抗真菌性タンパク質及びその利用
【課題】Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られた単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１、それをコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチド、及びそれらの用途を提供する。
【解決手段】Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られる単離・精製された抗真菌性タンパク質又はその生物学的に機能性の同等物。
【解決手段】Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られる単離・精製された抗真菌性タンパク質又はその生物学的に機能性の同等物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真菌性タンパク質及びその利用に関する。そのようなタンパク質の製造方法を提供する。本発明はまた、抗真菌性タンパク質の配列及びこのタンパク質配列をコード化するＤＮＡ、このＤＮＡ配列を含むベクター、このＤＮＡ配列によって形質転換された細胞、及び真菌性の疾患を治療及び／又は抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００種類を超える動物の真菌性病原体及び３０種類を超える普通の植物の真菌性病原体が、ヒトの健康及び経済状態に大きな衝撃を与え得ることが知られている。今日では、ヒトの真菌性病原体を抑制する主な薬物は、ポリエン類、アゾール類、フルコナゾール、アムホテリシンＢ等の低分子である。薬物乱用の増加によって、真菌株の薬物耐性の状況は益々厳しくなっている。新たな抗真菌薬の開発は急務である（Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ，Ｃ．Ｐ．，２００１，Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，２８８３−２８９４、並びにＬｉｕ Ｙ．，Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｔｏｒｔｏｒａ，Ｇ．，Ｌａｕｚｏｎ，Ｃ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｍ．Ｋ．及びＧｏｌｕｂ，Ｌ．Ｍ．，２００２，化学的に修飾されたテトラサイクリン（ＣＭＴ−３）は新たな抗真菌剤である（Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ （ＣＭＴ−３） ｉｓ ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｇｅｎｔ．）。Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６，１４４７−１４５４参照）。
【０００３】
植物、細菌、真菌、昆虫、鳥及び哺乳類の全ては、抗真菌性タンパク質を製造できることが知られている（Ｋａｉｓｅｒｅｒ，Ｌ．，Ｏｂｅｒｐａｒｉｅｉｔｅｒ，Ｃ．，Ｗｅｉｌｅｒ−Ｇｏｒｚ，Ｒ．Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｌｅｉｔｅｒ，Ｅ．及びＭａｒｘ，Ｆ．，２００３，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡＦの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｈｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡＦ）Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８０，２０４−２１０参照）。これらのタンパク質は、異なるアミノ酸配列及び四次構造を有しているが、それらの低分子量、高塩基性及び高システイン含量の特性は、殆どの抗真菌性タンパク質の分子の主な特徴である（Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆら、２００１参照）。
【０００４】
研究された糸状菌由来の数個の抗真菌性タンパク質、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来のＡＦＰタンパク質（Ｗｎｅｎｄｔ，Ｓ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｎ．及びＳｔａｈｌ，Ｕ．，１９９０，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓの抗真菌性タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング及びヌクレオチド配列並びに生来の遺伝子の予備的特徴付（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，３９８７，、Ｗｎｅｎｄｔ，Ｓ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｎ．及びＳｔａｈｌ，Ｕ．，１９９４，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来の抗真菌性タンパク質をコードする遺伝子の分子クローニング、配列分析及び発現（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ．）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２５，５１９−５２３、Ｔｈｅｉｓ，ｔ．，Ｍａｒｘ，Ｆ．，Ｓａｌｖｅｎｍｏｓｅｒ，Ｗ．，Ｓｔａｈｌ，Ｕ．及びＭｅｙｅｒ，Ｖ．，２００５，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓの抗真菌性タンパク質の標的部位への新たな識見及び作用様式（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ．）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｌ．１５６，４７−５６、及びＴｈｅｉｓ，Ｔ．，Ｗｅｄｄｅ，Ｍ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｖ．及びＳｔａｈｌ，Ｕ．，２００３，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来の抗真菌性タンパク質は膜浸透（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を引き起こす（Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ ｃａｕｓｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７，５８８−５９３を参照）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のＰＡＦタンパク質（Ｍａｒｘ，Ｆ．，Ｈａｓｓ，Ｈ．，Ｒｅｉｎｄｌ，Ｍ．，Ｓｔｏｆｆｌｅｒ，Ｇ．，Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．及びＲｅｄｌ Ｂ．，１９９５，抗真菌活性を有する豊富に分泌されるタンパク質をコード化するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ｐａｆ遺伝子のクローニング、構造的構成（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）及び発現の調節（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ｐａｆ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔｌｙ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．）Ｇｅｎｅ １６７，１６７−１７１、及びＫａｉｓｅｒｅｒら，２００３参照）、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のＡｎａｆｐタンパク質（Ｌｅｅ，Ｇ．Ｄ．，Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｙ．，Ｍａｅｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｊｉｎ，Ｚ．Ｚ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｌ．及びＨａｈｍ，ＫＳ．，１９９９、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来の新規な抗真菌性ペプチドの単離及び特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３，６４６−６５１参照）。上述した抗真菌性タンパク質は、いずれも分泌型タンパク質であり、それらは広い範囲の真菌類を阻害できるが、細菌及び酵母には影響を与えない。これらの抗真菌性タンパク質は類似の分子特徴を有するが、抗真菌性タンパク質ＰＡＦ及びＡＦＰのアミノ酸配列の間にはたった４２％の配列類似性しかない。（Ｋａｉｓｅｒｅｒら，２００３参照）。これらの真菌誘導性抗真菌性タンパク質は、主にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．の真菌を阻害する（Ｔｈｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，及びＫａｉｓｅｒｅｒら，２００３参照）。ＰＡＦタンパク質はさらにＡｂａｉｄｉａ ｓｐｐ．、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．及びＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．等のヒト及び動物の真菌性病原体を阻害することができる。これらのタンパク質類は、植物の真菌性病原体を生物学的に抑制するのに有用なだけでなく、潜在的なヒト及び動物の抗真菌性薬物としても有用である（ＧａｌｇＯｃｚｙ，Ｌ．，Ｐａｐｐ．Ｔ．，Ｌｅｔｔｅｒ，Ｅ．Ｍａｒｘ，Ｆ．，Ｐｏｃｓｉ，Ｉ．及びＶａｇｖｏｌｇｙｉ，Ｃ．，２００５，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの抗真菌性タンパク質（ＰＡＦ）に対する異なる接合菌綱（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）の感受性（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＰＡＦ）．）Ｊ．Ｂａｓｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．４５，１３６−１４１参照）。さらに、コメの胚（ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ）の病原体Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対するコメの抵抗力が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来のＡＦＰタンパク質のｃＤＮＡをコメにトランスフェクションすることによって増強され得、従って、ＡＦＰタンパク質は、コメの胚の予防に用いることができることが報告されている（Ｃｏｃａ，Ｍ．，Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｉ，Ｃ．，Ｒｕｆａｔ，Ｍ．，Ｐｅｎａｓ，Ｇ．，Ｅｒｉｔｊａ，Ｒ．，Ｔｈａｒｒｅａｕ，Ｄ．，ｄｅｌ Ｐｏｚｏ Ａ，Ｍ．，Ｍｅｓｓｅｇｕｅｒ，Ｊ．及びＳａｎ Ｓｅｇｕｎｄｏ，Ｂ．，２００４，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来の抗真菌性ＡＦＰタンパク質を発現するトランスジェニックコメ植物は、コメの胚の真菌であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対する増強された抵抗力を示す。（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ＡＦＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ ｓｈｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ．）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４，２４５−２５９、及びＭｏｒｅｎｏ，Ａ．Ｂ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｄｅｌ Ｐｏｚｏ，Ａ．及びＳａｎ Ｓｅｇｕｎｄｏ Ｂ．２００６，バイオテクノロジー的に適切な酵素及びタンパク質：コメの胚の真菌であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓのＡＦＰの抗真菌メカニズム（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ： Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ ＡＦＰ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ．）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２（５）：８８３−８９５参照）がある。
【０００５】
Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ及びＰ．ｌｉｌａｃｉｎｕｓは、最も至る所に存在するＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属の種であり、また、ヒトの感染症に最も頻繁に関係する。眼内炎（ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｉｍｉｔｉｓ）及び心内膜炎（ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）は、それぞれＰ．ｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ及びＰ．ｌｉｌａｃｉｎｕｓによって引き起こされる最も一般的な感染症のうちの２つであり、予後が非常に悪い。感染症の標準的な治療の失敗率（ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｅ）は約４０％である。将来の治療アプローチは、併用療法を用いること、又は新規なクラスの抗真菌剤の開発であろう（Ｏｒｔｏｎｅｄａ，Ｍ．，Ｃａｐｉｌｌａ，Ｊ．，Ｐａｓｔｏｒ，Ｆ．Ｊ．，Ｐｕｊｏｌ，Ｉ．，Ｙｕｓｔｅｓ，Ｃ．，Ｓｅｒｅｎａ，Ｃ．及びＧｕａｒｒｏ，Ｊ．（２００４）、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．に対する認可された新規な薬物のＩｎ ｖｉｔｒｏにおける相互作用（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８，２７２７−２７２９参照）。Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉは植物の壊疽輪紋病（ｒｉｎｇ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ）の病原体である。真菌性感染症を効果的に予防し、真菌性疾患によって生じるヒトの健康、経済的な作物及び畜産業の損失を低減するために、生物分子技術（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用することは重要なテーマ（ｔｏｐｉｃ）である。
【０００６】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は、東アジアにおける発酵のための伝統的に重要な真菌であり、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌｉｃｓ）、発酵赤米（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｒｅｄ ｒｉｃｅ（ａｎｋａ））、豆腐（ｓｕｆｕ）、醤油等の発酵産物の製造に用いられている。さらに、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は種々の代謝産物及び酵素を製造する。例えば、モナコリンＫ（ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ）（Ｅｎｄｏ，Ａ．，Ｈａｓｕｍｉ，Ｋ．及びＮｅｇｉｓｈｉ，Ｓ．（１９８５）、モナコリンＪ及びＬ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅ．によって製造されるコレステロール生合成の新規な阻害剤（Ｍｏｎａｃｏｌｉｎｓ Ｊ ａｎｄ Ｌ， ｎｅｗ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ．）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ） ３８（３）：４２０−２）参照）、シトリニン（ｃｉｔｒｉｎｉｎ）（Ｈａｊｊａｊ，Ｈ．，ｋｌａｅｂｅ，Ａ．，Ｇｏｍａ，Ｇ．，Ｂｌａｎｃ，Ｐ．Ｊ．，Ｂａｒｂｉｅｒ，Ｅ．及びＦｒａｎｃｏｉｓ，Ｊ．（２０００）、中鎖脂肪酸は糸状菌Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒにおけるシトリニン生産に影響を及ぼす（Ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｆｆｅｃｔ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（３）：１１２０−５参照）、ＧＡＢＡ（Ｓｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｔ．Ｔ．及びＰａｎ，Ｔ．Ｍ．（２００３）、Ｍｏｎａｓｃｕｓによる二次代謝産物γ−アミノ酪酸及びモナコリン（ｍｏｎａｃｏｌｉｎ）Ｋの生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ ｂｙ Ｍｏｎａｓｃｕｓ）Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（１）：４１−６参照）、赤色及び黄色色素（Ｃａｒｅｌｓ，Ｍ．及びＳｈｅｐｈｅｒｄ，Ｄ．（１９７７）、沈降振盪培養におけるＭｏｎａｓｃｕｓ種の色素生産及び胞子形成に及ぼす異なる窒素源の影響（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ， ｓｈａｋｅｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３（１０）：１３６０−７２、及びＴｓｅｎｇ，Ｙ．Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．ｔ．及びＬｉｎ，Ｃ．Ｆ．（２０００）、塩、亜硝酸ナトリウム、ポリリン酸塩及び各種の等によって影響されるＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの増殖、色素生産及びプロテアーゼ活性（Ｇｒｏｗｔｈ， ｐｉｇｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓａｌｔ， ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｉｔｅ， ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｕｇａｒｓ．）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８（１）：３１−７参照）、及びプロテアーゼ（Ｔｓａｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｈｓｅｕ，Ｔ．Ｈ．及びＳｈｅｎ，Ｙ．Ｓ．（１９７８）、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｋａｏｌｉａｎｇ由来の酸性プロテアーゼの生成及び特徴付け（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｋａｏｌｉａｎｇ．）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１２，２９３−３０２参照）等である。従って、薬物開発及び工業的酵素応用における高い潜在能力を有している。これらの適用のうち、シトリニンは、細菌の増殖を阻害する能力を有することが知られている。しかしながら、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種の菌類の増殖を抑制する活性に関する文献発表はない。我々が以前に行ったＭｏｎａｓｃｕｓの全ゲノム配列分析及び解読プロジェクトは、可能性のある抗真菌性タンパク質遺伝子を見つけ出し（ｍｉｎｅｄ）、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種が抗真菌活性を有する可能性を示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの目的は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られた単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１を提供することである。Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ及びＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒからなる群から選択されることが好ましい。Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ ＢＣＲＣ ３３３０９＝ＡＴＣＣ １６９６６、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ ＢＣＲＣ ３３３１０＝ＩＭＩ ２８２５８７、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ ＢＣＲＣ ３３６４０＝ＡＴＣＣ ２０４３９７、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２（台湾国３００、新竹、食品路３３１号の、Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）に保存されている）、ＢＣＲＣ ３８０９３（ＦＲＩＤＩのＢＣＲＣに保存されている）及びＢＣＲＣ ３１５０２＝ＡＴＣＣ １６３６３、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５２３＝ＡＴＣＣ １６３７８、ＢＣＲＣ ３１５３３＝ＡＴＣＣ １６２４６、ＢＣＲＣ ３１５３４＝ＡＴＣＣ １６３６６、ＢＣＲＣ ３１５３５＝ＡＴＣＣ １８１９９、ＢＣＲＣ３３３１４＝ＡＴＣＣ １６３７１及びＢＣＲＣ ３３３２３＝ＡＴＣＣ １８１９９からなる群から選択されることがより好ましい。
【０００８】
本発明の別の目的は、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化する組み換えベクターのヌクレオチド配列を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、本発明の組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、抗真菌性タンパク質、及び好適なキャリアを含む抗真菌性組成物であって、該タンパク質が、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で提供されることを特徴とする抗真菌性組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、本発明の抗真菌性タンパク質を真菌性の疾病に対する保護を提供するのに十分な量で植物に適用することを含む、植物の真菌を抑制する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子がそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）生物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、真菌性の疾病に対する保護を提供するのに十分な量の本発明の抗真菌性タンパク質を患者に投与することを含む、患者の真菌性の疾病を治療する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅し得る、単離・精製されたプライマー対を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、本発明のプライマー対を含むＰＣＲアッセイキットを提供することである。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から容易に見出すことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られた単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１を提供することができる。
本発明によれば、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することができる。
【００１９】
本発明によれば、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化する組み換えベクターのヌクレオチド配列を提供することができる。
本発明によれば、本発明の組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞を提供することができる。
本発明によれば、抗真菌性タンパク質、及び好適なキャリアを含む抗真菌性組成物であって、該タンパク質が、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で提供されることを特徴とする抗真菌性組成物を提供することができる。
【００２０】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質を真菌性の疾病からの保護を提供するのに十分な量で植物に適用することを含む、植物の真菌を抑制する方法を提供することができる。
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子がそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック生物を提供することができる。
【００２１】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅し得る、単離・精製されたプライマー対を提供することができる。
本発明によれば、本発明のプライマー対を含むＰＣＲアッセイキットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種の新規な遺伝子（以下、ｍａｆｐ１という）に主な特徴を有し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓにおける抗真菌性タンパク質ＡＦＰをコード化する遺伝子及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ中のＰＡＦをコード化する遺伝子に対する類似性を有することによって特徴付けられる。新規な遺伝子によってコード化されるタンパク質（以下、ＭＡＦＰ１という）は、抗真菌活性を有し、真菌性の疾病の治療及び／又は抑制に有用であることがわかる。
【００２３】
定義
本明細書において特に断らない限り、本発明に関連して用いられている科学技術的用語は、当業者が普通に理解する意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明確であるべきであるが、何らかの潜在的なあいまいさが生じた場合には、本明細書に与えられた定義が、如何なる辞書の定義又は付帯的な定義に優先する。
【００２４】
一般に、本明細書中に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、及びそれらの技術は、周知のものであり、当業界で通常に用いられるものである。本発明の方法及び技術は、一般に、当業界で周知の、及び別途示さない限り本明細書中で引用又は考察している種々の一般的な文献及びより具体的な文献に記載されているような従来方法に従って実施する。酵素反応及び精製法は、当業界で共通の完成された、又は本明細書に記載された製造業者の仕様書に従って実施する。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び医薬品化学及び製薬化学と関連して用いられる命名法、並びにそれらの実験室手順及び技術は、当業界で周知であり、普通に用いられているものである。標準技術は、化学合成、化学分析、製薬学的調製物、製剤及び送達、並びに患者の治療に用いられる。
【００２５】
本明細書の開示に従って用いられる下記語句は、別途示さない限り、下記の意味を有するものと理解すべきである：
【００２６】
本明細書でいう語句「単離・精製されたタンパク質」は、目的のタンパク質が、（１）通常、一緒に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含んでいない、（２）同じ起源由来の、例えば、同じ種由来の他のタンパク質を本質的に含んでいない、（３）異なる種由来の細胞によって発現されている、（４）自然状態で結合している（ｗｉｔｈ ｗｈｉｃｈ ｉｔ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）単離されたタンパク質が自然状態で結合しているタンパク質の一部と（共有又は非共有相互作用によって）結合していない、（６）自然状態で結合していないポリペプチドと（共有又は非共有相互作用によって）作動可能に結合されている、又は（７）自然状態では生じないことを意味する。合成されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ、又はそれらの組み合わせは、そのような単離されたタンパク質をコード化することができる。単離されたタンパク質は、その自然環境に見出され、その治療、診断、予防、研究又は他の用途を妨害するタンパク質若しくはポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。単離・精製されたタンパク質が、当業界で周知のタンパク質精製法を用いた単離によって、自然界では結合されている成分を実質的に含まないようにすることもできる。
【００２７】
語句「抗真菌性タンパク質」は、例えば、真菌細胞の増殖を阻害する、真菌細胞を殺す、又は胞子発芽、胞子形成、及び交配等の真菌のライフ・サイクルの段階を中断若しくは遅延させる、抗真菌性を有するタンパク質を意味する。
【００２８】
語句「アミノ酸配列」は、天然に生じるタンパク質分子のアミノ酸配列を意味する。「ポリペプチド」又は「タンパク質」等の「アミノ酸配列」及び類似の語句は、そのアミノ酸配列を、提示された（ｒｅｃｉｔｅｄ）タンパク質分子と関連する、天然の完全なアミノ酸配列に限定することを意味しない。アミノ酸配列としては、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列、及びその断片若しくは部分、及び天然に生じる分子若しくは合成分子が挙げられる。
【００２９】
語句「生物学的に機能性の同等物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、ＭＡＦＰ１等の本発明の新規なペプチドに類似の配列を示す配列若しくは部分を含有し、本明細書に開示された抗真菌活性を含む、ポリペプチドの機能特性と同じ若しくは類似の機能特性を示す、本発明の抗真菌性タンパク質に対する同等物を言う。例えば、本発明の抗真菌性タンパク質の生物学的に機能性の同等物は、多かれ少なかれ、そのタンパク質のアミノ酸配列と異なっているが、本質的に同等であり、かつ、本明細書に記載のタンパク質と本質的に同じ特性を有する、そのアミノ酸配列中に幾つかの変性箇所を有していてもよい。
【００３０】
語句「単離・精製されたポリヌクレオチド」は、本明細書において、目的のポリヌクレオチドは、（１）自然状態では目的のポリヌクレオチドが結合している他のポリヌクレオチドの全部又は一部と（共有的に又は非共有的に）結合されていない、（２）自然状態では結合していない分子と結合している、又は（３）他の如何なるポリヌクレオチドとも結合して自然状態で生じないことを意味する。そのようなポリヌクレオチドは、合成されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得る。本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは、単一のコード領域を含んでいることが好ましい。ポリヌクレオチドは単一のコード領域を含んでいるが、それはポリヌクレオチドの機能に有害な影響を及ぼさない追加的なヌクレオチドを含むことができる。例えば、５’及び３’の非翻訳領域は、可変の数のヌクレオチドを含んでいてもよい。追加的なヌクレオチドは単一のコード領域の外に存在することが好ましい。
【００３１】
語句「ヌクレオチド配列」は、少なくとも１０塩基の長さの一本鎖又は二本鎖の核酸ポリマーを意味する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドを修飾した形態であり得る。このような修飾としては、ブロモウリジン及びイノシン誘導体等の塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース修飾、及びホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）等のヌクレオチド間結合修飾等が挙げられる。本発明のヌクレオチド配列は、検出アッセイのための放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原性標識を含む標識を含むことができる。
【００３２】
語句「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を運搬するために用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、エピソーム、又はウイルス）を意味する。この語句はまた、「組み換えベクター」、「発現ベクター」又は「発現構築物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」を含む。語句「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ、それに作動可能に結合された１以上の非相同の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）コーディング領域の発現を、（宿主細胞と共同して）指令及び／又は抑制するヌクレオチド配列を含有するベクターをいう。発現構築物は、これらに限定されないが、それに作動可能に結合されたコーティング領域の転写、翻訳、及び、イントロンが存在するなら、ＲＮＡスプライシグに影響を及ぼすか又は抑制する配列を含んでいてもよい。好ましいベクターは、それらが結合している核酸の自立的複製及び発現が可能なものである。
【００３３】
語句「宿主細胞」は、核酸配列によって形質転換されているか、又は形質転換でき、それによって目的とする選択された遺伝子を発現する細胞を意味する。この語句は、選択された遺伝子が存在する限り、その子孫が元の親細胞と形態学的に又は遺伝子構造（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋ−ｕｐ）が同一であるか否かを問わず、この子孫を含む。
【００３４】
語句「形質転換」とは、細胞の遺伝子的特徴における変化をいい、新たなＤＮＡを含有するように修飾されたときに、細胞は形質転換される。例えば、ある細胞が、トランスフェクション、トランスダクション、又は他の技術によってその自然の状態から遺伝学的に修飾された場合、その細胞は形質転換されている。
【００３５】
語句「トランスジェニック生物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、ある生物の１以上、好ましくは本質的に全部の細胞に外来の遺伝子が導入された任意の生物をいう。この遺伝子は、マイクロ・インジェクション又は組み換えベクターによる感染等の意図的な遺伝子操作による細胞の前駆体中への導入によって直接的に又は間接的に細胞に導入される。語句「遺伝子操作」には、古典的な交雑、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精だけでなく、染色体内で一体化することができる、又は染色体外で複製することができる組み換えＤＮＡ分子の導入を含む。トランスジェニック動物は、動物、又はトランスジェニック動物由来の臓器、組織若しくは細胞を含む。トランスジェニック植物は、植物、その子孫、そのトランスジェニック植物由来種子、又は形質転換された植物細胞若しくは原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）由来の細胞を含む。
【００３６】
語句「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２以上のポリペプチド分子又は２以上の核酸分子の配列を比較することによって決定される、これらの間の関係をいう。「同一性」は、より小さい２以上の配列の間の同一の一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈｅｓ）のパーセンテージによって評価する。
【００３７】
語句「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、「同一性」と対照をなしている関連した概念に関して当業界で用いられるが、「類似性」とは、同一の一致及び同類置換一致（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｃｈｓ）の両者を包含する関連の尺度をいう。
【００３８】
文脈によって別途必要でない限り、単数形の語句は、複数形を含み、かつ複数形の語句は単数形を含むものとする。
【００３９】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質及びその遺伝子
本発明の一つの目的は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種由来の単離・精製された抗真菌性タンパク質を提供することである。本発明の他の目的は、抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することである。Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質及びその抗真菌性タンパク質をコード化する遺伝子は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ全ゲノムデータベースからの抽出（ｍｉｎｉｎｇ）及び比較分析によって発見された。
【００４０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（受託番号ｅｍｂ｜ＣＡＡ３７５２３．１｜）の抗真菌性タンパク質ＡＦＰ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（受託番号ｇｂ｜ＡＡＡ９２７１８．１｜）のＰＡＦのアミノ酸配列を、ｔｂｌａｓｔｎを用いて、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２（本願出願人（ＦＩＲＤＩ）の社内データベース）の全ゲノム配列データベースからの単一遺伝子データベースの配列と比較した。ＢＬＡＳＴプログラム（ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｔｘ、ｔｂｌａｓｔｘ及び類似のプログラムを含む）は、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）及び他の提供元（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ メリーランド州２０８９４、ベセスダ）から公的に利用可能である。ＡＦＰ及びＰＡＦのタンパク質配列に約３０％の類似性を有する単一遺伝子ｃｏｎｔｉｇを得て、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）予測のためのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ）ソフトウエアで分析した。２７９個の塩基対であるｃＤＮＡ（配列番号：１）をＯＲＦ予測によって同定した。そしてそれは９２個のアミノ酸（配列番号：２）からなるタンパク質に翻訳できる。抗真菌性タンパク質はＭＡＦＰ１と名付けられた。配列番号：２に示されるこの配列は、単一のペプチド（１−１８位）、プロペプチド（１９−３４位）及び成熟タンパク質（３５−９２位）を有することが見出された（図１参照）。このタンパク質はＭｏｎａｓｃｕｓの細胞から分泌され得ることが示唆された。
【００４１】
配列番号：１に示される配列を、ｂｌａｓｔｎを用いてＭｏｎａｓｃｕｓ全ゲノムデータベースと比較し、抗真菌性タンパク質に対するゲノムＤＮＡ配列が得られ（配列番号：４）、ｍａｆｐ１と名付けられた。配列番号：１及び配列番号：４に示される配列を、ｂｌａｓｔｎを用いてＮＣＢＩ ＤＮＡデータベースと比較し、配列番号：２で示される配列をｔｂｌａｓｔｎを用いてＮＣＢＩ及びスイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）タンパク質データベースと比較し、ＭＡＦＰ１のＤＮＡ及びタンパク質配列と類似の公表された配列を同定した。ベクターＮＴＩソフトウエアのアラインメントプログラムを、ＭＡＦＰ１のアミノ酸配列（配列番号：２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（受託番号ｅｍｂ｜ＣＡＡ ３７５２３．１｜）及びＰｅｎｉｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（受託番号ｇｂ｜ＡＡＡ９２７１８．１｜）のＰＡＦのアラインメントに用いて、アミノ酸配列の高度に保存された配列（ＡＡＸＧＸＶＡＸＰ）を見出した（図２（Ｂ）参照）。シグナル・ペプチド及びプロペプチドの領域内に高度に保存された領域が存在することがわかる。ＭＡＦＰ１の成熟タンパク質配列（配列番号：３）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓのＡＦＰ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＰＡＦのアミノ酸配列に対してそれぞれ２９％及び３１％の類似性を有する。成熟ＭＡＦＰ１配列の８、１５、２８、３６、４３及び５４位の６つのシステインは、真菌起源の抗真菌性タンパク質の高度に保存された残基である。ＭＡＦＰ１（配列番号：１）のｃＤＮＡに類似したＤＮＡ配列は存在せず、ゲノムＤＮＡ配列（ｍａｆｐ１、配列番号：４）は、ｂｌａｓｔｎ比較によって、ＮＣＢＩのｎｒデータベース中のＤＮＡ配列中に見出された。従って、ＭＡＦＰ１は新規なタンパク質であり、ｍａｆｐ１は新規な遺伝子であると結論付けることができる。
【００４２】
本発明の抗真菌性タンパク質と生物学的機能的に同等なペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、本発明の範囲内であることが意図されており、抗真菌性タンパク質の基本配列中における保存的なアミノ酸の変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅｓ）を含むアミノ酸配列を含む。そのようなアミノ酸配列には、基本配列中の１以上のアミノ酸が、別のアミノ酸（類）によって置換されており、そのアミノ酸の電荷及び極性（ｐｏｌａｒｉｔｙ）は、元のアミノ酸のそれらと類似している。即ち、保存的なアミノ酸の置換は沈黙の変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）となる。
【００４３】
基本のポリペプチド配列内のアミノ酸の置換は、自然界に存在するアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸から選択することができる。
【００４４】
アミノ酸は、次の４つのグループに分類される：
（１）酸性アミノ酸
（２）塩基性アミノ酸
（３）中性極性アミノ酸
（４）中性非極性アミノ酸
これら各種のグループ内の代表的なアミノ酸としては、これらに限定されないが、（１）アスパラギン酸及びグルタミン酸等の酸性（マイナスの電気を帯びた）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジン及びリジン等の塩基性（プラスの電気を帯びた）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン等の中性極性アミノ酸；及び（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニン等の中性非極性（疎水性）アミノ酸が挙げられる。
【００４５】
基本のタンパク質配列内の保存的なアミノ酸の変化は、上記グループの一つの中の一つのアミノ酸を同じグループ内の別のアミノ酸に置換することによって為すことができる。抗真菌性タンパク質の生物学的に機能性の同等物は、２０以下、より好ましくは１０以下、最も好ましくは５以下の保存的なアミノ酸変化を有することができる。コード化ヌクレオチド配列（遺伝子、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）は、従って、対応する塩基置換を有し、抗真菌性タンパク質の生物学的に機能性の同等な形態をコード化することを可能にするであろう。
【００４６】
従って、本明細書中で意図されている生物学的に機能性の同等ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、本発明の抗真菌性タンパク質の基本のアミノ酸配列、若しくはその中の対応する部分に対して、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、最も好ましくは約９０％以上の配列類似性を有しているべきである。
【００４７】
本発明の抗真菌性ポリペプチドは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に機能性の同等物を含むことが好ましいが、この抗真菌性ポリペプチドの抗真菌活性と同じ又は類似の活性を有するこれらの配列の断片及び変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）も本発明に包含される。従って、配列番号：２中の連続する８以上のアミノ酸配列がそのような活性を示すことができる。
【００４８】
配列番号：２の断片は、Ｎ−末端、Ｃ−末端、ペプチドの中間又はこれらの組み合わせから１以上のアミノ酸が削除された切断された形態であり得る。これらの断片は、配列番号：２の天然に存在するか又は合成の変異体であり得、配列番号：２の抗真菌活性を保持しているはずである。
【００４９】
配列番号：２の変異体は、天然又は合成の配列中に１以上のアミノ酸が挿入された形態を含む。また、これらの変異体は、配列番号：２の天然に存在するか又は合成の変異体であり得、配列番号：２の抗真菌活性を保持しているはずである。
【００５０】
前述の、即ち、アミノ酸の欠失及び付加の両方を含有する抗真菌性タンパク質の形態もまた、本発明に包含される。その中にアミノ酸の置換が存在していてもよい。
【００５１】
本発明に包含される配列番号：２の断片及び変異体は、配列番号：２の対応する領域に対して、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の配列類似性を有しているべきである。
【００５２】
本発明において有用な本発明の抗真菌性タンパク質の他の生物学的に機能性の同等形態（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍｓ）は、ポリペプチド、又は上述したその生物学的に機能性の同等物と、本発明の抗真菌性タンパク質の抗真菌活性と比較して、同じ、類似又はより強い活性を発揮する、融合生成物を形成する、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を含む。
【００５３】
生物学的に機能性の同等物はまた、本発明の抗真菌性タンパク質に対する、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両者を含む抗体と反応する、即ち、特異的に結合し、同じ又は類似の抗真菌活性を示す、ペプチド類、ポリペプチド類及びタンパク質類を含む。
【００５４】
ポリペプチド又はタンパク質の生物学的に機能性の同等物の製造方法は、直接的な化学合成、又は微生物、植物及び動物系のような異種の生物系（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ）；組織培養；細胞培養；若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系における合成等の、当業界で公知の任意の好適な方法を含む。例えば、核酸配列又はアミノ酸配列を修飾するための部位特異的突然変異誘発及び組み換えタンパク質の発現のような遺伝子工学技術等のアミノ酸配列を変える方法は、当業界で周知である。
【００５５】
本発明は、配列番号：１又は４に示されるＤＮＡ配列のみでなく、生物学的に機能性の同等物のヌクレオチド配列も含む。「生物学的に機能性の同等なヌクレオチド配列」という句は、配列番号：２のものと同じ又は類似の抗真菌活性を示すペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をコード化するゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオチド配列をいう。即ち、機能的に作動可能に宿主細胞に導入され、それらが発現されたときに、そのような細胞に真菌性病原体に対する抵抗性を与えるのに十分なレベルの抗真菌活性を示す、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する。
【００５６】
本発明の生物学的に機能性の同等ヌクレオチド配列は、その中で沈黙の変化を生じさせる、基本の抗真菌性タンパク質配列内の保存的なアミノ酸変化をコード化するヌクレオチド配列を含む。そのようなヌクレオチド配列は、配列番号：２等の野生型抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と比較して、対応する塩基置換体を含有する。
【００５７】
基本の抗真菌性タンパク質配列内の保存的なアミノ酸変化をコード化するヌクレオチド配列に加え、本発明の生物学的に機能性の同等ヌクレオチド配列は、他の塩基置換、付加又は欠失を含有するヌクレオチド配列を含む。これらは、配列番号：１又は４のＤＮＡに含まれるのと同じ生来の遺伝子情報を含有し、宿主細胞及び生物に、配列番号：２の真菌抵抗性と同じ又は類似の真菌抵抗性を付与するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコード化する核酸を含む。このようなヌクレオチド配列は、配列番号：１又は４に示されるＤＮＡの「遺伝学的に同等な改質形態（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｏｒｍｓ）」と呼ぶことができ、本明細書中に記載された方法によって同定することができる。
【００５８】
配列番号：１等の、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の核酸中に生じた突然変異は、コード配列のリーディングフレームを保持していることが好ましい。さらに、これらの突然変異は、ハイブリダイズして、ｍＲＮＡ翻訳に悪影響を及ぼす、ループやヘアピン等のｍＲＮＡの二次構造を生成し得る、相補的な領域を作り出さないことが好ましい。
【００５９】
突然変異部位は予め決めることができるが、突然変異自体の性質を予め決める必要はない。例えば、所定部位における突然変異体の最適な特徴を選択するために、ランダム変異導入法をターゲット・コドンに実施することができる。或いは、突然変異は、自然の（ｎａｔｉｖｅ）ｃＤＮＡ配列の断片に連結反応し得る制限部位と隣接する、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座（ｌｏｃｉ）に導入することができる。連結反応後、得られた再構築されたヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸挿入、置換又は欠失を有する核酸配列の誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）をコード化している。何れの場合においても、発現された突然変異体は、例えば、実施例４に記載の方法によって所望の抗真菌活性によってスクリーニングできる。
【００６０】
配列番号１又は４のＤＮＡの有用な遺伝学的に同等な改質形態の具体例としては、配列番号１又は４に対する高レベルの配列同一性を示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡが挙げられる。これは、配列番号１又は４のＤＮＡ又はその対応する部分に対して、約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは９０％以上の配列同一性の範囲であり得る。
【００６１】
このような遺伝学的に同等な改質形態は、従来のＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション法を用いて、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法による増幅によって容易に単離することができる。これらの形態は、従来の形質転換方法によって、真菌性病原体に通常の感受性を有する宿主細胞中に導入したときに、その真菌性病原体に対する抵抗性を付与する能力を有するはずである。
【００６２】
配列番号：２等の抗真菌性タンパク質の断片及び変異体は、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はｍＲＮＡによってコード化されていてもよい。これらの核酸は、配列番号：１若しくは４に示されるヌクレオチド配列、又はそれに対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を有するＤＮＡの対応する領域又は部分に対して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の配列類似性を有するべきである。
【００６３】
本発明において、配列番号：１又は４に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡと同等の生物学的に機能性の核酸としては、下記のものが挙げられる。
【００６４】
部分的なヌクレオチドの欠失、挿入、付加等の自然の又は人工的な突然変異のいずれかによって改変された長さを有するＤＮＡであって、配列番号：１又は４の全長を１００％としたときに、生物学的に機能性の同等な配列は、配列番号：１５の約６０〜約１２０％、好ましくは約８０％〜約１１０％の近似した長さ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｌｅｎｇｔｈ）を有している。
【００６５】
部分的な（通常、全長の約２０％以下、好ましくは約１０％以下、より好ましくは約５％以下）、天然の、又は人工的な突然変異を含有し、異なるアミノ酸をコード化するヌクレオチド配列であるが、得られるポリペプチドは、配列番号：２等の本発明の抗真菌性ポリペプチドの抗真菌活性を保持している。このようにして生成された突然変異したＤＮＡは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して、通常、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコード化している。
【００６６】
本発明において、人工的な突然変異を生じさせるために用いる方法は、特に限定されず、そのような突然変異は、当業界で常套的な任意の手段によって製造できる。これらの方法のいずれかによって製造された、本明細書中に開示されたＤＮＡ配列の生物学的に機能性の同等物は、それによってコード化されたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、実施例に記載の方法を用いてアッセイすることによって選択できる。
【００６７】
遺伝子コードの縮退のために、即ち、タンパク質中に自然に生じる殆どのアミノ酸に対して１以上のコドンが存在するために、本発明のＤＮＡと本質的に同じ遺伝子情報を含有し、配列番号：１又は４のヌクレオチド配列によってコード化されたアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコード化している他のＤＮＡ（及びＲＮＡ）配列は、本発明の実施に用いることができる。この原理は、本明細書中で検討している他のヌクレオチド配列のいずれにも同様に適用される。
【００６８】
本発明のＤＮＡの生物学的に機能性の同等形態はまた、特定の宿主細胞中での発現を増加させるために設計された合成ＤＮＡを含む。宿主細胞は、しばしば、コドン利用の好ましいパターンを示し、それ故、特定の宿主細胞中での発現を増加させるように設計された合成ＤＮＡは、宿主細胞中でのコドンの利用パターンを反映しているはずである。
【００６９】
本発明で有用な配列番号：１又は４のＤＮＡの他の生物学的に機能性の同等形態は、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との接合体をコード化するように修飾され、それによってそれらとの融合生成物をコード化したものを含む。
【００７０】
配列番号：２等の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列の一つの実施形態は、配列番号：１又は４に示されているが、本発明は、配列番号：１又は４の配列及びその相補的な配列にハイブリダイズし、本発明の抗真菌性タンパク質と同じ又は類似の抗真菌活性を有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコード化しているヌクレオチド配列も含むと理解すべきである。このようなヌクレオチド配列は、中〜高緊縮条件下で、配列番号：１若しくは４、又はその相補的配列にハイブリダイズすることが好ましい。
【００７１】
もし、上記のヌクレオチド配列が、配列番号：２の抗真菌効果と約２５％以下の差の抗真菌効果を有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコード化しているならば、それらは、配列番号：１又は４のＤＮＡと実質的に同等な生物学的機能を有していると考えられる。
【００７２】
ベクター及び宿主系
本発明の他の目的は、配列番号：１又は４に示される核酸配列を含有するベクターを提供することである。生物学的に活性なＭＡＦＰ１を発現させるために、ＭＡＦＰ１又は生物学的に機能性の同等物をコード化する核酸配列は、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含んでいるベクター中に挿入され得る。本発明によれば、当業者に周知の方法を用いて、ＭＡＦＰ１をコード化する配列及び適切な転写及び翻訳制御要素を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子組み換えを含む。ベクターは通常、用いる特定の宿主細胞中で機能性となるように選択される（即ち、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こり得るように、ベクターは宿主細胞装置（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）と適合している）。
【００７３】
本発明の別の目的は、配列番号：１若しくは４で示される核酸配列又はその配列を含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供することである。本発明によれば、多数の宿主系を利用して、ＭＡＦＰ１をコード化する配列を含有し、発現させることができる。そのような宿主系及び発現ベクターとしては、以下のものに限定されないが、組み換え型バクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌；酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；ウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター又は細菌発現ベクターに感染した植物細胞系；及び動物細胞系が挙げられる。ベクターを構築し、ＭＡＦＰ１をコード化する核酸配列をベクターの適切な部位に挿入した後、完成されたベクターを、増幅及び／又はポリペプチド発現のために好適な宿主細胞中に挿入することができる。ＭＡＦＰ１タンパク質の発現ベクターの選択された宿主細胞中への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、マイクロ・インジェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション等を含む周知の方法によって達成することができる。選択された方法は、部分的に、用いる宿主細胞の種類の機能となるであろう。宿主細胞は、適切な条件下で培養されたときに、ＭＡＦＰ１タンパク質を合成することができ、その後、（宿主細胞がＭＡＦＰ１タンパク質を培地中に分泌する場合には）ＭＡＦＰ１タンパク質は培地から回収でき、（培地中に分泌されない場合には）ＭＡＦＰ１を製造する宿主細胞から直接回収できる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性にとって望ましい又は必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化等）、及び生物学的に活性な分子中への組み込みの容易さ等の種々のファクターに依存する。
【００７４】
有用性
本発明によれば、驚くべきことに、ＭＡＦＰ１タンパク質が分泌性のタンパク質であり、病原性真菌の増殖を効果的に阻害できることを見出した。従って、本発明のＭＡＦＰ１タンパク質は、動物、植物又は微生物の真菌性疾病の治療、抑制及び／又は予防に用いることができる。抗真菌性タンパク質を被験者に投与することによって、又は抗真菌性タンパク質をコード化するＤＮＡ分子を含むベクターによって被験者を形質転換することによって、被験者中のコード化された抗真菌性タンパク質を発現させる抗真菌性タンパク質を直接使用して、真菌性疾病に対する保護を提供することができる。
【００７５】
本発明の抗真菌性タンパク質の用途に加え、本明細書中で意図されている核酸配列も、多様な他の用途を有している。例えば、これらの核酸配列もまた、核酸ハイブリダイゼーションの実施形態のプローブ又はプライマーとしての有用性を有する。そのようなものとして（ａｓ ｓｕｃｈ）、配列番号：１又は４の１４個のヌクレオチド長の連続したＤＮＡセグメントと同じ又はそれに相補的な、少なくとも１４個のヌクレオチド長の連続配列からなる配列領域を含む核酸セグメントには、特別な有用性が見出されるであろう。同一又は相補的な、より長い連続配列、例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００ｂｐ等のもの（４０９個の塩基対の中間の長さ及び４０９個までの長さを有する全ての中間体を含む、かつ４０９個の塩基対からなる全長の配列を含む）も、特定の実施形態において用いられるであろう。
【００７６】
そのような核酸プライマーが配列をコード化する抗真菌性タンパク質を特異的に増幅又はそれにハイブリダイズする能力は、所定の検体中の配列をコード化する抗真菌性タンパク質の存在を検出する用途に、核酸プライマーを用いることを可能にするであろう。しかしながら、他の遺伝子構築物の製造における用途のための突然変異種又はプライマーの製造のための配列情報の利用を含む他の用途が考えられる。
【００７７】
抗真菌性組成物
本発明はまた、特に、真菌性疾病を治療、抑制及び／又は予防のために、本発明の抗真菌性タンパク質を含む抗真菌性組成物を提供する。この組成物は、好適なキャリア、希釈剤、溶媒、不活性物質又は他の添加剤を含んでいてもよく、任意に、他の抗真菌活性物質、賦形剤、補助剤（ａｕｘｉｌｉａｒｉｅｓ）、肥料又は成長調節剤を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の抗真菌性組成物は、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠形成（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、粉末化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）及び／又は凍結乾燥工程を含む当業界で公知の方法で製造されてもよい。
【００７９】
抗真菌性組成物は、以下に限られないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、直腸内手段を含む多数の経路によって動物に投与することによって、又は標準的な農業技術（例えば、スプレー又は種子処理）を用いて組成物が真菌性病原体と接触するように、組成物を植物、又は植物の環境に直接適用することによって病原性真菌の増殖阻害又は殺傷するために用いることができる。
【００８０】
先に述べたように、より広い抗真菌スペクトルを提供するように、即ち、追加的な病原体を抑制する、又は同じ真菌性病原体の抑制のための多角的な作用様式を与えるように、本発明の抗真菌性タンパク質は、抗真菌活性を示す他のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む、他の抗真菌性試薬と組み合わせて使用することができる。
【００８１】
また、本明細書中で意図されている抗真菌性組成物は、本発明の抗真菌性ポリペプチドを製造しうる細菌及び真菌細胞のような宿主細胞の形態のものも含む。
【００８２】
トランスジェニック生物
このようにして単離されたｃＤＮＡは、宿主細胞中に導入するための適切な形質転換／発現ベクターに移送することができる。さらに別の態様では、本発明の抗真菌性遺伝子は、本発明の新規な抗真菌性タンパク質をコード化する核酸セグメントを発現するトランスジェニック生物を製造するために用いることができる。トランスジェニック生物の製造方法は、マイクロインジェクション又は遺伝子組換えベクターによる感染等、当業界で周知である。一般に、この方法は、ＭＡＦＰ１抗真菌性タンパク質をコード化するコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを含有するＤＮＡセグメントによる好適な宿主細胞の形質転換を含む。このようなコード領域は、一般に、転写終結領域に作動可能に連結されており、それによってプロモーターは細胞内のコード領域の転写を駆動することができ、従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えタンパク質を製造する能力を与えることができる。
【００８３】
トランスジェニック生物は、本明細書中に開示された新規な抗真菌性タンパク質の１以上をコード化する遺伝子又は遺伝子セグメントを発現することができる。植物細胞等の好適な宿主細胞を配列番号：２のようなＭＡＦＰ１抗真菌性ポリペプチドをコードする組換え核酸配列によって形質転換することで、コード化された抗真菌性タンパク質の発現によって、真菌に対する抵抗性を示す生物を作り出すことができる。本明細書で用いているように、語句「トランスジェニック生物」とは、おそらく普通には存在しない遺伝子に限らず、ＲＮＡに通常は転写されないか、タンパク質に翻訳されない（「発現されない」）ＤＮＡ配列、又は形質転換されていない生物中には通常存在しないが、遺伝子組み換え若しくは異なる発現のいずれかが望まれる遺伝子等の、形質転換されていない生物中に導入されることが望まれる任意の他の遺伝子又はＤＮＡ配列がを組み込まれた生物をいうことが意図されている。
【００８４】
１より多いトランス遺伝子が、形質転換された宿主植物細胞のゲノム中に組み込まれるであろう。そのような場合、１より多いＭＡＦＰ１抗真菌性タンパク質コード化ＤＮＡセグメントが、そのような生物のゲノム中に組み込まれる。ある状況では、１、２、３、４又はそれ以上の抗真菌性タンパク質（野生型又は組換え技術によって作られたかのいずれか）が組み込まれることが望ましく、形質転換されたトランスジェニック生物中で安定して発現されることが望ましい。
【００８５】
また、他のＤＮＡセグメントをトランスジェニック生物のゲノム中に組み込むことが望ましく、その場合、そのようなＤＮＡは、開示された抗真菌性タンパク質とは非相同の他の抗真菌性タンパク質又は生物の生産物の質若しくは性能を改善する種々の他のタンパク質をコード化する。従って、ＤＮＡによってコード化された他の種類のタンパク質としては、抗細菌性、抗ウイルス性又は殺虫性タンパク質が挙げられる。
【００８６】
トランスジェニック生物は、非ヒト哺乳類、植物又は微生物等の任意の使い勝手の良い生物であってよい。例えば、実験室試験操作に用いるような、齧歯類（例えば、マウス又はラット）；及び例えば、イネ、ジャガイモ及びタバコ等の農業に用いるような生物である。しかしながら、本発明が、ＭＡＦＰ１が阻害効果を示す菌類に感染しやすいいずれの生物にも適用できることは自明であろう。
【００８７】
プライマー
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを用いることが有利である。そのようなプライマーの配列は、ＰＣＲ法に用いるための抗真菌性タンパク質遺伝子の特定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）セグメントを検出、増幅又は突然変異させるために設計される。ＰＣＲ用のプライマー及びハイブリダイゼーション・スクリーニング用のプローブは、配列番号：１又は４に示されるＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。プライマーは、二量体形成を防止するために、自己相補的な配列も、それらの３’末端の相補的配列も有しないことが好ましい。プライマーは、制限部位を含んでいてもよい。プライマーは、ＤＮＡにアニーリングされ、十分な回数のＰＣＲを実施することにより、ゲル電気泳動及び染色によって容易に可視化される生成物を得る。プライマーは、一般に少なくとも１４個、通常少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２４個、より好ましくは少なくとも２８個のヌクレオチド長を有する。そのようなプライマーは、配列番号：２と同じ若しくは類似の抗真菌活性を有する抗真菌性ポリペプチド又はタンパク質をコード化する遺伝子を特異的にプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）することができるであろう。他の種由来の関連する抗真菌性タンパク質遺伝子のセグメントも、このようなプライマーを用いたＰＣＲによって増幅することができる。増幅された断片は、精製され、適切なベクター中に挿入され、当業界で公知の常套手段によって増殖され得る。
【実施例】
【００８８】
下記実施例は、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供されている。たとえそうであっても、本明細書中で検討されている実施形態における修飾及び変更が、本発明的発見の精神又は範囲から逸脱することなく当業者によって為され得るので、実施例は、本発明を不当に限定して解釈されるべきではない。
【００８９】
材料
以下の実施例で用いるＭｏｎａｓｃｕｓ株は、台湾のＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）に保存されているＭｏｎａｓｃｕｓ株である：Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ（ＢＣＲＣ ３８０７２、ＢＣＲＣ ３８０９３及びＢＣＲＣ３１５０２）、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ（ＢＣＲＣ ３３３０９）、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ（ＢＣＲＣ ３３３１０）、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ（ＢＣＲＣ ３３６４０）、Ｍ．ｒｕｂｅｒ（ＢＣＲＣ ３１５３４、ＢＣＲＣ ３１５２３、ＢＣＲＣ ３１５３５、ＢＣＲＣ ３３３１４、ＢＣＲＣ ３３３２３及びＢＣＲＣ ３１５３３）、Ｍ．ｋａｏｌｉａｎｇ（ＢＣＲＣ ３１６０５＝ＣＢＳ ３０２．７８）、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ（ＢＣＲＣ ３１５４１＝ＡＴＣＣ １６３７９、ＢＣＲＣ ３３３２５＝ＩＦＯ ３０８７３、ＢＣＲＣ ３１６１５＝ＤＳＭ １３７９、ＢＣＲＣ ３１４９９＝ＡＴＣＣ １６３６０＝ＡＴＣＣ ２６３１１及びＢＣＲＣ ３１５４２＝ＡＴＣＣ １６３６５＝ＡＴＣＣ １６４２６）、及びＭ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（ＢＣＲＣ ３３４４６＝ＡＴＣＣ ２００６１３から選択する。
【００９０】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株又は単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１の抗真菌活性を試験するための真菌株は、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉ（ＢＣＲＣ ３５００４）及びＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ（ＢＣＲＣ ３３１７４）から選択される。
【００９１】
真菌株を、ＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天、Ｄｉｆｉｃｏ Ｃｏ．）培地皿上に接種し、２５℃で７〜１４日間培養した。
【００９２】
実施例１
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子の分布
種々のＭｏｎａｓｃｕｓ種にｍａｆｐ１遺伝子（配列番号：１）が存在するか否かを明らかにするために、ｍａｆｐ１遺伝子を増幅するためのプライマーを、プライマー設計ソフトウエア（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ）Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ）を用いて設計した。プライマーは、次の３つのグループに組み合わされた：（１）プライマーＨ１６０−５Ｆ（配列番号：６）とプライマーＨ１６０−３Ｒ（配列番号：７）、これらはｍａｆｐ１遺伝子の全長配列の増幅に用いることができる；（２）プライマーＨ１６０−５Ｓ（配列番号：８）とプライマーＨ１６０−３Ｒ、これらはプロペプチド及び成熟ＭＡＦＰ１領域を含む配列をコード化するヌクレオチド配列の増幅に用いることができる；及び（３）プライマーＨ１６０−５Ｐ（配列番号：９）とプライマーＨ１６０−３Ｒ、これらは成熟ＭＡＦＰ１領域を含む配列をコード化するヌクレオチド配列の増幅に用いることができる。
【００９３】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株をＹＭ培地（グリセロール７％、グルコース３％、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム）３％、ポリペプトン１．２％、ＮａＮＯ３ ０．２％及びＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１％、ｐＨ６．０）中、２５℃で９日間培養した。真菌体及び培養液を３Ｍフィルター膜による真空濾過によって分離した。好適量の真菌体を用いた従来のフェノール抽出法によって真菌の染色体ＤＮＡを得た。
【００９４】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子の存在を試験するために、前述の３つのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を実施した。Ｍｏｎａｓｃｕｓ株から得られた染色体ＤＮＡ １００ｎｇをＰＣＲテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応溶液は、１０ｎＭ ｄＮＴＰ ０．２μＬ、１０×ＰＣＲバッファー２．５μＬ、前方のプライマー及び逆のプライマー５ピコモル、及びＴａｑ酵素５単位を含む。ｍａｆｐ１遺伝子を増幅するためのＰＣＲ条件は、（１）９４℃、５分間；（２）９４℃で４０秒間を３０回、５５℃で４０秒間及び７２℃で３０秒間；（３）７２℃で３分間；及び（４）４℃で保持した。ＰＣＲ増幅の結果を表１に示す。
【表１】
【００９５】
結果は、ｍａｆｐ１遺伝子が、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ ＢＣＲＣ ３３３０９、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ ＢＣＲＣ ３３３１０、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ ＢＣＲＣ ３３６４０、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ（ＢＣＲＣ ３８０７２、ＢＣＲＣ ３８０９３及びＢＣＲＣ ３１５０２）及びＭ．ｒｕｂｅｒ（ＢＣＲＣ ３１５２３、ＢＣＲＣ ３１５３３、ＢＣＲＣ ３１５３４、ＢＣＲＣ ３１５３５、ＢＣＲＣ ３３３１４及びＢＣＲＣ ３３３２３）中に存在することを示した。Ｍ．ｋａｏｌｉａｎｇ ＢＣＲＣ ３１５０６、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ（ＢＣＲＣ ３１４９９、ＢＣＲＣ ３１５４２、ＢＣＲＣ ３１５４１、ＢＣＲＣ ３１６１５及びＢＣＲＣ ３３３２５）及びＭ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ ＢＣＲＣ ３３４４６にはｍａｆｐ１遺伝子は見出されない。Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ及びＭ．ｒｕｂｅｒ等のＭｏｎａｓｃｕｓ種が抗真菌活性を有していることが示唆されている。
【００９６】
実施例２
ｍａｆｐ１遺伝子と各種のＭｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子のｃＤＮＡとの配列比較
ｍａｆｐ１遺伝子のクローニング及び配列決定
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株をＹＭ培地（グリセロール７％、グルコース３％、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム）３％、ポリペプトン１．２％、ＮａＮＯ３ ０．２％及びＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１％、ｐＨ６．０）中、２５℃で９日間培養した。３Ｍフィルター膜による真空濾過によって、真菌体と培養液を分離した。好適量の真菌体を用いる従来のフェノール抽出法によって真菌の染色体ＤＮＡを得た。プライマーＨ１６０−５Ｆ及びＨ１６０−３Ｒを用いてＰＣＲ増幅を実施した。Ｍｏｎａｓｃｕｓ株から得られた染色体ＤＮＡ １００ｎｇを、ＰＣＲテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応溶液は、１０ｎＭ ｄＮＴＰ ０．２μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、前方プライマー及び後方プライマー５ピコモル及びＴａｑ酵素５単位を含む。ｍａｆｐ１遺伝子を増幅するためのＰＣＲ条件は、（１）９４℃、５分間；（２）９４℃、４０秒間を３０サイクル、５５℃、４０秒間及び７０℃３０秒間；（３）７２℃３分間；及び（４）４℃に保持である。ｍａｆｐ１遺伝子の全長配列のうちのＰＣＲ増幅されたヌクレオチド断片を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを配列決定のために抽出した。
【００９７】
ｍａｆｐ１ ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株を、ＹＭ培地（グリセロール７％、グルコース３％、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム）３％、ポリペプトン１．２％、ＮａＮＯ３ ０．２％及びＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１％、ｐＨ６．０）中、２５℃で９日間培養した。３Ｍフィルター膜による真空濾過によって真菌体と培養液を分離した。好適量の真菌体を用いるＲｉｂｏＰｕｒｅ（登録商標）−酵母キット（Ａｍｂｉｏｎ）によって真菌の全ＲＮＡを得た。Ｉｍｐｒｏｍ−ＩＩ（登録商標）逆転写系（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて最初のｃＤＮＡ鎖を製造した。ｍａｆｐ１遺伝子の特定のプライマー対（Ｈ１６０−５Ｆ及びＨ１６０−３Ｒ）をＰＣＲに用いて、全長のｍａｆｐ１のｃＤＮＡ断片を増幅した。好適量の最初のｃＤＮＡ鎖をＰＣＲテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応溶液は、１０ｎＭ ｄＮＴＰ ０．２μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、Ｈ１６０−５Ｆ及びＨ１６０−３Ｒ ５ピコモル及びＴａｑ酵素５単位を含む。ｍａｆｐ１ ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ条件は、（１）９４℃、５分間；（２）９４℃、４０秒間、５５℃、４０秒間を３０サイクル及び７２℃、１分間；（３）７２℃、３分間；及び（４）４℃で保持である。増幅されたＰＣＲ産物を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを配列決定のために抽出した。
【００９８】
ｍａｆｐ１遺伝子と各種のＭｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子のｃＤＮＡとの配列比較結果を表２に示した。
【表２】
【００９９】
結果は、ｍａｆｐ１遺伝子並びにＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３１５０２及びＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５３３中のｍａｆｐ１遺伝子のｃＤＮＡの配列は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２のそれらに対して１００％の配列類似性を有することを示した。これらのＭｏｎａｓｃｕｓ株全部が同じｍａｆｐ１遺伝子を有しており、転写されたｍＲＮＡが同じであることがわかる。これらの株は同じＭＡＦＰ１タンパク質を製造できると結論付けられる。
【０１００】
実施例３
病原体対峙培養アッセイ
Ｍｏｎａｓｃｕｓ真菌の抗真菌活性を確認するために、２種類のＭｏｎａｓｃｕｓ種（Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２及びＢＣＲＣ ３８０９３）の円形真菌ブロック（直径０．５ｃｍ）と、病原性真菌（Ｈ．ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４）とをＰＤＡ皿の両側に置き、２８℃で培養した。病原性真菌の増殖阻害を観察した。この予備的な結果は、両方の株が、Ｈ．ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４の増殖を阻害できることを示した。
【０１０１】
Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３は、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２の突然変異体である。（表２に示されるように）それらは同じｍａｆｐ１配列を有し、同じ抗真菌活性を有する。Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３を、以下の精製実施例に用いた。
【０１０２】
実施例４
Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質（ＭＡＦＰ１）の精製、Ｎ−末端配列決定、及び抗真菌活性アッセイ
ＭＡＦＰ１の精製
Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３の、２５℃、９日間培養後の培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ）４００ｍＬを、０．２２μｍのフィルター膜を用いて、４，５００ｒｐｍで遠心分離して、不純物を除去した。３０ｋＤａのフィルター膜を用いて遠心分離された培養液を処理し（ｐｒｏｃｅｓｓ）、３０ｋＤａより小さい分子を含む溶液を回収し、ｐＨ６．６に調整した。ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）樹脂１０ｍＬとタンパク質溶液４０ｍＬとを、室温で１６時間混合した。この混合物を空のクロマトグラフィーカラムに充填した。結合していないタンパク質を洗い出した。このカラムを、溶液Ａ（１０ｍＭ ナトリウム−リン酸緩衝液中２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）１００ｍＬで溶出し、溶液Ａ及び溶液Ｂ（１０ｍＭ ナトリウム−リン酸緩衝液中１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）の異なる割合からなる溶液を用いてタンパク質を溶出した。溶液Ａの濃度勾配は、９５％から、８０％、７５％、５０％、０％までであった。それぞれの濃度勾配に対して溶液１００ｍＬを使用し、溶出画分を１５ｍＬの試験管に別々に分けた。
【０１０３】
それぞれの試験管からの溶液１ｍＬを、ＴＣＡで沈殿させ、ＳＤＳＡ−ＰＡＧＥで分析した。ＭＡＦＰ１タンパク質の分子量は約７０ｋＤａである。ＭＡＦＰ１タンパク質を含有する溶液を、１つの試験管中に貯めた。この溶液を３ｋＤａのフィルター膜によって低いスピード（２，０００ｒｐｍ）で遠心分離した。３ｋＤａより大きいタンパク質を含有する溶液を集め、濃縮し、１ｋＤａのフィルター膜によって脱塩した。精製されたＭＡＦＰ１タンパク質を、病原体拮抗アッセイ及びタンパク質Ｎ−末端配列決定に用いた。
【０１０４】
Ｎ−末端配列決定
精製されたＭＡＦＰ１溶液をＴＣＡで沈殿させ、１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。異なる濃度のリゾチームをタンパク質の定量基準として用いた。電気泳動後、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に移し、０．１％クマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０）で染色した（図３参照）。ＭＡＦＰ１タンパク質のバンドを切り出し、メタノールで脱色した。ｄｄＨ２Ｏで膜を何回も洗浄し、暗所で乾燥させた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｃｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ４９４を用いて、処理されたＭＡＦＰ１タンパク質のＮ−末端配列を決定した。
【０１０５】
精製されたＭＡＦＰ１タンパク質のＮ−末端配列決定結果は、精製されたＭＡＦＰ１タンパク質のＮ−末端が、ＬＳＫＹＧＧＥＣＳＬＱＨＮＴＣ（配列番号：５）であることを示した。精製されたタンパク質のＮ−末端配列決定は、ＭＡＦＰ１タンパク質（配列番号：３）の成熟形態の最初の１５個のアミノ酸配列と一致している。精製されたタンパク質はＭＡＦＰ１タンパク質の成熟形態であることが証明された。
【０１０６】
抗真菌活性アッセイ
病原体拮抗投与量アッセイを実施し、精製したＭＡＦＰ１タンパク質の抗真菌活性を確認した。病原性真菌（Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉｉ ＢＣＲＣ ３３１７４及びＨ．ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４）の真菌区画（ｂｌｏｃｋ）をＰＤＡ皿の中央に置いた。各濃度のＭＡＦＰ１溶液（精製したＭＡＦＰ１タンパク質を０μｇ〜０．８μｇ含有する）の６ｍｍのペーパーディスクを、病原性真菌の真菌区画の周りに置いた。皿を２８℃で培養し、病原性真菌の増殖阻害を観察した。結果を図４に示した。結果は、ＭＡＦＰ１タンパク質０．２μｇで、Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉｉの増殖を有意に抑制できることを示した。また、結果は、ＭＡＦＰ１タンパク質０．４μｇで、Ｈ．ｐａｎｉｃｉの増殖を有意に阻害できることを示した。ＭＡＦＰ１の濃度が高ければ高いほど、病原性真菌の増殖を阻害する活性が強いことが観察された。Ｍｏｎａｓｃｕｓ種由来のＭＡＦＰ１タンパク質は、抗真菌活性を有するタンパク質であり、Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉｉ等のヒトの病原体及びＨ．ｐａｎｉｃｉ等の植物の病原体の増殖を阻害できることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２の全ゲノム配列及びユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）データベースを探索することによって得られる抗真菌性タンパク質遺伝子及びそのｃＤＮＡ配列に関する。前記遺伝子は抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化することができる。Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ培養培地から得られる分子量約７ｋＤａの精製されたタンパク質は、Ｎ−末端タンパク質配列決定及び比較分析によってＭＡＦＰ１と同定される。精製されたＭＡＦＰ１タンパク質は、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ ＢＣＲＣ ３３１７４及びＨｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４等の病原体の増殖を阻害できる。さらに、ＰＣＲ試験によってこの抗真菌性タンパク質の遺伝子が、Ｍ．Ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ、及びＭ．ｒｕｂｅｒ等の他のＭｏｎａｓｃｕｓ種に存在していることがわかる。また、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ（ＢＣＲＣ ３８０７２、ＢＣＲＣ ３８０９３及びＢＣＲＣ ３１５０２）及びＭ．ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５３３の、４種類のＭｏｎａｓｃｕｓ株中のｍａｆｐ１遺伝子及びそのｃＤＮＡが、同じＤＮＡ配列を有していることが証明されている。
【０１０８】
本発明によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られた単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１、それをコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチド及びそれをコード化する組み換えベクターのヌクレオチド配列、並びにその組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞が提供される。
【０１０９】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質を含む抗真菌性組成物が提供される。
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質を用いる植物の真菌性疾病を抑制する方法が提供される。
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子がそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック生物が提供される。
【０１１０】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅し得る、単離・精製されたプライマー対、及びそれを含むＰＣＲアッセイキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１のアミノ酸配列を示す。シグナル・ペプチド；プロペプチド；及び成熟タンパク質のそれぞれの領域を、下線を付して示す。
【図２】図２は、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓの抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１、Ａ．ｇｉｇａｎｔｅｕｓのＡＦＰタンパク質、及びＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＰＡＦタンパク質の、（Ａ）成熟領域及び（Ｂ）全長の配列アラインメントを示す。網掛けで示した領域は３種又は２種のタンパク質の間で同一のアミノ酸残基を示す。
【図３】図３は、精製されたＭｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１はタンパク質マーカー；レーン２は精製されたＭＡＦＰ１タンパク質である。
【図４】図４は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１の抗真菌活性アッセイを示す。病原性新菌であるＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ（ＢＣＲＣ ３３１７４）及びＨｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉ（ＢＣＲＣ ３５００４）に対する精製されたＭＡＦＰ１タンパク質の抗真菌能を、対峙培養によって検討し、真菌類の増殖を観察した。（−）ＭＡＦＰ１：ＭＡＦＰ１無しの対照群；（＋）ＭＡＦＰ１：各種の量のＭＡＦＰ１タンパク質による実験群。Ａ〜Ｈはそれぞれ、ＭＡＦＰ１タンパク質０．４μｇ、０．２μｇ、０．１μｇ、０．０５μｇ、０μｇ、０．８μｇ、０．６４μｇ及び０．３２μｇのペーパーディスクを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真菌性タンパク質及びその利用に関する。そのようなタンパク質の製造方法を提供する。本発明はまた、抗真菌性タンパク質の配列及びこのタンパク質配列をコード化するＤＮＡ、このＤＮＡ配列を含むベクター、このＤＮＡ配列によって形質転換された細胞、及び真菌性の疾患を治療及び／又は抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００種類を超える動物の真菌性病原体及び３０種類を超える普通の植物の真菌性病原体が、ヒトの健康及び経済状態に大きな衝撃を与え得ることが知られている。今日では、ヒトの真菌性病原体を抑制する主な薬物は、ポリエン類、アゾール類、フルコナゾール、アムホテリシンＢ等の低分子である。薬物乱用の増加によって、真菌株の薬物耐性の状況は益々厳しくなっている。新たな抗真菌薬の開発は急務である（Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ，Ｃ．Ｐ．，２００１，Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，２８８３−２８９４、並びにＬｉｕ Ｙ．，Ｒｙａｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｔｏｒｔｏｒａ，Ｇ．，Ｌａｕｚｏｎ，Ｃ．，Ｌｅｕｎｇ，Ｍ．Ｋ．及びＧｏｌｕｂ，Ｌ．Ｍ．，２００２，化学的に修飾されたテトラサイクリン（ＣＭＴ−３）は新たな抗真菌剤である（Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ （ＣＭＴ−３） ｉｓ ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｇｅｎｔ．）。Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４６，１４４７−１４５４参照）。
【０００３】
植物、細菌、真菌、昆虫、鳥及び哺乳類の全ては、抗真菌性タンパク質を製造できることが知られている（Ｋａｉｓｅｒｅｒ，Ｌ．，Ｏｂｅｒｐａｒｉｅｉｔｅｒ，Ｃ．，Ｗｅｉｌｅｒ−Ｇｏｒｚ，Ｒ．Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｌｅｉｔｅｒ，Ｅ．及びＭａｒｘ，Ｆ．，２００３，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡＦの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｈｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡＦ）Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８０，２０４−２１０参照）。これらのタンパク質は、異なるアミノ酸配列及び四次構造を有しているが、それらの低分子量、高塩基性及び高システイン含量の特性は、殆どの抗真菌性タンパク質の分子の主な特徴である（Ｓｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆら、２００１参照）。
【０００４】
研究された糸状菌由来の数個の抗真菌性タンパク質、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来のＡＦＰタンパク質（Ｗｎｅｎｄｔ，Ｓ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｎ．及びＳｔａｈｌ，Ｕ．，１９９０，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓの抗真菌性タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング及びヌクレオチド配列並びに生来の遺伝子の予備的特徴付（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，３９８７，、Ｗｎｅｎｄｔ，Ｓ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｎ．及びＳｔａｈｌ，Ｕ．，１９９４，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来の抗真菌性タンパク質をコードする遺伝子の分子クローニング、配列分析及び発現（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ．）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２５，５１９−５２３、Ｔｈｅｉｓ，ｔ．，Ｍａｒｘ，Ｆ．，Ｓａｌｖｅｎｍｏｓｅｒ，Ｗ．，Ｓｔａｈｌ，Ｕ．及びＭｅｙｅｒ，Ｖ．，２００５，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓの抗真菌性タンパク質の標的部位への新たな識見及び作用様式（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ．）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｌ．１５６，４７−５６、及びＴｈｅｉｓ，Ｔ．，Ｗｅｄｄｅ，Ｍ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｖ．及びＳｔａｈｌ，Ｕ．，２００３，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来の抗真菌性タンパク質は膜浸透（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を引き起こす（Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ ｃａｕｓｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４７，５８８−５９３を参照）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のＰＡＦタンパク質（Ｍａｒｘ，Ｆ．，Ｈａｓｓ，Ｈ．，Ｒｅｉｎｄｌ，Ｍ．，Ｓｔｏｆｆｌｅｒ，Ｇ．，Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．及びＲｅｄｌ Ｂ．，１９９５，抗真菌活性を有する豊富に分泌されるタンパク質をコード化するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ｐａｆ遺伝子のクローニング、構造的構成（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）及び発現の調節（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ｐａｆ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔｌｙ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．）Ｇｅｎｅ １６７，１６７−１７１、及びＫａｉｓｅｒｅｒら，２００３参照）、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のＡｎａｆｐタンパク質（Ｌｅｅ，Ｇ．Ｄ．，Ｓｈｉｎ，Ｓ．Ｙ．，Ｍａｅｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｊｉｎ，Ｚ．Ｚ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｌ．及びＨａｈｍ，ＫＳ．，１９９９、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来の新規な抗真菌性ペプチドの単離及び特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６３，６４６−６５１参照）。上述した抗真菌性タンパク質は、いずれも分泌型タンパク質であり、それらは広い範囲の真菌類を阻害できるが、細菌及び酵母には影響を与えない。これらの抗真菌性タンパク質は類似の分子特徴を有するが、抗真菌性タンパク質ＰＡＦ及びＡＦＰのアミノ酸配列の間にはたった４２％の配列類似性しかない。（Ｋａｉｓｅｒｅｒら，２００３参照）。これらの真菌誘導性抗真菌性タンパク質は、主にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．の真菌を阻害する（Ｔｈｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，及びＫａｉｓｅｒｅｒら，２００３参照）。ＰＡＦタンパク質はさらにＡｂａｉｄｉａ ｓｐｐ．、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．及びＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．等のヒト及び動物の真菌性病原体を阻害することができる。これらのタンパク質類は、植物の真菌性病原体を生物学的に抑制するのに有用なだけでなく、潜在的なヒト及び動物の抗真菌性薬物としても有用である（ＧａｌｇＯｃｚｙ，Ｌ．，Ｐａｐｐ．Ｔ．，Ｌｅｔｔｅｒ，Ｅ．Ｍａｒｘ，Ｆ．，Ｐｏｃｓｉ，Ｉ．及びＶａｇｖｏｌｇｙｉ，Ｃ．，２００５，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの抗真菌性タンパク質（ＰＡＦ）に対する異なる接合菌綱（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）の感受性（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＰＡＦ）．）Ｊ．Ｂａｓｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．４５，１３６−１４１参照）。さらに、コメの胚（ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ）の病原体Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対するコメの抵抗力が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来のＡＦＰタンパク質のｃＤＮＡをコメにトランスフェクションすることによって増強され得、従って、ＡＦＰタンパク質は、コメの胚の予防に用いることができることが報告されている（Ｃｏｃａ，Ｍ．，Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｉ，Ｃ．，Ｒｕｆａｔ，Ｍ．，Ｐｅｎａｓ，Ｇ．，Ｅｒｉｔｊａ，Ｒ．，Ｔｈａｒｒｅａｕ，Ｄ．，ｄｅｌ Ｐｏｚｏ Ａ，Ｍ．，Ｍｅｓｓｅｇｕｅｒ，Ｊ．及びＳａｎ Ｓｅｇｕｎｄｏ，Ｂ．，２００４，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ由来の抗真菌性ＡＦＰタンパク質を発現するトランスジェニックコメ植物は、コメの胚の真菌であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対する増強された抵抗力を示す。（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ＡＦＰ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ ｓｈｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ．）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４，２４５−２５９、及びＭｏｒｅｎｏ，Ａ．Ｂ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｄｅｌ Ｐｏｚｏ，Ａ．及びＳａｎ Ｓｅｇｕｎｄｏ Ｂ．２００６，バイオテクノロジー的に適切な酵素及びタンパク質：コメの胚の真菌であるＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓのＡＦＰの抗真菌メカニズム（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ： Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ ＡＦＰ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ．）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２（５）：８８３−８９５参照）がある。
【０００５】
Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ及びＰ．ｌｉｌａｃｉｎｕｓは、最も至る所に存在するＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属の種であり、また、ヒトの感染症に最も頻繁に関係する。眼内炎（ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｉｍｉｔｉｓ）及び心内膜炎（ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）は、それぞれＰ．ｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ及びＰ．ｌｉｌａｃｉｎｕｓによって引き起こされる最も一般的な感染症のうちの２つであり、予後が非常に悪い。感染症の標準的な治療の失敗率（ｆａｉｌｕｒｅ ｒａｔｅ）は約４０％である。将来の治療アプローチは、併用療法を用いること、又は新規なクラスの抗真菌剤の開発であろう（Ｏｒｔｏｎｅｄａ，Ｍ．，Ｃａｐｉｌｌａ，Ｊ．，Ｐａｓｔｏｒ，Ｆ．Ｊ．，Ｐｕｊｏｌ，Ｉ．，Ｙｕｓｔｅｓ，Ｃ．，Ｓｅｒｅｎａ，Ｃ．及びＧｕａｒｒｏ，Ｊ．（２００４）、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．に対する認可された新規な薬物のＩｎ ｖｉｔｒｏにおける相互作用（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｏｖｅｄ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８，２７２７−２７２９参照）。Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉは植物の壊疽輪紋病（ｒｉｎｇ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ）の病原体である。真菌性感染症を効果的に予防し、真菌性疾患によって生じるヒトの健康、経済的な作物及び畜産業の損失を低減するために、生物分子技術（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用することは重要なテーマ（ｔｏｐｉｃ）である。
【０００６】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は、東アジアにおける発酵のための伝統的に重要な真菌であり、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌｉｃｓ）、発酵赤米（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｒｅｄ ｒｉｃｅ（ａｎｋａ））、豆腐（ｓｕｆｕ）、醤油等の発酵産物の製造に用いられている。さらに、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は種々の代謝産物及び酵素を製造する。例えば、モナコリンＫ（ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ）（Ｅｎｄｏ，Ａ．，Ｈａｓｕｍｉ，Ｋ．及びＮｅｇｉｓｈｉ，Ｓ．（１９８５）、モナコリンＪ及びＬ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅ．によって製造されるコレステロール生合成の新規な阻害剤（Ｍｏｎａｃｏｌｉｎｓ Ｊ ａｎｄ Ｌ， ｎｅｗ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ．）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ） ３８（３）：４２０−２）参照）、シトリニン（ｃｉｔｒｉｎｉｎ）（Ｈａｊｊａｊ，Ｈ．，ｋｌａｅｂｅ，Ａ．，Ｇｏｍａ，Ｇ．，Ｂｌａｎｃ，Ｐ．Ｊ．，Ｂａｒｂｉｅｒ，Ｅ．及びＦｒａｎｃｏｉｓ，Ｊ．（２０００）、中鎖脂肪酸は糸状菌Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒにおけるシトリニン生産に影響を及ぼす（Ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｆｆｅｃｔ ｃｉｔｒｉｎｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（３）：１１２０−５参照）、ＧＡＢＡ（Ｓｕ，Ｙ．Ｃ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｔ．Ｔ．及びＰａｎ，Ｔ．Ｍ．（２００３）、Ｍｏｎａｓｃｕｓによる二次代謝産物γ−アミノ酪酸及びモナコリン（ｍｏｎａｃｏｌｉｎ）Ｋの生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｍｏｎａｃｏｌｉｎ Ｋ ｂｙ Ｍｏｎａｓｃｕｓ）Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（１）：４１−６参照）、赤色及び黄色色素（Ｃａｒｅｌｓ，Ｍ．及びＳｈｅｐｈｅｒｄ，Ｄ．（１９７７）、沈降振盪培養におけるＭｏｎａｓｃｕｓ種の色素生産及び胞子形成に及ぼす異なる窒素源の影響（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ， ｓｈａｋｅｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３（１０）：１３６０−７２、及びＴｓｅｎｇ，Ｙ．Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．ｔ．及びＬｉｎ，Ｃ．Ｆ．（２０００）、塩、亜硝酸ナトリウム、ポリリン酸塩及び各種の等によって影響されるＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの増殖、色素生産及びプロテアーゼ活性（Ｇｒｏｗｔｈ， ｐｉｇｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ａｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓａｌｔ， ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｉｔｅ， ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｕｇａｒｓ．）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８（１）：３１−７参照）、及びプロテアーゼ（Ｔｓａｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｈｓｅｕ，Ｔ．Ｈ．及びＳｈｅｎ，Ｙ．Ｓ．（１９７８）、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｋａｏｌｉａｎｇ由来の酸性プロテアーゼの生成及び特徴付け（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｋａｏｌｉａｎｇ．）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１２，２９３−３０２参照）等である。従って、薬物開発及び工業的酵素応用における高い潜在能力を有している。これらの適用のうち、シトリニンは、細菌の増殖を阻害する能力を有することが知られている。しかしながら、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種の菌類の増殖を抑制する活性に関する文献発表はない。我々が以前に行ったＭｏｎａｓｃｕｓの全ゲノム配列分析及び解読プロジェクトは、可能性のある抗真菌性タンパク質遺伝子を見つけ出し（ｍｉｎｅｄ）、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種が抗真菌活性を有する可能性を示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの目的は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られた単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１を提供することである。Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ及びＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒからなる群から選択されることが好ましい。Ｍｏｎａｓｃｕｓ種は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ ＢＣＲＣ ３３３０９＝ＡＴＣＣ １６９６６、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ ＢＣＲＣ ３３３１０＝ＩＭＩ ２８２５８７、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ ＢＣＲＣ ３３６４０＝ＡＴＣＣ ２０４３９７、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２（台湾国３００、新竹、食品路３３１号の、Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）に保存されている）、ＢＣＲＣ ３８０９３（ＦＲＩＤＩのＢＣＲＣに保存されている）及びＢＣＲＣ ３１５０２＝ＡＴＣＣ １６３６３、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５２３＝ＡＴＣＣ １６３７８、ＢＣＲＣ ３１５３３＝ＡＴＣＣ １６２４６、ＢＣＲＣ ３１５３４＝ＡＴＣＣ １６３６６、ＢＣＲＣ ３１５３５＝ＡＴＣＣ １８１９９、ＢＣＲＣ３３３１４＝ＡＴＣＣ １６３７１及びＢＣＲＣ ３３３２３＝ＡＴＣＣ １８１９９からなる群から選択されることがより好ましい。
【０００８】
本発明の別の目的は、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化する組み換えベクターのヌクレオチド配列を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、本発明の組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、抗真菌性タンパク質、及び好適なキャリアを含む抗真菌性組成物であって、該タンパク質が、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で提供されることを特徴とする抗真菌性組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、本発明の抗真菌性タンパク質を真菌性の疾病に対する保護を提供するのに十分な量で植物に適用することを含む、植物の真菌を抑制する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子がそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）生物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、真菌性の疾病に対する保護を提供するのに十分な量の本発明の抗真菌性タンパク質を患者に投与することを含む、患者の真菌性の疾病を治療する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅し得る、単離・精製されたプライマー対を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、本発明のプライマー対を含むＰＣＲアッセイキットを提供することである。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から容易に見出すことができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られた単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１を提供することができる。
本発明によれば、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することができる。
【００１９】
本発明によれば、抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化する組み換えベクターのヌクレオチド配列を提供することができる。
本発明によれば、本発明の組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞を提供することができる。
本発明によれば、抗真菌性タンパク質、及び好適なキャリアを含む抗真菌性組成物であって、該タンパク質が、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で提供されることを特徴とする抗真菌性組成物を提供することができる。
【００２０】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質を真菌性の疾病からの保護を提供するのに十分な量で植物に適用することを含む、植物の真菌を抑制する方法を提供することができる。
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子がそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック生物を提供することができる。
【００２１】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅し得る、単離・精製されたプライマー対を提供することができる。
本発明によれば、本発明のプライマー対を含むＰＣＲアッセイキットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種の新規な遺伝子（以下、ｍａｆｐ１という）に主な特徴を有し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓにおける抗真菌性タンパク質ＡＦＰをコード化する遺伝子及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ中のＰＡＦをコード化する遺伝子に対する類似性を有することによって特徴付けられる。新規な遺伝子によってコード化されるタンパク質（以下、ＭＡＦＰ１という）は、抗真菌活性を有し、真菌性の疾病の治療及び／又は抑制に有用であることがわかる。
【００２３】
定義
本明細書において特に断らない限り、本発明に関連して用いられている科学技術的用語は、当業者が普通に理解する意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明確であるべきであるが、何らかの潜在的なあいまいさが生じた場合には、本明細書に与えられた定義が、如何なる辞書の定義又は付帯的な定義に優先する。
【００２４】
一般に、本明細書中に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、及びそれらの技術は、周知のものであり、当業界で通常に用いられるものである。本発明の方法及び技術は、一般に、当業界で周知の、及び別途示さない限り本明細書中で引用又は考察している種々の一般的な文献及びより具体的な文献に記載されているような従来方法に従って実施する。酵素反応及び精製法は、当業界で共通の完成された、又は本明細書に記載された製造業者の仕様書に従って実施する。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び医薬品化学及び製薬化学と関連して用いられる命名法、並びにそれらの実験室手順及び技術は、当業界で周知であり、普通に用いられているものである。標準技術は、化学合成、化学分析、製薬学的調製物、製剤及び送達、並びに患者の治療に用いられる。
【００２５】
本明細書の開示に従って用いられる下記語句は、別途示さない限り、下記の意味を有するものと理解すべきである：
【００２６】
本明細書でいう語句「単離・精製されたタンパク質」は、目的のタンパク質が、（１）通常、一緒に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含んでいない、（２）同じ起源由来の、例えば、同じ種由来の他のタンパク質を本質的に含んでいない、（３）異なる種由来の細胞によって発現されている、（４）自然状態で結合している（ｗｉｔｈ ｗｈｉｃｈ ｉｔ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）単離されたタンパク質が自然状態で結合しているタンパク質の一部と（共有又は非共有相互作用によって）結合していない、（６）自然状態で結合していないポリペプチドと（共有又は非共有相互作用によって）作動可能に結合されている、又は（７）自然状態では生じないことを意味する。合成されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ、又はそれらの組み合わせは、そのような単離されたタンパク質をコード化することができる。単離されたタンパク質は、その自然環境に見出され、その治療、診断、予防、研究又は他の用途を妨害するタンパク質若しくはポリペプチド又は他の汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。単離・精製されたタンパク質が、当業界で周知のタンパク質精製法を用いた単離によって、自然界では結合されている成分を実質的に含まないようにすることもできる。
【００２７】
語句「抗真菌性タンパク質」は、例えば、真菌細胞の増殖を阻害する、真菌細胞を殺す、又は胞子発芽、胞子形成、及び交配等の真菌のライフ・サイクルの段階を中断若しくは遅延させる、抗真菌性を有するタンパク質を意味する。
【００２８】
語句「アミノ酸配列」は、天然に生じるタンパク質分子のアミノ酸配列を意味する。「ポリペプチド」又は「タンパク質」等の「アミノ酸配列」及び類似の語句は、そのアミノ酸配列を、提示された（ｒｅｃｉｔｅｄ）タンパク質分子と関連する、天然の完全なアミノ酸配列に限定することを意味しない。アミノ酸配列としては、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列、及びその断片若しくは部分、及び天然に生じる分子若しくは合成分子が挙げられる。
【００２９】
語句「生物学的に機能性の同等物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、ＭＡＦＰ１等の本発明の新規なペプチドに類似の配列を示す配列若しくは部分を含有し、本明細書に開示された抗真菌活性を含む、ポリペプチドの機能特性と同じ若しくは類似の機能特性を示す、本発明の抗真菌性タンパク質に対する同等物を言う。例えば、本発明の抗真菌性タンパク質の生物学的に機能性の同等物は、多かれ少なかれ、そのタンパク質のアミノ酸配列と異なっているが、本質的に同等であり、かつ、本明細書に記載のタンパク質と本質的に同じ特性を有する、そのアミノ酸配列中に幾つかの変性箇所を有していてもよい。
【００３０】
語句「単離・精製されたポリヌクレオチド」は、本明細書において、目的のポリヌクレオチドは、（１）自然状態では目的のポリヌクレオチドが結合している他のポリヌクレオチドの全部又は一部と（共有的に又は非共有的に）結合されていない、（２）自然状態では結合していない分子と結合している、又は（３）他の如何なるポリヌクレオチドとも結合して自然状態で生じないことを意味する。そのようなポリヌクレオチドは、合成されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得る。本発明の単離・精製されたポリヌクレオチドは、単一のコード領域を含んでいることが好ましい。ポリヌクレオチドは単一のコード領域を含んでいるが、それはポリヌクレオチドの機能に有害な影響を及ぼさない追加的なヌクレオチドを含むことができる。例えば、５’及び３’の非翻訳領域は、可変の数のヌクレオチドを含んでいてもよい。追加的なヌクレオチドは単一のコード領域の外に存在することが好ましい。
【００３１】
語句「ヌクレオチド配列」は、少なくとも１０塩基の長さの一本鎖又は二本鎖の核酸ポリマーを意味する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドを修飾した形態であり得る。このような修飾としては、ブロモウリジン及びイノシン誘導体等の塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボース等のリボース修飾、及びホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）等のヌクレオチド間結合修飾等が挙げられる。本発明のヌクレオチド配列は、検出アッセイのための放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原性標識を含む標識を含むことができる。
【００３２】
語句「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を運搬するために用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、エピソーム、又はウイルス）を意味する。この語句はまた、「組み換えベクター」、「発現ベクター」又は「発現構築物（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」を含む。語句「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ、それに作動可能に結合された１以上の非相同の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）コーディング領域の発現を、（宿主細胞と共同して）指令及び／又は抑制するヌクレオチド配列を含有するベクターをいう。発現構築物は、これらに限定されないが、それに作動可能に結合されたコーティング領域の転写、翻訳、及び、イントロンが存在するなら、ＲＮＡスプライシグに影響を及ぼすか又は抑制する配列を含んでいてもよい。好ましいベクターは、それらが結合している核酸の自立的複製及び発現が可能なものである。
【００３３】
語句「宿主細胞」は、核酸配列によって形質転換されているか、又は形質転換でき、それによって目的とする選択された遺伝子を発現する細胞を意味する。この語句は、選択された遺伝子が存在する限り、その子孫が元の親細胞と形態学的に又は遺伝子構造（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋ−ｕｐ）が同一であるか否かを問わず、この子孫を含む。
【００３４】
語句「形質転換」とは、細胞の遺伝子的特徴における変化をいい、新たなＤＮＡを含有するように修飾されたときに、細胞は形質転換される。例えば、ある細胞が、トランスフェクション、トランスダクション、又は他の技術によってその自然の状態から遺伝学的に修飾された場合、その細胞は形質転換されている。
【００３５】
語句「トランスジェニック生物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、ある生物の１以上、好ましくは本質的に全部の細胞に外来の遺伝子が導入された任意の生物をいう。この遺伝子は、マイクロ・インジェクション又は組み換えベクターによる感染等の意図的な遺伝子操作による細胞の前駆体中への導入によって直接的に又は間接的に細胞に導入される。語句「遺伝子操作」には、古典的な交雑、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精だけでなく、染色体内で一体化することができる、又は染色体外で複製することができる組み換えＤＮＡ分子の導入を含む。トランスジェニック動物は、動物、又はトランスジェニック動物由来の臓器、組織若しくは細胞を含む。トランスジェニック植物は、植物、その子孫、そのトランスジェニック植物由来種子、又は形質転換された植物細胞若しくは原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）由来の細胞を含む。
【００３６】
語句「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２以上のポリペプチド分子又は２以上の核酸分子の配列を比較することによって決定される、これらの間の関係をいう。「同一性」は、より小さい２以上の配列の間の同一の一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈｅｓ）のパーセンテージによって評価する。
【００３７】
語句「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、「同一性」と対照をなしている関連した概念に関して当業界で用いられるが、「類似性」とは、同一の一致及び同類置換一致（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｃｈｓ）の両者を包含する関連の尺度をいう。
【００３８】
文脈によって別途必要でない限り、単数形の語句は、複数形を含み、かつ複数形の語句は単数形を含むものとする。
【００３９】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質及びその遺伝子
本発明の一つの目的は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種由来の単離・精製された抗真菌性タンパク質を提供することである。本発明の他の目的は、抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチドを提供することである。Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質及びその抗真菌性タンパク質をコード化する遺伝子は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ全ゲノムデータベースからの抽出（ｍｉｎｉｎｇ）及び比較分析によって発見された。
【００４０】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（受託番号ｅｍｂ｜ＣＡＡ３７５２３．１｜）の抗真菌性タンパク質ＡＦＰ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（受託番号ｇｂ｜ＡＡＡ９２７１８．１｜）のＰＡＦのアミノ酸配列を、ｔｂｌａｓｔｎを用いて、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２（本願出願人（ＦＩＲＤＩ）の社内データベース）の全ゲノム配列データベースからの単一遺伝子データベースの配列と比較した。ＢＬＡＳＴプログラム（ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｔｘ、ｔｂｌａｓｔｘ及び類似のプログラムを含む）は、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）及び他の提供元（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ メリーランド州２０８９４、ベセスダ）から公的に利用可能である。ＡＦＰ及びＰＡＦのタンパク質配列に約３０％の類似性を有する単一遺伝子ｃｏｎｔｉｇを得て、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）予測のためのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ）ソフトウエアで分析した。２７９個の塩基対であるｃＤＮＡ（配列番号：１）をＯＲＦ予測によって同定した。そしてそれは９２個のアミノ酸（配列番号：２）からなるタンパク質に翻訳できる。抗真菌性タンパク質はＭＡＦＰ１と名付けられた。配列番号：２に示されるこの配列は、単一のペプチド（１−１８位）、プロペプチド（１９−３４位）及び成熟タンパク質（３５−９２位）を有することが見出された（図１参照）。このタンパク質はＭｏｎａｓｃｕｓの細胞から分泌され得ることが示唆された。
【００４１】
配列番号：１に示される配列を、ｂｌａｓｔｎを用いてＭｏｎａｓｃｕｓ全ゲノムデータベースと比較し、抗真菌性タンパク質に対するゲノムＤＮＡ配列が得られ（配列番号：４）、ｍａｆｐ１と名付けられた。配列番号：１及び配列番号：４に示される配列を、ｂｌａｓｔｎを用いてＮＣＢＩ ＤＮＡデータベースと比較し、配列番号：２で示される配列をｔｂｌａｓｔｎを用いてＮＣＢＩ及びスイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）タンパク質データベースと比較し、ＭＡＦＰ１のＤＮＡ及びタンパク質配列と類似の公表された配列を同定した。ベクターＮＴＩソフトウエアのアラインメントプログラムを、ＭＡＦＰ１のアミノ酸配列（配列番号：２）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（受託番号ｅｍｂ｜ＣＡＡ ３７５２３．１｜）及びＰｅｎｉｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（受託番号ｇｂ｜ＡＡＡ９２７１８．１｜）のＰＡＦのアラインメントに用いて、アミノ酸配列の高度に保存された配列（ＡＡＸＧＸＶＡＸＰ）を見出した（図２（Ｂ）参照）。シグナル・ペプチド及びプロペプチドの領域内に高度に保存された領域が存在することがわかる。ＭＡＦＰ１の成熟タンパク質配列（配列番号：３）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓのＡＦＰ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＰＡＦのアミノ酸配列に対してそれぞれ２９％及び３１％の類似性を有する。成熟ＭＡＦＰ１配列の８、１５、２８、３６、４３及び５４位の６つのシステインは、真菌起源の抗真菌性タンパク質の高度に保存された残基である。ＭＡＦＰ１（配列番号：１）のｃＤＮＡに類似したＤＮＡ配列は存在せず、ゲノムＤＮＡ配列（ｍａｆｐ１、配列番号：４）は、ｂｌａｓｔｎ比較によって、ＮＣＢＩのｎｒデータベース中のＤＮＡ配列中に見出された。従って、ＭＡＦＰ１は新規なタンパク質であり、ｍａｆｐ１は新規な遺伝子であると結論付けることができる。
【００４２】
本発明の抗真菌性タンパク質と生物学的機能的に同等なペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、本発明の範囲内であることが意図されており、抗真菌性タンパク質の基本配列中における保存的なアミノ酸の変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅｓ）を含むアミノ酸配列を含む。そのようなアミノ酸配列には、基本配列中の１以上のアミノ酸が、別のアミノ酸（類）によって置換されており、そのアミノ酸の電荷及び極性（ｐｏｌａｒｉｔｙ）は、元のアミノ酸のそれらと類似している。即ち、保存的なアミノ酸の置換は沈黙の変化（ｓｉｌｅｎｔ ｃｈａｎｇｅ）となる。
【００４３】
基本のポリペプチド配列内のアミノ酸の置換は、自然界に存在するアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸から選択することができる。
【００４４】
アミノ酸は、次の４つのグループに分類される：
（１）酸性アミノ酸
（２）塩基性アミノ酸
（３）中性極性アミノ酸
（４）中性非極性アミノ酸
これら各種のグループ内の代表的なアミノ酸としては、これらに限定されないが、（１）アスパラギン酸及びグルタミン酸等の酸性（マイナスの電気を帯びた）アミノ酸；（２）アルギニン、ヒスチジン及びリジン等の塩基性（プラスの電気を帯びた）アミノ酸；（３）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン等の中性極性アミノ酸；及び（４）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニン等の中性非極性（疎水性）アミノ酸が挙げられる。
【００４５】
基本のタンパク質配列内の保存的なアミノ酸の変化は、上記グループの一つの中の一つのアミノ酸を同じグループ内の別のアミノ酸に置換することによって為すことができる。抗真菌性タンパク質の生物学的に機能性の同等物は、２０以下、より好ましくは１０以下、最も好ましくは５以下の保存的なアミノ酸変化を有することができる。コード化ヌクレオチド配列（遺伝子、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ）は、従って、対応する塩基置換を有し、抗真菌性タンパク質の生物学的に機能性の同等な形態をコード化することを可能にするであろう。
【００４６】
従って、本明細書中で意図されている生物学的に機能性の同等ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、本発明の抗真菌性タンパク質の基本のアミノ酸配列、若しくはその中の対応する部分に対して、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、最も好ましくは約９０％以上の配列類似性を有しているべきである。
【００４７】
本発明の抗真菌性ポリペプチドは、配列番号：２で示されるアミノ酸配列、又はその生物学的に機能性の同等物を含むことが好ましいが、この抗真菌性ポリペプチドの抗真菌活性と同じ又は類似の活性を有するこれらの配列の断片及び変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）も本発明に包含される。従って、配列番号：２中の連続する８以上のアミノ酸配列がそのような活性を示すことができる。
【００４８】
配列番号：２の断片は、Ｎ−末端、Ｃ−末端、ペプチドの中間又はこれらの組み合わせから１以上のアミノ酸が削除された切断された形態であり得る。これらの断片は、配列番号：２の天然に存在するか又は合成の変異体であり得、配列番号：２の抗真菌活性を保持しているはずである。
【００４９】
配列番号：２の変異体は、天然又は合成の配列中に１以上のアミノ酸が挿入された形態を含む。また、これらの変異体は、配列番号：２の天然に存在するか又は合成の変異体であり得、配列番号：２の抗真菌活性を保持しているはずである。
【００５０】
前述の、即ち、アミノ酸の欠失及び付加の両方を含有する抗真菌性タンパク質の形態もまた、本発明に包含される。その中にアミノ酸の置換が存在していてもよい。
【００５１】
本発明に包含される配列番号：２の断片及び変異体は、配列番号：２の対応する領域に対して、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の配列類似性を有しているべきである。
【００５２】
本発明において有用な本発明の抗真菌性タンパク質の他の生物学的に機能性の同等形態（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍｓ）は、ポリペプチド、又は上述したその生物学的に機能性の同等物と、本発明の抗真菌性タンパク質の抗真菌活性と比較して、同じ、類似又はより強い活性を発揮する、融合生成物を形成する、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を含む。
【００５３】
生物学的に機能性の同等物はまた、本発明の抗真菌性タンパク質に対する、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両者を含む抗体と反応する、即ち、特異的に結合し、同じ又は類似の抗真菌活性を示す、ペプチド類、ポリペプチド類及びタンパク質類を含む。
【００５４】
ポリペプチド又はタンパク質の生物学的に機能性の同等物の製造方法は、直接的な化学合成、又は微生物、植物及び動物系のような異種の生物系（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ）；組織培養；細胞培養；若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系における合成等の、当業界で公知の任意の好適な方法を含む。例えば、核酸配列又はアミノ酸配列を修飾するための部位特異的突然変異誘発及び組み換えタンパク質の発現のような遺伝子工学技術等のアミノ酸配列を変える方法は、当業界で周知である。
【００５５】
本発明は、配列番号：１又は４に示されるＤＮＡ配列のみでなく、生物学的に機能性の同等物のヌクレオチド配列も含む。「生物学的に機能性の同等なヌクレオチド配列」という句は、配列番号：２のものと同じ又は類似の抗真菌活性を示すペプチド、ポリペプチド及びタンパク質をコード化するゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオチド配列をいう。即ち、機能的に作動可能に宿主細胞に導入され、それらが発現されたときに、そのような細胞に真菌性病原体に対する抵抗性を与えるのに十分なレベルの抗真菌活性を示す、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する。
【００５６】
本発明の生物学的に機能性の同等ヌクレオチド配列は、その中で沈黙の変化を生じさせる、基本の抗真菌性タンパク質配列内の保存的なアミノ酸変化をコード化するヌクレオチド配列を含む。そのようなヌクレオチド配列は、配列番号：２等の野生型抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と比較して、対応する塩基置換体を含有する。
【００５７】
基本の抗真菌性タンパク質配列内の保存的なアミノ酸変化をコード化するヌクレオチド配列に加え、本発明の生物学的に機能性の同等ヌクレオチド配列は、他の塩基置換、付加又は欠失を含有するヌクレオチド配列を含む。これらは、配列番号：１又は４のＤＮＡに含まれるのと同じ生来の遺伝子情報を含有し、宿主細胞及び生物に、配列番号：２の真菌抵抗性と同じ又は類似の真菌抵抗性を付与するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコード化する核酸を含む。このようなヌクレオチド配列は、配列番号：１又は４に示されるＤＮＡの「遺伝学的に同等な改質形態（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｏｒｍｓ）」と呼ぶことができ、本明細書中に記載された方法によって同定することができる。
【００５８】
配列番号：１等の、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の核酸中に生じた突然変異は、コード配列のリーディングフレームを保持していることが好ましい。さらに、これらの突然変異は、ハイブリダイズして、ｍＲＮＡ翻訳に悪影響を及ぼす、ループやヘアピン等のｍＲＮＡの二次構造を生成し得る、相補的な領域を作り出さないことが好ましい。
【００５９】
突然変異部位は予め決めることができるが、突然変異自体の性質を予め決める必要はない。例えば、所定部位における突然変異体の最適な特徴を選択するために、ランダム変異導入法をターゲット・コドンに実施することができる。或いは、突然変異は、自然の（ｎａｔｉｖｅ）ｃＤＮＡ配列の断片に連結反応し得る制限部位と隣接する、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座（ｌｏｃｉ）に導入することができる。連結反応後、得られた再構築されたヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸挿入、置換又は欠失を有する核酸配列の誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）をコード化している。何れの場合においても、発現された突然変異体は、例えば、実施例４に記載の方法によって所望の抗真菌活性によってスクリーニングできる。
【００６０】
配列番号１又は４のＤＮＡの有用な遺伝学的に同等な改質形態の具体例としては、配列番号１又は４に対する高レベルの配列同一性を示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡが挙げられる。これは、配列番号１又は４のＤＮＡ又はその対応する部分に対して、約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは９０％以上の配列同一性の範囲であり得る。
【００６１】
このような遺伝学的に同等な改質形態は、従来のＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション法を用いて、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法による増幅によって容易に単離することができる。これらの形態は、従来の形質転換方法によって、真菌性病原体に通常の感受性を有する宿主細胞中に導入したときに、その真菌性病原体に対する抵抗性を付与する能力を有するはずである。
【００６２】
配列番号：２等の抗真菌性タンパク質の断片及び変異体は、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はｍＲＮＡによってコード化されていてもよい。これらの核酸は、配列番号：１若しくは４に示されるヌクレオチド配列、又はそれに対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を有するＤＮＡの対応する領域又は部分に対して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の配列類似性を有するべきである。
【００６３】
本発明において、配列番号：１又は４に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡと同等の生物学的に機能性の核酸としては、下記のものが挙げられる。
【００６４】
部分的なヌクレオチドの欠失、挿入、付加等の自然の又は人工的な突然変異のいずれかによって改変された長さを有するＤＮＡであって、配列番号：１又は４の全長を１００％としたときに、生物学的に機能性の同等な配列は、配列番号：１５の約６０〜約１２０％、好ましくは約８０％〜約１１０％の近似した長さ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｌｅｎｇｔｈ）を有している。
【００６５】
部分的な（通常、全長の約２０％以下、好ましくは約１０％以下、より好ましくは約５％以下）、天然の、又は人工的な突然変異を含有し、異なるアミノ酸をコード化するヌクレオチド配列であるが、得られるポリペプチドは、配列番号：２等の本発明の抗真菌性ポリペプチドの抗真菌活性を保持している。このようにして生成された突然変異したＤＮＡは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して、通常、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコード化している。
【００６６】
本発明において、人工的な突然変異を生じさせるために用いる方法は、特に限定されず、そのような突然変異は、当業界で常套的な任意の手段によって製造できる。これらの方法のいずれかによって製造された、本明細書中に開示されたＤＮＡ配列の生物学的に機能性の同等物は、それによってコード化されたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、実施例に記載の方法を用いてアッセイすることによって選択できる。
【００６７】
遺伝子コードの縮退のために、即ち、タンパク質中に自然に生じる殆どのアミノ酸に対して１以上のコドンが存在するために、本発明のＤＮＡと本質的に同じ遺伝子情報を含有し、配列番号：１又は４のヌクレオチド配列によってコード化されたアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコード化している他のＤＮＡ（及びＲＮＡ）配列は、本発明の実施に用いることができる。この原理は、本明細書中で検討している他のヌクレオチド配列のいずれにも同様に適用される。
【００６８】
本発明のＤＮＡの生物学的に機能性の同等形態はまた、特定の宿主細胞中での発現を増加させるために設計された合成ＤＮＡを含む。宿主細胞は、しばしば、コドン利用の好ましいパターンを示し、それ故、特定の宿主細胞中での発現を増加させるように設計された合成ＤＮＡは、宿主細胞中でのコドンの利用パターンを反映しているはずである。
【００６９】
本発明で有用な配列番号：１又は４のＤＮＡの他の生物学的に機能性の同等形態は、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との接合体をコード化するように修飾され、それによってそれらとの融合生成物をコード化したものを含む。
【００７０】
配列番号：２等の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列の一つの実施形態は、配列番号：１又は４に示されているが、本発明は、配列番号：１又は４の配列及びその相補的な配列にハイブリダイズし、本発明の抗真菌性タンパク質と同じ又は類似の抗真菌活性を有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコード化しているヌクレオチド配列も含むと理解すべきである。このようなヌクレオチド配列は、中〜高緊縮条件下で、配列番号：１若しくは４、又はその相補的配列にハイブリダイズすることが好ましい。
【００７１】
もし、上記のヌクレオチド配列が、配列番号：２の抗真菌効果と約２５％以下の差の抗真菌効果を有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコード化しているならば、それらは、配列番号：１又は４のＤＮＡと実質的に同等な生物学的機能を有していると考えられる。
【００７２】
ベクター及び宿主系
本発明の他の目的は、配列番号：１又は４に示される核酸配列を含有するベクターを提供することである。生物学的に活性なＭＡＦＰ１を発現させるために、ＭＡＦＰ１又は生物学的に機能性の同等物をコード化する核酸配列は、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含んでいるベクター中に挿入され得る。本発明によれば、当業者に周知の方法を用いて、ＭＡＦＰ１をコード化する配列及び適切な転写及び翻訳制御要素を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子組み換えを含む。ベクターは通常、用いる特定の宿主細胞中で機能性となるように選択される（即ち、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こり得るように、ベクターは宿主細胞装置（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）と適合している）。
【００７３】
本発明の別の目的は、配列番号：１若しくは４で示される核酸配列又はその配列を含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供することである。本発明によれば、多数の宿主系を利用して、ＭＡＦＰ１をコード化する配列を含有し、発現させることができる。そのような宿主系及び発現ベクターとしては、以下のものに限定されないが、組み換え型バクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌；酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；ウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター又は細菌発現ベクターに感染した植物細胞系；及び動物細胞系が挙げられる。ベクターを構築し、ＭＡＦＰ１をコード化する核酸配列をベクターの適切な部位に挿入した後、完成されたベクターを、増幅及び／又はポリペプチド発現のために好適な宿主細胞中に挿入することができる。ＭＡＦＰ１タンパク質の発現ベクターの選択された宿主細胞中への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、マイクロ・インジェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション等を含む周知の方法によって達成することができる。選択された方法は、部分的に、用いる宿主細胞の種類の機能となるであろう。宿主細胞は、適切な条件下で培養されたときに、ＭＡＦＰ１タンパク質を合成することができ、その後、（宿主細胞がＭＡＦＰ１タンパク質を培地中に分泌する場合には）ＭＡＦＰ１タンパク質は培地から回収でき、（培地中に分泌されない場合には）ＭＡＦＰ１を製造する宿主細胞から直接回収できる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性にとって望ましい又は必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化等）、及び生物学的に活性な分子中への組み込みの容易さ等の種々のファクターに依存する。
【００７４】
有用性
本発明によれば、驚くべきことに、ＭＡＦＰ１タンパク質が分泌性のタンパク質であり、病原性真菌の増殖を効果的に阻害できることを見出した。従って、本発明のＭＡＦＰ１タンパク質は、動物、植物又は微生物の真菌性疾病の治療、抑制及び／又は予防に用いることができる。抗真菌性タンパク質を被験者に投与することによって、又は抗真菌性タンパク質をコード化するＤＮＡ分子を含むベクターによって被験者を形質転換することによって、被験者中のコード化された抗真菌性タンパク質を発現させる抗真菌性タンパク質を直接使用して、真菌性疾病に対する保護を提供することができる。
【００７５】
本発明の抗真菌性タンパク質の用途に加え、本明細書中で意図されている核酸配列も、多様な他の用途を有している。例えば、これらの核酸配列もまた、核酸ハイブリダイゼーションの実施形態のプローブ又はプライマーとしての有用性を有する。そのようなものとして（ａｓ ｓｕｃｈ）、配列番号：１又は４の１４個のヌクレオチド長の連続したＤＮＡセグメントと同じ又はそれに相補的な、少なくとも１４個のヌクレオチド長の連続配列からなる配列領域を含む核酸セグメントには、特別な有用性が見出されるであろう。同一又は相補的な、より長い連続配列、例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００ｂｐ等のもの（４０９個の塩基対の中間の長さ及び４０９個までの長さを有する全ての中間体を含む、かつ４０９個の塩基対からなる全長の配列を含む）も、特定の実施形態において用いられるであろう。
【００７６】
そのような核酸プライマーが配列をコード化する抗真菌性タンパク質を特異的に増幅又はそれにハイブリダイズする能力は、所定の検体中の配列をコード化する抗真菌性タンパク質の存在を検出する用途に、核酸プライマーを用いることを可能にするであろう。しかしながら、他の遺伝子構築物の製造における用途のための突然変異種又はプライマーの製造のための配列情報の利用を含む他の用途が考えられる。
【００７７】
抗真菌性組成物
本発明はまた、特に、真菌性疾病を治療、抑制及び／又は予防のために、本発明の抗真菌性タンパク質を含む抗真菌性組成物を提供する。この組成物は、好適なキャリア、希釈剤、溶媒、不活性物質又は他の添加剤を含んでいてもよく、任意に、他の抗真菌活性物質、賦形剤、補助剤（ａｕｘｉｌｉａｒｉｅｓ）、肥料又は成長調節剤を含んでいてもよい。
【００７８】
本発明の抗真菌性組成物は、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠形成（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、粉末化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）及び／又は凍結乾燥工程を含む当業界で公知の方法で製造されてもよい。
【００７９】
抗真菌性組成物は、以下に限られないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、直腸内手段を含む多数の経路によって動物に投与することによって、又は標準的な農業技術（例えば、スプレー又は種子処理）を用いて組成物が真菌性病原体と接触するように、組成物を植物、又は植物の環境に直接適用することによって病原性真菌の増殖阻害又は殺傷するために用いることができる。
【００８０】
先に述べたように、より広い抗真菌スペクトルを提供するように、即ち、追加的な病原体を抑制する、又は同じ真菌性病原体の抑制のための多角的な作用様式を与えるように、本発明の抗真菌性タンパク質は、抗真菌活性を示す他のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む、他の抗真菌性試薬と組み合わせて使用することができる。
【００８１】
また、本明細書中で意図されている抗真菌性組成物は、本発明の抗真菌性ポリペプチドを製造しうる細菌及び真菌細胞のような宿主細胞の形態のものも含む。
【００８２】
トランスジェニック生物
このようにして単離されたｃＤＮＡは、宿主細胞中に導入するための適切な形質転換／発現ベクターに移送することができる。さらに別の態様では、本発明の抗真菌性遺伝子は、本発明の新規な抗真菌性タンパク質をコード化する核酸セグメントを発現するトランスジェニック生物を製造するために用いることができる。トランスジェニック生物の製造方法は、マイクロインジェクション又は遺伝子組換えベクターによる感染等、当業界で周知である。一般に、この方法は、ＭＡＦＰ１抗真菌性タンパク質をコード化するコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを含有するＤＮＡセグメントによる好適な宿主細胞の形質転換を含む。このようなコード領域は、一般に、転写終結領域に作動可能に連結されており、それによってプロモーターは細胞内のコード領域の転写を駆動することができ、従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えタンパク質を製造する能力を与えることができる。
【００８３】
トランスジェニック生物は、本明細書中に開示された新規な抗真菌性タンパク質の１以上をコード化する遺伝子又は遺伝子セグメントを発現することができる。植物細胞等の好適な宿主細胞を配列番号：２のようなＭＡＦＰ１抗真菌性ポリペプチドをコードする組換え核酸配列によって形質転換することで、コード化された抗真菌性タンパク質の発現によって、真菌に対する抵抗性を示す生物を作り出すことができる。本明細書で用いているように、語句「トランスジェニック生物」とは、おそらく普通には存在しない遺伝子に限らず、ＲＮＡに通常は転写されないか、タンパク質に翻訳されない（「発現されない」）ＤＮＡ配列、又は形質転換されていない生物中には通常存在しないが、遺伝子組み換え若しくは異なる発現のいずれかが望まれる遺伝子等の、形質転換されていない生物中に導入されることが望まれる任意の他の遺伝子又はＤＮＡ配列がを組み込まれた生物をいうことが意図されている。
【００８４】
１より多いトランス遺伝子が、形質転換された宿主植物細胞のゲノム中に組み込まれるであろう。そのような場合、１より多いＭＡＦＰ１抗真菌性タンパク質コード化ＤＮＡセグメントが、そのような生物のゲノム中に組み込まれる。ある状況では、１、２、３、４又はそれ以上の抗真菌性タンパク質（野生型又は組換え技術によって作られたかのいずれか）が組み込まれることが望ましく、形質転換されたトランスジェニック生物中で安定して発現されることが望ましい。
【００８５】
また、他のＤＮＡセグメントをトランスジェニック生物のゲノム中に組み込むことが望ましく、その場合、そのようなＤＮＡは、開示された抗真菌性タンパク質とは非相同の他の抗真菌性タンパク質又は生物の生産物の質若しくは性能を改善する種々の他のタンパク質をコード化する。従って、ＤＮＡによってコード化された他の種類のタンパク質としては、抗細菌性、抗ウイルス性又は殺虫性タンパク質が挙げられる。
【００８６】
トランスジェニック生物は、非ヒト哺乳類、植物又は微生物等の任意の使い勝手の良い生物であってよい。例えば、実験室試験操作に用いるような、齧歯類（例えば、マウス又はラット）；及び例えば、イネ、ジャガイモ及びタバコ等の農業に用いるような生物である。しかしながら、本発明が、ＭＡＦＰ１が阻害効果を示す菌類に感染しやすいいずれの生物にも適用できることは自明であろう。
【００８７】
プライマー
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーを用いることが有利である。そのようなプライマーの配列は、ＰＣＲ法に用いるための抗真菌性タンパク質遺伝子の特定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）セグメントを検出、増幅又は突然変異させるために設計される。ＰＣＲ用のプライマー及びハイブリダイゼーション・スクリーニング用のプローブは、配列番号：１又は４に示されるＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。プライマーは、二量体形成を防止するために、自己相補的な配列も、それらの３’末端の相補的配列も有しないことが好ましい。プライマーは、制限部位を含んでいてもよい。プライマーは、ＤＮＡにアニーリングされ、十分な回数のＰＣＲを実施することにより、ゲル電気泳動及び染色によって容易に可視化される生成物を得る。プライマーは、一般に少なくとも１４個、通常少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２４個、より好ましくは少なくとも２８個のヌクレオチド長を有する。そのようなプライマーは、配列番号：２と同じ若しくは類似の抗真菌活性を有する抗真菌性ポリペプチド又はタンパク質をコード化する遺伝子を特異的にプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）することができるであろう。他の種由来の関連する抗真菌性タンパク質遺伝子のセグメントも、このようなプライマーを用いたＰＣＲによって増幅することができる。増幅された断片は、精製され、適切なベクター中に挿入され、当業界で公知の常套手段によって増殖され得る。
【実施例】
【００８８】
下記実施例は、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供されている。たとえそうであっても、本明細書中で検討されている実施形態における修飾及び変更が、本発明的発見の精神又は範囲から逸脱することなく当業者によって為され得るので、実施例は、本発明を不当に限定して解釈されるべきではない。
【００８９】
材料
以下の実施例で用いるＭｏｎａｓｃｕｓ株は、台湾のＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）に保存されているＭｏｎａｓｃｕｓ株である：Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ（ＢＣＲＣ ３８０７２、ＢＣＲＣ ３８０９３及びＢＣＲＣ３１５０２）、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ（ＢＣＲＣ ３３３０９）、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ（ＢＣＲＣ ３３３１０）、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ（ＢＣＲＣ ３３６４０）、Ｍ．ｒｕｂｅｒ（ＢＣＲＣ ３１５３４、ＢＣＲＣ ３１５２３、ＢＣＲＣ ３１５３５、ＢＣＲＣ ３３３１４、ＢＣＲＣ ３３３２３及びＢＣＲＣ ３１５３３）、Ｍ．ｋａｏｌｉａｎｇ（ＢＣＲＣ ３１６０５＝ＣＢＳ ３０２．７８）、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ（ＢＣＲＣ ３１５４１＝ＡＴＣＣ １６３７９、ＢＣＲＣ ３３３２５＝ＩＦＯ ３０８７３、ＢＣＲＣ ３１６１５＝ＤＳＭ １３７９、ＢＣＲＣ ３１４９９＝ＡＴＣＣ １６３６０＝ＡＴＣＣ ２６３１１及びＢＣＲＣ ３１５４２＝ＡＴＣＣ １６３６５＝ＡＴＣＣ １６４２６）、及びＭ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ（ＢＣＲＣ ３３４４６＝ＡＴＣＣ ２００６１３から選択する。
【００９０】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株又は単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１の抗真菌活性を試験するための真菌株は、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉ（ＢＣＲＣ ３５００４）及びＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ（ＢＣＲＣ ３３１７４）から選択される。
【００９１】
真菌株を、ＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天、Ｄｉｆｉｃｏ Ｃｏ．）培地皿上に接種し、２５℃で７〜１４日間培養した。
【００９２】
実施例１
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子の分布
種々のＭｏｎａｓｃｕｓ種にｍａｆｐ１遺伝子（配列番号：１）が存在するか否かを明らかにするために、ｍａｆｐ１遺伝子を増幅するためのプライマーを、プライマー設計ソフトウエア（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ）Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ）を用いて設計した。プライマーは、次の３つのグループに組み合わされた：（１）プライマーＨ１６０−５Ｆ（配列番号：６）とプライマーＨ１６０−３Ｒ（配列番号：７）、これらはｍａｆｐ１遺伝子の全長配列の増幅に用いることができる；（２）プライマーＨ１６０−５Ｓ（配列番号：８）とプライマーＨ１６０−３Ｒ、これらはプロペプチド及び成熟ＭＡＦＰ１領域を含む配列をコード化するヌクレオチド配列の増幅に用いることができる；及び（３）プライマーＨ１６０−５Ｐ（配列番号：９）とプライマーＨ１６０−３Ｒ、これらは成熟ＭＡＦＰ１領域を含む配列をコード化するヌクレオチド配列の増幅に用いることができる。
【００９３】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株をＹＭ培地（グリセロール７％、グルコース３％、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム）３％、ポリペプトン１．２％、ＮａＮＯ３ ０．２％及びＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１％、ｐＨ６．０）中、２５℃で９日間培養した。真菌体及び培養液を３Ｍフィルター膜による真空濾過によって分離した。好適量の真菌体を用いた従来のフェノール抽出法によって真菌の染色体ＤＮＡを得た。
【００９４】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子の存在を試験するために、前述の３つのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を実施した。Ｍｏｎａｓｃｕｓ株から得られた染色体ＤＮＡ １００ｎｇをＰＣＲテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応溶液は、１０ｎＭ ｄＮＴＰ ０．２μＬ、１０×ＰＣＲバッファー２．５μＬ、前方のプライマー及び逆のプライマー５ピコモル、及びＴａｑ酵素５単位を含む。ｍａｆｐ１遺伝子を増幅するためのＰＣＲ条件は、（１）９４℃、５分間；（２）９４℃で４０秒間を３０回、５５℃で４０秒間及び７２℃で３０秒間；（３）７２℃で３分間；及び（４）４℃で保持した。ＰＣＲ増幅の結果を表１に示す。
【表１】
【００９５】
結果は、ｍａｆｐ１遺伝子が、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ ＢＣＲＣ ３３３０９、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ ＢＣＲＣ ３３３１０、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ ＢＣＲＣ ３３６４０、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ（ＢＣＲＣ ３８０７２、ＢＣＲＣ ３８０９３及びＢＣＲＣ ３１５０２）及びＭ．ｒｕｂｅｒ（ＢＣＲＣ ３１５２３、ＢＣＲＣ ３１５３３、ＢＣＲＣ ３１５３４、ＢＣＲＣ ３１５３５、ＢＣＲＣ ３３３１４及びＢＣＲＣ ３３３２３）中に存在することを示した。Ｍ．ｋａｏｌｉａｎｇ ＢＣＲＣ ３１５０６、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ（ＢＣＲＣ ３１４９９、ＢＣＲＣ ３１５４２、ＢＣＲＣ ３１５４１、ＢＣＲＣ ３１６１５及びＢＣＲＣ ３３３２５）及びＭ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ ＢＣＲＣ ３３４４６にはｍａｆｐ１遺伝子は見出されない。Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ及びＭ．ｒｕｂｅｒ等のＭｏｎａｓｃｕｓ種が抗真菌活性を有していることが示唆されている。
【００９６】
実施例２
ｍａｆｐ１遺伝子と各種のＭｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子のｃＤＮＡとの配列比較
ｍａｆｐ１遺伝子のクローニング及び配列決定
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株をＹＭ培地（グリセロール７％、グルコース３％、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム）３％、ポリペプトン１．２％、ＮａＮＯ３ ０．２％及びＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１％、ｐＨ６．０）中、２５℃で９日間培養した。３Ｍフィルター膜による真空濾過によって、真菌体と培養液を分離した。好適量の真菌体を用いる従来のフェノール抽出法によって真菌の染色体ＤＮＡを得た。プライマーＨ１６０−５Ｆ及びＨ１６０−３Ｒを用いてＰＣＲ増幅を実施した。Ｍｏｎａｓｃｕｓ株から得られた染色体ＤＮＡ １００ｎｇを、ＰＣＲテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応溶液は、１０ｎＭ ｄＮＴＰ ０．２μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、前方プライマー及び後方プライマー５ピコモル及びＴａｑ酵素５単位を含む。ｍａｆｐ１遺伝子を増幅するためのＰＣＲ条件は、（１）９４℃、５分間；（２）９４℃、４０秒間を３０サイクル、５５℃、４０秒間及び７０℃３０秒間；（３）７２℃３分間；及び（４）４℃に保持である。ｍａｆｐ１遺伝子の全長配列のうちのＰＣＲ増幅されたヌクレオチド断片を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを配列決定のために抽出した。
【００９７】
ｍａｆｐ１ ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定
Ｍｏｎａｓｃｕｓ株を、ＹＭ培地（グリセロール７％、グルコース３％、ＭＳＧ（Ｌ−グルタミン酸１ナトリウム）３％、ポリペプトン１．２％、ＮａＮＯ３ ０．２％及びＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．１％、ｐＨ６．０）中、２５℃で９日間培養した。３Ｍフィルター膜による真空濾過によって真菌体と培養液を分離した。好適量の真菌体を用いるＲｉｂｏＰｕｒｅ（登録商標）−酵母キット（Ａｍｂｉｏｎ）によって真菌の全ＲＮＡを得た。Ｉｍｐｒｏｍ−ＩＩ（登録商標）逆転写系（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて最初のｃＤＮＡ鎖を製造した。ｍａｆｐ１遺伝子の特定のプライマー対（Ｈ１６０−５Ｆ及びＨ１６０−３Ｒ）をＰＣＲに用いて、全長のｍａｆｐ１のｃＤＮＡ断片を増幅した。好適量の最初のｃＤＮＡ鎖をＰＣＲテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応溶液は、１０ｎＭ ｄＮＴＰ ０．２μＬ、１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、Ｈ１６０−５Ｆ及びＨ１６０−３Ｒ ５ピコモル及びＴａｑ酵素５単位を含む。ｍａｆｐ１ ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ条件は、（１）９４℃、５分間；（２）９４℃、４０秒間、５５℃、４０秒間を３０サイクル及び７２℃、１分間；（３）７２℃、３分間；及び（４）４℃で保持である。増幅されたＰＣＲ産物を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを配列決定のために抽出した。
【００９８】
ｍａｆｐ１遺伝子と各種のＭｏｎａｓｃｕｓ種中のｍａｆｐ１遺伝子のｃＤＮＡとの配列比較結果を表２に示した。
【表２】
【００９９】
結果は、ｍａｆｐ１遺伝子並びにＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３１５０２及びＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５３３中のｍａｆｐ１遺伝子のｃＤＮＡの配列は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２のそれらに対して１００％の配列類似性を有することを示した。これらのＭｏｎａｓｃｕｓ株全部が同じｍａｆｐ１遺伝子を有しており、転写されたｍＲＮＡが同じであることがわかる。これらの株は同じＭＡＦＰ１タンパク質を製造できると結論付けられる。
【０１００】
実施例３
病原体対峙培養アッセイ
Ｍｏｎａｓｃｕｓ真菌の抗真菌活性を確認するために、２種類のＭｏｎａｓｃｕｓ種（Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２及びＢＣＲＣ ３８０９３）の円形真菌ブロック（直径０．５ｃｍ）と、病原性真菌（Ｈ．ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４）とをＰＤＡ皿の両側に置き、２８℃で培養した。病原性真菌の増殖阻害を観察した。この予備的な結果は、両方の株が、Ｈ．ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４の増殖を阻害できることを示した。
【０１０１】
Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３は、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２の突然変異体である。（表２に示されるように）それらは同じｍａｆｐ１配列を有し、同じ抗真菌活性を有する。Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３を、以下の精製実施例に用いた。
【０１０２】
実施例４
Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質（ＭＡＦＰ１）の精製、Ｎ−末端配列決定、及び抗真菌活性アッセイ
ＭＡＦＰ１の精製
Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０９３の、２５℃、９日間培養後の培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ）４００ｍＬを、０．２２μｍのフィルター膜を用いて、４，５００ｒｐｍで遠心分離して、不純物を除去した。３０ｋＤａのフィルター膜を用いて遠心分離された培養液を処理し（ｐｒｏｃｅｓｓ）、３０ｋＤａより小さい分子を含む溶液を回収し、ｐＨ６．６に調整した。ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）樹脂１０ｍＬとタンパク質溶液４０ｍＬとを、室温で１６時間混合した。この混合物を空のクロマトグラフィーカラムに充填した。結合していないタンパク質を洗い出した。このカラムを、溶液Ａ（１０ｍＭ ナトリウム−リン酸緩衝液中２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）１００ｍＬで溶出し、溶液Ａ及び溶液Ｂ（１０ｍＭ ナトリウム−リン酸緩衝液中１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）の異なる割合からなる溶液を用いてタンパク質を溶出した。溶液Ａの濃度勾配は、９５％から、８０％、７５％、５０％、０％までであった。それぞれの濃度勾配に対して溶液１００ｍＬを使用し、溶出画分を１５ｍＬの試験管に別々に分けた。
【０１０３】
それぞれの試験管からの溶液１ｍＬを、ＴＣＡで沈殿させ、ＳＤＳＡ−ＰＡＧＥで分析した。ＭＡＦＰ１タンパク質の分子量は約７０ｋＤａである。ＭＡＦＰ１タンパク質を含有する溶液を、１つの試験管中に貯めた。この溶液を３ｋＤａのフィルター膜によって低いスピード（２，０００ｒｐｍ）で遠心分離した。３ｋＤａより大きいタンパク質を含有する溶液を集め、濃縮し、１ｋＤａのフィルター膜によって脱塩した。精製されたＭＡＦＰ１タンパク質を、病原体拮抗アッセイ及びタンパク質Ｎ−末端配列決定に用いた。
【０１０４】
Ｎ−末端配列決定
精製されたＭＡＦＰ１溶液をＴＣＡで沈殿させ、１５％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。異なる濃度のリゾチームをタンパク質の定量基準として用いた。電気泳動後、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に移し、０．１％クマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０）で染色した（図３参照）。ＭＡＦＰ１タンパク質のバンドを切り出し、メタノールで脱色した。ｄｄＨ２Ｏで膜を何回も洗浄し、暗所で乾燥させた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｃｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ４９４を用いて、処理されたＭＡＦＰ１タンパク質のＮ−末端配列を決定した。
【０１０５】
精製されたＭＡＦＰ１タンパク質のＮ−末端配列決定結果は、精製されたＭＡＦＰ１タンパク質のＮ−末端が、ＬＳＫＹＧＧＥＣＳＬＱＨＮＴＣ（配列番号：５）であることを示した。精製されたタンパク質のＮ−末端配列決定は、ＭＡＦＰ１タンパク質（配列番号：３）の成熟形態の最初の１５個のアミノ酸配列と一致している。精製されたタンパク質はＭＡＦＰ１タンパク質の成熟形態であることが証明された。
【０１０６】
抗真菌活性アッセイ
病原体拮抗投与量アッセイを実施し、精製したＭＡＦＰ１タンパク質の抗真菌活性を確認した。病原性真菌（Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉｉ ＢＣＲＣ ３３１７４及びＨ．ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４）の真菌区画（ｂｌｏｃｋ）をＰＤＡ皿の中央に置いた。各濃度のＭＡＦＰ１溶液（精製したＭＡＦＰ１タンパク質を０μｇ〜０．８μｇ含有する）の６ｍｍのペーパーディスクを、病原性真菌の真菌区画の周りに置いた。皿を２８℃で培養し、病原性真菌の増殖阻害を観察した。結果を図４に示した。結果は、ＭＡＦＰ１タンパク質０．２μｇで、Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉｉの増殖を有意に抑制できることを示した。また、結果は、ＭＡＦＰ１タンパク質０．４μｇで、Ｈ．ｐａｎｉｃｉの増殖を有意に阻害できることを示した。ＭＡＦＰ１の濃度が高ければ高いほど、病原性真菌の増殖を阻害する活性が強いことが観察された。Ｍｏｎａｓｃｕｓ種由来のＭＡＦＰ１タンパク質は、抗真菌活性を有するタンパク質であり、Ｐ．ｖａｒｉｏｔｉｉ等のヒトの病原体及びＨ．ｐａｎｉｃｉ等の植物の病原体の増殖を阻害できることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２の全ゲノム配列及びユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）データベースを探索することによって得られる抗真菌性タンパク質遺伝子及びそのｃＤＮＡ配列に関する。前記遺伝子は抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１をコード化することができる。Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ培養培地から得られる分子量約７ｋＤａの精製されたタンパク質は、Ｎ−末端タンパク質配列決定及び比較分析によってＭＡＦＰ１と同定される。精製されたＭＡＦＰ１タンパク質は、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ ＢＣＲＣ ３３１７４及びＨｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉ ＢＣＲＣ ３５００４等の病原体の増殖を阻害できる。さらに、ＰＣＲ試験によってこの抗真菌性タンパク質の遺伝子が、Ｍ．Ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍ．ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ、及びＭ．ｒｕｂｅｒ等の他のＭｏｎａｓｃｕｓ種に存在していることがわかる。また、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓ（ＢＣＲＣ ３８０７２、ＢＣＲＣ ３８０９３及びＢＣＲＣ ３１５０２）及びＭ．ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５３３の、４種類のＭｏｎａｓｃｕｓ株中のｍａｆｐ１遺伝子及びそのｃＤＮＡが、同じＤＮＡ配列を有していることが証明されている。
【０１０８】
本発明によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られた単離・精製された抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１、それをコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチド及びそれをコード化する組み換えベクターのヌクレオチド配列、並びにその組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞が提供される。
【０１０９】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質を含む抗真菌性組成物が提供される。
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質を用いる植物の真菌性疾病を抑制する方法が提供される。
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子がそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック生物が提供される。
【０１１０】
本発明によれば、本発明の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅し得る、単離・精製されたプライマー対、及びそれを含むＰＣＲアッセイキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１のアミノ酸配列を示す。シグナル・ペプチド；プロペプチド；及び成熟タンパク質のそれぞれの領域を、下線を付して示す。
【図２】図２は、Ｍ．ｐｉｌｏｓｕｓの抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１、Ａ．ｇｉｇａｎｔｅｕｓのＡＦＰタンパク質、及びＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのＰＡＦタンパク質の、（Ａ）成熟領域及び（Ｂ）全長の配列アラインメントを示す。網掛けで示した領域は３種又は２種のタンパク質の間で同一のアミノ酸残基を示す。
【図３】図３は、精製されたＭｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１はタンパク質マーカー；レーン２は精製されたＭＡＦＰ１タンパク質である。
【図４】図４は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ抗真菌性タンパク質ＭＡＦＰ１の抗真菌活性アッセイを示す。病原性新菌であるＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ（ＢＣＲＣ ３３１７４）及びＨｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｉｃｉ（ＢＣＲＣ ３５００４）に対する精製されたＭＡＦＰ１タンパク質の抗真菌能を、対峙培養によって検討し、真菌類の増殖を観察した。（−）ＭＡＦＰ１：ＭＡＦＰ１無しの対照群；（＋）ＭＡＦＰ１：各種の量のＭＡＦＰ１タンパク質による実験群。Ａ〜Ｈはそれぞれ、ＭＡＦＰ１タンパク質０．４μｇ、０．２μｇ、０．１μｇ、０．０５μｇ、０μｇ、０．８μｇ、０．６４μｇ及び０．３２μｇのペーパーディスクを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られる単離・精製された抗真菌性タンパク質又は生物学的に機能性のその同等物。
【請求項２】
前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ種が、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ及びＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒからなる群から選択される、請求項１に記載の抗真菌性タンパク質。
【請求項３】
前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ ＢＣＲＣ ３３３０９であり、
前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ ＢＣＲＣ ３３３１０であり、前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ ＢＣＲＣ ３３６４０であり、前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２、 ＢＣＲＣ ３８０９３又はＢＣＲＣ ３１５０２であり、及び前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５２３、ＢＣＲＣ ３１５３３、ＢＣＲＣ ３１５３４、ＢＣＲＣ ３１５３５、ＢＣＲＣ ３３３１４又はＢＣＲＣ ３３３２３である請求項２に記載の抗真菌性タンパク質。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：３若しくは配列番号：５のアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質、又は生物学的に機能性のその同等物。
【請求項５】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号：１又は配列番号：４のヌクレオチド配列；
ｂ）ａ）の縮退配列；
ｃ）ａ）又はｂ）の相補配列；及び
ｄ）高緊縮条件下でａ）〜ｃ）のいずれかにハイブリダイズするヌクレオチド配列
からなる群から選択される請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５に記載の単離・精製されたヌクレオチド配列を含む遺伝子組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクター又は請求項５に記載の単離・精製されたヌクレオチド配列を含む遺伝子組み換え宿主細胞。
【請求項９】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質、及び好適なキャリアを含む抗真菌性組成物であって、該タンパク質が、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で提供されることを特徴とする抗真菌性組成物。
【請求項１０】
追加的な抗真菌剤を含む請求項９に記載の抗真菌性組成物。
【請求項１１】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質を、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で、植物に適用することを含む植物真菌の抑制方法。
【請求項１２】
前記抗真菌性タンパク質が請求項９に記載の組成物によって提供される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するＤＮＡ分子を含むベクターによって植物細胞を形質転換し、コード化された抗真菌性タンパク質を、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で発現させることによって前記抗真菌性タンパク質が提供される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
真菌性疾病を治療するための医薬品の製造のための、請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質の使用。
【請求項１５】
前記抗真菌性タンパク質が、請求項９に記載の組成物によって提供される請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子が、そのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック生物。
【請求項１７】
前記生物が植物若しくはその子孫又はその植物由来の種子である請求項１６に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１８】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅することができる単離・精製されたプライマー対であって、該プライマーの配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８及び配列番号：９からなる群から選択される配列のうちの少なくとも８個のヌクレオチドを含むことを特徴とする単離・精製されたプライマー対。
【請求項１９】
請求項１８に記載のプライマー対を含むＰＣＲアッセイキット。
【請求項１】
Ｍｏｎａｓｃｕｓ種から得られる単離・精製された抗真菌性タンパク質又は生物学的に機能性のその同等物。
【請求項２】
前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ種が、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ及びＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒからなる群から選択される、請求項１に記載の抗真菌性タンパク質。
【請求項３】
前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｂａｒｋｅｒｉｓ ＢＣＲＣ ３３３０９であり、
前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ ＢＣＲＣ ３３３１０であり、前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ ＢＣＲＣ ３３６４０であり、前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ ＢＣＲＣ ３８０７２、 ＢＣＲＣ ３８０９３又はＢＣＲＣ ３１５０２であり、及び前記Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ株がＭｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｅｒ ＢＣＲＣ ３１５２３、ＢＣＲＣ ３１５３３、ＢＣＲＣ ３１５３４、ＢＣＲＣ ３１５３５、ＢＣＲＣ ３３３１４又はＢＣＲＣ ３３３２３である請求項２に記載の抗真菌性タンパク質。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：３若しくは配列番号：５のアミノ酸配列を含む抗真菌性タンパク質、又は生物学的に機能性のその同等物。
【請求項５】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む単離・精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号：１又は配列番号：４のヌクレオチド配列；
ｂ）ａ）の縮退配列；
ｃ）ａ）又はｂ）の相補配列；及び
ｄ）高緊縮条件下でａ）〜ｃ）のいずれかにハイブリダイズするヌクレオチド配列
からなる群から選択される請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５に記載の単離・精製されたヌクレオチド配列を含む遺伝子組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクター又は請求項５に記載の単離・精製されたヌクレオチド配列を含む遺伝子組み換え宿主細胞。
【請求項９】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質、及び好適なキャリアを含む抗真菌性組成物であって、該タンパク質が、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で提供されることを特徴とする抗真菌性組成物。
【請求項１０】
追加的な抗真菌剤を含む請求項９に記載の抗真菌性組成物。
【請求項１１】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質を、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で、植物に適用することを含む植物真菌の抑制方法。
【請求項１２】
前記抗真菌性タンパク質が請求項９に記載の組成物によって提供される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するＤＮＡ分子を含むベクターによって植物細胞を形質転換し、コード化された抗真菌性タンパク質を、真菌性疾病に対する保護を提供するのに十分な量で発現させることによって前記抗真菌性タンパク質が提供される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
真菌性疾病を治療するための医薬品の製造のための、請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質の使用。
【請求項１５】
前記抗真菌性タンパク質が、請求項９に記載の組成物によって提供される請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するトランス遺伝子が、そのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック生物。
【請求項１７】
前記生物が植物若しくはその子孫又はその植物由来の種子である請求項１６に記載のトランスジェニック生物。
【請求項１８】
請求項１又は４に記載の抗真菌性タンパク質をコード化するヌクレオチドを増幅することができる単離・精製されたプライマー対であって、該プライマーの配列が配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８及び配列番号：９からなる群から選択される配列のうちの少なくとも８個のヌクレオチドを含むことを特徴とする単離・精製されたプライマー対。
【請求項１９】
請求項１８に記載のプライマー対を含むＰＣＲアッセイキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１６１１７９（Ｐ２００８−１６１１７９Ａ）
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１７３９４（Ｐ２００７−２１７３９４）
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５９６０３２６９４）財団法人食品工業発展研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５９６０３２６９４）財団法人食品工業発展研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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