抗体評価試験
【課題】再現性を有し、かかる評価の妨げとなりうる抗体のＦａｂ領域による影響を受けることなく、抗体Ｆｃ領域によるＦｃ受容体の活性化能を特異的に評価することを可能にする、抗体製剤のＦｃ受容体活性化能の測定方法の提供。
【解決手段】ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、ｂ）Ｆｃ受容体を発現している細胞を、前記凝集抗体と接触させるステップと、ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答を測定するステップを含んでなる測定方法。
【解決手段】ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、ｂ）Ｆｃ受容体を発現している細胞を、前記凝集抗体と接触させるステップと、ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答を測定するステップを含んでなる測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体製剤のＦｃ受容体活性化能の測定方法の提供に関し、当該方法は以下のステップを含んでなる：
ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、
ｂ）Ｆｃ受容体を発現している細胞を、前記凝集抗体と接触させるステップと、
ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答を測定するステップ。
【背景技術】
【０００２】
調査研究への抗体の使用が盛んに行われるうちに、抗体は更に診断及び治療用ツールの１つとしても用いられるようになり、従来の治療方法に対する代替的方法を提供するに至った。
【０００３】
治療に用いられている多くの抗体製剤（血清若しくは生物工学的手法に由来する）が、現在市販されているか、又は臨床試験段階にある。それらの特性を改良することにより、特異的にそれらの標的と結合し、免疫細胞を効果的に補充できる治療用ツールが得られる。
【０００４】
ここ数年来の開発の方向は、抗体の効果の改良、特にそれらのＦｃ定常領域の操作が中心となっている。抗体の「エフェクター」特性の原因となるのは後者であるが、その理由は、それがエフェクター免疫細胞及び補体分子の動員を促進するからである。この活性は、特定の免疫細胞上の糖蛋白質、Ｆｃ受容体（又はＦｃＲｓ）の存在によって可能となる。これらの受容体は抗体の定常領域と結合でき、その結合後、抗体の可変領域を介して標的抗原と結合する。これらの細胞との接触後、当該抗体は、異なる細胞内機構（例えばファゴサイトーシス及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）を活性化させる。
【０００５】
これは、Ｆｃ受容体への抗体のＦｃ領域の結合に起因するそれらの「有効性」（すなわち免疫細胞機構を活性化させる能力）に基づいて抗体を識別する方法に対する問題を提起するものである。
【０００６】
特許文献１では、抗体の機能活性を測定する方法が開示されている。この方法は、ＣＤ１６受容体を発現する細胞を、抗体及び前記抗体の抗原の存在下で、反応培地と接触させるステップと、ＣＤ１６受容体を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量を測定するステップを含んでなり、この測定により、抗体による免疫系のエフェクター細胞の活性化能が示される。
【０００７】
すなわち、この方法により、抗原抗体複合体を用いたエフェクター細胞の活性化の評価が可能となる。しかしながら、この方法では、エフェクター細胞の活性化は、抗体とその標的とのアフィニティ、及びＦｃ受容体と結合するＦｃ領域の性能の両方に依存することとなる。したがって、この試験では、抗体のＦｃ領域単独によるエフェクター細胞の活性化の評価を行うことができない。
【０００８】
この課題を解決するために、特許文献２では、抗体のＦａｂ領域の結合能に影響されることなく、抗体のＦｃ領域の機能性を測定することを可能にする方法を開示している。この方法は、試験する抗体を固定化するステップと、それをＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞中と抗体のＦｃ領域を反応させるステップと、エフェクター細胞の活性化に起因するエフェクター細胞の応答を測定するステップを含んでなる。この方法では、抗体はプレート又はビーズ上へのコーティングによって固定化される。
【０００９】
このように固定化される抗体数は制御できないが、それはプレートへの抗体の正しい結合の如何、プレート又はビーズ上におけるそれらの向き、及び抗体の電荷に依存するからである。実際、抗体の電荷はそれらのアミノ化レベルに依存し、それにより、ビーズ又はプレートに固定化されるそれらの能力に影響が及ぶ。すなわち、この変動要因の存在により、試験成績が抗体の関数として随時変化し、そのため異なる配列及び／又は特異性を有する２つの抗体のＦｃ領域の機能性を比較することが困難となる。更に、当該試験はヒトの単核球細胞株（ＴＨＰ−１）を使用して実施されるが、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体が一貫して細胞表面で発現されるためには、インターフェロンγによる活性化を行う必要がある。この事前の活性化により試験成績が大きく変動し、したがって実験結果を比較することが困難となる。
【特許文献１】仏国特許第０２１１４１６号公報
【特許文献２】欧州特許第１２９８２１９号公報
【非特許文献１】Ｖａｎ Ｍｉｒｒｅら、（２００４）．Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＩｇＧ ｉｎ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＦｃｇＲＩＩ ａｎｄ ＦｃｇＲＩＩＩｂ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；３３２：３３９
【非特許文献２】Ｆａｒａｇ Ｓ．Ｓ．，Ｆｌｉｎｎ Ｉ．Ｗ．，Ｍｏｄａｌｉ Ｒ．，Ｌｅｈｍａｎ Ｔ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ Ｄ．，ａｎｄ Ｂｙｒｄ Ｊ．Ｃ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０３，ｎ［．］４，１４７２−１４７４．
【非特許文献３】Ｗｕ Ｊ．，Ｅｄｂｅｒｇ Ｊ．Ｃ，Ｒｅｄｅｃｈａ Ｐ．Ｂ．，Ｂａｎｓａｌ Ｖ．，Ｇｕｙｒｅ Ｐ．Ｍ．，Ｃｏｌｅｍａｎ Ｋ．，Ｓａｌｍｏｎ Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｒ．Ｐ．１９９７，Ｊ．） Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１００，ｎ［．］５，１０５９−１０７０．
【非特許文献４】Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．，Ｌａｉ Ｊ．，Ｋｅｃｋ Ｒ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｌ：Ｙ．，Ｈｏｎｇ Ｋ．，Ｍｅｎｇ Ｙ．Ｇ．，Ｗｅｉｋｅｒｔ Ｓ．Ｈ．Ａ．，ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７７，ｎ［．］３０，２６７３３−２６７４０．
【非特許文献５】Ｎｉｗａ Ｒ．，Ｈａｔａｎａｋａ Ｓ．，Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａ Ｅ．，Ｓａｋｕｒａｄａ Ｍ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｙ．，−Ｕｅｈａｒａ Ａ．，Ｙｏｋｏｉ Ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ．，ａｎｄ Ｓｈｉｔａｒａ Ｋ．（２００４），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６２４８−６２５５．
【非特許文献６】Ｗｅｉｓｓ Ａ．，Ｗｉｓｋｏｃｉｌ Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｓｔｏｂｏ Ｊ．Ｄ．１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１３３，ｎ［．］ｌ，１２３−１２８．
【非特許文献７】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｕ．，Ｓｃｈｗｅｎｋ Ｈ．Ｕ．，ａｎｄ Ｂｏｒｎｋａｍｍ Ｇ．（１９７７） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，ｖｏｌ．１９，ｎ［．］５，６２１−６２６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上をまとめると、「有効性」に基づいて抗体を識別する現行の方法では、抗体のＦｃ領域によるエフェクター細胞の活性化の評価を十分行うことができないか、あるいは再現性に乏しく、その結果標準化するのも困難となる。以上を踏まえ、新規な方法を開発すべく発明者らが鋭意研究を行った結果、再現性を有し、かかる評価の妨げとなりうる抗体のＦａｂ領域による影響を受けることなく、抗体Ｆｃ領域によるＦｃ受容体の活性化能を特異的に評価することを可能にする、抗体製剤のＦｃ受容体活性化能の測定方法を開発するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、第１の本発明の目的は、抗体製剤によるＦｃ受容体の活性化性能を測定する方法の提供に関し、当該方法は以下の工程を含んでなる。
ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、
ｂ）Ｆｃ受容体を発現している細胞を、前記凝集抗体と接触させるステップと、
ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答を測定するステップ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の用語「前記抗体を相互に凝集させる」とは、溶液中に分散している抗体を相互に結合させ、当該抗体間の強い結合に基づくネットワークを形成することを意味する。
【００１３】
抗体のこの凝集により、抗体が一定の方向を向くように制御され、それにより、全ての若しくは大多数の抗体のＦｃ領域が、Ｆｃ受容体を発現するエフェクター細胞のＦｃ受容体の方向に向かって好適な位置関係をとる。実際、発明者らは驚くべきことに、かかる凝集の効果として、特定の抗体のＦｃ領域が、試験しようとする抗体の特異性又は一次構造に関係なく、特定の形式において、適切な位置関係をとるという事実が挙げられるという点を見出した。
【００１４】
本発明に係る評価方法の利点としては、当該方法で利用される抗体の量とエフェクター細胞の活性化との間で用量依存的な相関が見られることと、再現性を有することが挙げられる。
【００１５】
更に発明者らは驚くべきことに、かかる方法では、標的抗原が存在せずとも、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞の活性化が可能となる点を見出した。実際、Ｆｃ受容体はｉｎ ｖｉｖｏで、抗体の定常領域がその可変領域を介して標的抗原に結合した後、抗体の定常領域と結合することができる。上記方法では抗原標的を細胞表面に発現する細胞の使用が不要となるが、それにより生物学的試験の変動性の原因がなくなり、それにより当該方法において生じうる変動性パラメータが減少するという顕著な効果を得ることができる。
【００１６】
すなわち、従来技術の方法において見られる、標的細胞の存在による生物学的可変性、並びに抗体の特異性及び一次構造の影響は、本発明の方法では非常に限られるか、あるいはゼロである。
【００１７】
本発明を実施するために、抗体の凝集に通常用いられている、限定されないが例えば熱的又は免疫学的方法（例えば全免疫グロブリンＧ）などの、当業者に公知のあらゆる手段を用いて抗体を凝集させてもよい。更に、本発明による方法には、溶液状の抗体により実施できるという効果がある。
【００１８】
本発明の用語「Ｆｃ受容体」とは、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）及びＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）などの、エフェクター細胞上に存在する、抗体のＦｃ領域と結合するあらゆる受容体のことを意味する。
【００１９】
本発明の用語「抗体」とは、その特異性及びアイソタイプを問わない、あらゆる抗体のことを意味するが、但し、Ｆｃ領域又はＦｃ領域と同じ機能を有する部位を含んでなる。それはすなわち、全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦｃ抗体フラグメント）であってもよい。更に、本発明の方法で利用される抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ、又はこれらの混合物であってもよい。更に、本発明の方法で利用される抗体はモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体であってもよく、それらがモノクローナル抗体である場合、これらの抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は動物由来の抗体であってもよい。本発明の用語「Ｆｃ受容体を発現する細胞」とは、細胞表面にＦｃ受容体を発現するあらゆる細胞（その受容体を天然において発現するか、又は遺伝子組み換えにより発現できる細胞）のことを意味する。例えばＮＫ細胞、活性単核細胞、末梢血顆粒球、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球又は肥満細胞などが例示されるが、これらに限定されない。好適なことに、抗体のＦｃ領域がそれらの表面で発現するＦｃ受容体と結合するとき、これらの細胞はある種の応答を示す。
【００２０】
本発明の用語「Ｆｃ受容体を発現する細胞による応答」とは、これらの細胞のＦｃ受容体と抗体のＦｃ領域との間の相互作用に起因する、あらゆる測定可能な応答のことを意味する。この応答は細胞内での応答であってもよく、細胞外での応答であってもよい。その例としては、１つ以上のサイトカイン、細胞内カルシウム、パーフォリン、グランザイム又は一酸化窒素のレベルの測定が挙げられるが、これらのリストに限定されない。
【００２１】
好適には、当該凝集はＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片を使用して実施する。この手段により、抗体のＦｃ領域の方向が制御されるという意味で、特に好適な凝集が可能となる。実際、各Ｆ（ａｂ’） ２フラグメントは試験対象となる２つの異なる抗体と結合するが、それにより、試験対象の抗体のＦｃ領域が好適な態様の位置関係をとる。この方向性は、特にエフェクター細胞とＦｃ受容体との相互作用にとり好適であり、それにより、エフェクター細胞の活性化にとり好適である。
【００２２】
本実施形態において使用できるＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片は、抗体のいかなる断片、部分若しくはドメインであってもよく、例えばＦｃ領域、Ｆａｂ領域又は全ＩｇＧ分子であってもよい。Ｆ（Ａｂ’）２断片はモノクローナル性であってもよく、又はポリクローナル性であってもよい。
【００２３】
本発明の本実施形態では、試験される抗体及びＦ（ａｂ’）２の濃度は、正確に制御することができる。それにより、上記の２つの相関を算出することが可能となり、更に、試験される抗体製剤の如何に関係なく再現性を伴う形で試験を実施することが可能となる。
【００２４】
特に好適には、このＦ（ａｂ’）２抗−ＩｇＧ断片は、試験対象の抗体製剤に対する反応性を有する、抗−Ｆａｂ又は抗−Ｆ（ａｂ’）２断片である。こと断片はヤギ又はウサギ由来の断片であってもよい。
【００２５】
具体的実施形態では、各Ｆ（ａｂ’） ２フラグメントは、試験される２つの抗体分子のＦａｂの一部と結合し、それにより試験される抗体のＦｃ領域が適切な位置関係をとり、その結果、それらがＦｃＲと結合し、細胞表面でこれらのＦｃＲｓを発現する細胞が活性化される。
【００２６】
他の実施形態では、当該凝集は熱による凝集である。抗体は最初に加熱され、それによりそれらが相互に凝集し（本発明の方法のステップ（ａ））、次にＦｃ受容体を発現する細胞と接触する形で配置される（ステップ（ｂ））。抗体の相互凝集に適するいかなる加熱方法も、本発明の実施態様において使用することができる。例えば、６０℃で３０分間の抗体を加熱してもよい（非特許文献１参照）。
【００２７】
本発明の他の実施形態では、当該凝集は、Ｆａｂ領域相互の架橋、又は重鎖と軽鎖との架橋により実施される。本発明の用語「架橋」とは、２つの抗体分子間のあらゆる架橋（ブリッジング）のことを意味し、例えば、これらの抗体のＦｃ領域が一定に、エフェクター細胞のＣＤ１６受容体の方向を向いている態様が好ましい。好適には、抗体は１つ以上の架橋を有する。それにより抗体はネットワークを形成でき、またその配向性は、エフェクター細胞により担持されるＣＤ１６受容体との最適な結合を形成するのに適している。好適なことに、抗体相互の架橋（すなわちブリッジング）を可能にするいかなる手段も、本発明の実施態様に用いることができる。例えば、化学結合又は紫外線によって架橋がなされてもよいが、このリストに限定されるものではない。好適には、エフェクター細胞により発現するＦｃ受容体は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ）及びＣＤ６４である。特に好適にはＣＤ１６が選択される。
【００２８】
好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体を発現する細胞は、前記受容体をコードする遺伝子を導入された細胞である。本実施形態では、エフェクター細胞により提示される受容体のアロタイプを制御することが可能である。実際、所望の試験を行うという観点から、１つの受容体のみを有する細胞を特性の観点から選択して本発明の方法を実施してもよく、あるいはこれらの受容体の組合せを用いて実施してもよい。例えば、ＣＤ１６をコードする遺伝子を細胞に導入し、ＣＤ１６のみを発現するエフェクター細胞を使用する手段を選択して、本発明を実施してもよい。すなわち、他の可変因子（すなわちエフェクター細胞の表面に存在する１つ以上のＦｃ受容体の性質及び量）を排除することが可能となる。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体を発現する細胞は、ＣＤ１６を発現するＪｕｒｋａｔ細胞であり、この株は、これらの細胞の非特異的な活性化物質（例えばＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート １３−アセテート））の存在下で培養される。この株化細胞を用いた本発明の方法の実施態様の、特に有利な態様の１つは、この株が、凝集抗体と接触するエフェクター細胞を配置する前の活性化ステップを必要としないという事実に基づく。実際、ある種のエフェクター細胞株では、Ｆｃ受容体の顕著な発現のためには、１つ以上のサイトカインによる活性化が必要となる（例えば欧州特許第１２９８２１９号を参照）。サイトカインを用いたこの従来の活性化はしばしばランダムな結果に至らしめ、時間のロスや実験の標準化を困難にするなどの、克服するのが困難な問題を生じさせる。更に、ＣＤ１６受容体をコードする発現ベクターを導入されたＪｕｒｋａｔ株（「Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６株」）は、不死化されることにより、培養培地中で無限に増殖させることが可能となる。
【００３０】
これらの細胞は、二重に刺激されると活性化されうるという利点を有する。本発明の方法では、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞の活性化は、ＰＭＡ（Ｔ細胞に対する非特異的な活性化物質）、及び抗体のＦｃ領域とＣＤ１６との結合によりなされる。Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化は、培養上清へのＩＬ−２の放出により示される。その結果、ＣＤ１６に対する抗体のＦｃ領域の機能性が高いほど、上澄に放出されるＩＬ−２の量はより多くなる。
【００３１】
好適には、前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞応答の測定は、ＣＤ１６受容体を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン量の測定により行われる。実際、エフェクター細胞の活性化は特に、培養上清へのＩＬ−２の放出によって示される。例えば、培地中のサイトカイン濃度は、市販のＥＬＩＳＡ（バイオアッセイ）試験により測定できる。他の方法としては、サイトカイン（例えばＩＬ−２）の合成をアッセイすることが挙げられる。すなわち、ＩＬ−２のメッセンジャーＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＴ及びノーザンブロット法でアッセイするか、又は細胞内のＩＬ−２及び培養上清中のＩＬ−２をウエスタンブロット及びサイトメトリでアッセイする手法が挙げられる（このリストに限定されない）。
【００３２】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの量の測定は、これらのサイトカインのｍＲＮＡのアッセイにより行われ、これらのｍＲＮＡの量は、対応するサイトカインの発現のレベルと相関し、それはすなわち、エフェクター細胞の活性化レベルを示す。
【００３３】
好適には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）から選択される少なくとも１つのサイトカインが定量される（このリストに限定されない）。
【００３４】
特に好適には、細胞応答の測定はインターロイキンＩＬ−２の測定により実施される。
【００３５】
分泌されたインターロイキンＩＬ−２のレベルは、ＡＤＣＣ−タイプ活性と相関している。実際、エフェクター細胞によるサイトカインの分泌と、エフェクター細胞のＣＤ１６により媒介されるＡＤＣＣ活性との間の強い相関が確認されている（仏国特許第０２１１４１６号公報）。すなわち、本発明の方法は、特に治療用の細胞毒性抗体の選抜において有利である。
【００３６】
本発明の他の一実施形態では、細胞応答の測定は、カルシウム流入、リン酸化、転写又はアポトーシス因子の測定により行われる。これらのパラメータの増加はエフェクター細胞の活性化と相関し、それはすなわち、エフェクター細胞のＦｃ受容体を活性化させる抗体の性能を示すものである。
【００３７】
好適には、当該方法は、ＣＤ１６受容体と相互作用できるモノクローナル抗体を産生する細胞の性能を評価（すなわち抗体又は抗体製剤の細胞障害性を評価）することに適している。過去の研究においては、ＣＤ１６に対する抗体のアフィニティが、Ｆｃ受容体（例えばＣＤ１６の多型［非特許文献２、３］）、更にはＦｃ領域の特性に依存することが証明されており、また、免疫グロブリンの重鎖の位置２９７のアスパラギンに存在するオリゴ糖のフコースレベルが、Ｆｃ受容体との結合において役割を果たすことが証明されている［非特許文献４、５］。
【００３８】
抗体産生株化細胞は、増殖できるいかなる株であってもよく、特にＣＨＯ、ＹＢ２／０、ＳＰ２／０、ＳＰ２／０−ＡＧ１４、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒト骨髄腫、ＰＥＲＣ６株化細胞、ＣＨＯ株（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択されるが、それらに限定されない。
【００３９】
好適には、当該方法は、１つ以上の精製工程の後に得られた抗体製剤のＦｃ領域の有効性及び完全性を評価することに適する。
【００４０】
本発明の方法の他の用途は、変性条件下に置かれたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含有する、特に治療用の製剤の、安定性のモニタリングである。
【００４１】
ゆえに本発明の方法は特に、治療用の製剤の、時間経過に伴うモニタリングに有用である。実際、本発明者らは、数カ月にわたり抗体製剤を変性条件下で保存して活性をモニターし、それが減少することを解明した。すなわち、高温（例えば４０℃）で保存した場合、治療用製剤は時間経過と共にその活性を喪失する。更に本発明の方法により、標的抗原を担持する細胞を用いた試験と異なり、抗体のどの部分が、この活性の損失に関係しているかを識別することが可能となる。変性させた場合に、ＣＤ１６に対するアフィニティを喪失するのは、抗体のＦｃ領域であることは明らかである（実施例４を参照）。
【００４２】
当該方法は更に、抗体のＦｃ領域の機能性の測定にとり好適である。本発明の用語「抗体のＦｃ領域の機能性」とは、このＦｃ領域による、Ｆｃ受容体に対する（特にＣＤ１６受容体に対する）結合を介したエフェクター細胞の活性化能のことを意味する。本発明の方法は非常に再現性が高く（参照実施例２、パラグラフ５）、抗体の配列及び／又は特異性が異なる場合においても測定効率が変わらないため、抗体製剤の機能性を分析するためのルーチン試験や、非常に高い細胞毒性を有する抗体のスクリーニングにしようすることができる。
【００４３】
好適なことに、当該方法は、遺伝子導入植物又は遺伝子導入哺乳動物によるモノクローナル抗体の産生のアッセイに適している。本発明に係る方法の実施によって得られるかかる抗体は、そのＦｃ領域がＦｃ受容体を活性化させる性能を有することを特徴とする。
【００４４】
好適なことに、当該方法は、治療用抗体の効率的な選抜に適している。例えば、当該抗体は、抗体が存在しないコントロール、又は、ネガティブコントロールとしての所定の抗体と比較して１００％超、あるいは２５０％、好適には５００％、より好適には１０００％のレベルでサイトカイン（例えばＩＬ−２）の放出が観察されるものが選択される。
【００４５】
好適なことに、当該方法は、６５％未満、好ましくは４０％未満のフコース含量の抗体組成物の選抜に適している。実際、抗体製剤の活性が、重鎖の位置２９７のグリカン単位上のフコース含量に依存していることが証明されている。
【００４６】
抗体は重鎖と軽鎖により構成され、それらはジスルフィド架橋によって結合している。各鎖は、Ｎ末端では、抗体が結合する抗原に対して特異的な可変領域（又はドメイン）により構成され、Ｃ末端では、軽鎖では単一のＣＬ領域、重鎖では幾つかの領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む定常領域により構成される。重鎖の可変ドメイン、ＣＨｌ及びＣＬ領域、並びに軽鎖が会合して抗体のＦａｂ部分を形成し、それは非常に柔軟なヒンジ領域を介してＦｃ領域と連結し、各Ｆａｂの標的抗原との結合を可能にする。Ｆｃ領域（抗体のエフェクタ特性の調節部分）は、エフェクター分子（例えばＦｃγＲ受容体、ＦｃγＲ）に対するアクセス可能性を保持している。Ｆｃ領域（２つの球状領域ＣＨ２及びＣＨ３により構成される）は、２つの鎖の各々において、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）に結合する２アンテナタイプのＮ−グリカンの存在により、ＣＨ２領域のレベルでグリコシル化されている。
【００４７】
このタイプのＮ−グリカンは、以下の一般式で表される：
【化１】
【００４８】
すなわち、本発明による抗体組成物において、「フコース」とは、これらのＮ−オリゴ糖により担持されるフコースのことを意味する。フコース分子が存在する場合、それはＮ−オリゴ糖のＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に密接に結合し、このＧｌｃＮＡｃはそれ自体がＡｓｎ２９７に結合する。各抗体の各２つの重鎖により担持される各２つのＮ−グリカンは、フコース分子を担持してもよく、又は担持しなくともよい。すなわち、各抗体はそれぞれ０、１又は２個のフコース分子を含んでもよく、そのＮ−グリカンのいずれもフコースを担持しない場合、そのＮ−グリカンのうちの１つのみがフコース分子を担持する場合、又はそのＮ−グリカンの両方が各々フコース分子を担持する場合がありえる。すなわち、「６５％未満のフコース含量の抗体組成物」の用語は、組成物中の抗体の各糖鎖形成部位（Ａｓｎ２９７）に担持されるグリカン構造の全体の６５％未満がフコース分子である、抗体組成物のことを意味する。
【００４９】
本発明者らによって、かかる組成物が特に好適なＡＤＣＣ活性を有することが証明されている。
【００５０】
好ましくは、フコース含量が２０％〜４５％、又は２５％〜４０％である抗体の組成物が選択される。本発明の方法において、抗体組成物（製剤）中のフコースレベルが減少するとき、ＣＤ１６に関連する抗体の機能的な活性の増加がみられたことから、機能的な活性とフコースレベルとの間の定量的な関係が示されている。
【００５１】
本発明の別の目的は、以下の工程を含んでなるモノクローナル抗体組成物の調製方法に関する。
ａ）ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は１つ以上の前記抗体の発現用のベクトルを使用して遺伝子導入した動物、植物若しくはヒト由来の株化細胞から抗体を得るステップと、
ｂ）Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片によってステップａ）において得られた抗体を凝集させるステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた抗体を、−ＣＤ１６を発現する細胞を有するエフェクター細胞と、−ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を含有する反応混合液に添加するステップと、
ｄ）ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量を測定するステップと、
ｅ）抗体が存在しない場合、又はネガティブコントロールとしての所定の抗体が存在する場合と比較し、０．５、１、２、５、１０、１００又は５００倍超のサイトカイン産生量が測定される抗体組成物を選抜するステップ。
【００５２】
好適には、ＣＤ１６を発現する細胞からなるエフェクター細胞は、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞である。
【００５３】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン量の測定は、これらのサイトカインのｍＲＮＡのアッセイによりなされる。これらのｍＲＮＡの量は対応するサイトカインの発現レベルと相関し、それはすなわちエフェクター細胞の活性化レベルを示す。
【００５４】
例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）から選択される少なくとも１つのサイトカインが定量される（このリストに限定されない）。
【００５５】
好適には、細胞応答の測定は、インターロイキンＩＬ−２の測定によりなされる。
【００５６】
分泌されたインターロイキン（例えばＩＬ−２）のレベルは、ＡＤＣＣ−タイプ活性と相関している。実際、エフェクター細胞によるサイトカインの分泌と、エフェクター細胞のＣＤ１６により媒介されるＡＤＣＣ活性との間に、強い相関が存在することが確認されている（仏国特許第０２１１４１６号公報）。
【００５７】
本発明の他の一実施形態では、細胞応答の測定は、カルシウム流入、リン酸化、転写制御因子又はアポトーシスの測定によりなされる。これらのパラメータの増加はエフェクター細胞の活性化と相関し、それはすなわち、抗体がエフェクター細胞のＦｃ受容体を活性化させる性能を有することを示す。
【００５８】
好適には、ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量の測定は、ＣＤ１６を発現する細胞によって産生されるＩＬ−２の量の測定によってなされる。
【００５９】
本発明の他の目的は、上記の方法のうちの１つの実施態様に必要な構成要素を含んでなる、治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットに関し、当該キットは特に以下の構成要素を含んでなる。
（ｉ）前記治療用抗体を凝集させる手段と、
（ｉｉ）Ｆｃ受容体を発現することができる細胞と、
（ｉｉｉ）前記細胞のＦｃ受容体が前記抗体のＦｃ領域によって活性化されたときの、Ｆｃ受容体を発現できる前記細胞における応答を測定するための手段と、
（ｉｖ）上記のいずれか１つの方法の実施に必要な他の構成要素。
【００６０】
治療用抗体の活性を測定するための生物学的試験キットは、
（ｉ）前記治療用抗体を凝集させる手段と、
（ｉｉ）Ｆｃ受容体を発現することができる細胞と、
（ｉｉｉ）前記細胞のＦｃ受容体が前記抗体のＦｃ領域によって活性化されたときの、Ｆｃ受容体を発現できる前記細胞における応答を測定するための手段と、
（ｉｖ）上記のいずれか１つの方法の実施に必要な他の構成要素を含んでなる。
【００６１】
本発明の好適な実施形態では、前記キットに含まれる、前記細胞の応答を測定するための手段は、前記細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインを定量化するための手段である。
【００６２】
本発明の有利な実施形態では、前記キットに含まれる、少なくとも１つのサイトカインを定量化するための前記手段は、前記サイトカインのｍＲＮＡをアッセイするための手段である。
【００６３】
本発明の他の一実施形態では、前記キットの前記細胞の応答を測定するための手段は、カルシウム流入、リン酸化、転写制御因子又はアポトーシスを測定するための手段である。
【００６４】
本発明の他の態様及び効果を以下の実施例に記載するが、それは例示を目的とするものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６５】
１． 細胞培養
１．１ 細胞株
Ｊｕｒｋａｔ細胞、クローンＥ６−１、（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）は、１９８４年にＡ．Ｗｅｉｓｓ［非特許文献６］によってＡＴＣＣに寄託された。クローンＥ６−１は野生型Ｊｕｒｋａｔ株から得た。これは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒその他によって、１９７７年、急性リンパ球性白血病に罹患する１４歳の子供の末梢血から分離された［非特許文献７］。Ｔ細胞マーカーを発現するこの株は、２つの異なる活性化シグナルにより刺激されると、インターロイキン２（ＩＬ−２）を産生することができる。しかしながら、ＩＬ−２の分泌レベルは、株及び取扱条件により変化する。ゆえに、それらが膜レベルでＦｃγＲＩＩＩａ受容体を発現するように、異なる由来のＪｕｒｋａｔクローンをトランスフェクションした。ヒトのＦｃγＲＩＩＩａ（γ鎖の膜貫通領域及び細胞内領域と、ＣＤ１６の細胞外領域が結合）及びネオマイシン選択遺伝子をコードするキメラ発現ベクターによってトランスフェクションし、細胞株を得た。位置１５８のフェニルアラニンを有するヒトＣＤ１６を発現することから、これらの細胞をＪＣＤ１６＋Ｐｈｅと称する。
【００６６】
１．２ 培養培地及びサブカルチャー用培地
ＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞を、ＩＭＤＭ培養液（Ｉｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地）（＋４ｍＭのＬ−グルタミン＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、γ線照射を受け、非働化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０％、及び０．５ｍｇ／ｍｌ（プロメガ）のネオマイシン類縁体（Ｇ４１８スルフェート）を含有）中で培養した。この株化細胞を、０．２×１０６細胞／ｍｌの接種で、１週当たり２つのサブカルチャーの割合で維持培養した。
【００６７】
２． フローサイトメトリ
それぞれの標識を、ＥＰＩＣＳ ＸＬ血球計測器（ベックマン・クールター社製）で分析した。
【００６８】
２．１ ＪＣＤｌ６＋Ｐｈｅ株化細胞のフェノタイプ解析
この表現型のタイピングは、ＣＤ４５（白血球細胞のマーカー）、ＣＤ１９（Ｂリンパ球の特異性のマーカー）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８（Ｔリンパ球の特異性のマーカー）、ＣＤ５８（ＣＤ２のリガンド）、更にＩＬ−２受容体の異なる鎖（ＣＤ２５又はＩＬ−２ Ｒα、ＣＤ１２２又はＩＬ−２ Ｒβ、並びにＣＤ１３２又はＩＬ−２ Ｒγ）を用いた、各種膜マーカーの解析により行った。ラベリングは、１００μｌの１×ＰＢＳ（リン酸緩衝液）中の１０６個の細胞に対して実施した。処理条件は以下のとおりである：１０μｌの抗ＣＤ２ ＦＩＴＣ（２−フルオレセインイソチオシアネート、クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ３ ＲＤ１（Ｒ−フィコエリトリン、クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤｌ９ ＥＣＤ（Ｒ−フィコエリトリン／テキサスレッドタンデムダイ、クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ１６ ＰＣ５（Ｒ−フィコエリトリン／シアニン５タンデムダイ、ＩＯＴｅｓｔ、ベックマン・クールター社製）。
【００６９】
１０μｌの抗ＣＤ４５ ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ３ ＲＤ１（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ４ ＥＣＤ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ８ ＰＣ５（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）。
【００７０】
− １０μｌの抗ＣＤ５８ ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
− ５μｌの抗ＣＤ１２２ ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ１３２ポリエチレン（フィコエリトリン、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）＋１０μｌの抗ＣＤ２５ ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
【００７１】
これらの４つのラベリングと並列して、アイソタイプコントロールとして以下のものを調製した：
− １０μｌのＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＲＤｌ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ２ｂ−ＥＣＤ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、ベックマン・クールター社製）。
− １０μｌのＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＲＤｌ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＣＤ４ ＥＣＤ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、ベックマン・クールター社製）。
− １０μｌのＩｇＧ２ａ−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
− ５μｌのＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ポリエチレン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）＋１０μｌのＩｇＧ２ａ−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
【００７２】
細胞を、室温で、暗所で３０分間、各モノクローナル抗体の存在下でインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで洗浄した後、１２００回転／分で５分間遠心沈降させ、ラベリングをサイトメトリによって直接分析した。
【００７３】
２．２ ＣＤ１６部位の数の決定
細胞表面で発現するＦｃγＲＩＩＩａ受容体の数を、ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いてアッセイした。この技術の実施においては、細胞表面で全ての抗原性部位を占めるのに必要な抗ＣＤ１６抗体（クローン３Ｇ８、フルオレセインコンジュゲート抗ＣＤ１６ ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製））の飽和投与量を事前に定量する必要がある。細胞（生理食塩水中、０．２５×１０６／１００μｌ）を、室温で３０分間、抗ＣＤ１６ ３Ｇ８の添加量を変化させ、インキュベートした。生理食塩水で洗浄した後、１２００回転／分で５分間遠心沈降させ、更に細胞を暗所で３０分間、の１／２０ｔｈに希釈したＰＥラベル付き抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｈ＋Ｌ）（ベックマン・クールター社製）５０μｌと共にインキュベートした。インキュベート終了後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）によって直接分析した。
【００７４】
キット（Ｎｏ．Ｋ００７８）の手順に従い、ＣＤ１６部位の数を、２．５×１０５個の細胞を用いて解析した。細胞を室温で３０分間、試験対象の５００ｎｇの抗体でインキュベートした。洗浄及び遠心沈降（１２００回転／分、５分）の後、細胞を、室温で３０分間、暗所で、１／５０ｔｈに希釈したＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｑｉｆｉｋｉｔ社製）１００μｌによりインキュベートした。細胞を更に洗浄し、ＦＡＣＳによって直接分析した。
【００７５】
３． Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ−２産生試験
３．１ 特異性抗原を担持する赤血球の存在下における試験
３．１．１ 試験サンプルの調製
抗Ｄ抗体のサンプルは、以下の８ポイントの濃度スケールに従って試験した：３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、９．４ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、１８．７５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３７．５ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌ。各濃度は、ＩＭＤＭ＋５％の不働化ウシ胎児血清でサンプルを希釈することにより調整した。
【００７６】
３．１．２ 標的細胞の調製
標的細胞は、ドナー（好ましくはＯ＋）から得たＲｈｅｓｕｓ Ｄ＋赤血球である。それはパパイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で事前に処理されている。これをボリューム／ボリュームで球状のペレットに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ、Ｅｃｏｔａｉｎｅｒ、Ｂ ＢＲＡＵＮ）を過剰量添加し、反応を停止させた。細胞を０．９％のＮａＣｌ水で３回洗浄し、最初２回の洗浄液を５分、及び最後の洗浄液を１０分間、３０００回転／分で遠心分離した。赤血球ペレットを更に８×１０６細胞／ｍｌ（０．０８％）の濃度でＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清で希釈し、細胞懸濁液を得た。
【００７７】
３．１．３ ＰＭＡ溶液の調製
４０ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＭＡ溶液（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を、ＩＭＤＭ＋５％のウシ胎児血清で１／２５０ｔｈで希釈して調製した。
【００７８】
３．１．４ エフェクター細胞の調製
Ｊｕｒｋａｔ細胞（試験前４８〜７２時間においてサブカルチャー）をＭａｒａｓｓｅｚスライドで計数し、１０７細胞（１つのマイクロプレートに必要な量）となるようにサンプリングする細胞懸濁液の量を算出した。細胞懸濁液を１２００回転／分で１０分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを更に、２×１０６細胞／ｍｌの濃度となるように、ＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清中に再懸濁した。懸濁液の濃縮を検査するために再度カウントを実施し、必要に応じて、ＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清を添加して正確に調整した。
【００７９】
３．１．５ 試験の実施
９６穴のＵ型ウェルを有するプレートの各ウェルに、以下のものを添加した：５０μｌの試験対象の抗Ｄ抗体、５０μｌの赤血球懸濁液（すなわち５０μｌあたり４×１０５赤血球）、５０μｌの細胞懸濁液（すなわち５０μｌあたり１０５細胞）、５０μｌのＰＭＡ（すなわち５０μｌあたり２ｎｇ）。
【００８０】
プレートごとに、抗Ｄ対照溶液、並びに抗Ｄポリクローナル抗体（Ｒｈｏｐｈｙｌａｃ ３００ ＴＭ、Ｂｉｏｔｅｓｔ）に対応するコントロールサンプルを添加した。撹拌しながらウェルをホモジナイズした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を１２５ｇで１分間遠心沈降し、デカントした。上澄を除去し、ＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡ試験で測定した。
【００８１】
３．２ 抗原標的の非存在下における試験
試験される抗体は、３．１．１において定義した８つの濃度スケールにより試験した。この試験においては、赤血球を、特異的なＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片（１．３ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で置換した。これも同様に、ＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清を用いて８つの異なる濃度となるように希釈した。抗Ｄ抗体及びＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ抗体を、１／１．５の比率において試験した。ＰＭＡ溶液を１０ｎｇ／ｍｌの濃縮で調製した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＩＭＤＭ＋５％のウシ胎児血清を用いて、２．１．４において定義した濃度となるように希釈した。
【００８２】
９６穴のＵ型ウェルを有するプレートの各ウェルに、以下のものを添加した：５０μｌの試験対象の抗Ｄ抗体、５０μｌの特異的Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片、５０μｌの細胞懸濁液、５０μｌのＰＭＡ（すなわち５０μｌあたり０．５ｎｇ）。
【００８３】
撹拌しながらウェルをホモジナイズした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を１２５ｇで１分間遠心沈降し、デカントした。上澄を除去し、ＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡ試験により、又はＩＬ−２をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のアッセイにより測定した。
【００８４】
３．３ ＥＬＩＳＡ法による細胞上澄中のＩＬ−２量
３．３．１ 材料及び方法
分泌されるＩＬ−２の量を、Ｄｕｏｓｅｔ（登録商標）ヒトＩＬ−２キット（ＤＹ２０２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の操作マニュアル従ってアッセイした。マイクロプレートの各ウェルに捕捉抗体を分散させた。ウシアルブミン溶液で飽和させた後、アッセイされる上澄を、異なる希釈度（ＩＬ−２の参照スケールと同様に）でアプライした。次にビオチン化ヒト抗ＩＬ−２抗体を添加し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼＨＲＰの溶液を更に添加した。基質（テトラメチルベンジジン）の添加後、青色に発色した。硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で反応を停止させた後、各ウェルの光学濃度を、４５０ｎｍによるプレートの測定により決定した。各ウェルのＩＬ−２濃度測定は、ＩＬ−２スケールの回帰曲線（［ＩＬ−２］＝［抗体］２＋ｂ［抗体］＋ｃ）をＢｉｏｌｉｓｅソフトウェアによって決定し、各ウェルのサンプルの希釈比を考慮することにより行った。
【００８５】
３．３．２ 結果の考察
ＥＬＩＳＡ試験で測定されたＩＬ−２濃度により、試験される各抗Ｄ抗体の活性を測定することが可能となる。その測定方法は以下のとおりである
：参照抗体を用い、測定されるＩＬ−２濃度を抗体濃度範囲の関数としてプロットし、２次曲線を決定した。アプライされるサンプル濃度ごとに、等量の参照抗Ｄ濃度を、上記２次曲線を用いて算出した。等量の抗Ｄ値の各々を、試験される抗体の希釈度を考慮しながら、標的細胞を有する試験では５０ｎｇ／ｍｌ、又は標的細胞を有さない試験では１０μｇ／ｍｌの理論濃度となるようにした。次に各サンプルの平均値を算出した。サンプルの活性パーセンテージを測定する際、便宜上、参照サンプルの活性を１００％の活性とした。それにより、以下の式で簡便に算出することが可能となる：
（再計算されたサンプル濃度の平均）／（再計算された参照サンプル濃度の平均）。
【００８６】
すなわち、活性のパーセンテージが未知の抗Ｄにおいて１００未満である場合、この抗体の活性が参照抗体のそれより低いことを意味する。一方、活性のパーセンテージが１００超である場合、試験した抗Ｄが参照よりも大きい活性を有することを意味する。
【００８７】
３．４ ＩＬ−２をコードするｍＲＮＡのアッセイによる、ＩＬ−２の測定
この技術は、ＩＬ−２をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のアッセイに基づく。最初に、全ＲＮＡを細胞から抽出した。ＲＮＡを、逆転写酵素と呼ばれる酵素を使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。ＩＬ−２に対応する遺伝子配列を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって特異的プライマにより検出した。サンプルを各々比較するため、当該アッセイを標準化することが必要である。この試験は、遍在型（ユビキタス）若しくは構成的の遺伝子をコードするｍＲＮＡの同時試験により実施し、その発現量は、培養組織及び刺激作用状態に関係なく、全ての細胞において同一であった。これらの試験において選択されたユビキタス遺伝子はｂ−アクチン（細胞骨格成分の１つ）である。細胞が活性化されると、ＩＬ−２ ｃＤＮＡ／ｂ−アクチンｃＤＮＡ比率が高くなる。ＩＬ−２をコードするｍＲＮＡは一過性のものである。すなわち、実験条件下で、刺激の後の遺伝子発現が最大となる時間（４〜６時間）を測定した。
【００８８】
３．４．１ 材料及び方法１）細胞培養以下の条件下で試験を実施した：
− ２００μｌの１０７細胞／ｍｌのＪＵＲＫＡＴ ＣＤ１６＋細胞懸濁液、
− Ｆ（ａｂ’）２を有する抗Ｄモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、
− ２００μｌの１０μｇ／ｍｌの抗ＤｍＡｂ、及び２００μｌの１５μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）特異的抗フラグメント、又は、
− ２００μｌの５μｇ／ｍｌの抗ＤｍＡｂ、及び２００μｌの７．５μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）特異的抗フラグメント、
− ２００μｌの４０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ。
【００８９】
使用する全ての溶液は、ＩＭＤＭ培養液＋５％のウシ胎児血清を用いて調製した。
【００９０】
次に細胞を、制御された雰囲気（９５％の空気＋５％のＣＯ２）下で、インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。
【００９１】
２）全ＲＮＡの抽出
以下の２つの市販のキットを使用して、全ＲＮＡを抽出した。
（ＱＩＡＧＥＮ）：
−ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒキット、
−ＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔミニキット。
次に、抽出ＲＮＡを２６０ｎｍで分光光度測定した。
【００９２】
３）逆転写酵素反応
４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡを得た。
− １μｇの線形ＲＮＡ（６５℃で加熱し、即座に４℃で冷却）、
− オリゴｄＴプライマー、
− ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、
− ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、
− ＲＮＡａｓｅ阻害剤、
− 逆転写酵素。
【００９３】
４）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は、以下の特異的プライマを使用して実施した：
（ＩＬ−２用）
ＩＬ−２ Ｈ１：ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＧ
ＩＬ−２ Ｈ２：ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＡ
（ｂ−アクチン用）
ＢＡＣＴ Ｈ１：ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧ
ＢＡＣＴ Ｈ２：ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＡＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＧ。
【００９４】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応法は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００装置、及びＰｏｗｅｒ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ マスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して実施した。２つのプライマーペアに使用したプログラムは、以下のとおりである：
− ９５℃で１０分間、脱ハイブリッドサイクル １サイクル、
− 以下を４０サイクル：
− ９５℃で１０秒間、脱ハイブリッド、
− ６０℃で１５秒間、「アニーリング」（プライマーカップリング）、
− ７２℃で６０秒間、伸長。
【００９５】
ＰＣＲ終了後、増幅産物を徐々に変性させ、増幅生成物に特異的な解離曲線及びＴｍ（融解温度（℃））を決定した。
【００９６】
３．４．２ 結果
２つの異なる濃度（５及び１０μｇ／ｍｌ）の２つの抗Ｄ ｍＡｂ調製物を比較した。調製物のうちの１つを５℃で、その他を４０℃で、３ヵ月間保存した。
【００９７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う際、試験細胞の培養開始から４時間においてＲＮＡの抽出を行い、サンプルを調製した。
【００９８】
培養上清中のＩＬ−２のＥＬＩＳＡアッセイを行う際、培養開始から１６時間においてサンプルを調製した。
【００９９】
１）ＥＬＩＳＡ結果
上澄に存在するＩＬ−２濃度を、試験開始後１６時間において、試験キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して定量化した。得られた結果を図６に示す。
【０１００】
２）定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果
Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞のＩＬ−２遺伝子発現を、試験開始の４時間後において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより推定した。結果を、ｂ−アクチンユビキタス遺伝子に関して標準化した。結果を図７に示す。
【０１０１】
３．４．３ 考察
刺激されたＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞の上澄中のサイトカインＩＬ−２濃度に関する直接的な試験法方法の結果と、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、その遺伝子発現のアッセイ方法の結果との相関が見られた。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ試験に関しては、ＩＬ−２遺伝子の発現強度は、試験したｍＡｂの性質及びその濃度に依存した。したがって、この技術は、ｍＡｂのＦｃ領域とＣＤ１６受容体との間の相互作用の解析に用いることができる。
【０１０３】
＜実施例１＞１． 株化細胞の特性評価
１．１ 株の遺伝子タイピング
この試験方法の開発の前に、各細胞株の遺伝子タイピングを、Ｑ−ＰＣＲ（７３００を適用した）による対立遺伝子の識別により実施した。遺伝子タイピングはＲＴ−ＰＣＲにより試験した。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
Ｑ−ＰＣＲ（ＤＮＡ）及びＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）による細胞株の遺伝子型の解析
Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋ｌｉｎｅは、その細胞表面の膜上にＦｃγＲＩＩＩ受容体を発現しない。Ｐｈｅと称するＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞株はＴ（Ｐｈｅ）遺伝子型を示す。
【０１０６】
１．２ 細胞株のフェノタイピング
Ｆ ＡＣＳ標識による膜マーカーの解析を行い、以下の結果を得た。
【表２】
【０１０７】
トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞株における、２つの膜マーカーを用いたサイトメトリ解析
細胞株は以下の表現型：ＣＤ４５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ１６＋、ＣＤ５８＋及びＣＤ１３２＋を有する。
【０１０８】
１．３ ＣＤ１６部位の数の決定
この実験の目的は、サイトメトリ分析される間接的なマーキングにより、ＣＤ１６抗原部位の数を定量化することである。当該技術は、所定量（１０３〜１０６の抗体結合能力（又はＡＢＣ））のモノクローナル抗体（マウス抗ヒトＣＤ５）をコーティングされた１０μｍ直径のビーズの５つの集合体の使用に基づく。これらの異なる集合体の使用により、抗体結合能力（ＡＢＣ）に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）に該当するキャリブレーション曲線の作成が可能となる。細胞を、標識二次抗体で示される目的の一次抗体（抗ＣＤ１６）で飽和させ、飽和条件下に置いた。これらの状態を維持し、細胞表面に存在する抗原部位の数に対応する結合した一次抗体の数を測定した。その結果、蛍光強度は、細胞と結合した一次抗体の数と相関していた。細胞のＡＢＣを、キャリブレーション曲線により測定した。
【０１０９】
下表は、試験した細胞株のＣＤ１６部位の数の測定結果（幾つかのサブカルチャーに関して実施した試験）を要約したものである。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
ライブラリから得られるバイアルを解凍した後、各細胞株を、ＣＤ１６発現が維持されていることを確かめるために、選択培地中で、幾つかのサブカルチャーに関してモニターした。
【０１１２】
すなわち、若干の時間経過後、ＣＤ１６の発現は維持され、サブカルチャー間では、同一の培養条件下ではほとんど変化が見られなかった点に留意すべきである。更に、選抜条件及びその結果から、高い発現能力を有するクローンの選抜が可能であることが示唆された。更に、端部の集合（下の１０％及び上の１０％集団）の部位数測定の結果、この技術を用いることにより、細胞表面におけるＣＤ１６発現が外来遺伝子によるものであることが正確に分析された。
【０１１３】
＜実施例２＞：ＣＤ１６活性化試験
１． 特異性試験
特異性試験を、以下の通りに実施した：幾つかのコントロールを、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ−２分泌試験に供し、細胞活性化メカニズムを確認した。１５ｐｇ／ｍｌの検出限界は、試験キットのＩＬ−２参照スケールの最低ポイントとして定義されている。この閾値下では、細胞によるＩＬ−２の分泌は検出不可能と考えられる。下表は、ＩＬ−２レベルのｎ回の実験における平均、及びＩＬ−２産生試験に供される各コントロールにおける標準偏差を示す（＜ＬＴ：１５ｐｇ／ｍｌの検出限界以下）。
【０１１４】
【表４】
【０１１５】
細胞のみの培養上清を用いた試験により、検出不可能なそれらの基本分泌レベルの測定が可能となる。このコントロールの使用により、いかなる刺激が存在しない場合でも、細胞からのＩＬ−２分泌がなされないことが確認できる。更に、これらのコントロールの使用により、２つの刺激（ＰＭＡ及び抗−Ｄ／Ｆ（ａｂ’）２複合体）が細胞の活性化に必要であることが確認できる。実際、２つの刺激のうちの１つが存在しない（コントロールＰＭＡ＋Ｆ（ａｂ’）２又はＦ（ａｂ’）２＋抗Ｄ）とき、ＩＬ−２の分泌は極小であるか、ゼロである。同様に、ＣＤ１６の活性化は抗体の凝集が必要であるが、それは、Ｆ（ａｂ’）２の非存在の場合、ＩＬ−２の分泌が若干見られるものの、ＰＭＡ及びアンチ−Ｄ／Ｆ（ａｂ’）２凝集体の存在下での分泌よりもはるかに少ないからである。更に、各実験において、最大の活性化レベルを、ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いて測定した。ゆえにこれらの結果は、ＩＬ−２分泌を生じさせるためには、ＪＣＤ１６＋細胞を二重に刺激する必要があることを示すものである。
【０１１６】
２． 投与量効果及び抗体濃度範囲の定量
残りの実験において抗Ｄの最適濃度範囲を解析するため、用量反応試験（以下の２本の曲線により示される）を実施した。この目的のため、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲のＲ２９７抗体（バッチＣ０２９−０２５）を反応培地中で試験した。実験は、５回の反復試験により実施した（図２を参照）。
【０１１７】
低い抗Ｄ濃度の場合、刺激後２４時間における上澄中のＩＬ−２濃度曲線は、試験に供した抗Ｄの濃度に比例していた。高い抗Ｄ濃度では、曲線はプラトーに至った。
【０１１８】
３． 活性化の動態、及びインキュベーション時間の決定
最適インキュベート時間を決定するため、２つの株化細胞におけるＩＬ−２分泌の動態を解析した。この目的のため、細胞を、所定の抗Ｄ濃度範囲（０．６２５〜１０μｇ／ｍｌ、バッチＣ０２９−０２５）において、８、２４、３２、４８、５６又は７２時間刺激した。上澄中のＩＬ−２濃度を、抗Ｄ濃度、及びインキュベート時間ごとにアッセイし、図３の直線を得た。
【０１１９】
この試験結果から、刺激後８時間では、細胞がごくわずかなＩＬ−２しか分泌しないことが示された。またＩＬ−２レベルは２４時間後において最大値に至った。刺激後２４時間で、曲線は更に上昇する傾向さえ示した。試験時間を制限するため、インキュベートの最適時間を２４時間と設定した。
【０１２０】
４． 試験における細胞濃度の効果
生物学的試験において、細胞濃度を標準化することは比較的困難である。この研究の目的は、所定のサンプルの活性（％）が細胞濃縮に依存するか否かを確認することである。このため、３つの独立の試験を、抗Ｄモノクローナル抗体のサンプル（バッチＲ２９７ Ｎｏ．０５−０８１、Ｔ０）を、５つの異なる細胞濃度（Ｃ１＝１０５細胞／ウェル、Ｃ２＝２．５×１０５細胞／ウェル、Ｃ３＝５×１０５細胞／ウェル、Ｃ４＝７．５×１０５細胞／ウェル及びＣ５＝１０６細胞／ウェル）で試験した。活性（％）は、参照抗Ｄ（バッチＣ０２９−０２５）との比較により測定し、参照サンプルにおける活性を便宜上１００％活性とした。３つの実験における、各濃度において得られた結果を以下の表に示す。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
５つの細胞濃度条件における３つの独立の試験において、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞における、サンプルＲ２９７ Ｎｏ．０５−０８１の活性（％）を試験した。この試験では、変動係数（ＣＶ）の解析により、試験した細胞の濃度に関係なく、３つの試験において、サンプルＮｏ．０５−０８１による同等の活性が得られたことを示す。
【０１２４】
５． 試験の再現性
試験において細胞を用いる場合、株化細胞の場合でさえも、生物学的変動性の問題が存在する。すなわち、試験を標準化する目的においては、試験の再現性を担保する必要がある。抗体の活性に対する精製方法の影響を試験する場合、更に、安定性試験が治療用製剤を用いて何度も実施される場合には、この点は更に重要である。
【０１２５】
サンプル（バッチＣ０２９−０２５）の活性に関して、複数回にわたり試験した。その活性（％）は同じサンプルに対応する参照との比較において算出し、その活性は、便宜上参照の場合を１００％とした。
【０１２６】
【表７】
【０１２７】
【表８】
【０１２８】
再現性試験：ｎ回の試験における、サンプル（バッチＣ０２９−０２５）の活性（％）の測定
生物学的試験の場合、１５〜２０％の最大変動係数であれば、試験が有効であるとされる。ゆえに本発明の試験の場合、得られたＣＶ（ＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞の場合で５％）は承認できるレベル以下である。ゆえにこの試験のルーチン使用は、サンプルの安定性をモニターする以外にも、その精製工程の間のサンプル活性レベルを確認することも可能となる。
【０１２９】
＜実施例３＞：ＣＤ１６と比較した、抗体の細胞障害性の評価
過去の研究において、免疫グロブリンの重鎖のレベルに存在する、オリゴ糖中のフコシル化レベルが、抗体のエフェクタ特性に影響を与えることが証明されている。実際、低いフコースレベルは、ＣＤ１６に結合する抗体の性能を向上させる［２６］。更にこの機構は、ＣＤ１６の多型現象からは全く独立している［２７］。本発明において、発明者らは、抗体の機能活性に対するフコースレベルの影響に関して検討を行った。ＬＦＢは、グリカン鎖に存在するそれらのフコースレベルによって特徴付けられる様々なモノクローナル抗体製剤を含有する。１００％フコシル化された抗体は免疫グロブリンに対応し、その２つのグリカン鎖は、重鎖の位置２９７において完全にフコシル化されている。様々なフコースレベル（以下）を有する異なるサンプルを、標的細胞の存在下での試験、並びに標的細胞の非存在下での試験に供した：
− 抗ＨＩＶ Ｇｐ１２０（１００％のフコース）、
− ＡＤ１（抗Ｄ）（１００％のフコース）、
− Ｔ１２５ ＣＨＯ（ＣＨＯ細胞で産生される抗Ｄ）（８１％のフコース）、
− Ｒ２７０（抗Ｄ）（６４％のフコース）、
− Ｒ２９７（４０％のフコース）、
− Ｃ０２９−０２５（３３％のフコース）、
− Ｒ２９７（２５％のフコース）。
【０１３０】
図４Ａ及び４Ｂは、標的細胞の存在下での試験（４Ａ）、及び標的細胞の非存在下であるがＦ（ａｂ’）２を使用して凝集した抗体製剤を含有する試験により得られた結果を表す。サンプルの活性測定に使用する試験に関わりなく、フコースレベルが増加すると、ＣＤ１６と比較した抗体の機能活性の減少が顕著となった。１００％のフコースレベルを有する抗体（ＡＤ１など）は、この受容体と比較し、活性が全く見られなかった。この試験により、フコースレベルが、ＣＤ１６の抗体との結合に影響することが示された。重鎖の位置２９７のアスパラギンのオリゴ糖レベルにおいて完全にフコシル化された免疫グロブリンは、ＣＤ１６と抗体とのいかなる相互作用も防止し、それによりその活性化をもたらさない。
【０１３１】
＜実施例４＞：モノクローナル抗体の安定性のモニタリング試験
この試験の他の応用は、変性条件下に配置した治療用製剤の安定性の迅速なモニタリングである（図５参照）。このモニタリングは、毎月、数カ月にわたってサンプルの活性を測定することによって行われる。この試験を、４０℃に配置したサンプルＮｏ．０５−０８１に関して実施した。その活性は、標的細胞を有する試験、及び標的細胞のない試験（ジェネリック試験と呼ばれる）において、異なる期間（Ｔ０、Ｔ＋１月及びＴ＋２月）において試験した。参照抗体（標的細胞を有する試験では試験バッチＲ２９７、及びジェネリック試験では試験バッチＣ０２９−０２５）による測定結果を１００％活性とした。
【０１３２】
この試験により、高温に曝露されたサンプルの活性損失を検出することが可能となる。この損失は、サンプルの加温暴露時間に比例していた。この試験ではまた、同様の結果が両方の試験において得られたことを示す。したがって、これらの２つの試験は、治療用製剤の時間経過に伴う安定性のモニタリングに使用できる。
【０１３３】
＜実施例５＞：熱、又は、（Ｆａｂ）２ＩｇＧ断片と反応するＦ（ａｂ）’２断片により凝集する抗体による、ＩＬ−２の特異的産生の比較
熱（６３℃で２０分）、又は（Ｆａｂ）２ＩｇＧ断片と結合するＦ（ａｂ）’２断片によって凝集させた抗−Ｄモノクローナル抗体製剤を用いた、ＣＤ１６を発現するように遺伝子組み換えされたＪｕｒｋａｔ細胞株によるＩＬ−２産生に対する用量効果を試験した。
【０１３４】
塊状のモノクローナル抗体を、上澄にＩＬ−２を添加する前に、３７℃で１６時間、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞とインキュベートした。結果を以下の表１に示す。
【０１３５】
【表９】
表１
【０１３６】
モノクローナル抗体の凝集に使用する方法に関係なく、表１は、細胞により上澄中に分泌されたＩＬ−２の量と、試験系に存在する凝集モノクローナル抗体の濃度との間に、添加量／効果の関係が存在することを示す。
【０１３７】
しかしながら、熱により凝集したモノクローナル抗体により分泌されたＩＬ−２の量は、ＩｇＧ 抗−Ｆ（ａｂ）’２抗体により凝集されたものよりも低かった。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】（Ａ）５つのビーズ集団の平均蛍光強度の測定により定義される校正曲線。（Ｂ）抗ＣＤ１６標識のＦＡＣＳ解析によって得られた、ＪＣＤ１６＋Ｖａｌ集団のＣＤ１６発現プロファイル。
【図２】塊状の抗Ｄ抗体（バッチＣ０２９−０２５）の用量応答曲線。曲線はＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞に特異的である。赤い垂直線は、試験で使用した残りの濃度範囲（０．６２５〜１０μｇ／ｍｌ）を示す。
【図３】ＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞における、ＩＬ−２分泌動態を示す図。
【図４Ａ】抗体活性の、フコース濃度による影響を示す。標的細胞の存在下における、抗Ｇｐ１２０抗体ＶＩＨ（１００％のフコース）、ＡＤ１（１００％のフコース）、Ｔ１２５ ＣＨＯ（８１％のフコース）、Ｒ２７０（６４％のフコース）、Ｒ２９７（４０％のフコース）及びＲ２９７（２５％のフコース）の活性試験。
【図４Ｂ】標的細胞の非存在下における、抗Ｇｐ１２０抗体ＶＩＨ（１００％のフコース）、ＡＤ１（１００％のフコース）、Ｔ１２５ ＣＨＯ（８１％のフコース）、Ｒ２７０（６４％のフコース）、Ｒ２９７（４０％のフコース）及びＲ２９７（２５％のフコース）の活性試験。
【図５】４０℃における、バッチ０５−０８１の活性の、毎月の測定によるその安定性のモニタリング結果。
【図６】１０及び５μｇ／ｍｌのＣＤ１６を活性化させる能力に対する、抗Ｄモノクローナル抗体活性の温度による影響を示す（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【図７】１０及び５μｇ／ｍｌのＣＤ１６を活性化させる能力に対する、抗Ｄモノクローナル抗体活性の温度による影響を示す（定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体製剤のＦｃ受容体活性化能の測定方法の提供に関し、当該方法は以下のステップを含んでなる：
ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、
ｂ）Ｆｃ受容体を発現している細胞を、前記凝集抗体と接触させるステップと、
ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答を測定するステップ。
【背景技術】
【０００２】
調査研究への抗体の使用が盛んに行われるうちに、抗体は更に診断及び治療用ツールの１つとしても用いられるようになり、従来の治療方法に対する代替的方法を提供するに至った。
【０００３】
治療に用いられている多くの抗体製剤（血清若しくは生物工学的手法に由来する）が、現在市販されているか、又は臨床試験段階にある。それらの特性を改良することにより、特異的にそれらの標的と結合し、免疫細胞を効果的に補充できる治療用ツールが得られる。
【０００４】
ここ数年来の開発の方向は、抗体の効果の改良、特にそれらのＦｃ定常領域の操作が中心となっている。抗体の「エフェクター」特性の原因となるのは後者であるが、その理由は、それがエフェクター免疫細胞及び補体分子の動員を促進するからである。この活性は、特定の免疫細胞上の糖蛋白質、Ｆｃ受容体（又はＦｃＲｓ）の存在によって可能となる。これらの受容体は抗体の定常領域と結合でき、その結合後、抗体の可変領域を介して標的抗原と結合する。これらの細胞との接触後、当該抗体は、異なる細胞内機構（例えばファゴサイトーシス及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）を活性化させる。
【０００５】
これは、Ｆｃ受容体への抗体のＦｃ領域の結合に起因するそれらの「有効性」（すなわち免疫細胞機構を活性化させる能力）に基づいて抗体を識別する方法に対する問題を提起するものである。
【０００６】
特許文献１では、抗体の機能活性を測定する方法が開示されている。この方法は、ＣＤ１６受容体を発現する細胞を、抗体及び前記抗体の抗原の存在下で、反応培地と接触させるステップと、ＣＤ１６受容体を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量を測定するステップを含んでなり、この測定により、抗体による免疫系のエフェクター細胞の活性化能が示される。
【０００７】
すなわち、この方法により、抗原抗体複合体を用いたエフェクター細胞の活性化の評価が可能となる。しかしながら、この方法では、エフェクター細胞の活性化は、抗体とその標的とのアフィニティ、及びＦｃ受容体と結合するＦｃ領域の性能の両方に依存することとなる。したがって、この試験では、抗体のＦｃ領域単独によるエフェクター細胞の活性化の評価を行うことができない。
【０００８】
この課題を解決するために、特許文献２では、抗体のＦａｂ領域の結合能に影響されることなく、抗体のＦｃ領域の機能性を測定することを可能にする方法を開示している。この方法は、試験する抗体を固定化するステップと、それをＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞中と抗体のＦｃ領域を反応させるステップと、エフェクター細胞の活性化に起因するエフェクター細胞の応答を測定するステップを含んでなる。この方法では、抗体はプレート又はビーズ上へのコーティングによって固定化される。
【０００９】
このように固定化される抗体数は制御できないが、それはプレートへの抗体の正しい結合の如何、プレート又はビーズ上におけるそれらの向き、及び抗体の電荷に依存するからである。実際、抗体の電荷はそれらのアミノ化レベルに依存し、それにより、ビーズ又はプレートに固定化されるそれらの能力に影響が及ぶ。すなわち、この変動要因の存在により、試験成績が抗体の関数として随時変化し、そのため異なる配列及び／又は特異性を有する２つの抗体のＦｃ領域の機能性を比較することが困難となる。更に、当該試験はヒトの単核球細胞株（ＴＨＰ−１）を使用して実施されるが、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体が一貫して細胞表面で発現されるためには、インターフェロンγによる活性化を行う必要がある。この事前の活性化により試験成績が大きく変動し、したがって実験結果を比較することが困難となる。
【特許文献１】仏国特許第０２１１４１６号公報
【特許文献２】欧州特許第１２９８２１９号公報
【非特許文献１】Ｖａｎ Ｍｉｒｒｅら、（２００４）．Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ＩｇＧ ｉｎ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｉｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ＦｃｇＲＩＩ ａｎｄ ＦｃｇＲＩＩＩｂ．Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；３３２：３３９
【非特許文献２】Ｆａｒａｇ Ｓ．Ｓ．，Ｆｌｉｎｎ Ｉ．Ｗ．，Ｍｏｄａｌｉ Ｒ．，Ｌｅｈｍａｎ Ｔ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ Ｄ．，ａｎｄ Ｂｙｒｄ Ｊ．Ｃ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０３，ｎ［．］４，１４７２−１４７４．
【非特許文献３】Ｗｕ Ｊ．，Ｅｄｂｅｒｇ Ｊ．Ｃ，Ｒｅｄｅｃｈａ Ｐ．Ｂ．，Ｂａｎｓａｌ Ｖ．，Ｇｕｙｒｅ Ｐ．Ｍ．，Ｃｏｌｅｍａｎ Ｋ．，Ｓａｌｍｏｎ Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ｒ．Ｐ．１９９７，Ｊ．） Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１００，ｎ［．］５，１０５９−１０７０．
【非特許文献４】Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．，Ｌａｉ Ｊ．，Ｋｅｃｋ Ｒ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｌ：Ｙ．，Ｈｏｎｇ Ｋ．，Ｍｅｎｇ Ｙ．Ｇ．，Ｗｅｉｋｅｒｔ Ｓ．Ｈ．Ａ．，ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７７，ｎ［．］３０，２６７３３−２６７４０．
【非特許文献５】Ｎｉｗａ Ｒ．，Ｈａｔａｎａｋａ Ｓ．，Ｓｈｏｊｉ−Ｈｏｓａｋａ Ｅ．，Ｓａｋｕｒａｄａ Ｍ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｙ．，−Ｕｅｈａｒａ Ａ．，Ｙｏｋｏｉ Ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ．，ａｎｄ Ｓｈｉｔａｒａ Ｋ．（２００４），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６２４８−６２５５．
【非特許文献６】Ｗｅｉｓｓ Ａ．，Ｗｉｓｋｏｃｉｌ Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ Ｓｔｏｂｏ Ｊ．Ｄ．１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１３３，ｎ［．］ｌ，１２３−１２８．
【非特許文献７】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｕ．，Ｓｃｈｗｅｎｋ Ｈ．Ｕ．，ａｎｄ Ｂｏｒｎｋａｍｍ Ｇ．（１９７７） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，ｖｏｌ．１９，ｎ［．］５，６２１−６２６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上をまとめると、「有効性」に基づいて抗体を識別する現行の方法では、抗体のＦｃ領域によるエフェクター細胞の活性化の評価を十分行うことができないか、あるいは再現性に乏しく、その結果標準化するのも困難となる。以上を踏まえ、新規な方法を開発すべく発明者らが鋭意研究を行った結果、再現性を有し、かかる評価の妨げとなりうる抗体のＦａｂ領域による影響を受けることなく、抗体Ｆｃ領域によるＦｃ受容体の活性化能を特異的に評価することを可能にする、抗体製剤のＦｃ受容体活性化能の測定方法を開発するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、第１の本発明の目的は、抗体製剤によるＦｃ受容体の活性化性能を測定する方法の提供に関し、当該方法は以下の工程を含んでなる。
ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、
ｂ）Ｆｃ受容体を発現している細胞を、前記凝集抗体と接触させるステップと、
ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答を測定するステップ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の用語「前記抗体を相互に凝集させる」とは、溶液中に分散している抗体を相互に結合させ、当該抗体間の強い結合に基づくネットワークを形成することを意味する。
【００１３】
抗体のこの凝集により、抗体が一定の方向を向くように制御され、それにより、全ての若しくは大多数の抗体のＦｃ領域が、Ｆｃ受容体を発現するエフェクター細胞のＦｃ受容体の方向に向かって好適な位置関係をとる。実際、発明者らは驚くべきことに、かかる凝集の効果として、特定の抗体のＦｃ領域が、試験しようとする抗体の特異性又は一次構造に関係なく、特定の形式において、適切な位置関係をとるという事実が挙げられるという点を見出した。
【００１４】
本発明に係る評価方法の利点としては、当該方法で利用される抗体の量とエフェクター細胞の活性化との間で用量依存的な相関が見られることと、再現性を有することが挙げられる。
【００１５】
更に発明者らは驚くべきことに、かかる方法では、標的抗原が存在せずとも、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞の活性化が可能となる点を見出した。実際、Ｆｃ受容体はｉｎ ｖｉｖｏで、抗体の定常領域がその可変領域を介して標的抗原に結合した後、抗体の定常領域と結合することができる。上記方法では抗原標的を細胞表面に発現する細胞の使用が不要となるが、それにより生物学的試験の変動性の原因がなくなり、それにより当該方法において生じうる変動性パラメータが減少するという顕著な効果を得ることができる。
【００１６】
すなわち、従来技術の方法において見られる、標的細胞の存在による生物学的可変性、並びに抗体の特異性及び一次構造の影響は、本発明の方法では非常に限られるか、あるいはゼロである。
【００１７】
本発明を実施するために、抗体の凝集に通常用いられている、限定されないが例えば熱的又は免疫学的方法（例えば全免疫グロブリンＧ）などの、当業者に公知のあらゆる手段を用いて抗体を凝集させてもよい。更に、本発明による方法には、溶液状の抗体により実施できるという効果がある。
【００１８】
本発明の用語「Ｆｃ受容体」とは、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）及びＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）などの、エフェクター細胞上に存在する、抗体のＦｃ領域と結合するあらゆる受容体のことを意味する。
【００１９】
本発明の用語「抗体」とは、その特異性及びアイソタイプを問わない、あらゆる抗体のことを意味するが、但し、Ｆｃ領域又はＦｃ領域と同じ機能を有する部位を含んでなる。それはすなわち、全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦｃ抗体フラグメント）であってもよい。更に、本発明の方法で利用される抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ、又はこれらの混合物であってもよい。更に、本発明の方法で利用される抗体はモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体であってもよく、それらがモノクローナル抗体である場合、これらの抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又は動物由来の抗体であってもよい。本発明の用語「Ｆｃ受容体を発現する細胞」とは、細胞表面にＦｃ受容体を発現するあらゆる細胞（その受容体を天然において発現するか、又は遺伝子組み換えにより発現できる細胞）のことを意味する。例えばＮＫ細胞、活性単核細胞、末梢血顆粒球、マクロファージ、好中球、ＣＤ８リンパ球、Ｔγδリンパ球、ＮＫＴ細胞、好酸球、好塩基球又は肥満細胞などが例示されるが、これらに限定されない。好適なことに、抗体のＦｃ領域がそれらの表面で発現するＦｃ受容体と結合するとき、これらの細胞はある種の応答を示す。
【００２０】
本発明の用語「Ｆｃ受容体を発現する細胞による応答」とは、これらの細胞のＦｃ受容体と抗体のＦｃ領域との間の相互作用に起因する、あらゆる測定可能な応答のことを意味する。この応答は細胞内での応答であってもよく、細胞外での応答であってもよい。その例としては、１つ以上のサイトカイン、細胞内カルシウム、パーフォリン、グランザイム又は一酸化窒素のレベルの測定が挙げられるが、これらのリストに限定されない。
【００２１】
好適には、当該凝集はＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片を使用して実施する。この手段により、抗体のＦｃ領域の方向が制御されるという意味で、特に好適な凝集が可能となる。実際、各Ｆ（ａｂ’） ２フラグメントは試験対象となる２つの異なる抗体と結合するが、それにより、試験対象の抗体のＦｃ領域が好適な態様の位置関係をとる。この方向性は、特にエフェクター細胞とＦｃ受容体との相互作用にとり好適であり、それにより、エフェクター細胞の活性化にとり好適である。
【００２２】
本実施形態において使用できるＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片は、抗体のいかなる断片、部分若しくはドメインであってもよく、例えばＦｃ領域、Ｆａｂ領域又は全ＩｇＧ分子であってもよい。Ｆ（Ａｂ’）２断片はモノクローナル性であってもよく、又はポリクローナル性であってもよい。
【００２３】
本発明の本実施形態では、試験される抗体及びＦ（ａｂ’）２の濃度は、正確に制御することができる。それにより、上記の２つの相関を算出することが可能となり、更に、試験される抗体製剤の如何に関係なく再現性を伴う形で試験を実施することが可能となる。
【００２４】
特に好適には、このＦ（ａｂ’）２抗−ＩｇＧ断片は、試験対象の抗体製剤に対する反応性を有する、抗−Ｆａｂ又は抗−Ｆ（ａｂ’）２断片である。こと断片はヤギ又はウサギ由来の断片であってもよい。
【００２５】
具体的実施形態では、各Ｆ（ａｂ’） ２フラグメントは、試験される２つの抗体分子のＦａｂの一部と結合し、それにより試験される抗体のＦｃ領域が適切な位置関係をとり、その結果、それらがＦｃＲと結合し、細胞表面でこれらのＦｃＲｓを発現する細胞が活性化される。
【００２６】
他の実施形態では、当該凝集は熱による凝集である。抗体は最初に加熱され、それによりそれらが相互に凝集し（本発明の方法のステップ（ａ））、次にＦｃ受容体を発現する細胞と接触する形で配置される（ステップ（ｂ））。抗体の相互凝集に適するいかなる加熱方法も、本発明の実施態様において使用することができる。例えば、６０℃で３０分間の抗体を加熱してもよい（非特許文献１参照）。
【００２７】
本発明の他の実施形態では、当該凝集は、Ｆａｂ領域相互の架橋、又は重鎖と軽鎖との架橋により実施される。本発明の用語「架橋」とは、２つの抗体分子間のあらゆる架橋（ブリッジング）のことを意味し、例えば、これらの抗体のＦｃ領域が一定に、エフェクター細胞のＣＤ１６受容体の方向を向いている態様が好ましい。好適には、抗体は１つ以上の架橋を有する。それにより抗体はネットワークを形成でき、またその配向性は、エフェクター細胞により担持されるＣＤ１６受容体との最適な結合を形成するのに適している。好適なことに、抗体相互の架橋（すなわちブリッジング）を可能にするいかなる手段も、本発明の実施態様に用いることができる。例えば、化学結合又は紫外線によって架橋がなされてもよいが、このリストに限定されるものではない。好適には、エフェクター細胞により発現するＦｃ受容体は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ）及びＣＤ６４である。特に好適にはＣＤ１６が選択される。
【００２８】
好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体を発現する細胞は、前記受容体をコードする遺伝子を導入された細胞である。本実施形態では、エフェクター細胞により提示される受容体のアロタイプを制御することが可能である。実際、所望の試験を行うという観点から、１つの受容体のみを有する細胞を特性の観点から選択して本発明の方法を実施してもよく、あるいはこれらの受容体の組合せを用いて実施してもよい。例えば、ＣＤ１６をコードする遺伝子を細胞に導入し、ＣＤ１６のみを発現するエフェクター細胞を使用する手段を選択して、本発明を実施してもよい。すなわち、他の可変因子（すなわちエフェクター細胞の表面に存在する１つ以上のＦｃ受容体の性質及び量）を排除することが可能となる。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体を発現する細胞は、ＣＤ１６を発現するＪｕｒｋａｔ細胞であり、この株は、これらの細胞の非特異的な活性化物質（例えばＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート １３−アセテート））の存在下で培養される。この株化細胞を用いた本発明の方法の実施態様の、特に有利な態様の１つは、この株が、凝集抗体と接触するエフェクター細胞を配置する前の活性化ステップを必要としないという事実に基づく。実際、ある種のエフェクター細胞株では、Ｆｃ受容体の顕著な発現のためには、１つ以上のサイトカインによる活性化が必要となる（例えば欧州特許第１２９８２１９号を参照）。サイトカインを用いたこの従来の活性化はしばしばランダムな結果に至らしめ、時間のロスや実験の標準化を困難にするなどの、克服するのが困難な問題を生じさせる。更に、ＣＤ１６受容体をコードする発現ベクターを導入されたＪｕｒｋａｔ株（「Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６株」）は、不死化されることにより、培養培地中で無限に増殖させることが可能となる。
【００３０】
これらの細胞は、二重に刺激されると活性化されうるという利点を有する。本発明の方法では、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞の活性化は、ＰＭＡ（Ｔ細胞に対する非特異的な活性化物質）、及び抗体のＦｃ領域とＣＤ１６との結合によりなされる。Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化は、培養上清へのＩＬ−２の放出により示される。その結果、ＣＤ１６に対する抗体のＦｃ領域の機能性が高いほど、上澄に放出されるＩＬ−２の量はより多くなる。
【００３１】
好適には、前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞応答の測定は、ＣＤ１６受容体を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン量の測定により行われる。実際、エフェクター細胞の活性化は特に、培養上清へのＩＬ−２の放出によって示される。例えば、培地中のサイトカイン濃度は、市販のＥＬＩＳＡ（バイオアッセイ）試験により測定できる。他の方法としては、サイトカイン（例えばＩＬ−２）の合成をアッセイすることが挙げられる。すなわち、ＩＬ−２のメッセンジャーＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＴ及びノーザンブロット法でアッセイするか、又は細胞内のＩＬ−２及び培養上清中のＩＬ−２をウエスタンブロット及びサイトメトリでアッセイする手法が挙げられる（このリストに限定されない）。
【００３２】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの量の測定は、これらのサイトカインのｍＲＮＡのアッセイにより行われ、これらのｍＲＮＡの量は、対応するサイトカインの発現のレベルと相関し、それはすなわち、エフェクター細胞の活性化レベルを示す。
【００３３】
好適には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）から選択される少なくとも１つのサイトカインが定量される（このリストに限定されない）。
【００３４】
特に好適には、細胞応答の測定はインターロイキンＩＬ−２の測定により実施される。
【００３５】
分泌されたインターロイキンＩＬ−２のレベルは、ＡＤＣＣ−タイプ活性と相関している。実際、エフェクター細胞によるサイトカインの分泌と、エフェクター細胞のＣＤ１６により媒介されるＡＤＣＣ活性との間の強い相関が確認されている（仏国特許第０２１１４１６号公報）。すなわち、本発明の方法は、特に治療用の細胞毒性抗体の選抜において有利である。
【００３６】
本発明の他の一実施形態では、細胞応答の測定は、カルシウム流入、リン酸化、転写又はアポトーシス因子の測定により行われる。これらのパラメータの増加はエフェクター細胞の活性化と相関し、それはすなわち、エフェクター細胞のＦｃ受容体を活性化させる抗体の性能を示すものである。
【００３７】
好適には、当該方法は、ＣＤ１６受容体と相互作用できるモノクローナル抗体を産生する細胞の性能を評価（すなわち抗体又は抗体製剤の細胞障害性を評価）することに適している。過去の研究においては、ＣＤ１６に対する抗体のアフィニティが、Ｆｃ受容体（例えばＣＤ１６の多型［非特許文献２、３］）、更にはＦｃ領域の特性に依存することが証明されており、また、免疫グロブリンの重鎖の位置２９７のアスパラギンに存在するオリゴ糖のフコースレベルが、Ｆｃ受容体との結合において役割を果たすことが証明されている［非特許文献４、５］。
【００３８】
抗体産生株化細胞は、増殖できるいかなる株であってもよく、特にＣＨＯ、ＹＢ２／０、ＳＰ２／０、ＳＰ２／０−ＡＧ１４、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒト骨髄腫、ＰＥＲＣ６株化細胞、ＣＨＯ株（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択されるが、それらに限定されない。
【００３９】
好適には、当該方法は、１つ以上の精製工程の後に得られた抗体製剤のＦｃ領域の有効性及び完全性を評価することに適する。
【００４０】
本発明の方法の他の用途は、変性条件下に置かれたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含有する、特に治療用の製剤の、安定性のモニタリングである。
【００４１】
ゆえに本発明の方法は特に、治療用の製剤の、時間経過に伴うモニタリングに有用である。実際、本発明者らは、数カ月にわたり抗体製剤を変性条件下で保存して活性をモニターし、それが減少することを解明した。すなわち、高温（例えば４０℃）で保存した場合、治療用製剤は時間経過と共にその活性を喪失する。更に本発明の方法により、標的抗原を担持する細胞を用いた試験と異なり、抗体のどの部分が、この活性の損失に関係しているかを識別することが可能となる。変性させた場合に、ＣＤ１６に対するアフィニティを喪失するのは、抗体のＦｃ領域であることは明らかである（実施例４を参照）。
【００４２】
当該方法は更に、抗体のＦｃ領域の機能性の測定にとり好適である。本発明の用語「抗体のＦｃ領域の機能性」とは、このＦｃ領域による、Ｆｃ受容体に対する（特にＣＤ１６受容体に対する）結合を介したエフェクター細胞の活性化能のことを意味する。本発明の方法は非常に再現性が高く（参照実施例２、パラグラフ５）、抗体の配列及び／又は特異性が異なる場合においても測定効率が変わらないため、抗体製剤の機能性を分析するためのルーチン試験や、非常に高い細胞毒性を有する抗体のスクリーニングにしようすることができる。
【００４３】
好適なことに、当該方法は、遺伝子導入植物又は遺伝子導入哺乳動物によるモノクローナル抗体の産生のアッセイに適している。本発明に係る方法の実施によって得られるかかる抗体は、そのＦｃ領域がＦｃ受容体を活性化させる性能を有することを特徴とする。
【００４４】
好適なことに、当該方法は、治療用抗体の効率的な選抜に適している。例えば、当該抗体は、抗体が存在しないコントロール、又は、ネガティブコントロールとしての所定の抗体と比較して１００％超、あるいは２５０％、好適には５００％、より好適には１０００％のレベルでサイトカイン（例えばＩＬ−２）の放出が観察されるものが選択される。
【００４５】
好適なことに、当該方法は、６５％未満、好ましくは４０％未満のフコース含量の抗体組成物の選抜に適している。実際、抗体製剤の活性が、重鎖の位置２９７のグリカン単位上のフコース含量に依存していることが証明されている。
【００４６】
抗体は重鎖と軽鎖により構成され、それらはジスルフィド架橋によって結合している。各鎖は、Ｎ末端では、抗体が結合する抗原に対して特異的な可変領域（又はドメイン）により構成され、Ｃ末端では、軽鎖では単一のＣＬ領域、重鎖では幾つかの領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む定常領域により構成される。重鎖の可変ドメイン、ＣＨｌ及びＣＬ領域、並びに軽鎖が会合して抗体のＦａｂ部分を形成し、それは非常に柔軟なヒンジ領域を介してＦｃ領域と連結し、各Ｆａｂの標的抗原との結合を可能にする。Ｆｃ領域（抗体のエフェクタ特性の調節部分）は、エフェクター分子（例えばＦｃγＲ受容体、ＦｃγＲ）に対するアクセス可能性を保持している。Ｆｃ領域（２つの球状領域ＣＨ２及びＣＨ３により構成される）は、２つの鎖の各々において、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７）に結合する２アンテナタイプのＮ−グリカンの存在により、ＣＨ２領域のレベルでグリコシル化されている。
【００４７】
このタイプのＮ−グリカンは、以下の一般式で表される：
【化１】
【００４８】
すなわち、本発明による抗体組成物において、「フコース」とは、これらのＮ−オリゴ糖により担持されるフコースのことを意味する。フコース分子が存在する場合、それはＮ−オリゴ糖のＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に密接に結合し、このＧｌｃＮＡｃはそれ自体がＡｓｎ２９７に結合する。各抗体の各２つの重鎖により担持される各２つのＮ−グリカンは、フコース分子を担持してもよく、又は担持しなくともよい。すなわち、各抗体はそれぞれ０、１又は２個のフコース分子を含んでもよく、そのＮ−グリカンのいずれもフコースを担持しない場合、そのＮ−グリカンのうちの１つのみがフコース分子を担持する場合、又はそのＮ−グリカンの両方が各々フコース分子を担持する場合がありえる。すなわち、「６５％未満のフコース含量の抗体組成物」の用語は、組成物中の抗体の各糖鎖形成部位（Ａｓｎ２９７）に担持されるグリカン構造の全体の６５％未満がフコース分子である、抗体組成物のことを意味する。
【００４９】
本発明者らによって、かかる組成物が特に好適なＡＤＣＣ活性を有することが証明されている。
【００５０】
好ましくは、フコース含量が２０％〜４５％、又は２５％〜４０％である抗体の組成物が選択される。本発明の方法において、抗体組成物（製剤）中のフコースレベルが減少するとき、ＣＤ１６に関連する抗体の機能的な活性の増加がみられたことから、機能的な活性とフコースレベルとの間の定量的な関係が示されている。
【００５１】
本発明の別の目的は、以下の工程を含んでなるモノクローナル抗体組成物の調製方法に関する。
ａ）ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は１つ以上の前記抗体の発現用のベクトルを使用して遺伝子導入した動物、植物若しくはヒト由来の株化細胞から抗体を得るステップと、
ｂ）Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片によってステップａ）において得られた抗体を凝集させるステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた抗体を、−ＣＤ１６を発現する細胞を有するエフェクター細胞と、−ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を含有する反応混合液に添加するステップと、
ｄ）ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量を測定するステップと、
ｅ）抗体が存在しない場合、又はネガティブコントロールとしての所定の抗体が存在する場合と比較し、０．５、１、２、５、１０、１００又は５００倍超のサイトカイン産生量が測定される抗体組成物を選抜するステップ。
【００５２】
好適には、ＣＤ１６を発現する細胞からなるエフェクター細胞は、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６細胞である。
【００５３】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン量の測定は、これらのサイトカインのｍＲＮＡのアッセイによりなされる。これらのｍＲＮＡの量は対応するサイトカインの発現レベルと相関し、それはすなわちエフェクター細胞の活性化レベルを示す。
【００５４】
例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）から選択される少なくとも１つのサイトカインが定量される（このリストに限定されない）。
【００５５】
好適には、細胞応答の測定は、インターロイキンＩＬ−２の測定によりなされる。
【００５６】
分泌されたインターロイキン（例えばＩＬ−２）のレベルは、ＡＤＣＣ−タイプ活性と相関している。実際、エフェクター細胞によるサイトカインの分泌と、エフェクター細胞のＣＤ１６により媒介されるＡＤＣＣ活性との間に、強い相関が存在することが確認されている（仏国特許第０２１１４１６号公報）。
【００５７】
本発明の他の一実施形態では、細胞応答の測定は、カルシウム流入、リン酸化、転写制御因子又はアポトーシスの測定によりなされる。これらのパラメータの増加はエフェクター細胞の活性化と相関し、それはすなわち、抗体がエフェクター細胞のＦｃ受容体を活性化させる性能を有することを示す。
【００５８】
好適には、ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量の測定は、ＣＤ１６を発現する細胞によって産生されるＩＬ−２の量の測定によってなされる。
【００５９】
本発明の他の目的は、上記の方法のうちの１つの実施態様に必要な構成要素を含んでなる、治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットに関し、当該キットは特に以下の構成要素を含んでなる。
（ｉ）前記治療用抗体を凝集させる手段と、
（ｉｉ）Ｆｃ受容体を発現することができる細胞と、
（ｉｉｉ）前記細胞のＦｃ受容体が前記抗体のＦｃ領域によって活性化されたときの、Ｆｃ受容体を発現できる前記細胞における応答を測定するための手段と、
（ｉｖ）上記のいずれか１つの方法の実施に必要な他の構成要素。
【００６０】
治療用抗体の活性を測定するための生物学的試験キットは、
（ｉ）前記治療用抗体を凝集させる手段と、
（ｉｉ）Ｆｃ受容体を発現することができる細胞と、
（ｉｉｉ）前記細胞のＦｃ受容体が前記抗体のＦｃ領域によって活性化されたときの、Ｆｃ受容体を発現できる前記細胞における応答を測定するための手段と、
（ｉｖ）上記のいずれか１つの方法の実施に必要な他の構成要素を含んでなる。
【００６１】
本発明の好適な実施形態では、前記キットに含まれる、前記細胞の応答を測定するための手段は、前記細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインを定量化するための手段である。
【００６２】
本発明の有利な実施形態では、前記キットに含まれる、少なくとも１つのサイトカインを定量化するための前記手段は、前記サイトカインのｍＲＮＡをアッセイするための手段である。
【００６３】
本発明の他の一実施形態では、前記キットの前記細胞の応答を測定するための手段は、カルシウム流入、リン酸化、転写制御因子又はアポトーシスを測定するための手段である。
【００６４】
本発明の他の態様及び効果を以下の実施例に記載するが、それは例示を目的とするものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６５】
１． 細胞培養
１．１ 細胞株
Ｊｕｒｋａｔ細胞、クローンＥ６−１、（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）は、１９８４年にＡ．Ｗｅｉｓｓ［非特許文献６］によってＡＴＣＣに寄託された。クローンＥ６−１は野生型Ｊｕｒｋａｔ株から得た。これは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒその他によって、１９７７年、急性リンパ球性白血病に罹患する１４歳の子供の末梢血から分離された［非特許文献７］。Ｔ細胞マーカーを発現するこの株は、２つの異なる活性化シグナルにより刺激されると、インターロイキン２（ＩＬ−２）を産生することができる。しかしながら、ＩＬ−２の分泌レベルは、株及び取扱条件により変化する。ゆえに、それらが膜レベルでＦｃγＲＩＩＩａ受容体を発現するように、異なる由来のＪｕｒｋａｔクローンをトランスフェクションした。ヒトのＦｃγＲＩＩＩａ（γ鎖の膜貫通領域及び細胞内領域と、ＣＤ１６の細胞外領域が結合）及びネオマイシン選択遺伝子をコードするキメラ発現ベクターによってトランスフェクションし、細胞株を得た。位置１５８のフェニルアラニンを有するヒトＣＤ１６を発現することから、これらの細胞をＪＣＤ１６＋Ｐｈｅと称する。
【００６６】
１．２ 培養培地及びサブカルチャー用培地
ＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞を、ＩＭＤＭ培養液（Ｉｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地）（＋４ｍＭのＬ−グルタミン＋２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、γ線照射を受け、非働化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０％、及び０．５ｍｇ／ｍｌ（プロメガ）のネオマイシン類縁体（Ｇ４１８スルフェート）を含有）中で培養した。この株化細胞を、０．２×１０６細胞／ｍｌの接種で、１週当たり２つのサブカルチャーの割合で維持培養した。
【００６７】
２． フローサイトメトリ
それぞれの標識を、ＥＰＩＣＳ ＸＬ血球計測器（ベックマン・クールター社製）で分析した。
【００６８】
２．１ ＪＣＤｌ６＋Ｐｈｅ株化細胞のフェノタイプ解析
この表現型のタイピングは、ＣＤ４５（白血球細胞のマーカー）、ＣＤ１９（Ｂリンパ球の特異性のマーカー）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８（Ｔリンパ球の特異性のマーカー）、ＣＤ５８（ＣＤ２のリガンド）、更にＩＬ−２受容体の異なる鎖（ＣＤ２５又はＩＬ−２ Ｒα、ＣＤ１２２又はＩＬ−２ Ｒβ、並びにＣＤ１３２又はＩＬ−２ Ｒγ）を用いた、各種膜マーカーの解析により行った。ラベリングは、１００μｌの１×ＰＢＳ（リン酸緩衝液）中の１０６個の細胞に対して実施した。処理条件は以下のとおりである：１０μｌの抗ＣＤ２ ＦＩＴＣ（２−フルオレセインイソチオシアネート、クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ３ ＲＤ１（Ｒ−フィコエリトリン、クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤｌ９ ＥＣＤ（Ｒ−フィコエリトリン／テキサスレッドタンデムダイ、クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ１６ ＰＣ５（Ｒ−フィコエリトリン／シアニン５タンデムダイ、ＩＯＴｅｓｔ、ベックマン・クールター社製）。
【００６９】
１０μｌの抗ＣＤ４５ ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ３ ＲＤ１（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ４ ＥＣＤ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ８ ＰＣ５（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）。
【００７０】
− １０μｌの抗ＣＤ５８ ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
− ５μｌの抗ＣＤ１２２ ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌの抗ＣＤ１３２ポリエチレン（フィコエリトリン、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）＋１０μｌの抗ＣＤ２５ ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
【００７１】
これらの４つのラベリングと並列して、アイソタイプコントロールとして以下のものを調製した：
− １０μｌのＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＲＤｌ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ２ｂ−ＥＣＤ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、ベックマン・クールター社製）。
− １０μｌのＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＲＤｌ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＣＤ４ ＥＣＤ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、ベックマン・クールター社製）。
− １０μｌのＩｇＧ２ａ−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
− ５μｌのＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（クールタークローン、ベックマン・クールター社製）＋１０μｌのＩｇＧ１−ポリエチレン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）＋１０μｌのＩｇＧ２ａ−ＰＣ５（ＩＯＴｅｓｔ、クールタークローン）。
【００７２】
細胞を、室温で、暗所で３０分間、各モノクローナル抗体の存在下でインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで洗浄した後、１２００回転／分で５分間遠心沈降させ、ラベリングをサイトメトリによって直接分析した。
【００７３】
２．２ ＣＤ１６部位の数の決定
細胞表面で発現するＦｃγＲＩＩＩａ受容体の数を、ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いてアッセイした。この技術の実施においては、細胞表面で全ての抗原性部位を占めるのに必要な抗ＣＤ１６抗体（クローン３Ｇ８、フルオレセインコンジュゲート抗ＣＤ１６ ＩｇＧ１（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製））の飽和投与量を事前に定量する必要がある。細胞（生理食塩水中、０．２５×１０６／１００μｌ）を、室温で３０分間、抗ＣＤ１６ ３Ｇ８の添加量を変化させ、インキュベートした。生理食塩水で洗浄した後、１２００回転／分で５分間遠心沈降させ、更に細胞を暗所で３０分間、の１／２０ｔｈに希釈したＰＥラベル付き抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｈ＋Ｌ）（ベックマン・クールター社製）５０μｌと共にインキュベートした。インキュベート終了後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）によって直接分析した。
【００７４】
キット（Ｎｏ．Ｋ００７８）の手順に従い、ＣＤ１６部位の数を、２．５×１０５個の細胞を用いて解析した。細胞を室温で３０分間、試験対象の５００ｎｇの抗体でインキュベートした。洗浄及び遠心沈降（１２００回転／分、５分）の後、細胞を、室温で３０分間、暗所で、１／５０ｔｈに希釈したＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｑｉｆｉｋｉｔ社製）１００μｌによりインキュベートした。細胞を更に洗浄し、ＦＡＣＳによって直接分析した。
【００７５】
３． Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ−２産生試験
３．１ 特異性抗原を担持する赤血球の存在下における試験
３．１．１ 試験サンプルの調製
抗Ｄ抗体のサンプルは、以下の８ポイントの濃度スケールに従って試験した：３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、９．４ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、１８．７５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３７．５ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌ。各濃度は、ＩＭＤＭ＋５％の不働化ウシ胎児血清でサンプルを希釈することにより調整した。
【００７６】
３．１．２ 標的細胞の調製
標的細胞は、ドナー（好ましくはＯ＋）から得たＲｈｅｓｕｓ Ｄ＋赤血球である。それはパパイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で事前に処理されている。これをボリューム／ボリュームで球状のペレットに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ、Ｅｃｏｔａｉｎｅｒ、Ｂ ＢＲＡＵＮ）を過剰量添加し、反応を停止させた。細胞を０．９％のＮａＣｌ水で３回洗浄し、最初２回の洗浄液を５分、及び最後の洗浄液を１０分間、３０００回転／分で遠心分離した。赤血球ペレットを更に８×１０６細胞／ｍｌ（０．０８％）の濃度でＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清で希釈し、細胞懸濁液を得た。
【００７７】
３．１．３ ＰＭＡ溶液の調製
４０ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＭＡ溶液（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を、ＩＭＤＭ＋５％のウシ胎児血清で１／２５０ｔｈで希釈して調製した。
【００７８】
３．１．４ エフェクター細胞の調製
Ｊｕｒｋａｔ細胞（試験前４８〜７２時間においてサブカルチャー）をＭａｒａｓｓｅｚスライドで計数し、１０７細胞（１つのマイクロプレートに必要な量）となるようにサンプリングする細胞懸濁液の量を算出した。細胞懸濁液を１２００回転／分で１０分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを更に、２×１０６細胞／ｍｌの濃度となるように、ＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清中に再懸濁した。懸濁液の濃縮を検査するために再度カウントを実施し、必要に応じて、ＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清を添加して正確に調整した。
【００７９】
３．１．５ 試験の実施
９６穴のＵ型ウェルを有するプレートの各ウェルに、以下のものを添加した：５０μｌの試験対象の抗Ｄ抗体、５０μｌの赤血球懸濁液（すなわち５０μｌあたり４×１０５赤血球）、５０μｌの細胞懸濁液（すなわち５０μｌあたり１０５細胞）、５０μｌのＰＭＡ（すなわち５０μｌあたり２ｎｇ）。
【００８０】
プレートごとに、抗Ｄ対照溶液、並びに抗Ｄポリクローナル抗体（Ｒｈｏｐｈｙｌａｃ ３００ ＴＭ、Ｂｉｏｔｅｓｔ）に対応するコントロールサンプルを添加した。撹拌しながらウェルをホモジナイズした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を１２５ｇで１分間遠心沈降し、デカントした。上澄を除去し、ＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡ試験で測定した。
【００８１】
３．２ 抗原標的の非存在下における試験
試験される抗体は、３．１．１において定義した８つの濃度スケールにより試験した。この試験においては、赤血球を、特異的なＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片（１．３ｍｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で置換した。これも同様に、ＩＭＤＭ＋５％ウシ胎児血清を用いて８つの異なる濃度となるように希釈した。抗Ｄ抗体及びＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ抗体を、１／１．５の比率において試験した。ＰＭＡ溶液を１０ｎｇ／ｍｌの濃縮で調製した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＩＭＤＭ＋５％のウシ胎児血清を用いて、２．１．４において定義した濃度となるように希釈した。
【００８２】
９６穴のＵ型ウェルを有するプレートの各ウェルに、以下のものを添加した：５０μｌの試験対象の抗Ｄ抗体、５０μｌの特異的Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片、５０μｌの細胞懸濁液、５０μｌのＰＭＡ（すなわち５０μｌあたり０．５ｎｇ）。
【００８３】
撹拌しながらウェルをホモジナイズした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を１２５ｇで１分間遠心沈降し、デカントした。上澄を除去し、ＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡ試験により、又はＩＬ−２をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のアッセイにより測定した。
【００８４】
３．３ ＥＬＩＳＡ法による細胞上澄中のＩＬ−２量
３．３．１ 材料及び方法
分泌されるＩＬ−２の量を、Ｄｕｏｓｅｔ（登録商標）ヒトＩＬ−２キット（ＤＹ２０２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の操作マニュアル従ってアッセイした。マイクロプレートの各ウェルに捕捉抗体を分散させた。ウシアルブミン溶液で飽和させた後、アッセイされる上澄を、異なる希釈度（ＩＬ−２の参照スケールと同様に）でアプライした。次にビオチン化ヒト抗ＩＬ−２抗体を添加し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼＨＲＰの溶液を更に添加した。基質（テトラメチルベンジジン）の添加後、青色に発色した。硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で反応を停止させた後、各ウェルの光学濃度を、４５０ｎｍによるプレートの測定により決定した。各ウェルのＩＬ−２濃度測定は、ＩＬ−２スケールの回帰曲線（［ＩＬ−２］＝［抗体］２＋ｂ［抗体］＋ｃ）をＢｉｏｌｉｓｅソフトウェアによって決定し、各ウェルのサンプルの希釈比を考慮することにより行った。
【００８５】
３．３．２ 結果の考察
ＥＬＩＳＡ試験で測定されたＩＬ−２濃度により、試験される各抗Ｄ抗体の活性を測定することが可能となる。その測定方法は以下のとおりである
：参照抗体を用い、測定されるＩＬ−２濃度を抗体濃度範囲の関数としてプロットし、２次曲線を決定した。アプライされるサンプル濃度ごとに、等量の参照抗Ｄ濃度を、上記２次曲線を用いて算出した。等量の抗Ｄ値の各々を、試験される抗体の希釈度を考慮しながら、標的細胞を有する試験では５０ｎｇ／ｍｌ、又は標的細胞を有さない試験では１０μｇ／ｍｌの理論濃度となるようにした。次に各サンプルの平均値を算出した。サンプルの活性パーセンテージを測定する際、便宜上、参照サンプルの活性を１００％の活性とした。それにより、以下の式で簡便に算出することが可能となる：
（再計算されたサンプル濃度の平均）／（再計算された参照サンプル濃度の平均）。
【００８６】
すなわち、活性のパーセンテージが未知の抗Ｄにおいて１００未満である場合、この抗体の活性が参照抗体のそれより低いことを意味する。一方、活性のパーセンテージが１００超である場合、試験した抗Ｄが参照よりも大きい活性を有することを意味する。
【００８７】
３．４ ＩＬ−２をコードするｍＲＮＡのアッセイによる、ＩＬ−２の測定
この技術は、ＩＬ−２をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のアッセイに基づく。最初に、全ＲＮＡを細胞から抽出した。ＲＮＡを、逆転写酵素と呼ばれる酵素を使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。ＩＬ−２に対応する遺伝子配列を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって特異的プライマにより検出した。サンプルを各々比較するため、当該アッセイを標準化することが必要である。この試験は、遍在型（ユビキタス）若しくは構成的の遺伝子をコードするｍＲＮＡの同時試験により実施し、その発現量は、培養組織及び刺激作用状態に関係なく、全ての細胞において同一であった。これらの試験において選択されたユビキタス遺伝子はｂ−アクチン（細胞骨格成分の１つ）である。細胞が活性化されると、ＩＬ−２ ｃＤＮＡ／ｂ−アクチンｃＤＮＡ比率が高くなる。ＩＬ−２をコードするｍＲＮＡは一過性のものである。すなわち、実験条件下で、刺激の後の遺伝子発現が最大となる時間（４〜６時間）を測定した。
【００８８】
３．４．１ 材料及び方法１）細胞培養以下の条件下で試験を実施した：
− ２００μｌの１０７細胞／ｍｌのＪＵＲＫＡＴ ＣＤ１６＋細胞懸濁液、
− Ｆ（ａｂ’）２を有する抗Ｄモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、
− ２００μｌの１０μｇ／ｍｌの抗ＤｍＡｂ、及び２００μｌの１５μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）特異的抗フラグメント、又は、
− ２００μｌの５μｇ／ｍｌの抗ＤｍＡｂ、及び２００μｌの７．５μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）特異的抗フラグメント、
− ２００μｌの４０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ。
【００８９】
使用する全ての溶液は、ＩＭＤＭ培養液＋５％のウシ胎児血清を用いて調製した。
【００９０】
次に細胞を、制御された雰囲気（９５％の空気＋５％のＣＯ２）下で、インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。
【００９１】
２）全ＲＮＡの抽出
以下の２つの市販のキットを使用して、全ＲＮＡを抽出した。
（ＱＩＡＧＥＮ）：
−ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒキット、
−ＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔミニキット。
次に、抽出ＲＮＡを２６０ｎｍで分光光度測定した。
【００９２】
３）逆転写酵素反応
４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡを得た。
− １μｇの線形ＲＮＡ（６５℃で加熱し、即座に４℃で冷却）、
− オリゴｄＴプライマー、
− ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、
− ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、
− ＲＮＡａｓｅ阻害剤、
− 逆転写酵素。
【００９３】
４）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は、以下の特異的プライマを使用して実施した：
（ＩＬ−２用）
ＩＬ−２ Ｈ１：ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＧ
ＩＬ−２ Ｈ２：ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＴＧＡ ＣＡ
（ｂ−アクチン用）
ＢＡＣＴ Ｈ１：ＧＧＧ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧ
ＢＡＣＴ Ｈ２：ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＡＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＧ。
【００９４】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応法は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００装置、及びＰｏｗｅｒ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ マスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して実施した。２つのプライマーペアに使用したプログラムは、以下のとおりである：
− ９５℃で１０分間、脱ハイブリッドサイクル １サイクル、
− 以下を４０サイクル：
− ９５℃で１０秒間、脱ハイブリッド、
− ６０℃で１５秒間、「アニーリング」（プライマーカップリング）、
− ７２℃で６０秒間、伸長。
【００９５】
ＰＣＲ終了後、増幅産物を徐々に変性させ、増幅生成物に特異的な解離曲線及びＴｍ（融解温度（℃））を決定した。
【００９６】
３．４．２ 結果
２つの異なる濃度（５及び１０μｇ／ｍｌ）の２つの抗Ｄ ｍＡｂ調製物を比較した。調製物のうちの１つを５℃で、その他を４０℃で、３ヵ月間保存した。
【００９７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲを行う際、試験細胞の培養開始から４時間においてＲＮＡの抽出を行い、サンプルを調製した。
【００９８】
培養上清中のＩＬ−２のＥＬＩＳＡアッセイを行う際、培養開始から１６時間においてサンプルを調製した。
【００９９】
１）ＥＬＩＳＡ結果
上澄に存在するＩＬ−２濃度を、試験開始後１６時間において、試験キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して定量化した。得られた結果を図６に示す。
【０１００】
２）定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果
Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞のＩＬ−２遺伝子発現を、試験開始の４時間後において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより推定した。結果を、ｂ−アクチンユビキタス遺伝子に関して標準化した。結果を図７に示す。
【０１０１】
３．４．３ 考察
刺激されたＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞の上澄中のサイトカインＩＬ−２濃度に関する直接的な試験法方法の結果と、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、その遺伝子発現のアッセイ方法の結果との相関が見られた。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ試験に関しては、ＩＬ−２遺伝子の発現強度は、試験したｍＡｂの性質及びその濃度に依存した。したがって、この技術は、ｍＡｂのＦｃ領域とＣＤ１６受容体との間の相互作用の解析に用いることができる。
【０１０３】
＜実施例１＞１． 株化細胞の特性評価
１．１ 株の遺伝子タイピング
この試験方法の開発の前に、各細胞株の遺伝子タイピングを、Ｑ−ＰＣＲ（７３００を適用した）による対立遺伝子の識別により実施した。遺伝子タイピングはＲＴ−ＰＣＲにより試験した。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
Ｑ−ＰＣＲ（ＤＮＡ）及びＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）による細胞株の遺伝子型の解析
Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋ｌｉｎｅは、その細胞表面の膜上にＦｃγＲＩＩＩ受容体を発現しない。Ｐｈｅと称するＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞株はＴ（Ｐｈｅ）遺伝子型を示す。
【０１０６】
１．２ 細胞株のフェノタイピング
Ｆ ＡＣＳ標識による膜マーカーの解析を行い、以下の結果を得た。
【表２】
【０１０７】
トランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞株における、２つの膜マーカーを用いたサイトメトリ解析
細胞株は以下の表現型：ＣＤ４５＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ＣＤ１６＋、ＣＤ５８＋及びＣＤ１３２＋を有する。
【０１０８】
１．３ ＣＤ１６部位の数の決定
この実験の目的は、サイトメトリ分析される間接的なマーキングにより、ＣＤ１６抗原部位の数を定量化することである。当該技術は、所定量（１０３〜１０６の抗体結合能力（又はＡＢＣ））のモノクローナル抗体（マウス抗ヒトＣＤ５）をコーティングされた１０μｍ直径のビーズの５つの集合体の使用に基づく。これらの異なる集合体の使用により、抗体結合能力（ＡＢＣ）に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）に該当するキャリブレーション曲線の作成が可能となる。細胞を、標識二次抗体で示される目的の一次抗体（抗ＣＤ１６）で飽和させ、飽和条件下に置いた。これらの状態を維持し、細胞表面に存在する抗原部位の数に対応する結合した一次抗体の数を測定した。その結果、蛍光強度は、細胞と結合した一次抗体の数と相関していた。細胞のＡＢＣを、キャリブレーション曲線により測定した。
【０１０９】
下表は、試験した細胞株のＣＤ１６部位の数の測定結果（幾つかのサブカルチャーに関して実施した試験）を要約したものである。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】
ライブラリから得られるバイアルを解凍した後、各細胞株を、ＣＤ１６発現が維持されていることを確かめるために、選択培地中で、幾つかのサブカルチャーに関してモニターした。
【０１１２】
すなわち、若干の時間経過後、ＣＤ１６の発現は維持され、サブカルチャー間では、同一の培養条件下ではほとんど変化が見られなかった点に留意すべきである。更に、選抜条件及びその結果から、高い発現能力を有するクローンの選抜が可能であることが示唆された。更に、端部の集合（下の１０％及び上の１０％集団）の部位数測定の結果、この技術を用いることにより、細胞表面におけるＣＤ１６発現が外来遺伝子によるものであることが正確に分析された。
【０１１３】
＜実施例２＞：ＣＤ１６活性化試験
１． 特異性試験
特異性試験を、以下の通りに実施した：幾つかのコントロールを、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ−２分泌試験に供し、細胞活性化メカニズムを確認した。１５ｐｇ／ｍｌの検出限界は、試験キットのＩＬ−２参照スケールの最低ポイントとして定義されている。この閾値下では、細胞によるＩＬ−２の分泌は検出不可能と考えられる。下表は、ＩＬ−２レベルのｎ回の実験における平均、及びＩＬ−２産生試験に供される各コントロールにおける標準偏差を示す（＜ＬＴ：１５ｐｇ／ｍｌの検出限界以下）。
【０１１４】
【表４】
【０１１５】
細胞のみの培養上清を用いた試験により、検出不可能なそれらの基本分泌レベルの測定が可能となる。このコントロールの使用により、いかなる刺激が存在しない場合でも、細胞からのＩＬ−２分泌がなされないことが確認できる。更に、これらのコントロールの使用により、２つの刺激（ＰＭＡ及び抗−Ｄ／Ｆ（ａｂ’）２複合体）が細胞の活性化に必要であることが確認できる。実際、２つの刺激のうちの１つが存在しない（コントロールＰＭＡ＋Ｆ（ａｂ’）２又はＦ（ａｂ’）２＋抗Ｄ）とき、ＩＬ−２の分泌は極小であるか、ゼロである。同様に、ＣＤ１６の活性化は抗体の凝集が必要であるが、それは、Ｆ（ａｂ’）２の非存在の場合、ＩＬ−２の分泌が若干見られるものの、ＰＭＡ及びアンチ−Ｄ／Ｆ（ａｂ’）２凝集体の存在下での分泌よりもはるかに少ないからである。更に、各実験において、最大の活性化レベルを、ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いて測定した。ゆえにこれらの結果は、ＩＬ−２分泌を生じさせるためには、ＪＣＤ１６＋細胞を二重に刺激する必要があることを示すものである。
【０１１６】
２． 投与量効果及び抗体濃度範囲の定量
残りの実験において抗Ｄの最適濃度範囲を解析するため、用量反応試験（以下の２本の曲線により示される）を実施した。この目的のため、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲のＲ２９７抗体（バッチＣ０２９−０２５）を反応培地中で試験した。実験は、５回の反復試験により実施した（図２を参照）。
【０１１７】
低い抗Ｄ濃度の場合、刺激後２４時間における上澄中のＩＬ−２濃度曲線は、試験に供した抗Ｄの濃度に比例していた。高い抗Ｄ濃度では、曲線はプラトーに至った。
【０１１８】
３． 活性化の動態、及びインキュベーション時間の決定
最適インキュベート時間を決定するため、２つの株化細胞におけるＩＬ−２分泌の動態を解析した。この目的のため、細胞を、所定の抗Ｄ濃度範囲（０．６２５〜１０μｇ／ｍｌ、バッチＣ０２９−０２５）において、８、２４、３２、４８、５６又は７２時間刺激した。上澄中のＩＬ−２濃度を、抗Ｄ濃度、及びインキュベート時間ごとにアッセイし、図３の直線を得た。
【０１１９】
この試験結果から、刺激後８時間では、細胞がごくわずかなＩＬ−２しか分泌しないことが示された。またＩＬ−２レベルは２４時間後において最大値に至った。刺激後２４時間で、曲線は更に上昇する傾向さえ示した。試験時間を制限するため、インキュベートの最適時間を２４時間と設定した。
【０１２０】
４． 試験における細胞濃度の効果
生物学的試験において、細胞濃度を標準化することは比較的困難である。この研究の目的は、所定のサンプルの活性（％）が細胞濃縮に依存するか否かを確認することである。このため、３つの独立の試験を、抗Ｄモノクローナル抗体のサンプル（バッチＲ２９７ Ｎｏ．０５−０８１、Ｔ０）を、５つの異なる細胞濃度（Ｃ１＝１０５細胞／ウェル、Ｃ２＝２．５×１０５細胞／ウェル、Ｃ３＝５×１０５細胞／ウェル、Ｃ４＝７．５×１０５細胞／ウェル及びＣ５＝１０６細胞／ウェル）で試験した。活性（％）は、参照抗Ｄ（バッチＣ０２９−０２５）との比較により測定し、参照サンプルにおける活性を便宜上１００％活性とした。３つの実験における、各濃度において得られた結果を以下の表に示す。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
５つの細胞濃度条件における３つの独立の試験において、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞における、サンプルＲ２９７ Ｎｏ．０５−０８１の活性（％）を試験した。この試験では、変動係数（ＣＶ）の解析により、試験した細胞の濃度に関係なく、３つの試験において、サンプルＮｏ．０５−０８１による同等の活性が得られたことを示す。
【０１２４】
５． 試験の再現性
試験において細胞を用いる場合、株化細胞の場合でさえも、生物学的変動性の問題が存在する。すなわち、試験を標準化する目的においては、試験の再現性を担保する必要がある。抗体の活性に対する精製方法の影響を試験する場合、更に、安定性試験が治療用製剤を用いて何度も実施される場合には、この点は更に重要である。
【０１２５】
サンプル（バッチＣ０２９−０２５）の活性に関して、複数回にわたり試験した。その活性（％）は同じサンプルに対応する参照との比較において算出し、その活性は、便宜上参照の場合を１００％とした。
【０１２６】
【表７】
【０１２７】
【表８】
【０１２８】
再現性試験：ｎ回の試験における、サンプル（バッチＣ０２９−０２５）の活性（％）の測定
生物学的試験の場合、１５〜２０％の最大変動係数であれば、試験が有効であるとされる。ゆえに本発明の試験の場合、得られたＣＶ（ＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞の場合で５％）は承認できるレベル以下である。ゆえにこの試験のルーチン使用は、サンプルの安定性をモニターする以外にも、その精製工程の間のサンプル活性レベルを確認することも可能となる。
【０１２９】
＜実施例３＞：ＣＤ１６と比較した、抗体の細胞障害性の評価
過去の研究において、免疫グロブリンの重鎖のレベルに存在する、オリゴ糖中のフコシル化レベルが、抗体のエフェクタ特性に影響を与えることが証明されている。実際、低いフコースレベルは、ＣＤ１６に結合する抗体の性能を向上させる［２６］。更にこの機構は、ＣＤ１６の多型現象からは全く独立している［２７］。本発明において、発明者らは、抗体の機能活性に対するフコースレベルの影響に関して検討を行った。ＬＦＢは、グリカン鎖に存在するそれらのフコースレベルによって特徴付けられる様々なモノクローナル抗体製剤を含有する。１００％フコシル化された抗体は免疫グロブリンに対応し、その２つのグリカン鎖は、重鎖の位置２９７において完全にフコシル化されている。様々なフコースレベル（以下）を有する異なるサンプルを、標的細胞の存在下での試験、並びに標的細胞の非存在下での試験に供した：
− 抗ＨＩＶ Ｇｐ１２０（１００％のフコース）、
− ＡＤ１（抗Ｄ）（１００％のフコース）、
− Ｔ１２５ ＣＨＯ（ＣＨＯ細胞で産生される抗Ｄ）（８１％のフコース）、
− Ｒ２７０（抗Ｄ）（６４％のフコース）、
− Ｒ２９７（４０％のフコース）、
− Ｃ０２９−０２５（３３％のフコース）、
− Ｒ２９７（２５％のフコース）。
【０１３０】
図４Ａ及び４Ｂは、標的細胞の存在下での試験（４Ａ）、及び標的細胞の非存在下であるがＦ（ａｂ’）２を使用して凝集した抗体製剤を含有する試験により得られた結果を表す。サンプルの活性測定に使用する試験に関わりなく、フコースレベルが増加すると、ＣＤ１６と比較した抗体の機能活性の減少が顕著となった。１００％のフコースレベルを有する抗体（ＡＤ１など）は、この受容体と比較し、活性が全く見られなかった。この試験により、フコースレベルが、ＣＤ１６の抗体との結合に影響することが示された。重鎖の位置２９７のアスパラギンのオリゴ糖レベルにおいて完全にフコシル化された免疫グロブリンは、ＣＤ１６と抗体とのいかなる相互作用も防止し、それによりその活性化をもたらさない。
【０１３１】
＜実施例４＞：モノクローナル抗体の安定性のモニタリング試験
この試験の他の応用は、変性条件下に配置した治療用製剤の安定性の迅速なモニタリングである（図５参照）。このモニタリングは、毎月、数カ月にわたってサンプルの活性を測定することによって行われる。この試験を、４０℃に配置したサンプルＮｏ．０５−０８１に関して実施した。その活性は、標的細胞を有する試験、及び標的細胞のない試験（ジェネリック試験と呼ばれる）において、異なる期間（Ｔ０、Ｔ＋１月及びＴ＋２月）において試験した。参照抗体（標的細胞を有する試験では試験バッチＲ２９７、及びジェネリック試験では試験バッチＣ０２９−０２５）による測定結果を１００％活性とした。
【０１３２】
この試験により、高温に曝露されたサンプルの活性損失を検出することが可能となる。この損失は、サンプルの加温暴露時間に比例していた。この試験ではまた、同様の結果が両方の試験において得られたことを示す。したがって、これらの２つの試験は、治療用製剤の時間経過に伴う安定性のモニタリングに使用できる。
【０１３３】
＜実施例５＞：熱、又は、（Ｆａｂ）２ＩｇＧ断片と反応するＦ（ａｂ）’２断片により凝集する抗体による、ＩＬ−２の特異的産生の比較
熱（６３℃で２０分）、又は（Ｆａｂ）２ＩｇＧ断片と結合するＦ（ａｂ）’２断片によって凝集させた抗−Ｄモノクローナル抗体製剤を用いた、ＣＤ１６を発現するように遺伝子組み換えされたＪｕｒｋａｔ細胞株によるＩＬ−２産生に対する用量効果を試験した。
【０１３４】
塊状のモノクローナル抗体を、上澄にＩＬ−２を添加する前に、３７℃で１６時間、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞とインキュベートした。結果を以下の表１に示す。
【０１３５】
【表９】
表１
【０１３６】
モノクローナル抗体の凝集に使用する方法に関係なく、表１は、細胞により上澄中に分泌されたＩＬ−２の量と、試験系に存在する凝集モノクローナル抗体の濃度との間に、添加量／効果の関係が存在することを示す。
【０１３７】
しかしながら、熱により凝集したモノクローナル抗体により分泌されたＩＬ−２の量は、ＩｇＧ 抗−Ｆ（ａｂ）’２抗体により凝集されたものよりも低かった。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】（Ａ）５つのビーズ集団の平均蛍光強度の測定により定義される校正曲線。（Ｂ）抗ＣＤ１６標識のＦＡＣＳ解析によって得られた、ＪＣＤ１６＋Ｖａｌ集団のＣＤ１６発現プロファイル。
【図２】塊状の抗Ｄ抗体（バッチＣ０２９−０２５）の用量応答曲線。曲線はＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞に特異的である。赤い垂直線は、試験で使用した残りの濃度範囲（０．６２５〜１０μｇ／ｍｌ）を示す。
【図３】ＪＣＤ１６＋Ｐｈｅ細胞における、ＩＬ−２分泌動態を示す図。
【図４Ａ】抗体活性の、フコース濃度による影響を示す。標的細胞の存在下における、抗Ｇｐ１２０抗体ＶＩＨ（１００％のフコース）、ＡＤ１（１００％のフコース）、Ｔ１２５ ＣＨＯ（８１％のフコース）、Ｒ２７０（６４％のフコース）、Ｒ２９７（４０％のフコース）及びＲ２９７（２５％のフコース）の活性試験。
【図４Ｂ】標的細胞の非存在下における、抗Ｇｐ１２０抗体ＶＩＨ（１００％のフコース）、ＡＤ１（１００％のフコース）、Ｔ１２５ ＣＨＯ（８１％のフコース）、Ｒ２７０（６４％のフコース）、Ｒ２９７（４０％のフコース）及びＲ２９７（２５％のフコース）の活性試験。
【図５】４０℃における、バッチ０５−０８１の活性の、毎月の測定によるその安定性のモニタリング結果。
【図６】１０及び５μｇ／ｍｌのＣＤ１６を活性化させる能力に対する、抗Ｄモノクローナル抗体活性の温度による影響を示す（ＥＬＩＳＡにより測定）。
【図７】１０及び５μｇ／ｍｌのＣＤ１６を活性化させる能力に対する、抗Ｄモノクローナル抗体活性の温度による影響を示す（定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体製剤の、Ｆｃ受容体を活性化させる性能を測定する方法であって、
ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、
ｂ）Ｆｃ受容体を発現する細胞を前記凝集抗体と接触させるステップと、
ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する前記細胞の応答を測定するステップを含んでなる方法。
【請求項２】
前記凝集が、抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いて実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが、試験される抗体製剤を認識する抗Ｆａｂ又は抗Ｆ（ａｂ’）２である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記凝集が、熱による凝集である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記凝集が、前記Ｆａｂ領域相互間、又は重鎖及び軽鎖相互間における架橋により実施される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ）、及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）から選択される、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記Ｆｃ受容体を発現する前記細胞が、前記受容体をコードする遺伝子を導入された細胞である、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記Ｆｃ受容体を発現する前記細胞が、ＣＤ１６を発現するＪｕｒｋａｔ細胞であり、この細胞株が、これらの細胞の非特異的活性化剤（例えばＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート １３−アセテート））の存在下で培養される、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記抗体のＦｃ領域による前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答の測定が、前記Ｆｃ受容体を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン量の測定により実施される、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのサイトカインの測定が、前記サイトカインのｍＲＮＡのアッセイにより実施される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）から選択される少なくとも１つのサイトカインが測定される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
インターロイキンＩＬ−２が測定される、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
分泌されるインターロイキンＩＬ−２のレベルが、ＡＤＣＣ−タイプの活性と相関する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞応答の測定が、カルシウム流入、リン酸エステル化、転写制御因子又はアポトーシスの測定である、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
細胞の、ＣＤ１６受容体と相互作用できるモノクローナル抗体を産生する能力を評価するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体産生細胞が、ＣＨＯ、ＹＢ２／０、ＳＰ２／０、ＳＰ２／０−ＡＧ１４、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒトの骨髄腫、ＰＥＲＣ６細胞、ＣＨＯ細胞（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の精製工程後における、抗体のＦｃ領域の有効性及び完全性を評価するための、又は、変性条件下における治療用製剤の安定性をモニターするための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
抗体のＦｃ領域の機能を測定するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子導入植物又は遺伝子導入哺乳類によるモノクローナル抗体の産生能を評価するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
効果的な治療用抗体を選抜するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
フコース含量が６５％未満、好ましくは４０％未満である抗体組成物を選抜するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）受容体を活性化できるモノクローナル抗体組成物の調製方法であって、
ａ）ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は１つ以上の前記抗体の発現用のベクトルを使用して遺伝子導入した動物、植物若しくはヒト由来の株化細胞から抗体を得るステップと、
ｂ）Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片によってステップａ）において得られた抗体を凝集させるステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた抗体を、
ａ．ＣＤ１６を発現する細胞を有するエフェクター細胞と、
ｂ．ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を含有する反応混合液に添加するステップと、
ｄ）ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量を測定するステップと、
ｅ）抗体が存在しない場合、又はネガティブコントロールとしての所定の抗体が存在する場合と比較し、０．５、１、２、５、１０、１００又は５００倍超のサイトカイン産生量が測定される抗体組成物を選抜するステップを含んでなる方法。
【請求項２３】
ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン量の測定が、ＣＤ１６を発現する細胞によって産生されるＩＬ−２量の測定である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、
（ｉ）前記治療用抗体を凝集させる手段と、
（ｉｉ）Ｆｃ受容体を発現することができる細胞と、
（ｉｉｉ）前記細胞のＦｃ受容体が前記抗体のＦｃ領域によって活性化されたときの、Ｆｃ受容体を発現できる前記細胞における応答を測定するための手段と、
（ｉｖ）上記のいずれか１つの方法の実施に必要な他の構成要素を含んでなるキット。
【請求項２５】
請求項２４記載の治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、前記細胞の応答を測定するための手段が、前記細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインを定量化するための手段である、前記キット。
【請求項２６】
請求項２５記載の治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、前記少なくとも１つのサイトカインを定量化するための手段が、前記サイトカインのｍＲＮＡをアッセイする手段である、前記キット。
【請求項２７】
請求項２４記載の治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、前記細胞の応答を測定するための手段が、カルシウム流入、リン酸化、転写制御因子又はアポトーシスを測定するための手段である、前記キット。
【請求項１】
抗体製剤の、Ｆｃ受容体を活性化させる性能を測定する方法であって、
ａ）前記抗体を相互に凝集させるステップと、
ｂ）Ｆｃ受容体を発現する細胞を前記凝集抗体と接触させるステップと、
ｃ）前記抗体のＦｃ領域による、前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する前記細胞の応答を測定するステップを含んでなる方法。
【請求項２】
前記凝集が、抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを用いて実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが、試験される抗体製剤を認識する抗Ｆａｂ又は抗Ｆ（ａｂ’）２である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記凝集が、熱による凝集である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記凝集が、前記Ｆａｂ領域相互間、又は重鎖及び軽鎖相互間における架橋により実施される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ）、及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）から選択される、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記Ｆｃ受容体を発現する前記細胞が、前記受容体をコードする遺伝子を導入された細胞である、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記Ｆｃ受容体を発現する前記細胞が、ＣＤ１６を発現するＪｕｒｋａｔ細胞であり、この細胞株が、これらの細胞の非特異的活性化剤（例えばＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート １３−アセテート））の存在下で培養される、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記抗体のＦｃ領域による前記細胞のＦｃ受容体の活性化に起因する細胞の応答の測定が、前記Ｆｃ受容体を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン量の測定により実施される、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのサイトカインの測定が、前記サイトカインのｍＲＮＡのアッセイにより実施される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）から選択される少なくとも１つのサイトカインが測定される、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
インターロイキンＩＬ−２が測定される、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
分泌されるインターロイキンＩＬ−２のレベルが、ＡＤＣＣ−タイプの活性と相関する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞応答の測定が、カルシウム流入、リン酸エステル化、転写制御因子又はアポトーシスの測定である、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
細胞の、ＣＤ１６受容体と相互作用できるモノクローナル抗体を産生する能力を評価するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体産生細胞が、ＣＨＯ、ＹＢ２／０、ＳＰ２／０、ＳＰ２／０−ＡＧ１４、ＩＲ９８３Ｆ、Ｎａｍａｌｗａヒトの骨髄腫、ＰＥＲＣ６細胞、ＣＨＯ細胞（特にＣＨＯ−Ｋ−１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１３、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−）、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４及びＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の精製工程後における、抗体のＦｃ領域の有効性及び完全性を評価するための、又は、変性条件下における治療用製剤の安定性をモニターするための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
抗体のＦｃ領域の機能を測定するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子導入植物又は遺伝子導入哺乳類によるモノクローナル抗体の産生能を評価するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
効果的な治療用抗体を選抜するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
フコース含量が６５％未満、好ましくは４０％未満である抗体組成物を選抜するための、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）受容体を活性化できるモノクローナル抗体組成物の調製方法であって、
ａ）ハイブリドーマ、ヘテロハイブリドーマ、又は１つ以上の前記抗体の発現用のベクトルを使用して遺伝子導入した動物、植物若しくはヒト由来の株化細胞から抗体を得るステップと、
ｂ）Ｆ（ａｂ’）２抗ＩｇＧ断片によってステップａ）において得られた抗体を凝集させるステップと、
ｃ）ステップｂ）において得られた抗体を、
ａ．ＣＤ１６を発現する細胞を有するエフェクター細胞と、
ｂ．ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を含有する反応混合液に添加するステップと、
ｄ）ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインの量を測定するステップと、
ｅ）抗体が存在しない場合、又はネガティブコントロールとしての所定の抗体が存在する場合と比較し、０．５、１、２、５、１０、１００又は５００倍超のサイトカイン産生量が測定される抗体組成物を選抜するステップを含んでなる方法。
【請求項２３】
ＣＤ１６を発現する細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン量の測定が、ＣＤ１６を発現する細胞によって産生されるＩＬ−２量の測定である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、
（ｉ）前記治療用抗体を凝集させる手段と、
（ｉｉ）Ｆｃ受容体を発現することができる細胞と、
（ｉｉｉ）前記細胞のＦｃ受容体が前記抗体のＦｃ領域によって活性化されたときの、Ｆｃ受容体を発現できる前記細胞における応答を測定するための手段と、
（ｉｖ）上記のいずれか１つの方法の実施に必要な他の構成要素を含んでなるキット。
【請求項２５】
請求項２４記載の治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、前記細胞の応答を測定するための手段が、前記細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカインを定量化するための手段である、前記キット。
【請求項２６】
請求項２５記載の治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、前記少なくとも１つのサイトカインを定量化するための手段が、前記サイトカインのｍＲＮＡをアッセイする手段である、前記キット。
【請求項２７】
請求項２４記載の治療用抗体の活性測定用の生物学的試験キットであって、前記細胞の応答を測定するための手段が、カルシウム流入、リン酸化、転写制御因子又はアポトーシスを測定するための手段である、前記キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５１９４５５（Ｐ２００９−５１９４５５Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５０４４（Ｐ２００８−５４５０４４）
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８０２７４
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（５０８１７７４６０）エルエフビー バイオテクノロジーズ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８０２７４
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（５０８１７７４６０）エルエフビー バイオテクノロジーズ (3)
【Ｆターム（参考）】
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