分類不可能なハエモフィルスインフルエンザエのＬＫＰピリン構造遺伝子およびオペロン
【課題】ハエモフィルス インフルエンザエの感染症の予防もしくは治療に適するハエモフィルス インフルエンザエのピリ線毛蛋白質、特に先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ分子の提供。
【解決手段】血清型５ ＬＫＰ ピリン蛋白質もしくはその生物学的活性断片を含んでなる単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ピリ線毛蛋白質（例えば、先端付着因子蛋白質）およびそれをコードするＤＮＡ分子。
【解決手段】血清型５ ＬＫＰ ピリン蛋白質もしくはその生物学的活性断片を含んでなる単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ピリ線毛蛋白質（例えば、先端付着因子蛋白質）およびそれをコードするＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、蛋白質をコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
分類不可能なハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）は主な非侵襲性ヒト呼吸器官病原体である。ＮＴＨｉは偏共生体として呼吸器官内に存在するか、あるいは局所感染（これには、中耳炎、気管支炎、副鼻腔炎、および稀には肺炎が含まれる）を生じることがある（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３参照）。ハエモフィルス インフルエンザエ（分類可能および分類不可能の両方）のヒト細胞への付着については数々の潜在的な粘着因子が既に記載されており、それらには４種類の線毛／ピリ線毛、およびボルデテラ ペルトゥシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の線維状赤血球凝集素との類似性を有する２つの高分子量蛋白質が含まれる（非特許文献４参照）。ピリ線毛は細菌性表面抗原である。これらは主要蛋白質（ピリン）サブユニットのらせん状対称構築物からなる蛋白質付属物である。幾つかのピリ線毛はその先端に会合している２〜３の微量蛋白質をも保持し得る。これらの蛋白質の内の一つである付着因子は、ヒトおよび動物の細胞上の特異的膜レセプターへのピリ線毛付着のための活性部位を保持している。
【０００３】
ある種のピリ線毛／線毛については既に広範な研究がなされており、それは長硬ピリ線毛（ｌｏｎｇ ｔｈｉｃｋ ｐｉｌｉ）（ＬＫＰ）ファミリーである。ＬＫＰピリ線毛は分類可能および分類不可能の両Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｈｉｂ）により発現される。このファミリーのピリ線毛は特徴的形態を有し、付着特異性は部分的に共有しており、かつそれらの構造蛋白質はアミノ酸配列を共有している。これらのピリ線毛は赤血球凝集陽性であり、かつヒト粘膜細胞に対する付着を媒介する（非特許文献５参照）。ヒト赤血球の赤血球凝集はＡｎＷｊ血液型抗原への結合を介して達成される一方で、上皮細胞への結合はシアル酸含有性ラクトシルセラミドレセプターを必要とする（非特許文献６参照）。
【０００４】
このＬＫＰファミリーは、精製されたピリ線毛に対して作製されたポリクローナル抗血清に対する反応性を基に、様々な株特異的血清型に分類されている。ピリ線毛血清型間では交差反応性は殆ど観察されていない（非特許文献７参照）。
【０００５】
細胞へのＨ．インフルエンザエによるＬＫＰピリ線毛−媒介性付着を阻害もしくは遮断することによりＨ．インフルエンザエ疾患を予防することができる。精製された無傷のＬＫＰピリ線毛はチンチラモデルではＮＴＨｉ中耳炎のための候補ワクチンであり、類似のピリ線毛血清型を保持するＮＴＨｉ株での攻撃誘発に対する防御を付与することが既に示されている（非特許文献８参照）。しかしながら、このような防御はピリ線毛特異的であるため、広範な防御のためにはワクチンは多価性であることが必要とされ、このようなワクチンには天然の病原体集団において最も頻繁に生じる血清型のピリ線毛が含まれる。ＬＫＰピリン構造遺伝子は数々のグループにより既にクローン化および配列決定されているが（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１および非特許文献１２参照）、ピリ線毛血清型１および４の原因となる遺伝子のみが同定されているに過ぎない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｃ．Ｄ．、ａｎｄ Ｊ．Ｏ．Ｋｌｅｉｎ、Ｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ．、３５６（１９８３）
【非特許文献２】Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｓｔｏｏｌ ｅｄ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．
【非特許文献３】Ｍｕｓｈｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．９９：３４４−３５０（１９８３）
【非特許文献４】Ｓｔ．Ｇｅｍｅ，Ｊ．Ｗ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８７５−２８７９（１９９３）
【非特許文献５】Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９）
【非特許文献６】ｖａｎ Ａｌｐｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４４７３−４４７７（１９９１）
【非特許文献７】Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９）
【非特許文献８】Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ６２−６５（１９８８）
【非特許文献９】Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１７１６−１７２２（１９９１）
【非特許文献１０】Ｆｏｒｎｅｙ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１９９１−１９９６（１９９１）
【非特許文献１１】Ｋａｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９９０）
【非特許文献１２】ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ．８：３５３５−３５４０（１９８９）
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ピリ線毛血清型５についてのピリン遺伝子の単離、クローニング、および配列決定（図１）、完全なＬＫＰ１オペロンの配列決定（これは表５に示される）、ならびにＬＫＰ１０、ＬＫＰ１１、およびＬＫＰ１２のピリ線毛のクローニングに関する。本発明は更に、Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＬＫＰ、特に先端付着因子蛋白質を含む蛋白質をコードするＤＮＡ分子（本明細書ではＤＮＡ配列もしくは核酸配列としても引用される）にも関する。本発明は更に、ピリ線毛に関するハエモフィルス インフルエンザエのゲノムのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ分子にも関する。本発明のＤＮＡ分子は、ある試料（例えば、血液試料）をハエモフィルス インフルエンザエの存在についてアッセイするための方法に用いることができる。従って本発明は、診断法としての該ＤＮＡ分子の使用に関する。
【０００８】
本発明は更に、組換えハエモフィルス インフルエンザエのピリ線毛蛋白質、およびペ
プチド、特に先端付着因子蛋白質に関する。本発明の蛋白質もしくはペプチドを用いてポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体（これらはＨ．インフルエンザエ）ピリ線毛蛋白質との反応性を示す（例えば、結合する））を産生させることができ、かつ診断用アッセイに用いて例えば血液試料中のハエモフィルス インフルエンザエの抗体の存在を検出することができる。このような抗体は更に、受動免疫の方法でのワクチンとして用いることもできる。
【０００９】
本発明の蛋白質およびペプチドは更に、哺乳類（例えば、ヒト）をハエモフィルス インフルエンザエ感染に対して免疫化するための方法に、そしてそのため例えば中耳炎のようなハエモフィルス インフルエンザエの関連性疾患の予防のためのワクチンとして利用することもできる。具体的には、本明細書に示されるＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づき、哺乳類においてＨ．インフルエンザエに対する防御抗体を誘導することができる付着因子蛋白質もしくはペプチド、すなわちワクチンを構築することができる。
【００１０】
＜発明の詳細な記述＞
ハエモフィルス インフルエンザエ 血清型５ピリン遺伝子のクローニング、ならびに完全なＬＫＰ１オペロンの配列（配列番号４）および６つのオペロン読み取り枠についての推定アミノ酸配列（配列番号５〜１０）が今回初めて本明細書に記載される。表５に示されるようにＬＫＰ１オペロンは５つの個別の遺伝子からできており、それらはｈｉｐＰ（ピリン遺伝子）、ｈｉｐＣ（ペリプラズムシャペロン遺伝子）、ｈｉｐＲ（膜アンカー蛋白質）、ｈｉｐＭ（微量先端会合蛋白質遺伝子）、およびｈｉｐＡ（先端付着因子遺伝子）である。これら５つの遺伝子は、本明細書では、ｈｉｆＡ（ｈｉｐＰについて）、ｈｉｆＢ（ｈｉｐＣについて）、ｈｉｆＣ（ｈｉｐＲについて）、ｈｉｆＤ（ｈｉｐＭについて）、およびｈｉｆＥ（ｈｉｐＡについて）として称されることもある。ＬＫＰ１オペロン上にはインテグラーゼ遺伝子およびペプチダーゼ遺伝子も存在する。ＬＫＰ１オペロンのこれらの遺伝子によりコードされる蛋白質およびＬＫＰ５ピリン蛋白質は本明細書では包括的に、Ｈ．インフルエンザエ ピリ線毛蛋白質として称される。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載されるＨ．インフルエンザエ ピリ線毛蛋白質もしくはその生物学的活性断片をコードする単離された核酸配列および／または組換え体の核酸配列を包含する。本明細書に用いられる際には、核酸はＤＮＡおよびＲＮＡ、またはＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列、またはＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子と称される。本明細書で「単離された」と称される核酸は、それらの起源のゲノムＤＮＡもしくは細胞性ＲＮＡの核酸から分離された核酸であり（例えば、それが細胞中もしくは例えばライブラリーのような核酸の混合物中に存在する場合）、そしてさらなる処理が施されたものであってもよい。「単離された」核酸には、単離された核酸を取得するために当業者に知られる方法、および本明細書に記載された方法により取得された核酸が含まれる。これらの単離された核酸には、本質的には純粋な核酸、化学合成、生物学的合成と化学合成との組み合わせにより生成される核酸、単離される組換え核酸が含まれる。
【００１２】
本明細書で「組換え体」と称される核酸は組換えＤＮＡ法により産生された核酸であり、これには例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いるベクター内へのクローニングのような人工組換えの方法を頼みとする手法により作製される核酸が含まれる。
【００１３】
「組換え」核酸は更に、細胞の天然のメカニズムを通して生じる組換え現象から生じるが、ただし所望される組換え現象を可能にさせかつ有望なものにさせるために設計された核酸をその細胞内に組み込ませた後に選択される核酸でもある。
【００１４】
本明細書に記載されるＨ．インフルエンザエのＤＮＡ配列に実質的に相補的な核酸配列
（ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列）、および実質的核酸配列同一性に関してＤＮＡ配列を同定するのに十分な当業者に知られる緊縮性の条件下でこれらのＤＮＡ配列とハイブリダイズする核酸配列も本発明により包含される。このようなストリンジェントな条件下で同定されたＤＮＡ配列がＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質（本明細書では、ポリペプチドもしくはペプチド断片とも称される）をコードするかも知れないと予測することは理にかなっている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一般的記述が、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８９、において論議されており、その教示事項は引用により本明細書に取り込まれる。例えばプローブの長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のパーセントミスマッチ百分率、温度、およびイオン強度のような因子は核酸ハイブリッドの安定性に影響を及ぼす。従って、さらなるＨ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ピリ線毛蛋白質を同定するに十分なストリンジェントな条件（例えば、高いストリンジェントな条件もしくは適度なストリンジェントな条件）は、他の未知の核酸を配列相同性について比較する既知のＤＮＡの特徴に部分的に依存して経験的に決定することができる。
【００１５】
本明細書に記載される際には「実質的に相補的な」は、その配列は例えば配列番号４の厳密な配列を反映する必要はないが、ただしストリンジェントな条件下で配列番号４とハイブリダイズするための配列の同一性の点では十分に類似している必要があることを意味する。例えば、非相補的は塩基または長目もしくは短目の配列を配列内に散在させることができるが、ただしその配列は例えば配列番号４に関してはその配列とハイブリダイズするに十分な相補性塩基を有する。
【００１６】
本発明のＤＮＡ分子が、機能的もしくは生物学的に活性なピリ線毛蛋白質をコードすることが好ましく、それらは例えばピリン遺伝子、ｈｉｐＰ；ペリプラズムシャペロン、ｈｉｐＣ；膜結アンカー白質、ｈｉｐＲ；先端会合蛋白質、ｈｉｐＭ、および最も好ましくは先端付着因子蛋白質、ｈｉｐＡである。「機能的であるかもしくは生物学的に活性な蛋白質」は本明細書では、有意な同一性（例えば、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％）を内因性蛋白質の対応配列と共有し、かつその機能の内の一つもしくは複数を保持する蛋白質として特定される。Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の生物学的機能には、抗原性、構造性、および付着特性が含まれる。例えば、Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ６２−６５（１９８８））に記載されるように（この教示事項は引用により本明細書に取り込まれる）、ピリ線毛蛋白質は粘膜細胞および赤血球細胞に付着することを示すことができる。従ってこのような付着特性は生物学的活性の測定対象となり得る。生物学的活性は、その蛋白質もしくはペプチドの抗原性（これはピリ線毛蛋白質に結合する抗体の産生をもたらす）を含むことができることも、本明細書に記載される。
【００１７】
本発明のＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質は具体的には、ＬＫＰ１オペロンの蛋白質および血清型５ ｈｉｐＰピリン蛋白質、ならびにそれらの配列に類似するアミノ酸配列を有する蛋白質を含むことが理解される。このような蛋白質は本明細書では、Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質アナログもしくは誘導体として特定される。「類似のアミノ酸配列」は本明細書では、先端付着因子の生物学的活性を保持するのに十分な、例えばＬＫＰ１先端付着因子蛋白質とのアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を意味するように特定される。先端付着因子の生物学的活性は例えば、ヒトおよび動物の細胞上の特異的膜レセプターに結合する先端付着因子の能力を含むことができる。例えば、アミノ酸配列内に「サイレント」変化を保持し、そのアミノ酸配列では一つもしくは複数のアミノ酸残基がＬＫＰ１付着因子のアミノ酸残基とは異なりはするが依然として付着活性を保
持するアナログポリペプチドを作製することができる。そのような差異の例には、例えば配列番号９への残基の添加、欠失、もしくは置換が含まれる。本発明のピリ線毛蛋白質の低目もしくは高目の生物学的活性を呈する類似蛋白質も本発明に包含される。
【００１８】
本発明は更に、本明細書に記載されるＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の生物学的に活性な蛋白質、もしくは生物学的に活性な断片をも包含する。このような断片はピリ線毛蛋白質の全長アミノ酸配列の一部分を含むにすぎないが、依然として生物学的活性を保持することができる。このような断片は、アミノ−およびカルボキシル−末端欠失、ならびに内部欠失により作製することができる。このようなペプチド断片を、本明細書に記載される生物学的活性について検査することができる。従って、機能的、もしくは生物学的に活性な蛋白質は、一つもしくは複数のアミノ酸が予め置換、欠失、もしくは添加されている内因性蛋白質の突然変異体もしくは誘導体を含む。その蛋白質の活性断片もやはり本発明に含まれる。先に記載されるＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質は機能的もしくは生物学的に活性なピリ線毛蛋白質を含み、それらの例は、ピリン構造蛋白質、ｈｉｐＰ；ペリプラズムシャペロン、ｈｉｐＣ；膜アンカー蛋白質、ｈｉｐＲ；先端会合蛋白質、ｈｉｐＭ；および最も好ましくは先端付着因子蛋白質、ｈｉｐＡである。
【００１９】
本発明は更に、天然に見いだされるピリ線毛蛋白質には生じることのない第二部分に連結された、本明細書に記載されるピリ線毛蛋白質（本明細書では第一部分として引用される）を含む融合蛋白質にも関する。従って、この第二部分は単一のアミノ酸、ペプチド、もしくはポリペプチドであることができる。この第一部分は、その融合蛋白質にとってのＮ−末端の位置、Ｃ−末端の位置、もしくは内部に存在することができる。ある態様では、この融合蛋白質はピリ線毛蛋白質、ならびにマルトース結合性蛋白質（ＭＢＰ）（配列番号１１）もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のいずれかを含む。
【００２０】
本発明のＤＮＡ配列を、適切な宿主細胞内での本明細書に特定される機能的Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の発現に適するプロモーターの制御下でのインビトロもしくはインビボでの細胞の感染、トランスフェクション、もしくは形質転換のための組換え構築物に用いることもできる。このような組換え構築物は本明細書では発現ベクターとも称される。例えば、あるＤＮＡ配列を、例えばｐＵＣ１９のような適切な発現ベクター内に組み込まれる適切なプロモーター（例えば、構成性プロモーターもしくは誘導性プロモーター、あるいは内因性プロモーター）に機能的に連結させることができ、これをその後に適切な宿主細胞内に組み込ませる。この構築物は更に、一つもしくは複数の選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａｃ、ｈｙｇ、およびｈｉｓｄ）、あるいは一つもしくは複数の異なる抗原、または治療用蛋白質を含むことができる。
【００２１】
この構築物を先に記載されるいずれかの適切な手段、例えばリン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、電気穿孔法、もしくは感染（例えば、感染性レトロウイルス、ヘルペス、ワクシニア、もしくはアデノウイルスベクター）により組み込ませることができる。宿主細胞は真核生物もしくは原核生物の細胞であることができる。適切な細胞には、細菌性（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））もしくは哺乳類の細胞が含まれる。哺乳類細胞には、初代体細胞（例えば、上皮細胞、繊維芽細胞、表皮細胞、マクロファージ、もしくはＴ細胞）または不滅化細胞株（例えば、ＨｅＬａもしくはＨＴ１０８０）が含まれる。その後に組換え宿主細胞を培養し、そして場合によっては適切な条件下でのインビトロでの選択を行ってその蛋白質の発現をもたらすことができる。別法では、その細胞をインビボ発現のために動物（例えばヒト）内に移植もしくは注入することができる。
【００２２】
ある態様では、本発明はＬＫＰタイプピリ線毛産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え体に関する。このような組換え体が既に、本明細書に記載される要領でハエモフィルス イ
ンフルエンザエから構築されている。これらの単一血清型組換え体は、容易に精製可能な大容量でピリ線毛を産生した。これらは植え継ぎの際に相性変化を生じたり不応性を示したりはせず、かつ液体培地中では良好なピリ線毛収率を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）として増殖することができた。それらから増殖および精製した単一血清型のピリ線毛調製物は、親Ｈ．インフルエンザエ （Ｈｆｌｕ）株におけるものと同一のピリ線毛を含み、かつ他のＨｆｌｕ抗原は全く含んでいなかった。これらの調製物は、後続の多価ワクチンへの混合のために、純度、同一性、濃度、および力価についての標準化が容易であり、かつワクチン製造業者にとってピリ線毛を産生するための効率の良い手法を提供する。本明細書に記載される要領で、単一型産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換えワクチン株が既にＬＫＰ１０、ＬＫＰ１１、およびＬＫＰ１２血清型について構築されている。
【００２３】
個別のプラスミド上に２つのオペロンを含む多重血清型組換え体も既に構築されている。これらの株の単一コロニーは２つの血清型のピリ線毛を良好な量で同時に発現した。しかしながらこれらの株はインビトロ継代の際に急速にピリ線毛発現を消失する傾向にあるという点で不安定であり、これは恐らく用いられたプラスミドが不適合であるためと思われる。この２つのオペロンが２つの適合性プラスミド上に存在する場合には、これらの株は一層安定となることが予期される。安定かつ高産生性の二重発現性組換え株を使用することで、必要とされるワクチン株数を半分に削減することにより、ワクチン使用に適する蛋白質の産生を簡潔化することができるだろう。
【００２４】
様々な血清型のＨｆｌｕ ＬＫＰピリ線毛のための良好な産生法、濃縮法、および精製法が既に開発されており、そして本明細書に記載されている。ピリ線毛を、Ｈｆｌｕ培養物からのピリ線毛の精製のために記載される要領で、Ｈｆｌｕピリ線毛を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え体培養物から精製することができる。固相および液相の両発酵法がこれまでに用いられている。好ましい方法には、回収された細菌からのピリ線毛の機械的取り出し作業および遠心分離による細菌性細胞からの分離が含まれる。ピリ線毛には、無傷のピリ線毛桿状体の縦方向の凝集（結晶化）（ただし可溶性不純物は、その結晶の遠心分離により除去される）およびその後のそのピル結晶の遊離のピル桿状体への可溶化（ただし粒子性不純物は、遠心分離により除去される）という別の周期により濃縮および更に進んだ精製が施される。産生／精製過程の各段階は、各ピル血清型について至適化させた。今日までに１９の異なるＬＫＰ血清型が既に精製されている。
【００２５】
分析的および工業的な実用性を有する別のピリ線毛精製法も既に開発されている。適切な溶媒およびカラム条件を用いることにより、無傷のピリ線毛をサイズ調製カラム、疎水性カラム、もしくはイオン交換カラムでのＨＰＬＣもしくはＦＰＬＣにより混入性蛋白質から精製し出すことができる。これらの方法も、工業的産生性の拡大を可能にすることができる。
【００２６】
無傷のＬＫＰピリ線毛から出発する個々のピリ線毛蛋白質のための精製法も既に開発されている。他のピリ線毛遺伝子とのピリ線毛遺伝子配列の多重配列アラインメントから演繹したところ、Ｈｆｌｕ ＬＫＰピリ線毛構造蛋白質には、ピリン、小先端微量蛋白質、および巨大先端微量蛋白質が含まれる。この巨大先端微量蛋白質は「付着因子」として称されるが、それはその蛋白質がヒト赤血球細胞に対する既知のＬＫＰピリ線毛付着特異性を有するためである。しかしながら他のピリ線毛ファミリーとの類似性によると、他の２つのＬＫＰピリ線毛構造蛋白質も、未だ知られていないヒトレセプターに対する特異性を有する付着因子であってもよい。ＬＫＰピリ線毛のピリンおよび付着因子の両方共が既に生物学的活性形態で精製されている。
【００２７】
ピリンは、微量先端蛋白質の除去および分子サイズ調製用カラムでの微量物質からの桿状体の分離により、会合した桿状体形態で精製される。会合形態ではピリン単位は無傷の
ピリ線毛の抗原特異性を保持しており、この特異性は、そのピリ線毛桿状体の外側表面上のピリンサブユニットの露出表面抗原決定基により付与される。ピリン桿状体は多価ワクチン特異性と同等の効率を示すことが予期されるが、それは無傷のピリ線毛は、純度が一層高いという利点を有しかつ副作用が低下している可能性があることがあるためである。
【００２８】
ＬＫＰ１１の付着因子が既に単離されており、そして活性かつ可溶性形態で精製されている。ＬＫＰ１１ピリ線毛から付着因子を除去すると、ヒト赤血球細胞に結合するピリ線毛の能力が消失する。純粋形態では、付着因子はヒト赤血球細胞膜に結合することができる。ＳＤＳゲル上の付着因子バンドを、付着因子の断片とマルトース結合性蛋白質とを含んでなる融合蛋白質に反応性を示す抗体によりラベル化する。精製されたＬＫＰピリ線毛付着因子は、付着因子遮断用もしくは除去用の抗体を誘導することが可能なワクチン構成成分としての利用性を有することがある。ＬＫＰ１１付着因子はウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット上ではＬＫＰ１付着因子とは抗原的には交差反応を行わなかった。従って、３つの異なるＬＫＰ付着因子について見いだされた見かけ上の分子量のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル類似性からは、この限定的２血清型検査における抗原類似性は予知されなかった。遊離付着因子を、中耳炎のワクチンとしての効率について、および付着因子遮断用抗体を誘導するそれらの能力について検査することができる。この融合蛋白質に対する抗血清（これを用いてウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット上で付着因子バンドをラベル化する）は赤血球細胞への付着を遮断しなかった。
【００２９】
本発明の単離された組換え蛋白質を哺乳類に投与して、その哺乳類をＨ．インフルエンザエの感染から防御するか、もしくは治療することができる。単離された組換えピリ線毛蛋白質をワクチン組成物に製剤することができ、これは例えば米国特許第５，３３６，４９０号（この教示事項は引用により本明細書に取り込まれる）に記載される要領で実施される。この蛋白質は感染性構築物、好ましくは複製不全性であるかもしくは弱毒化されたウイルス構築物を介して投与することもできる。別法では、この蛋白質を、インビボでその蛋白質を発現するであろう組換え宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）を介してか、あるいは薬剤学的に許容される担体内で投与することができる。特に組換えＬＫＰ１先端付着因子蛋白質、その生物学的活性断片、もしくは融合蛋白質を、哺乳類中での抗体の産生を誘導するためのワクチン組成として用いることができる。そのような抗体が、その哺乳類をＨ．インフルエンザエ感染症の疾患から防御することができるということを予期することは理にかなっている。
【００３０】
このワクチン組成物は、Ｈ．インフルエンザエの感染からの防御を付与するに十分な血中抗体レベルを達成するための期間にわたり、一回量もしくは一回を上回る量で投与されることがある。
【００３１】
適切な薬剤学的担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース、もしくはスターチ）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘着性パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）が含まれるが、これらには限定されない。薬剤学的調製物を滅菌し、そして望ましくは補助剤（例えば、滑沢剤、保存料、安定剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、および／または芳香族性物質などであることができる（これらは活性物質とは有害な反応を生じない）。これらは所望される場合には、代謝分解を減少させるための他の活性物質（例えば、酵素阻害剤）と組み合わせることもできる。
【００３２】
非経口的適用のためには、注入用滅菌溶液、好ましくは油性もしくは水性の溶液、ならびに懸濁液、乳液、もしくは座薬を含む移植片が特に適切である。アンプルは簡便な単位用量である。
【００３３】
投与の様式は当業者に知られており、それは例えば、非経口投与、経口投与、もしくは鼻内投与であるか、または細胞性移植片である。
【００３４】
特定の症例における蛋白質の実質的有効量は、例えば、利用される特定の化合物、製剤される具体的な組成物、投与の様式、ならびに患者の年齢、体重、および症状によって変化するであろうことが認識されるであろう。本明細書で用いられる場合には、蛋白質の有効量は、Ｈ．インフルエンザエの感染からの防御を提供するに十分なレベルに哺乳類内の抗体レベルを上昇させることができる蛋白質の量である。個々の患者のための用量は、通常の考慮法を用いて当業者により決定され得る（例えば、適切な通常の薬理学的プロトコールによる）。
【００３５】
本発明のＤＮＡ分子および蛋白質をインビトロ診断用アッセイに用いて、生物学的試料中のＨ．インフルエンザエの存在を検出することができる。ある態様ではＤＮＡ分子もしくはその断片を、ある試料（例えば、哺乳類（例えば、ヒト）からの血液試料）中のハエモフィルス インフルエンザエを検出するためのアッセイにおけるプローブとして用いることができる。このようなプローブは、それらが標的配列（例えば、Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質）に特異的に結合するように設計することができる。
【００３６】
ある態様では、ＤＮＡプローブはＨ．インフルエンザエのゲノムの血清型保存領域のヌクレオチド（例えば、先端付着因子蛋白質をコードするヌクレオチド）を含むことができる。その標的配列に特異的に結合するためには、そのプローブは所望される特異性を提供する（すなわち、その試料中のランダム配列にハイブリダイズすることを回避する）に十分な長さのものである必要がある。ハイブリダイゼーションが可能なＤＮＡ分子は好ましくは少なくとも約４００のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０００のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約１２００のヌクレオチドを含む。例えば、ＤＮＡ分子は、おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド７０００〜７４００の間の少なくとも約４００ヌクレオチドを含むことができる。このＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、ハエモフィルス インフルエンザエのゲノムの対応配列と、好ましくは少なくとも約７０％の相同性、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を共有する。
【００３７】
具体的には、本発明のＤＮＡ分子は、Ｈ．インフルエンザエのゲノムの血清型保存領域にハイブリダイズすることが可能である。特に好ましい態様は、先端付着因子蛋白質をコードするＨ．インフルエンザエの領域とハイブリダイズするＤＮＡ分子である。例えば、ＤＮＡ分子は、血清型１の先端付着因子蛋白質をコードする遺伝子、好ましくはおおまかには配列番号４の内のヌクレオチド６９５５〜８２６５の間に記載される配列にハイブリダイズすることが可能である。ある態様では、ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される緊縮条件下で、そのゲノムにハイブリダイズすることが可能である。このハイブリダイゼーションアッセイは、既知のハイブリダイゼーション方法（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を利用ことで実施することができる。このプローブは例えば当該技術分野における既知のラベルを利用して検出用にラベル化することができ、それらのラベルには、酵素、染料、抗体、および放射性活性ラベルが含まれる。このプローブは固体支持体（例えば、膜）上に固定化されることが好ましい。
【００３８】
別法では、このＤＮＡ分子は、ハエモフィルス インフルエンザエのゲノムの非保存領域にハイブリダイズするように選択することができる。例えば、ピリン蛋白質をコードする遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡ分子を利用することができる。このようなアッセイは、試料中のハエモフィルス インフルエンザエの個々の血清型の存在を検出することができる。
【００３９】
このアッセイに供することができる試料は、ハエモフィルス インフルエンザエを含むか、もしくはそれが混入しているいずれかの試料であることができる。このような試料の例には、血液試料、鼻咽頭試料、もしくは耳吸引液が含まれる。
【００４０】
従ってこのアッセイを被検体（例えば、哺乳類（例えば、ヒト））のハエモフィルス インフルエンザエによる感染の検出のための診断法として用いることができる。このアッセイを用いて更に、ある物質（例えば、食品、医薬品、もしくは生物学的物質）のハエモフィルス インフルエンザエによる混入の存在を検出することもできる。
【００４１】
他の態様では、この蛋白質を、ある試料（例えば、血液試料）におけるハエモフィルス
インフルエンザエの感染を検出するためのアッセイに用いることができる。例えば、病原体のピリ線毛を、本明細書に記載される技術を利用して、その試料から単離するか、もしくは組換え的に産生させることができる。その後にピリ線毛の内の一つもしくは複数の蛋白質、またはその断片の配列を決定することができる。その配列を、配列番号４の対応蛋白質配列（一つもしくは複数）に対して整列させ、そして比較を行うことができる。例えば９０％を上回る相同性は、その試料中の病原体の存在（つまり、感染）を表す。
【００４２】
ピリ線毛蛋白質もしくはその断片（例えば、ペプチド断片）を免疫アッセイ、具体的にはＥＬＩＳＡに用いて、生物学的試料（例えば、血液、血清、もしくは組織）中の抗体の存在を検出することもできる。このような免疫アッセイは、ＬＫＰピリ線毛蛋白質もしくはペプチド断片に結合する抗体を検出するために完全に確立された技術を用いて当業者により容易に実施され得る。
【００４３】
ピリ線毛蛋白質もしくはその断片（本明細書ではペプチドもしくはペプチド断片としても引用される）を用いて、本明細書に記載されるピリ線毛蛋白質との反応性を示す抗体を産生することもできる。用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を包含することが意図される。ポリクローナル抗体は当業者に知られる技術を用い、未精製であるかもしくは精製されたピリ線毛蛋白質の調製物で動物を免疫化することにより調製することができる。ピリ線毛融合蛋白質も免疫化に用いることができる。モノクローナル抗体は当業者に知られる技術を用いて調製することができる。これらの抗体を診断用アッセイに用いて、先に記載される生物学的試料中のＨ．インフルエンザエの抗体の存在を検出することができる。
【００４４】
本発明は、以下の実施例により更に具体的に説明される。
【実施例１】
【００４５】
ＬＫＰおよび５ ｈｉｐＰ遺伝子、およびＬＫＰ１オペロンのクローニングおよび配列決定
材料および方法
【００４６】
細菌株およびプラスミド
既に記載されており、各々ＬＫＰ血清型１、４、および５を発現するＨ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株Ｐ８６０２９５、Ｐ８６１２４９、およびＰ８６０６８８（Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９）が利用された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＢ３９２（Ｋａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９８０））およびＨＢ１０１が組換えプラスミドのための宿主として用いられ、そして株ＤＨ５−αがβ−ガラクトシダーゼ α−ペプチドの相補性に関わるクローニング段階のために用いられた。Ｈｆｌｕを、１０μｇ／ｍｌのヘミン（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および２μｇ／ｍｌのＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ社）を含むブレインハートインフュージョン（Ｄｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）中、３７℃で増殖させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨン（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．、２０３（１９７２）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）中、３７℃で増殖させた。適切である場合には抗生物質を以下の濃度で用いた：アンピリシン（Ｓｉｇｍａ社）１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ社）
２５μｇ／ｍｌ、およびクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ社）２０μｇ／ｍｌ。
【００４７】
既に記載されている、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でＬＫＰ１ピリ線毛を発現するプラスミドｐＨＦ１の構築および特性（Ｋａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９９０））を利用した。プラスミドｐＰＸ５５１は、ＢａｍＨＩ部位内に挿入されたｐＨＦ１の１．９ｋｂのＸｈｏＩ断片を含むｐＵＣ１８誘導体である。ｐｅｐＮ遺伝子座を喪失しているｐＨＦ１の欠失クローンは本文中に記載される要領で構築された。ＬＫＰ４ピリン構造遺伝子を、以下の配列、すなわち：その遺伝子の５’末端については５′ＧＴＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣＡＴＴＡＧＧ３′（配列番号１２）および３’末端については５′ＴＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧ３′（配列番号１３）を有するプライマーを用いるＰ８６０２９５染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅により単離した。この５’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（配列中、下線が施されている）を含んでおり、かつ３’プライマーはＥｃｏＲＩ部位（やはり下線が施されている）を含んでいた。このＰＣＲ産物を、製造業者の指示事項によりｐＣＲ１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、ＣＡ）内にクローン化した。このＬＫＰ４構造遺伝子は、４つ全てのｄＮＴＰの存在下でクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いてＥｃｏＲＩ部位の平滑化を行い、そしてＡｓｐ７１８Ｉ（一つのＡｓｐ７１８Ｉ部位がこのベクター中に存在する）で切断して、その断片を放出させることによりサブクローン化させた。ＬＫＰ４遺伝子をＨｉｎｄＩＩ−Ａｓｐ７１８Ｉで切断させたｐＰＸ１９１（ｂｌａ遺伝子がｐＡＣＹＣ１８４からのｃａｔ遺伝子により置換されているｐＵＣ１９の誘導体（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．、ａｎｄ Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６（１９７８））内に連結させてｐＰＸ６０２を作製した。
【００４８】
ＬＫＰ５ピリン構造遺伝子を、以下のプライマー、すなわち：５’末端については５′−ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＣＴＴＴＡＧ（配列番号１４）および３’末端については３′−ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＡＡＧＣＣ（配列番号１５）を用いるＰＣＲにより単離した。約１ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）内にクローン化させ、そしてそれをそのベクターのフランクＥｃｏＲＩ部位を用いて作製されたＥｃｏＲＩ末端のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）処理による平滑末端断片としてサブクローン化させた。このＬＫＰ５ピリン遺伝子をプラスミドｐＰＸ１９１内にサブクローン化させ、そして配向を制限分析により決定した。ＬＫＰ５サブクローンをｐＰＸ６０５として保存した。
【００４９】
他のＬＫＰ血清型をコードするｈｉｐＰ遺伝子のクローニング
ｈｉｐＰ遺伝子座がコードする血清型４および血清型１ ＬＫＰ遺伝子が既に記載されている（Ｋａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９９０）；ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ．８：３５３５−３５４０（１９８９））。ｈｉｐＰ遺伝子内に位置するＬＫＰピリ線毛の血清型特異性を決定するためにＰＣＲを用いて、これらのピリ線毛を発現するＮＴＨｉ株から血清型４および５のピリ線毛ンをクローン化した。ＬＫＰ４ピリン遺伝子についてのＰＣＲ産
物を先に記載される要領でｐＰＸ１９１内にクローン化させ、そしてｌａｃプロモーターの制御下で発現させる。ＬＫＰ５が発現するＨｆｌｕ株からのｈｉｐＰ遺伝子を記載される要領でＰＣＲにより単離させ、そしてｌａｃ制御下での発現のためにｐＰＸ１９１内にクローン化させた。
【００５０】
オリゴヌクレオチド合成
ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定のためのプライマーとして用いられた合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）３０８ｂ ＤＮＡ合成機上、ｂ−シアノエチルホスホルアミダイト化学法（Ｓｈｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：４５３９−４５５７（１９８４））を用いて合成された。
【００５１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
ＬＫＰ４ ｈｉｐＰおよびＬＫＰ５ ｈｉｐＰピリン遺伝子を各々ＮＴＨｉ株Ｐ８６１２４９およびＰ８６０６８８からＰＣＲにより、標準的ＰＣＲ増幅プロトコールを用いて増幅した（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８））。
【００５２】
ＤＮＡ配列決定
プラスミドｐＰＸ５５１上に含まれるｈｉｐＰ遺伝子およびプラスミドｐＨＦ１上に含まれる完全なＬＫＰ１オペロンは、標準的Ｍ１３配列決定用プライマー、ならびに重複性センスおよびアンチセンスプライマーを用いて配列決定した。全てのＤＮＡ配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上、ＡＢＩからのＴａｑサーマルサイクリング（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇ）ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定用キット（ｐａｒｔ ＃９０１４９７）を利用して実施された。ＬＫＰ４およびＬＫＰ５血清型の配列決定は、ＰＣＲ増幅プライマーおよびＬＫＰ１配列決定研究に基づく内部合成プライマーを用い、ＰＣＲ産物から直接実施した。
【００５３】
８ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、７０ｍｍ×１００ｍｍのミニゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−６８５（１９７０））の方法を用いて実施した。試料を試料調製用緩衝液中のβ−メルカプトエタノールもしくはＤＴＴで還元し、そして５分間沸騰させた。ゲルを１５０Ｖの定電圧で泳動させた。分離された蛋白質をクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブリリアントブルー Ｇ−２５０（Ｓｉｇｍａ社）での染色により検出した。
【００５４】
ピリ線毛の部分精製
ＬＫＰピリ線毛を既述の方法に従い、ｐＨ差溶解性を用いて精製した（Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９））。簡潔に記載すると、毛形成細菌を遠心分離により液体培養物から回収し、そしてリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２、中で２度洗浄した。この細菌ペレットを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭ トリス、ｐＨ１０．３、中に、４ｍｌ（緩衝液）／ｇ（細胞の湿潤重量）の比率で再懸濁させた。Ｏｓｔｅｒミニブレンダー中での３回の３分間バースト（４℃）でブレンドすることによりピリ線毛を剥ぎ取った。細菌の破片を遠心分離により分離させ、そして棄却した。この上清を５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、に対して一晩透析させてピリ線毛を沈殿させ、かつ他の蛋白質を変性させた。このペレットを１５，０００×ｇ、４℃での遠心分離により回収し、そして５０ｍＭの０．０１Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１０．４、中に、緩和に震盪させなが
ら一晩溶解させた。酸沈殿および塩基性緩衝液中での可溶化からなるこの周期を更に２回繰り返した。その後に最終的酸ペレットを０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ１０．４、中に再溶解させ、そして非溶解性物質を棄却した。この可溶性分画を部分精製ピリ線毛として引用した。
【００５５】
ＬＫＰ１オペロンの配列
ＬＫＰ１オペロンの配列決定は既述の要領で実施し、そして完全な配列を配列番号４に示す。配列分析によりＬＫＰオペロン中に６つの可能な読み取り枠（ＯＲＦ）が同定され、これらにはｈｉｐＰ（おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド１８８２−２５３２）およびｈｉｐＣ（おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド２８５４−３６３０）の遺伝子が含まれる。このＬＫＰオペロン中の６つの全ＯＲＦは、蛋白質の多重配列アラインメントにより特定したところ、ピリ線毛スーパーファミリー中の同等のピリ線毛オペロン遺伝子に相同であることが同定された。配列アラインメントの分析も、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＥｎｔｒｅｚ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ １０．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて実施した。得られるアミノ酸配列（各ＯＲＦについてものの）が表５（配列番号５〜１０）に示される。各読み取り枠についての機能は配列アラインメント分析に基づき割り当てられた。ｈｉｐＣプロモーター領域により制御されるオペロンに分類されるように思われる５つのＯＲＦが存在する。ｈｉｐＣ（ペリプラズムシャペロン）遺伝子の後には、第二読み取り枠ｈｉｐＲ（おおまかには配列番号４の内の４０１６−６２３８に位置する）が示され（これは膜アンカー蛋白質である）、第三ＯＲＦ ｈｉｐＭ（おおまかに配列番号４の内の６２５９−６８７３に位置する）が示され（これは先端会合蛋白質であり、本明細書では微量先端蛋白質としても引用される）、そして第四ＯＲＦ ｈｉｐＡ（おおまかには配列番号４の内の６９５５−８２６５に位置する）（これは先端接付着因子蛋白質である）が示された。ピリン遺伝子（ｈｉｐＰ）およびペリプラズムシャペロン遺伝子（ｈｉｐＣ）は、既に同定されているＴＡ反復構造を有するプロモーター領域を保持するＬＫＰ４オペロンとは逆配向で転写される（ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ７３：１１８７−１１９６（１９９３）。ｐＨＦ１は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内ではＬＫＰ１ピリ線毛を発現するという理由のため、ｖａｎ Ｈａｍらにより記載されるように、内部プロモーター領域には１０のＴＡ反復構造が存在する。これらのＴＡ反復構造はＬＫＰピリ線毛表現型の相性変化の原因となっており、幾つかの反復構造の喪失によりピリ線毛発現の喪失がもたらされ、かつ１０と１１との間のＴＡ反復構造数によりＬＫＰオペロンの発現が可能となる。同定を行ってみたところ、ＯＲＦがコードするインテグラーゼがＬＫＰ１オペロン上に存在していた（おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド１４９５−１８６８に位置する）。酵素ペプチダーゼをコードする配列もＬＫＰ１オペロン上に存在していた（おおまかには配列番号４の内の８３９５−９３４７に位置する）。
【００５６】
ＬＫＰ１ ｈｉｐＰ遺伝子産物の予想サイズは約２１．２キロダルトンであり、２０アミノ酸のシグナル配列の長さが仮定される一方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの見かけ上の分子量は約２７キロダルトンである。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル内での一般的なＬＫＰピリンの変則的配列遊走により部分的には説明されるが（成熟したＬＫＰ４は２４キロダルトンの分子サイズに遊走する一方で、その予想サイズは２２．１キロダルトンである）、厳密な説明は未知のままである。
【００５７】
ＬＫＰ血清型１、４、および５のｈｉｐＰ遺伝子の配列比較
この報告は、ＬＫＰ血清型１および５をコードするｈｉｐＰ遺伝子の最初の配列分析を示す（図１）。ＬＫＰ４発現性Ｈｉｂ株からのｈｉｐＰ遺伝子も既に配列決定されており（ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ．８：３５３５−３５４
０（１９８９））、そしてそれに由来するアミノ酸配列は、本明細書に含まれるＬＫＰ４
ｈｉｐＰ由来のアミノ酸配列と９９％の同一性を示す。Ｈｉｂ株ＥａｇａｎおよびＭ４３からのｈｉｐＰ遺伝子配列が既に公開されている（Ｆｏｒｎｅｙ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１９９１−１９９６（１９９１））。ＬＫＰ１ ｈｉｐＰ遺伝子は約２１．５ｋＤの蛋白質をコードする一方で、ＬＫＰ４ ｈｉｐＰ蛋白質の予想分子量は２３．８ｋＤである。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に観察される実際のｈｉｐＰ遺伝子産物は、ＬＫＰ４およびＬＫＰ５についてのウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットではおおよそ正しいサイズのものであるが、ＬＫＰ１ピリンは２６ｋＤと予測されるよりも大き目の分子量に変則的に泳動する。ＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウエアーを用いてこれらの遺伝子の相同性を評定したところ、ＬＫＰ４ ｈｉｐＰ蛋白質およびＬＫＰ５ ｈｉｐＰ蛋白質に関してはＬＫＰ１ ｈｉｐＰに対して各々７０％および６７％の同一性が示された。これらの配列間のアラインメントはその蛋白質の末端では非常に良好であるが、ただし図中に示されるように、ＬＫＰ１、４、および５の血清型遺伝子には３つの主要配列分岐領域が存在し、それらが更に蛋白質へと反映されている。抗−ＬＫＰ１血清、抗−ＬＫＰ４血清、もしくは抗−ＬＫＰ５血清と、異種血清型の無傷のピリ線毛との間には殆ど交差反応性が観察されないため、分類用抗血清の血清型特異性の原因となるこれらの配列は先の３つの領域内に位置しているはずである。ＧｅｎＢａｎｋ内の配列と、ＬＫＰ４配列との比較により、Ｈ．インフルザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タイプｂ Ｍ４３ピリン（Ｇｉｌｓｄｏｒｆ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：１０６５−１０７２（１９９０）（これは、Ｇｉｌｓｄｏｒｆらにより配列決定されている）もＬＫＰ４血清型遺伝子であるように思われる（データ非公開）。
【実施例２】
【００５８】
ＬＫＰタイプのピリ線毛産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え体の構築
【００５９】
細菌株
大腸菌組換え体構築に用いられる毛形成Ｈｆｌｕ株は、ＬＫＰ１１／ＣＢ５９、ＬＫＰ１０／８８−０８０７、およびＬＫＰ１２／８８−０６７７である。赤血球凝集および血清凝集を、遺伝子ライブラリーを作製する以前に調査した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（商標）およびＨＢ１０１をクローニング宿主細胞として用いた。
【００６０】
ＤＮＡライブラリー構築物およびコスミドベクターＤＮＡ
ＬＫＰ１１、ＬＫＰ１０、およびＬＫＰ１２からの染色体ＤＮＡを各々標準技術により抽出および精製した。ＨｆｌｕゲノムＤＮＡサイズは約１．８×１０６ｂｐである。染色体ＤＮＡを部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで消化した。約３０ｋｂ ＤＮＡ分画をＬＭＴＡ−ゲル（Ｓｉｇｍａ社）から溶離させ、かつフェノール−クロロホル法により精製した。最終ＤＮＡ濃度は約１μｇ／μｌである。
【００６１】
ベクターＤＮＡ ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）をＸｂａＩで消化し、そしてウシ腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化させた。ＸｂａＩおよびＣＩＡＰで処理したベクターＤＮＡを、その後にはＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。約６．５ｋｂのベクターＤＮＡ断片が取得された。
【００６２】
ＬＫＰ１１／ＣＢ５９、ＬＫＰ１０／８８−０８０７、およびＬＫＰ１２／８８−０６７７のＤＮＡ断片を各々、ベクターＤＮＡ ＳｕｐｅｒＣｏｓ ＩのＢａｍＨＩ部位で連結させた。連結させたＤＮＡを、Ｃｉｇａ−ｐａｃｋ Ｇｏｌｄキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて１つのファージ粒子内にパッケージングした。パッケージング用の宿主細胞はＸＬ１−Ｂｌｕｅ（商標）であった。
【００６３】
ライブラリースクリーニング
ＬＫＰタイプのピリ線毛を発現した組換え体をコロニーブロット法によりスクリーニングした。ＬＫＰ１１、ＬＫＰ１０、およびＬＫＰ１２からの抗−ピリ線毛血清の濃度は１：１０００稀釈であった。陽性コロニーのパーセンテージは、ＬＫＰ１１については４０／４２００、ＬＫＰ１０については９／７００、そしてＬＫＰ１２については１／６００であった。細胞の毛形成はＥＭ（電子顕微鏡）により調査した。これらの組換え体を更にＨＡ（赤血球凝集）およびＳＡ（血清凝集）アッセイにより確認し、そしてそれらを、ＬＫＰ１１についてはＣＬＪ１１、ＬＫＰ１０についてはＣＬＪ１０、およびＬＫＰ１２についてはＣＪＬ１２と命名した（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）。組換えＤＮＡを抽出し、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１に形質転換させたが、それはＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞はタイプＩのピリ線毛を発現するためである。この組換え体のＤＮＡサイズはＣＬＪ１１については約１８．５ｋｂである。この値は、挿入断片およびベクターＤＮＡ上の制限部位を用いる消化およびその後の連結により得られた。ＣＬＪ１０ ＤＮＡは約２５ｋｂであり、そしてＣＬＪ１２についてはそのＤＮＡは約３５ｋｂである。部分的ＤＮＡ配列がこれらの組換え体挿入断片については取得可能である。
【実施例３】
【００６４】
液相法を用いる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株からのＬＫＰピリ線毛の精製のためのプロトコール
【００６５】
一般的プロトコール
１． アンピリシンを含む３ｍｌのＬＢ培地中に組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を接種し、そしてＯＤ ５４０ｎｍの読み取り値が０．６〜０．８に達するまで３７℃で増殖させる（３〜４時間）。
２． その細胞懸濁物を５０ｍｌの培地に移し、そして５４０ｎｍでの読み取り値が０．８〜１．０に達するまで３７℃で増殖させる（４〜５時間）。
３． ２．８Ｌのフラスコ内の１Ｌの培地に５０ｍｌの細胞培養物を移し、そして５４０ｎｍの読み取り値が４．０〜５．０に達するまで３７℃で一晩（１６〜１８時間）増殖させる。
４． ５０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により細胞を回収する。
５． 細胞を５０ｎＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、中に再懸濁させ、そしてその懸濁物を室温に１時間維持させる。
６． 大カップでは１１０００ｒｐｍで、もしくは小カップでは１４０００ｒｐｍでオムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）を用い、氷上で３分間ブレンドする。
７． １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ８．０に滴定し、そして３時間室温に放置する。
８． １２０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離する。全ペレット重量を測定し、棄却する。
９． １０μｌのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを、各１００ｍｌの調製物に添加する。完全に混合させ、そして１０分間室温に放置する。
１０．数回緩衝液を交換しながら５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、に対して一晩透析する。この調製物のｐＨが一晩たっても５．０に達しない場合には、緩衝液を更に頻繁に交換しながら一層長時間の透析にかける。
１１．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃下で遠心分離させて蛋白質沈殿物およびピリ線毛結晶をペレット化させる。
１２．このペレットを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０、で元の約２５％の容積中に再懸濁させる。
１３．緩和に撹拌させながらＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＥＤＴＡをその調製物に添加して０．２％および５ｍＭの最終濃度を取得する。緩和に一晩、４℃で撹拌する。
１４．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃下での遠心分離により調製物を清澄化させる。１５．ＮａＣｌおよびＰＥＧ８０００を、各々０．５Ｍおよび３．０％の最終濃度になるまで添加し、次いで氷上で２時間、その調製物をインキュベートする。
１６．その調製物を１６０００ｒｍｐで６０分間、４℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化させる。
１７．ペレットを以前の容積の１／３の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中に再懸濁させる。少な目の溶液を用いると少な目のピリ線毛結晶が取得される。
１８．段階１３〜１７を反復する。
１９．ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中に再懸濁させる。物質の純度および量に依存して別法の可溶化および結晶化段階が必要に応じて継続されることがある。
【００６６】
精製中、各段階後には試料を採取し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてその試料の純度を検定する。暗視野顕微鏡アッセイが純度検定のための補助作業として必要とされる。ＵＶスキャニングを用いてＤＮＡもしくはＲＮＡによるいずれかの混入を決定することが必要とされる。
【００６７】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は２８０ｎｍに強い吸収を有するため、精製後にはＰＥＧおよびＮａＣｌによるピリ線毛の、一度もしくは複数回の結晶化により残存性Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を除去することは重要である。このことによりＵＶ法によりピリ線毛調製物の濃度を決定する際の、２８０ｎｍでのあいまいな読み取り値が回避される。
【００６８】
ＬＫＰ５ピリ線毛の精製
１． ５〜１０ｍｌ／トレーを用いて８０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ５．０、中に回収する。
２． 必要であらば調製物を６Ｎ ＨＣｌでｐＨ５．０に滴定する。
３． オムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）を用い、氷上で３分間ブレンドする（平均速度＝９８００ｒｐｍ）（大き目のカップ内では可能な場合には最高１１０００ｒｐｍまで、そして小カップでは最高１４０００ｒｐｍまで）。
４． ５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ９．０に滴定し、そして３時間室温に放置する。ｐＨ変化を避けるためには緩和に撹拌することが必要であることがある。全過程を通してｐＨをモニターし、そして必要があらば調節する。（培養物をブイヨン中で増殖させる場合には、ＮａＯＨの代わりに１Ｍ緩衝液（Ｔｒｉｓ）で滴定する）。
５． １５３００ｇで２０分間、４℃で遠心分離する。上清を清潔なボトルに移し、そして以前の要領で２度の清澄化を行う。全ペレットの重量を測定し、そして棄却する。
６． 上清のｐＨを８．０に調節し、そして１０μｌのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを各１００ｍｌの調製物について添加する。完全に混合させ、そして１０分間室温に放置する。
７． 数回緩衝液を交換しながら４０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、に対して一晩透析する。この調製物のｐＨが一晩たっても５．０に達しない場合には、緩衝液を更に頻繁に交換しながら一層長時間の透析にかける。
８． １８６００ｇで６０分間、４℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化させる（結晶は透明なピリ線毛については典型的ではない）。
９． ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、で、ラバーポリスマンを用いて元の約２５％の容積中に再懸濁する。４℃で緩和に数時間撹拌する（泡形成はさける）。必要であらば大きな塊を緩和なピペッティングで粉砕する。
１０．緩和に撹拌しながらＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（２％保存物）をその調製物に０．４％の最終濃度が取得されるまで添加し、そしてＥＤＴＡ（２５ｍＭ保存物）を５ｍＭの最終濃度になるまで添加する。４℃で一晩インキュベートする。
１１．１８６０００ｇで６０分間、４℃の遠心分離によりその調製物を清澄化させる。上清を清潔なフラスコに移す。
１２．上清のｐＨを１ＮのＨＣｌを用いて８．０以下に調節する。
１３．ＮａＣｌ（５Ｍの保存物）を０．５Ｍの最終濃度になるまで、そしてＰＥＧ（３０％の保存物）を３％の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で０．５時間
インキュベートする。暗視野で結晶についての調査を行う。必要であらば時間を延長させるが、ただしピリ線毛をＰＡＧＥに過剰露出させないことは重要であり、それは再溶解は時間が長くなるに連れてどんどん難しくなるためである。
１４．調製物を１８６００ｇで６０分間、４℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化させる。
１５．ペレットを４０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０、で洗浄して過剰なＰＥＧ／ＮａＣｌを除去する。その後に１８６０００ｇで６０分間遠心分離にかける（２度）。
１６．ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、中、以前の１／２の容積に再懸濁させる。かき回すこと、次いで緩和なピペッティングにより可溶化させる。試料をゲル上で泳動させて純度を検定する。必要であらば段階１７を続ける。
１７．調製物に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．４％の最終濃度が取得されるまで、そしてＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度になるまで添加し、次いで一晩４℃でインキュベートする（詳細については段階１０を参照されたい）。
１８．調製物のｐＨを、ＨＣｌを用いて８．０以下に調節する（７と８との間）。
１９．ＮａＣｌを０．５Ｍの最終濃度になるまで、そしてＰＥＧを３％の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で０．５時間インキュベートする（詳細については段階１３を参照されたい）。
２０．調製物を１８６０００ｇで６０分間、５℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化する。
２１．そのペレットを２５２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、中に再懸濁させてピリ線毛を可溶化させる（詳細については段階１６を参照されたい）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度の検定を行う。必要であらば段階２２を続ける。
２２．その調製物に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．４％の最終濃度が得られるまで、そしてＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度になるまで添加し、次いで一晩、４℃でインキュベートする（詳細については段階１０を参照されたい）。
２３．１８６０００ｇで６０分間、４℃の遠心分離により清澄化させる。
２４．ＮａＣｌを０．５Ｍの最終濃度になるまで、そしてＰＥＧを３＃の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で０．５時間インキュベートする（詳細については段階１３を参照されたい）。
２５．１８６０００ｇで１時間、４℃で遠心分離する。上清を棄却する。２６．ペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、中に再懸濁させる。物質の量および純度に依存し、別の可溶化／結晶化段階が必要に応じて続けられることがある。
【００６９】
精製過程中は、ペレット物質および上清を暗視野および／またはゲルおよび／またはスキャンによりモニターせよ。これまでの過程を再度繰り返す必要があることもある。
【００７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検定による純度：必要であらばＴｒｉｔｏｎ段階を反復するが、ただしピリ線毛がかなり喪失されるため、前のプロトコールにおけるＳＤＳ反応段階は回避されよ。
【実施例４】
【００７１】
ＨＰＬＣおよび他のカラム法によるＬＫＰピリ線毛の精製
洗剤抽出およびＰＥＧ沈殿以外では、ＬＫＰピリ線毛はＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、および他のカラム法により精製することもできる。これらの方法は特に未知のＬＫＰピリ線毛にとっては都合がよい。通常、ピリ線毛は最初に抽出および沈殿によりピリ線毛溶液が透明になるまで部分精製し、濃縮し、そして極少量にする。この調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定すると依然として純粋ではなく、カラム法が最上の適用法となるであろう。サイズ決定用カラムがこの目的に用いられることが好ましい。カラムにかける前には、ピリ線毛試料の更に進んだ精製のための処理が重要となる。ピリ線毛の部分精製のために用いられた洗剤を、透析もしくは他の既知の技術によりピリ線毛試料から除去すべきである。洗剤
はカラム分離能を有意に低下させる。サイズ排除カラムは少量の試料容積を必要とする。
【００７２】
ＨＰＬＣもしくはＦＰＬＣのためには５０μｌ〜２００μｌのロード容積が推奨され、そして他の日常的に実施されるＬＣゲル濾過カラムのためには試料のロード容積はそのカラムの長さおよびサイズに依存する。１ｍｌのピリ線毛試料が５０ｍｌの総容積のカラムにとっては好ましい。ピリ線毛は２８０ｎｍでの吸収が低いため、高目の感度のモニターが推奨される。カラムから溶離されて取得される蛋白質を２３０ｎｍでモニターすることができる。更に進んだ蛋白質の精製をＨＰＬＣにより実施することができる。精製用のカラム法もピリ線毛からのピリンの単離にとっては有用である。
【実施例５】
【００７３】
固相法を用いるＨｆｌｕ株もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株からのＬＫＰピリ線毛の精製のためのプロトコール
一般論として記載すると、組換え株は親株であるＨｆｌｕよりもピリ線毛構造蛋白質の発現量が大きくなるため、組換え細胞からピリ線毛を精製することは一層容易となる。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株は親であるＨｆｌｕと同様の様式でピリ線毛蛋白質を発現するという事実に起因し、Ｈｆｌｕもしくは組換え株からのピリ線毛桿状体の精製法は基本的には同一となる。Ｈｆｌｕ株の増殖にはチョコレートアガー培地および所定量のＣＯ２、および湿度が必要とされる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株の増殖は、アンピリシンを含むＬＢアガー培地を必要とする。
【００７４】
１． ５ｍｌ／トレーを用いて８０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ５．０、中で回収する。滑らかなガラスの縁を用いて湿潤細胞を掻爬し、次いでその細胞懸濁物をオムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）カップに移す。細胞の量が少なければ表面のみが形成され、湿潤細胞を回収するには培地表面の湿気を使用する。
２． 必要であらば調製物を２Ｍ酢酸緩衝液でｐＨ５．０に滴定する。
３． 氷上でオムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）を用い、１４０００ｒｐｍで３〜５分間ブレンドする。
４． １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に滴定し、そしてｐＨメーターによりｐＨ変化をモニターする。調製物が多数の湿潤細胞を含む場合にはＴｒｉｓ緩衝液の代わりに２．５もしくは５Ｍ ＮａＯＨでそのｐＨに滴定されることもある。ＮａＯＨを用いる場合には細胞の溶解を回避するよう注意する。その調製物を室温で３時間インキュベートする。
５． １２０００ｒｐｍで２０〜３０分間、４℃で遠心分離する。全ペレットの重量を測定し、そして棄却する。
６． 各１００ｍｌの調製物に１０μｌのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを添加する。完全に混合させ、そして１０分間室温に放置する。
７． 数回緩衝液を交換しながら５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、に対して一晩透析する。この調製物のｐＨが一晩たっても５．０に達しない場合には、緩衝液を更に頻繁に交換しながら一層長時間の透析にかける。
８． １６０００ｒｐｍで６０分間、４℃での遠心分離にかけて蛋白質沈殿物およびピリ線毛結晶をペレット化させる。
９． ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０、で元の約２５％の容積中に再懸濁させる。
１０．緩和に撹拌しながら調製物にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＥＤＴＡを、０．２％および５ｍＭの最終濃度が得られるまで添加する。４℃で一晩、緩和に撹拌する。
１１．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃の遠心分離により調製物を清澄化させる。
１２．ＮａＣｌおよびＰＥＧ ８０００を、各々０．５Ｍおよび３．０％の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で２時間インキュベートする。長さおよび直径を異にするＬＫＰピリ線毛は、異なった濃度のＮａＣｌおよびＰＥＧ中で結晶化することが
ある。従って異なるピリ線毛を結晶化させるためのＮａＣｌおよびＰＥＧについての濃度検査は重要である。
１３．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃での遠心分離にかけてピリ線毛結晶をペレット化させる。
１４．ペレットを以前の１／３の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中、にペレットを再懸濁させる。使用する溶液の量をより少なくすると、一層少量のピリ線毛結晶が取得される。
１５．段階１０〜１４を反復する。
１６．ペレットを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中に再懸濁させる。物質の純度および量に依存して別の可溶化および結晶化段階が必要に応じて続けられることがある。
【００７５】
精製中、各段階後には試料を採取し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて試料の純度を調査する。暗視野顕微鏡アッセが純度検定の補助作業として必要とされる。ＤＮＡもしくはＲＮＡによるいずれかの混入を見いだすにはＵＶスキャニングを用いることが必要とされる。
【００７６】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は２８０ｎｍに強い吸収を有するため、精製後にはＰＥＧおよびＮａＣｌによるピリ線毛の、一度もしくは複数回の結晶化により、その洗剤の残存物を除去するのが賢明である。このことによりＵＶ法によりピリ線毛調製物の濃度を決定する際の、２８０ｎｍでのあいまいな読み取り値が回避される。
【実施例６】
【００７７】
ＭＢＰ−Δ３’先端融合蛋白質の構築
ベクターｐＭＡＬ−ｐ２内ではＭＢＰ蛋白遺伝子とインフレームになっているであろう遺伝子融合物を、ＰＣＲプライマーを用いることによりｐＨＦ１からＬＫＰ１先端遺伝子の一部分を取得する目的で構築した。これらのプライマーは、その先端蛋白質の内の約１００アミノ酸からなるカルボキシル末端が欠失され、かつストップコドンで置換されるように設計されていた。この蛋白質のアミノ末端部分は、シグナル配列開裂部位に近い地点の適切な制限部位に関してはインフレームでＰＣＲ増幅されており、この部位は、他の細菌シグナル配列との類推およびその先端蛋白質の演繹アミノ酸配列の疎水性分布により決定された。この融合蛋白質のアミノ酸配列が図２に示される。この融合蛋白質のＬＫＰ先端蛋白質の部分配列に下線が施されている。
【００７８】
融合物の発現、精製、および抗血清産生
この蛋白質は、０．２ｍＭのＩＰＴＧでの誘導後に１００μｇ／ｍｌでのアンピリシンを含むＳＯＢブイヨン中、２８℃で増殖させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ｏｎｎｉｐＴ．ｌｏｎ Ｋ−１２株）内で発現させた。この細胞を遠心分離によりペレット化させ、そしてＰＢＳ中で一回洗浄した。この細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡおよび４００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、中、２０ｍｌ／リットル（元の培養物）の比率で再懸濁させた。この細胞をフレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）に３回通すことにより溶解させ、そして細胞破片を８倍×ｇで２０分間、４℃の低速の遠心分離により除去した。この上清を破壊に用いられたものと同一の緩衝液中で５倍に希釈し、そして１５ｍｌのベッド容積のアミロース樹脂カラムに、室温で１ｍｌ／分で通過させた。この溶解物をカラムに通して流した後に、このカラムをベッド容積の１５倍分の溶解用緩衝液で５ｍｌ／分で洗浄した。結合した物質を、１０ｍＭのマルトースを含む洗浄用緩衝液を用いて溶離させた。この溶離は、５０ｍｌの緩衝液を用いて１ｍｌ／分で実施し、そして溶出物を合わせた。得られる蛋白質混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）および抗−ＭＢＰ血清により分析し、そして融合物、破壊産物、および全長ＭＢＰが含まれることが見いだ
された。他の物質は殆ど検出されなかった。
【００７９】
この融合蛋白質、ＭＢＰ、および破壊産物は複合体として溶離された。マウスを１０μｇの用量の複合体で、１００μｇのＭＰＬをアジュバントとして用いて免疫化した。免疫化は皮下的に、第０、４、および６週目に実施され、そして第８週目にマウスからの全採血を実施した。陰性対照血清は、同一の精製および免疫化プロトコールを用いて精製されたＭＢＰに対して作製されたマウス抗−ＭＢＰ血清であった。
【００８０】
抗−ＧＳＴ血清
ＧＳＴ融合物は、完全なＬＫＰ先端遺伝子を用いて構築され、これはシグナル配列を含んでいた。この遺伝子を、インフレームでのｐＧＥＸ−３Ｘ内への挿入に適する制限酵素部位を有するＰＨＦ１からＰＣＲ増幅させ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内で発現させた。この細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピリシンを含むＳＯＢ中で増殖させ、そして０．２ｍＭのＩＰＴＧ、３７℃下で２時間誘導させた。この細胞を回収し、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次いでＰＢＳ中に再懸濁させ、そしてフレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）に通すことにより溶解させた。細胞破片を遠心分離により回収し、そして、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４を含む緩衝液で３回洗浄し、そしてこの封入体を遠心分離により回収した。この封入体を５ＭのグアニジンＨＣｌ中で可溶化させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。グアニジン濃度を透析により２．５Ｍにまで低下させ、そして可溶性封入体を４℃に保存した。抗血清は、調製用の１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動させ、そしてその融合物バンドをそのゲルから切り出すことにより作製した。アクリルアミド−蛋白質バンドをメスを用いて切り刻み、そしてＭＰＬ（１００μｇ）と混合させ、次いで第０、４、および６週目に３回マウスに注入した。第８週目にマウスからの採血を実施した。
【実施例７】
【００８１】
Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＬＫＰピリ線毛先端付着因子蛋白質の取り出し、精製、および同定
これは、Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＬＫＰピリ線毛からの先端接着因子蛋白質をピリ線毛桿状体の解重合なしに取り出すことができるということの最初の記述である。遊離の先端付着因子蛋白質を、透析および調製用電気泳動により単離および精製することができる。精製された先端付着因子を、構築された遺伝子融合蛋白質（これはＬＫＰ１先端遺伝子の一部分およびＭＢＰ（マルトース結合性蛋白質）遺伝子からのものである）からの抗血清によりウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）分析を用いて同定することができる。特異的結合が精製された先端蛋白質と融合蛋白質抗血清との間に検出され、このことにより、ＬＫＰ１ピリ線毛調製物から精製された蛋白質がＬＫＰ１先端付着因子蛋白質であることが明白に示される。
【００８２】
ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）ゴーストでの活性アッセイにより、精製された先端蛋白質は天然のゴースト調製物には結合するが、変性させたＲＢＣゴーストには結合しないことが示され、このことにより精製された先端蛋白質が生物学的機能を示すか、もしくは少なくとも部分的機能を示すことが示される。
【００８３】
ピリ線毛桿状体からの先端蛋白質の取り出し
１． 精製されたＬＫＰ１ピリ線毛を、５Ｍ ＮａＣｌを含む２００ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．０、中、室温で４〜６時間透析する。
２． 透析バッグを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０、中に移し、そしてピリ線毛調製物のｐＨがｐＨ８．０に達するまで数時間透析する。
３． そのピリ線毛調製物に０．１％の最終濃度になるまでＳＤＳを添加し、そして４℃で１０時間インキュベートする。
４． そのピリ線毛調製物を５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０、中で一晩透析する。
５． ピリ線毛凝集物を遠心分離により除去することができ、そして大半の遊離先端蛋白質は上清中に残ったままにまっている。
【００８４】
先端蛋白質は、ピリ線毛桿状体の解重合なしで２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中の２％ＳＤＳにより完全に取り出すことができるが、ＳＤＳはこの蛋白質の活性を損なうことがある。０．１％のＳＤＳのみでは約２０〜３０％の総先端蛋白質が取り出されるに過ぎないが、この蛋白質は生物学的活性を維持している。この結果は、ｐＨ２．０の緩衝液中の４Ｍ尿素および２Ｍ ＧｕＨＣｌが解重合なしでピリ線毛桿状体から先端蛋白質を部分的に取り出すことができることも示している。
【００８５】
先端蛋白質の精製
１． ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料処理用緩衝液と、濃縮させた先端蛋白質とを混合する。この比率は、０．３ｍｌの試料処理用緩衝液に対して２．５ｍｌのピリ線毛調製物である。
２． この試料を、０．８〜１．０ｃｍの濃縮用ゲルおよび５ｃｍのランニングゲルの長さを有するＰｒｅｐ−Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（０．１％ＳＤＳ）にかける。
３． このゲルを冷却システムを用いて３００ボルトで６〜８時間泳動させ、そして溶離を２８０ｎｍでモニターする。
４． 先端蛋白質を含む分画を合わせ、そして濃縮する。
５． 合わせた分画の純度をミニＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定する。抗−ＫＬＰ１−ＭＢＰ融合蛋白質による精製先端蛋白質の同定が図４に示される。精製された先端蛋白質の、ヒト赤血球細胞ゴーストとの結合性活性が図５および６に示される。図７はＳＤＳ／ＰＡＧＥによる様々なＬＫＰタイプのピリ線毛からの付着因子蛋白質を比較している。
【実施例８】
【００８６】
血清型分析
ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｈｆｌｕ）の細菌叢は、細菌相性もしくは細胞タイプの特殊化複合体であり、これは社会的に組織化されていて、ヒト細胞膜レセプターへの結合性のための特異的付着性決定基を保持する蛋白質付属物がＨｆｌｕの表面に発現され、かつ更に遊離形態でＨｆｌｕから分泌されることを促進させる。ピリ線毛は病原体細胞を脊椎動物宿主内に存在するよう適合させるが、それは宿主自体の蛋白質の機能を模倣させることによる。ピリ線毛機能には、多種多様の宿主細胞および組織に細菌を連結させること、ならびに細菌に有利になりかつ宿主に損傷を及ぼすように宿主の免疫系を刺激することが含まれる。ピリ線毛は大半の細菌性疾患における伝染、毒性、撒種、病原性、および免疫性の因子である。
【００８７】
ピリ線毛の発現は遺伝子スイッチングメカニズム、つまり相性の多様性により制御されており、各相でのピリ線毛発現およびピリ線毛タイプのスイッチは、その細菌に近接する環境における条件およびシグナルと共に変化しかつそれらにより決定される確立でオンおよびオフとなる。幾つかの条件下ではスイッチングの確立は細菌細胞分裂当たり１０−２という程、非常に高いものとなり得る。他の環境条件下では同一相性スイッチの確立は１０−６もしくはそれを下回ることがあり得る。相性スイッチングには、ピリ線毛オペロンのＤＮＡ内での可逆的および不可逆的再配列の両方が伴う。インビトロ増殖中の相性スイッチングにはピリ線毛オペロン遺伝子に対する欠失が伴うことが頻繁に生じ、その結果、非毛形成相性がその相に不可逆的に留まることとなる。
【００８８】
Ｈｆｌｕピリ線毛を様々な単離物から精製し、そして精製された調製物に対する抗血清
を産生することにより、これまでに独特なピリ線毛血清型が同定されている。Ｈｆｌｕ細菌叢の様々なピリ線毛発現相性を同定するためには様々な血清型の発現がマーカーとして用いられる。
【００８９】
【表１】
Ｌ＝１は＜０．２μの長さ
Ｌ＝２は＜０．２μ＜０．５μの長さ
Ｌ＝３は＜０．５μの長さ
Ｄ＝３は３ｎｍの直径（「薄型」）
Ｄ＝４は４ｎｍの直径（「厚型」）
【００９０】
各ＬＫＰ血清型の頻度は全型別可能血清型培養物、および全発現性培養物について単一発現体および多重発現体の両方におけるタイプを計測することにより決定した。２０の血清型の内の１６が典型的なＬＫＰ毛形成培養物であることが見いだされ、かつこれらの培養物の内の９０％は２０−タイプ系内で血清型の型別が可能であった。これらの培養物に
ついての血清型の頻度分布が表１に示される。
【００９１】
３つの異なるＬＫＰピリ線毛オペロン遺伝子が選択され、それらはピリン遺伝子、アンカー遺伝子、および付着因子遺伝子であり、これら全ての遺伝子は多重配列アラインメントにおいては様々な血清型の間で配列類似性を呈するが、ただしこれらはＨｆｌｕ ＬＫＰピリ線毛に特徴的でもあった。配列は、ＰＣＲ反応における使用のための、各遺伝子をフランクする適切なプライマー配列として作動するであろう遺伝子から選択された。
【００９２】
ＬＫＰピリン： ＨＦ２ ５′＞ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＡＡＧＣＣ＜３′
（配列番号１６）
ＨＦ１ ５′＞ＡＡＣＧＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＣＣＴＴ＜３′
（配列番号１７）
ＬＫＰアンカー（Ａｎｃｈｅｒ）：Ｒ５ ５′＞ＧＣＣＧＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＣＧ＞３′
（配列番号１８）
Ｒ３ ５′＞ＧＧＣＡＡＡＴＡＣＧＣＡＣＣＧＣＴＡＡＡＴ＞３′
（配列番号１９）
ＬＫＰ付着因子：Ａ５ ５′＞ＣＧＧＡＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡ＞３′
（配列番号２０）
Ａ３１ ５′＞ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＡＣＡ＞３′
（配列番号２１）
【００９３】
プライマーの全３対は合成され、かつＨｆｌｕ単離物から抽出されるＤＮＡのセグメントを増幅するためのＰＣＲ反応に用いられた。
【００９４】
検査されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株中のＬＫＰピリ線毛オペロンの存在を示すデータが表２に示される。
【００９５】
【表２】
１． ピリ線毛の長さ０は、非毛形成を意味する。
２． 長さ３は＞０．５ミクロンを意味する（最長、典型的なＬＫＰピリ線毛）。
３． ＨＡ＋はヒト赤血球細胞の赤血球凝集について陽性であることを意味する；典型的なＬＫＰピリ線毛。（これらの単離物は定義によると不応性ではない）。
４． ＨＡ−はヒト赤血球細胞の赤血球凝集について陰性であることを意味する；典型的なＳＮＮピリ線毛。（これらの単離物は不応性であり、それは全単離物が少なくとも一度は赤血球吸着したためである）。
５． ピリ線毛直径３は、その単離物がＳＮＮピリ線毛の典型的直径を有するピリ線毛を発現することを意味する。
６． ピリ線毛直径４は、その単離物がＬＫＰピリ線毛の典型的直径を有するピリ線毛を発現することを意味する。
７． 血清型分類可能は、その単離物が１〜２０の系内のＬＫＰピリ線毛タイピング用抗血清の内の少なくとも一つと、標準条件下で凝集することを意味する。
８． 血清型分類が可能ではないは、その単離物が１〜２０の系内のＬＫＰピリ線毛タイピング用抗血清の内のいずれのものとも凝集しないことを意味する。
【実施例９】
【００９６】
ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）アッセイプローブ構築のためのハイブリダイゼーションアッセイ
プラスミドｐＨＦ１（Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ６２−６５（１９８８））からの約１１００ｂｐの断片（これは、ＬＫＰ１血清型オペロンを含む）をＰＣＲにより、ｈｉｐＡ遺伝子の５’および３’末端でハイブリダイズするプライマーを用いて増幅させた。この遺伝子はＬＫＰ１ピリ線毛の先端付着因子蛋白質をコードする。ＰＣＲ反応には、ジゴキシゲニンラベル化させたｄＵＴＰと共にジゴキシゲニンでＰＣＲ反応産物をラベル化するための４つのｄＮＴＰが含まれていた。このプローブをアガロースゲル上で電気泳動にかけ、かつ約１．２ｋｂのバンドを切り出し、そしてＤＮＡを標準方法により抽出することにより精製した。このプローブを３０μｌの適切な緩衝液中に再溶解させた。
【００９７】
ハイブリダイゼーションアッセイ
１１のランダムに選択されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の臨床的単離物をＢＨＩ−ＸＶプレート上、３７℃、５％
ＣＯ２を用いて増殖させ、そして更にＢＨＩアガー上で画線培養させた。全単離物はＢＨＩ−ＸＶプレート上でのみ増殖し、このことによりそれらがＨ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）であることが示される。これらの単離物には、２つのＨｉｂ株および９つのＮＴＨｉが含まれていた。これらの株をＢＨＩ−ＸＶアガー上に置かれたナイロン膜上に接種した。他の呼吸器性病原体モラキセラ カタルラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の５つの臨床的単離物もそのフィルター上にスポットした。これらの細菌を一晩、３７℃、５％ＣＯ２中で増殖させた。増殖後に、２つのボルデテラ ペルツトゥシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）株をそのフィルター上にスポットした。フィルターを、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９９１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）の方法に従ってコロニーハイブリダイゼーション用の処理を施した。フィルターを、Ｇｅｎｉｕｓ（商標）システムについてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍにより記載される要領で、予備ハイブリダイゼーション用溶液中、６５℃で３時間遮断させた。コロニーの破片を湿ったペーパータオルで緩和にこすることにより除去した。プローブ３０μｌを５ｍｌの予備−ハイブリダイゼーション用溶液に添加し、そして１０分間沸騰させてＤＮＡを変性させた。プローブを即座にそのフィルターに添加し、そして一晩、６５℃でハイブリダイズさせた。フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２度、５分間／洗浄で、室温で洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で、１５分間づつ２度洗浄した。結合したプローブを、アルカリ性フォスファターゼでラベル化した抗−ジゴキシゲニン抗体を用い、製造業者により記載される要領で検出した。結果を表３に示す。
【００９８】
【表３】
【００９９】
このプローブはＨ．インフルエンザエに特異的であり、Ｍ．カタルラリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）もしくはＢ．ペルトゥシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のいずれともハイブリダイゼーションを示さない。
【０１００】
ハエモフィルス インフルエンザエのピリ線毛の分類不能株のハイブリダイゼーションアッセイ
異なる血清型のＬＫＰピリ線毛を発現する１０のＬＫＰピリ線毛発現性ＮＴＨｉ株と共にＨｉｂ Ｅａｇａｎを、チョコレートアガー上に重層させたナイロンフィルター上、３７℃、５％ＣＯ２中で増殖させた。これには追加的ＮＴＨｉ単離物も含まれていた。増殖後に２つの株はそのフィルター上で黄色に見え（このことにより、非−ハエモフィルス
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌であることが示唆される）、そのためそれらをＢＨＩおよびＢＨＩ−ＸＶ上での増殖により検査した。この実験により、それらが混入物であって、ＮＴＨｉではないことが示された。このフィルターをアガーから取り外し、そして先に記載の要領での処理を施した。第一実験からのプローブを再度沸騰させ、そして以前と同様にフィルターに添加したが、ただし例外は、ハイブリダイゼーション温度を６２℃に下げたことであった。このフィルターを先の要領で洗浄したが、ただし例外は、洗浄温度も６２℃であったことであった。結合したプローブは先の要領で検出された。結果が表４に示される。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
先に示される結果により、このＤＮＡプローブは選択的にハエモフィルス インフルエンザエに対してハイブリダイズすることが確認される。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】Ｈ．インフルエンザエの血清型１、４、および５のピリン遺伝子の保存領域のグラフ表示である（各々配列番号１−３）。
【図２】図２のＡ、Ｂ、およびＣは、それぞれＬＫＰ挿入断片を含むベクターの制限酵素消化により取得される物理的マップの概略図である。
【図３】ＬＫＰ１融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。下線は、マルトース結合性蛋白質に融合されたＬＫＰ先端付着因子蛋白質の部分的アミノ酸配列を示す。
【図４】ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットを行った膜上でＬＫＰ１先端付着因子−ＭＢＰという融合蛋白質との反応性を示す抗体によるＬＫＰ１先端付着因子蛋白質の同定を示すゲルの写真である。レーン１および２：先端蛋白質（４７Ｋｄ）を有する精製されたＬＫＰ１ピリ線毛の様々な調製物。（陽性反応が先端蛋白質と抗体との間に示された）；レーン３：先端付着因子（４７Ｋｄ）を有する精製されたＬＫＰ１０ピリ線毛（この先端蛋白質は抗体とは反応しない）；レーン４：先端蛋白質を有する精製されたＬＫＰ１１ピリ線毛（４７Ｋｄ）（この先端蛋白質は抗体とは反応しない）；レーン５：蛋白質分子量マーカーを示す。
【図５】ヒト赤血球細胞（ＨＲＣ）ゴーストに対するＬＫＰ１先端付着因子の結合性活性を示すゲルの写真である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：先端蛋白質を有する精製されたＬＫＰ１ピリ線毛；レーン３：ピリ線毛および遠心分離後のＨＣＲゴースト。先端蛋白質バンド（４７Ｋｄ）はゴーストペレットに対する先端付着因子ピリ線毛の結合に起因して消失した；レーン４：対照として用いられる遠心分離後のＨＲＣゴースト；レーン５：先端蛋白質を有さない精製されたピリ線毛（１％ＳＤＳで処理されたもの）を新鮮なゴーストと共にインキュベートしたところ、レーン３のパターンと同一の蛋白質バンドパターンが示された；レーン６：先端蛋白質を有さない精製されたピリ線毛を示す。ゲルにかける前にピリ線毛を１％ＳＤＳで処理し、２５ｍのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０、で徹底的に透析し、ＰＥＧプラスＮａＣｌによる結晶化を行い、そして２５ｍのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０、中に再溶解させた。
【図６】ヒト赤血球細胞ゴーストに対する精製されたＬＫＰ１先端付着因子蛋白質の結合性活性を示すゲルの写真である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：４７Ｋｄの分子量を有する精製された先端付着因子蛋白質（この蛋白質は１００ｍＭのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、ｐＨ２．０、中の０．１％ＳＤＳにより取り出した）；レーン３：精製された付着因子を新鮮なヒト赤血球細胞ゴーストと共にインキュベートし、そして遠心分離によりペレット化させた後に上清をゲルにかけた。この先端付着因子バンドはＨＲＣゴーストに対する結合に起因して消失した；レーン４：精製された付着因子を沸騰させたＨＣＲゴーストと共にインキュベートし、そして遠心分離によりペレット化させ、その後にその上清をゲルにかけた。この図により４７Ｋｄを有する付着因子バンドが示され、このことにより先端付着因子蛋白質はゴーストペレットには結合しないことが示される；レーン５：遠心分離後の新鮮なゴーストの上清。これが対照として用いられた；レーン６：沸騰させたＨＲＣゴーストの遠心分離後の上清（これは新鮮なＨＲＣゴーストのものとは異なる可溶性蛋白質パターンを示し、もう一つの対照として用いられた）；レーン７：新鮮なＨＲＣゴーストと共にインキュベートされた精製先端蛋白質の別の調製物（これは、先端蛋白質と新鮮なＨＲＣゴーストペレットとの間の結合を示した）；レーン８：沸騰させたＨＲＣゴーストと共にインキュベートされた精製先端蛋白質の別の調製物（この先端蛋白質は変性させたゴーストとは結合しないことが示された）。このゲルを銀染色した。
【図７】同一の分子量を有する別のＬＫＰタイプのピリ線毛からの付着因子蛋白質示すゲルの写真である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：ＬＫＰ１０ピリ線毛；レーン３：ＬＫＰ１１ピリ線毛、ならびにレーン４〜６：ＬＫＰ１ピリ線毛の異なる精製調製物。蛋白質は銀で染色した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、蛋白質をコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
分類不可能なハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）は主な非侵襲性ヒト呼吸器官病原体である。ＮＴＨｉは偏共生体として呼吸器官内に存在するか、あるいは局所感染（これには、中耳炎、気管支炎、副鼻腔炎、および稀には肺炎が含まれる）を生じることがある（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３参照）。ハエモフィルス インフルエンザエ（分類可能および分類不可能の両方）のヒト細胞への付着については数々の潜在的な粘着因子が既に記載されており、それらには４種類の線毛／ピリ線毛、およびボルデテラ ペルトゥシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の線維状赤血球凝集素との類似性を有する２つの高分子量蛋白質が含まれる（非特許文献４参照）。ピリ線毛は細菌性表面抗原である。これらは主要蛋白質（ピリン）サブユニットのらせん状対称構築物からなる蛋白質付属物である。幾つかのピリ線毛はその先端に会合している２〜３の微量蛋白質をも保持し得る。これらの蛋白質の内の一つである付着因子は、ヒトおよび動物の細胞上の特異的膜レセプターへのピリ線毛付着のための活性部位を保持している。
【０００３】
ある種のピリ線毛／線毛については既に広範な研究がなされており、それは長硬ピリ線毛（ｌｏｎｇ ｔｈｉｃｋ ｐｉｌｉ）（ＬＫＰ）ファミリーである。ＬＫＰピリ線毛は分類可能および分類不可能の両Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｈｉｂ）により発現される。このファミリーのピリ線毛は特徴的形態を有し、付着特異性は部分的に共有しており、かつそれらの構造蛋白質はアミノ酸配列を共有している。これらのピリ線毛は赤血球凝集陽性であり、かつヒト粘膜細胞に対する付着を媒介する（非特許文献５参照）。ヒト赤血球の赤血球凝集はＡｎＷｊ血液型抗原への結合を介して達成される一方で、上皮細胞への結合はシアル酸含有性ラクトシルセラミドレセプターを必要とする（非特許文献６参照）。
【０００４】
このＬＫＰファミリーは、精製されたピリ線毛に対して作製されたポリクローナル抗血清に対する反応性を基に、様々な株特異的血清型に分類されている。ピリ線毛血清型間では交差反応性は殆ど観察されていない（非特許文献７参照）。
【０００５】
細胞へのＨ．インフルエンザエによるＬＫＰピリ線毛−媒介性付着を阻害もしくは遮断することによりＨ．インフルエンザエ疾患を予防することができる。精製された無傷のＬＫＰピリ線毛はチンチラモデルではＮＴＨｉ中耳炎のための候補ワクチンであり、類似のピリ線毛血清型を保持するＮＴＨｉ株での攻撃誘発に対する防御を付与することが既に示されている（非特許文献８参照）。しかしながら、このような防御はピリ線毛特異的であるため、広範な防御のためにはワクチンは多価性であることが必要とされ、このようなワクチンには天然の病原体集団において最も頻繁に生じる血清型のピリ線毛が含まれる。ＬＫＰピリン構造遺伝子は数々のグループにより既にクローン化および配列決定されているが（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１および非特許文献１２参照）、ピリ線毛血清型１および４の原因となる遺伝子のみが同定されているに過ぎない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，Ｃ．Ｄ．、ａｎｄ Ｊ．Ｏ．Ｋｌｅｉｎ、Ｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ．、３５６（１９８３）
【非特許文献２】Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｓｔｏｏｌ ｅｄ．Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．
【非特許文献３】Ｍｕｓｈｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．９９：３４４−３５０（１９８３）
【非特許文献４】Ｓｔ．Ｇｅｍｅ，Ｊ．Ｗ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８７５−２８７９（１９９３）
【非特許文献５】Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９）
【非特許文献６】ｖａｎ Ａｌｐｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４４７３−４４７７（１９９１）
【非特許文献７】Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９）
【非特許文献８】Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ６２−６５（１９８８）
【非特許文献９】Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１７１６−１７２２（１９９１）
【非特許文献１０】Ｆｏｒｎｅｙ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１９９１−１９９６（１９９１）
【非特許文献１１】Ｋａｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９９０）
【非特許文献１２】ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ．８：３５３５−３５４０（１９８９）
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ピリ線毛血清型５についてのピリン遺伝子の単離、クローニング、および配列決定（図１）、完全なＬＫＰ１オペロンの配列決定（これは表５に示される）、ならびにＬＫＰ１０、ＬＫＰ１１、およびＬＫＰ１２のピリ線毛のクローニングに関する。本発明は更に、Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＬＫＰ、特に先端付着因子蛋白質を含む蛋白質をコードするＤＮＡ分子（本明細書ではＤＮＡ配列もしくは核酸配列としても引用される）にも関する。本発明は更に、ピリ線毛に関するハエモフィルス インフルエンザエのゲノムのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ分子にも関する。本発明のＤＮＡ分子は、ある試料（例えば、血液試料）をハエモフィルス インフルエンザエの存在についてアッセイするための方法に用いることができる。従って本発明は、診断法としての該ＤＮＡ分子の使用に関する。
【０００８】
本発明は更に、組換えハエモフィルス インフルエンザエのピリ線毛蛋白質、およびペ
プチド、特に先端付着因子蛋白質に関する。本発明の蛋白質もしくはペプチドを用いてポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体（これらはＨ．インフルエンザエ）ピリ線毛蛋白質との反応性を示す（例えば、結合する））を産生させることができ、かつ診断用アッセイに用いて例えば血液試料中のハエモフィルス インフルエンザエの抗体の存在を検出することができる。このような抗体は更に、受動免疫の方法でのワクチンとして用いることもできる。
【０００９】
本発明の蛋白質およびペプチドは更に、哺乳類（例えば、ヒト）をハエモフィルス インフルエンザエ感染に対して免疫化するための方法に、そしてそのため例えば中耳炎のようなハエモフィルス インフルエンザエの関連性疾患の予防のためのワクチンとして利用することもできる。具体的には、本明細書に示されるＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づき、哺乳類においてＨ．インフルエンザエに対する防御抗体を誘導することができる付着因子蛋白質もしくはペプチド、すなわちワクチンを構築することができる。
【００１０】
＜発明の詳細な記述＞
ハエモフィルス インフルエンザエ 血清型５ピリン遺伝子のクローニング、ならびに完全なＬＫＰ１オペロンの配列（配列番号４）および６つのオペロン読み取り枠についての推定アミノ酸配列（配列番号５〜１０）が今回初めて本明細書に記載される。表５に示されるようにＬＫＰ１オペロンは５つの個別の遺伝子からできており、それらはｈｉｐＰ（ピリン遺伝子）、ｈｉｐＣ（ペリプラズムシャペロン遺伝子）、ｈｉｐＲ（膜アンカー蛋白質）、ｈｉｐＭ（微量先端会合蛋白質遺伝子）、およびｈｉｐＡ（先端付着因子遺伝子）である。これら５つの遺伝子は、本明細書では、ｈｉｆＡ（ｈｉｐＰについて）、ｈｉｆＢ（ｈｉｐＣについて）、ｈｉｆＣ（ｈｉｐＲについて）、ｈｉｆＤ（ｈｉｐＭについて）、およびｈｉｆＥ（ｈｉｐＡについて）として称されることもある。ＬＫＰ１オペロン上にはインテグラーゼ遺伝子およびペプチダーゼ遺伝子も存在する。ＬＫＰ１オペロンのこれらの遺伝子によりコードされる蛋白質およびＬＫＰ５ピリン蛋白質は本明細書では包括的に、Ｈ．インフルエンザエ ピリ線毛蛋白質として称される。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載されるＨ．インフルエンザエ ピリ線毛蛋白質もしくはその生物学的活性断片をコードする単離された核酸配列および／または組換え体の核酸配列を包含する。本明細書に用いられる際には、核酸はＤＮＡおよびＲＮＡ、またはＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列、またはＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子と称される。本明細書で「単離された」と称される核酸は、それらの起源のゲノムＤＮＡもしくは細胞性ＲＮＡの核酸から分離された核酸であり（例えば、それが細胞中もしくは例えばライブラリーのような核酸の混合物中に存在する場合）、そしてさらなる処理が施されたものであってもよい。「単離された」核酸には、単離された核酸を取得するために当業者に知られる方法、および本明細書に記載された方法により取得された核酸が含まれる。これらの単離された核酸には、本質的には純粋な核酸、化学合成、生物学的合成と化学合成との組み合わせにより生成される核酸、単離される組換え核酸が含まれる。
【００１２】
本明細書で「組換え体」と称される核酸は組換えＤＮＡ法により産生された核酸であり、これには例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いるベクター内へのクローニングのような人工組換えの方法を頼みとする手法により作製される核酸が含まれる。
【００１３】
「組換え」核酸は更に、細胞の天然のメカニズムを通して生じる組換え現象から生じるが、ただし所望される組換え現象を可能にさせかつ有望なものにさせるために設計された核酸をその細胞内に組み込ませた後に選択される核酸でもある。
【００１４】
本明細書に記載されるＨ．インフルエンザエのＤＮＡ配列に実質的に相補的な核酸配列
（ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列）、および実質的核酸配列同一性に関してＤＮＡ配列を同定するのに十分な当業者に知られる緊縮性の条件下でこれらのＤＮＡ配列とハイブリダイズする核酸配列も本発明により包含される。このようなストリンジェントな条件下で同定されたＤＮＡ配列がＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質（本明細書では、ポリペプチドもしくはペプチド断片とも称される）をコードするかも知れないと予測することは理にかなっている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一般的記述が、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９８９、において論議されており、その教示事項は引用により本明細書に取り込まれる。例えばプローブの長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のパーセントミスマッチ百分率、温度、およびイオン強度のような因子は核酸ハイブリッドの安定性に影響を及ぼす。従って、さらなるＨ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ピリ線毛蛋白質を同定するに十分なストリンジェントな条件（例えば、高いストリンジェントな条件もしくは適度なストリンジェントな条件）は、他の未知の核酸を配列相同性について比較する既知のＤＮＡの特徴に部分的に依存して経験的に決定することができる。
【００１５】
本明細書に記載される際には「実質的に相補的な」は、その配列は例えば配列番号４の厳密な配列を反映する必要はないが、ただしストリンジェントな条件下で配列番号４とハイブリダイズするための配列の同一性の点では十分に類似している必要があることを意味する。例えば、非相補的は塩基または長目もしくは短目の配列を配列内に散在させることができるが、ただしその配列は例えば配列番号４に関してはその配列とハイブリダイズするに十分な相補性塩基を有する。
【００１６】
本発明のＤＮＡ分子が、機能的もしくは生物学的に活性なピリ線毛蛋白質をコードすることが好ましく、それらは例えばピリン遺伝子、ｈｉｐＰ；ペリプラズムシャペロン、ｈｉｐＣ；膜結アンカー白質、ｈｉｐＲ；先端会合蛋白質、ｈｉｐＭ、および最も好ましくは先端付着因子蛋白質、ｈｉｐＡである。「機能的であるかもしくは生物学的に活性な蛋白質」は本明細書では、有意な同一性（例えば、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％）を内因性蛋白質の対応配列と共有し、かつその機能の内の一つもしくは複数を保持する蛋白質として特定される。Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の生物学的機能には、抗原性、構造性、および付着特性が含まれる。例えば、Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ６２−６５（１９８８））に記載されるように（この教示事項は引用により本明細書に取り込まれる）、ピリ線毛蛋白質は粘膜細胞および赤血球細胞に付着することを示すことができる。従ってこのような付着特性は生物学的活性の測定対象となり得る。生物学的活性は、その蛋白質もしくはペプチドの抗原性（これはピリ線毛蛋白質に結合する抗体の産生をもたらす）を含むことができることも、本明細書に記載される。
【００１７】
本発明のＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質は具体的には、ＬＫＰ１オペロンの蛋白質および血清型５ ｈｉｐＰピリン蛋白質、ならびにそれらの配列に類似するアミノ酸配列を有する蛋白質を含むことが理解される。このような蛋白質は本明細書では、Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質アナログもしくは誘導体として特定される。「類似のアミノ酸配列」は本明細書では、先端付着因子の生物学的活性を保持するのに十分な、例えばＬＫＰ１先端付着因子蛋白質とのアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を意味するように特定される。先端付着因子の生物学的活性は例えば、ヒトおよび動物の細胞上の特異的膜レセプターに結合する先端付着因子の能力を含むことができる。例えば、アミノ酸配列内に「サイレント」変化を保持し、そのアミノ酸配列では一つもしくは複数のアミノ酸残基がＬＫＰ１付着因子のアミノ酸残基とは異なりはするが依然として付着活性を保
持するアナログポリペプチドを作製することができる。そのような差異の例には、例えば配列番号９への残基の添加、欠失、もしくは置換が含まれる。本発明のピリ線毛蛋白質の低目もしくは高目の生物学的活性を呈する類似蛋白質も本発明に包含される。
【００１８】
本発明は更に、本明細書に記載されるＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の生物学的に活性な蛋白質、もしくは生物学的に活性な断片をも包含する。このような断片はピリ線毛蛋白質の全長アミノ酸配列の一部分を含むにすぎないが、依然として生物学的活性を保持することができる。このような断片は、アミノ−およびカルボキシル−末端欠失、ならびに内部欠失により作製することができる。このようなペプチド断片を、本明細書に記載される生物学的活性について検査することができる。従って、機能的、もしくは生物学的に活性な蛋白質は、一つもしくは複数のアミノ酸が予め置換、欠失、もしくは添加されている内因性蛋白質の突然変異体もしくは誘導体を含む。その蛋白質の活性断片もやはり本発明に含まれる。先に記載されるＨ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質は機能的もしくは生物学的に活性なピリ線毛蛋白質を含み、それらの例は、ピリン構造蛋白質、ｈｉｐＰ；ペリプラズムシャペロン、ｈｉｐＣ；膜アンカー蛋白質、ｈｉｐＲ；先端会合蛋白質、ｈｉｐＭ；および最も好ましくは先端付着因子蛋白質、ｈｉｐＡである。
【００１９】
本発明は更に、天然に見いだされるピリ線毛蛋白質には生じることのない第二部分に連結された、本明細書に記載されるピリ線毛蛋白質（本明細書では第一部分として引用される）を含む融合蛋白質にも関する。従って、この第二部分は単一のアミノ酸、ペプチド、もしくはポリペプチドであることができる。この第一部分は、その融合蛋白質にとってのＮ−末端の位置、Ｃ−末端の位置、もしくは内部に存在することができる。ある態様では、この融合蛋白質はピリ線毛蛋白質、ならびにマルトース結合性蛋白質（ＭＢＰ）（配列番号１１）もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のいずれかを含む。
【００２０】
本発明のＤＮＡ配列を、適切な宿主細胞内での本明細書に特定される機能的Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質の発現に適するプロモーターの制御下でのインビトロもしくはインビボでの細胞の感染、トランスフェクション、もしくは形質転換のための組換え構築物に用いることもできる。このような組換え構築物は本明細書では発現ベクターとも称される。例えば、あるＤＮＡ配列を、例えばｐＵＣ１９のような適切な発現ベクター内に組み込まれる適切なプロモーター（例えば、構成性プロモーターもしくは誘導性プロモーター、あるいは内因性プロモーター）に機能的に連結させることができ、これをその後に適切な宿主細胞内に組み込ませる。この構築物は更に、一つもしくは複数の選択マーカー（例えば、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａｃ、ｈｙｇ、およびｈｉｓｄ）、あるいは一つもしくは複数の異なる抗原、または治療用蛋白質を含むことができる。
【００２１】
この構築物を先に記載されるいずれかの適切な手段、例えばリン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、電気穿孔法、もしくは感染（例えば、感染性レトロウイルス、ヘルペス、ワクシニア、もしくはアデノウイルスベクター）により組み込ませることができる。宿主細胞は真核生物もしくは原核生物の細胞であることができる。適切な細胞には、細菌性（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））もしくは哺乳類の細胞が含まれる。哺乳類細胞には、初代体細胞（例えば、上皮細胞、繊維芽細胞、表皮細胞、マクロファージ、もしくはＴ細胞）または不滅化細胞株（例えば、ＨｅＬａもしくはＨＴ１０８０）が含まれる。その後に組換え宿主細胞を培養し、そして場合によっては適切な条件下でのインビトロでの選択を行ってその蛋白質の発現をもたらすことができる。別法では、その細胞をインビボ発現のために動物（例えばヒト）内に移植もしくは注入することができる。
【００２２】
ある態様では、本発明はＬＫＰタイプピリ線毛産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え体に関する。このような組換え体が既に、本明細書に記載される要領でハエモフィルス イ
ンフルエンザエから構築されている。これらの単一血清型組換え体は、容易に精製可能な大容量でピリ線毛を産生した。これらは植え継ぎの際に相性変化を生じたり不応性を示したりはせず、かつ液体培地中では良好なピリ線毛収率を示す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）として増殖することができた。それらから増殖および精製した単一血清型のピリ線毛調製物は、親Ｈ．インフルエンザエ （Ｈｆｌｕ）株におけるものと同一のピリ線毛を含み、かつ他のＨｆｌｕ抗原は全く含んでいなかった。これらの調製物は、後続の多価ワクチンへの混合のために、純度、同一性、濃度、および力価についての標準化が容易であり、かつワクチン製造業者にとってピリ線毛を産生するための効率の良い手法を提供する。本明細書に記載される要領で、単一型産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換えワクチン株が既にＬＫＰ１０、ＬＫＰ１１、およびＬＫＰ１２血清型について構築されている。
【００２３】
個別のプラスミド上に２つのオペロンを含む多重血清型組換え体も既に構築されている。これらの株の単一コロニーは２つの血清型のピリ線毛を良好な量で同時に発現した。しかしながらこれらの株はインビトロ継代の際に急速にピリ線毛発現を消失する傾向にあるという点で不安定であり、これは恐らく用いられたプラスミドが不適合であるためと思われる。この２つのオペロンが２つの適合性プラスミド上に存在する場合には、これらの株は一層安定となることが予期される。安定かつ高産生性の二重発現性組換え株を使用することで、必要とされるワクチン株数を半分に削減することにより、ワクチン使用に適する蛋白質の産生を簡潔化することができるだろう。
【００２４】
様々な血清型のＨｆｌｕ ＬＫＰピリ線毛のための良好な産生法、濃縮法、および精製法が既に開発されており、そして本明細書に記載されている。ピリ線毛を、Ｈｆｌｕ培養物からのピリ線毛の精製のために記載される要領で、Ｈｆｌｕピリ線毛を産生する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え体培養物から精製することができる。固相および液相の両発酵法がこれまでに用いられている。好ましい方法には、回収された細菌からのピリ線毛の機械的取り出し作業および遠心分離による細菌性細胞からの分離が含まれる。ピリ線毛には、無傷のピリ線毛桿状体の縦方向の凝集（結晶化）（ただし可溶性不純物は、その結晶の遠心分離により除去される）およびその後のそのピル結晶の遊離のピル桿状体への可溶化（ただし粒子性不純物は、遠心分離により除去される）という別の周期により濃縮および更に進んだ精製が施される。産生／精製過程の各段階は、各ピル血清型について至適化させた。今日までに１９の異なるＬＫＰ血清型が既に精製されている。
【００２５】
分析的および工業的な実用性を有する別のピリ線毛精製法も既に開発されている。適切な溶媒およびカラム条件を用いることにより、無傷のピリ線毛をサイズ調製カラム、疎水性カラム、もしくはイオン交換カラムでのＨＰＬＣもしくはＦＰＬＣにより混入性蛋白質から精製し出すことができる。これらの方法も、工業的産生性の拡大を可能にすることができる。
【００２６】
無傷のＬＫＰピリ線毛から出発する個々のピリ線毛蛋白質のための精製法も既に開発されている。他のピリ線毛遺伝子とのピリ線毛遺伝子配列の多重配列アラインメントから演繹したところ、Ｈｆｌｕ ＬＫＰピリ線毛構造蛋白質には、ピリン、小先端微量蛋白質、および巨大先端微量蛋白質が含まれる。この巨大先端微量蛋白質は「付着因子」として称されるが、それはその蛋白質がヒト赤血球細胞に対する既知のＬＫＰピリ線毛付着特異性を有するためである。しかしながら他のピリ線毛ファミリーとの類似性によると、他の２つのＬＫＰピリ線毛構造蛋白質も、未だ知られていないヒトレセプターに対する特異性を有する付着因子であってもよい。ＬＫＰピリ線毛のピリンおよび付着因子の両方共が既に生物学的活性形態で精製されている。
【００２７】
ピリンは、微量先端蛋白質の除去および分子サイズ調製用カラムでの微量物質からの桿状体の分離により、会合した桿状体形態で精製される。会合形態ではピリン単位は無傷の
ピリ線毛の抗原特異性を保持しており、この特異性は、そのピリ線毛桿状体の外側表面上のピリンサブユニットの露出表面抗原決定基により付与される。ピリン桿状体は多価ワクチン特異性と同等の効率を示すことが予期されるが、それは無傷のピリ線毛は、純度が一層高いという利点を有しかつ副作用が低下している可能性があることがあるためである。
【００２８】
ＬＫＰ１１の付着因子が既に単離されており、そして活性かつ可溶性形態で精製されている。ＬＫＰ１１ピリ線毛から付着因子を除去すると、ヒト赤血球細胞に結合するピリ線毛の能力が消失する。純粋形態では、付着因子はヒト赤血球細胞膜に結合することができる。ＳＤＳゲル上の付着因子バンドを、付着因子の断片とマルトース結合性蛋白質とを含んでなる融合蛋白質に反応性を示す抗体によりラベル化する。精製されたＬＫＰピリ線毛付着因子は、付着因子遮断用もしくは除去用の抗体を誘導することが可能なワクチン構成成分としての利用性を有することがある。ＬＫＰ１１付着因子はウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット上ではＬＫＰ１付着因子とは抗原的には交差反応を行わなかった。従って、３つの異なるＬＫＰ付着因子について見いだされた見かけ上の分子量のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル類似性からは、この限定的２血清型検査における抗原類似性は予知されなかった。遊離付着因子を、中耳炎のワクチンとしての効率について、および付着因子遮断用抗体を誘導するそれらの能力について検査することができる。この融合蛋白質に対する抗血清（これを用いてウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット上で付着因子バンドをラベル化する）は赤血球細胞への付着を遮断しなかった。
【００２９】
本発明の単離された組換え蛋白質を哺乳類に投与して、その哺乳類をＨ．インフルエンザエの感染から防御するか、もしくは治療することができる。単離された組換えピリ線毛蛋白質をワクチン組成物に製剤することができ、これは例えば米国特許第５，３３６，４９０号（この教示事項は引用により本明細書に取り込まれる）に記載される要領で実施される。この蛋白質は感染性構築物、好ましくは複製不全性であるかもしくは弱毒化されたウイルス構築物を介して投与することもできる。別法では、この蛋白質を、インビボでその蛋白質を発現するであろう組換え宿主細胞（例えば、哺乳類細胞）を介してか、あるいは薬剤学的に許容される担体内で投与することができる。特に組換えＬＫＰ１先端付着因子蛋白質、その生物学的活性断片、もしくは融合蛋白質を、哺乳類中での抗体の産生を誘導するためのワクチン組成として用いることができる。そのような抗体が、その哺乳類をＨ．インフルエンザエ感染症の疾患から防御することができるということを予期することは理にかなっている。
【００３０】
このワクチン組成物は、Ｈ．インフルエンザエの感染からの防御を付与するに十分な血中抗体レベルを達成するための期間にわたり、一回量もしくは一回を上回る量で投与されることがある。
【００３１】
適切な薬剤学的担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース、もしくはスターチ）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘着性パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）が含まれるが、これらには限定されない。薬剤学的調製物を滅菌し、そして望ましくは補助剤（例えば、滑沢剤、保存料、安定剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、および／または芳香族性物質などであることができる（これらは活性物質とは有害な反応を生じない）。これらは所望される場合には、代謝分解を減少させるための他の活性物質（例えば、酵素阻害剤）と組み合わせることもできる。
【００３２】
非経口的適用のためには、注入用滅菌溶液、好ましくは油性もしくは水性の溶液、ならびに懸濁液、乳液、もしくは座薬を含む移植片が特に適切である。アンプルは簡便な単位用量である。
【００３３】
投与の様式は当業者に知られており、それは例えば、非経口投与、経口投与、もしくは鼻内投与であるか、または細胞性移植片である。
【００３４】
特定の症例における蛋白質の実質的有効量は、例えば、利用される特定の化合物、製剤される具体的な組成物、投与の様式、ならびに患者の年齢、体重、および症状によって変化するであろうことが認識されるであろう。本明細書で用いられる場合には、蛋白質の有効量は、Ｈ．インフルエンザエの感染からの防御を提供するに十分なレベルに哺乳類内の抗体レベルを上昇させることができる蛋白質の量である。個々の患者のための用量は、通常の考慮法を用いて当業者により決定され得る（例えば、適切な通常の薬理学的プロトコールによる）。
【００３５】
本発明のＤＮＡ分子および蛋白質をインビトロ診断用アッセイに用いて、生物学的試料中のＨ．インフルエンザエの存在を検出することができる。ある態様ではＤＮＡ分子もしくはその断片を、ある試料（例えば、哺乳類（例えば、ヒト）からの血液試料）中のハエモフィルス インフルエンザエを検出するためのアッセイにおけるプローブとして用いることができる。このようなプローブは、それらが標的配列（例えば、Ｈ．インフルエンザエのピリ線毛蛋白質）に特異的に結合するように設計することができる。
【００３６】
ある態様では、ＤＮＡプローブはＨ．インフルエンザエのゲノムの血清型保存領域のヌクレオチド（例えば、先端付着因子蛋白質をコードするヌクレオチド）を含むことができる。その標的配列に特異的に結合するためには、そのプローブは所望される特異性を提供する（すなわち、その試料中のランダム配列にハイブリダイズすることを回避する）に十分な長さのものである必要がある。ハイブリダイゼーションが可能なＤＮＡ分子は好ましくは少なくとも約４００のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０００のヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約１２００のヌクレオチドを含む。例えば、ＤＮＡ分子は、おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド７０００〜７４００の間の少なくとも約４００ヌクレオチドを含むことができる。このＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、ハエモフィルス インフルエンザエのゲノムの対応配列と、好ましくは少なくとも約７０％の相同性、より好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を共有する。
【００３７】
具体的には、本発明のＤＮＡ分子は、Ｈ．インフルエンザエのゲノムの血清型保存領域にハイブリダイズすることが可能である。特に好ましい態様は、先端付着因子蛋白質をコードするＨ．インフルエンザエの領域とハイブリダイズするＤＮＡ分子である。例えば、ＤＮＡ分子は、血清型１の先端付着因子蛋白質をコードする遺伝子、好ましくはおおまかには配列番号４の内のヌクレオチド６９５５〜８２６５の間に記載される配列にハイブリダイズすることが可能である。ある態様では、ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される緊縮条件下で、そのゲノムにハイブリダイズすることが可能である。このハイブリダイゼーションアッセイは、既知のハイブリダイゼーション方法（例えば、本明細書に記載されるようなもの）を利用ことで実施することができる。このプローブは例えば当該技術分野における既知のラベルを利用して検出用にラベル化することができ、それらのラベルには、酵素、染料、抗体、および放射性活性ラベルが含まれる。このプローブは固体支持体（例えば、膜）上に固定化されることが好ましい。
【００３８】
別法では、このＤＮＡ分子は、ハエモフィルス インフルエンザエのゲノムの非保存領域にハイブリダイズするように選択することができる。例えば、ピリン蛋白質をコードする遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡ分子を利用することができる。このようなアッセイは、試料中のハエモフィルス インフルエンザエの個々の血清型の存在を検出することができる。
【００３９】
このアッセイに供することができる試料は、ハエモフィルス インフルエンザエを含むか、もしくはそれが混入しているいずれかの試料であることができる。このような試料の例には、血液試料、鼻咽頭試料、もしくは耳吸引液が含まれる。
【００４０】
従ってこのアッセイを被検体（例えば、哺乳類（例えば、ヒト））のハエモフィルス インフルエンザエによる感染の検出のための診断法として用いることができる。このアッセイを用いて更に、ある物質（例えば、食品、医薬品、もしくは生物学的物質）のハエモフィルス インフルエンザエによる混入の存在を検出することもできる。
【００４１】
他の態様では、この蛋白質を、ある試料（例えば、血液試料）におけるハエモフィルス
インフルエンザエの感染を検出するためのアッセイに用いることができる。例えば、病原体のピリ線毛を、本明細書に記載される技術を利用して、その試料から単離するか、もしくは組換え的に産生させることができる。その後にピリ線毛の内の一つもしくは複数の蛋白質、またはその断片の配列を決定することができる。その配列を、配列番号４の対応蛋白質配列（一つもしくは複数）に対して整列させ、そして比較を行うことができる。例えば９０％を上回る相同性は、その試料中の病原体の存在（つまり、感染）を表す。
【００４２】
ピリ線毛蛋白質もしくはその断片（例えば、ペプチド断片）を免疫アッセイ、具体的にはＥＬＩＳＡに用いて、生物学的試料（例えば、血液、血清、もしくは組織）中の抗体の存在を検出することもできる。このような免疫アッセイは、ＬＫＰピリ線毛蛋白質もしくはペプチド断片に結合する抗体を検出するために完全に確立された技術を用いて当業者により容易に実施され得る。
【００４３】
ピリ線毛蛋白質もしくはその断片（本明細書ではペプチドもしくはペプチド断片としても引用される）を用いて、本明細書に記載されるピリ線毛蛋白質との反応性を示す抗体を産生することもできる。用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を包含することが意図される。ポリクローナル抗体は当業者に知られる技術を用い、未精製であるかもしくは精製されたピリ線毛蛋白質の調製物で動物を免疫化することにより調製することができる。ピリ線毛融合蛋白質も免疫化に用いることができる。モノクローナル抗体は当業者に知られる技術を用いて調製することができる。これらの抗体を診断用アッセイに用いて、先に記載される生物学的試料中のＨ．インフルエンザエの抗体の存在を検出することができる。
【００４４】
本発明は、以下の実施例により更に具体的に説明される。
【実施例１】
【００４５】
ＬＫＰおよび５ ｈｉｐＰ遺伝子、およびＬＫＰ１オペロンのクローニングおよび配列決定
材料および方法
【００４６】
細菌株およびプラスミド
既に記載されており、各々ＬＫＰ血清型１、４、および５を発現するＨ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株Ｐ８６０２９５、Ｐ８６１２４９、およびＰ８６０６８８（Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９）が利用された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＢ３９２（Ｋａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９８０））およびＨＢ１０１が組換えプラスミドのための宿主として用いられ、そして株ＤＨ５−αがβ−ガラクトシダーゼ α−ペプチドの相補性に関わるクローニング段階のために用いられた。Ｈｆｌｕを、１０μｇ／ｍｌのヘミン（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および２μｇ／ｍｌのＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ社）を含むブレインハートインフュージョン（Ｄｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）中、３７℃で増殖させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨン（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．、２０３（１９７２）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）中、３７℃で増殖させた。適切である場合には抗生物質を以下の濃度で用いた：アンピリシン（Ｓｉｇｍａ社）１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ社）
２５μｇ／ｍｌ、およびクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ社）２０μｇ／ｍｌ。
【００４７】
既に記載されている、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でＬＫＰ１ピリ線毛を発現するプラスミドｐＨＦ１の構築および特性（Ｋａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９９０））を利用した。プラスミドｐＰＸ５５１は、ＢａｍＨＩ部位内に挿入されたｐＨＦ１の１．９ｋｂのＸｈｏＩ断片を含むｐＵＣ１８誘導体である。ｐｅｐＮ遺伝子座を喪失しているｐＨＦ１の欠失クローンは本文中に記載される要領で構築された。ＬＫＰ４ピリン構造遺伝子を、以下の配列、すなわち：その遺伝子の５’末端については５′ＧＴＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣＡＴＴＡＧＧ３′（配列番号１２）および３’末端については５′ＴＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧ３′（配列番号１３）を有するプライマーを用いるＰ８６０２９５染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅により単離した。この５’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（配列中、下線が施されている）を含んでおり、かつ３’プライマーはＥｃｏＲＩ部位（やはり下線が施されている）を含んでいた。このＰＣＲ産物を、製造業者の指示事項によりｐＣＲ１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、ＣＡ）内にクローン化した。このＬＫＰ４構造遺伝子は、４つ全てのｄＮＴＰの存在下でクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いてＥｃｏＲＩ部位の平滑化を行い、そしてＡｓｐ７１８Ｉ（一つのＡｓｐ７１８Ｉ部位がこのベクター中に存在する）で切断して、その断片を放出させることによりサブクローン化させた。ＬＫＰ４遺伝子をＨｉｎｄＩＩ−Ａｓｐ７１８Ｉで切断させたｐＰＸ１９１（ｂｌａ遺伝子がｐＡＣＹＣ１８４からのｃａｔ遺伝子により置換されているｐＵＣ１９の誘導体（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．、ａｎｄ Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６（１９７８））内に連結させてｐＰＸ６０２を作製した。
【００４８】
ＬＫＰ５ピリン構造遺伝子を、以下のプライマー、すなわち：５’末端については５′−ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＣＴＴＴＡＧ（配列番号１４）および３’末端については３′−ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＡＡＧＣＣ（配列番号１５）を用いるＰＣＲにより単離した。約１ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）内にクローン化させ、そしてそれをそのベクターのフランクＥｃｏＲＩ部位を用いて作製されたＥｃｏＲＩ末端のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）処理による平滑末端断片としてサブクローン化させた。このＬＫＰ５ピリン遺伝子をプラスミドｐＰＸ１９１内にサブクローン化させ、そして配向を制限分析により決定した。ＬＫＰ５サブクローンをｐＰＸ６０５として保存した。
【００４９】
他のＬＫＰ血清型をコードするｈｉｐＰ遺伝子のクローニング
ｈｉｐＰ遺伝子座がコードする血清型４および血清型１ ＬＫＰ遺伝子が既に記載されている（Ｋａｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：９０３−９０８（１９９０）；ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ．８：３５３５−３５４０（１９８９））。ｈｉｐＰ遺伝子内に位置するＬＫＰピリ線毛の血清型特異性を決定するためにＰＣＲを用いて、これらのピリ線毛を発現するＮＴＨｉ株から血清型４および５のピリ線毛ンをクローン化した。ＬＫＰ４ピリン遺伝子についてのＰＣＲ産
物を先に記載される要領でｐＰＸ１９１内にクローン化させ、そしてｌａｃプロモーターの制御下で発現させる。ＬＫＰ５が発現するＨｆｌｕ株からのｈｉｐＰ遺伝子を記載される要領でＰＣＲにより単離させ、そしてｌａｃ制御下での発現のためにｐＰＸ１９１内にクローン化させた。
【００５０】
オリゴヌクレオチド合成
ＰＣＲ増幅およびＤＮＡ配列決定のためのプライマーとして用いられた合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）３０８ｂ ＤＮＡ合成機上、ｂ−シアノエチルホスホルアミダイト化学法（Ｓｈｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：４５３９−４５５７（１９８４））を用いて合成された。
【００５１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
ＬＫＰ４ ｈｉｐＰおよびＬＫＰ５ ｈｉｐＰピリン遺伝子を各々ＮＴＨｉ株Ｐ８６１２４９およびＰ８６０６８８からＰＣＲにより、標準的ＰＣＲ増幅プロトコールを用いて増幅した（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８））。
【００５２】
ＤＮＡ配列決定
プラスミドｐＰＸ５５１上に含まれるｈｉｐＰ遺伝子およびプラスミドｐＨＦ１上に含まれる完全なＬＫＰ１オペロンは、標準的Ｍ１３配列決定用プライマー、ならびに重複性センスおよびアンチセンスプライマーを用いて配列決定した。全てのＤＮＡ配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上、ＡＢＩからのＴａｑサーマルサイクリング（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇ）ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定用キット（ｐａｒｔ ＃９０１４９７）を利用して実施された。ＬＫＰ４およびＬＫＰ５血清型の配列決定は、ＰＣＲ増幅プライマーおよびＬＫＰ１配列決定研究に基づく内部合成プライマーを用い、ＰＣＲ産物から直接実施した。
【００５３】
８ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、７０ｍｍ×１００ｍｍのミニゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−６８５（１９７０））の方法を用いて実施した。試料を試料調製用緩衝液中のβ−メルカプトエタノールもしくはＤＴＴで還元し、そして５分間沸騰させた。ゲルを１５０Ｖの定電圧で泳動させた。分離された蛋白質をクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブリリアントブルー Ｇ−２５０（Ｓｉｇｍａ社）での染色により検出した。
【００５４】
ピリ線毛の部分精製
ＬＫＰピリ線毛を既述の方法に従い、ｐＨ差溶解性を用いて精製した（Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｃ．Ｃ．Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８ Ｓｕｐｐｌ．：５４−６１（１９８９））。簡潔に記載すると、毛形成細菌を遠心分離により液体培養物から回収し、そしてリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２、中で２度洗浄した。この細菌ペレットを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭ トリス、ｐＨ１０．３、中に、４ｍｌ（緩衝液）／ｇ（細胞の湿潤重量）の比率で再懸濁させた。Ｏｓｔｅｒミニブレンダー中での３回の３分間バースト（４℃）でブレンドすることによりピリ線毛を剥ぎ取った。細菌の破片を遠心分離により分離させ、そして棄却した。この上清を５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、に対して一晩透析させてピリ線毛を沈殿させ、かつ他の蛋白質を変性させた。このペレットを１５，０００×ｇ、４℃での遠心分離により回収し、そして５０ｍＭの０．０１Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１０．４、中に、緩和に震盪させなが
ら一晩溶解させた。酸沈殿および塩基性緩衝液中での可溶化からなるこの周期を更に２回繰り返した。その後に最終的酸ペレットを０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ１０．４、中に再溶解させ、そして非溶解性物質を棄却した。この可溶性分画を部分精製ピリ線毛として引用した。
【００５５】
ＬＫＰ１オペロンの配列
ＬＫＰ１オペロンの配列決定は既述の要領で実施し、そして完全な配列を配列番号４に示す。配列分析によりＬＫＰオペロン中に６つの可能な読み取り枠（ＯＲＦ）が同定され、これらにはｈｉｐＰ（おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド１８８２−２５３２）およびｈｉｐＣ（おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド２８５４−３６３０）の遺伝子が含まれる。このＬＫＰオペロン中の６つの全ＯＲＦは、蛋白質の多重配列アラインメントにより特定したところ、ピリ線毛スーパーファミリー中の同等のピリ線毛オペロン遺伝子に相同であることが同定された。配列アラインメントの分析も、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＥｎｔｒｅｚ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ １０．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて実施した。得られるアミノ酸配列（各ＯＲＦについてものの）が表５（配列番号５〜１０）に示される。各読み取り枠についての機能は配列アラインメント分析に基づき割り当てられた。ｈｉｐＣプロモーター領域により制御されるオペロンに分類されるように思われる５つのＯＲＦが存在する。ｈｉｐＣ（ペリプラズムシャペロン）遺伝子の後には、第二読み取り枠ｈｉｐＲ（おおまかには配列番号４の内の４０１６−６２３８に位置する）が示され（これは膜アンカー蛋白質である）、第三ＯＲＦ ｈｉｐＭ（おおまかに配列番号４の内の６２５９−６８７３に位置する）が示され（これは先端会合蛋白質であり、本明細書では微量先端蛋白質としても引用される）、そして第四ＯＲＦ ｈｉｐＡ（おおまかには配列番号４の内の６９５５−８２６５に位置する）（これは先端接付着因子蛋白質である）が示された。ピリン遺伝子（ｈｉｐＰ）およびペリプラズムシャペロン遺伝子（ｈｉｐＣ）は、既に同定されているＴＡ反復構造を有するプロモーター領域を保持するＬＫＰ４オペロンとは逆配向で転写される（ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ７３：１１８７−１１９６（１９９３）。ｐＨＦ１は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内ではＬＫＰ１ピリ線毛を発現するという理由のため、ｖａｎ Ｈａｍらにより記載されるように、内部プロモーター領域には１０のＴＡ反復構造が存在する。これらのＴＡ反復構造はＬＫＰピリ線毛表現型の相性変化の原因となっており、幾つかの反復構造の喪失によりピリ線毛発現の喪失がもたらされ、かつ１０と１１との間のＴＡ反復構造数によりＬＫＰオペロンの発現が可能となる。同定を行ってみたところ、ＯＲＦがコードするインテグラーゼがＬＫＰ１オペロン上に存在していた（おおまかには配列番号４の内のヌクレオチド１４９５−１８６８に位置する）。酵素ペプチダーゼをコードする配列もＬＫＰ１オペロン上に存在していた（おおまかには配列番号４の内の８３９５−９３４７に位置する）。
【００５６】
ＬＫＰ１ ｈｉｐＰ遺伝子産物の予想サイズは約２１．２キロダルトンであり、２０アミノ酸のシグナル配列の長さが仮定される一方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの見かけ上の分子量は約２７キロダルトンである。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル内での一般的なＬＫＰピリンの変則的配列遊走により部分的には説明されるが（成熟したＬＫＰ４は２４キロダルトンの分子サイズに遊走する一方で、その予想サイズは２２．１キロダルトンである）、厳密な説明は未知のままである。
【００５７】
ＬＫＰ血清型１、４、および５のｈｉｐＰ遺伝子の配列比較
この報告は、ＬＫＰ血清型１および５をコードするｈｉｐＰ遺伝子の最初の配列分析を示す（図１）。ＬＫＰ４発現性Ｈｉｂ株からのｈｉｐＰ遺伝子も既に配列決定されており（ｖａｎ Ｈａｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ．８：３５３５−３５４
０（１９８９））、そしてそれに由来するアミノ酸配列は、本明細書に含まれるＬＫＰ４
ｈｉｐＰ由来のアミノ酸配列と９９％の同一性を示す。Ｈｉｂ株ＥａｇａｎおよびＭ４３からのｈｉｐＰ遺伝子配列が既に公開されている（Ｆｏｒｎｅｙ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１９９１−１９９６（１９９１））。ＬＫＰ１ ｈｉｐＰ遺伝子は約２１．５ｋＤの蛋白質をコードする一方で、ＬＫＰ４ ｈｉｐＰ蛋白質の予想分子量は２３．８ｋＤである。組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に観察される実際のｈｉｐＰ遺伝子産物は、ＬＫＰ４およびＬＫＰ５についてのウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットではおおよそ正しいサイズのものであるが、ＬＫＰ１ピリンは２６ｋＤと予測されるよりも大き目の分子量に変則的に泳動する。ＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウエアーを用いてこれらの遺伝子の相同性を評定したところ、ＬＫＰ４ ｈｉｐＰ蛋白質およびＬＫＰ５ ｈｉｐＰ蛋白質に関してはＬＫＰ１ ｈｉｐＰに対して各々７０％および６７％の同一性が示された。これらの配列間のアラインメントはその蛋白質の末端では非常に良好であるが、ただし図中に示されるように、ＬＫＰ１、４、および５の血清型遺伝子には３つの主要配列分岐領域が存在し、それらが更に蛋白質へと反映されている。抗−ＬＫＰ１血清、抗−ＬＫＰ４血清、もしくは抗−ＬＫＰ５血清と、異種血清型の無傷のピリ線毛との間には殆ど交差反応性が観察されないため、分類用抗血清の血清型特異性の原因となるこれらの配列は先の３つの領域内に位置しているはずである。ＧｅｎＢａｎｋ内の配列と、ＬＫＰ４配列との比較により、Ｈ．インフルザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タイプｂ Ｍ４３ピリン（Ｇｉｌｓｄｏｒｆ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：１０６５−１０７２（１９９０）（これは、Ｇｉｌｓｄｏｒｆらにより配列決定されている）もＬＫＰ４血清型遺伝子であるように思われる（データ非公開）。
【実施例２】
【００５８】
ＬＫＰタイプのピリ線毛産生性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え体の構築
【００５９】
細菌株
大腸菌組換え体構築に用いられる毛形成Ｈｆｌｕ株は、ＬＫＰ１１／ＣＢ５９、ＬＫＰ１０／８８−０８０７、およびＬＫＰ１２／８８−０６７７である。赤血球凝集および血清凝集を、遺伝子ライブラリーを作製する以前に調査した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（商標）およびＨＢ１０１をクローニング宿主細胞として用いた。
【００６０】
ＤＮＡライブラリー構築物およびコスミドベクターＤＮＡ
ＬＫＰ１１、ＬＫＰ１０、およびＬＫＰ１２からの染色体ＤＮＡを各々標準技術により抽出および精製した。ＨｆｌｕゲノムＤＮＡサイズは約１．８×１０６ｂｐである。染色体ＤＮＡを部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで消化した。約３０ｋｂ ＤＮＡ分画をＬＭＴＡ−ゲル（Ｓｉｇｍａ社）から溶離させ、かつフェノール−クロロホル法により精製した。最終ＤＮＡ濃度は約１μｇ／μｌである。
【００６１】
ベクターＤＮＡ ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）をＸｂａＩで消化し、そしてウシ腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化させた。ＸｂａＩおよびＣＩＡＰで処理したベクターＤＮＡを、その後にはＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。約６．５ｋｂのベクターＤＮＡ断片が取得された。
【００６２】
ＬＫＰ１１／ＣＢ５９、ＬＫＰ１０／８８−０８０７、およびＬＫＰ１２／８８−０６７７のＤＮＡ断片を各々、ベクターＤＮＡ ＳｕｐｅｒＣｏｓ ＩのＢａｍＨＩ部位で連結させた。連結させたＤＮＡを、Ｃｉｇａ−ｐａｃｋ Ｇｏｌｄキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて１つのファージ粒子内にパッケージングした。パッケージング用の宿主細胞はＸＬ１−Ｂｌｕｅ（商標）であった。
【００６３】
ライブラリースクリーニング
ＬＫＰタイプのピリ線毛を発現した組換え体をコロニーブロット法によりスクリーニングした。ＬＫＰ１１、ＬＫＰ１０、およびＬＫＰ１２からの抗−ピリ線毛血清の濃度は１：１０００稀釈であった。陽性コロニーのパーセンテージは、ＬＫＰ１１については４０／４２００、ＬＫＰ１０については９／７００、そしてＬＫＰ１２については１／６００であった。細胞の毛形成はＥＭ（電子顕微鏡）により調査した。これらの組換え体を更にＨＡ（赤血球凝集）およびＳＡ（血清凝集）アッセイにより確認し、そしてそれらを、ＬＫＰ１１についてはＣＬＪ１１、ＬＫＰ１０についてはＣＬＪ１０、およびＬＫＰ１２についてはＣＪＬ１２と命名した（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）。組換えＤＮＡを抽出し、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１に形質転換させたが、それはＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞はタイプＩのピリ線毛を発現するためである。この組換え体のＤＮＡサイズはＣＬＪ１１については約１８．５ｋｂである。この値は、挿入断片およびベクターＤＮＡ上の制限部位を用いる消化およびその後の連結により得られた。ＣＬＪ１０ ＤＮＡは約２５ｋｂであり、そしてＣＬＪ１２についてはそのＤＮＡは約３５ｋｂである。部分的ＤＮＡ配列がこれらの組換え体挿入断片については取得可能である。
【実施例３】
【００６４】
液相法を用いる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株からのＬＫＰピリ線毛の精製のためのプロトコール
【００６５】
一般的プロトコール
１． アンピリシンを含む３ｍｌのＬＢ培地中に組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を接種し、そしてＯＤ ５４０ｎｍの読み取り値が０．６〜０．８に達するまで３７℃で増殖させる（３〜４時間）。
２． その細胞懸濁物を５０ｍｌの培地に移し、そして５４０ｎｍでの読み取り値が０．８〜１．０に達するまで３７℃で増殖させる（４〜５時間）。
３． ２．８Ｌのフラスコ内の１Ｌの培地に５０ｍｌの細胞培養物を移し、そして５４０ｎｍの読み取り値が４．０〜５．０に達するまで３７℃で一晩（１６〜１８時間）増殖させる。
４． ５０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により細胞を回収する。
５． 細胞を５０ｎＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、中に再懸濁させ、そしてその懸濁物を室温に１時間維持させる。
６． 大カップでは１１０００ｒｐｍで、もしくは小カップでは１４０００ｒｐｍでオムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）を用い、氷上で３分間ブレンドする。
７． １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ８．０に滴定し、そして３時間室温に放置する。
８． １２０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離する。全ペレット重量を測定し、棄却する。
９． １０μｌのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを、各１００ｍｌの調製物に添加する。完全に混合させ、そして１０分間室温に放置する。
１０．数回緩衝液を交換しながら５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、に対して一晩透析する。この調製物のｐＨが一晩たっても５．０に達しない場合には、緩衝液を更に頻繁に交換しながら一層長時間の透析にかける。
１１．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃下で遠心分離させて蛋白質沈殿物およびピリ線毛結晶をペレット化させる。
１２．このペレットを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０、で元の約２５％の容積中に再懸濁させる。
１３．緩和に撹拌させながらＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＥＤＴＡをその調製物に添加して０．２％および５ｍＭの最終濃度を取得する。緩和に一晩、４℃で撹拌する。
１４．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃下での遠心分離により調製物を清澄化させる。１５．ＮａＣｌおよびＰＥＧ８０００を、各々０．５Ｍおよび３．０％の最終濃度になるまで添加し、次いで氷上で２時間、その調製物をインキュベートする。
１６．その調製物を１６０００ｒｍｐで６０分間、４℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化させる。
１７．ペレットを以前の容積の１／３の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中に再懸濁させる。少な目の溶液を用いると少な目のピリ線毛結晶が取得される。
１８．段階１３〜１７を反復する。
１９．ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中に再懸濁させる。物質の純度および量に依存して別法の可溶化および結晶化段階が必要に応じて継続されることがある。
【００６６】
精製中、各段階後には試料を採取し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてその試料の純度を検定する。暗視野顕微鏡アッセイが純度検定のための補助作業として必要とされる。ＵＶスキャニングを用いてＤＮＡもしくはＲＮＡによるいずれかの混入を決定することが必要とされる。
【００６７】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は２８０ｎｍに強い吸収を有するため、精製後にはＰＥＧおよびＮａＣｌによるピリ線毛の、一度もしくは複数回の結晶化により残存性Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を除去することは重要である。このことによりＵＶ法によりピリ線毛調製物の濃度を決定する際の、２８０ｎｍでのあいまいな読み取り値が回避される。
【００６８】
ＬＫＰ５ピリ線毛の精製
１． ５〜１０ｍｌ／トレーを用いて８０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ５．０、中に回収する。
２． 必要であらば調製物を６Ｎ ＨＣｌでｐＨ５．０に滴定する。
３． オムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）を用い、氷上で３分間ブレンドする（平均速度＝９８００ｒｐｍ）（大き目のカップ内では可能な場合には最高１１０００ｒｐｍまで、そして小カップでは最高１４０００ｒｐｍまで）。
４． ５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ９．０に滴定し、そして３時間室温に放置する。ｐＨ変化を避けるためには緩和に撹拌することが必要であることがある。全過程を通してｐＨをモニターし、そして必要があらば調節する。（培養物をブイヨン中で増殖させる場合には、ＮａＯＨの代わりに１Ｍ緩衝液（Ｔｒｉｓ）で滴定する）。
５． １５３００ｇで２０分間、４℃で遠心分離する。上清を清潔なボトルに移し、そして以前の要領で２度の清澄化を行う。全ペレットの重量を測定し、そして棄却する。
６． 上清のｐＨを８．０に調節し、そして１０μｌのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを各１００ｍｌの調製物について添加する。完全に混合させ、そして１０分間室温に放置する。
７． 数回緩衝液を交換しながら４０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、に対して一晩透析する。この調製物のｐＨが一晩たっても５．０に達しない場合には、緩衝液を更に頻繁に交換しながら一層長時間の透析にかける。
８． １８６００ｇで６０分間、４℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化させる（結晶は透明なピリ線毛については典型的ではない）。
９． ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、で、ラバーポリスマンを用いて元の約２５％の容積中に再懸濁する。４℃で緩和に数時間撹拌する（泡形成はさける）。必要であらば大きな塊を緩和なピペッティングで粉砕する。
１０．緩和に撹拌しながらＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（２％保存物）をその調製物に０．４％の最終濃度が取得されるまで添加し、そしてＥＤＴＡ（２５ｍＭ保存物）を５ｍＭの最終濃度になるまで添加する。４℃で一晩インキュベートする。
１１．１８６０００ｇで６０分間、４℃の遠心分離によりその調製物を清澄化させる。上清を清潔なフラスコに移す。
１２．上清のｐＨを１ＮのＨＣｌを用いて８．０以下に調節する。
１３．ＮａＣｌ（５Ｍの保存物）を０．５Ｍの最終濃度になるまで、そしてＰＥＧ（３０％の保存物）を３％の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で０．５時間
インキュベートする。暗視野で結晶についての調査を行う。必要であらば時間を延長させるが、ただしピリ線毛をＰＡＧＥに過剰露出させないことは重要であり、それは再溶解は時間が長くなるに連れてどんどん難しくなるためである。
１４．調製物を１８６００ｇで６０分間、４℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化させる。
１５．ペレットを４０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０、で洗浄して過剰なＰＥＧ／ＮａＣｌを除去する。その後に１８６０００ｇで６０分間遠心分離にかける（２度）。
１６．ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、中、以前の１／２の容積に再懸濁させる。かき回すこと、次いで緩和なピペッティングにより可溶化させる。試料をゲル上で泳動させて純度を検定する。必要であらば段階１７を続ける。
１７．調製物に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．４％の最終濃度が取得されるまで、そしてＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度になるまで添加し、次いで一晩４℃でインキュベートする（詳細については段階１０を参照されたい）。
１８．調製物のｐＨを、ＨＣｌを用いて８．０以下に調節する（７と８との間）。
１９．ＮａＣｌを０．５Ｍの最終濃度になるまで、そしてＰＥＧを３％の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で０．５時間インキュベートする（詳細については段階１３を参照されたい）。
２０．調製物を１８６０００ｇで６０分間、５℃で遠心分離させてピリ線毛結晶をペレット化する。
２１．そのペレットを２５２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、中に再懸濁させてピリ線毛を可溶化させる（詳細については段階１６を参照されたい）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度の検定を行う。必要であらば段階２２を続ける。
２２．その調製物に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．４％の最終濃度が得られるまで、そしてＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度になるまで添加し、次いで一晩、４℃でインキュベートする（詳細については段階１０を参照されたい）。
２３．１８６０００ｇで６０分間、４℃の遠心分離により清澄化させる。
２４．ＮａＣｌを０．５Ｍの最終濃度になるまで、そしてＰＥＧを３＃の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で０．５時間インキュベートする（詳細については段階１３を参照されたい）。
２５．１８６０００ｇで１時間、４℃で遠心分離する。上清を棄却する。２６．ペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、中に再懸濁させる。物質の量および純度に依存し、別の可溶化／結晶化段階が必要に応じて続けられることがある。
【００６９】
精製過程中は、ペレット物質および上清を暗視野および／またはゲルおよび／またはスキャンによりモニターせよ。これまでの過程を再度繰り返す必要があることもある。
【００７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検定による純度：必要であらばＴｒｉｔｏｎ段階を反復するが、ただしピリ線毛がかなり喪失されるため、前のプロトコールにおけるＳＤＳ反応段階は回避されよ。
【実施例４】
【００７１】
ＨＰＬＣおよび他のカラム法によるＬＫＰピリ線毛の精製
洗剤抽出およびＰＥＧ沈殿以外では、ＬＫＰピリ線毛はＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、および他のカラム法により精製することもできる。これらの方法は特に未知のＬＫＰピリ線毛にとっては都合がよい。通常、ピリ線毛は最初に抽出および沈殿によりピリ線毛溶液が透明になるまで部分精製し、濃縮し、そして極少量にする。この調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定すると依然として純粋ではなく、カラム法が最上の適用法となるであろう。サイズ決定用カラムがこの目的に用いられることが好ましい。カラムにかける前には、ピリ線毛試料の更に進んだ精製のための処理が重要となる。ピリ線毛の部分精製のために用いられた洗剤を、透析もしくは他の既知の技術によりピリ線毛試料から除去すべきである。洗剤
はカラム分離能を有意に低下させる。サイズ排除カラムは少量の試料容積を必要とする。
【００７２】
ＨＰＬＣもしくはＦＰＬＣのためには５０μｌ〜２００μｌのロード容積が推奨され、そして他の日常的に実施されるＬＣゲル濾過カラムのためには試料のロード容積はそのカラムの長さおよびサイズに依存する。１ｍｌのピリ線毛試料が５０ｍｌの総容積のカラムにとっては好ましい。ピリ線毛は２８０ｎｍでの吸収が低いため、高目の感度のモニターが推奨される。カラムから溶離されて取得される蛋白質を２３０ｎｍでモニターすることができる。更に進んだ蛋白質の精製をＨＰＬＣにより実施することができる。精製用のカラム法もピリ線毛からのピリンの単離にとっては有用である。
【実施例５】
【００７３】
固相法を用いるＨｆｌｕ株もしくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株からのＬＫＰピリ線毛の精製のためのプロトコール
一般論として記載すると、組換え株は親株であるＨｆｌｕよりもピリ線毛構造蛋白質の発現量が大きくなるため、組換え細胞からピリ線毛を精製することは一層容易となる。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株は親であるＨｆｌｕと同様の様式でピリ線毛蛋白質を発現するという事実に起因し、Ｈｆｌｕもしくは組換え株からのピリ線毛桿状体の精製法は基本的には同一となる。Ｈｆｌｕ株の増殖にはチョコレートアガー培地および所定量のＣＯ２、および湿度が必要とされる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）組換え株の増殖は、アンピリシンを含むＬＢアガー培地を必要とする。
【００７４】
１． ５ｍｌ／トレーを用いて８０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ５．０、中で回収する。滑らかなガラスの縁を用いて湿潤細胞を掻爬し、次いでその細胞懸濁物をオムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）カップに移す。細胞の量が少なければ表面のみが形成され、湿潤細胞を回収するには培地表面の湿気を使用する。
２． 必要であらば調製物を２Ｍ酢酸緩衝液でｐＨ５．０に滴定する。
３． 氷上でオムニミキサー（ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）を用い、１４０００ｒｐｍで３〜５分間ブレンドする。
４． １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でｐＨ８．０に滴定し、そしてｐＨメーターによりｐＨ変化をモニターする。調製物が多数の湿潤細胞を含む場合にはＴｒｉｓ緩衝液の代わりに２．５もしくは５Ｍ ＮａＯＨでそのｐＨに滴定されることもある。ＮａＯＨを用いる場合には細胞の溶解を回避するよう注意する。その調製物を室温で３時間インキュベートする。
５． １２０００ｒｐｍで２０〜３０分間、４℃で遠心分離する。全ペレットの重量を測定し、そして棄却する。
６． 各１００ｍｌの調製物に１０μｌのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを添加する。完全に混合させ、そして１０分間室温に放置する。
７． 数回緩衝液を交換しながら５０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、に対して一晩透析する。この調製物のｐＨが一晩たっても５．０に達しない場合には、緩衝液を更に頻繁に交換しながら一層長時間の透析にかける。
８． １６０００ｒｐｍで６０分間、４℃での遠心分離にかけて蛋白質沈殿物およびピリ線毛結晶をペレット化させる。
９． ペレットを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０、で元の約２５％の容積中に再懸濁させる。
１０．緩和に撹拌しながら調製物にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＥＤＴＡを、０．２％および５ｍＭの最終濃度が得られるまで添加する。４℃で一晩、緩和に撹拌する。
１１．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃の遠心分離により調製物を清澄化させる。
１２．ＮａＣｌおよびＰＥＧ ８０００を、各々０．５Ｍおよび３．０％の最終濃度になるまで添加し、次いでその調製物を氷上で２時間インキュベートする。長さおよび直径を異にするＬＫＰピリ線毛は、異なった濃度のＮａＣｌおよびＰＥＧ中で結晶化することが
ある。従って異なるピリ線毛を結晶化させるためのＮａＣｌおよびＰＥＧについての濃度検査は重要である。
１３．１６０００ｒｐｍで６０分間、４℃での遠心分離にかけてピリ線毛結晶をペレット化させる。
１４．ペレットを以前の１／３の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中、にペレットを再懸濁させる。使用する溶液の量をより少なくすると、一層少量のピリ線毛結晶が取得される。
１５．段階１０〜１４を反復する。
１６．ペレットを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中に再懸濁させる。物質の純度および量に依存して別の可溶化および結晶化段階が必要に応じて続けられることがある。
【００７５】
精製中、各段階後には試料を採取し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて試料の純度を調査する。暗視野顕微鏡アッセが純度検定の補助作業として必要とされる。ＤＮＡもしくはＲＮＡによるいずれかの混入を見いだすにはＵＶスキャニングを用いることが必要とされる。
【００７６】
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は２８０ｎｍに強い吸収を有するため、精製後にはＰＥＧおよびＮａＣｌによるピリ線毛の、一度もしくは複数回の結晶化により、その洗剤の残存物を除去するのが賢明である。このことによりＵＶ法によりピリ線毛調製物の濃度を決定する際の、２８０ｎｍでのあいまいな読み取り値が回避される。
【実施例６】
【００７７】
ＭＢＰ−Δ３’先端融合蛋白質の構築
ベクターｐＭＡＬ−ｐ２内ではＭＢＰ蛋白遺伝子とインフレームになっているであろう遺伝子融合物を、ＰＣＲプライマーを用いることによりｐＨＦ１からＬＫＰ１先端遺伝子の一部分を取得する目的で構築した。これらのプライマーは、その先端蛋白質の内の約１００アミノ酸からなるカルボキシル末端が欠失され、かつストップコドンで置換されるように設計されていた。この蛋白質のアミノ末端部分は、シグナル配列開裂部位に近い地点の適切な制限部位に関してはインフレームでＰＣＲ増幅されており、この部位は、他の細菌シグナル配列との類推およびその先端蛋白質の演繹アミノ酸配列の疎水性分布により決定された。この融合蛋白質のアミノ酸配列が図２に示される。この融合蛋白質のＬＫＰ先端蛋白質の部分配列に下線が施されている。
【００７８】
融合物の発現、精製、および抗血清産生
この蛋白質は、０．２ｍＭのＩＰＴＧでの誘導後に１００μｇ／ｍｌでのアンピリシンを含むＳＯＢブイヨン中、２８℃で増殖させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ｏｎｎｉｐＴ．ｌｏｎ Ｋ−１２株）内で発現させた。この細胞を遠心分離によりペレット化させ、そしてＰＢＳ中で一回洗浄した。この細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡおよび４００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、中、２０ｍｌ／リットル（元の培養物）の比率で再懸濁させた。この細胞をフレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）に３回通すことにより溶解させ、そして細胞破片を８倍×ｇで２０分間、４℃の低速の遠心分離により除去した。この上清を破壊に用いられたものと同一の緩衝液中で５倍に希釈し、そして１５ｍｌのベッド容積のアミロース樹脂カラムに、室温で１ｍｌ／分で通過させた。この溶解物をカラムに通して流した後に、このカラムをベッド容積の１５倍分の溶解用緩衝液で５ｍｌ／分で洗浄した。結合した物質を、１０ｍＭのマルトースを含む洗浄用緩衝液を用いて溶離させた。この溶離は、５０ｍｌの緩衝液を用いて１ｍｌ／分で実施し、そして溶出物を合わせた。得られる蛋白質混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）および抗−ＭＢＰ血清により分析し、そして融合物、破壊産物、および全長ＭＢＰが含まれることが見いだ
された。他の物質は殆ど検出されなかった。
【００７９】
この融合蛋白質、ＭＢＰ、および破壊産物は複合体として溶離された。マウスを１０μｇの用量の複合体で、１００μｇのＭＰＬをアジュバントとして用いて免疫化した。免疫化は皮下的に、第０、４、および６週目に実施され、そして第８週目にマウスからの全採血を実施した。陰性対照血清は、同一の精製および免疫化プロトコールを用いて精製されたＭＢＰに対して作製されたマウス抗−ＭＢＰ血清であった。
【００８０】
抗−ＧＳＴ血清
ＧＳＴ融合物は、完全なＬＫＰ先端遺伝子を用いて構築され、これはシグナル配列を含んでいた。この遺伝子を、インフレームでのｐＧＥＸ−３Ｘ内への挿入に適する制限酵素部位を有するＰＨＦ１からＰＣＲ増幅させ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内で発現させた。この細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピリシンを含むＳＯＢ中で増殖させ、そして０．２ｍＭのＩＰＴＧ、３７℃下で２時間誘導させた。この細胞を回収し、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次いでＰＢＳ中に再懸濁させ、そしてフレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）に通すことにより溶解させた。細胞破片を遠心分離により回収し、そして、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４を含む緩衝液で３回洗浄し、そしてこの封入体を遠心分離により回収した。この封入体を５ＭのグアニジンＨＣｌ中で可溶化させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。グアニジン濃度を透析により２．５Ｍにまで低下させ、そして可溶性封入体を４℃に保存した。抗血清は、調製用の１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動させ、そしてその融合物バンドをそのゲルから切り出すことにより作製した。アクリルアミド−蛋白質バンドをメスを用いて切り刻み、そしてＭＰＬ（１００μｇ）と混合させ、次いで第０、４、および６週目に３回マウスに注入した。第８週目にマウスからの採血を実施した。
【実施例７】
【００８１】
Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＬＫＰピリ線毛先端付着因子蛋白質の取り出し、精製、および同定
これは、Ｈ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＬＫＰピリ線毛からの先端接着因子蛋白質をピリ線毛桿状体の解重合なしに取り出すことができるということの最初の記述である。遊離の先端付着因子蛋白質を、透析および調製用電気泳動により単離および精製することができる。精製された先端付着因子を、構築された遺伝子融合蛋白質（これはＬＫＰ１先端遺伝子の一部分およびＭＢＰ（マルトース結合性蛋白質）遺伝子からのものである）からの抗血清によりウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）分析を用いて同定することができる。特異的結合が精製された先端蛋白質と融合蛋白質抗血清との間に検出され、このことにより、ＬＫＰ１ピリ線毛調製物から精製された蛋白質がＬＫＰ１先端付着因子蛋白質であることが明白に示される。
【００８２】
ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）ゴーストでの活性アッセイにより、精製された先端蛋白質は天然のゴースト調製物には結合するが、変性させたＲＢＣゴーストには結合しないことが示され、このことにより精製された先端蛋白質が生物学的機能を示すか、もしくは少なくとも部分的機能を示すことが示される。
【００８３】
ピリ線毛桿状体からの先端蛋白質の取り出し
１． 精製されたＬＫＰ１ピリ線毛を、５Ｍ ＮａＣｌを含む２００ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．０、中、室温で４〜６時間透析する。
２． 透析バッグを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０、中に移し、そしてピリ線毛調製物のｐＨがｐＨ８．０に達するまで数時間透析する。
３． そのピリ線毛調製物に０．１％の最終濃度になるまでＳＤＳを添加し、そして４℃で１０時間インキュベートする。
４． そのピリ線毛調製物を５０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０、中で一晩透析する。
５． ピリ線毛凝集物を遠心分離により除去することができ、そして大半の遊離先端蛋白質は上清中に残ったままにまっている。
【００８４】
先端蛋白質は、ピリ線毛桿状体の解重合なしで２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中の２％ＳＤＳにより完全に取り出すことができるが、ＳＤＳはこの蛋白質の活性を損なうことがある。０．１％のＳＤＳのみでは約２０〜３０％の総先端蛋白質が取り出されるに過ぎないが、この蛋白質は生物学的活性を維持している。この結果は、ｐＨ２．０の緩衝液中の４Ｍ尿素および２Ｍ ＧｕＨＣｌが解重合なしでピリ線毛桿状体から先端蛋白質を部分的に取り出すことができることも示している。
【００８５】
先端蛋白質の精製
１． ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料処理用緩衝液と、濃縮させた先端蛋白質とを混合する。この比率は、０．３ｍｌの試料処理用緩衝液に対して２．５ｍｌのピリ線毛調製物である。
２． この試料を、０．８〜１．０ｃｍの濃縮用ゲルおよび５ｃｍのランニングゲルの長さを有するＰｒｅｐ−Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（０．１％ＳＤＳ）にかける。
３． このゲルを冷却システムを用いて３００ボルトで６〜８時間泳動させ、そして溶離を２８０ｎｍでモニターする。
４． 先端蛋白質を含む分画を合わせ、そして濃縮する。
５． 合わせた分画の純度をミニＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定する。抗−ＫＬＰ１−ＭＢＰ融合蛋白質による精製先端蛋白質の同定が図４に示される。精製された先端蛋白質の、ヒト赤血球細胞ゴーストとの結合性活性が図５および６に示される。図７はＳＤＳ／ＰＡＧＥによる様々なＬＫＰタイプのピリ線毛からの付着因子蛋白質を比較している。
【実施例８】
【００８６】
血清型分析
ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｈｆｌｕ）の細菌叢は、細菌相性もしくは細胞タイプの特殊化複合体であり、これは社会的に組織化されていて、ヒト細胞膜レセプターへの結合性のための特異的付着性決定基を保持する蛋白質付属物がＨｆｌｕの表面に発現され、かつ更に遊離形態でＨｆｌｕから分泌されることを促進させる。ピリ線毛は病原体細胞を脊椎動物宿主内に存在するよう適合させるが、それは宿主自体の蛋白質の機能を模倣させることによる。ピリ線毛機能には、多種多様の宿主細胞および組織に細菌を連結させること、ならびに細菌に有利になりかつ宿主に損傷を及ぼすように宿主の免疫系を刺激することが含まれる。ピリ線毛は大半の細菌性疾患における伝染、毒性、撒種、病原性、および免疫性の因子である。
【００８７】
ピリ線毛の発現は遺伝子スイッチングメカニズム、つまり相性の多様性により制御されており、各相でのピリ線毛発現およびピリ線毛タイプのスイッチは、その細菌に近接する環境における条件およびシグナルと共に変化しかつそれらにより決定される確立でオンおよびオフとなる。幾つかの条件下ではスイッチングの確立は細菌細胞分裂当たり１０−２という程、非常に高いものとなり得る。他の環境条件下では同一相性スイッチの確立は１０−６もしくはそれを下回ることがあり得る。相性スイッチングには、ピリ線毛オペロンのＤＮＡ内での可逆的および不可逆的再配列の両方が伴う。インビトロ増殖中の相性スイッチングにはピリ線毛オペロン遺伝子に対する欠失が伴うことが頻繁に生じ、その結果、非毛形成相性がその相に不可逆的に留まることとなる。
【００８８】
Ｈｆｌｕピリ線毛を様々な単離物から精製し、そして精製された調製物に対する抗血清
を産生することにより、これまでに独特なピリ線毛血清型が同定されている。Ｈｆｌｕ細菌叢の様々なピリ線毛発現相性を同定するためには様々な血清型の発現がマーカーとして用いられる。
【００８９】
【表１】
Ｌ＝１は＜０．２μの長さ
Ｌ＝２は＜０．２μ＜０．５μの長さ
Ｌ＝３は＜０．５μの長さ
Ｄ＝３は３ｎｍの直径（「薄型」）
Ｄ＝４は４ｎｍの直径（「厚型」）
【００９０】
各ＬＫＰ血清型の頻度は全型別可能血清型培養物、および全発現性培養物について単一発現体および多重発現体の両方におけるタイプを計測することにより決定した。２０の血清型の内の１６が典型的なＬＫＰ毛形成培養物であることが見いだされ、かつこれらの培養物の内の９０％は２０−タイプ系内で血清型の型別が可能であった。これらの培養物に
ついての血清型の頻度分布が表１に示される。
【００９１】
３つの異なるＬＫＰピリ線毛オペロン遺伝子が選択され、それらはピリン遺伝子、アンカー遺伝子、および付着因子遺伝子であり、これら全ての遺伝子は多重配列アラインメントにおいては様々な血清型の間で配列類似性を呈するが、ただしこれらはＨｆｌｕ ＬＫＰピリ線毛に特徴的でもあった。配列は、ＰＣＲ反応における使用のための、各遺伝子をフランクする適切なプライマー配列として作動するであろう遺伝子から選択された。
【００９２】
ＬＫＰピリン： ＨＦ２ ５′＞ＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＡＡＧＣＣ＜３′
（配列番号１６）
ＨＦ１ ５′＞ＡＡＣＧＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＣＣＴＴ＜３′
（配列番号１７）
ＬＫＰアンカー（Ａｎｃｈｅｒ）：Ｒ５ ５′＞ＧＣＣＧＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＡＣＧ＞３′
（配列番号１８）
Ｒ３ ５′＞ＧＧＣＡＡＡＴＡＣＧＣＡＣＣＧＣＴＡＡＡＴ＞３′
（配列番号１９）
ＬＫＰ付着因子：Ａ５ ５′＞ＣＧＧＡＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡ＞３′
（配列番号２０）
Ａ３１ ５′＞ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＡＣＡ＞３′
（配列番号２１）
【００９３】
プライマーの全３対は合成され、かつＨｆｌｕ単離物から抽出されるＤＮＡのセグメントを増幅するためのＰＣＲ反応に用いられた。
【００９４】
検査されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株中のＬＫＰピリ線毛オペロンの存在を示すデータが表２に示される。
【００９５】
【表２】
１． ピリ線毛の長さ０は、非毛形成を意味する。
２． 長さ３は＞０．５ミクロンを意味する（最長、典型的なＬＫＰピリ線毛）。
３． ＨＡ＋はヒト赤血球細胞の赤血球凝集について陽性であることを意味する；典型的なＬＫＰピリ線毛。（これらの単離物は定義によると不応性ではない）。
４． ＨＡ−はヒト赤血球細胞の赤血球凝集について陰性であることを意味する；典型的なＳＮＮピリ線毛。（これらの単離物は不応性であり、それは全単離物が少なくとも一度は赤血球吸着したためである）。
５． ピリ線毛直径３は、その単離物がＳＮＮピリ線毛の典型的直径を有するピリ線毛を発現することを意味する。
６． ピリ線毛直径４は、その単離物がＬＫＰピリ線毛の典型的直径を有するピリ線毛を発現することを意味する。
７． 血清型分類可能は、その単離物が１〜２０の系内のＬＫＰピリ線毛タイピング用抗血清の内の少なくとも一つと、標準条件下で凝集することを意味する。
８． 血清型分類が可能ではないは、その単離物が１〜２０の系内のＬＫＰピリ線毛タイピング用抗血清の内のいずれのものとも凝集しないことを意味する。
【実施例９】
【００９６】
ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）アッセイプローブ構築のためのハイブリダイゼーションアッセイ
プラスミドｐＨＦ１（Ｋａｒａｓｉｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．８（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ６２−６５（１９８８））からの約１１００ｂｐの断片（これは、ＬＫＰ１血清型オペロンを含む）をＰＣＲにより、ｈｉｐＡ遺伝子の５’および３’末端でハイブリダイズするプライマーを用いて増幅させた。この遺伝子はＬＫＰ１ピリ線毛の先端付着因子蛋白質をコードする。ＰＣＲ反応には、ジゴキシゲニンラベル化させたｄＵＴＰと共にジゴキシゲニンでＰＣＲ反応産物をラベル化するための４つのｄＮＴＰが含まれていた。このプローブをアガロースゲル上で電気泳動にかけ、かつ約１．２ｋｂのバンドを切り出し、そしてＤＮＡを標準方法により抽出することにより精製した。このプローブを３０μｌの適切な緩衝液中に再溶解させた。
【００９７】
ハイブリダイゼーションアッセイ
１１のランダムに選択されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の臨床的単離物をＢＨＩ−ＸＶプレート上、３７℃、５％
ＣＯ２を用いて増殖させ、そして更にＢＨＩアガー上で画線培養させた。全単離物はＢＨＩ−ＸＶプレート上でのみ増殖し、このことによりそれらがＨ．インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）であることが示される。これらの単離物には、２つのＨｉｂ株および９つのＮＴＨｉが含まれていた。これらの株をＢＨＩ−ＸＶアガー上に置かれたナイロン膜上に接種した。他の呼吸器性病原体モラキセラ カタルラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の５つの臨床的単離物もそのフィルター上にスポットした。これらの細菌を一晩、３７℃、５％ＣＯ２中で増殖させた。増殖後に、２つのボルデテラ ペルツトゥシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）株をそのフィルター上にスポットした。フィルターを、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９９１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）の方法に従ってコロニーハイブリダイゼーション用の処理を施した。フィルターを、Ｇｅｎｉｕｓ（商標）システムについてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍにより記載される要領で、予備ハイブリダイゼーション用溶液中、６５℃で３時間遮断させた。コロニーの破片を湿ったペーパータオルで緩和にこすることにより除去した。プローブ３０μｌを５ｍｌの予備−ハイブリダイゼーション用溶液に添加し、そして１０分間沸騰させてＤＮＡを変性させた。プローブを即座にそのフィルターに添加し、そして一晩、６５℃でハイブリダイズさせた。フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２度、５分間／洗浄で、室温で洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で、１５分間づつ２度洗浄した。結合したプローブを、アルカリ性フォスファターゼでラベル化した抗−ジゴキシゲニン抗体を用い、製造業者により記載される要領で検出した。結果を表３に示す。
【００９８】
【表３】
【００９９】
このプローブはＨ．インフルエンザエに特異的であり、Ｍ．カタルラリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）もしくはＢ．ペルトゥシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のいずれともハイブリダイゼーションを示さない。
【０１００】
ハエモフィルス インフルエンザエのピリ線毛の分類不能株のハイブリダイゼーションアッセイ
異なる血清型のＬＫＰピリ線毛を発現する１０のＬＫＰピリ線毛発現性ＮＴＨｉ株と共にＨｉｂ Ｅａｇａｎを、チョコレートアガー上に重層させたナイロンフィルター上、３７℃、５％ＣＯ２中で増殖させた。これには追加的ＮＴＨｉ単離物も含まれていた。増殖後に２つの株はそのフィルター上で黄色に見え（このことにより、非−ハエモフィルス
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌であることが示唆される）、そのためそれらをＢＨＩおよびＢＨＩ−ＸＶ上での増殖により検査した。この実験により、それらが混入物であって、ＮＴＨｉではないことが示された。このフィルターをアガーから取り外し、そして先に記載の要領での処理を施した。第一実験からのプローブを再度沸騰させ、そして以前と同様にフィルターに添加したが、ただし例外は、ハイブリダイゼーション温度を６２℃に下げたことであった。このフィルターを先の要領で洗浄したが、ただし例外は、洗浄温度も６２℃であったことであった。結合したプローブは先の要領で検出された。結果が表４に示される。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
先に示される結果により、このＤＮＡプローブは選択的にハエモフィルス インフルエンザエに対してハイブリダイズすることが確認される。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】Ｈ．インフルエンザエの血清型１、４、および５のピリン遺伝子の保存領域のグラフ表示である（各々配列番号１−３）。
【図２】図２のＡ、Ｂ、およびＣは、それぞれＬＫＰ挿入断片を含むベクターの制限酵素消化により取得される物理的マップの概略図である。
【図３】ＬＫＰ１融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。下線は、マルトース結合性蛋白質に融合されたＬＫＰ先端付着因子蛋白質の部分的アミノ酸配列を示す。
【図４】ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロットを行った膜上でＬＫＰ１先端付着因子−ＭＢＰという融合蛋白質との反応性を示す抗体によるＬＫＰ１先端付着因子蛋白質の同定を示すゲルの写真である。レーン１および２：先端蛋白質（４７Ｋｄ）を有する精製されたＬＫＰ１ピリ線毛の様々な調製物。（陽性反応が先端蛋白質と抗体との間に示された）；レーン３：先端付着因子（４７Ｋｄ）を有する精製されたＬＫＰ１０ピリ線毛（この先端蛋白質は抗体とは反応しない）；レーン４：先端蛋白質を有する精製されたＬＫＰ１１ピリ線毛（４７Ｋｄ）（この先端蛋白質は抗体とは反応しない）；レーン５：蛋白質分子量マーカーを示す。
【図５】ヒト赤血球細胞（ＨＲＣ）ゴーストに対するＬＫＰ１先端付着因子の結合性活性を示すゲルの写真である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：先端蛋白質を有する精製されたＬＫＰ１ピリ線毛；レーン３：ピリ線毛および遠心分離後のＨＣＲゴースト。先端蛋白質バンド（４７Ｋｄ）はゴーストペレットに対する先端付着因子ピリ線毛の結合に起因して消失した；レーン４：対照として用いられる遠心分離後のＨＲＣゴースト；レーン５：先端蛋白質を有さない精製されたピリ線毛（１％ＳＤＳで処理されたもの）を新鮮なゴーストと共にインキュベートしたところ、レーン３のパターンと同一の蛋白質バンドパターンが示された；レーン６：先端蛋白質を有さない精製されたピリ線毛を示す。ゲルにかける前にピリ線毛を１％ＳＤＳで処理し、２５ｍのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０、で徹底的に透析し、ＰＥＧプラスＮａＣｌによる結晶化を行い、そして２５ｍのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０、中に再溶解させた。
【図６】ヒト赤血球細胞ゴーストに対する精製されたＬＫＰ１先端付着因子蛋白質の結合性活性を示すゲルの写真である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：４７Ｋｄの分子量を有する精製された先端付着因子蛋白質（この蛋白質は１００ｍＭのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液、ｐＨ２．０、中の０．１％ＳＤＳにより取り出した）；レーン３：精製された付着因子を新鮮なヒト赤血球細胞ゴーストと共にインキュベートし、そして遠心分離によりペレット化させた後に上清をゲルにかけた。この先端付着因子バンドはＨＲＣゴーストに対する結合に起因して消失した；レーン４：精製された付着因子を沸騰させたＨＣＲゴーストと共にインキュベートし、そして遠心分離によりペレット化させ、その後にその上清をゲルにかけた。この図により４７Ｋｄを有する付着因子バンドが示され、このことにより先端付着因子蛋白質はゴーストペレットには結合しないことが示される；レーン５：遠心分離後の新鮮なゴーストの上清。これが対照として用いられた；レーン６：沸騰させたＨＲＣゴーストの遠心分離後の上清（これは新鮮なＨＲＣゴーストのものとは異なる可溶性蛋白質パターンを示し、もう一つの対照として用いられた）；レーン７：新鮮なＨＲＣゴーストと共にインキュベートされた精製先端蛋白質の別の調製物（これは、先端蛋白質と新鮮なＨＲＣゴーストペレットとの間の結合を示した）；レーン８：沸騰させたＨＲＣゴーストと共にインキュベートされた精製先端蛋白質の別の調製物（この先端蛋白質は変性させたゴーストとは結合しないことが示された）。このゲルを銀染色した。
【図７】同一の分子量を有する別のＬＫＰタイプのピリ線毛からの付着因子蛋白質示すゲルの写真である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：ＬＫＰ１０ピリ線毛；レーン３：ＬＫＰ１１ピリ線毛、ならびにレーン４〜６：ＬＫＰ１ピリ線毛の異なる精製調製物。蛋白質は銀で染色した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む血清型５ ＬＫＰ ピリン蛋白質もしくはその生物学的活性断片を含んでなる単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）蛋白質であって、かつ、該生物学的活性断片が配列番号１と少なくとも９５％同一性を有し、そして該蛋白質および生物学的活性断片がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【請求項２】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質の生物学的活性断片とマルトース結合性蛋白質もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含んでなり、かつ、該断片が該ＬＫＰ先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項３】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質またはその生物学的活性断片であって、該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列もしくはその生物学的活性断片を含んでなり、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質に結合する抗体の生産方法であって、哺乳類を配列番号１のアミノ酸配列を含む組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ） ＬＫＰ 先端付着因子融合蛋白質で免疫化することを含んでなる、上記方法。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ挿入断片を含んでなる組換え発現ベクターであって、該発現ベクターが原核生物もしくは真核生物の細胞内で該ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質を発現することができ、そして該蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、ことを特徴とする上記ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターで形質転換された原核生物もしくは真核生物の宿主細胞。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質もしくはその生物学的活性断片をコードする組換えＤＮＡ分子であって、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応するものである、上記の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
ある生物学的試料中のハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の存在についてのアッセイ方法であって、該試料をハイブリダイゼーションに適するストリンジェントな条件下で、配列番号１のアミノ酸配列を含む先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、そして該ＤＮＡに少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも４００個のヌクレオチドからなるＤＮＡプローブと、接触させる段階、およびハイブリダイズしたＤＮＡの存在を検出する段階を含む、上記の方法。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列を含む単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質であって、かつ、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【請求項１０】
配列番号６のアミノ酸配列を含む血清型５ ＬＫＰ ピリン蛋白質もしくはその生物学的活性断片を含んでなる単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）蛋白質であって、かつ、該生物学的活性断片が配列番号６と少なくとも９５％同一性を有し、そして該蛋白質および生物学的活性断片がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【請求項１１】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質の生物学的活性断片とマルトース結合性蛋白質もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含んでなり、かつ、該断片が該ＬＫＰ先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項１２】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質またはその生物学的活性断片であって、該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質が配列番号６のアミノ酸配列もしくはその生物学的活性断片を含んでなり、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項１３】
配列番号６のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質に結合する抗体の生産方法であって、哺乳類を配列番号６のアミノ酸配列を含む組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ） ＬＫＰ 先端付着因子融合蛋白質で免疫化することを含んでなる、上記方法。
【請求項１４】
配列番号６のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ挿入断片を含んでなる組換え発現ベクターであって、該発現ベクターが原核生物もしくは真核生物の細胞内で該ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質を発現することがで
き、そして該蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、ことを特徴とする上記ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターで形質転換された原核生物もしくは真核生物の宿主細胞。
【請求項１６】
配列番号６のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質もしくはその生物学的活性断片をコードする組換えＤＮＡ分子であって、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応するものである、上記の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１７】
ある生物学的試料中のハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の存在についてのアッセイ方法であって、該試料をハイブリダイゼーションに適するストリンジェントな条件下で、配列番号６のアミノ酸配列を含む先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、そして該ＤＮＡに少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも４００個のヌクレオチドからなるＤＮＡプローブと、接触させる段階、およびハイブリダイズしたＤＮＡの存在を検出する段階を含む、上記の方法。
【請求項１８】
配列番号６のアミノ酸配列を含む単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質であって、かつ、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む血清型５ ＬＫＰ ピリン蛋白質もしくはその生物学的活性断片を含んでなる単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）蛋白質であって、かつ、該生物学的活性断片が配列番号１と少なくとも９５％同一性を有し、そして該蛋白質および生物学的活性断片がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【請求項２】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質であって、配列番号１のアミノ酸配列を含む該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質の生物学的活性断片とマルトース結合性蛋白質もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含んでなり、かつ、該断片が該ＬＫＰ先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項３】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質またはその生物学的活性断片であって、該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質が配列番号１のアミノ酸配列もしくはその生物学的活性断片を含んでなり、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質に結合する抗体の生産方法であって、哺乳類を配列番号１のアミノ酸配列を含む組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ） ＬＫＰ 先端付着因子融合蛋白質で免疫化することを含んでなる、上記方法。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ挿入断片を含んでなる組換え発現ベクターであって、該発現ベクターが原核生物もしくは真核生物の細胞内で該ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質を発現することができ、そして該蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、ことを特徴とする上記ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターで形質転換された原核生物もしくは真核生物の宿主細胞。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質もしくはその生物学的活性断片をコードする組換えＤＮＡ分子であって、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応するものである、上記の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
ある生物学的試料中のハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の存在についてのアッセイ方法であって、該試料をハイブリダイゼーションに適するストリンジェントな条件下で、配列番号１のアミノ酸配列を含む先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、そして該ＤＮＡに少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも４００個のヌクレオチドからなるＤＮＡプローブと、接触させる段階、およびハイブリダイズしたＤＮＡの存在を検出する段階を含む、上記の方法。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸配列を含む単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型１ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質であって、かつ、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【請求項１０】
配列番号６のアミノ酸配列を含む血清型５ ＬＫＰ ピリン蛋白質もしくはその生物学的活性断片を含んでなる単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）蛋白質であって、かつ、該生物学的活性断片が配列番号６と少なくとも９５％同一性を有し、そして該蛋白質および生物学的活性断片がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【請求項１１】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質であって、配列番号６のアミノ酸配列を含む該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質の生物学的活性断片とマルトース結合性蛋白質もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含んでなり、かつ、該断片が該ＬＫＰ先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項１２】
組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質またはその生物学的活性断片であって、該ＬＫＰ先端付着因子融合蛋白質が配列番号６のアミノ酸配列もしくはその生物学的活性断片を含んでなり、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応し、そして該融合蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記融合蛋白質。
【請求項１３】
配列番号６のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質に結合する抗体の生産方法であって、哺乳類を配列番号６のアミノ酸配列を含む組換えハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ） ＬＫＰ 先端付着因子融合蛋白質で免疫化することを含んでなる、上記方法。
【請求項１４】
配列番号６のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ挿入断片を含んでなる組換え発現ベクターであって、該発現ベクターが原核生物もしくは真核生物の細胞内で該ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ 先端付着因子蛋白質を発現することがで
き、そして該蛋白質がハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、ことを特徴とする上記ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターで形質転換された原核生物もしくは真核生物の宿主細胞。
【請求項１６】
配列番号６のアミノ酸配列を含むハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質もしくはその生物学的活性断片をコードする組換えＤＮＡ分子であって、該断片が該先端付着因子蛋白質の対応する配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつ、該断片が該先端付着因子蛋白質と特異的に反応する抗体と特異的に反応するものである、上記の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１７】
ある生物学的試料中のハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の存在についてのアッセイ方法であって、該試料をハイブリダイゼーションに適するストリンジェントな条件下で、配列番号６のアミノ酸配列を含む先端付着因子蛋白質をコードするＤＮＡ分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、そして該ＤＮＡに少なくとも９０％の同一性を有する少なくとも４００個のヌクレオチドからなるＤＮＡプローブと、接触させる段階、およびハイブリダイズしたＤＮＡの存在を検出する段階を含む、上記の方法。
【請求項１８】
配列番号６のアミノ酸配列を含む単離されたハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）血清型５ ＬＫＰ先端付着因子蛋白質であって、かつ、ハエモフィルス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の感染に対して防御するか、もしくは感染症を治療する能力を有する、上記蛋白質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−６７７０７（Ｐ２００８−６７７０７Ａ）
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４９２２３（Ｐ２００７−２４９２２３）
【出願日】平成１９年９月２６日（２００７．９．２６）
【分割の表示】特願平８−５０５１４２の分割
【原出願日】平成７年７月１３日（１９９５．７．１３）
【出願人】（５０７２８７０７６）ワイス・ホールディングズ・コーポレーション (1)
【出願人】（５０７２８７０８７）バクテツクス・インコーポレーテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２６日（２００７．９．２６）
【分割の表示】特願平８−５０５１４２の分割
【原出願日】平成７年７月１３日（１９９５．７．１３）
【出願人】（５０７２８７０７６）ワイス・ホールディングズ・コーポレーション (1)
【出願人】（５０７２８７０８７）バクテツクス・インコーポレーテツド (1)
【Ｆターム（参考）】
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