光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法
本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を安価な原料から簡便に製造できる方法を提供する。つまり、本発明は、安価に入手可能な酢酸エステル誘導体と塩基及び蟻酸エステルとを反応させて、２−ホルミル酢酸エステル誘導体に変換した後、前記誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記誘導体のホルミル基を立体選択的に還元することにより、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体、とりわけ光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステル誘導体の製法に関する。
より詳細には、安価に入手可能な酢酸エステル誘導体、蟻酸エステル及び塩基を用いて２−ホルミル酢酸エステル誘導体を合成し、当該２−ホルミル酢酸エステル誘導体を、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体、とりわけ光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステル誘導体の製法に関する。
【背景技術】
従来、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法としては、以下の様な方法が知られている。
１）２−置換−１，３−プロパンジオールを微生物を用いて不斉酸化することにより、光学活性２−置換−３−ヒドロキシプロピオン酸を得る方法（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９７９，Ｖｏｌ．１１，１３７９−１３８０）。
２）０．１％濃度の２−ホルミル酢酸エステル誘導体をキャンディダ属、ロドトルラ属、トルロプシス属等に属する微生物を用いて還元することにより、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を得る方法（特開昭６０−１９９３８９号公報）。
しかしながら、１）の方法では、基質として用いるジオール化合物が高価であり、また、２位置換基がメチル基以外の場合では立体選択性も低い。また、２）の方法では、使用基質が微生物、酵素の還元活性に悪影響を与えることから、仕込濃度が極めて低い等、いずれも工業的製法としては大きな課題を有している。
一方、２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法としては、以下の様な方法が知られている。
３）２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−プロピオン酸エチルをＮａＨ及び蟻酸エチルを用いてホルミル化した後、蒸留精製することにより、α−（ホルミル）−２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−プロピオン酸エチルを得る方法（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ Ｓｕｌｆｕｒ，１９８６，Ｖｏｌ．２８，３３０−３４５）。
４）フェニルプロピオン酸エチルを金属ナトリウム及び蟻酸エチルを用いてホルミル化することにより、粗２−ホルミルフェニルプロピオン酸エチルを得る方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，，１９８８，Ｖｏｌ．２３，５３−６２）。
しかしながら、いずれの方法においても反応生成物は未反応原料あるいはＮａＨ由来の鉱油等の不純物を多く含有しており、高純度の生成物を得るには、蒸留、晶析またはカラム等の精製工程を必要とする等、工業的製法としては改善すべき課題を有している。
発明の要約
上記現状に鑑み、本発明の目的は、医薬品の中間体として有用な光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体、中でも光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステル誘導体を安価で入手容易な原料から簡便に製造する方法を提供することにある。
本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、安価に入手可能な酢酸エステル誘導体から、簡便な方法にて高純度の２−ホルミル酢酸エステル誘導体を合成し、該２−ホルミル酢酸エステル誘導体を、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することにより、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を簡便に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、一般式（１）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される酢酸エステル誘導体を、塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、一般式（２）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に変換する工程、及び、有機溶媒と水を用いて、不純物を有機層に除去しつつ、前記式（２）で表される誘導体を水層に転溶する工程からなることを特徴とする、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法を提供する。
また、本発明は、一般式（２）；
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＸは前記と同じ基を表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することを特徴とする、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法を提供する。
また、本発明は、一般式（４）；
（式中、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表し、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エステル誘導体を提供する。
また、本発明は、一般式（５）；
（式中、Ｒ４は炭素数２〜６のアルキル基を表す。Ｒ５は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を提供する。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、本発明に関わる化合物について説明する。前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ１は、炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基である。
例えば、炭素数２〜１０のアルキル基としては、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基及び置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基の置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子；メチル基、エチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基；メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜１０のアルコキシ基；ニトロ基、シアノ基、メチレンジオキシ基等が挙げられる。なお、上記アラルキル基及びアリール基の炭素数は、当該置換基の炭素数は含まず、アラルキル基及びアリール基のみの炭素数を意味する。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｍ−メトキシベンジル基、３，４−メチレンジオキシベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、ピリジルメチル基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基としては、フェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ナフチル基、ピリジル基、インドリル基等が挙げられる。
上記のなかでもＲ１として好ましくは、炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である。炭素数２〜１０のアルキル基として好ましくは、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基であり、より好ましくはｎ−ブチル基である。置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基として好ましくは、ベンジル基、３，４−メチレンジオキシベンジル基であり、より好ましくは３，４−メチレンジオキシベンジル基である。
また、前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ２は、炭素数１〜１０のアルキル基、または置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である。Ｒ２としての置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基の置換基としては、Ｒ１のアラルキル基の置換基として例示したものと同じもの等が挙げられる。上記Ｒ２のアラルキル基の炭素数には、置換基の炭素数を含まないものである。
例えば、炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。好ましくは、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｍ−メトキシベンジル基、３，４−メチレンジオキシベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、ピリジルメチル基等が挙げられる。好ましくは、ベンジル基である。
上記のなかでもＲ２として好ましくは、炭素数１〜１０のアルキル基であり、より好ましくは、メチル基、エチル基である。
また、前記式（４）において、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基である。炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
また、前記式（３）及び（４）において、＊は不斉炭素原子を表す。
また、前記式（５）において、Ｒ４は炭素数２〜６のアルキル基である。炭素数２〜６のアルキル基としては、例えば、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。好ましくはｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基であり、更に好ましくはｎ−ブチル基である。
また、前記式（５）において、Ｒ５は炭素数１〜１０のアルキル基である。炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。好ましくは、エチル基である。
また、前記式（２）及び（５）において、ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫである。好ましくは、Ｎａである。
なお、前記式（４）で表される光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エステル誘導体及び前記式（５）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体は、文献に未記載の新規化合物である。
次に、本発明における前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法について説明する。
まず、上記のＲ１及びＲ２を有する誘導体（１）は、工業的に入手可能、あるいは工業的に入手可能な原料から容易に合成することができる。例えば、３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルは、３，４−メチレンジオキシ桂皮酸を水素化した後、エチルエステル化することにより容易に調製することができる。
前記式（１）で表される酢酸エステル誘導体を、適当な溶媒中にて塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を製造することができる。
上記塩基としては、ナトリウムハイドライド（ＮａＨ）；リチウムハイドライド（ＬｉＨ）；金属ナトリウム（Ｎａ）；ナトリウムメトキサイド（ＭｅＯＮａ）、ナトリウムエトキサイド（ＥｔＯＮａ）、ナトリウムイソプロポキサイド（ｉＰｒＯＮａ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキサイド（ｔＢｕＯＫ）等のアルカリ金属アルコキサイド等が挙げられる。好ましくは、ナトリウムハイドライド、金属ナトリウム、アルカリ金属アルコキサイドが挙げられ、より好ましくは、ナトリウムハイドライド（ＮａＨ）が挙げられる。
塩基の使用量は、酢酸エステル誘導体（１）と塩基のモル比（酢酸エステル誘導体（１）：塩基）として、好ましくは１：１〜１：１５、より好ましくは１：１〜１：５、更に好ましくは１：１〜１：３である。
上記蟻酸エステルとしては、例えば、蟻酸メチル、蟻酸エチル、蟻酸ｎ−プロピル、蟻酸ｉｓｏ−プロピル、蟻酸ｎ−ブチル、蟻酸ｉｓｏ−ブチル、蟻酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。好ましくは、蟻酸メチル、蟻酸エチルである。なお、本反応においては、塩基性条件下、蟻酸エステル由来のアルコールが副生する為、前記酢酸エステル誘導体（１）は副生したアルコールによりエステル交換され易い。そこで、前記酢酸エステル誘導体（１）と蟻酸エステルのエステル基は同一基であることが望ましい。
蟻酸エステルの使用量は、酢酸エステル誘導体（１）と蟻酸エステルのモル比（酢酸エステル誘導体（１）：蟻酸エステル）として好ましくは１：１〜１：３０、より好ましくは１：１〜１：１０、更に好ましくは１：１〜１：５である。
本反応に使用できる溶媒としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素系溶媒；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ジメチルホルムアミド、アセトアミド、ホルムアミド、アセトニトリル、プロピオニトリル等の含窒素系溶媒；ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられる。上記溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本反応の反応温度としては、好ましくは−２０〜６０℃、より好ましくは０〜５０℃である。
本反応の反応時間としては、好ましくは１時間〜７２時間、より好ましくは１時間〜２０時間である。
上記反応を行うに際し、各試剤の混合方法は特に限定されないが、工業的規模で反応を安全に制御して行う上では、塩基と溶媒の混合物に、酢酸エステル誘導体および蟻酸エステルを同時に添加する方法が好ましい。この方法では、加えた酢酸エステル誘導体が逐次反応するため、添加速度を調節することによって反応を安全に制御することができる。ここで、工業的規模とは、反応で用いる塩基使用量として、通常１ｋｇ以上であり、好ましくは１０ｋｇ以上、より好ましくは１００ｋｇ以上、さらに好ましくは１０００ｋｇ以上、特に好ましくは１００００ｋｇ以上の塩基を反応に供することを意味する。
酢酸エステル誘導体および蟻酸エステルの添加時間は、反応の規模にもよるが、１時間以上とすることが好ましく、より好ましくは３時間以上、さらに好ましくは５時間以上である。また、添加時間は、７２時間以下とすることが好ましい。
また、この方法にて反応をより安全に行う上では、塩基濃度を高めることが好ましく、その際の塩基と溶媒の混合物における塩基濃度としては一概には云えないが、通常１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは３０重量％以上であり、とりわけ４０重量％以上として反応を行うことも好適である。
更に、上記反応方法に於いては、反応温度を高めて、添加した基質をより短時間で反応させて、反応を安全に制御することが好ましい。この場合の反応温度としては一概には云えないが、通常、２０℃以上であり、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４０℃以上であり、また反応液の沸点まで反応温度を高めてもよい。
上記方法にて反応を行う場合、塩基濃度が１０重量％以上、および反応温度が２０℃以上の条件で行うことが特に好ましい。
尚、反応の進行と共に反応液の流動性が低下する場合には、適正な攪拌状態を維持して反応を円滑に行う上で、反応の進行に応じて溶媒を添加すれば良く、簡便には酢酸エステル誘導体と蟻酸エステルの混合物を溶媒に溶解した溶液として加えれば良い。
反応終了後、反応液中に含まれる前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体は、その製造過程における各種分解や副反応、また原料等が残存することにより多量の不純物、例えば、未反応の酢酸エステル誘導体、蟻酸エステル、鉱油等の塩基由来の不純物等を多数含む。高純度の目的物を得るためには、これらの不純物を除去する必要がある。
本発明者らは鋭意検討の結果、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）及び不純物を含有する反応液を水と接触させることで、２−ホルミル酢酸エステル誘導体のアルカリ金属塩を水層に、不純物を有機層に選択的に分配できることを見いだし、得られた水層を酸を用いて酸性化した後、水層に含まれる２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）を有機溶媒で抽出、濃縮することにより、これら不純物を有機層に簡便に除去し、高純度の目的物を効率よく取得できる方法を開発するに至った。
以下に、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の単離精製操作について説明する。前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に含まれる不純物を除去する為には、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）及び不純物を含有する反応液に水を添加して、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）のアルカリ金属塩を水層に選択的に転溶する。この場合、目的物である２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）をほとんどロスすることなく、未反応の酢酸エステル誘導体等の不純物を反応溶媒等の有機層に除去することができる。
水の添加に先立ち、予め反応液を濃縮減量しても良く、また、反応液に一般的な抽出溶媒、例えば、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、メチルエチルケトン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、塩化メチレン等を添加しておいても良い。また、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）のアルカリ金属塩を水層に転溶した後、水層を上記一般的な抽出溶媒を用いて再洗浄することにより、不純物をさらに低減することも可能である。
次いで、上記の高純度の２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）を含有する水層を、一般的な酸、例えば、塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、クエン酸等の有機酸等を用いて、好ましくはｐＨ５以下、より好ましくはｐＨ３以下に調整した後、上記一般的な抽出溶媒を用いて２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）を抽出した後、これを濃縮することにより化学純度の高い目的物を効率よく取得することができる。
上記純度は、好ましくは９０重量％以上であり、より好ましくは９４重量％以上である。
一方、反応液に水を添加する上記転溶操作なしに、反応液に酸を加えて抽出する場合、目的物である２−ホルミル酢酸エステル誘導体及び未反応の酢酸エステル誘導体等の不純物は、ともに反応溶媒等の有機層に抽出される為、高純度の目的物を得ることができない。
次に、本発明における前記式（３）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法について説明する。
前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する活性を有する酵素源の存在下、前記式（２）のホルミル基を立体選択的に還元することにより、前記式（３）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造することができる。
ここで、「酵素源」とは、上記還元活性を有する酵素自体はもちろんのこと、上記還元活性を有する微生物の培養物およびその処理物も含まれる。「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味する。「その処理物」としては、例えば、粗抽出液、凍結乾燥微生物体、アセトン乾燥微生物体、それら菌体の磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。
本発明の酵素還元工程において、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する活性を有する酵素源としては、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、及びミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。
上記酵素源のうち、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｌｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が好ましい。
上記酵素源のうち、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、ブレタノマイセス・アノマラス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓａｎｏｍａｌｕｓ）、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・グラエボーサ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｅｂｏｓａ）、キャンディダ・グロペンギッセリイ（Ｃａｎｄｉｄａｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、キャンディダ・ラクチス−コンデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、キャンディダ・モギイ（Ｃａｎｄｉｄａｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・ピニ（Ｃａｎｄｉｄａｐｉｎｉ）、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・ソルボフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・バーサチリス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、デバリオマイセス・ネパレンシス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、デバリオマイセス・ロベルトシエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｒｏｂｅｒｔｓｉａｅ）、ガラクトマイセス・レースシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓｒｅｅｓｓｉｉ）、オガタエア・ミヌータ バー．ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ピキア・シルビコラ（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、ロドトルラ・アウランチアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ラクトーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｌａｃｔｏｓａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボラス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ステリグマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヤマダジーマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アクロモバクター・キシロキダンス サブスピーシーズ デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｆｉｍｉ）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、クレブシエラ・プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ）、ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等の微生物由来の酵素源が好ましい。
また、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、及びミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が好ましい。
また、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）、シストフィロバシディウム・ビスポリヂイ（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍｂｉｓｐｏｒｉｄｉｉ）、ピキア・ビスポーラ（Ｐｉｃｈｉａｂｉｓｐｏｌａ）、ロドトルラ・グルチニス バー．グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トルラスポラ・グロボーサ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｇｌｏｂｏｓａ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、ヤロビア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロバクテリウム・エステラロマチカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）等の微生物由来の酵素源が好ましい。
また、上記微生物由来の還元酵素の産生能を有する微生物としては、野生株または変異株のいずれでもよい。あるいは細胞融合、遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いることができる。本酵素を生産する遺伝子操作された微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードするＤＮＡ配列を得る工程、このＤＮＡを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を得る工程を含有する方法により得ることができる（ＷＯ９８／３５０２５号パンフレット）。
酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、下記栄養源を含有する通常の液体培地を使用することができる。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質；エタノール、グリセロール等のアルコール類；オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類；菜種油、大豆油等の油類等が挙げられる。
窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、燐酸１水素アンモニウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなどが挙げられる。
無機塩類として、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸マンガン等の硫酸塩；塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなどが挙げられる。
他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を使用することができる。
培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨが３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行うことができる。
本発明の還元反応は、適当な溶媒中に基質の２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び上記微生物の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下攪拌することにより行うことができる。
還元反応に用いる溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ヘキサン等を添加してもよい。
反応条件は、用いる酵素、微生物またはその処理物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約０．１〜１００重量％、好ましくは１〜６０重量％である。
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、基質に対して、通常、０．０００１〜１００モル％、好ましくは０．０００１〜０．１モル％である。
反応温度は、通常、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃である。
反応のｐＨは、通常、４〜９、好ましくは５〜８である。
反応時間は、通常、１〜１２０時間、好ましくは１〜７２時間である。
上記反応は、基質を一括、または連続的に添加して行うことができる。また、反応はバッチ方式または連続方式で行うことができる。
本発明の還元工程において、一般に用いられる補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系を組み合わせて用いることにより、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることができる。代表的なＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系としては、例えば、グルコース脱水素酵素及びグルコースを用いる方法が挙げられる。
還元酵素遺伝子及びこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の還元反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調整する必要がないため、より低コストで光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造することができる。
上記のような形質転換微生物としては、上記還元酵素をコードするＤＮＡ及び該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードするＤＮＡを有するプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。ここで、酵素を再生する能力を有する酵素としては、グルコース脱水素酵素が好ましく、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素がより好ましい。また、宿主微生物としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）が好ましい。
より好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８、受託日：平成１１年９月２８日）、
デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８、受託日：平成１５年８月２５日）、
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ０４１５由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５８、受託日：平成１４年１月２２日）、
セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１２４６８由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＳＧＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８４４９、受託日：平成１３年８月６日）、
ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９、受託日：平成１２年４月１１日）、
ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＫＮＫ０１由来の還元酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５、受託日：平成１５年１１月１０日）等が挙げられる。
これらの形質転換微生物は、それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、これらの形質転換微生物のうち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）、及び、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）は、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。
なお、本発明の還元工程を、補酵素再生系と組み合わせて実施する、または、酵素源として上記形質転換微生物の培養物もしくはその処理物を用いる場合は、補酵素として、より安価な酸化型のＮＡＤ（Ｐ）を添加して反応を行うことも可能である。
還元反応で生じた光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体（３）は、常法により精製することが出来る。例えば、光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルは、酵素源として微生物等を用いた場合には、必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下に除去し、そして減圧蒸留またはクロマトグラフィー等の処理を行う事により、精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（参考例１） ３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルエステルの調製
３，４−メチレンジオキシケイ皮酸５０ｇをエタノール５００ｍｌに溶解させ、これに５％Ｐｄ／Ｃ触媒５ｇを加えた。反応系を水素ガス置換し、２５℃で６時間攪拌した。反応終了後、Ｐｄ／Ｃ触媒をろ過操作にて除去した。得られたエタノール溶液を５℃に冷却し、塩化チオニル３７．１ｇを一時間かけて滴下した。滴下終了後、内温５℃でさらに３時間攪拌した。反応終了後、減圧下にて溶媒を留去し、橙色濃縮物５４．７ｇを得た。これを一部抜き取り、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ １００ ＰＲ−８（Ｅ）２５０ｍｍ×４．０ｍｍＩ．Ｄ．、メルク社製、移動相：リン酸・リン酸二水素カリウム水溶液／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍＬ／分、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）にて分析を行ったところ、表題化合物４９．８ｇを含有していることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７７−６．６３（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），４，１７−４．１０（２Ｈ，ｑ），２．８６（２Ｈ，ｔ），２．５６（２Ｈ，ｔ），１．２７（３Ｈ，ｔ）。
（参考例２） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ４．４ｇをＴＨＦ２００ｍｌに懸濁した溶液に、３−フェニルプロピオン酸エチル１７．８ｇ及び蟻酸エチル８．２ｇを氷冷下、１時間かけて適下した後、室温にて１５時間攪拌した。さらに、６０％ＮａＨ１４ｇ及び蟻酸エチル２５．９ｇを３回に分割して添加した後、室温にて１５時間攪拌した。得られた反応液に、１０％クエン酸溶液を添加した後、酢酸エチルにて抽出し、減圧濃縮することにより茶色油状の濃縮物３２．４ｇを得た。得られた濃縮物をシリカゲルカラムにて精製することにより、表題化合物１７．９ｇを透明油状物として得た。
（参考例３） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸メチルの製造法
３−フェニルプロピオン酸エチル及び蟻酸エチルの代わりに３−フェニルプロピオン酸メチル及び蟻酸メチルを用いて、参考例２と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。
（参考例４） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸イソプロピルの製造法
３−フェニルプロピオン酸エチル及び蟻酸エチルの代わりに３−フェニルプロピオン酸イソプロピル及び蟻酸イソプロピルを用いて、参考例２と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。
（参考例５） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸イソブチルの製造法
３−フェニルプロピオン酸エチル及び蟻酸エチルの代わりに３−フェニルプロピオン酸イソブチル及び蟻酸イソブチルを用いて、参考例２と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。
（実施例１） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ４２．４ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５００ｍｌに懸濁した。３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル８４．５ｇ（純度９３．７重量％）をＴＨＦ１００ｍｌに溶かし、先の懸濁液に室温で滴下した。４０℃に昇温して１５分攪拌した後、蟻酸エチル１３１ｇを２．５時間かけて滴下した後、さらに３時間攪拌した。
溶媒を留去し、反応溶液を約半量まで濃縮した後、氷浴で冷却し、水５００ｍｌを内温が１０℃以下を保つ速度で滴下した。水層をヘキサン２００ｍｌで二回洗浄した後に、濃塩酸でｐＨ４．５に調節した。これをトルエン５００ｍｌで３回抽出し、減圧濃縮により表題化合物８２．８ｇを得た。下記の条件にてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法にて化学純度を分析したところ、化学純度９４．７重量％であった。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＴＣ−ＦＦＡＰ １ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．（ＧＬサイエンス社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝８ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１５０℃、検出時間：２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル ４．０分。
（実施例２） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ７．９１ｇをＴＨＦ１２ｍｌに懸濁し、４０℃に昇温した。３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル１１．０ｇと蟻酸エチル１１．０ｇをＴＨＦ７７．０ｍｌに溶解し、先の懸濁液に５〜１４時間掛けて滴下した。１時間攪拌後、蟻酸エチル３．７ｇを５時間で添加し、更に１２時間攪拌した。
得られた反応混合物にトルエン２５０ｍｌを加えて減圧濃縮し、約１０重量％のトルエン懸濁液とした後、これを１０℃以下に冷却した水５５ｍｌに内温が維持できる速度で滴下した。有機層を廃棄後、水層をトルエン１８０ｍｌで一回洗浄し、この水層を濃塩酸でｐＨ５〜７に調節した後に、トルエン９０ｍｌで２回抽出し、１回水洗後、有機層を減圧濃縮して、表題化合物１１．２ｇを得た。実施例１の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９８．８重量％であった。
（実施例３） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチルの製造法
６０％ＮａＨ１．３８ｇをＴＨＦ１２ｍｌに懸濁した。３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチル２．４ｇをＴＨＦ１２ｍｌに溶かし、先の懸濁液に室温で滴下した。４０℃に昇温して１５分攪拌した後、蟻酸メチル３．４６ｇを１時間かけて滴下した。さらに、６０％ＮａＨ０．７ｇ及び蟻酸メチル０．９ｇを４回に分割して添加した後、４０℃にて３時間攪拌した。
溶媒を留去し、反応溶液を約半量まで濃縮した後、氷浴で冷却し、水４０ｍｌを内温が１０℃以下を保つ速度で滴下した。水層をトルエン５０ｍｌで二回洗浄した後に、濃塩酸でｐＨ４．５に調節した。これをトルエン５０ｍｌで２回抽出し、減圧濃縮により表題化合物２．６３ｇを得た。実施例１の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．４重量％であった。
（実施例４） ２−ホルミルヘキサン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ６０ｇをＴＨＦ６００ｍｌに懸濁し、ヘキサン酸エチル７２．１ｇを先の懸濁液に室温で滴下した。４０℃に昇温して１５分攪拌した後、蟻酸エチル１８５．２ｇを６時間かけて滴下した。さらに、６０％ＮａＨ３０ｇ及び蟻酸エチル９２．６ｇを４回に分割して添加した後、４０℃にて３時間攪拌した。
溶媒を留去し、反応溶液を約半量まで濃縮した後、氷浴で冷却し、水４０ｍｌを内温が１０℃以下を保つ速度で滴下した。水層をトルエン４００ｍｌで二回洗浄した後に、濃塩酸でｐＨ４．５に調節した。これをトルエン７００ｍｌで２回抽出し、減圧濃縮により表題化合物７６．８ｇを得た。下記の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．６重量％であった。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＨＰ−５ ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝１２５ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１２０℃、検出時間：２−ホルミルヘキサン酸エチル ６．９分、２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル ９．８分。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４２（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．０（０．６Ｈ，ｄ），４．１６−４．２７（２Ｈ，ｍ），３．２５（０．４Ｈ，ｍ），１．２４−２．３７（９Ｈ，ｍ），０．９０（３Ｈ，ｔ）。
（実施例５） ２−ホルミルヘキサン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ６２ｇをＴＨＦ１２６ｍｌに懸濁し、４０℃に昇温した。ヘキサン酸エチル５６ｇと蟻酸エチル８６ｇをＴＨＦ２５０ｍｌに溶解し、先の懸濁液に５〜２０時間掛けて滴下した。３時間攪拌後、蟻酸エチル８６ｇを５時間で添加し、更に１２時間攪拌した。
得られた反応混合物にトルエン１２００ｍｌを加えて減圧濃縮し、約１０重量％のトルエン懸濁液とした後、これを１０℃以下に冷却した水２８０ｍｌに内温が維持できる速度で滴下した。有機層を廃棄後、水層をトルエン５７０ｍｌで一回洗浄し、この水層を濃塩酸でｐＨ５〜７に調節した後に、酢酸エチル２８０ｍｌで２回抽出し、１回水洗後、有機層を減圧濃縮して、表題化合物５５ｇを得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９７．２重量％であった。
（実施例６） ２−ホルミル酪酸エチルの製造法
ヘキサン酸エチルの代わりに酪酸エチルを用いて、実施例４と同様の方法に従い、表題化合物を茶色油状物として得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．４重量％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４２（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．０（０．６Ｈ，ｄ），４．１５−４．２８（２Ｈ，ｍ），３．１７−３．２１（０．４Ｈ，ｍ），１．２３−２．２９（５Ｈ，ｍ），０．９６−１．０５（３Ｈ，ｍ）。
（実施例７） ２−ホルミルヘプタン酸エチルの製造法
ヘキサン酸エチルの代わりにヘプタン酸エチルを用いて、実施例４と同様の方法に従い、表題化合物を茶色油状物として得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．７重量％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４３（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．１（０．６Ｈ，ｄ），４．１６−４．２７（２Ｈ，ｍ），３．２３−３．２７（０．４Ｈ，ｍ），１．２１−２．０６（１１Ｈ，ｍ），０．８５−０．９１（３Ｈ，ｍ）。
（実施例８） ２−ホルミルオクタン酸エチルの製造法
ヘキサン酸エチルの代わりにオクタン酸エチルを用いて、実施例４と同様の方法に従い、表題化合物を茶色油状物として得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９５．４重量％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４３（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．０（０．６Ｈ，ｄ），４．１６−４．２７（２Ｈ，ｍ），３．２３−３．２７（０．４Ｈ，ｍ），１．２５−１．８８（１３Ｈ，ｍ），０．８８（３Ｈ，ｔ）。
（比較例１） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ２．０ｇをＴＨＦ３０ｍｌに懸濁した。懸濁液を０℃に冷却し、３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル６．０ｇ（純度９２．１重量％）をＴＨＦ２０ｍｌに溶かし、先の懸濁液に滴下した。０℃で蟻酸エチル４ｍＬを滴下した後、室温に戻しさらに２０分攪拌した。反応溶液を４０℃に加熱し、さらに攪拌を続けた。加熱後、約３０分でガス発生が認められた。ガス発生が終わった時点でＨＰＬＣ（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ １００ ＰＲ−８（Ｅ）２５０ｍｍ×４．０ｍｍＩ．Ｄ．、メルク社製、移動相：リン酸・リン酸二水素カリウム水溶液／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍＬ／分、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）にて反応溶液を分析したところ、原料の残存が認められたため、さらにＮａＨ１ｇ、蟻酸エチル４ｍＬを加え、４０℃で攪拌した。再びガス発生が始まり、１５分程度で終了した。反応液を再度分析したところ、まだ原料の残存が認められたため、再度ＮａＨ１ｇと蟻酸エチル４ｍＬを加えた。ガス発生終了後、再度分析を行ったところ、わずかに原料の残存があり、さらにＮａＨ１ｇおよび蟻酸エチル８ｍＬを添加、原料の消失を確認したので、反応を停止した。塩酸でｐＨ＝７〜８に調整後、酢酸エチルを加え抽出を行った。分液ロートにて、ＮａＨに含まれるミネラルオイルを分液操作で除去し、得られた酢酸エチル層を濃縮することにより、オレンジ色のオイルとして表題化合物４．７５ｇを得た。実施例１の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度８０．２０重量％であった。
（実施例９） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
グルコース４％、イーストエキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４ １．３％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．７％、ＮａＣｌ ０．０１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００５％、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ ０．００１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を調製し、大型試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌した。これらの液体培地に表１に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、水洗後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液０．５ｍｌと、２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチル２ｍｇ、グルコース２０ｍｇを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液０．５ｍｌとを混合し、栓付試験管に入れ３０℃で２４時間振盪した。反応後、反応液を等量体積の酢酸エチルにより抽出し、抽出液中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することにより、変換率（％）を求めた。また、光学純度については、生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて精製した後、ＨＰＬＣ法により分析した。その結果を表１に示す（変換率は２０〜１００％）。
分析条件、及び、変換率、光学純度の計算方法は以下の通りである。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＴＣ−ＦＦＡＰ ５ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．（ＧＬサイエンス社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝３０ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１５０℃、検出時間：２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチル ４．０分、２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸エチル １２．０分。
ＨＰＬＣ分析条件＝カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＡＳ ２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９８／２、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃、検出時間：Ｒ体１６．１分、Ｓ体１８．３分。
変換率（％）＝生成物量／（基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表わし、Ａ＞Ｂである）。
（実施例１０）光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
表２に示す微生物について、グリセリン１．５％、イーストエキス０．５％、ＫＨ２ＰＯ４ １．３％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．７％、ＮａＣｌ ０．０１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００５％、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ ０．００１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いて培養する以外は、実施例９と同様の方法に従い、変換率及び光学純度を測定した。その結果を表２に示す（変換率は２０〜１００％）。
（実施例１１） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
グルコース４％、イーストエキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４ １．３％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．７％、ＮａＣｌ ０．０１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００５％、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ ０．００１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を調製し、大型試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌した。これらの液体培地に表３に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、水洗し、氷冷アセトンを添加した後、減圧乾燥することにより、アセトン乾燥菌体を調製した。得られたアセトン乾燥菌体５ｍｇ、２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチル２ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ＝６．５）及び酢酸エチル０．５ｍｌを栓付試験管に添加し、３０℃で２４時間振盪した。次に、実施例９と同様の操作を行い、変換率及び光学純度を測定した。その結果を表３に示す。
（実施例１２） 光学活性２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの製造法
実施例１１で得られたアセトン乾燥菌体５ｍｇ、表４に示す各種２−ホルミルアルカン酸エチル２ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、ＮＡＤＰ１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ＝６．５）及び酢酸エチル０．５ｍｌを栓付試験管に添加し、３０℃で２４時間振盪した。反応後、反応液を等量体積の酢酸エチルにより抽出し、抽出液中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することにより、変換率（％）を求めた。また、光学純度については、生成物をＨＰＬＣラベル化剤（３，５−ジニトロ塩化ベンゾイル）を用いて誘導化し、ＴＬＣにて精製した後、ＨＰＬＣ法により分析した。その結果を表４に示す。分析条件は以下の通りである。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＨＰ−５ ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝１２５ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１２０℃、検出時間：２−ホルミルヘキサン酸エチル ６．９分、２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル ９．８分。
ＨＰＬＣ分析条件＝カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−Ｈ ０．４６×２５ｃｍＩ．Ｄ．（ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９５／５、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃、検出時間：（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル誘導体３０．６分、（Ｓ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル誘導体３７．４分。
（実施例１３） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌに表５に示す各種２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エステル１０ｍｇ、ＮＡＤＰ１ｍｇ、グルコース１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応終了後、実施例９と同様の分析法で、変換率及び光学純度を分析した。その結果を表５に示す（いずれも変換率は１００％であった）。
（実施例１４） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
表６に示す各種組み換え大腸菌を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌに２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル１０ｍｇ、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）１ｍｇ、グルコース１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応終了後、実施例９と同様の分析法で、変換率と生成物の光学純度を分析した。その結果を表６に示す（いずれも変換率は１００％であった）。
（実施例１５） 光学活性２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの製造法
表７に示す各種組み換え大腸菌を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌに、表７に示す各種２−ホルミルアルカン酸エチル１０ｍｇ、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）１ｍｇ、グルコース１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応終了後、実施例１２と同様の分析法で、変換率と生成物の光学純度を分析した。その結果を表７に示す（いずれも変換率は１００％であった）。
（実施例１６） （Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液５５０ｍｌに実施例１で得られた２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）プロピオン酸エチル８７ｇ、ＮＡＤＰ２７．５ｍｇ、グルコース８９ｇを添加し、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液からトルエンを用いて抽出、濃縮することにより、茶色油状物８４．１ｇを得た。実施例９と同様の分析法で、生成物の化学純度と光学純度を分析したところ、化学純度９６．５％、光学純度９６．４％ｅｅ、（Ｒ）体であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７３−６．５６（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），４．１２−４．２３（２Ｈ，ｑ），３．７６−３．６４（２Ｈ，ｍ），２．９５−２．６９（３Ｈ，ｍ），１．２７（３Ｈ，ｔ）。
（実施例１７） （Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液５０ｍｌに実施例１で得られた２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチル１．８９ｇ、ＮＡＤＰ２．５ｍｇ、グルコース１．９ｇを添加し、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液からトルエンを用いて抽出、濃縮することにより、茶色油状物１．８２ｇを得た。実施例９と同様の分析法で、生成物の化学純度及び光学純度を分析したところ、化学純度９６．８％、光学純度９８．０％ｅｅ、（Ｒ）体であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７３−６．６２（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），３．７７−３．６７（２Ｈ，ｍ），３．７０（３Ｈ，ｓ），２．９６−２．９０（１Ｈ，ｍ），２．８２−２．７５（２Ｈ，ｍ）。
（実施例１８） （Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−プロピオン酸エチルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液５０ｍｌに実施例１で得られた２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル０．５ｇ、ＮＡＤＰ２．５ｍｇ、グルコース０．５ｇを添加し、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液からトルエンを用いて抽出、濃縮することにより、茶色油状物０．４９ｇを得た。実施例９と同様の分析法で、生成物の化学純度と光学純度を分析したところ、化学純度９６．８％、光学純度４３％ｅｅ、（Ｓ）体であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７３−６．５６（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），４．１２−４．２３（２Ｈ，ｑ），３．７６−３．６４（２Ｈ，ｍ），２．９５−２．６９（３Ｈ，ｍ），１．２７（３Ｈ，ｔ）。
（実施例１９） （Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、硫酸亜鉛７水和物 ５０ｍｇ、ｐＨ＝７．０）に接種し、３０℃で４０時間振とう培養した。得られた培養液２５ｍｌにグルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１，０００ｕｎｉｔｓ、２−ホルミルヘキサン酸エチル２．５ｇ、ＮＡＤ３ｍｇ、グルコース４ｇ、硫酸亜鉛７水和物５０ｍｇを添加し、２．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸エチル１００ｍｌを加えて抽出し、有機層を減圧下で留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、油状の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチルを得た。収率は９０％、光学純度は９３．６％ｅ．ｅ．であった。なお、光学純度の分析は、ＨＰＬＣラベル化剤（３，５−ジニトロ塩化ベンゾイル）を用いて誘導化した後、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−Ｈカラム ０．４６×２５ｃｍＩ．Ｄ．（ダイセル化学工業社製）を用いたＨＰＬＣ法によって行った。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．１３−４．２４（２Ｈ，ｑ），３．７２−３．７９（２Ｈ，ｍ），２．５３−２．５９（１Ｈ，ｍ），１．５−１．７（２Ｈ，ｍ），１．２４−１．３７（７Ｈ，ｍ），０．９（３Ｈ，ｔ）。
（実施例２０） （Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘプタン酸エチルの合成
２−ホルミルヘキサン酸エチルの代わりに２−ホルミルヘプタン酸エチルを用いて、実施例１９と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。収率は９０％、光学純度は８７％ｅｅであった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．１３−４．２４（２Ｈ，ｑ），３．６９−３．７９（２Ｈ，ｍ），２．５３−２．５９（１Ｈ，ｍ），１．４４−１．６９（２Ｈ，ｍ），１．２２−１．３６（９Ｈ，ｍ），０．９（３Ｈ，ｔ）。
【産業上の利用可能性】
本発明の方法により、医薬品中間体として有用な光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を安価な原料から簡便に製造することができる。
【技術分野】
本発明は、医薬品中間体として有用な光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体、とりわけ光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステル誘導体の製法に関する。
より詳細には、安価に入手可能な酢酸エステル誘導体、蟻酸エステル及び塩基を用いて２−ホルミル酢酸エステル誘導体を合成し、当該２−ホルミル酢酸エステル誘導体を、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することを特徴とする、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体、とりわけ光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステル誘導体の製法に関する。
【背景技術】
従来、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法としては、以下の様な方法が知られている。
１）２−置換−１，３−プロパンジオールを微生物を用いて不斉酸化することにより、光学活性２−置換−３−ヒドロキシプロピオン酸を得る方法（Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９７９，Ｖｏｌ．１１，１３７９−１３８０）。
２）０．１％濃度の２−ホルミル酢酸エステル誘導体をキャンディダ属、ロドトルラ属、トルロプシス属等に属する微生物を用いて還元することにより、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を得る方法（特開昭６０−１９９３８９号公報）。
しかしながら、１）の方法では、基質として用いるジオール化合物が高価であり、また、２位置換基がメチル基以外の場合では立体選択性も低い。また、２）の方法では、使用基質が微生物、酵素の還元活性に悪影響を与えることから、仕込濃度が極めて低い等、いずれも工業的製法としては大きな課題を有している。
一方、２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法としては、以下の様な方法が知られている。
３）２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−プロピオン酸エチルをＮａＨ及び蟻酸エチルを用いてホルミル化した後、蒸留精製することにより、α−（ホルミル）−２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−プロピオン酸エチルを得る方法（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ Ｓｕｌｆｕｒ，１９８６，Ｖｏｌ．２８，３３０−３４５）。
４）フェニルプロピオン酸エチルを金属ナトリウム及び蟻酸エチルを用いてホルミル化することにより、粗２−ホルミルフェニルプロピオン酸エチルを得る方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，，１９８８，Ｖｏｌ．２３，５３−６２）。
しかしながら、いずれの方法においても反応生成物は未反応原料あるいはＮａＨ由来の鉱油等の不純物を多く含有しており、高純度の生成物を得るには、蒸留、晶析またはカラム等の精製工程を必要とする等、工業的製法としては改善すべき課題を有している。
発明の要約
上記現状に鑑み、本発明の目的は、医薬品の中間体として有用な光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体、中でも光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステル誘導体を安価で入手容易な原料から簡便に製造する方法を提供することにある。
本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、安価に入手可能な酢酸エステル誘導体から、簡便な方法にて高純度の２−ホルミル酢酸エステル誘導体を合成し、該２−ホルミル酢酸エステル誘導体を、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することにより、光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を簡便に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、一般式（１）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される酢酸エステル誘導体を、塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、一般式（２）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に変換する工程、及び、有機溶媒と水を用いて、不純物を有機層に除去しつつ、前記式（２）で表される誘導体を水層に転溶する工程からなることを特徴とする、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法を提供する。
また、本発明は、一般式（２）；
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＸは前記と同じ基を表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて立体選択的に還元することを特徴とする、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法を提供する。
また、本発明は、一般式（４）；
（式中、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表し、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エステル誘導体を提供する。
また、本発明は、一般式（５）；
（式中、Ｒ４は炭素数２〜６のアルキル基を表す。Ｒ５は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を提供する。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳細に説明する。
まず、本発明に関わる化合物について説明する。前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ１は、炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基である。
例えば、炭素数２〜１０のアルキル基としては、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基及び置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基の置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子；メチル基、エチル基等の炭素数１〜１０のアルキル基；メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１〜１０のアルコキシ基；ニトロ基、シアノ基、メチレンジオキシ基等が挙げられる。なお、上記アラルキル基及びアリール基の炭素数は、当該置換基の炭素数は含まず、アラルキル基及びアリール基のみの炭素数を意味する。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｍ−メトキシベンジル基、３，４−メチレンジオキシベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、ピリジルメチル基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基としては、フェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｍ−ブロモフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ナフチル基、ピリジル基、インドリル基等が挙げられる。
上記のなかでもＲ１として好ましくは、炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である。炭素数２〜１０のアルキル基として好ましくは、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基であり、より好ましくはｎ−ブチル基である。置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基として好ましくは、ベンジル基、３，４−メチレンジオキシベンジル基であり、より好ましくは３，４−メチレンジオキシベンジル基である。
また、前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ２は、炭素数１〜１０のアルキル基、または置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である。Ｒ２としての置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基の置換基としては、Ｒ１のアラルキル基の置換基として例示したものと同じもの等が挙げられる。上記Ｒ２のアラルキル基の炭素数には、置換基の炭素数を含まないものである。
例えば、炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。好ましくは、メチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。
置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基としては、ベンジル基、ｏ−クロロベンジル基、ｍ−ブロモベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、ｍ−メトキシベンジル基、３，４−メチレンジオキシベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、ピリジルメチル基等が挙げられる。好ましくは、ベンジル基である。
上記のなかでもＲ２として好ましくは、炭素数１〜１０のアルキル基であり、より好ましくは、メチル基、エチル基である。
また、前記式（４）において、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基である。炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
また、前記式（３）及び（４）において、＊は不斉炭素原子を表す。
また、前記式（５）において、Ｒ４は炭素数２〜６のアルキル基である。炭素数２〜６のアルキル基としては、例えば、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。好ましくはｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基であり、更に好ましくはｎ−ブチル基である。
また、前記式（５）において、Ｒ５は炭素数１〜１０のアルキル基である。炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。好ましくは、エチル基である。
また、前記式（２）及び（５）において、ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫである。好ましくは、Ｎａである。
なお、前記式（４）で表される光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エステル誘導体及び前記式（５）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体は、文献に未記載の新規化合物である。
次に、本発明における前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法について説明する。
まず、上記のＲ１及びＲ２を有する誘導体（１）は、工業的に入手可能、あるいは工業的に入手可能な原料から容易に合成することができる。例えば、３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルは、３，４−メチレンジオキシ桂皮酸を水素化した後、エチルエステル化することにより容易に調製することができる。
前記式（１）で表される酢酸エステル誘導体を、適当な溶媒中にて塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体を製造することができる。
上記塩基としては、ナトリウムハイドライド（ＮａＨ）；リチウムハイドライド（ＬｉＨ）；金属ナトリウム（Ｎａ）；ナトリウムメトキサイド（ＭｅＯＮａ）、ナトリウムエトキサイド（ＥｔＯＮａ）、ナトリウムイソプロポキサイド（ｉＰｒＯＮａ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキサイド（ｔＢｕＯＫ）等のアルカリ金属アルコキサイド等が挙げられる。好ましくは、ナトリウムハイドライド、金属ナトリウム、アルカリ金属アルコキサイドが挙げられ、より好ましくは、ナトリウムハイドライド（ＮａＨ）が挙げられる。
塩基の使用量は、酢酸エステル誘導体（１）と塩基のモル比（酢酸エステル誘導体（１）：塩基）として、好ましくは１：１〜１：１５、より好ましくは１：１〜１：５、更に好ましくは１：１〜１：３である。
上記蟻酸エステルとしては、例えば、蟻酸メチル、蟻酸エチル、蟻酸ｎ−プロピル、蟻酸ｉｓｏ−プロピル、蟻酸ｎ−ブチル、蟻酸ｉｓｏ−ブチル、蟻酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。好ましくは、蟻酸メチル、蟻酸エチルである。なお、本反応においては、塩基性条件下、蟻酸エステル由来のアルコールが副生する為、前記酢酸エステル誘導体（１）は副生したアルコールによりエステル交換され易い。そこで、前記酢酸エステル誘導体（１）と蟻酸エステルのエステル基は同一基であることが望ましい。
蟻酸エステルの使用量は、酢酸エステル誘導体（１）と蟻酸エステルのモル比（酢酸エステル誘導体（１）：蟻酸エステル）として好ましくは１：１〜１：３０、より好ましくは１：１〜１：１０、更に好ましくは１：１〜１：５である。
本反応に使用できる溶媒としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素系溶媒；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ジメチルホルムアミド、アセトアミド、ホルムアミド、アセトニトリル、プロピオニトリル等の含窒素系溶媒；ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられる。上記溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本反応の反応温度としては、好ましくは−２０〜６０℃、より好ましくは０〜５０℃である。
本反応の反応時間としては、好ましくは１時間〜７２時間、より好ましくは１時間〜２０時間である。
上記反応を行うに際し、各試剤の混合方法は特に限定されないが、工業的規模で反応を安全に制御して行う上では、塩基と溶媒の混合物に、酢酸エステル誘導体および蟻酸エステルを同時に添加する方法が好ましい。この方法では、加えた酢酸エステル誘導体が逐次反応するため、添加速度を調節することによって反応を安全に制御することができる。ここで、工業的規模とは、反応で用いる塩基使用量として、通常１ｋｇ以上であり、好ましくは１０ｋｇ以上、より好ましくは１００ｋｇ以上、さらに好ましくは１０００ｋｇ以上、特に好ましくは１００００ｋｇ以上の塩基を反応に供することを意味する。
酢酸エステル誘導体および蟻酸エステルの添加時間は、反応の規模にもよるが、１時間以上とすることが好ましく、より好ましくは３時間以上、さらに好ましくは５時間以上である。また、添加時間は、７２時間以下とすることが好ましい。
また、この方法にて反応をより安全に行う上では、塩基濃度を高めることが好ましく、その際の塩基と溶媒の混合物における塩基濃度としては一概には云えないが、通常１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは３０重量％以上であり、とりわけ４０重量％以上として反応を行うことも好適である。
更に、上記反応方法に於いては、反応温度を高めて、添加した基質をより短時間で反応させて、反応を安全に制御することが好ましい。この場合の反応温度としては一概には云えないが、通常、２０℃以上であり、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４０℃以上であり、また反応液の沸点まで反応温度を高めてもよい。
上記方法にて反応を行う場合、塩基濃度が１０重量％以上、および反応温度が２０℃以上の条件で行うことが特に好ましい。
尚、反応の進行と共に反応液の流動性が低下する場合には、適正な攪拌状態を維持して反応を円滑に行う上で、反応の進行に応じて溶媒を添加すれば良く、簡便には酢酸エステル誘導体と蟻酸エステルの混合物を溶媒に溶解した溶液として加えれば良い。
反応終了後、反応液中に含まれる前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体は、その製造過程における各種分解や副反応、また原料等が残存することにより多量の不純物、例えば、未反応の酢酸エステル誘導体、蟻酸エステル、鉱油等の塩基由来の不純物等を多数含む。高純度の目的物を得るためには、これらの不純物を除去する必要がある。
本発明者らは鋭意検討の結果、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）及び不純物を含有する反応液を水と接触させることで、２−ホルミル酢酸エステル誘導体のアルカリ金属塩を水層に、不純物を有機層に選択的に分配できることを見いだし、得られた水層を酸を用いて酸性化した後、水層に含まれる２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）を有機溶媒で抽出、濃縮することにより、これら不純物を有機層に簡便に除去し、高純度の目的物を効率よく取得できる方法を開発するに至った。
以下に、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の単離精製操作について説明する。前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に含まれる不純物を除去する為には、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）及び不純物を含有する反応液に水を添加して、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）のアルカリ金属塩を水層に選択的に転溶する。この場合、目的物である２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）をほとんどロスすることなく、未反応の酢酸エステル誘導体等の不純物を反応溶媒等の有機層に除去することができる。
水の添加に先立ち、予め反応液を濃縮減量しても良く、また、反応液に一般的な抽出溶媒、例えば、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、メチルエチルケトン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、塩化メチレン等を添加しておいても良い。また、２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）のアルカリ金属塩を水層に転溶した後、水層を上記一般的な抽出溶媒を用いて再洗浄することにより、不純物をさらに低減することも可能である。
次いで、上記の高純度の２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）を含有する水層を、一般的な酸、例えば、塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、クエン酸等の有機酸等を用いて、好ましくはｐＨ５以下、より好ましくはｐＨ３以下に調整した後、上記一般的な抽出溶媒を用いて２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）を抽出した後、これを濃縮することにより化学純度の高い目的物を効率よく取得することができる。
上記純度は、好ましくは９０重量％以上であり、より好ましくは９４重量％以上である。
一方、反応液に水を添加する上記転溶操作なしに、反応液に酸を加えて抽出する場合、目的物である２−ホルミル酢酸エステル誘導体及び未反応の酢酸エステル誘導体等の不純物は、ともに反応溶媒等の有機層に抽出される為、高純度の目的物を得ることができない。
次に、本発明における前記式（３）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法について説明する。
前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する活性を有する酵素源の存在下、前記式（２）のホルミル基を立体選択的に還元することにより、前記式（３）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造することができる。
ここで、「酵素源」とは、上記還元活性を有する酵素自体はもちろんのこと、上記還元活性を有する微生物の培養物およびその処理物も含まれる。「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味する。「その処理物」としては、例えば、粗抽出液、凍結乾燥微生物体、アセトン乾燥微生物体、それら菌体の磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して用いることができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行うことができる。
本発明の酵素還元工程において、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する活性を有する酵素源としては、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、及びミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が挙げられる。
上記酵素源のうち、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｌｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が好ましい。
上記酵素源のうち、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、ブレタノマイセス・アノマラス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓａｎｏｍａｌｕｓ）、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・グラエボーサ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｅｂｏｓａ）、キャンディダ・グロペンギッセリイ（Ｃａｎｄｉｄａｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、キャンディダ・ラクチス−コンデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、キャンディダ・モギイ（Ｃａｎｄｉｄａｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・ピニ（Ｃａｎｄｉｄａｐｉｎｉ）、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・ソルボフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・バーサチリス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、デバリオマイセス・ネパレンシス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、デバリオマイセス・ロベルトシエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｒｏｂｅｒｔｓｉａｅ）、ガラクトマイセス・レースシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓｒｅｅｓｓｉｉ）、オガタエア・ミヌータ バー．ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ピキア・シルビコラ（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、ロドトルラ・アウランチアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ラクトーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｌａｃｔｏｓａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボラス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ステリグマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヤマダジーマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アクロモバクター・キシロキダンス サブスピーシーズ デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｆｉｍｉ）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、クレブシエラ・プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ）、ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等の微生物由来の酵素源が好ましい。
また、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、及びミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素源が好ましい。
また、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する活性を有する酵素源としては、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）、シストフィロバシディウム・ビスポリヂイ（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍｂｉｓｐｏｒｉｄｉｉ）、ピキア・ビスポーラ（Ｐｉｃｈｉａｂｉｓｐｏｌａ）、ロドトルラ・グルチニス バー．グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トルラスポラ・グロボーサ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｇｌｏｂｏｓａ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、ヤロビア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロバクテリウム・エステラロマチカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）等の微生物由来の酵素源が好ましい。
また、上記微生物由来の還元酵素の産生能を有する微生物としては、野生株または変異株のいずれでもよい。あるいは細胞融合、遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いることができる。本酵素を生産する遺伝子操作された微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードするＤＮＡ配列を得る工程、このＤＮＡを他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本酵素を得る工程を含有する方法により得ることができる（ＷＯ９８／３５０２５号パンフレット）。
酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、下記栄養源を含有する通常の液体培地を使用することができる。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質；エタノール、グリセロール等のアルコール類；オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類；菜種油、大豆油等の油類等が挙げられる。
窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、燐酸１水素アンモニウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなどが挙げられる。
無機塩類として、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸マンガン等の硫酸塩；塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなどが挙げられる。
他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を使用することができる。
培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨが３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行うことができる。
本発明の還元反応は、適当な溶媒中に基質の２−ホルミル酢酸エステル誘導体（２）、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び上記微生物の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下攪拌することにより行うことができる。
還元反応に用いる溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ヘキサン等を添加してもよい。
反応条件は、用いる酵素、微生物またはその処理物、基質濃度等によって異なるが、通常、基質濃度は約０．１〜１００重量％、好ましくは１〜６０重量％である。
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、基質に対して、通常、０．０００１〜１００モル％、好ましくは０．０００１〜０．１モル％である。
反応温度は、通常、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃である。
反応のｐＨは、通常、４〜９、好ましくは５〜８である。
反応時間は、通常、１〜１２０時間、好ましくは１〜７２時間である。
上記反応は、基質を一括、または連続的に添加して行うことができる。また、反応はバッチ方式または連続方式で行うことができる。
本発明の還元工程において、一般に用いられる補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系を組み合わせて用いることにより、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させることができる。代表的なＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生系としては、例えば、グルコース脱水素酵素及びグルコースを用いる方法が挙げられる。
還元酵素遺伝子及びこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の還元反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調整する必要がないため、より低コストで光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造することができる。
上記のような形質転換微生物としては、上記還元酵素をコードするＤＮＡ及び該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードするＤＮＡを有するプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。ここで、酵素を再生する能力を有する酵素としては、グルコース脱水素酵素が好ましく、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素がより好ましい。また、宿主微生物としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）が好ましい。
より好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ０７０５由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８、受託日：平成１１年９月２８日）、
デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）ＩＦＯ１３５８４由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８、受託日：平成１５年８月２５日）、
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ０４１５由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５８、受託日：平成１４年１月２２日）、
セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ１２４６８由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＳＧＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８４４９、受託日：平成１３年８月６日）、
ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ１３８６７由来の還元酵素遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のグルコース脱水素酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９、受託日：平成１２年４月１１日）、
ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＫＮＫ０１由来の還元酵素遺伝子で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５、受託日：平成１５年１１月１０日）等が挙げられる。
これらの形質転換微生物は、それぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、これらの形質転換微生物のうち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）、及び、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）は、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。
なお、本発明の還元工程を、補酵素再生系と組み合わせて実施する、または、酵素源として上記形質転換微生物の培養物もしくはその処理物を用いる場合は、補酵素として、より安価な酸化型のＮＡＤ（Ｐ）を添加して反応を行うことも可能である。
還元反応で生じた光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体（３）は、常法により精製することが出来る。例えば、光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルは、酵素源として微生物等を用いた場合には、必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下に除去し、そして減圧蒸留またはクロマトグラフィー等の処理を行う事により、精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（参考例１） ３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルエステルの調製
３，４−メチレンジオキシケイ皮酸５０ｇをエタノール５００ｍｌに溶解させ、これに５％Ｐｄ／Ｃ触媒５ｇを加えた。反応系を水素ガス置換し、２５℃で６時間攪拌した。反応終了後、Ｐｄ／Ｃ触媒をろ過操作にて除去した。得られたエタノール溶液を５℃に冷却し、塩化チオニル３７．１ｇを一時間かけて滴下した。滴下終了後、内温５℃でさらに３時間攪拌した。反応終了後、減圧下にて溶媒を留去し、橙色濃縮物５４．７ｇを得た。これを一部抜き取り、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ １００ ＰＲ−８（Ｅ）２５０ｍｍ×４．０ｍｍＩ．Ｄ．、メルク社製、移動相：リン酸・リン酸二水素カリウム水溶液／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍＬ／分、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）にて分析を行ったところ、表題化合物４９．８ｇを含有していることを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７７−６．６３（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），４，１７−４．１０（２Ｈ，ｑ），２．８６（２Ｈ，ｔ），２．５６（２Ｈ，ｔ），１．２７（３Ｈ，ｔ）。
（参考例２） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ４．４ｇをＴＨＦ２００ｍｌに懸濁した溶液に、３−フェニルプロピオン酸エチル１７．８ｇ及び蟻酸エチル８．２ｇを氷冷下、１時間かけて適下した後、室温にて１５時間攪拌した。さらに、６０％ＮａＨ１４ｇ及び蟻酸エチル２５．９ｇを３回に分割して添加した後、室温にて１５時間攪拌した。得られた反応液に、１０％クエン酸溶液を添加した後、酢酸エチルにて抽出し、減圧濃縮することにより茶色油状の濃縮物３２．４ｇを得た。得られた濃縮物をシリカゲルカラムにて精製することにより、表題化合物１７．９ｇを透明油状物として得た。
（参考例３） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸メチルの製造法
３−フェニルプロピオン酸エチル及び蟻酸エチルの代わりに３−フェニルプロピオン酸メチル及び蟻酸メチルを用いて、参考例２と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。
（参考例４） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸イソプロピルの製造法
３−フェニルプロピオン酸エチル及び蟻酸エチルの代わりに３−フェニルプロピオン酸イソプロピル及び蟻酸イソプロピルを用いて、参考例２と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。
（参考例５） ２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸イソブチルの製造法
３−フェニルプロピオン酸エチル及び蟻酸エチルの代わりに３−フェニルプロピオン酸イソブチル及び蟻酸イソブチルを用いて、参考例２と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。
（実施例１） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ４２．４ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５００ｍｌに懸濁した。３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル８４．５ｇ（純度９３．７重量％）をＴＨＦ１００ｍｌに溶かし、先の懸濁液に室温で滴下した。４０℃に昇温して１５分攪拌した後、蟻酸エチル１３１ｇを２．５時間かけて滴下した後、さらに３時間攪拌した。
溶媒を留去し、反応溶液を約半量まで濃縮した後、氷浴で冷却し、水５００ｍｌを内温が１０℃以下を保つ速度で滴下した。水層をヘキサン２００ｍｌで二回洗浄した後に、濃塩酸でｐＨ４．５に調節した。これをトルエン５００ｍｌで３回抽出し、減圧濃縮により表題化合物８２．８ｇを得た。下記の条件にてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法にて化学純度を分析したところ、化学純度９４．７重量％であった。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＴＣ−ＦＦＡＰ １ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．（ＧＬサイエンス社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝８ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１５０℃、検出時間：２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル ４．０分。
（実施例２） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ７．９１ｇをＴＨＦ１２ｍｌに懸濁し、４０℃に昇温した。３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル１１．０ｇと蟻酸エチル１１．０ｇをＴＨＦ７７．０ｍｌに溶解し、先の懸濁液に５〜１４時間掛けて滴下した。１時間攪拌後、蟻酸エチル３．７ｇを５時間で添加し、更に１２時間攪拌した。
得られた反応混合物にトルエン２５０ｍｌを加えて減圧濃縮し、約１０重量％のトルエン懸濁液とした後、これを１０℃以下に冷却した水５５ｍｌに内温が維持できる速度で滴下した。有機層を廃棄後、水層をトルエン１８０ｍｌで一回洗浄し、この水層を濃塩酸でｐＨ５〜７に調節した後に、トルエン９０ｍｌで２回抽出し、１回水洗後、有機層を減圧濃縮して、表題化合物１１．２ｇを得た。実施例１の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９８．８重量％であった。
（実施例３） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチルの製造法
６０％ＮａＨ１．３８ｇをＴＨＦ１２ｍｌに懸濁した。３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチル２．４ｇをＴＨＦ１２ｍｌに溶かし、先の懸濁液に室温で滴下した。４０℃に昇温して１５分攪拌した後、蟻酸メチル３．４６ｇを１時間かけて滴下した。さらに、６０％ＮａＨ０．７ｇ及び蟻酸メチル０．９ｇを４回に分割して添加した後、４０℃にて３時間攪拌した。
溶媒を留去し、反応溶液を約半量まで濃縮した後、氷浴で冷却し、水４０ｍｌを内温が１０℃以下を保つ速度で滴下した。水層をトルエン５０ｍｌで二回洗浄した後に、濃塩酸でｐＨ４．５に調節した。これをトルエン５０ｍｌで２回抽出し、減圧濃縮により表題化合物２．６３ｇを得た。実施例１の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．４重量％であった。
（実施例４） ２−ホルミルヘキサン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ６０ｇをＴＨＦ６００ｍｌに懸濁し、ヘキサン酸エチル７２．１ｇを先の懸濁液に室温で滴下した。４０℃に昇温して１５分攪拌した後、蟻酸エチル１８５．２ｇを６時間かけて滴下した。さらに、６０％ＮａＨ３０ｇ及び蟻酸エチル９２．６ｇを４回に分割して添加した後、４０℃にて３時間攪拌した。
溶媒を留去し、反応溶液を約半量まで濃縮した後、氷浴で冷却し、水４０ｍｌを内温が１０℃以下を保つ速度で滴下した。水層をトルエン４００ｍｌで二回洗浄した後に、濃塩酸でｐＨ４．５に調節した。これをトルエン７００ｍｌで２回抽出し、減圧濃縮により表題化合物７６．８ｇを得た。下記の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．６重量％であった。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＨＰ−５ ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝１２５ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１２０℃、検出時間：２−ホルミルヘキサン酸エチル ６．９分、２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル ９．８分。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４２（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．０（０．６Ｈ，ｄ），４．１６−４．２７（２Ｈ，ｍ），３．２５（０．４Ｈ，ｍ），１．２４−２．３７（９Ｈ，ｍ），０．９０（３Ｈ，ｔ）。
（実施例５） ２−ホルミルヘキサン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ６２ｇをＴＨＦ１２６ｍｌに懸濁し、４０℃に昇温した。ヘキサン酸エチル５６ｇと蟻酸エチル８６ｇをＴＨＦ２５０ｍｌに溶解し、先の懸濁液に５〜２０時間掛けて滴下した。３時間攪拌後、蟻酸エチル８６ｇを５時間で添加し、更に１２時間攪拌した。
得られた反応混合物にトルエン１２００ｍｌを加えて減圧濃縮し、約１０重量％のトルエン懸濁液とした後、これを１０℃以下に冷却した水２８０ｍｌに内温が維持できる速度で滴下した。有機層を廃棄後、水層をトルエン５７０ｍｌで一回洗浄し、この水層を濃塩酸でｐＨ５〜７に調節した後に、酢酸エチル２８０ｍｌで２回抽出し、１回水洗後、有機層を減圧濃縮して、表題化合物５５ｇを得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９７．２重量％であった。
（実施例６） ２−ホルミル酪酸エチルの製造法
ヘキサン酸エチルの代わりに酪酸エチルを用いて、実施例４と同様の方法に従い、表題化合物を茶色油状物として得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．４重量％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４２（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．０（０．６Ｈ，ｄ），４．１５−４．２８（２Ｈ，ｍ），３．１７−３．２１（０．４Ｈ，ｍ），１．２３−２．２９（５Ｈ，ｍ），０．９６−１．０５（３Ｈ，ｍ）。
（実施例７） ２−ホルミルヘプタン酸エチルの製造法
ヘキサン酸エチルの代わりにヘプタン酸エチルを用いて、実施例４と同様の方法に従い、表題化合物を茶色油状物として得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９６．７重量％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４３（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．１（０．６Ｈ，ｄ），４．１６−４．２７（２Ｈ，ｍ），３．２３−３．２７（０．４Ｈ，ｍ），１．２１−２．０６（１１Ｈ，ｍ），０．８５−０．９１（３Ｈ，ｍ）。
（実施例８） ２−ホルミルオクタン酸エチルの製造法
ヘキサン酸エチルの代わりにオクタン酸エチルを用いて、実施例４と同様の方法に従い、表題化合物を茶色油状物として得た。実施例４の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度９５．４重量％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１１．４３（０．６Ｈ，ｄ），９．７０（０．４Ｈ，ｄ），７．０（０．６Ｈ，ｄ），４．１６−４．２７（２Ｈ，ｍ），３．２３−３．２７（０．４Ｈ，ｍ），１．２５−１．８８（１３Ｈ，ｍ），０．８８（３Ｈ，ｔ）。
（比較例１） ２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
６０％ＮａＨ２．０ｇをＴＨＦ３０ｍｌに懸濁した。懸濁液を０℃に冷却し、３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル６．０ｇ（純度９２．１重量％）をＴＨＦ２０ｍｌに溶かし、先の懸濁液に滴下した。０℃で蟻酸エチル４ｍＬを滴下した後、室温に戻しさらに２０分攪拌した。反応溶液を４０℃に加熱し、さらに攪拌を続けた。加熱後、約３０分でガス発生が認められた。ガス発生が終わった時点でＨＰＬＣ（カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ １００ ＰＲ−８（Ｅ）２５０ｍｍ×４．０ｍｍＩ．Ｄ．、メルク社製、移動相：リン酸・リン酸二水素カリウム水溶液／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍＬ／分、検出波長：２１０ｎｍ、カラム温度：３０℃）にて反応溶液を分析したところ、原料の残存が認められたため、さらにＮａＨ１ｇ、蟻酸エチル４ｍＬを加え、４０℃で攪拌した。再びガス発生が始まり、１５分程度で終了した。反応液を再度分析したところ、まだ原料の残存が認められたため、再度ＮａＨ１ｇと蟻酸エチル４ｍＬを加えた。ガス発生終了後、再度分析を行ったところ、わずかに原料の残存があり、さらにＮａＨ１ｇおよび蟻酸エチル８ｍＬを添加、原料の消失を確認したので、反応を停止した。塩酸でｐＨ＝７〜８に調整後、酢酸エチルを加え抽出を行った。分液ロートにて、ＮａＨに含まれるミネラルオイルを分液操作で除去し、得られた酢酸エチル層を濃縮することにより、オレンジ色のオイルとして表題化合物４．７５ｇを得た。実施例１の方法に従い、化学純度を分析したところ、化学純度８０．２０重量％であった。
（実施例９） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
グルコース４％、イーストエキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４ １．３％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．７％、ＮａＣｌ ０．０１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００５％、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ ０．００１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を調製し、大型試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌した。これらの液体培地に表１に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、水洗後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液０．５ｍｌと、２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチル２ｍｇ、グルコース２０ｍｇを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液０．５ｍｌとを混合し、栓付試験管に入れ３０℃で２４時間振盪した。反応後、反応液を等量体積の酢酸エチルにより抽出し、抽出液中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することにより、変換率（％）を求めた。また、光学純度については、生成物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて精製した後、ＨＰＬＣ法により分析した。その結果を表１に示す（変換率は２０〜１００％）。
分析条件、及び、変換率、光学純度の計算方法は以下の通りである。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＴＣ−ＦＦＡＰ ５ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．（ＧＬサイエンス社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝３０ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１５０℃、検出時間：２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチル ４．０分、２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸エチル １２．０分。
ＨＰＬＣ分析条件＝カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＡＳ ２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９８／２、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃、検出時間：Ｒ体１６．１分、Ｓ体１８．３分。
変換率（％）＝生成物量／（基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅｅ）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａ及びＢは対応する鏡像異性体量を表わし、Ａ＞Ｂである）。
（実施例１０）光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
表２に示す微生物について、グリセリン１．５％、イーストエキス０．５％、ＫＨ２ＰＯ４ １．３％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．７％、ＮａＣｌ ０．０１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００５％、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ ０．００１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いて培養する以外は、実施例９と同様の方法に従い、変換率及び光学純度を測定した。その結果を表２に示す（変換率は２０〜１００％）。
（実施例１１） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エチルの製造法
グルコース４％、イーストエキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４ １．３％、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．７％、ＮａＣｌ ０．０１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０８％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００６％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００９％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００５％、ＭｎＳＯ４・４〜５Ｈ２Ｏ ０．００１％からなる液体培地（ｐＨ７．０）を調製し、大型試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌した。これらの液体培地に表３に示した微生物をそれぞれ１白金耳植菌し、３０℃で２〜３日間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を集め、水洗し、氷冷アセトンを添加した後、減圧乾燥することにより、アセトン乾燥菌体を調製した。得られたアセトン乾燥菌体５ｍｇ、２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エチル２ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ＝６．５）及び酢酸エチル０．５ｍｌを栓付試験管に添加し、３０℃で２４時間振盪した。次に、実施例９と同様の操作を行い、変換率及び光学純度を測定した。その結果を表３に示す。
（実施例１２） 光学活性２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの製造法
実施例１１で得られたアセトン乾燥菌体５ｍｇ、表４に示す各種２−ホルミルアルカン酸エチル２ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、ＮＡＤＰ１ｍｇ、０．１Ｍリン酸緩衝液０．５ｍｌ（ｐＨ＝６．５）及び酢酸エチル０．５ｍｌを栓付試験管に添加し、３０℃で２４時間振盪した。反応後、反応液を等量体積の酢酸エチルにより抽出し、抽出液中の基質及び生成物量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法により分析することにより、変換率（％）を求めた。また、光学純度については、生成物をＨＰＬＣラベル化剤（３，５−ジニトロ塩化ベンゾイル）を用いて誘導化し、ＴＬＣにて精製した後、ＨＰＬＣ法により分析した。その結果を表４に示す。分析条件は以下の通りである。
ＧＣ分析条件＝カラム：ＨＰ−５ ３０ｍ×０．３２ｍｍＩ．Ｄ．（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、キャリアーガス：Ｈｅ＝１２５ｋＰａ、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１２０℃、検出時間：２−ホルミルヘキサン酸エチル ６．９分、２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル ９．８分。
ＨＰＬＣ分析条件＝カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−Ｈ ０．４６×２５ｃｍＩ．Ｄ．（ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液：ヘキサン／イソプロパノール＝９５／５、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：４０℃、検出時間：（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル誘導体３０．６分、（Ｓ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチル誘導体３７．４分。
（実施例１３） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルプロピオン酸エステルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌに表５に示す各種２−ホルミル−３−フェニルプロピオン酸エステル１０ｍｇ、ＮＡＤＰ１ｍｇ、グルコース１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応終了後、実施例９と同様の分析法で、変換率及び光学純度を分析した。その結果を表５に示す（いずれも変換率は１００％であった）。
（実施例１４） 光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
表６に示す各種組み換え大腸菌を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌに２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル１０ｍｇ、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）１ｍｇ、グルコース１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応終了後、実施例９と同様の分析法で、変換率と生成物の光学純度を分析した。その結果を表６に示す（いずれも変換率は１００％であった）。
（実施例１５） 光学活性２−ヒドロキシメチルアルカン酸エチルの製造法
表７に示す各種組み換え大腸菌を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌに、表７に示す各種２−ホルミルアルカン酸エチル１０ｍｇ、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）１ｍｇ、グルコース１０ｍｇを添加し、３０℃で２時間攪拌した。反応終了後、実施例１２と同様の分析法で、変換率と生成物の光学純度を分析した。その結果を表７に示す（いずれも変換率は１００％であった）。
（実施例１６） （Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液５５０ｍｌに実施例１で得られた２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）プロピオン酸エチル８７ｇ、ＮＡＤＰ２７．５ｍｇ、グルコース８９ｇを添加し、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液からトルエンを用いて抽出、濃縮することにより、茶色油状物８４．１ｇを得た。実施例９と同様の分析法で、生成物の化学純度と光学純度を分析したところ、化学純度９６．５％、光学純度９６．４％ｅｅ、（Ｒ）体であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７３−６．５６（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），４．１２−４．２３（２Ｈ，ｑ），３．７６−３．６４（２Ｈ，ｍ），２．９５−２．６９（３Ｈ，ｍ），１．２７（３Ｈ，ｔ）。
（実施例１７） （Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液５０ｍｌに実施例１で得られた２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸メチル１．８９ｇ、ＮＡＤＰ２．５ｍｇ、グルコース１．９ｇを添加し、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液からトルエンを用いて抽出、濃縮することにより、茶色油状物１．８２ｇを得た。実施例９と同様の分析法で、生成物の化学純度及び光学純度を分析したところ、化学純度９６．８％、光学純度９８．０％ｅｅ、（Ｒ）体であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７３−６．６２（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），３．７７−３．６７（２Ｈ，ｍ），３．７０（３Ｈ，ｓ），２．９６−２．９０（１Ｈ，ｍ），２．８２−２．７５（２Ｈ，ｍ）。
（実施例１８） （Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシベンジル）−プロピオン酸エチルの製造法
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ＝７．０）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した。得られた培養液５０ｍｌに実施例１で得られた２−ホルミル−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エチル０．５ｇ、ＮＡＤＰ２．５ｍｇ、グルコース０．５ｇを添加し、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液からトルエンを用いて抽出、濃縮することにより、茶色油状物０．４９ｇを得た。実施例９と同様の分析法で、生成物の化学純度と光学純度を分析したところ、化学純度９６．８％、光学純度４３％ｅｅ、（Ｓ）体であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．７３−６．５６（３Ｈ，ｍ），５．９３（２Ｈ，ｓ），４．１２−４．２３（２Ｈ，ｑ），３．７６−３．６４（２Ｈ，ｍ），２．９５−２．６９（３Ｈ，ｍ），１．２７（３Ｈ，ｔ）。
（実施例１９） （Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチルの合成
組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５を、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で滅菌した５０ｍｌの２×ＹＴ培地（トリペプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ ０．５％、硫酸亜鉛７水和物 ５０ｍｇ、ｐＨ＝７．０）に接種し、３０℃で４０時間振とう培養した。得られた培養液２５ｍｌにグルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１，０００ｕｎｉｔｓ、２−ホルミルヘキサン酸エチル２．５ｇ、ＮＡＤ３ｍｇ、グルコース４ｇ、硫酸亜鉛７水和物５０ｍｇを添加し、２．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸エチル１００ｍｌを加えて抽出し、有機層を減圧下で留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、油状の（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸エチルを得た。収率は９０％、光学純度は９３．６％ｅ．ｅ．であった。なお、光学純度の分析は、ＨＰＬＣラベル化剤（３，５−ジニトロ塩化ベンゾイル）を用いて誘導化した後、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ−Ｈカラム ０．４６×２５ｃｍＩ．Ｄ．（ダイセル化学工業社製）を用いたＨＰＬＣ法によって行った。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．１３−４．２４（２Ｈ，ｑ），３．７２−３．７９（２Ｈ，ｍ），２．５３−２．５９（１Ｈ，ｍ），１．５−１．７（２Ｈ，ｍ），１．２４−１．３７（７Ｈ，ｍ），０．９（３Ｈ，ｔ）。
（実施例２０） （Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘプタン酸エチルの合成
２−ホルミルヘキサン酸エチルの代わりに２−ホルミルヘプタン酸エチルを用いて、実施例１９と同様の方法に従い、表題化合物を透明油状物として得た。収率は９０％、光学純度は８７％ｅｅであった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ：４．１３−４．２４（２Ｈ，ｑ），３．６９−３．７９（２Ｈ，ｍ），２．５３−２．５９（１Ｈ，ｍ），１．４４−１．６９（２Ｈ，ｍ），１．２２−１．３６（９Ｈ，ｍ），０．９（３Ｈ，ｔ）。
【産業上の利用可能性】
本発明の方法により、医薬品中間体として有用な光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を安価な原料から簡便に製造することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される酢酸エステル誘導体を、塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、一般式（２）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、またはＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に変換する工程、及び、有機溶媒と水を用い、不純物を有機層に除去しつつ、前記式（２）で表される誘導体を水層に転溶する工程を含むことを特徴とする、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法。
【請求項２】
前記式（１）及び（２）において、Ｒ１が炭素数２〜１０のアルキル基又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項３】
前記式（１）及び（２）において、Ｒ２が炭素数１〜１０のアルキル基である請求の範囲第１または２項記載の製造法。
【請求項４】
塩基が、ナトリウムハイドライド、金属ナトリウム、又はアルカリ金属アルコキサイドである請求の範囲第１、２または３項記載の製造法。
【請求項５】
反応を、塩基を含む溶媒に酢酸エステル誘導体および蟻酸エステルを添加して行う請求の範囲第１、２、３または４項記載の製造法。
【請求項６】
反応を塩基濃度が１０重量％以上、および反応温度が２０℃以上の条件で行う請求の範囲第５項記載の製造法。
【請求項７】
一般式（２）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、またはＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることにより、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造する方法であって、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造するか、
又は、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造することを特徴とする製造法。
【請求項８】
前記式（２）及び（３）において、Ｒ１が炭素数２〜１０のアルキル基又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である請求の範囲第７項記載の製造法。
【請求項９】
Ｒ選択的な酵素源として、ブレタノマイセス・アノマラス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓａｎｏｍａｌｕｓ）、クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、デバリオマイセス・ネパレンシス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、デバリオマイセス・ロベルトシエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｒｏｂｅｒｔｓｉａｅ）、ガラクトマイセス・レースシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓｒｅｅｓｓｉｉ）、オガタエア・ミヌータ バー．ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ピキア・シルビコラ（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボラス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ステリグマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヤマダジーマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アクロモバクター・キシロキダンス サブスピーシーズ デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｕｓ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｆｉｍｉ）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、クレブシエラ・プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ）、ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、及びセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造する請求の範囲第７又は８項記載の製造法。
【請求項１０】
Ｒ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＳＧＧ１）（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４４９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５）の培養物又はその処理物である請求の範囲第７、８または９項記載の製造法。
【請求項１１】
Ｓ選択的な酵素源として、シストフィロバシディウム・ビスポリヂイ（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍｂｉｓｐｏｒｉｄｉｉ）、ピキア・ビスポーラ（Ｐｉｃｈｉａｂｉｓｐｏｌａ）、ロドトルラ・グルチニス バー．グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トルラスポラ・グロボーサ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｇｌｏｂｏｓａ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、ヤロビア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロバクテリウム・エステラロマチカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、及びミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造する請求の範囲第７又は８項記載の製造法。
【請求項１２】
Ｓ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）の培養物又はその処理物である請求の範囲第７、８または１１項記載の製造方法。
【請求項１３】
一般式（２）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることにより、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造する方法であって、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・グラエボーサ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｅｂｏｓａ）、キャンディダ・グロペンギッセリイ（Ｃａｎｄｉｄａｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、キャンディダ・ラクチス−コンデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、キャンディダ・モギイ（Ｃａｎｄｉｄａｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・ピニ（Ｃａｎｄｉｄａｐｉｎｉ）、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・ソルボフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・バーサチリス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、ロドトルラ・アウランチアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓ）、及びロドトルラ・ラクトーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｌａｃｔｏｓａ）からなる群より選択される微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造するか、
又は、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造することを特徴とする製造法。
【請求項１４】
Ｒ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５８）の培養物又はその処理物である請求の範囲第１３項記載の製造法。
【請求項１５】
Ｓ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）の培養物又はその処理物である請求の範囲第１３項記載の製造法。
【請求項１６】
前記式（２）及び（３）において、Ｒ１がｎ−ブチル基又は３，４−メチレンジオキシベンジル基である請求の範囲第１３項記載の製造法。
【請求項１７】
一般式（１）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される酢酸エステル誘導体を、塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、一般式（２）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に変換する工程、有機溶媒と水を用い、不純物を有機層に除去しつつ、前記式（２）で表される誘導体を水層に転溶する工程、及び前記式（２）で表される誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（２）で表される誘導体を立体選択的に還元することにより、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を取得する工程を含むことを特徴とする、前記式（３）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法。
【請求項１８】
前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ１が炭素数２〜１０のアルキル基又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である請求の範囲第１７項記載の製造法。
【請求項１９】
前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ２が炭素数１〜１０のアルキル基である請求の範囲第１７または１８項記載の製造法。
【請求項２０】
前記式（２）で表される誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源が、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｌｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来する酵素源である請求の範囲第１７、１８又は１９項記載の製造法。
【請求項２１】
酵素源として、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、又はセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する能力を有する酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造する請求の範囲第２０項記載の製造法。
【請求項２２】
Ｒ選択的に還元する能力を有する酵素源が、ブレタノマイセス・アノマラス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓａｎｏｍａｌｕｓ）、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・グラエボーサ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｅｂｏｓａ）、キャンディダ・グロペンギッセリイ（Ｃａｎｄｉｄａｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、キャンディダ・ラクチス−コンデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、キャンディダ・モギイ（Ｃａｎｄｉｄａｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・ピニ（Ｃａｎｄｉｄａｐｉｎｉ）、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・ソルボフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・バーサチリス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、デバリオマイセス・ネパレンシス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、デバリオマイセス・ロベルトシエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｒｏｂｅｒｔｓｉａｅ）、ガラクトマイセス・レースシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓｒｅｅｓｓｉｉ）、オガタエア・ミヌータ バー．ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ピキア・シルビコラ（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、ロドトルラ・アウランチアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ラクトーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｌａｃｔｏｓａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボラス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ステリグマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヤマダジーマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アクロモバクター・キシロキダンス サブスピーシーズ デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｆｉｍｉ）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、クレブシエラ・プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ）、ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、及びセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源である請求の範囲第２１項記載の製造法。
【請求項２３】
Ｒ選択的に還元する能力を有する酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５８）、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＴＳＧＧ１）（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４４９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５）の培養物又はその処理物である請求の範囲第２２項記載の製造法。
【請求項２４】
酵素源として、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造する請求の範囲第２０項記載の製造法。
【請求項２５】
前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源が、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）、シストフィロバシディウム・ビスポリヂイ（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍｂｉｓｐｏｒｉｄｉｉ）、ピキア・ビスポーラ（Ｐｉｃｈｉａｂｉｓｐｏｌａ）、ロドトルラ・グルチニス バー．グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トルラスポラ・グロボーサ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｇｌｏｂｏｓａ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、ヤロビア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロバクテリウム・エステラロマチカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、及びミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源である請求の範囲第２４項記載の製造方法。
【請求項２６】
前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）の培養物またはその処理物である請求の範囲第２４または２５項記載の製造法。
【請求項２７】
一般式（４）；
（式中、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表し、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エステル誘導体。
【請求項２８】
一般式（５）；
（式中、Ｒ４は炭素数２〜６のアルキル基を表す。Ｒ５は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体。
【請求項２９】
一般式（５）において、Ｒ５がエチル基である請求の範囲第２８項記載の２−ホルミル酢酸エステル誘導体。
【請求項３０】
一般式（５）において、Ｒ４がエチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基である請求の範囲第２８または２９項記載の２−ホルミル酢酸エステル誘導体。
【請求項１】
一般式（１）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される酢酸エステル誘導体を、塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、一般式（２）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、またはＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に変換する工程、及び、有機溶媒と水を用い、不純物を有機層に除去しつつ、前記式（２）で表される誘導体を水層に転溶する工程を含むことを特徴とする、前記式（２）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体の製造法。
【請求項２】
前記式（１）及び（２）において、Ｒ１が炭素数２〜１０のアルキル基又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項３】
前記式（１）及び（２）において、Ｒ２が炭素数１〜１０のアルキル基である請求の範囲第１または２項記載の製造法。
【請求項４】
塩基が、ナトリウムハイドライド、金属ナトリウム、又はアルカリ金属アルコキサイドである請求の範囲第１、２または３項記載の製造法。
【請求項５】
反応を、塩基を含む溶媒に酢酸エステル誘導体および蟻酸エステルを添加して行う請求の範囲第１、２、３または４項記載の製造法。
【請求項６】
反応を塩基濃度が１０重量％以上、および反応温度が２０℃以上の条件で行う請求の範囲第５項記載の製造法。
【請求項７】
一般式（２）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、またはＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることにより、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造する方法であって、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造するか、
又は、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造することを特徴とする製造法。
【請求項８】
前記式（２）及び（３）において、Ｒ１が炭素数２〜１０のアルキル基又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である請求の範囲第７項記載の製造法。
【請求項９】
Ｒ選択的な酵素源として、ブレタノマイセス・アノマラス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓａｎｏｍａｌｕｓ）、クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、デバリオマイセス・ネパレンシス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、デバリオマイセス・ロベルトシエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｒｏｂｅｒｔｓｉａｅ）、ガラクトマイセス・レースシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓｒｅｅｓｓｉｉ）、オガタエア・ミヌータ バー．ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ピキア・シルビコラ（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボラス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ステリグマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヤマダジーマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アクロモバクター・キシロキダンス サブスピーシーズ デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｕｓ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｆｉｍｉ）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、クレブシエラ・プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ）、ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、及びセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造する請求の範囲第７又は８項記載の製造法。
【請求項１０】
Ｒ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＳＧＧ１）（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４４９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５）の培養物又はその処理物である請求の範囲第７、８または９項記載の製造法。
【請求項１１】
Ｓ選択的な酵素源として、シストフィロバシディウム・ビスポリヂイ（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍｂｉｓｐｏｒｉｄｉｉ）、ピキア・ビスポーラ（Ｐｉｃｈｉａｂｉｓｐｏｌａ）、ロドトルラ・グルチニス バー．グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トルラスポラ・グロボーサ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｇｌｏｂｏｓａ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、ヤロビア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロバクテリウム・エステラロマチカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、及びミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造する請求の範囲第７又は８項記載の製造法。
【請求項１２】
Ｓ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）の培養物又はその処理物である請求の範囲第７、８または１１項記載の製造方法。
【請求項１３】
一般式（２）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に、そのホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を作用させることにより、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を製造する方法であって、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・グラエボーサ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｅｂｏｓａ）、キャンディダ・グロペンギッセリイ（Ｃａｎｄｉｄａｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、キャンディダ・ラクチス−コンデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、キャンディダ・モギイ（Ｃａｎｄｉｄａｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・ピニ（Ｃａｎｄｉｄａｐｉｎｉ）、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・ソルボフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・バーサチリス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、ロドトルラ・アウランチアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓ）、及びロドトルラ・ラクトーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｌａｃｔｏｓａ）からなる群より選択される微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造するか、
又は、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造することを特徴とする製造法。
【請求項１４】
Ｒ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５８）の培養物又はその処理物である請求の範囲第１３項記載の製造法。
【請求項１５】
Ｓ選択的な酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）の培養物又はその処理物である請求の範囲第１３項記載の製造法。
【請求項１６】
前記式（２）及び（３）において、Ｒ１がｎ−ブチル基又は３，４−メチレンジオキシベンジル基である請求の範囲第１３項記載の製造法。
【請求項１７】
一般式（１）；
（式中、Ｒ１は炭素数２〜１０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアリール基を表す。Ｒ２は炭素数１〜１０のアルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基を表す。）で表される酢酸エステル誘導体を、塩基及び蟻酸エステルと反応させることにより、一般式（２）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体に変換する工程、有機溶媒と水を用い、不純物を有機層に除去しつつ、前記式（２）で表される誘導体を水層に転溶する工程、及び前記式（２）で表される誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源を用いて、前記式（２）で表される誘導体を立体選択的に還元することにより、一般式（３）；
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体を取得する工程を含むことを特徴とする、前記式（３）で表される光学活性３−ヒドロキシプロピオン酸エステル誘導体の製造法。
【請求項１８】
前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ１が炭素数２〜１０のアルキル基又は置換基を有していても良い炭素数５〜１５のアラルキル基である請求の範囲第１７項記載の製造法。
【請求項１９】
前記式（１）、（２）及び（３）において、Ｒ２が炭素数１〜１０のアルキル基である請求の範囲第１７または１８項記載の製造法。
【請求項２０】
前記式（２）で表される誘導体のホルミル基を立体選択的に還元する能力を有する酵素源が、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｌｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来する酵素源である請求の範囲第１７、１８又は１９項記載の製造法。
【請求項２１】
酵素源として、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトマイセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、サッカロマイコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、ステリグマトマイセス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジーマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、ジェンセニア（Ｊｅｎｓｅｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、又はセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＲ選択的に還元する能力を有する酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＲ体を製造する請求の範囲第２０項記載の製造法。
【請求項２２】
Ｒ選択的に還元する能力を有する酵素源が、ブレタノマイセス・アノマラス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓａｎｏｍａｌｕｓ）、キャンディダ・カンタレリ（Ｃａｎｄｉｄａｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ）、キャンディダ・グラエボーサ（Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｅｂｏｓａ）、キャンディダ・グロペンギッセリイ（Ｃａｎｄｉｄａｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ）、キャンディダ・ラクチス−コンデンシイ（Ｃａｎｄｉｄａｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ）、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｒｉａｅ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・マリス（Ｃａｎｄｉｄａｍａｒｉｓ）、キャンディダ・モギイ（Ｃａｎｄｉｄａｍｏｇｉｉ）、キャンディダ・ピニ（Ｃａｎｄｉｄａｐｉｎｉ）、キャンディダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）、キャンディダ・ソルボフィラ（Ｃａｎｄｉｄａｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・バーサチリス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・クルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、デバリオマイセス・ネパレンシス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、デバリオマイセス・ロベルトシエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｒｏｂｅｒｔｓｉａｅ）、ガラクトマイセス・レースシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓｒｅｅｓｓｉｉ）、オガタエア・ミヌータ バー．ミヌータ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａｖａｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・カナデンシス（Ｐｉｃｈｉａｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ピキア・シルビコラ（Ｐｉｃｈｉａｓｉｌｖｉｃｏｌａ）、ピキア・キシローサ（Ｐｉｃｈｉａｘｙｌｏｓａ）、ロドトルラ・アウランチアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ラクトーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｌａｃｔｏｓａ）、サッカロマイコプシス・セレノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｓｅｌｅｎｏｓｐｏｒａ）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボラス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロマイセス・サルモニコラ（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、ステリグマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヤマダジーマ・スチピチス（Ｙａｍａｄａｚｙｍａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アクロモバクター・キシロキダンス サブスピーシーズ デニトリフィカンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、セルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｆｉｍｉ）、セルロモナス・スピーシーズ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｓｐ．）、セルロモナス・ウダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓｕｄａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａａｌｖｅｉ）、ジェンセニア・カニクルリア（Ｊｅｎｓｅｎｉａｃａｎｉｃｒｕｒｉａ）、クレブシエラ・プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）、プロテウス・インコンスタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｑｕｉ）、ロドコッカス・スピーシーズ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、及びセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源である請求の範囲第２１項記載の製造法。
【請求項２３】
Ｒ選択的に還元する能力を有する酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５８）、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＮＴＳＧＧ１）（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４４９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＳ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５４５）の培養物又はその処理物である請求の範囲第２２項記載の製造法。
【請求項２４】
酵素源として、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、シストフィロバシディウム（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ウィリオプシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）属、ヤロビア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物に由来し、前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源を用い、前記式（３）で表される誘導体のＳ体を製造する請求の範囲第２０項記載の製造法。
【請求項２５】
前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源が、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｇｎｏｌｉａｅ）、シストフィロバシディウム・ビスポリヂイ（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｌｏｂａｓｉｄｉｕｍｂｉｓｐｏｒｉｄｉｉ）、ピキア・ビスポーラ（Ｐｉｃｈｉａｂｉｓｐｏｌａ）、ロドトルラ・グルチニス バー．グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓｖａｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トルラスポラ・グロボーサ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｇｌｏｂｏｓａ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．マラキイ（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｍｒａｋｉｉ）、ウィリオプシス・サツルヌス バー．サツルヌス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓｓａｔｕｒｎｕｓｖａｒ．ｓａｔｕｒｎｕｓ）、ヤロビア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）、ミクロバクテリウム・エステラロマチカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、及びミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）からなる群より選択される微生物由来の酵素源である請求の範囲第２４項記載の製造方法。
【請求項２６】
前記式（２）で表される誘導体のホルミル基をＳ選択的に還元する能力を有する酵素源が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＲＧ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８９８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８４５８）、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＢＧ１）（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１１９）の培養物またはその処理物である請求の範囲第２４または２５項記載の製造法。
【請求項２７】
一般式（４）；
（式中、Ｒ３は炭素数１〜１０のアルキル基を表し、＊は不斉炭素原子を表す。）で表される光学活性２−（ヒドロキシメチル）−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−プロピオン酸エステル誘導体。
【請求項２８】
一般式（５）；
（式中、Ｒ４は炭素数２〜６のアルキル基を表す。Ｒ５は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、又はＫを表す。）で表される２−ホルミル酢酸エステル誘導体。
【請求項２９】
一般式（５）において、Ｒ５がエチル基である請求の範囲第２８項記載の２−ホルミル酢酸エステル誘導体。
【請求項３０】
一般式（５）において、Ｒ４がエチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基である請求の範囲第２８または２９項記載の２−ホルミル酢酸エステル誘導体。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５２８２９
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２３５８（Ｐ２００５−５０２３５８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５６４４
【国際出願日】平成１５年１２月８日（２００３．１２．８）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５６４４
【国際出願日】平成１５年１２月８日（２００３．１２．８）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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