微小管重合阻害化合物、及びその利用
【課題】１‐ナフトール誘導体の新たな利用を提供する。
【解決手段】本発明は、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、上記微小管重合阻害化合物が、１‐ナフトール誘導体である微小管重合阻害化合物を提供する。
【解決手段】本発明は、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、上記微小管重合阻害化合物が、１‐ナフトール誘導体である微小管重合阻害化合物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物、及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微小管は、細胞構造の基盤をなす構成因子であり、広範囲な細胞機能・細胞機序（例えば、細胞運動、細胞分裂、細胞形態の維持、細胞内輸送）に関連している。その一方で、酵母細胞においては、微小管は、染色体及び核の移動に関連している。微小管は、α‐チューブリン及びβ‐チューブリンのヘテロダイマーで構成されており、このヘテロダイマーが重合することで、微小管のダイナミックな挙動が実現される（非特許文献１，２）。
【０００３】
このような微小管のダイナミックな挙動を妨げる薬剤は、染色体結合性、分裂期のスピンドルに欠損が生じ、結果として、細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ期・分裂期に停止させる。抗癌治療法の進展をさらに促進するために、微小管重合を阻害する、あるいは微小管の脱重合をブロックすることにより、微小管のアセンブリーを調節可能な薬剤が期待される。
【０００４】
従来、細胞内での微小管重合を阻害する阻害活性を示す化合物として、Ｐｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）（非特許文献３），Ｔｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅ（チアベンダゾール），Ｂｅｎｏｍｙｌ（ベノミル），Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ（ノコダゾール）等が知られている。
【０００５】
また、１‐ナフトール誘導体は、細胞内でのｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）の活性を阻害することが知られている(非特許文献４)。
【非特許文献１】Solomon, F., Analyses of the cytoskeleton in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Biol., 7, 633-662 (1991).
【非特許文献２】Botstein, D., Amberg, D., Mulholland, J., Huffaker, T., Adams, A., Drubin, D., and Stearns, T., The yeast cytoskeleton, 1. In “The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae” eds. Pringle, J., R., Broach, J. R., and Jones, E. W., pp. 1-90 (1997).
【非特許文献３】Usui, T., Watanabe, H., Nakayama, H., Tada, Y., Kanoh, N., Kondoh, M., Asao, T., Takio, K., Watanabe, H., Nishikawa, K., Kitahara, T., and Osada, H., The anticancer natural product pironetin selectively targets Lys352 of α-tubulin. Chem, Biol., 8 11, 799-806 (2004).
【非特許文献４】Current Medical Chemistry, 2006,13,3663-3674
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２は、アラキドン酸からのプロスタグランジン生合成の律速酵素であり、生体内の必須脂肪酸であるアラキドン酸からＰＧやトロンボキサンが生成される過程で、中間体であるＰＧＨ２の生成に関与する酵素である。上述のように、１‐ナフトール誘導体は、動物細胞では、細胞内でのＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の活性を阻害することが知られている。
【０００７】
しかしながら、現在のところ、細胞増殖の基盤をなす機構（細胞運動、細胞分裂、細胞形態の維持、細胞内輸送）に対する１‐ナフトール誘導体の影響は、全く解明されていない。
【０００８】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、１‐ナフトール誘導体の新たな利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、１‐ナフトール誘導体による生育阻害を抑制する、すなわち１‐ナフトール誘導体に対し耐性を示す酵母優性変異株を単離し、その変異株は、α‐チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子（配列番号１）が変異しているという知見を見出した。そして、この知見により、１‐ナフトール誘導体が微小管重合阻害化合物として利用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の微小管重合阻害化合物は、上記の課題を解決するために、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、上記微小管重合阻害化合物が、１‐ナフトール誘導体であることを特徴としている。
【００１１】
また、本発明の微小管重合阻害化合物では、上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（１）または（２）
【００１２】
【化１】
【００１３】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくは水酸基に変換し得る基を表す。）
で示される化合物であることが好ましい。
【００１４】
上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくはメトキシル基を表わすことが好ましい。
【００１５】
また、本発明の微小管重合阻害化合物では、上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（３）
【００１６】
【化２】
【００１７】
で示される化合物であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の微小管重合阻害化合物は、微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとしていることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の微小管重合阻害剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２０】
また、上記の微小管重合阻害剤においては、微小管重合阻害剤に対する上記微小管重合阻害化合物の量が、２０μＭよりも多くなっていることを特徴としている。
【００２１】
また、本発明の抗癌剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２２】
また、本発明の抗カビ剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２３】
また、本発明の除草剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２４】
また、本発明の駆虫剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２５】
以上のように、本発明は、微小管重合阻害化合物としての１‐ナフトール誘導体の新たな利用を提供する。微小管重合阻害化合物は、主要な機能として、細胞の増殖を阻害する、もしくは細胞を死滅させる機能を有する。それゆえ、本発明は、医療分野、農業分野等の多岐の用途に有効利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２７】
（１）微小管重合阻害化合物
本発明の化合物（以下、本化合物と記す）は、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、１‐ナフトール誘導体であることを特徴としている。
【００２８】
「細胞内の微小管重合を阻害する作用」（以下、単に本作用と記す）とは、真核細胞におけるα‐チューブリン及びβ−チューブリンのヘテロダイマー同士の重合を阻害する作用のことを意味する。微小管は、α‐チューブリン及びβ−チューブリンのヘテロダイマーを単位構成分子とし、この単位構成分子同士が重合されている。そして、真核細胞内において、微小管は、ヘテロダイマー同士が重合・解離を繰り返すことで、ダイナミックに挙動する。この微小管のダイナミックな挙動は、主に核移動または核分裂時期に起きる。それゆえ、本作用により、真核細胞は、核移動時期、または核分裂時期で停止する。
【００２９】
本発明者は、１‐ナフトール誘導体による生育阻害を抑制する、すなわち１‐ナフトール誘導体に対し耐性を示す酵母優性変異株を単離し、その変異株は、α‐チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子が変異しているという知見を見出した。そして、実際に、１‐ナフトール誘導体処理により、酵母細胞における微小管の重合が阻害される（本作用を示す）ことを顕微鏡観察により確認した。
【００３０】
より具体的には、本化合物は、下記化学式（１）または（２）
【００３１】
【化３】
【００３２】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくは水酸基に変換し得る基を表す。）
で示される１‐ナフトール誘導体である。
【００３３】
化学式（１）または（２）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4で表される水酸基に変換し得る基としては、炭素数１ないし６のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基など）、炭素数６ないし１０のアリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基など）、炭素数７ないし１２のアラルキルオキシ基（例えば、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、ナフチルエチルオキシ基など）、炭素数１ないし６のアルキルカルボニルオキシ基（例えば、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基など）、炭素数６ないし１０のアリールカルボニルオキシ基（例えば、ベンゾイルオキシ基、ナフチルカルボニルオキシ基など）、炭素数７ないし１２のアラルキルカルボニルオキシ基（例えば、ベンジルカルボニルオキシ基、フェネチルカルボニルオキシ基など）、糖類などが挙げられる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4で表される水酸基に変換し得る基は、置換基を有していてもよく、これら置換基としては、例えば、ハロゲン、糖類、アルコキシ基、カルボキシル基、スルホ基が挙げられる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4としては、水酸基、もしくはメトキシル基が好ましい。
【００３４】
好ましくは、本微小管重合阻害化合物は、下記化学式（３）
【００３５】
【化４】
【００３６】
で示される１‐ナフトール誘導体（ＮＫＨ−７）である。
【００３７】
また、本微小管重合阻害化合物は、下記化学式（４）〜（６）の何れかで示される１‐ナフトール誘導体であってもよい。化学式（４）〜（６）で示される１‐ナフトール誘導体はそれぞれ、後述の実施例に記載のＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２である。
【００３８】
【化５】
【００３９】
【化６】
【００４０】
【化７】
【００４１】
化学式（３）〜（６）に示される１‐ナフトール誘導体（ＮＫＨ−７、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２）は、後述の実施例に記載のように、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧する薬剤のポジティブスクリーニングにより取得された化合物である。そして、これら１‐ナフトール誘導体のうち、ＮＫＨ−７に対し薬剤耐性を示す酵母優性変異株として、α‐チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子の変異株（ＴＵＢ１−２４８変異株）を取得している（図１参照）。ＴＵＢ１−２４８変異株における変異型ＴＵＢ１遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示されるものであり、それがコードする変異型Ｔｕｂ１蛋白のアミノ酸配列は配列番号４に示すものであった。より具体的には、ＴＵＢ１−２４８変異株が有する変異型ＴＵＢ１遺伝子は、野生型ＴＵＢ１遺伝子（配列番号１）の８５７番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換（点変異）されており、その結果野生型Ｔｕｂ１蛋白のアミノ酸配列（配列番号３）における２４８番目のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換されていた。さらに、本発明者は、このＴＵＢ１−２４８変異株が、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２に対しても薬剤耐性を示すことを確認している。また、後述の実施例に記載のように、従来知られている微小管重合阻害剤（ノコダゾール，ピロネチン）は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧することを明らかにしている（図７参照）。
【００４２】
これらの知見から、微小管重合を阻害する作用を示す化合物は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧するという特性を有していることが考えられる。さらに、ＴＵＢ１−２４８変異株は、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２に対しても薬剤耐性を示す。このことから、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２は、ＮＫＨ−７と同様に微小管重合阻害作用を示すと考えられる。
【００４３】
また、本化合物は、微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとしていることと特徴としている。
【００４４】
「微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとしている」ことは、化合物存在下でＴＵＢ１−２４８変異株が耐性を示すか否かにより判定することが可能である。本化合物がα‐チューブリンをターゲットとしている場合、ＴＵＢ１−２４８変異株が耐性を示すことになる。ここでいう「耐性を示す」とは、野生型株が生育可能な化合物の上限濃度で、ＴＵＢ１−２４８変異株が生育していることを意味する。
【００４５】
通常、化合物の濃度系列をとって各濃度における野生型株の生育状況を調べると、化合物濃度が高くなるに従い野生型株の生育が弱くなる。そして、化合物が特定の濃度に達すると、野生型株は生育できなくなる。この野生型株が生育できなくなる濃度が、上記の上限濃度になる。ＴＵＢ１−２４８変異株が化合物に対し耐性を示す場合、ＴＵＢ１−２４８変異株の生育状況は、以下のようになる。
【００４６】
すなわち、野生型株とＴＵＢ１−２４８変異株との間で、化合物の濃度系列をとって生育状況を比較したとき、各濃度において、野生型株とＴＵＢ１−２４８変異株との間で生育の違いを目視できるとともに、ＴＵＢ１−２４８変異株は、野生型株が生育可能な化合物の上限濃度で生育している。すなわち、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで、生育可能な上限濃度が異なっている。
【００４７】
上記のように、ＴＵＢ１−２４８変異株は、α−チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子に変異が生じており、α‐チューブリンの機能が野生型株と異なっている。一方、β−チューブリンの機能は、野生型株と同等である。もし、微小管重合阻害化合物がβ−チューブリンをターゲットとする場合、この化合物によるβ−チューブリンの機能低下は、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで同じ程度になる。そして、この機能低下の影響で、生育可能な微小管重合阻害化合物の上限濃度が、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで略同じなる。一方、微小管重合阻害化合物がα−チューブリンをターゲットとする場合、この化合物によるα‐チューブリンの機能は、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで異なる。この機能の相違により、生育可能な微小管重合阻害化合物の上限濃度が、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで異なる。つまり、耐性を示すことになる。
【００４８】
このように、ＴＵＢ１−２４８変異株が耐性を示すか否かにより、微小管重合阻害化合物がα−チューブリンをターゲットとするのかを判定することができる。
【００４９】
（２）本化合物の製造方法
本化合物を得るには、天然物から目的の化合物を抽出精製する方法、天然物から抽出精製された化合物を修飾することにより化学合成する方法、目的とする化合物を全化学合成する方法などが考えられるが、本発明はこれら製造方法により限定されるものではない。
【００５０】
本化合物を得る方法の一つとして、目的とする化合物を全化学合成する方法が挙げられる。この場合、例えば、非特許文献４に記載のように、１−ハイドロキシ−２−ナフトエ酸を出発物質した合成方法が挙げられる。また、合成された化合物の確認は、例えば、薄相クロマトグラフィーや元素分析などを行うことにより可能である。あるいは、合成された化合物の質量分析、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲの結果を基準品と比較することにより可能である。
【００５１】
（３）本発明の微小管重合阻害剤
本発明の微小管重合阻害剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有しているものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の微小管重合化合物（例えば、ピロネチン、チアベンダゾール、ベノミル、またはノコダゾール）を含んでいてもよい。
【００５２】
また、溶媒は、本化合物を溶解することができる溶媒であれば特に限定されない。特に、本化合物として、上記化学式（２）〜（６）に示された１‐ナフトール誘導体を使用する場合、溶媒として、エタノール等のアルコール系溶媒（アルコール系有機溶媒）を使用することが好ましい。
【００５３】
また、微小管重合阻害剤に対する本化合物の量は、対象の細胞の薬剤透過性や微小管重合阻害効果に応じて、適宜設定することができる。後述の実施例に記載のように、酵母野生型株が増殖可能なＮＫＨ−７の濃度の上限は２０μＭである。対象の細胞が出芽酵母細胞である場合、微小管重合阻害剤に対する本化合物の量は、２０μＭよりも多くなっていることが好ましい。
【００５４】
（４）本化合物の利用
微小管重合阻害化合物は、主要な機能として、細胞の増殖を阻害する、もしくは細胞を死滅させる機能を有する。それゆえ、本化合物または微小管重合阻害剤は、医療分野、農業分野等の多岐の用途とし、抗癌剤、抗カビ剤、駆虫剤、除草剤などに有用である。
【００５５】
本化合物を抗癌剤として使用する場合、本発明の化合物は単独で投与しても良いし、あるいは医薬的に許容される担体に含有させても良い。担体としては固形、半固形、又は液状の希釈剤、充填剤、及びその他の処用の助剤などが用いられる。本発明の化合物を含有する医薬組成物は、経口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与等）又は経直腸的に投与することができ、これらの投与方法に適した剤型で投与される。
【００５６】
経口投与は固形または液状の用量単位、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、舌下錠、坐剤、その他の剤型によって行うことができる。固形の医薬組成物は、適切な結合剤、滑剤、分散剤、希釈剤、崩壊剤、風味剤、着色料、香料、流動化剤、および溶解剤などを含んでもよい。液状の医薬組成物は、水溶液または水懸濁液、医薬に許容可能な脂肪または油、アルコール類またはその他の有機溶剤、例えば乳濁液、エステル、エリキシル、シロップ、非発泡性顆粒から作った溶液、または懸濁液、発泡性顆粒から作った発泡性製剤などを含んでもよい。また、適した溶剤、保存料、乳化剤、沈殿防止剤、希釈剤、甘味料、増粘剤および溶解剤を含有してもよい。さらに、風味剤、香料、着色料を含有してもよい。
【００５７】
組織内投与は液状の用量単位、例えば溶液や懸濁剤の形態として、皮下・筋肉又は静脈内注射などにより行うことができる。これらのものは、本化合物を、注射の目的に適合する非毒性の液状担体に溶解し利用することができる。さらに、非毒性の塩や塩溶液を添加してもよい。また安定剤、保存剤、乳化剤のようなものを併用することもできる。
【００５８】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５９】
〔Ｉ：材料および方法〕
（１）酵母細胞株、培地、及び化学化合物
本実施例に使用される酵母細胞株を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
（表１の「遺伝子型」の欄中、４文字（３文字＋番号）表記であり、かつ小文字である遺伝子（例えばｔｒｐ１，ｐｄｒ１等）は、劣性変異遺伝子を示す。また、４文字（３文字＋番号）表記であり、かつ大文字である遺伝子（例えばＨＩＳ３，ＴＲＰ１等）は、野生型遺伝子を示す。また、「a：：Ｂ」（例えば、ｚｄｓ１：：ＴＲＰ１）は、出芽酵母ゲノムにおけるａ遺伝子（例えばＺＤＳ１遺伝子）座に、Ｂ遺伝子（例えばＴＲＰ１遺伝子）が挿入された遺伝子型を表わす。すなわち、「a：：Ｂ」が表記された株は、ａ遺伝子が発現する代わりにＢ遺伝子が発現しており、ａ遺伝子が破壊されている。また、「ＭＡＴ」は出芽酵母の接合型を表わし、「ＭＡＴａ」は、ａタイプの接合型を表わす。また、４文字以上の表記であり、かつ大文字である遺伝子（例えば、ＴＵＢ１‐２４８）は、優性変異遺伝子を表わす。また、ＴＵＢ１‐ＧＦＰは、ＧＦＰ遺伝子が連結されたＴＵＢ１遺伝子を表わす。）
表１においては、遺伝子型を簡潔に説明するとの観点から、ａタイプの接合型（Ｍａｔａ）の酵母株のみを示している。本実施例においては、表１に示す遺伝子型を有するαタイプの接合型（Ｍａｔα）の酵母株も使用している。そして、互いに異なる遺伝子型を有するａタイプの接合型及びαタイプの接合型同士を掛け合わせたヘテロ二倍体について、従来公知の方法を用いて作製した二重変異株も使用している。
【００６２】
なお、以降の説明では、表１の記載に準じて、特に明記しない限り、遺伝子を４文字（３文字＋番号）で、かつ小文字で表記したとき、その遺伝子は劣性遺伝子である。そして、遺伝子Ａの破壊株をａΔと表記する。また、遺伝子を４文字（３文字＋番号）表記で、かつ大文字で表記したとき、その遺伝子は野生型遺伝子である。また、遺伝子を４文字以上の表記で、かつ大文字で表記したとき（例えば、ＴＵＢ１‐２４８）、その遺伝子は優性変異遺伝子である。
【００６３】
ＮＫＨ−７耐性変異株のスクリーニングに用いられる１‐ナフトール誘導体化合物は、Cur.Med. Chem., 13, 3663-3674 (2006) Kongkathip,.et.alに従って、合成された。以下の化合物が、ポジティブスクリーニングアッセイにより生物活性を示し、かつ本実施例で用いられる。
ＮＫＨ−７；2-((1-(hydroxymethyl) cyclohexyl) methyl) naphthalen-1-ol
ＮＫＨ−８；1-methoxy-2-((1-(hydroxyl) cyclohexyl) methyl) naphthalene
ＮＰ−１ ；1-methoxy-2-((1-(hydroxyl) cyclopentyl) methyl) naphthalene
ＮＰ−２ ；2-((1-hydroxymethyl) cyclopentyl) methyl) naphthalen-1-ol
また、微小管重合阻害化合物である、methyl 1-(butylcarbarmoyl)-2-benzimidazole [benomyl]、2-(4-thiazolyl) benzimidazole [チアベンダゾール]、及びノコダゾールをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。また、ピロネチン(Pironetin)は、日本化薬より供与された。
【００６４】
（２）薬剤のポジティブスクリーニングの手順
Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1942-1946 (2000). Shitamukai et alに記載されている方法に従い、ＣａＣｌ２を１５０ｍＭ含有するＹＰＤソフトアガー培地上で、ハローアッセイにより薬剤のポジティブスクリーニングが行われた。活性基質の半定量アッセイを行うために、アガー培地の表面に、試料化合物のエタノール溶液３μｌ分量をスポットした。そして、３０℃、２日間の培養後、スポットされた試料化合物の周囲に現れた増殖ゾーンを観察した。また、酵母細胞の生育は、ＹＰＤ液体培地中でモニターされた。具体的には、３０℃で振盪培養した培養液における、６００ｎｍ波長の吸光度を、バイオフォトレコーダー (東洋エンジニアリング製作所, 東京)を用いて測定した。
【００６５】
（３）蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による分析
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でＤＮＡを染色した細胞のＤＮＡ含量を、FACSCalibur；ＦＡＣＳキャリバー (Becton, Dickinson, Franklin Lakes, NJ)により分析した。
【００６６】
（４）ＮＫＨ−７耐性を示す酵母変異株の、単離及び遺伝学的キャラクタリゼーション
総細胞数約１０７個のＹＦＫ３６酵母細胞を、ＮＫＨ−７を１０μＭ含有するＹＰＤアガー培地にスプレッドした。そして、３０℃で２日間培養後、自然変異（スポンタニアス変異）により、培地上に出現したコロニーをピックアップした。ピックアップしたコロニーの細胞に関する遺伝学的解析は、J. Biol. Chem., 277, 28810-28814 (2002) Miyamoto et al、及びBiosci. Biotechnol. Biochem., 70, 2451-2459 21 (2006) Kobayashi et alに記載の方法に基づいて行われた。
【００６７】
（５）ＹＮＲ１−１優性変異遺伝子のクローニング
ＹＦＫ３６への形質転換のために、ＵＲＡ３マーカー及びセントロメアを有するｐＲＳ３１６ベクターを用いたことを除いて、J. Biol. Chem., 277, 28810-28814 (2002) Miyamoto et al、及びBiosci. Biotechnol. Biochem., 70, 2451-2459 21 (2006) Kobayashi et alに記載の方法に基づいて、ＹＮＲ１−１優性酵母変異株のゲノムバンクを構築した。約３００００個のゲノムバンク形質転換体のコロニーをピックアップした。ピックアップした形質転換体を、ＮＫＨ−７を４μＭ含有するＹＰＤアガー培地にスプレッドし、３０℃で３日間培養した。そして、ゲノムバンク形質転換体のうち、ＮＫＨ−７耐性を示す形質転換体をピックアップした。ピックアップした形質転換体からプラスミドを回収し、回収したプラスミドを再度ＹＦＫ３６へ形質転換することで、ＮＫＨ−７耐性がプラスミドに由来することを確認した。
【００６８】
（６）ＧＦＰ融合ＴＵＢ１蛋白を発現する薬剤感受性酵母株の構築
ＴＵＢ１−ＧＦＰ遺伝子を含む自己挿入型プラスミドｐＡＦＳ１２５を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し線状プラスミドにした後、ＹＦＫ３６へ形質転換した。この形質転換により、ＴＵＢ１−ＧＦＰ遺伝子コンストラクトが、ＹＦＫ３６のゲノムのＵＲＡ３遺伝子座に挿入されることになる。つまり、プラスミドｐＡＦＳ１２５が、ＵＲＡ３遺伝子座に挿入される。
【００６９】
（７）蛍光顕微鏡観察
ＧＦＰで蛍光標識されたチューブリンを観察するために、ＹＰＤ培養液でＧＦＰ融合Ｔｕｂ１蛋白を発現する細胞を対数増殖期まで培養後、培養液に対する濃度が２μＭになるようにＮＫＨ−７を添加した。ＮＫＨ−７添加後、さらに２５℃で３０分間培養後の細胞を蛍光顕微鏡観察に用いた。具体的には、ＮＫＨ−７処理した細胞を、室温の遠心分離により集菌し、生理食塩水で２回洗浄した。そして、この細胞内で発現する、ＧＦＰで蛍光標識されたチューブリンを観察した。
【００７０】
〔ＩＩ：結果〕
（１）１‐ナフトール誘導体化合物としてのＮＫＨ−７は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧する。
【００７１】
Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1942-1946 (2000). Shitamukai et alに記載されている方法に従い、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧するポジティブ薬剤をスクリーニングした。その結果、ＮＫＨ−７及びそれに構造的に類似した化合物が取得された。これら化合物について、１５０ｍＭＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのＹＮＳ１７株の生育の影響を調べた結果を図１に示す。外因性のＣａＣｌ２存在下で、酵母細胞は、細胞内のＣａ２＋シグナリングが過度に活性化することに起因して、生育が遅延する（細胞周期のＧ２期の進行が遅れる）ことが分かっている。また、ｚｄｓ１破壊酵母変異株は、上記のＣａ２＋シグナリングの過度の活性化により、外因性のＣａＣｌ２存在下で、生育遅延が顕著になり、結果として生育停止することが分かっている。もし、上記のＣａ２＋シグナリングの過度の活性化を抑制する薬剤が存在すれば、この薬剤によりｚｄｓ１破壊酵母変異株のＣａＣｌ２存在下での生育遅延を回復すると考えられる。
【００７２】
図１に示されるように、ＮＫＨ−７及びそれに構造的に類似した化合物がＹＰＤアガー培地上にスポットし、３０℃２日間培養した後、ｚｄｓ１破壊酵母変異株は、ＣａＣｌ２存在下で、スポットした部分を中心に増殖ゾーンのハローを形成していた。このことは、これらの化合物が生育遅延を回復することを示唆している。また、ＮＫＨ−７をスポットした場合、増殖ゾーンの内側に明確な増殖阻止ゾーンが観察された（つまり、スポット下部分を中心として、ドーナツ状の増殖ゾーンが観察された）。
【００７３】
（２）ＮＫＨ−７による、細胞分裂及び核分裂の阻害
酵母は、動物細胞と比較して一般的に薬剤感受性が低いことが知られている。この原因としては、酵母細胞表層における薬剤透過性の低さ、及び毒性物質に対抗する生命維持装置としての強力な多剤耐性機構が挙げられる。それゆえ、酵母野生型株は、薬剤感受性感度が低く、ＮＫＨ−７による生育阻害効果を調べることが困難であるという問題がある。そこで、本願発明者らは、この薬剤感受性感度の低さを改善するために、様々な薬剤体制機構にかかわる各種遺伝子を破壊した酵母変異株ＹＦＫ３６を構築した。具体的には、ＹＦＫ３６は、細胞膜における薬剤透過性の低さにかかわっている膜エルゴステロールの生合成遺伝子の１つであるＥＲＧ３遺伝子、多剤耐性ＡＢＣトランスポーターをコードするＰＤＲ１遺伝子・ＰＤＲ３遺伝子・ＰＤＲ５遺伝子、及びその他薬剤耐性に関わる膜タンパクをコードするＹＲＲ１遺伝子並びにＹＯＲ１遺伝子が破壊されている。これら６つの遺伝子を全て破壊した酵母六重破壊株は、個々の遺伝子を破壊した単独破壊株よりも、ＮＫＨ−７に対する感受性感度が向上していることを確認している。
【００７４】
この薬剤感受性感度が向上した酵母変異株ＹＦＫ３６を用いて、ＮＫＨ−７存在下での細胞の動態を調べた。まず、酵母野生型株及び酵母変異株ＹＦＫ３６について、ＮＫＨ−７に対する感受性感度を比較した。その比較結果を図２のＡ及びＢに示す。図２のＡに示されるように、酵母野生型株であるＷ３０３は、６μＭのＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地上で正常に増殖している。なお、本願発明者は、ＹＰＤ培地中のＮＫＨ−７の濃度が、２０μＭになるまで、酵母野生型株が正常に増殖していることを確認している。すなわち、酵母野生型株が増殖可能なＮＫＨ−７の濃度の上限が、２０μＭである。一方、図２のＡに示されるように、酵母変異株ＹＦＫ３６は、３〜４μＭのＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地上で増殖していない。このＮＫＨ−７の濃度依存的な増殖阻害は、図２のＡに示されるＹＰＤ液体培地中での増殖曲線から明らかである。
【００７５】
また、図２のＢに、ＮＫＨ−７で処理した酵母細胞と、ＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）とを顕微鏡観察により比較した結果を示す。なお、図２のＢでは、ＰＩで核染色し、核分裂の動態も比較している。図２のＢに示されるように、ＮＫＨ−７を３μＭ含むＹＰＤ液体培地で３時間培養したとき、酵母細胞（ＹＦＫ３６）は、細胞形態が均一化しており、大部分（約９０％）が、ラージバットの形態になっていた。さらに、ＰＩ染色により核を観察すると、これらの細胞は、単核になっており、細胞内で拡散していた。このことから、ＮＫＨ−７処理により、酵母細胞は、細胞周期の核の分配（核分裂）に欠損が生じることが示唆された。一方、ＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）では、細胞形態が均一化されておらず、細胞周期が正常に進行していることがわかる。この比較結果から、ＮＫＨ−７処理により、酵母細胞は、バッドの出現及び伸長は正常に進行する一方、バッド伸長後の細胞質分裂で停止していることが明らかになった。
【００７６】
さらに、図２のＣに、ＮＫＨ−７で処理した酵母細胞と、ＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）とをＦＡＣＳ解析により比較した結果を示す。図２のＣに示されるように、ＮＫＨ−７処理により、ＤＮＡ含量が２Ｃの酵母細胞が蓄積していることがわかった。このことから、ＮＫＨ−７処理により、酵母細胞は、ＤＮＡ複製が正常に進行する一方、ＤＮＡ複製後の染色体分離が進行しないことが明らかになった。
【００７７】
図２のＡ〜Ｃに示された結果から、ＮＫＨ−７は、細胞分裂及び核分裂の進行をブロックする薬剤であることが示された。
【００７８】
（３）ＮＫＨ−７耐性を示す酵母変異株の、単離及び遺伝学的キャラクタリゼーション
本発明者らは、ＮＫＨ−７の細胞毒性（増殖阻害）の作用を解析するため、遺伝学的手法を用いて、ＮＫＨ−７の細胞内のターゲットを同定した。具体的には、ＮＫＨ−７に対し耐性を示す酵母変異株のスクリーニングを行った。
【００７９】
このスクリーニングでは、まず、親株であるＹＦＫ３６酵母細胞から、自然変異により、ＮＫＨ−７耐性を示す変異株を７７株選抜した。なお、耐性の判別は、４μＭのＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地で増殖可能であるか否かを指標にして行われた。次に、これら７７株について、この耐性がＮＫＨ−７特異的であるか否かを調べた。具体的には、選抜した７７株について、ローダミン６Ｇ、フルフェナジン、４‐ニトロキノリン１‐オキサイド、及びサイクロヘキシイミドといった薬剤に対する耐性を調べた。その結果、ＮＫＨ−７特異的に耐性を示す酵母変異株を３９株選抜した。
【００８０】
これら３９株それぞれについて、親株と掛け合わせたヘテロ２倍体を作製した。そして、このヘテロ２倍体がＮＫＨ−７耐性を示すか否かを指標として、３６株の優劣判定（優性変異か劣性変異かの判定）を行った。その結果、優性変異または半優性変異を示す８株を選抜した。さらに、これら８株と親株と掛け合わせたヘテロ２倍体を胞子形成後、四分子解析を行った結果、各へテロ２倍体の胞子から得られた４つの配偶子の表現型が、２：２に分離されていた（ＮＫＨ−７耐性の配偶子：ＮＫＨ−７非耐性の配偶子が２：２）。このことから、これら８株の変異は、単一変異であることが確認された。
【００８１】
次に、これら８株同士を掛け合わせた２倍体の表現型を調べることにより、８株を相補性グループに分けた。その結果、８株のうち、６株が単一の相補性グループＹＮＲ−１に属し、残りの２株がそれぞれ、別々の相補性グループＹＮＲ−２及びＹＮＲ−３に属することがわかった。以下、最も多くの酵母変異株が属する単一の相補性グループＹＮＲ−１に着目して、解析を行った。図３のＡに、相補性グループＹＮＲ−１に属する酵母変異株の１つＹＮＲ１−１変異株の表現型を示す。図３のＡに示されるように、野生型（ＷＴ）とＹＮＲ１−１変異株とを掛け合わせたヘテロ２倍体（ＷＴ／ＹＮＲ１−１）は、野生型ホモ２倍体（ＷＴ／ＷＴ）と比較して、より高い濃度のＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地で増殖している。また、ＹＮＲ１−１ホモ２倍体（ＹＮＲ１−１／ＹＮＲ１−１）は、ヘテロ２倍体（ＷＴ／ＹＮＲ１−１）と比較して、より高い濃度のＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地で増殖している。このことから、ＹＮＲ１−１変異は、半優性変異であることがわかる。
【００８２】
（４）ＹＮＲ１−１変異に起因する遺伝子の同定
ＹＮＲ１−１変異に起因する遺伝子を同定する目的で、まず、本発明者は、ＹＮＲ１−１株のゲノム断片をセントロメアベースのベクターに連結したゲノムライブラリを構築した。そして、このゲノムライブラリを親株へ形質転換し、これら形質転換体のうち、ＮＫＨ−７耐性を示す形質転換体を選抜した。この形質転換体からプラスミドを回収し、該プラスミドに挿入されているＹＮＲ１−１株由来のゲノム断片をシークエンシング（塩基配列決定）した。その結果、このゲノム断片は、ＹＭＬ０８３ｃ及びＹＭＬ０８４ｃのＯＲＦ、並びにＴＵＢ１遺伝子を含むことが明らかになった。さらに、このゲノム断片からＴＵＢ１遺伝子のみをサブクローニングし、親株に形質転換すると、形質転換体がＮＫＨ−７耐性を示した。これにより、ＹＮＲ１−１変異に起因する遺伝子がＴＵＢ１遺伝子であることが分かった。つまり、ＹＮＲ１−１変異株は、ＴＵＢ１遺伝子の変異により、ＮＫＨ−７耐性を示すことが明らかになった。
【００８３】
さらに、上記ＴＵＢ１遺伝子のみをサブクローニングした断片をシークエンシングし、変異ＴＵＢ１遺伝子の変異点を同定した。その結果、この変異ＴＵＢ１遺伝子は、野生型ＴＵＢ１遺伝子と比較して、アミノ酸配列の２４８番目のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換する変異であることが分かった（図３のＣ）。さらに、ＰＣＲによる点変異導入法を用いて、野生型ＴＵＢ１遺伝子に上記変異点を導入した。そして、この遺伝子をセントロメアベースのベクターに連結したプラスミドｐＲＳ−ＴＵＢ１−２４８を構築し、親株に形質転換した。この形質転換体の表現型を図３のＢに示す。ｐＲＳ−ＴＵＢ１−２４８の形質転換体は、図３のＢに示されるように、ＮＫＨ−７耐性を示した。さらに、この形質転換体は、図３のＡに示すヘテロ２倍体（ＷＴ／ＹＮＲ１−１）と類似したＮＫＨ−７耐性レベルを示した。このことから、ＹＮＲ１−１変異株は、ＴＵＢ１遺伝子の変異により、ＮＫＨ−７耐性を示すことが確認された。以下、ＹＮＲ１−１変異株をＴＵＢ１−２４８変異株と称する。
【００８４】
出芽酵母(S.cerevisiae)ゲノムにおいて、α‐チューブリンをコードする遺伝子として、ＴＵＢ１遺伝子、及びＴＵＢ３遺伝子が知られている。ゲノム上のＴＵＢ１遺伝子を破壊したｔｕｂ１遺伝子破壊株は、生育不能、すなわち致死になる。一方、ＴＵＢ３遺伝子を破壊したｔｕｂ３遺伝子破壊株は、生育可能である。また、ＴＵＢ３遺伝子の発現量は、ＴＵＢ１遺伝子に比べ低くなっている。それゆえ、出芽酵母においては、ｔｕｂ１蛋白及びｔｕｂ３蛋白のうち、ｔｕｂ１蛋白がα‐チューブリンの主要な機能を担っている。
【００８５】
そこで、野生型ＴＵＢ１遺伝子及びＴＵＢ１−２４８変異遺伝子の両バックグラウンドおける、ｔｕｂ３遺伝子破壊株のＮＫＨ−７に対する影響を調べた。もし、α‐チューブリンがＮＫＨ−７の作用機序のターゲットであるとすると、野生型ＴＵＢ１遺伝子のバックグラウンドで、ＴＵＢ３遺伝子破壊株は、ＮＫＨ−７に対して感受性であることが予想される。図４に示されるように、野生株（以下、ＴＵＢ１・ＴＵＢ３株）と比較して、ＴＵＢ３遺伝子破壊株（以下、ＴＵＢ１・ｔｕｂ３Δ株）は、ＮＫＨ−７に対し感受性を示し、１μＭのＮＫＨ−７存在下で、生育が低下していた。このことから、α‐チューブリンがＮＫＨ−７の作用機序のターゲットであることが示唆される。
【００８６】
上述した、ＮＫＨ−７によるｔｕｂ３遺伝子破壊株の生育阻害の理由として、ＮＫＨ−７が、ＴＵＢ３遺伝子の発現を向上させるという可能性が残されている。つまり、ＮＫＨ−７が、ＴＵＢ３遺伝子をターゲットとしている可能性が考えられる。
【００８７】
このような可能性の正否を確かめるために、ＴＵＢ１−２４８変異遺伝子バックグラウンドにおける、ＴＵＢ３遺伝子破壊株のＮＫＨ−７に対する影響を調べた。もし、ＴＵＢ３遺伝子由来の蛋白（以下、Ｔｕｂ３蛋白）の機能低下がＮＫＨ−７作用機序に起因するとすると、ＴＵＢ１−２４８変異遺伝子及びＴＵＢ３遺伝子破壊の二重変異株（以下、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株）のＮＫＨ−７耐性度合いは、ＴＵＢ１−２４８遺伝子変異株（以下、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株）よりも高くなることが予想される。なぜなら、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株では、Ｔｕｂ３蛋白は発現しておらず、β‐チューブリンと結合するα‐チューブリンは、全てＴＵＢ１−２４８変異遺伝子由来の蛋白（以下、ｔｕｂ１−２４８蛋白）である。これに対し、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株では、α‐チューブリンとしてＴｕｂ３蛋白及びｔｕｂ１−２４８蛋白が共存し、これら蛋白がβ‐チューブリンと結合している。それゆえ、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株と比較して、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株では、ＮＫＨ−７耐性に寄与するｔｕｂ１−２４８蛋白が、より多くβ‐チューブリンと結合し、微小管機能を担っている。
【００８８】
図４に示されるように、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株は、ＴＵＢ１・ｔｕｂ３Δ株よりもＮＫＨ−７耐性を示す。しかしながら、上記の予想に反し、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株は、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株よりもＮＫＨ−７耐性になっておらず、感受性になっていた。このことから、ＴＵＢ３蛋白は、ＮＫＨ−７作用機序に対し、機能向上に寄与することが考えられる。しかしながら、ＴＵＢ３蛋白は、アミノ酸配列がＴＵＢ１蛋白と９０％相同性があり、Ｔｕｂ１蛋白と異なる残りのアミノ酸配列がＮＫＨ−７作用機序に対し、機能向上に寄与することになる。それにも関わらず、上記の遺伝学的な結果は、ＮＫＨ−７のターゲットがＴｕｂ１蛋白であることを強く示唆する結果である。
【００８９】
（５）ＮＫＨ−７は、微小管構造の異常を誘発する。
【００９０】
細胞内の微小管構造におけるＮＫＨ−７の影響を調べた。細胞内の微小管を可視化するため、ゲノムのＵＲＡ３遺伝子座に、Ｔｕｂ１蛋白をＧＦＰで標識するための遺伝子コンストラクトを挿入したＹＲＣ７株を構築した。そして、このＹＲＣ７株を用いて、微小管骨格の形態を顕微鏡観察した。その観察結果を図５に示す。図５に示されるように、ＮＫＨ−７非処理の、対数増殖期の野生型酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、大部分の細胞で、伸長した微小管構造が観察された。これに対し、３μＭのＮＫＨ−７で処理した酵母細胞では、縮小した微小管構造が観察された。
【００９１】
（６）ＴＵＢ１−２４８変異により付与される耐性の薬剤特異性
微小管重合阻害化合物としては、従来、α‐チューブリンをターゲットとする化合物とβ‐チューブリンをターゲットとする化合物が知られている。
【００９２】
次に、従来知られている微小管重合阻害化合物存在下における、ＴＵＢ１−２４８株と野生株との耐性レベルを比較することで、ＴＵＢ１−２４８変異により付与される耐性が、α‐チューブリンとβ‐チューブリンとの何れの機能向上によるものかなのかを調べた。
【００９３】
その結果を、図６に示す。図６に示されるＰｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）は、α‐チューブリンをターゲットとする微小管重合阻害化合物であることが知られている。一方、Ｔｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅ（チアベンダゾール）、Ｂｅｎｏｍｙｌ（ベノミル）、及びＮｏｃｏｄａｚｏｌｅ（ノコダゾール）は、β‐チューブリンをターゲットとする微小管重合阻害化合物であることが知られている。
【００９４】
同図に示されるように、ＴＵＢ１−２４８株は、α‐チューブリンをターゲットとするＰｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）に対し、顕著な交叉耐性を示していた。一方、β‐チューブリンをターゲットとするＴｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅ（チアベンダゾール）、及びＮｏｃｏｄａｚｏｌｅ（ノコダゾール）に対しては、顕著な交叉耐性を示していなかった、すなわち、野性型株とＴＵＢ１−２４８株とで、薬剤耐性レベルの上限の違いがはっきりしていない。
【００９５】
また、Ｂｅｎｏｍｙｌ（ベノミル）に対しては、目視可能に交差耐性を示していた。しかしながら、この交差耐性のレベルは、Ｐｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）ほど顕著ではなかった。
【００９６】
（７）ＮＫＨ−７による、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害抑制効果と微小管重合阻害効果との機能的関連性
次に、ｚｄｓ１遺伝子破壊とＴＵＢ１−２４８遺伝子変異との２重変異株（ＹＲＣ１０）を構築した。そして、この２重変異株とｚｄｓ１遺伝子破壊株とで、ＮＫＨ−７に対する生育の影響を、上述したハローアッセイを用いて比較した。ＮＫＨ−７のターゲット分子であるＴｕｂ１蛋白が、ｚｄｓ１破壊酵母変異株における上記生育阻害抑制効果を仲介するものであれば、２重変異株の増殖ゾーンは、ｚｄｓ１遺伝子破壊株の増殖ゾーンよりも小さくなる。なぜなら、２重変異株のα‐チューブリンは、ＮＫＨ−７に対し耐性を付与するからである。これに対し、ＮＫＨ−７のターゲット分子であるＴｕｂ１蛋白が、ｚｄｓ１破壊酵母変異株における上記生育阻害抑制効果を仲介しない場合、２重変異株の増殖ゾーンは、ｚｄｓ１遺伝子破壊株の増殖ゾーンと略同じ大きさになる。
【００９７】
図７のＡに示されるように、上記２重変異株（ＹＲＣ１０）は、ｚｄｓ１遺伝子破壊株と同様に、ＣａＣｌ２存在下で、ＮＫＨ−７をスポットした部分を中心に増殖ゾーンのハローを形成していた。そして、この増殖ゾーンは、ｚｄｓ１遺伝子破壊株と比較して、若干縮小しているとともに、ハローを中心とした増殖阻止ゾーンが若干縮小され、鮮明になっていた。上記増殖阻止ゾーンの縮小は、上記２重変異株（ＹＲＣ１０）のＮＫＨ−７耐性によるものであると考えられる。
【００９８】
また、上記増殖ゾーンの縮小は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害抑制効果が、ＮＫＨ−７により若干抑えられることを示唆している。それゆえ、上記生育阻害抑制効果は、ＮＫＨ−７の作用機序により仲介される可能性が考えられる。そこで、ｚｄｓ１破壊酵母変異株について、従来知られている微小管重合阻害剤（ノコダゾール及びピロネチン）について、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた（図７のＢ）。図７のＢに示されるように、ノコダゾール及びピロネチンにより、ｚｄｓ１Δ株は、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地での生育阻害が抑制されていた。このことは、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害抑制効果が、微小管重合阻害化合物の作用機序により仲介されることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の化合物は、微小管重合阻害作用を示し、細胞の増殖を抑制する効果を有することから、抗癌剤、抗カビ剤、駆虫薬、除草剤などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】１‐ナフトール誘導体誘導体について、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた結果を示す図である。
【図２】Ａは、ＹＰＤアガー培地及びＹＰＤ液体培地での、酵母野生型株及び酵母変異株ＹＦＫ３６の増殖を示す図である。なお、４つの増殖曲線はそれぞれ、上から順に０μＭ、１μＭ、２μＭ、及び４μＭのＮＫＨ−７を含有するときの、酵母変異株ＹＦＫ３６の生育を示す増殖曲線である。Ｂは、ＮＫＨ−７で処理した酵母細胞とＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）との細胞形態を示す図であり、Ｃは、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３】Ａは、相補性グループＹＮＲ−１に属する酵母変異株の１つＹＮＲ１−１変異株の表現型を示す図であり、Ｂは、オリジナルのＹＮＲ１−１変異株と、プラスミドｐＲＳ−ＴＵＢ１−２４８を親株に形質転換した形質転換体との生育を示す図であり、Ｃは、Ｔｕｂ１−２４８蛋白の変異点周辺のアミノ酸配列について、出芽酵母由来のＴｕｂ１蛋白、出芽酵母由来のＴｕｂ３蛋白、及びヒト由来Ｔｕｂ１蛋白をアライメントした結果を示し、「＊」は、Ｔｕｂ１−２４８蛋白の変異箇所を示す。
【図４】ＮＫＨ−７耐性について、野生型（ＴＵＢ１）及びＴＵＢ１−２４８変異バックグラウンドでの、ｔｕｂ３破壊変異の影響を示した図である。
【図５】ＮＫＨ−７処理下での、細胞内の微小管の形態を示した図である。
【図６】本発明の微小管重合阻害化合物に加え、従来知られている微小管重合阻害化合物存在下における、ＴＵＢ１−２４８株と野生株との耐性レベルを比較した結果を示す図である。Ａは、α−チューブリンをターゲットをする微小管重合阻害化合物存在下における耐性レベルを示し、Ｂは、β−チューブリンをターゲットをする微小管重合阻害化合物存在下における耐性レベルを示す。
【図７】Ａは、ＮＫＨ−７について、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのＴＵＢ１−２４８株及びｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた結果を示す図であり、Ｂは、ノコダゾール及びピロネチンについて、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物、及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微小管は、細胞構造の基盤をなす構成因子であり、広範囲な細胞機能・細胞機序（例えば、細胞運動、細胞分裂、細胞形態の維持、細胞内輸送）に関連している。その一方で、酵母細胞においては、微小管は、染色体及び核の移動に関連している。微小管は、α‐チューブリン及びβ‐チューブリンのヘテロダイマーで構成されており、このヘテロダイマーが重合することで、微小管のダイナミックな挙動が実現される（非特許文献１，２）。
【０００３】
このような微小管のダイナミックな挙動を妨げる薬剤は、染色体結合性、分裂期のスピンドルに欠損が生じ、結果として、細胞を細胞周期のＧ２／Ｍ期・分裂期に停止させる。抗癌治療法の進展をさらに促進するために、微小管重合を阻害する、あるいは微小管の脱重合をブロックすることにより、微小管のアセンブリーを調節可能な薬剤が期待される。
【０００４】
従来、細胞内での微小管重合を阻害する阻害活性を示す化合物として、Ｐｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）（非特許文献３），Ｔｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅ（チアベンダゾール），Ｂｅｎｏｍｙｌ（ベノミル），Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ（ノコダゾール）等が知られている。
【０００５】
また、１‐ナフトール誘導体は、細胞内でのｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）の活性を阻害することが知られている(非特許文献４)。
【非特許文献１】Solomon, F., Analyses of the cytoskeleton in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Biol., 7, 633-662 (1991).
【非特許文献２】Botstein, D., Amberg, D., Mulholland, J., Huffaker, T., Adams, A., Drubin, D., and Stearns, T., The yeast cytoskeleton, 1. In “The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae” eds. Pringle, J., R., Broach, J. R., and Jones, E. W., pp. 1-90 (1997).
【非特許文献３】Usui, T., Watanabe, H., Nakayama, H., Tada, Y., Kanoh, N., Kondoh, M., Asao, T., Takio, K., Watanabe, H., Nishikawa, K., Kitahara, T., and Osada, H., The anticancer natural product pironetin selectively targets Lys352 of α-tubulin. Chem, Biol., 8 11, 799-806 (2004).
【非特許文献４】Current Medical Chemistry, 2006,13,3663-3674
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２は、アラキドン酸からのプロスタグランジン生合成の律速酵素であり、生体内の必須脂肪酸であるアラキドン酸からＰＧやトロンボキサンが生成される過程で、中間体であるＰＧＨ２の生成に関与する酵素である。上述のように、１‐ナフトール誘導体は、動物細胞では、細胞内でのＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の活性を阻害することが知られている。
【０００７】
しかしながら、現在のところ、細胞増殖の基盤をなす機構（細胞運動、細胞分裂、細胞形態の維持、細胞内輸送）に対する１‐ナフトール誘導体の影響は、全く解明されていない。
【０００８】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、１‐ナフトール誘導体の新たな利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、１‐ナフトール誘導体による生育阻害を抑制する、すなわち１‐ナフトール誘導体に対し耐性を示す酵母優性変異株を単離し、その変異株は、α‐チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子（配列番号１）が変異しているという知見を見出した。そして、この知見により、１‐ナフトール誘導体が微小管重合阻害化合物として利用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の微小管重合阻害化合物は、上記の課題を解決するために、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、上記微小管重合阻害化合物が、１‐ナフトール誘導体であることを特徴としている。
【００１１】
また、本発明の微小管重合阻害化合物では、上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（１）または（２）
【００１２】
【化１】
【００１３】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくは水酸基に変換し得る基を表す。）
で示される化合物であることが好ましい。
【００１４】
上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくはメトキシル基を表わすことが好ましい。
【００１５】
また、本発明の微小管重合阻害化合物では、上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（３）
【００１６】
【化２】
【００１７】
で示される化合物であることが好ましい。
【００１８】
また、本発明の微小管重合阻害化合物は、微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとしていることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の微小管重合阻害剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２０】
また、上記の微小管重合阻害剤においては、微小管重合阻害剤に対する上記微小管重合阻害化合物の量が、２０μＭよりも多くなっていることを特徴としている。
【００２１】
また、本発明の抗癌剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２２】
また、本発明の抗カビ剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２３】
また、本発明の除草剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【００２４】
また、本発明の駆虫剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２５】
以上のように、本発明は、微小管重合阻害化合物としての１‐ナフトール誘導体の新たな利用を提供する。微小管重合阻害化合物は、主要な機能として、細胞の増殖を阻害する、もしくは細胞を死滅させる機能を有する。それゆえ、本発明は、医療分野、農業分野等の多岐の用途に有効利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２７】
（１）微小管重合阻害化合物
本発明の化合物（以下、本化合物と記す）は、細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、１‐ナフトール誘導体であることを特徴としている。
【００２８】
「細胞内の微小管重合を阻害する作用」（以下、単に本作用と記す）とは、真核細胞におけるα‐チューブリン及びβ−チューブリンのヘテロダイマー同士の重合を阻害する作用のことを意味する。微小管は、α‐チューブリン及びβ−チューブリンのヘテロダイマーを単位構成分子とし、この単位構成分子同士が重合されている。そして、真核細胞内において、微小管は、ヘテロダイマー同士が重合・解離を繰り返すことで、ダイナミックに挙動する。この微小管のダイナミックな挙動は、主に核移動または核分裂時期に起きる。それゆえ、本作用により、真核細胞は、核移動時期、または核分裂時期で停止する。
【００２９】
本発明者は、１‐ナフトール誘導体による生育阻害を抑制する、すなわち１‐ナフトール誘導体に対し耐性を示す酵母優性変異株を単離し、その変異株は、α‐チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子が変異しているという知見を見出した。そして、実際に、１‐ナフトール誘導体処理により、酵母細胞における微小管の重合が阻害される（本作用を示す）ことを顕微鏡観察により確認した。
【００３０】
より具体的には、本化合物は、下記化学式（１）または（２）
【００３１】
【化３】
【００３２】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくは水酸基に変換し得る基を表す。）
で示される１‐ナフトール誘導体である。
【００３３】
化学式（１）または（２）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4で表される水酸基に変換し得る基としては、炭素数１ないし６のアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基など）、炭素数６ないし１０のアリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基など）、炭素数７ないし１２のアラルキルオキシ基（例えば、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、ナフチルエチルオキシ基など）、炭素数１ないし６のアルキルカルボニルオキシ基（例えば、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基など）、炭素数６ないし１０のアリールカルボニルオキシ基（例えば、ベンゾイルオキシ基、ナフチルカルボニルオキシ基など）、炭素数７ないし１２のアラルキルカルボニルオキシ基（例えば、ベンジルカルボニルオキシ基、フェネチルカルボニルオキシ基など）、糖類などが挙げられる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4で表される水酸基に変換し得る基は、置換基を有していてもよく、これら置換基としては、例えば、ハロゲン、糖類、アルコキシ基、カルボキシル基、スルホ基が挙げられる。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4としては、水酸基、もしくはメトキシル基が好ましい。
【００３４】
好ましくは、本微小管重合阻害化合物は、下記化学式（３）
【００３５】
【化４】
【００３６】
で示される１‐ナフトール誘導体（ＮＫＨ−７）である。
【００３７】
また、本微小管重合阻害化合物は、下記化学式（４）〜（６）の何れかで示される１‐ナフトール誘導体であってもよい。化学式（４）〜（６）で示される１‐ナフトール誘導体はそれぞれ、後述の実施例に記載のＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２である。
【００３８】
【化５】
【００３９】
【化６】
【００４０】
【化７】
【００４１】
化学式（３）〜（６）に示される１‐ナフトール誘導体（ＮＫＨ−７、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２）は、後述の実施例に記載のように、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧する薬剤のポジティブスクリーニングにより取得された化合物である。そして、これら１‐ナフトール誘導体のうち、ＮＫＨ−７に対し薬剤耐性を示す酵母優性変異株として、α‐チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子の変異株（ＴＵＢ１−２４８変異株）を取得している（図１参照）。ＴＵＢ１−２４８変異株における変異型ＴＵＢ１遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示されるものであり、それがコードする変異型Ｔｕｂ１蛋白のアミノ酸配列は配列番号４に示すものであった。より具体的には、ＴＵＢ１−２４８変異株が有する変異型ＴＵＢ１遺伝子は、野生型ＴＵＢ１遺伝子（配列番号１）の８５７番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に置換（点変異）されており、その結果野生型Ｔｕｂ１蛋白のアミノ酸配列（配列番号３）における２４８番目のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換されていた。さらに、本発明者は、このＴＵＢ１−２４８変異株が、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２に対しても薬剤耐性を示すことを確認している。また、後述の実施例に記載のように、従来知られている微小管重合阻害剤（ノコダゾール，ピロネチン）は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧することを明らかにしている（図７参照）。
【００４２】
これらの知見から、微小管重合を阻害する作用を示す化合物は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧するという特性を有していることが考えられる。さらに、ＴＵＢ１−２４８変異株は、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２に対しても薬剤耐性を示す。このことから、ＮＫＨ−８、ＮＰ−１、及びＮＰ−２は、ＮＫＨ−７と同様に微小管重合阻害作用を示すと考えられる。
【００４３】
また、本化合物は、微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとしていることと特徴としている。
【００４４】
「微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとしている」ことは、化合物存在下でＴＵＢ１−２４８変異株が耐性を示すか否かにより判定することが可能である。本化合物がα‐チューブリンをターゲットとしている場合、ＴＵＢ１−２４８変異株が耐性を示すことになる。ここでいう「耐性を示す」とは、野生型株が生育可能な化合物の上限濃度で、ＴＵＢ１−２４８変異株が生育していることを意味する。
【００４５】
通常、化合物の濃度系列をとって各濃度における野生型株の生育状況を調べると、化合物濃度が高くなるに従い野生型株の生育が弱くなる。そして、化合物が特定の濃度に達すると、野生型株は生育できなくなる。この野生型株が生育できなくなる濃度が、上記の上限濃度になる。ＴＵＢ１−２４８変異株が化合物に対し耐性を示す場合、ＴＵＢ１−２４８変異株の生育状況は、以下のようになる。
【００４６】
すなわち、野生型株とＴＵＢ１−２４８変異株との間で、化合物の濃度系列をとって生育状況を比較したとき、各濃度において、野生型株とＴＵＢ１−２４８変異株との間で生育の違いを目視できるとともに、ＴＵＢ１−２４８変異株は、野生型株が生育可能な化合物の上限濃度で生育している。すなわち、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで、生育可能な上限濃度が異なっている。
【００４７】
上記のように、ＴＵＢ１−２４８変異株は、α−チューブリンをコードするＴＵＢ１遺伝子に変異が生じており、α‐チューブリンの機能が野生型株と異なっている。一方、β−チューブリンの機能は、野生型株と同等である。もし、微小管重合阻害化合物がβ−チューブリンをターゲットとする場合、この化合物によるβ−チューブリンの機能低下は、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで同じ程度になる。そして、この機能低下の影響で、生育可能な微小管重合阻害化合物の上限濃度が、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで略同じなる。一方、微小管重合阻害化合物がα−チューブリンをターゲットとする場合、この化合物によるα‐チューブリンの機能は、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで異なる。この機能の相違により、生育可能な微小管重合阻害化合物の上限濃度が、ＴＵＢ１−２４８変異株と野生型株とで異なる。つまり、耐性を示すことになる。
【００４８】
このように、ＴＵＢ１−２４８変異株が耐性を示すか否かにより、微小管重合阻害化合物がα−チューブリンをターゲットとするのかを判定することができる。
【００４９】
（２）本化合物の製造方法
本化合物を得るには、天然物から目的の化合物を抽出精製する方法、天然物から抽出精製された化合物を修飾することにより化学合成する方法、目的とする化合物を全化学合成する方法などが考えられるが、本発明はこれら製造方法により限定されるものではない。
【００５０】
本化合物を得る方法の一つとして、目的とする化合物を全化学合成する方法が挙げられる。この場合、例えば、非特許文献４に記載のように、１−ハイドロキシ−２−ナフトエ酸を出発物質した合成方法が挙げられる。また、合成された化合物の確認は、例えば、薄相クロマトグラフィーや元素分析などを行うことにより可能である。あるいは、合成された化合物の質量分析、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲの結果を基準品と比較することにより可能である。
【００５１】
（３）本発明の微小管重合阻害剤
本発明の微小管重合阻害剤は、上述の微小管重合阻害化合物を含有しているものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の微小管重合化合物（例えば、ピロネチン、チアベンダゾール、ベノミル、またはノコダゾール）を含んでいてもよい。
【００５２】
また、溶媒は、本化合物を溶解することができる溶媒であれば特に限定されない。特に、本化合物として、上記化学式（２）〜（６）に示された１‐ナフトール誘導体を使用する場合、溶媒として、エタノール等のアルコール系溶媒（アルコール系有機溶媒）を使用することが好ましい。
【００５３】
また、微小管重合阻害剤に対する本化合物の量は、対象の細胞の薬剤透過性や微小管重合阻害効果に応じて、適宜設定することができる。後述の実施例に記載のように、酵母野生型株が増殖可能なＮＫＨ−７の濃度の上限は２０μＭである。対象の細胞が出芽酵母細胞である場合、微小管重合阻害剤に対する本化合物の量は、２０μＭよりも多くなっていることが好ましい。
【００５４】
（４）本化合物の利用
微小管重合阻害化合物は、主要な機能として、細胞の増殖を阻害する、もしくは細胞を死滅させる機能を有する。それゆえ、本化合物または微小管重合阻害剤は、医療分野、農業分野等の多岐の用途とし、抗癌剤、抗カビ剤、駆虫剤、除草剤などに有用である。
【００５５】
本化合物を抗癌剤として使用する場合、本発明の化合物は単独で投与しても良いし、あるいは医薬的に許容される担体に含有させても良い。担体としては固形、半固形、又は液状の希釈剤、充填剤、及びその他の処用の助剤などが用いられる。本発明の化合物を含有する医薬組成物は、経口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与等）又は経直腸的に投与することができ、これらの投与方法に適した剤型で投与される。
【００５６】
経口投与は固形または液状の用量単位、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、舌下錠、坐剤、その他の剤型によって行うことができる。固形の医薬組成物は、適切な結合剤、滑剤、分散剤、希釈剤、崩壊剤、風味剤、着色料、香料、流動化剤、および溶解剤などを含んでもよい。液状の医薬組成物は、水溶液または水懸濁液、医薬に許容可能な脂肪または油、アルコール類またはその他の有機溶剤、例えば乳濁液、エステル、エリキシル、シロップ、非発泡性顆粒から作った溶液、または懸濁液、発泡性顆粒から作った発泡性製剤などを含んでもよい。また、適した溶剤、保存料、乳化剤、沈殿防止剤、希釈剤、甘味料、増粘剤および溶解剤を含有してもよい。さらに、風味剤、香料、着色料を含有してもよい。
【００５７】
組織内投与は液状の用量単位、例えば溶液や懸濁剤の形態として、皮下・筋肉又は静脈内注射などにより行うことができる。これらのものは、本化合物を、注射の目的に適合する非毒性の液状担体に溶解し利用することができる。さらに、非毒性の塩や塩溶液を添加してもよい。また安定剤、保存剤、乳化剤のようなものを併用することもできる。
【００５８】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５９】
〔Ｉ：材料および方法〕
（１）酵母細胞株、培地、及び化学化合物
本実施例に使用される酵母細胞株を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
（表１の「遺伝子型」の欄中、４文字（３文字＋番号）表記であり、かつ小文字である遺伝子（例えばｔｒｐ１，ｐｄｒ１等）は、劣性変異遺伝子を示す。また、４文字（３文字＋番号）表記であり、かつ大文字である遺伝子（例えばＨＩＳ３，ＴＲＰ１等）は、野生型遺伝子を示す。また、「a：：Ｂ」（例えば、ｚｄｓ１：：ＴＲＰ１）は、出芽酵母ゲノムにおけるａ遺伝子（例えばＺＤＳ１遺伝子）座に、Ｂ遺伝子（例えばＴＲＰ１遺伝子）が挿入された遺伝子型を表わす。すなわち、「a：：Ｂ」が表記された株は、ａ遺伝子が発現する代わりにＢ遺伝子が発現しており、ａ遺伝子が破壊されている。また、「ＭＡＴ」は出芽酵母の接合型を表わし、「ＭＡＴａ」は、ａタイプの接合型を表わす。また、４文字以上の表記であり、かつ大文字である遺伝子（例えば、ＴＵＢ１‐２４８）は、優性変異遺伝子を表わす。また、ＴＵＢ１‐ＧＦＰは、ＧＦＰ遺伝子が連結されたＴＵＢ１遺伝子を表わす。）
表１においては、遺伝子型を簡潔に説明するとの観点から、ａタイプの接合型（Ｍａｔａ）の酵母株のみを示している。本実施例においては、表１に示す遺伝子型を有するαタイプの接合型（Ｍａｔα）の酵母株も使用している。そして、互いに異なる遺伝子型を有するａタイプの接合型及びαタイプの接合型同士を掛け合わせたヘテロ二倍体について、従来公知の方法を用いて作製した二重変異株も使用している。
【００６２】
なお、以降の説明では、表１の記載に準じて、特に明記しない限り、遺伝子を４文字（３文字＋番号）で、かつ小文字で表記したとき、その遺伝子は劣性遺伝子である。そして、遺伝子Ａの破壊株をａΔと表記する。また、遺伝子を４文字（３文字＋番号）表記で、かつ大文字で表記したとき、その遺伝子は野生型遺伝子である。また、遺伝子を４文字以上の表記で、かつ大文字で表記したとき（例えば、ＴＵＢ１‐２４８）、その遺伝子は優性変異遺伝子である。
【００６３】
ＮＫＨ−７耐性変異株のスクリーニングに用いられる１‐ナフトール誘導体化合物は、Cur.Med. Chem., 13, 3663-3674 (2006) Kongkathip,.et.alに従って、合成された。以下の化合物が、ポジティブスクリーニングアッセイにより生物活性を示し、かつ本実施例で用いられる。
ＮＫＨ−７；2-((1-(hydroxymethyl) cyclohexyl) methyl) naphthalen-1-ol
ＮＫＨ−８；1-methoxy-2-((1-(hydroxyl) cyclohexyl) methyl) naphthalene
ＮＰ−１ ；1-methoxy-2-((1-(hydroxyl) cyclopentyl) methyl) naphthalene
ＮＰ−２ ；2-((1-hydroxymethyl) cyclopentyl) methyl) naphthalen-1-ol
また、微小管重合阻害化合物である、methyl 1-(butylcarbarmoyl)-2-benzimidazole [benomyl]、2-(4-thiazolyl) benzimidazole [チアベンダゾール]、及びノコダゾールをＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。また、ピロネチン(Pironetin)は、日本化薬より供与された。
【００６４】
（２）薬剤のポジティブスクリーニングの手順
Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1942-1946 (2000). Shitamukai et alに記載されている方法に従い、ＣａＣｌ２を１５０ｍＭ含有するＹＰＤソフトアガー培地上で、ハローアッセイにより薬剤のポジティブスクリーニングが行われた。活性基質の半定量アッセイを行うために、アガー培地の表面に、試料化合物のエタノール溶液３μｌ分量をスポットした。そして、３０℃、２日間の培養後、スポットされた試料化合物の周囲に現れた増殖ゾーンを観察した。また、酵母細胞の生育は、ＹＰＤ液体培地中でモニターされた。具体的には、３０℃で振盪培養した培養液における、６００ｎｍ波長の吸光度を、バイオフォトレコーダー (東洋エンジニアリング製作所, 東京)を用いて測定した。
【００６５】
（３）蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による分析
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でＤＮＡを染色した細胞のＤＮＡ含量を、FACSCalibur；ＦＡＣＳキャリバー (Becton, Dickinson, Franklin Lakes, NJ)により分析した。
【００６６】
（４）ＮＫＨ−７耐性を示す酵母変異株の、単離及び遺伝学的キャラクタリゼーション
総細胞数約１０７個のＹＦＫ３６酵母細胞を、ＮＫＨ−７を１０μＭ含有するＹＰＤアガー培地にスプレッドした。そして、３０℃で２日間培養後、自然変異（スポンタニアス変異）により、培地上に出現したコロニーをピックアップした。ピックアップしたコロニーの細胞に関する遺伝学的解析は、J. Biol. Chem., 277, 28810-28814 (2002) Miyamoto et al、及びBiosci. Biotechnol. Biochem., 70, 2451-2459 21 (2006) Kobayashi et alに記載の方法に基づいて行われた。
【００６７】
（５）ＹＮＲ１−１優性変異遺伝子のクローニング
ＹＦＫ３６への形質転換のために、ＵＲＡ３マーカー及びセントロメアを有するｐＲＳ３１６ベクターを用いたことを除いて、J. Biol. Chem., 277, 28810-28814 (2002) Miyamoto et al、及びBiosci. Biotechnol. Biochem., 70, 2451-2459 21 (2006) Kobayashi et alに記載の方法に基づいて、ＹＮＲ１−１優性酵母変異株のゲノムバンクを構築した。約３００００個のゲノムバンク形質転換体のコロニーをピックアップした。ピックアップした形質転換体を、ＮＫＨ−７を４μＭ含有するＹＰＤアガー培地にスプレッドし、３０℃で３日間培養した。そして、ゲノムバンク形質転換体のうち、ＮＫＨ−７耐性を示す形質転換体をピックアップした。ピックアップした形質転換体からプラスミドを回収し、回収したプラスミドを再度ＹＦＫ３６へ形質転換することで、ＮＫＨ−７耐性がプラスミドに由来することを確認した。
【００６８】
（６）ＧＦＰ融合ＴＵＢ１蛋白を発現する薬剤感受性酵母株の構築
ＴＵＢ１−ＧＦＰ遺伝子を含む自己挿入型プラスミドｐＡＦＳ１２５を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し線状プラスミドにした後、ＹＦＫ３６へ形質転換した。この形質転換により、ＴＵＢ１−ＧＦＰ遺伝子コンストラクトが、ＹＦＫ３６のゲノムのＵＲＡ３遺伝子座に挿入されることになる。つまり、プラスミドｐＡＦＳ１２５が、ＵＲＡ３遺伝子座に挿入される。
【００６９】
（７）蛍光顕微鏡観察
ＧＦＰで蛍光標識されたチューブリンを観察するために、ＹＰＤ培養液でＧＦＰ融合Ｔｕｂ１蛋白を発現する細胞を対数増殖期まで培養後、培養液に対する濃度が２μＭになるようにＮＫＨ−７を添加した。ＮＫＨ−７添加後、さらに２５℃で３０分間培養後の細胞を蛍光顕微鏡観察に用いた。具体的には、ＮＫＨ−７処理した細胞を、室温の遠心分離により集菌し、生理食塩水で２回洗浄した。そして、この細胞内で発現する、ＧＦＰで蛍光標識されたチューブリンを観察した。
【００７０】
〔ＩＩ：結果〕
（１）１‐ナフトール誘導体化合物としてのＮＫＨ−７は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧する。
【００７１】
Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1942-1946 (2000). Shitamukai et alに記載されている方法に従い、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害を抑圧するポジティブ薬剤をスクリーニングした。その結果、ＮＫＨ−７及びそれに構造的に類似した化合物が取得された。これら化合物について、１５０ｍＭＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのＹＮＳ１７株の生育の影響を調べた結果を図１に示す。外因性のＣａＣｌ２存在下で、酵母細胞は、細胞内のＣａ２＋シグナリングが過度に活性化することに起因して、生育が遅延する（細胞周期のＧ２期の進行が遅れる）ことが分かっている。また、ｚｄｓ１破壊酵母変異株は、上記のＣａ２＋シグナリングの過度の活性化により、外因性のＣａＣｌ２存在下で、生育遅延が顕著になり、結果として生育停止することが分かっている。もし、上記のＣａ２＋シグナリングの過度の活性化を抑制する薬剤が存在すれば、この薬剤によりｚｄｓ１破壊酵母変異株のＣａＣｌ２存在下での生育遅延を回復すると考えられる。
【００７２】
図１に示されるように、ＮＫＨ−７及びそれに構造的に類似した化合物がＹＰＤアガー培地上にスポットし、３０℃２日間培養した後、ｚｄｓ１破壊酵母変異株は、ＣａＣｌ２存在下で、スポットした部分を中心に増殖ゾーンのハローを形成していた。このことは、これらの化合物が生育遅延を回復することを示唆している。また、ＮＫＨ−７をスポットした場合、増殖ゾーンの内側に明確な増殖阻止ゾーンが観察された（つまり、スポット下部分を中心として、ドーナツ状の増殖ゾーンが観察された）。
【００７３】
（２）ＮＫＨ−７による、細胞分裂及び核分裂の阻害
酵母は、動物細胞と比較して一般的に薬剤感受性が低いことが知られている。この原因としては、酵母細胞表層における薬剤透過性の低さ、及び毒性物質に対抗する生命維持装置としての強力な多剤耐性機構が挙げられる。それゆえ、酵母野生型株は、薬剤感受性感度が低く、ＮＫＨ−７による生育阻害効果を調べることが困難であるという問題がある。そこで、本願発明者らは、この薬剤感受性感度の低さを改善するために、様々な薬剤体制機構にかかわる各種遺伝子を破壊した酵母変異株ＹＦＫ３６を構築した。具体的には、ＹＦＫ３６は、細胞膜における薬剤透過性の低さにかかわっている膜エルゴステロールの生合成遺伝子の１つであるＥＲＧ３遺伝子、多剤耐性ＡＢＣトランスポーターをコードするＰＤＲ１遺伝子・ＰＤＲ３遺伝子・ＰＤＲ５遺伝子、及びその他薬剤耐性に関わる膜タンパクをコードするＹＲＲ１遺伝子並びにＹＯＲ１遺伝子が破壊されている。これら６つの遺伝子を全て破壊した酵母六重破壊株は、個々の遺伝子を破壊した単独破壊株よりも、ＮＫＨ−７に対する感受性感度が向上していることを確認している。
【００７４】
この薬剤感受性感度が向上した酵母変異株ＹＦＫ３６を用いて、ＮＫＨ−７存在下での細胞の動態を調べた。まず、酵母野生型株及び酵母変異株ＹＦＫ３６について、ＮＫＨ−７に対する感受性感度を比較した。その比較結果を図２のＡ及びＢに示す。図２のＡに示されるように、酵母野生型株であるＷ３０３は、６μＭのＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地上で正常に増殖している。なお、本願発明者は、ＹＰＤ培地中のＮＫＨ−７の濃度が、２０μＭになるまで、酵母野生型株が正常に増殖していることを確認している。すなわち、酵母野生型株が増殖可能なＮＫＨ−７の濃度の上限が、２０μＭである。一方、図２のＡに示されるように、酵母変異株ＹＦＫ３６は、３〜４μＭのＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地上で増殖していない。このＮＫＨ−７の濃度依存的な増殖阻害は、図２のＡに示されるＹＰＤ液体培地中での増殖曲線から明らかである。
【００７５】
また、図２のＢに、ＮＫＨ−７で処理した酵母細胞と、ＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）とを顕微鏡観察により比較した結果を示す。なお、図２のＢでは、ＰＩで核染色し、核分裂の動態も比較している。図２のＢに示されるように、ＮＫＨ−７を３μＭ含むＹＰＤ液体培地で３時間培養したとき、酵母細胞（ＹＦＫ３６）は、細胞形態が均一化しており、大部分（約９０％）が、ラージバットの形態になっていた。さらに、ＰＩ染色により核を観察すると、これらの細胞は、単核になっており、細胞内で拡散していた。このことから、ＮＫＨ−７処理により、酵母細胞は、細胞周期の核の分配（核分裂）に欠損が生じることが示唆された。一方、ＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）では、細胞形態が均一化されておらず、細胞周期が正常に進行していることがわかる。この比較結果から、ＮＫＨ−７処理により、酵母細胞は、バッドの出現及び伸長は正常に進行する一方、バッド伸長後の細胞質分裂で停止していることが明らかになった。
【００７６】
さらに、図２のＣに、ＮＫＨ−７で処理した酵母細胞と、ＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）とをＦＡＣＳ解析により比較した結果を示す。図２のＣに示されるように、ＮＫＨ−７処理により、ＤＮＡ含量が２Ｃの酵母細胞が蓄積していることがわかった。このことから、ＮＫＨ−７処理により、酵母細胞は、ＤＮＡ複製が正常に進行する一方、ＤＮＡ複製後の染色体分離が進行しないことが明らかになった。
【００７７】
図２のＡ〜Ｃに示された結果から、ＮＫＨ−７は、細胞分裂及び核分裂の進行をブロックする薬剤であることが示された。
【００７８】
（３）ＮＫＨ−７耐性を示す酵母変異株の、単離及び遺伝学的キャラクタリゼーション
本発明者らは、ＮＫＨ−７の細胞毒性（増殖阻害）の作用を解析するため、遺伝学的手法を用いて、ＮＫＨ−７の細胞内のターゲットを同定した。具体的には、ＮＫＨ−７に対し耐性を示す酵母変異株のスクリーニングを行った。
【００７９】
このスクリーニングでは、まず、親株であるＹＦＫ３６酵母細胞から、自然変異により、ＮＫＨ−７耐性を示す変異株を７７株選抜した。なお、耐性の判別は、４μＭのＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地で増殖可能であるか否かを指標にして行われた。次に、これら７７株について、この耐性がＮＫＨ−７特異的であるか否かを調べた。具体的には、選抜した７７株について、ローダミン６Ｇ、フルフェナジン、４‐ニトロキノリン１‐オキサイド、及びサイクロヘキシイミドといった薬剤に対する耐性を調べた。その結果、ＮＫＨ−７特異的に耐性を示す酵母変異株を３９株選抜した。
【００８０】
これら３９株それぞれについて、親株と掛け合わせたヘテロ２倍体を作製した。そして、このヘテロ２倍体がＮＫＨ−７耐性を示すか否かを指標として、３６株の優劣判定（優性変異か劣性変異かの判定）を行った。その結果、優性変異または半優性変異を示す８株を選抜した。さらに、これら８株と親株と掛け合わせたヘテロ２倍体を胞子形成後、四分子解析を行った結果、各へテロ２倍体の胞子から得られた４つの配偶子の表現型が、２：２に分離されていた（ＮＫＨ−７耐性の配偶子：ＮＫＨ−７非耐性の配偶子が２：２）。このことから、これら８株の変異は、単一変異であることが確認された。
【００８１】
次に、これら８株同士を掛け合わせた２倍体の表現型を調べることにより、８株を相補性グループに分けた。その結果、８株のうち、６株が単一の相補性グループＹＮＲ−１に属し、残りの２株がそれぞれ、別々の相補性グループＹＮＲ−２及びＹＮＲ−３に属することがわかった。以下、最も多くの酵母変異株が属する単一の相補性グループＹＮＲ−１に着目して、解析を行った。図３のＡに、相補性グループＹＮＲ−１に属する酵母変異株の１つＹＮＲ１−１変異株の表現型を示す。図３のＡに示されるように、野生型（ＷＴ）とＹＮＲ１−１変異株とを掛け合わせたヘテロ２倍体（ＷＴ／ＹＮＲ１−１）は、野生型ホモ２倍体（ＷＴ／ＷＴ）と比較して、より高い濃度のＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地で増殖している。また、ＹＮＲ１−１ホモ２倍体（ＹＮＲ１−１／ＹＮＲ１−１）は、ヘテロ２倍体（ＷＴ／ＹＮＲ１−１）と比較して、より高い濃度のＮＫＨ−７を含有するＹＰＤ培地で増殖している。このことから、ＹＮＲ１−１変異は、半優性変異であることがわかる。
【００８２】
（４）ＹＮＲ１−１変異に起因する遺伝子の同定
ＹＮＲ１−１変異に起因する遺伝子を同定する目的で、まず、本発明者は、ＹＮＲ１−１株のゲノム断片をセントロメアベースのベクターに連結したゲノムライブラリを構築した。そして、このゲノムライブラリを親株へ形質転換し、これら形質転換体のうち、ＮＫＨ−７耐性を示す形質転換体を選抜した。この形質転換体からプラスミドを回収し、該プラスミドに挿入されているＹＮＲ１−１株由来のゲノム断片をシークエンシング（塩基配列決定）した。その結果、このゲノム断片は、ＹＭＬ０８３ｃ及びＹＭＬ０８４ｃのＯＲＦ、並びにＴＵＢ１遺伝子を含むことが明らかになった。さらに、このゲノム断片からＴＵＢ１遺伝子のみをサブクローニングし、親株に形質転換すると、形質転換体がＮＫＨ−７耐性を示した。これにより、ＹＮＲ１−１変異に起因する遺伝子がＴＵＢ１遺伝子であることが分かった。つまり、ＹＮＲ１−１変異株は、ＴＵＢ１遺伝子の変異により、ＮＫＨ−７耐性を示すことが明らかになった。
【００８３】
さらに、上記ＴＵＢ１遺伝子のみをサブクローニングした断片をシークエンシングし、変異ＴＵＢ１遺伝子の変異点を同定した。その結果、この変異ＴＵＢ１遺伝子は、野生型ＴＵＢ１遺伝子と比較して、アミノ酸配列の２４８番目のセリン（Ｓｅｒ）がプロリン（Ｐｒｏ）に置換する変異であることが分かった（図３のＣ）。さらに、ＰＣＲによる点変異導入法を用いて、野生型ＴＵＢ１遺伝子に上記変異点を導入した。そして、この遺伝子をセントロメアベースのベクターに連結したプラスミドｐＲＳ−ＴＵＢ１−２４８を構築し、親株に形質転換した。この形質転換体の表現型を図３のＢに示す。ｐＲＳ−ＴＵＢ１−２４８の形質転換体は、図３のＢに示されるように、ＮＫＨ−７耐性を示した。さらに、この形質転換体は、図３のＡに示すヘテロ２倍体（ＷＴ／ＹＮＲ１−１）と類似したＮＫＨ−７耐性レベルを示した。このことから、ＹＮＲ１−１変異株は、ＴＵＢ１遺伝子の変異により、ＮＫＨ−７耐性を示すことが確認された。以下、ＹＮＲ１−１変異株をＴＵＢ１−２４８変異株と称する。
【００８４】
出芽酵母(S.cerevisiae)ゲノムにおいて、α‐チューブリンをコードする遺伝子として、ＴＵＢ１遺伝子、及びＴＵＢ３遺伝子が知られている。ゲノム上のＴＵＢ１遺伝子を破壊したｔｕｂ１遺伝子破壊株は、生育不能、すなわち致死になる。一方、ＴＵＢ３遺伝子を破壊したｔｕｂ３遺伝子破壊株は、生育可能である。また、ＴＵＢ３遺伝子の発現量は、ＴＵＢ１遺伝子に比べ低くなっている。それゆえ、出芽酵母においては、ｔｕｂ１蛋白及びｔｕｂ３蛋白のうち、ｔｕｂ１蛋白がα‐チューブリンの主要な機能を担っている。
【００８５】
そこで、野生型ＴＵＢ１遺伝子及びＴＵＢ１−２４８変異遺伝子の両バックグラウンドおける、ｔｕｂ３遺伝子破壊株のＮＫＨ−７に対する影響を調べた。もし、α‐チューブリンがＮＫＨ−７の作用機序のターゲットであるとすると、野生型ＴＵＢ１遺伝子のバックグラウンドで、ＴＵＢ３遺伝子破壊株は、ＮＫＨ−７に対して感受性であることが予想される。図４に示されるように、野生株（以下、ＴＵＢ１・ＴＵＢ３株）と比較して、ＴＵＢ３遺伝子破壊株（以下、ＴＵＢ１・ｔｕｂ３Δ株）は、ＮＫＨ−７に対し感受性を示し、１μＭのＮＫＨ−７存在下で、生育が低下していた。このことから、α‐チューブリンがＮＫＨ−７の作用機序のターゲットであることが示唆される。
【００８６】
上述した、ＮＫＨ−７によるｔｕｂ３遺伝子破壊株の生育阻害の理由として、ＮＫＨ−７が、ＴＵＢ３遺伝子の発現を向上させるという可能性が残されている。つまり、ＮＫＨ−７が、ＴＵＢ３遺伝子をターゲットとしている可能性が考えられる。
【００８７】
このような可能性の正否を確かめるために、ＴＵＢ１−２４８変異遺伝子バックグラウンドにおける、ＴＵＢ３遺伝子破壊株のＮＫＨ−７に対する影響を調べた。もし、ＴＵＢ３遺伝子由来の蛋白（以下、Ｔｕｂ３蛋白）の機能低下がＮＫＨ−７作用機序に起因するとすると、ＴＵＢ１−２４８変異遺伝子及びＴＵＢ３遺伝子破壊の二重変異株（以下、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株）のＮＫＨ−７耐性度合いは、ＴＵＢ１−２４８遺伝子変異株（以下、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株）よりも高くなることが予想される。なぜなら、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株では、Ｔｕｂ３蛋白は発現しておらず、β‐チューブリンと結合するα‐チューブリンは、全てＴＵＢ１−２４８変異遺伝子由来の蛋白（以下、ｔｕｂ１−２４８蛋白）である。これに対し、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株では、α‐チューブリンとしてＴｕｂ３蛋白及びｔｕｂ１−２４８蛋白が共存し、これら蛋白がβ‐チューブリンと結合している。それゆえ、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株と比較して、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株では、ＮＫＨ−７耐性に寄与するｔｕｂ１−２４８蛋白が、より多くβ‐チューブリンと結合し、微小管機能を担っている。
【００８８】
図４に示されるように、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株は、ＴＵＢ１・ｔｕｂ３Δ株よりもＮＫＨ−７耐性を示す。しかしながら、上記の予想に反し、ＴＵＢ１−２４８・ｔｕｂ３Δ株は、ＴＵＢ１−２４８・ＴＵＢ３株よりもＮＫＨ−７耐性になっておらず、感受性になっていた。このことから、ＴＵＢ３蛋白は、ＮＫＨ−７作用機序に対し、機能向上に寄与することが考えられる。しかしながら、ＴＵＢ３蛋白は、アミノ酸配列がＴＵＢ１蛋白と９０％相同性があり、Ｔｕｂ１蛋白と異なる残りのアミノ酸配列がＮＫＨ−７作用機序に対し、機能向上に寄与することになる。それにも関わらず、上記の遺伝学的な結果は、ＮＫＨ−７のターゲットがＴｕｂ１蛋白であることを強く示唆する結果である。
【００８９】
（５）ＮＫＨ−７は、微小管構造の異常を誘発する。
【００９０】
細胞内の微小管構造におけるＮＫＨ−７の影響を調べた。細胞内の微小管を可視化するため、ゲノムのＵＲＡ３遺伝子座に、Ｔｕｂ１蛋白をＧＦＰで標識するための遺伝子コンストラクトを挿入したＹＲＣ７株を構築した。そして、このＹＲＣ７株を用いて、微小管骨格の形態を顕微鏡観察した。その観察結果を図５に示す。図５に示されるように、ＮＫＨ−７非処理の、対数増殖期の野生型酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、大部分の細胞で、伸長した微小管構造が観察された。これに対し、３μＭのＮＫＨ−７で処理した酵母細胞では、縮小した微小管構造が観察された。
【００９１】
（６）ＴＵＢ１−２４８変異により付与される耐性の薬剤特異性
微小管重合阻害化合物としては、従来、α‐チューブリンをターゲットとする化合物とβ‐チューブリンをターゲットとする化合物が知られている。
【００９２】
次に、従来知られている微小管重合阻害化合物存在下における、ＴＵＢ１−２４８株と野生株との耐性レベルを比較することで、ＴＵＢ１−２４８変異により付与される耐性が、α‐チューブリンとβ‐チューブリンとの何れの機能向上によるものかなのかを調べた。
【００９３】
その結果を、図６に示す。図６に示されるＰｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）は、α‐チューブリンをターゲットとする微小管重合阻害化合物であることが知られている。一方、Ｔｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅ（チアベンダゾール）、Ｂｅｎｏｍｙｌ（ベノミル）、及びＮｏｃｏｄａｚｏｌｅ（ノコダゾール）は、β‐チューブリンをターゲットとする微小管重合阻害化合物であることが知られている。
【００９４】
同図に示されるように、ＴＵＢ１−２４８株は、α‐チューブリンをターゲットとするＰｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）に対し、顕著な交叉耐性を示していた。一方、β‐チューブリンをターゲットとするＴｈｉａｂｅｎｄａｚｏｌｅ（チアベンダゾール）、及びＮｏｃｏｄａｚｏｌｅ（ノコダゾール）に対しては、顕著な交叉耐性を示していなかった、すなわち、野性型株とＴＵＢ１−２４８株とで、薬剤耐性レベルの上限の違いがはっきりしていない。
【００９５】
また、Ｂｅｎｏｍｙｌ（ベノミル）に対しては、目視可能に交差耐性を示していた。しかしながら、この交差耐性のレベルは、Ｐｉｒｏｎｅｔｉｎ（ピロネチン）ほど顕著ではなかった。
【００９６】
（７）ＮＫＨ−７による、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害抑制効果と微小管重合阻害効果との機能的関連性
次に、ｚｄｓ１遺伝子破壊とＴＵＢ１−２４８遺伝子変異との２重変異株（ＹＲＣ１０）を構築した。そして、この２重変異株とｚｄｓ１遺伝子破壊株とで、ＮＫＨ−７に対する生育の影響を、上述したハローアッセイを用いて比較した。ＮＫＨ−７のターゲット分子であるＴｕｂ１蛋白が、ｚｄｓ１破壊酵母変異株における上記生育阻害抑制効果を仲介するものであれば、２重変異株の増殖ゾーンは、ｚｄｓ１遺伝子破壊株の増殖ゾーンよりも小さくなる。なぜなら、２重変異株のα‐チューブリンは、ＮＫＨ−７に対し耐性を付与するからである。これに対し、ＮＫＨ−７のターゲット分子であるＴｕｂ１蛋白が、ｚｄｓ１破壊酵母変異株における上記生育阻害抑制効果を仲介しない場合、２重変異株の増殖ゾーンは、ｚｄｓ１遺伝子破壊株の増殖ゾーンと略同じ大きさになる。
【００９７】
図７のＡに示されるように、上記２重変異株（ＹＲＣ１０）は、ｚｄｓ１遺伝子破壊株と同様に、ＣａＣｌ２存在下で、ＮＫＨ−７をスポットした部分を中心に増殖ゾーンのハローを形成していた。そして、この増殖ゾーンは、ｚｄｓ１遺伝子破壊株と比較して、若干縮小しているとともに、ハローを中心とした増殖阻止ゾーンが若干縮小され、鮮明になっていた。上記増殖阻止ゾーンの縮小は、上記２重変異株（ＹＲＣ１０）のＮＫＨ−７耐性によるものであると考えられる。
【００９８】
また、上記増殖ゾーンの縮小は、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害抑制効果が、ＮＫＨ−７により若干抑えられることを示唆している。それゆえ、上記生育阻害抑制効果は、ＮＫＨ−７の作用機序により仲介される可能性が考えられる。そこで、ｚｄｓ１破壊酵母変異株について、従来知られている微小管重合阻害剤（ノコダゾール及びピロネチン）について、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた（図７のＢ）。図７のＢに示されるように、ノコダゾール及びピロネチンにより、ｚｄｓ１Δ株は、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地での生育阻害が抑制されていた。このことは、ｚｄｓ１破壊酵母変異株におけるカルシウム（ＣａＣｌ２）存在下での生育阻害抑制効果が、微小管重合阻害化合物の作用機序により仲介されることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の化合物は、微小管重合阻害作用を示し、細胞の増殖を抑制する効果を有することから、抗癌剤、抗カビ剤、駆虫薬、除草剤などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】１‐ナフトール誘導体誘導体について、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた結果を示す図である。
【図２】Ａは、ＹＰＤアガー培地及びＹＰＤ液体培地での、酵母野生型株及び酵母変異株ＹＦＫ３６の増殖を示す図である。なお、４つの増殖曲線はそれぞれ、上から順に０μＭ、１μＭ、２μＭ、及び４μＭのＮＫＨ−７を含有するときの、酵母変異株ＹＦＫ３６の生育を示す増殖曲線である。Ｂは、ＮＫＨ−７で処理した酵母細胞とＮＫＨ−７で処理していない酵母細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）との細胞形態を示す図であり、Ｃは、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３】Ａは、相補性グループＹＮＲ−１に属する酵母変異株の１つＹＮＲ１−１変異株の表現型を示す図であり、Ｂは、オリジナルのＹＮＲ１−１変異株と、プラスミドｐＲＳ−ＴＵＢ１−２４８を親株に形質転換した形質転換体との生育を示す図であり、Ｃは、Ｔｕｂ１−２４８蛋白の変異点周辺のアミノ酸配列について、出芽酵母由来のＴｕｂ１蛋白、出芽酵母由来のＴｕｂ３蛋白、及びヒト由来Ｔｕｂ１蛋白をアライメントした結果を示し、「＊」は、Ｔｕｂ１−２４８蛋白の変異箇所を示す。
【図４】ＮＫＨ−７耐性について、野生型（ＴＵＢ１）及びＴＵＢ１−２４８変異バックグラウンドでの、ｔｕｂ３破壊変異の影響を示した図である。
【図５】ＮＫＨ−７処理下での、細胞内の微小管の形態を示した図である。
【図６】本発明の微小管重合阻害化合物に加え、従来知られている微小管重合阻害化合物存在下における、ＴＵＢ１−２４８株と野生株との耐性レベルを比較した結果を示す図である。Ａは、α−チューブリンをターゲットをする微小管重合阻害化合物存在下における耐性レベルを示し、Ｂは、β−チューブリンをターゲットをする微小管重合阻害化合物存在下における耐性レベルを示す。
【図７】Ａは、ＮＫＨ−７について、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのＴＵＢ１−２４８株及びｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた結果を示す図であり、Ｂは、ノコダゾール及びピロネチンについて、ＣａＣｌ２を含有するＹＰＤアガー培地でのｚｄｓ１Δ株の生育の影響を調べた結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、
上記微小管重合阻害化合物が、１‐ナフトール誘導体であることを特徴とする微小管重合阻害化合物。
【請求項２】
上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（１）または（２）で示される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の微小管重合阻害化合物。
【化１】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくは水酸基に変換し得る基を表す。）
【請求項３】
上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくはメトキシル基を表わすことを特徴とする請求項２に記載の微小管重合阻害化合物。
【請求項４】
上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（３）
【化２】
で示される化合物であることを特徴とする請求項２に記載の微小管重合阻害化合物。
【請求項５】
微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとすることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有することを特徴とする微小管重合阻害剤。
【請求項７】
微小管重合阻害剤に対する上記微小管重合阻害化合物の量が、２０μＭよりも多くなっていることを特徴とする請求項６に記載の微小管重合阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする抗癌剤。
【請求項９】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする抗カビ剤。
【請求項１０】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする除草剤。
【請求項１１】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする駆虫剤。
【請求項１】
細胞内の微小管重合を阻害する作用を有する微小管重合阻害化合物であって、
上記微小管重合阻害化合物が、１‐ナフトール誘導体であることを特徴とする微小管重合阻害化合物。
【請求項２】
上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（１）または（２）で示される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の微小管重合阻害化合物。
【化１】
（ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくは水酸基に変換し得る基を表す。）
【請求項３】
上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水酸基、もしくはメトキシル基を表わすことを特徴とする請求項２に記載の微小管重合阻害化合物。
【請求項４】
上記１‐ナフトール誘導体が、下記化学式（３）
【化２】
で示される化合物であることを特徴とする請求項２に記載の微小管重合阻害化合物。
【請求項５】
微小管におけるα‐チューブリンをターゲットとすることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有することを特徴とする微小管重合阻害剤。
【請求項７】
微小管重合阻害剤に対する上記微小管重合阻害化合物の量が、２０μＭよりも多くなっていることを特徴とする請求項６に記載の微小管重合阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする抗癌剤。
【請求項９】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする抗カビ剤。
【請求項１０】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする除草剤。
【請求項１１】
請求項１〜５の何れか１項に記載の微小管重合阻害化合物を含有していることを特徴とする駆虫剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−１８４９６８（Ｐ２００９−１８４９６８Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６６２１（Ｐ２００８−２６６２１）
【出願日】平成２０年２月６日（２００８．２．６）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０１１２１２７７）カセサート大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月６日（２００８．２．６）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０１１２１２７７）カセサート大学 (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]