにおいて偏光の回転によって異なる影響を受け、異なる出口に向けられ、もしくは完全または部分的にしだいに減光される。
【００３８】
図６は、ミラーＭ１の傾斜がある場合とない場合の光線経路の相違を示す。極分割器ＰにおけるミラーＭ１の傾斜（図６ｂを参照）を通じて、光源（１）と試料光（２）との光経路の相互変位Ｖが存在することが明らかになる。さらに検出（４）は分離される。３つのポート（ＫＰ１，２，および４）が必要であり、これによって蛍光顕微鏡では励起光は方向（１）から来て試料方向（２）に導かれ、試料光は（２）から来て検出器方向（４）に分離されることが可能である。Ｍ１の傾斜がなければ、ポート（２）および（１）は共通の光線経路を形成するので、これは不可能である。これによって、励起光の試料への結合は不可能である（図６ａを参照）。
【００３９】
図７は、ＳＬＭＳがミラーＭ１の前に、ある間隔で分離して置かれた配置を示す。
図８は、ＳＬＭによるミラー・マスクＳＭを示し、これは図９ａに詳しく図示されている。これは鏡面化された部分と鏡面化されていない部分とを有する（暗い部分ＡＡは鏡面化されていない）。
【００４０】
図９ｂには、鏡面化されない領域に３つの層を有することが有利であるこの種のミラー・マスクの部分断面があり、この場合、層ｃは反射性であり、ｂは偏光回転のための層であり（１／４波長板）、ａは暗い部分ＡＡでは透過性である。
【００４１】
したがって、ＳＭの透過性個所において放射は偏光回転を受ける。ＳＭがＸに沿って（垂直に）変位すると、空間的さまざまな透過性領域が、スペクトル分割された光経路に達し、これによって他の波長成分がそれぞれ影響を受ける。したがって、ＳＭは調節可能な反射器として作用し、特定の領域において特定のスペクトル成分のために偏向が回転される。
【００４２】
ＳＭを通じて照明光が調節可能にそのスペクトル構成において影響されることは有利である。
要素ＳＭの別の実施形態を図１０に示す。この場合、ミラー・マスクを有する層ａと反射性層ｃとは互いに僅かな角度αで傾いている。これによって、マスクを通過して層ｃによって反射される光線は、層ａにおいて反射した光線に対して２αの角度の相互変位を受ける。層ｂは偏向光学的性質を示さず、したがって層ｂを、空気、または（望ましくない境界面反射による損失を避けるため）ミラー・マスクａの基板において屈折率が適合していることが有利である媒体とすることができる。
【００４３】
図１１は、図１０の要素ＳＭを適用する２つ構成を示す。この場合、すべての要素は上述の図におけると同様な機能と説明によって同じ方法で図示されている。この場合、図１１Ａは偏光光学要素を有する変形を示し、したがって２つの偏光光線分割器Ｐ１およびＰ２が使用される。この構成では、試料から放出された光（ＫＰ２）の偏光方向が直接Ｐ２およびＰ１を通じて検出ポートＫＰ４に達し、これによってこの光のために損失が最小限に抑えられることが有利である。他の偏光方向（励起光に平行に偏光される）のための励起と検出の分離は、ＳＭにおける光線のスペクトルに応じた傾斜を通じて行われる。試料における多重散乱を通じてその偏光方向に回転した励起光も同様に、Ｐ２およびＰ１を通じてＫＰ４に達する。この励起光のとりわけ非常に僅かな成分は、蛍光撮像を実施する場合には、検出の前にフィルタによって遮断される必要がある。一方では、対応する遮断が行われる場合には、この光は照明（散乱光）の中での撮像を可能にする。励起と検出の幾何学的分離によって、図１１Ｂに示すように偏光光学的構成要素に依拠しない実施形態も可能になる。この場合、Ｐ１およびＰ２はミラーＭ１およびＭ２に代わっている。これによって、この分離は光の偏光に（およびこれによって、散乱による励起光の偏光の、場合によっては存在する回転にも）依存しない。さらにこの分離は、もっと簡単な構成部分の適用による構造を簡略化する。
【００４４】
図９および１０に示すような要素ＳＭの代わりに、図１１における配置では、図１２に概略的に示すようにミラー・アレイを使用することもできる。この場合、それぞれの小さなミラー要素ＳＥは少なくとも２つの離散個所で個別に傾斜可能であるから、ｙ軸に沿ったどの個所で光線がＳＭに落ちるかによって、光線は１または２のように偏向される。この場合、ミラーの大きさは、完全なフレキシビリティを可能にするために、分散要素の分解と続くレンズに適合させるべきである。
【００４５】
図１３は、検出器配置ＤＥ１およびＤＥ２ならびに光源ＬＱおよび（影響されない）光源ＬＱ２を有し、さらに従来技術による試料ＰＲの方向における結像レンズを有する全体構成図である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】従来技術による共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）を説明する図。
【図２】従来技術による二色性光線分割器（ＭＤＢ）を説明する概略図。
【図３】従来技術によってスペクトル的に柔軟に励起光からの検出光の調節可能な分離を行うことができる光学的方法を示す図。
【図４】反射における本発明による配置を示す図。
【図５】本発明による配置の詳細側面図。
【図６】ミラーＭ１の傾斜がある場合とない場合の光線経路の相違を示す図。
【図７】ＳＬＭ（Ｓ）がミラーＭ１のミラーの前にある間隔で分離して置かれた配置を示す図。
【図８】ＳＬＭによるミラー・マスクＳＭを示す図。
【図９】図８のミラー・マスクの詳細図。
【図１０】要素ＳＭの別の実施形態を示す図。
【図１１】図１０の要素ＳＭを適用する２つの配置を示す図。
【図１２】ミラー・アレイを使用する図１１における配置を示す図。
【図１３】検出器配置ＤＥ１およびＤＥ２ならびに光源Ｑ１および（影響されない）光源ＬＱ２を有し、さらに従来技術による試料ＰＲの方向における結像レンズを有する全体配置図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して調節可能に変化させるための方法であって、
第１偏光手段（Ｐｏｌ１）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が実施され、
第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）によって、少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が行われ、
スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態が変えられ、
照明光および／または検出光の反射が実施される、
方法。
【請求項２】
照明光をそのスペクトル構成および／または強度に関して変化させるための装置であって、
異なる偏光の放射成分への空間的分離のための第１偏光手段（Ｐｏｌ１）であって、この上位または下位に少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割のための第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）が配置されている第１偏光手段と、
スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態を変化させるための手段であって、この下位に照明光および／または試料光の光方向を変えるための反射手段が配置されている手段と、
から成る装置。
【請求項３】
照明光と試料光を分離するための構成であって、
異なる偏光の放射成分への空間的分離のための第１偏光手段（Ｐｏｌ１）であって、この上位または下位に少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割のための第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）が配置されている第１偏光手段と、
スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態を変化させるための手段であって、この下位に照明光および／または試料光の光方向を変えるための反射手段が配置されている手段と、
から成る構成。
【請求項４】
照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して変化させるための装置であって、
少なくとも１つの放射成分をスペクトル・空間的に分割するための少なくとも１つの第１光学要素と、
スペクトル分割された光を少なくとも２つの異なる空間角の１つに空間的に可変反射させるための手段と、
各反射方向のスペクトル分割された光を集めるための第２光学要素と、
から成る装置。
【請求項５】
前記第１および第２光学要素が同一である請求項４に記載の構成。
【請求項６】
空間的に可変反射させるための前記手段が、少なくとも２つの方向の１つに方向配置された固定ミラー要素を備えるミラー・マスクである請求項４に記載の構成。
【請求項７】
空間的に可変反射させるための前記手段がミラー・アレイであって、各ミラー要素は空間における少なくとも２つの位置において方向配置されることができる請求項４に記載の構成。
【請求項８】
反射手段の傾斜が実施される請求項１乃至７のいずれか１項に記載の構成。
【請求項９】
照明光および／または試料光が互いに垂直に交わる偏光された成分に分割される請求項１乃至８のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１０】
試料光が少なくとも部分的に、少なくとも１つの検出器によって検出される請求項１乃至９のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１１】
光源として少なくとも１つのレーザが備えられる請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１２】
光源として白色光源が備えられる請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１３】
複数の波長による照明が実施される請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１４】
試料光から来る蛍光光および／または照明光および／または燐光光および／または散乱光が検出される請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１５】
照明光の強度および／またはスペクトル構成が像撮影の間に変化し、したがってさまざまな試料個所がさまざまに照明される請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１６】
分散要素に付属する結像レンズが備えられ、前記結像レンズはスペクトル成分を焦点面に結像し、前記焦点面には、空間的に分割した放射成分の少なくとも一部分の偏光状態を変化させるための手段が配置されている請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１７】
前記偏光状態の変化が、方向制御可能な液晶セルを有するＳＬＭ（空間光変調器）を通じて実施される請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の検出光の偏光状態を平行または順次にスペクトル分解式把握を行うための測定法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の光源および／または光学要素によって生じる励起光の強度変動を調整するための方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の構成を有する広視野顕微鏡。
【請求項２１】
請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の構成を有する蛍光顕微鏡。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の構成を有する点走査するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２３】
請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の構成を有する線走査するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２４】
走査式、部分走査式、または非走査式検出が実施される請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項２５】
請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の構成を有する流出細胞測定器。
【請求項２６】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の構成を有し、照明光線経路および／または検出光線経路の中にブレッドボードを有する平行共焦点顕微鏡。
【請求項２７】
請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の構成を有し、対象物への周期的構造の結像、構造の位相変位、位相変位された画像の記録のための構成。
【請求項１】
照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して調節可能に変化させるための方法であって、
第１偏光手段（Ｐｏｌ１）によって、異なる偏光の放射成分への空間的分離が実施され、
第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）によって、少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割が行われ、
スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態が変えられ、
照明光および／または検出光の反射が実施される、
方法。
【請求項２】
照明光をそのスペクトル構成および／または強度に関して変化させるための装置であって、
異なる偏光の放射成分への空間的分離のための第１偏光手段（Ｐｏｌ１）であって、この上位または下位に少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割のための第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）が配置されている第１偏光手段と、
スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態を変化させるための手段であって、この下位に照明光および／または試料光の光方向を変えるための反射手段が配置されている手段と、
から成る装置。
【請求項３】
照明光と試料光を分離するための構成であって、
異なる偏光の放射成分への空間的分離のための第１偏光手段（Ｐｏｌ１）であって、この上位または下位に少なくとも１つの放射成分のスペクトル・空間的分割のための第１分散手段（Ｄｉｓｐ１）が配置されている第１偏光手段と、
スペクトル・空間的に分割された放射成分の少なくとも１つの部分の偏光状態を変化させるための手段であって、この下位に照明光および／または試料光の光方向を変えるための反射手段が配置されている手段と、
から成る構成。
【請求項４】
照明光および／または試料光をそのスペクトル構成および／または強度に関して変化させるための装置であって、
少なくとも１つの放射成分をスペクトル・空間的に分割するための少なくとも１つの第１光学要素と、
スペクトル分割された光を少なくとも２つの異なる空間角の１つに空間的に可変反射させるための手段と、
各反射方向のスペクトル分割された光を集めるための第２光学要素と、
から成る装置。
【請求項５】
前記第１および第２光学要素が同一である請求項４に記載の構成。
【請求項６】
空間的に可変反射させるための前記手段が、少なくとも２つの方向の１つに方向配置された固定ミラー要素を備えるミラー・マスクである請求項４に記載の構成。
【請求項７】
空間的に可変反射させるための前記手段がミラー・アレイであって、各ミラー要素は空間における少なくとも２つの位置において方向配置されることができる請求項４に記載の構成。
【請求項８】
反射手段の傾斜が実施される請求項１乃至７のいずれか１項に記載の構成。
【請求項９】
照明光および／または試料光が互いに垂直に交わる偏光された成分に分割される請求項１乃至８のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１０】
試料光が少なくとも部分的に、少なくとも１つの検出器によって検出される請求項１乃至９のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１１】
光源として少なくとも１つのレーザが備えられる請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１２】
光源として白色光源が備えられる請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１３】
複数の波長による照明が実施される請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１４】
試料光から来る蛍光光および／または照明光および／または燐光光および／または散乱光が検出される請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１５】
照明光の強度および／またはスペクトル構成が像撮影の間に変化し、したがってさまざまな試料個所がさまざまに照明される請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１６】
分散要素に付属する結像レンズが備えられ、前記結像レンズはスペクトル成分を焦点面に結像し、前記焦点面には、空間的に分割した放射成分の少なくとも一部分の偏光状態を変化させるための手段が配置されている請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１７】
前記偏光状態の変化が、方向制御可能な液晶セルを有するＳＬＭ（空間光変調器）を通じて実施される請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の構成。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の検出光の偏光状態を平行または順次にスペクトル分解式把握を行うための測定法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の光源および／または光学要素によって生じる励起光の強度変動を調整するための方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の構成を有する広視野顕微鏡。
【請求項２１】
請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の構成を有する蛍光顕微鏡。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の構成を有する点走査するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２３】
請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の構成を有する線走査するレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２４】
走査式、部分走査式、または非走査式検出が実施される請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項２５】
請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の構成を有する流出細胞測定器。
【請求項２６】
請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の構成を有し、照明光線経路および／または検出光線経路の中にブレッドボードを有する平行共焦点顕微鏡。
【請求項２７】
請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の構成を有し、対象物への周期的構造の結像、構造の位相変位、位相変位された画像の記録のための構成。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００６−３１３３５６（Ｐ２００６−３１３３５６Ａ）
【公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２８５８５（Ｐ２００６−１２８５８５）
【出願日】平成１８年５月２日（２００６．５．２）
【出願人】（５０６１５１６５９）カール ツァイス マイクロイメージング ゲーエムベーハー (71)
【氏名又は名称原語表記】Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２日（２００６．５．２）
【出願人】（５０６１５１６５９）カール ツァイス マイクロイメージング ゲーエムベーハー (71)
【氏名又は名称原語表記】Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨ
【Ｆターム（参考）】
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