抗ＰｉｒＢ抗体
本開示は一般に神経発生及び神経障害に関する。本開示は、特に、ミエリン関連阻害系の新規な修飾因子の同定と、そのようにして同定された修飾因子の様々な用途に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に神経発生及び神経障害に関する。本発明は、ミエリン関連阻害系の新規な修飾因子の同定及びそのようにして同定された修飾因子の様々な用途に特に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミエリン及びミエリン関連タンパク質
成体哺乳動物のＣＮＳニューロンの軸索は傷害後に再生する能力が非常に限られている一方、末梢神経系（ＰＮＳ）の軸索は迅速に再生することが知られている。ＣＮＳニューロンの限られた再生能力は部分的にはＣＮＳ軸索の本来の性質によるが、また許容できない環境のためでもあることが知られている。ＣＮＳミエリンは、神経突起成長のための阻害キューの唯一のソースではないが、軸索成長を活発にブロックする多くの阻害性分子を含んでおり、よって再生に対する重要な障壁を構成している。３種のこのようなミエリン関連タンパク質（ＭＡＰｓ）が同定されている：Ｎｏｇｏ（ＮｏｇｏＡとしてもまた知られている）は２つの膜貫通ドメインを有するＲｅｔｉｃｕｌｏｎファミリータンパク質のメンバーである；ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）はＩｇスーパーファミリーの膜貫通タンパク質である；及びＯＭｇｐはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを持つロイシンに富む反復配列（ＬＲＲ）タンパク質である。Chen等, Nature 403:434-39 (2000); GrandPre等, Nature 417:439-444 (2000); Prinjha等, Nature 403:383-384 (2000); McKerracher等, Neuron 13:805-11 (1994); Wang等, Nature 417:941-4 (20020: Kottis等 J. Neurochem 82:1566-9 (2002)。ＮｏｇｏＡの一部のＮｏｇｏ６６は、Ｎｏｇｏの３種全てのアイソフォーム中に見出される６６アミノ酸の細胞外ポリペプチドとして記述されている。
【０００３】
その構造的な差異にもかかわらず、（Ｎｏｇｏ６６を含む）３種全ての阻害性タンパク質は、Ｎｏｇｏレセプター（ＮｇＲ；Ｎｏｇｏレセプタ−１又はＮｇＲ１としても知られている）と呼ばれる同じＧＰＩアンカーレセプターに結合することが示されており、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐの阻害作用の媒介にＮｇＲが必要とされているかも知れないことが提案されている。Fournier等, Nature 409: 341-346 (2001)。２種のＮｇＲ１ホモログ（ＮｇＲ２及びＮｇＲ３）もまた同定されている。２００５年３月３日公開のＵＳ２００５／００４８５２０Ａ１（Strittmatter等）。ＮｇＲはＧＰＩアンカー細胞表面タンパク質であることになったので、それが直接のシグナル伝達体であることはない（Zheng等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1205-1210 (2005)）。ニューロトロフィンレセプターｐ７５ＮＴＲがＮｇＲに対するコレセプターとして作用し、レセプター複合体中のシグナル伝達部分を提供することも示唆されている（Wang等, Nature 420:74-78 (2002)；Wong等, Nat. Neurosci. 5:1302-1308 (2002)）。
【０００４】
ＰｉｒＢ及びヒトオルソログ
主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩは、元々は免疫系に重要である分子ファミリーをコードする領域として元々は同定された。最近の証拠は、ＭＨＣクラスＩ分子が発達及び成体ＣＮＳにおいて更なる機能を有していることを示している。Boulanger及びShatz, Nature Rev Neurosci. 5:521-531 (2004)；２００３年９月１１日公開のＵＳ２００３／０１７０６９０（Shatz及びSyken）。ＭＨＣクラスＩメンバー及びその結合パートナーの多くがＣＮＳニューロン中に発現されることが見出されている。最近の遺伝子及び分子研究はＣＮＳ ＭＨＣクラスＩの生理学的機能に焦点を当てており、初期の結果は、ＭＨＣクラスＩ分子が、その間に既存のシナプス結合の強さがニューロン活動に応答して増加又は減少し、回路に長期間の構造的変化が続くプロセスである活動依存的シナプス可塑性に関与しているかも知れないことを示唆していた。更に、ＭＨＣクラスＩコード領域は神経学的徴候を有する広範囲の疾患に遺伝学的にまた関連しており、ＭＨＣクラスＩ分子の異常な機能は正常な脳発達及び可塑性の破壊に寄与すると考えられている。
【０００５】
免疫設定における既知のＭＨＣクラスＩレセプターの一つは、Kubagawa等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)によって最初に開示されたマウスポリペプチドのＰｉｒＢである。マウスＰｉｒＢは幾つかのヒトオルソログを有しており、これらは白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリーＢ（ＬＩＬＲＢ）のメンバーであり、「免疫グロブリン様転写物」（ＩＬＴｓ）とも称されている。ヒトオルソログは、最も高いものから最も低いものまで次の順：ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３、ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４でマウス配列と有意な相同性を示し、丁度ＰｉｒＢのように、全てが抑制性レセプターである。ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５（ＮＰ＿００６８５５）及びＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２（ＮＰ＿００６６６０）は最初にSamaridis及びColonna, Eur. J. Immunol. 27(3):660-665 (1997)によって記載された。ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３（ＮＰ＿００６８３１）は Borges等, J. Immunol. 159(11):5192-5196 (1997)によって同定された。ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４（ＭＩＲ１０としても知られている）は、Colonna等, J. Exp. Med. 186:1809-18 (1997)によって同定された。ＰｉｒＢとそのヒトオルソログは大きな度合いの構造可変性を示す。様々な選択的スプライシング型の配列がＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋから利用でき、例えばヒトＩＬＴ４ ｃＤＮＡに対する次の受託番号を含む：ＩＬＴ４−ｃ１１ ＡＦ００９６３４；ＩＬＴ４−ｃ１１７ ＡＦ１１５６６；ＩＬＴ４−ｃ１２６ ＡＦ１１５６５。上に記載したように、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドはＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）阻害性レセプターであり、免疫細胞活性化におけるその役割で知られている（上掲のKubagawa等；Hayami等, J. Biol. Chem. 272:7320 (1997)；Takai等, Immunology 115:433 (2005)；Takai等, Immunol. Rev. 181:215 (2001)；Nakamura等 Nat. Immunol. 5:623 (2004)；Liang等, Eur. J. Immunol. 32:2418 (2002)）。
【０００６】
Syken等（Science 313:1795-800 (2006)）による最近の研究では、ＰｉｒＢが脳全体のニューロンサブセット中に発現されることが報告されている。機能的ＰｉｒＢを欠く変異マウスでは、皮質眼球優位性（ＯＤ）可塑性が全ての年齢で有意に亢進され、視覚野における活動依存的可塑性の制限におけるＰｉｒＢの機能を示唆している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、機能ブロック性抗ＰｉｒＢ抗体を使用してＰｉｒＢ活性を妨げることがＮｏｇｏ６６及びミエリンによる神経突起の伸長阻害のレスキューを助けること、及びＰｉｒＢ及びＮｇＲ活性を同時にブロックすることでミエリン阻害からの略完全な解放に至ることに少なくとも部分的に基づいている。
【０００８】
一態様では、本発明は、ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体と同じヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）上のエピトープに本質的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に関する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体とヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）への結合について競合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に関する。
【００１０】
また他の態様では、本発明は、ＹＷ２５９．２重鎖（配列番号４又は１１）、ＹＷ２５９．９重鎖（配列番号５又は１２）、及びＹＷ２５９．１２重鎖（配列番号６又は１３）からなる群から選択される重鎖由来の一、二、又は三の高頻度可変領域配列を含む単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に関する。
【００１１】
ある実施態様では、抗体は、ＹＷ２５９．２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号４又は１１）を含む。
【００１２】
他の実施態様では、抗体は、ＹＷ２５９．９抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号５又は１２）を含む。
【００１３】
更に他の実施態様では、抗体は、ＹＷ２５９．１２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号６又は１３）を含む。
【００１４】
更なる実施態様では、抗体は軽鎖を含む。
【００１５】
また更なる実施態様では、抗体は、配列番号７のポリペプチド配列由来の軽鎖の一、二又は三の高頻度可変領域配列を含む。
【００１６】
更に他の実施態様では、抗体は、配列番号７又は１５のポリペプチド配列を含む軽鎖の全ての高頻度可変領域配列を含む。
【００１７】
特定の実施態様では、抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖がＹＷ２５９．２重鎖（配列番号４又は１１）、ＹＷ２５９．９重鎖（配列番号５又は１２）、及びＹＷ２５９．１２重鎖（配列番号６又は１３）からなる群から選択される重鎖由来の一、二、又は三の高頻度可変領域配列を含み、及び／又は軽鎖が配列番号７又は１５のポリペプチド配列由来の軽鎖の一、二又は三の高頻度可変領域配列を含む。
【００１８】
更なる実施態様では、抗体は、抗体ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９、及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される。
【００１９】
更なる態様では、本発明は、抗体の完全長ＩｇＧ型が５ｎＭ又はそれ以上、又は１ｎＭ又はそれ以上の結合親和性でヒトＰｉｒＢに特異的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ抗体に関する。
【００２０】
ある実施態様では、抗体は、ＣＮＳニューロンの再生のような軸索再生を促進する。
【００２１】
他の実施態様では、抗体は、Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる神経突起伸長阻害を少なくとも部分的に解放（レスキュー）する。
【００２２】
全ての態様において、抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、これは、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、又は二重特異性抗体、抗体断片又はイムノコンジュゲートでありうる。
【００２３】
更なる態様では、 本発明はここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２４】
他の態様では、本発明は、ここでの（一又は複数の抗体鎖のコード配列を含む）抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。該宿主細胞は、原核生物、真核生物及び哺乳動物宿主を含む。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を製造するための方法であって、（ａ）抗体をコードする核酸を含むベクターを適切な宿主細胞中において発現させ、（ｂ）抗体を回収することを含む方法に関する。
【００２６】
また更なる態様では、本発明は、ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含有する組成物に関する。場合によっては、該組成物は第二の医薬を含み、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体が第一の医薬である。第二の医薬は、例えばＮｇＲ阻害剤、例えば抗ＮｇＲ抗体でありうる。
【００２７】
異なる態様では、本発明はここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を含むキットに関する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、有効量のここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を必要とする被験者に投与することを含む軸索再生の促進方法。に関する。好ましくは、被験者はヒト患者である。
【００２９】
実施態様では、ここでの治療方法は生存又はニューロンを亢進し、及び／又はニューロン伸長を誘導する。
【００３０】
また他の態様では、本発明は、ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の有効量を、必要とする被験者に投与することを含む、神経変性疾患の治療方法に関する。神経変性疾患は、例えば中枢神経系への物理的損傷によって特徴付けられ得、限定しないが、脳卒中に伴う脳損傷を含む。
【００３１】
特定の実施態様では、神経変性疾患は、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、身体的傷害（例えば火傷、創傷）又は疾患状態、例えば糖尿病、腎不全又は癌及びＡＩＤＳの治療に使用される化学療法剤の毒作用によって引き起こされる末梢神経損傷、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものからなる群から選択される。
【００３２】
本発明は、ここでの抗ＰｉｒＢ抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体に更に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１ＡはマウスＰｉｒＢ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】図１ＢはヒトＬＩＬＲＢ２配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。（Ａ）代表的な顕微鏡写真。
【図２Ｂ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。（Ｂ）一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフ。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ａ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ｂ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ｃ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ｄ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図４Ａ】ＰｉｒＢ及びＮｇＲは両方とも、ミエリン阻害剤による成長円錐破壊を媒介するために必要とされる。出生後ＤＲＧ軸索の成長円錐を、破壊を刺激するために、３０分間、培地単独（コントロール）、ミエリン（３ｍｇ／ｍｌ）、又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（１００ｎＭ）で処理し、成長円錐を可視化するためにローダミン−ファロイジンで染色した。（Ａ）代表的な顕微鏡写真、（Ｂ）累積的実験からの成長円錐破壊（±ＳＥＭ）を測定するグラフ。抗ＰｉｒＢ処理によるＮｇＲの遺伝子的喪失又はＰｉｒＢの阻害の何れかが、ミエリン又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の成長円錐破壊活性を防止するのに十分なだけであった。双方の経路の阻害が破壊をまた十分にブロックした。（スケールバー，５０μｍ）。
【図４Ｂ】ＰｉｒＢ及びＮｇＲは両方とも、ミエリン阻害剤による成長円錐破壊を媒介するために必要とされる。出生後ＤＲＧ軸索の成長円錐を、破壊を刺激するために、３０分間、培地単独（コントロール）、ミエリン（３ｍｇ／ｍｌ）、又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（１００ｎＭ）で処理し、成長円錐を可視化するためにローダミン−ファロイジンで染色した。（Ａ）代表的な顕微鏡写真、（Ｂ）累積的実験からの成長円錐破壊（±ＳＥＭ）を測定するグラフ。抗ＰｉｒＢ処理によるＮｇＲの遺伝子的喪失又はＰｉｒＢの阻害の何れかが、ミエリン又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の成長円錐破壊活性を防止するのに十分なだけであった。双方の経路の阻害が破壊をまた十分にブロックした。（スケールバー，５０μｍ）。
【図５Ａ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図５Ｂ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図５Ｃ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図５Ｄ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図６】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２重鎖のＤＮＡ配列（配列番号８）。
【図７】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．９重鎖のＤＮＡ配列（配列番号９）。
【図８】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．１２重鎖のＤＮＡ配列（配列番号３）。
【図９】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２重鎖のタンパク質配列（配列番号４）。
【図１０】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．９重鎖のタンパク質配列（配列番号５）。
【図１１】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．１２重鎖のタンパク質配列（配列番号６）。
【図１２】全てのＹＷ２５９抗体の軽鎖のタンパク質配列（配列番号７）。
【図１３】ＨｉｓタグマウスＰｉｒＢの活性を阻害する抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（ＩｇＧ）の能力。
【図１４】ＨｉｓタグマウスＰｉｒＢの活性を阻害する抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．９（ＩｇＧ）の能力。
【図１５】ＨｉｓタグマウスＰｉｒＢの活性を阻害する抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．１２（ＩｇＧ）の能力。
【図１６】ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９、及びＹＷ２５９．１２を含む抗ＰｉｒＢ抗体パネルの相対的ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６結合性。
【図１７Ａ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１１）；ＹＷ２５９．９（配列番号１２）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１３）の重鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｈドメイン及び接触ＣＤＲ Ｈドメインと共に、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１７Ｂ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１１）；ＹＷ２５９．９（配列番号１２）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１３）の重鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｈドメイン及び接触ＣＤＲ Ｈドメインと共に、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１７Ｃ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１１）；ＹＷ２５９．９（配列番号１２）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１３）の重鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｈドメイン及び接触ＣＤＲ Ｈドメインと共に、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３配列にボックスを付している。Ｈｕｍ ＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１８Ａ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１５）；ＹＷ２５９．９（配列番号１５）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１５），及びＨｕｋＩ（配列番号１４）の軽鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｌドメイン及び接触ＣＤＲ Ｌドメインと共に、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１８Ｂ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１５）；ＹＷ２５９．９（配列番号１５）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１５）、及びＨｕｋＩ（配列番号１４）の軽鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｌドメイン及び接触ＣＤＲ Ｌドメインと共に、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１８Ｃ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１５）；ＹＷ２５９．９（配列番号１５）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１５）、及びＨｕｋＩ（配列番号１４）の軽鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｌドメイン及び接触ＣＤＲ Ｌドメインと共に、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１９】Ｃ１ＱＴＮＦ５（ＣＴＲＰ５；ＮＰ＿０５６４６）が後根神経節ニューロンの神経突起伸長を阻害し、この阻害は、ＰｉｒＢがＰｉｒＢ機能ブロック抗体ＹＷ２５９．２によってブロックされる場合に低減される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
ペアード免疫グロブリン様レセプターＢ」及び「ＰｉｒＢ」なる用語はここでは交換可能に使用され、配列番号１（図１）（ＮＰ＿０３５２２５）の天然配列の８４１アミノ酸マウス抑制タンパク質、及び全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含むラット及び他の非ヒト哺乳動物におけるその天然配列ホモログを意味する。更なる詳細については、Kubagawa等, Proc Natl Acad Sci USA 94, 5261 (1997)を参照のこと。
【００３５】
「ＬＩＬＲＢ」、「ＩＬＴ」及び「ＭＩＲ」なる用語はここでは交換可能に使用され、全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含む、ヒト「白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリーＢ」の全てのメンバーを意味する。ＬＩＬＲレセプターのこのＢ型サブファミリー内の個々のメンバーは、例えばＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３、及びＩＬＩＲＢ２／ＩＬＴ４のように、アクロニムに続く数字によって命名され、ここで、別の定義をしない限り、任意の個々のメンバーに対する言及は、全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型に対する言及をまた含む。よって、例えば、「ＬＩＬＲＢ２」「ＬＩＲ２」及び「ＭＩＲ１０」はここでは交換可能に使用され、配列番号２（図１）（ＮＰ＿００５８６５）の５９８アミノ酸ポリペプチド、及びその天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含むを意味する。更なる詳細については、Martin等, Trends Immunol. 23, 81 (2002)を参照のこと。
【００３６】
「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ」なる用語は、全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含む、対応するマウス及びヒトタンパク質及び他の非ヒト哺乳動物における天然配列ホモログを併せて意味するためにここで使用される。
【００３７】
「ミエリン関連タンパク質」なる用語は最も広い意味に使用され、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐを含む、ニューロン再生を抑制するＣＮＳミエリン中に存在する全てのタンパク質を含む。
【００３８】
「単離された」は、ここに開示された様々なタンパク質を記述するために使用される場合、同定されその自然環境の成分から分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、典型的にはそのタンパク質の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。好ましい実施態様では、タンパク質は、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、又は（２）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性まで、又は（３）質量分析又はペプチドマッピング技術により均一性まで、精製される。単離されたタンパク質には、当該タンパク質の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００３９】
「単離された」核酸分子は、当該核酸の天然源に通常は伴う少なくとも一種の汚染核酸分子から同定され分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態又は設定以外のものである。従って、単離された核酸分子は、それが天然の細胞中に存在している核酸分子から区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞の位置とは異なる染色体位置にあるコードされたかかる核酸を通常は発現する細胞中に含まれる核酸分子を含む。
【００４０】
ここで使用される場合、「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト」なる用語は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ活性をブロックし、中和し、阻害し、抑制し、低減させ又は妨害することのできる薬剤を指すために使用される。特に、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ミエリン関連阻害活性を妨害し、よって、神経突起伸長を亢進し、及び／又はニューロン成長、修復及び／又は再生を促進する。好ましい実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに結合することにより、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのＮｏｇｏ６６及び／又はＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐへの結合を阻害する。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、例えば、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する抗体及びその抗原結合断片、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＮｏｇｏ６６との間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＭＡＧとの間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＯＭｇｐとの間の結合を隔絶することができるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ又はＯＭｇｐの切断型は可溶型断片及びＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ関連阻害経路の小分子阻害剤を含む。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストはまたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ ｍＲＮＡの発現を阻害し又は減少させることができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を含む。好ましいＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体である。
【００４１】
ここでの「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にインタクトな抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二のインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。
【００４２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、少量で存在しうる可能な天然に生じる変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を示すものであり、抗体が何か特定の方法による生産を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256: 495 (1975)よって記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製されうる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」はまた例えばClackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離することもまたできる。
【００４３】
抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に一致するか又は相同するが、残りの鎖が、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に一致するか又は相同するものである「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を特に含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。ここで興味のあるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含むプリマタイズ抗体を含む。
【００４４】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４５】
「インタクト」抗体は抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、インタクト抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００４６】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は、抗体の性能を更に洗練させるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００４７】
ここで使用される「高頻度可変領域」なる用語は、配列が高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４、５０−５６、及び８９−９７、及び重鎖可変ドメインの３１−３５、５０−６５、及び９５−１０２；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２、５０−５２、及び９１−９６及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２、５３−５５、及び９６−１０１；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917(1987)）を含む。双方の場合、以下に更に詳細に検討するように、上掲のKabat等に従って可変ドメイン残基の番号を付ける。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義する高頻度可変領域中の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４８】
「親抗体」又は「野生型」抗体は、ここに開示された抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列改変を欠くアミノ酸配列を含む抗体である。よって、親抗体は一般にここに開示された抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一つの高頻度可変領域を有している。親ポリペプチドは、天然配列（つまり天然に生じる）抗体（天然に生じる対立遺伝子変異体）、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失及び／又は他の改変）を有する抗体を含みうる。開示全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」及び「親」又は「親の」抗体は交換可能に使用される。
【００４９】
ここで使用される場合、「抗体変異体」又は「変異体抗体」は、親抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する抗体を意味する。好ましくは、抗体変異体は、天然には見出されないアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含む。かかる変異体は親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性を必ず有している。好ましい実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、約７５％から１００％未満、より好ましくは約８０％から１００％未満、より好ましくは約８５％から１００％未満、より好ましくは約９０％から１００％未満、及び最も好ましくは約９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有する。抗体変異体は一般に一又は複数のその高頻度可変領域中に又はそれに隣接して一又は複数のアミノ酸変更を含むものである。
【００５０】
「アミノ酸改変」とは、予め定まったアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を意味する。例示的な変更は、挿入、置換及び欠失を含む。「アミノ酸置換」とは、予め定まったアミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基を他の異なったアミノ酸残基で置換することを意味する。
【００５１】
「置換」アミノ酸残基とは、アミノ酸配列中の別のアミノ酸残基を置換又は置き換えるアミノ酸残基を意味する。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基又は天然には生じないアミノ酸残基でありうる。
【００５２】
「アミノ酸挿入」とは、予め定まったアミノ酸配列中への一又は複数のアミノ酸残基の導入を意味する。アミノ酸挿入はペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドが予め定まったアミノ酸配列に導入される「ペプチド挿入」を含んでいてもよい。アミノ酸挿入がペプチド挿入を含む場合、挿入されたペプチドは天然には存在しないアミノ酸配列を持つようにランダム突然変異によって産生され得る。「高頻度可変領域の近傍」におけるアミノ酸変更は、挿入又は置換されたアミノ酸残基の少なくとも一つが当該高頻度可変領域のＮ末端又はＣ末端アミノ酸残基とペプチド結合を形成するような、高頻度可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端への一又は複数のアミノ酸残基の導入を意味する。
【００５３】
「天然に生じるアミノ酸残基」は、一般に、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される、遺伝子暗号にコードされたものである。
【００５４】
ここでの「天然に生じないアミノ酸残基」とは、上に列挙した天然に生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を意味し、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基（群）に共有的に結合可能である。天然に生じないアミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及びEllman等, Meth. Enzym. 202:301-336(1991)に記載のもののような他のアミノ酸残基アナログが含まれる。そのような天然に生じないアミノ酸残基を産生するには、Noren 等 Science 244:182(1989)と上掲のEllman等の手順を使用することができる。簡単にいうと、これらの手順は、天然に生じないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性させ、ついでインビトロのＲＮＡ転写と翻訳を行うことを含む。
【００５５】
本明細書にわたって、Kabat, E. A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及び(1991)からの番号付けシステムが参照される。これらの概論において、カバットは、各サブクラスに対して多くのアミノ酸配列を列挙し、そのサブクラスにおける各残基一に対して最も頻繁に生じるアミノ酸を列挙している。カバットは列挙された配列中の各アミノ酸に対して残基番号を割り当てる方法を使用し、残基番号を割り当てるこの方法は当該分野で標準的になった。この明細書では、カバット番号付けスキームに従う。本発明の目的に対しては、カバットの概論に含まれていない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り当てる場合は、次の工程に従う。一般に、候補配列をカバットで任意の免疫グロブリン配列又は任意のコンセンサス配列と整列させる。アラインメントは手作業で行うか、又は一般的に許容されるコンピュータプログラムを使用してコンピュータによってなされ得、かかるプログラムの一例はＡｌｉｇｎ２プログラムである。アラインメントは、殆どのＦａｂ配列に共通である幾らかのアミノ酸残基を使用することによって容易にすることができる。例えば、軽鎖及び重鎖はそれぞれ典型的には同じ残基番号を有している二つのシステインを有している；ＶＬドメインにおいてその二つのシステインは典型的には残基番号２３及び８８であり、ＶＨドメインでは、その二つのシステインは典型的には２２及び９２と番号付けされる。フレームワーク残基は一般的には、必ずしも全てではないが、およそ同じ残基番号を有しており、ＣＤＲｓはサイズが変化しうる。例えば、それが整列されるカバットの配列中のＣＤＲより長い候補配列からのＣＤＲの場合には、典型的には、更なる残基の挿入を示すために残基番号に接尾語が付加される（例えば、図１Ｂの残基１００ａｂｃを参照）。残基３４及び３６のカバット配列とアラインするが残基３５とアラインする残基をその間に持たない候補配列では、番号３５は単に残基には単に割り当てられない。
【００５６】
ここで使用される場合、「高親和性」を有する抗体は、ナノモル（ｎＭ）範囲又はそれより良いＫＤ、又は解離定数を有する抗体である。「ナノモル（ｎＭ）範囲又はそれより良い」ＫＤはＸｎＭによって表すことができ、ここで、Ｘは約１０未満の数である。
【００５７】
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数のＣＤＲに一又は複数の変更を有するものであって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の又は更にはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において既知の方法により生産される。Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992)は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas等, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００５８】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。
【００５９】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体からそれを区別するその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
【００６０】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編 (1988)に記載されたもののような常套的な交差ブロックアッセイ法を実施することができる。
【００６１】
「糸状ファージ」なる用語は、その表面に異種性ポリペプチドをディスプレイすることができるウイルス粒子を意味し、限定するものではないが、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、及びＭ１３を含む。糸状ファージはテトラサイクリンのような選択可能マーカーを含みうる（例えば「ｆｄ−ｔｅｔ」）。様々な糸状ファージディスプレイは当業者によく知られている（例えばZacher等 Gene 9: 127-140 (1980), Smith等 Science 228: 1315-1317 (1985);及びParmley及びSmith Gene 73: 305-318 (1988)を参照）。
【００６２】
「パニング」なる用語は、標的に対して高い親和性及び特異性を持つ抗体のような化合物を有するファージの同定及び単離において複数回のスクリーニング方法を指すために使用される。
【００６３】
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」なる用語は、遺伝子発現を妨害する小さい二本鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡｓは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子を発現停止させるプロセスであるＲＮＡ干渉の中間体である。ｓｉＲＮＡｓは典型的には一本鎖オーバーハングを含みうる二重鎖を形成する約１５−２５ヌクレオチド長の二つの一本鎖ＲＮＡｓから構成される。例えばポリメラーゼのような酵素複合体による二本鎖ＲＮＡのプロセシングは二本鎖ＲＮＡの開裂を生じ、ｓｉＲＮＡｓを生産する。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ｍＲＮＡ開裂をガイドするためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）サイレンシング複合体によって使用され、それによってｍＲＮＡ分解が促進される。例えば哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡｓを使用して特異的な遺伝子の発現を停止させるために、塩基対形成領域が、未関連ｍＲＮＡに対する偶然の相補性を避けるために選択される。ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、例えばFire等, Nature 391:806-811 (1998)及びMcManus等, Nat. Rev. Genet. 3(10):737-47 (2002)によるように当該分野で同定されている。
【００６４】
「干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）」なる用語は、ここでは、特定のｍＲＮＡｓの触媒的分解を生じる二本鎖ＲＮＡを意味するために使用され、よって特定の遺伝子の発現を阻害／低下させるために使用することができる。
【００６５】
「遺伝子多型」なる用語は、遺伝子又はその一部（例えばアレル変異体）の一を越える形態を意味するためにここで使用される。少なくとも２つの異なった形態にある遺伝子の一部は遺伝子の「遺伝子多型領域」と称される。遺伝子の多型領域の特定の遺伝子配列は「アレル」である。多型領域は、異なるアレルで異なるか又は幾つかのヌクレオチド長でありうる単一のヌクレオチドでありうる。
【００６６】
ここで使用される場合、一般に「疾患」なる用語は、軸索再生治療法から恩恵を受けることが期待される任意の症状、及び／又は神経系におけるシナプス可塑性の改善を含む、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ２のアンタゴニスト、例えば抗ＰｉｒＢ抗体での治療から恩恵を受ける任意の症状を意味する。ここで治療される疾患の非限定的な例には、限定しないが、例えば物理的に損傷を受けた神経及び神経変性疾患のような神経障害を含む、神経突起伸長の亢進、ニューロン成長、修復又は再生の促進から恩恵を受ける疾病及び症状を含む。かかる疾患は特に中枢神経系に対する物理的損傷（例えば、脊髄損傷及び頭部外傷）；脳卒中に伴う脳損傷；及び神経変性に関連する神経障害、例えば三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、多発性硬化症（ＭＳ）、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板(invertebrate disk)症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、身体的傷害又は糖尿病のような疾患状態によって引き起こされる末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものを含む。
【００６７】
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」なる用語は、治癒的治療、予防的療法及び防護的療法を意味する。連続的治療又は投与は、一又は複数の日数による治療の中断なく少なくとも毎日の基準での治療を意味する。間欠的治療又は投与、又は間欠的な形式での治療又は投与は、連続的ではなくむしろ周期的な性質である治療を意味する。
【００６８】
ここで使用される「神経変性を予防する」なる用語は、（１）神経変性疾患を持つと新たに診断された又は新たな神経変性疾患が発症するリスクにある患者において神経変性を阻害又は予防する能力及び（２）神経変性疾患に既に罹っているか又は神経変性疾患の徴候を有している患者において更なる神経変性を阻害又は予防する能力を含む。
【００６９】
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、高等の非ヒト霊長類、家庭及び酪農用動物、例えばウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳類に分類される任意の哺乳動物を意味する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００７０】
一又は複数の治療剤と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００７１】
「有効量」とは、有益な又は所望の治療（予防を含む）結果を達成するのに十分な量である。有効量は一又は複数の投与で投与されうる。
【００７２】
ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる表現は交換可能に使用され、かかる全ての標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」なる言葉は、移行数にかかわらず、初代対象細胞及びそれから誘導された培養物を含む。全ての子孫が、意図的な変異あるいは意図しない変異の影響で、ＤＮＡ含量において正確に同一でなくともよいこともまた理解される。「子孫」なる用語は、元々の形質転換細胞又は細胞株に続くあらゆる世代の任意の及び全ての子孫を意味する。元々の形質転換細胞おいてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。区別する標記が意図される場合は、それは文脈から明らかであろう。
【００７３】
ここで同定される配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成することができ、当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のためには、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテック社によって著作され、そのソースコードが米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用して得ることができる。ＡＬＩＧＮ-２はジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間で所望される同一性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００７５】
ここで定義される「高ストリンジェンシー条件」は、（１）５０℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと、洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる；（２）４２℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドに０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムの変性剤をハイブリダイゼーションに用いる；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）での４２℃での洗浄と５０％のホルムアミドでの５５℃での洗浄に、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄が続くものによって、同定されうる。
【００７６】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているようにして特定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜のインキュベーション後に、３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルター洗浄を行うことを含む。プローブ長などの因子に必要に応じて適合させるには、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは当業者であれば分かるであろう。
【００７７】
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００７８】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の実務に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
【００７９】
「小分子」はここでは約１０００ダルトン以下、好ましくは約５００ダルトン以下の分子量を有するものと定義される。
【００８０】
Ｂ．抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の生産
本発明の抗ＰｉｒＢ抗体は、組換えＤＮＡ法の技術を含む当該分野で知られている方法によって製造することができる。
ｉ）抗原調製
他の分子と結合されていてもよい可溶型抗原又はその断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。レセプターのような膜貫通分子では、これらの断片（例えばレセプターの細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。別法では、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することができる。かかる細胞は、天然源（例えば癌細胞株）から誘導することができ、又は膜貫通分子を発現させるために組換え技術によって形質転換されている細胞でありうる。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は当業者には明らかであろう。
【００８１】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物において産生させる。関連抗原を、二官能性又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣＩ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、Ｒ及びＲ１は異なったアルキル基である）を使用して、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシン阻害剤に結合させるのが有用でありうる。
【００８２】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８３】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで作製することができ、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又はマカクザル等の他の適切な宿主動物を上述のようにして免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を生産するか又は生産可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【００８４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含む適切な培養培地に播種され増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００８５】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。これらのなかで、より好ましいミエローマ細胞株はマウスミエローマ株、例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerから入手可能であるMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍から誘導されたものやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能であるSP-2又はX63-Ag8-653細胞である。ヒトモノクローナル抗体を生産するためにヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた開示されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００８６】
ハイブリドーマ細胞が増殖される培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合アッセイによって測定する。
【００８７】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる（Goding, MonoclonalAntibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的のための適当な培地には、例えば、D-MEM又はＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物においてインビボで腹水腫瘍として増殖させることもできる。
【００８８】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の一般的な免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から好適に分離される。
【００８９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しないミエローマ細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。抗体の組換え生産は以下により詳細に記載される。
【００９０】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。
【００９１】
Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体のそれぞれの単離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフッリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００９２】
また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより、修飾することができる。
【００９３】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換でき、あるいはそれらは抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、抗原に対して特異性を有する抗原結合部位と異なった抗原に対して特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ性二価抗体を産生する。
【００９４】
（ｉｖ）ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒトである由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の対応する配列に齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することにより、ウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾らかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【００９５】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を作製する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993)）。
【００９６】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムが購入可能である。これら表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００９７】
別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えばJakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる (Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリーからのヒト抗体の生産を以下に更に記載する。
【００９８】
（ｖ）抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照)。しかし、これらの断片は今は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載される他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子の構築を促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号を参照。
【００９９】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、エピトープが通常は異なった抗原由来である少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する。このような分子は通常は二つのエピトープを結合させるのみであるが(すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ)、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。ＢｓＡｂｓの例には、一方のアームがＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ２に向けられ他方のアームがＮｏｇｏ又はＭＡＧ又はＯＭｇｐに向けられたものが含まれる。ＢｓＡｂｓの更なる例には、一方のアームがＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ２に向けられ他方のアームがＮｇＲに向けられたものが含まれる。
【０１００】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な生産は、二つの鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein等, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成されるが、かなり面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順が国際公開第93/08829号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-36569(1991)に開示されている。異なるアプローチ法では、所望の結合特異性(抗体抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１０１】
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１０２】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１０３】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号）。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１０４】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１０５】
大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することもでき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
【０１０６】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。該断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１０７】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１０８】
（ｖｉｉ）エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成されたホモ二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体は、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１０９】
(ｖｉｉｉ）抗体-サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト名抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを導入することにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを導入することにより)、達成できる。
【０１１０】
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に移動させられた領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が移動する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の（例えばＩｇＧの）ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に移動する。
【０１１１】
（ｉｘ）抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾の例は、特に出典明示によりここに援用される米国特許第５５３４６１５号に記載されている。抗体の共有的修飾の好ましいタイプは、米国特許第４６４０８３５号；同第４４９６６８９号；同第４３０１１４４号；同第４６７０４１７号；同第４７９１１９２号又は同第４１７９３３７号に記載されているようにして、様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン類の一つに抗体を結合させることを含む。
【０１１２】
（ｘ）合成抗体ファージライブラリーからの抗体の産生
ある好適な実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリーの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
【０１１３】
ファージディスプレイ法の詳細は、例えば出典明示によりここに明示的に援用される２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができる。
【０１１４】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリーは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによって産生させることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリーを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリーを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリを創ることが好ましい場合がある。
【０１１５】
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリーをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリーをつくることができる。これらのライブラリーは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリーの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【０１１６】
好ましくは、ライブラリーは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリーは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
【０１１７】
一態様では、ライブラリーはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリーはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリーはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリーはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【０１１８】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリーにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
【０１１９】
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【０１２０】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリーを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリーをプール化し、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリーは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
【０１２１】
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリーから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリーを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【０１２２】
上述のプールされたライブラリーから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【０１２３】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリー又はライブラリー群が作成される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリーは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリーは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリーから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
【０１２４】
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリーを作成することが望ましい場合がある。
【０１２５】
これらの実施態様のライブラリーから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
【０１２６】
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリーを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリーと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリーは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリーと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリーは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリーと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリーは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリーは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【０１２７】
抗体変異体
ファージライブラリーから生成される新規な抗体を更に修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生産することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくとも約１０倍良好な、好ましくは少なくとも約２０倍良好な、より好ましくは少なくとも約５０倍良好な、時には少なくとも約１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくとも約１０倍強力な、好ましくは少なくとも約２０倍強力な、より好ましくは少なくとも約５０倍強力な、時には少なくとも約１００倍又は２００倍強力な、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する結合親和性を有することが好ましい。
【０１２８】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等 (1986) Science 233:747-753)；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において改変することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【０１２９】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
【０１３０】
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基（群）の一又は複数が、第二の哺乳動物種からの抗原とのアミノ酸の相互作用をなすためにアラニン又はポリアラニン残基（群）によって置換される。ついで、置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基（群）は、置換部位に又はそれに対して更なる又は他の変異を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体がここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
【０１３１】
通常は、「好ましい置換」の表題で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【０１３２】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けされる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択される部位がファージディスプレイを使用して親和性成熟される（上を参照）。
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発(例えばKunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488を参照)である。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されただけのものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の二以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【０１３３】
通常、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
【０１３４】
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原又はその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数に場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイを施して、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【０１３５】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性を改善することができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
【０１３６】
（ｘｉｉ）抗体の組換え生産
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離されるか合成されて、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列（例えば出典明示によりここに特に援用される米国特許第５５３４６１５号に記載のもの）である。
【０１３７】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなくむしろ例示的なものである。
【０１３８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【０１３９】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞はまた多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養をまた宿主として利用することができる。
【０１４０】
しかしながら、脊椎動物細胞における興味が最もあり、培養(組織培養)中の脊椎細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚腎細胞系(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol. 36:59(1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【０１４１】
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された一般的栄養培地で培養される。
【０１４２】
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ)、(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４３】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌される場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１４４】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（登録商標）樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）クロマトグラフィー（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０１４５】
Ｃ．抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の用途
本発明の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は、神経細胞の生存を亢進し又は伸長を誘導するための薬剤としての用途が見出されると考えられる。それらは、従って、例えば中枢神経系（脊髄及び脳）への物理的損傷；脳卒中に伴う脳損傷；及び神経変性に関連する神経障害、例えば三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、身体的傷害（例えば火傷、創傷）又は疾患状態、例えば糖尿病、腎不全又は癌及びＡＩＤＳの治療に使用される化学療法剤の毒作用によって引き起こされる末梢神経損傷、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板(invertebrate disk)症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものを含む、神経系の変性疾患（「神経変性疾患」）の治療に有用である。
【０１４６】
ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体はまたインビトロで神経細胞を培養するのに使用される培養培地の成分としても有用である。
【０１４７】
最後に、ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を含む調製物は、放射性ヨウ素、酵素、フルオロフォア、スピン標識等で標識される場合、競合的結合アッセイにおける標準物質として有用である。
【０１４８】
ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の治療的製剤は、所望の程度の純度を持つ抗体を、場合によって生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol., A., Ed., (1980)）と、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で混合することにより貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｔｏｎｉｃｓ、又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４９】
インビボ投与のために使用される抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、濾過滅菌膜による濾過によって容易に達成されうる。
【０１５０】
治療用組成物は、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配されうる。
【０１５１】
本発明の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は、ＮＧＦ、ＮＴ−３、及び／又はＢＤＮＦを含む神経栄養因子と場合によっては組み合わされ、又は併用して投与され、神経変性疾患のための他の一般的治療法と共に使用されうる。また、本発明の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は、有利には、ＮｇＲ阻害剤、例えばＮｇＲに対するＮｏｇｏ−６６、ＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐの結合をブロックする抗体、小分子又はペプチドと併用して投与されうる。
【０１５２】
投与経路は既知の方法、例えば、以下に説明するように、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
【０１５３】
脳内投与の場合、化合物は、ＣＮＳの液貯留部(fluid reservoirs)中に注入により連続的に投与されうるが、ボーラス注入も許容できる。化合物は好ましくは脳の脳室中に投与されるか又はＣＮＳ又は髄液中に導入等される。投与は、ポンプのような連続投与手段を使用する留置カテーテルにより実施することができ、又は徐放性ビヒクルの移植、例えば脳内移植によって投与することができる。より詳細には、化合物は、慢性移植カニューレを通して注入されるか、又は浸透圧ミニポンプの補助で慢性的に注入されうる。脳室に小さなチュービングを通してタンパク質をデリバーする皮下ポンプを利用できる。非常に複雑なポンプは皮膚から再充填でき、そのデリバリー速度は外科的介入なしにセットできる。皮下ポンプ装置又は全体的に移植されたドラッグデリバリー系による連続側脳室内注入を含む適切な投与プロトコル及びデリバリー系の例は、Harbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271 (1987)；及びDeYebenes等, Mov. Disord. 2:143 (1987)によって記載されているアルツハイマー患者及びパーキンソン病の動物モデルに対するドーパミン、ドーパミンアゴニスト、及び抗コリン性アゴニストの投与に対して使用されているものである。
【０１５４】
持続放出調製物の好適な例は、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態で半透過性ポリマーマトリクスを含む。持続放出マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman,等, 1983, Biopolymers 22:547）、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)（Langer,等, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167；Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98）、エチレン酢酸ビニル（Langer等, 同上）又はポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８Ａ）を含む。持続放出組成物は、リポソームに捕捉された化合物をまた含み、これは、それ自体知られた方法により調製することができる。（Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；米国特許第４４８５０４５号及び第４５４４５４５号；及びＥＰ１０２３２４Ａ）。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％コレステロール以上であり、選択される割合が最適な治療法に対して調整される微小（約２００−８００オングストローム）な単ラメラ状のものである。
【０１５５】
治療的に用いられる活性化合物の有効量は、例えば治療目的、投与経路、及び患者の状態に依存する。従って、治療専門家は、最適な治療効果が得られるように、投与量を滴定し投与経路を修正する必要がある。典型的な毎日の投薬量は、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であるかも知れない。典型的には、臨床医は、ニューロン機能を修復し、維持し、最適には再樹立する投薬量に達するまで活性化合物を投与する。この治療法の進行は常套的なアッセイによって容易にモニターされる。
【０１５６】
本発明の更なる詳細を次の非限定的な実施例によって例証する。
【０１５７】
実施例１
発現クローニングＬＩＬＲＢ２
阻害性ミエリンタンパク質のための新規レセプターを同定するために、発現クローニングアプローチ法を採用した。ベイトとして、次の特徴付けられたミエリン阻害剤（ヒトｃＤＮＡを使用）：Ｎｏｇｏ６６、ＮｏｇｏＡの二つの更なる阻害ドメイン（ＮｉＲ＜デルタ＞Ｄ２及びＮｉＧ＜デルタ＞２０）（Oertle T, J Neurosci. 2003, 23(13): 5393-406）、ＭＡＧ，及びＯＭｇｐのＮ−及び／又はＣ−末端にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を融合させたコンストラクトを生成させた。これらのコンストラクトを２９３細胞に形質移入して、ベイトタンパク質を含む条件培地（ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ中）を製造した。スクリーニングに使用されたｃＤＮＡライブラリーは、Ｏｒｉｇｅｎｅによって製造された発現準備済みベクター中の完全長ヒトｃＤＮＡから構成されていた。これらのｃＤＮＡｓを収集し、整列化させ、プール化した。およそ１００のｃＤＮＡのプールをＣＯＳ７細胞中に一過性に形質移入した。
【０１５８】
特に、１日目に、ＣＯＳ７細胞を１２ウェルプレート中に１ウェル当たり８５０００細胞の密度で播種した。２日目に、プール化ｃＤＮＡの１ｍｇを、脂質ベースの形質移入試薬ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して１ウェル毎に形質移入した。４日目に、スクリーニングを実施した。簡単に述べると、培養培地を細胞から取り除き、ＡＰ−融合ベイトタンパク質（２０−５０ｎＭ）を含む２９３細胞条件培地の０．５ｍｌで置換した。細胞を室温で９０分間、インキュベートした。ついで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで７分間固定し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）で３回洗浄し、６５℃で９０分間、熱失活させ、内在性ＡＰ活性を破壊した。細胞をＡＰバッファー（１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ９．５）で一回洗浄し、発色基質（Western Blue, Promega）中でインキュベートし、インキュベーションの１時間後と一晩のインキュベーション後に再び反応生成物の存在について分析した。陽性細胞を膜表面にわたる暗青色の沈殿物の存在によって同定した。陽性プールを更に破壊して、続くスクリーニング実験によって個々の陽性クローンを同定した。
【０１５９】
スクリーニングから、次の陽性ヒット（的中）を同定した：
ＭＡＧ−ＡＰベイトは４つの陽性ヒットを生じた。一つは過去に特徴付けられたＮｏｇｏレセプター（Fournier等, Nature 409, 342-346 (2001)）であった。これらのヒットの二つは糖分解プロセス酵素であり、関連性はないように思われた。第四のものは「クローン６４３由来ホモサピエンス仮説タンパク質（ＬＯＣ５７２２８）ｍＲＮＡ」と注釈された。ｃＤＮＡの密な分析により、過去に記載されたタンパク質ＳＭＡＧと相同であった他のＯＲＦが明らかになった。
【０１６０】
ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６ベイトは２つの陽性ヒットを生じた。一つは過去に特徴付けられたＮｏｇｏレセプターであった。他のものは「ホモサピエンス白血球免疫グロブリン様レセプター，サブファミリーＢ（ＴＭ及びＩＴＩＭドメインを含む）メンバー２（ＬＩＬＲＢ２）ｍＲＮＡ」（配列番号２）であった。この遺伝子はまたＭＩＧ１０、ＩＬＴ４、及びＬＩＲ２を含む複数の別名でも知られている（Kubagawa等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)；Colonna等, J. Exp. Med. 186:1809-18 (1997)）。
【０１６１】
実施例２
ＰｉｒＢ機能ブロック抗体の調製及び試験
ＰｉｒＢ機能ブロック抗体
ＰｉｒＢに対する抗体を、ＰｉｒＢ細胞外ドメインに対して合成ファージ抗体ライブラリーをパンニングすることによって産生させた（W. C. Liang等, J Mol Biol 366, 815 (2007))。ついで、抗体クローン（１０ｍｇ／ｍｌ）を、ＰｉｒＢ発現ＣＯＳ７細胞に対するＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（５０ｎＭ）の結合をブロックするその能力についてインビトロで試験した。様々なＹＷ２５９抗マウスＰｉｒＢ（抗ｍＰｉｒＢ）抗体の重鎖及び軽鎖配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図６−１６、及び１７及び１８に示す。図１７及び１８はまたそれぞれＹＷ２５９．２、ＹＷ２５０．９及びＹＷ２５９．１２の重鎖及び軽鎖内の高頻度可変領域配列を示す。
【０１６２】
神経突起伸長アッセイ
ポリ−Ｄ−リジンで前もって被覆された９６ウェルプレート（Biocoat, BD）をミエリン（０．７５μｇ／ｍｌ）で一晩又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はＭＡＧ−Ｆｃ（１５０−３００ｎｇ／スポット）で２時間被覆し、ついでラミニン（Ｆ−１２中１０μｇ／ｍｌ）で２時間（ＣＧＮ培養）又は４時間（ＤＲＧ培養）処理した。マウスＰ７小脳ニューロンを過去に記載されているようにして（B. Zheng等, Proc Natl Acad Sci U S A 102, 1205 (2005)）培養し、１ウェル当たり〜２×１０４細胞で蒔いた。マウスＰ１０ＤＲＧニューロンを過去に記載されているようにして（上掲のZheng等, 2005）培養し、１ウェル当たり〜５×１０３細胞で蒔いた。培養物を５％のＣＯ２を用いて３７℃で２２時間増殖させた後、４％のパラホルムアルデヒド／１０％のスクロースで固定し、抗βＩＩＩ−チューブリン（TuJ1, Covance）で染色した。各実験では、全ての条件は６通りの複製ウェルで実施し、それから最大の神経突起長を測定し、平均値を６ウェル間で決定した。各実験は少なくとも三回実施し、同様の結果であった。ｐ値はスチューデント検定を使用して決定した。
【０１６３】
成長円錐崩壊アッセイ
ＤＲＧ外植片を、３週齢のマウスからＤＲＧを解体し、それを３つにスライスすることにより単離した。ついで、各ＤＲＧ外植片を、８ウェルプレートから個々のＰＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）被覆及びラミニン（１０μｇ／ｍｌ）被覆ウェル中で培養した。播種後７２時間で、外植片をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（１００ｎＭ）又はミエリン（３ｍｇ／ｍｌ）と共に３０分インキュベートして破壊を刺激した。培養物を４％のパラホルムアルデヒド／１０％のスクロースで固定し、ついで、成長円錐をローダミン−ファロイジン（Molecular Probes）染色によって可視化し、破壊についてスコア化した。平均成長円錐破壊を、少なくとも３つの複製ウェルを平均することによって決定した。
【０１６４】
結果
ＰｉｒＢがＮｏｇｏ６６に対する機能的レセプターであるかどうかに取り組むために、我々は、神経突起伸長がＡＰ−Ｎｏｇｏ６６で増殖されるときに阻害される（K.C. Wang等, Nature 420,74 (2002)）若年性（Ｐ７）小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）に焦点を当てた。成人ＣＧＮはＰｉｒＢを発現することが示されており（J. Syken等, Science 313,1795 (2006)）、我々は、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーションによって評価して若年性ＣＧＮの場合も同じであることを見出した（データは示さず）。
【０１６５】
先ず、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６阻害を妨害するＰｉｒＢ（ＰｉｒＢ−Ｈｉｓ）の可溶性外部ドメインの能力をインビトロで試験した。図２Ａに示されるように、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６は、未処理コントロールレベルのおよそ６６％までＰ７ＣＧＮの神経突起伸長を阻害する。このアッセイにおけるＰｉｒＢ−Ｈｉｓの含有はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６阻害を逆にし、神経突起伸長は本質的にコントロールレベルに戻る。これらの結果は、Ｎｏｇｏ６６による阻害をブロックするためにＮｇＲの外部ドメインを使用して報告されたものと同様であり（B Zgeng等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1205 (2005)；A. E. Fournier等, J. Neurosci. 22, 8876 (200)；Z. L. He等, Neuron 38, 177 (2003)）、ＰｉｒＢがＮｏｇｏ６６の機能的に阻害性のドメインに結合可能であるが、ＣＧＮ中の内在性ＰｉｒＢがＡＰ−Ｎｏｇｏ６６による阻害を媒介するかどうかには対処できないことを示している。
【０１６６】
従って、ＰｉｒＢ−Ｎｏｇｏ６６相互作用を妨害することができる抗体をＰｉｒＢ（抗ＰｉｒＢ）に対して産生させた。ＰｉｒＢの細胞外ドメインに対してファージディスプレイプラットフォーム（W.C. Liang等, J. Mol. Biol. 366, 815 (2007)）を使用して、複数のクローンを、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６のＰｉｒＢへの結合を阻害するその能力についてスクリーニングした。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６−ＰｉｒＢ結合を最も妨害したクローンＹＷ２５９．２（ここではａＰＢ１と称する）は、ＰｉｒＢに対して５ｎＭのＫｄを有していた（図１３−１６を参照）。
【０１６７】
ａＰＢ１はＣＧＮｓのベースライン軸索伸長には効果がなかった。しかしながら、ａＰＢ１は培養されたＣＧＮ中においてＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンによる阻害を有意に低減させ（図２Ｂ）、神経突起伸長をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６で４１％から５９％まで、ミエリンで４７％から６２％までレスキューした。同様の結果が、阻害性基質としてＭＡＧを使用して、又は異なった細胞型（後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン）を使用して（図５）、見られた。これらの結果は、ＰｉｒＢが神経突起伸長の長期の阻害を媒介する機能的レセプターであると反論する。
【０１６８】
この結果を確認するために、膜貫通ドメイン及びＰｉｒＢ細胞内ドメインの一部をコードする４つのエキソンが除去されたＰｉｒＢＴＭマウス由来のニューロンを培養することにより（J. Syken等, Science 313,1795 (2006)）、細胞表面ＰｉｒＢの遺伝子的除去がまたＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンによる阻害を逆にするかどうかを試験した。ＰｉｒＢＴＭマウス又は野生型（ＷＴ）同腹仔由来のＣＧＮをコントロール基質、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンで培養した。コントロール基質（ＰＤＬ／ラミニン）では、ＰｉｒＢＴＭニューロンはＷＴニューロンと同様に挙動した（図２Ｃ）。しかしながら、ＰｉｒＢＴＭニューロンからの神経突起伸長は、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンの何れかでのＷＴニューロン由来よりも顕著に阻害が少なかった。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６では、ＷＴニューロンからの伸長はコントロールレベルの５０％まで阻害されたが、ＰｉｒＢＴＭニューロンは６６％までだけ阻害された。同様に、ミエリンでは、ＷＴニューロンはコントロールレベルの５２％まで阻害されたが、ＰｉｒＢＴＭニューロンは７０％までだえ阻害された。再び、我々はミエリン及びＡＰ−Ｎｏｇｏ６６双方でのＰｉｒＢＴＭ ＤＲＧニューロンの同様な部分的な脱抑制を観察した（図５）。これらの知見は、ＰｉｒＢが確かに神経突起成長のＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリン媒介阻害に対する機能的レセプターであることをを示している。しかしながら、ＰｉｒＢ活性の喪失は伸長を完全にはレスキューしない。
【０１６９】
ＮｇＲは過去にミエリン阻害剤のレセプターとして記載されているので、ＰｉｒＢ及びＮｇＲが共に機能して神経突起伸長の阻害を媒介することが可能である。これに取り組むために、抗ＰｉｒＢの存在下でＮｇＲ欠損マウス由来のニューロンを培養することによりＣＧＮにおいてＰｉｒＢ及びＮｇＲ機能の双方をブロックした。我々が過去に報告したように（上掲のB. Cheng等, PNAS 2005）、ＮｇＲ−／−ＣＧＮ神経突起伸長はＷＴニューロンにおけるものと同じ程度までＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンによって阻害される（５０％及び４９％；図３）。ＮｇＲ＋／−ニューロンのａＰＢ１抗体処置が、ＷＴニューロンのａＰＢ１処理に対して上で見られるように、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンの何れかによる阻害を部分的に逆にした。同様に、ＮｇＲ−／−ニューロンのａＰＢ１処置はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６による阻害を部分的に逆にしたが、ＮｇＲ＋／−ニューロン又はＷＴニューロンのａＰＢ１処理で見られるものよりも更なるレスキューはもたらさなかった。これに対して、ＮｇＲ−／−ニューロンのａＰＢ１処理は、略コントロールレベルまでミエリンでの神経突起伸長を回復させた。よって、ＮｇＲではないが、ＰｉｒＢはＣＧＮにおけるＡＰＮｏｇｏ６６による基質阻害に必要とされるが、部分的にだけであると思われる。更に、ＰｉｒＢ及びＮｇＲの双方がミエリンにより付与される基質阻害に寄与する。
【０１７０】
ＮｇＲは様々なミエリン阻害剤に応答して成長円錐破壊に必要とされること考えられるので（J.E. Kim等, Neuron 44, 439 (2004), O.Chivatakarn等, J. Neurosci. 27, 7117 (2007)）、ＰｉｒＢがまたこのより急性の応答に関与していることが可能である。ＰｉｒＢを発現することが確認された３週齢のマウスの後根神経節（ＤＲＧ）からの感覚ニューロンをこの実験に使用した。この培養系における成長円錐は高いベースラインレベルの破壊（〜３０％）を有しており、これはＡＰＮｏｇｏ６６又はミエリンとのインキュベーションによって更に増加する（図４）ことが見出された。この破壊はＮｇＲ−／−ニューロンにおいて大きく消滅した。加えて、ａＰＢ１でのブロックＰｉｒＢ機能はまたこれら阻害剤による成長円錐破壊を逆にするのに十分である。ＰｉｒＢ及びＮｇＲ経路双方の阻害（ＮｇＲ−／−マウス由来のニューロンへのａＰＢ１処理を使用）はまた成長円錐破壊を完全に逆にしたが、この結果は、何れの処置もこのアッセイでは完全なレスキューを与えたので、情報価値はなかった。
【０１７１】
他の実験では、Ｃ１ＱＴＮＦ５が小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）の神経突起伸長を阻害し、この阻害はＰｉｒＢ機能ブロック抗体ＹＷ２５９．２によって逆になった。結果は図１９に示す。
【０１７２】
併せて、これらの結果は、ミエリン抽出物、より詳細にはミエリン関連阻害剤Ｎｏｇｏ６６及びＭＡＧによる神経突起阻害のための必要なレセプターとしてのＰｉｒＢの新規な役割を支援する。実際、ＰｉｒＢは、ＰｉｒＢ機能単独の除去（遺伝的に又は抗体を使用して）がミエリン抽出物及びミエリン阻害剤双方での成長を部分的に脱抑制する一方、ＮｇＲ単独の遺伝子除去はこれらの基質の何れでも脱抑制しないので、ＮｇＲよりも基質阻害のより有意なメディエーターであると思われる。しかしながら、ＮｇＲは、ＮｇＲの遺伝子除去がミエリン（しかしＮｏｇｏ６６でではない）への抗ＰｉｒＢ抗体によって引き起こされる脱抑制を増強しうるので、ミエリン抽出物（しかしＮｏｇｏ６６ではない）による阻害の媒介に補助的役割を担っているようである。我々の知見は、ＮｇＲ外部ドメインが注入された齧歯類に見られる報告された再生又は出芽にもかかわらず（S. Li等, J. Neurosci. 24, 10511 (2004)）、ＮｇＲノックアウトマウスにおける亢進されたＣＳＴ再生の驚くべき欠如を説明するのに役立ちうる（上掲のJ.E. Kim等, B. Zheng等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1205 (2005)）。よって、インビボでの有意な再生を達成するためにはＰｉｒＢ及びＮｇＲの双方を取り除くことが必要であるかも知れない。加えて、Ｎｏｇｏ６６基質では、ＮｇＲの遺伝子除去がＰｉｒＢ除去の部分的な脱抑制効果を更に増強することはないので、Ｎｏｇｏ６６に対して更なる結合レセプターが存在するようである。
【０１７３】
ＰｉｒＢはＮｇＲよりも基質阻害のためのより有意なレセプターであるようであるが、ＰｉｒＢ又はＮｇＲの何れか単独の不活性化が、ミエリン阻害剤の添加によって引き起こされる急性成長円錐破壊をブロックするのに十分である。この知見は、破壊がより要望されるプロセスで、ＰｉｒＢ及びＮｇＲ活性の双方を必要とし、平行にあるいは一緒に作用することを示唆している。この文脈において、ＰｉｒＢ及びＮｇＲレセプターが視覚野におけるシナプス結合の可塑性の制限に同様の役割を果たしていることが最近示されていることは興味深い：何れかのレセプターを欠くマウスでは、重要な発達期間中の眼の閉鎖が開いた眼を介する結合の過剰な強化を生じる（上掲のJ. Syken等, 2006, 上掲のA.W. McGee等, Science 309, 2222 (2005)）。成長円錐破壊の媒介における双方のレセプターの効果の原因となっている機序はまた眼球優位性可塑性におけるその役割の共有性の基礎にありうる。
【０１７４】
損傷後に成体軸索を再生できないことは、ＣＮＳへの外傷性侵襲後における機能の再獲得に対する主要な障害である。過剰な又は過剰増殖性シナプス結合の発達を制限する目的で、シナプス可塑性の能力が年齢と共に限られてくると、再生潜在力が減退することが推測されている。この推測は、発育中及び成人期の双方におけるシナプス可塑性の制限に過去に関係付けられている（上掲のJ. Syken等, 2006）ＰｉｒＢがまたミエリンによる軸索阻害のメディエーターであるという知見からサポートを獲得しており、初期に軸索阻害に関係付けられているＮｇＲがシナプス可塑性を同様に調節するという知見を平行に提供する（S. Li等, J. Neurosci. 24, 10511 (2004)）。
【０１７５】
我々の知見はまたクラスＩ ＭＨＣ分子の範囲を超えて潜在的なＰｉｒＢリガンドのレパートリーを広くし、ニューロン再成長阻害剤を含む。逆に、既知のミエリン阻害剤Ｎｏｇｏ又はＭＡＧの遺伝子欠失がミエリンによる阻害の最も少ない減少を生じるだけなので（他の阻害剤が存在することを意味する）、我々の知見は、正常にはオリゴデンドロサイトによって低レベルで発現されるＭＨＣＩ分子が、損傷後にアップレギュレートされ、中枢ミエリンによるＮｏｇｏ及びＭＡＧと一致して伸長阻害に寄与しうる可能性を提起する。
【０１７６】
ＰｉｒＢがミエリン阻害剤に応答して軸索伸長を阻害するシグナルを発する機序は明らかではない。しかしながら、ＰｉｒＢはインテグリンレセプターの機能をアンタゴナイズ（S. Pereira等, J. Immunol. 173:5757 (2004)）し、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２ホスファターゼの双方を補充することが示された；これらの事象の何れか又は双方が正常な神経突起伸長を減弱できた。ここでの抗ＰｉｒＢ抗体を使用するか又は他の手段によるＰｉｒＢ活性のブロックは、軸索再生を刺激するための治療介入の重要な新規標的を提供する。
【０１７７】
該開示を通して引用された全ての文献は出典明示によりその全体をここに明示的に援用する。
【０１７８】
本発明を特定の実施態様であると考えられるものを参照して説明したが、本発明はそのような実施態様には限定されないことが理解されなければならない。それとは反対に、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な変形例及び均等物をカバーするものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に神経発生及び神経障害に関する。本発明は、ミエリン関連阻害系の新規な修飾因子の同定及びそのようにして同定された修飾因子の様々な用途に特に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミエリン及びミエリン関連タンパク質
成体哺乳動物のＣＮＳニューロンの軸索は傷害後に再生する能力が非常に限られている一方、末梢神経系（ＰＮＳ）の軸索は迅速に再生することが知られている。ＣＮＳニューロンの限られた再生能力は部分的にはＣＮＳ軸索の本来の性質によるが、また許容できない環境のためでもあることが知られている。ＣＮＳミエリンは、神経突起成長のための阻害キューの唯一のソースではないが、軸索成長を活発にブロックする多くの阻害性分子を含んでおり、よって再生に対する重要な障壁を構成している。３種のこのようなミエリン関連タンパク質（ＭＡＰｓ）が同定されている：Ｎｏｇｏ（ＮｏｇｏＡとしてもまた知られている）は２つの膜貫通ドメインを有するＲｅｔｉｃｕｌｏｎファミリータンパク質のメンバーである；ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）はＩｇスーパーファミリーの膜貫通タンパク質である；及びＯＭｇｐはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを持つロイシンに富む反復配列（ＬＲＲ）タンパク質である。Chen等, Nature 403:434-39 (2000); GrandPre等, Nature 417:439-444 (2000); Prinjha等, Nature 403:383-384 (2000); McKerracher等, Neuron 13:805-11 (1994); Wang等, Nature 417:941-4 (20020: Kottis等 J. Neurochem 82:1566-9 (2002)。ＮｏｇｏＡの一部のＮｏｇｏ６６は、Ｎｏｇｏの３種全てのアイソフォーム中に見出される６６アミノ酸の細胞外ポリペプチドとして記述されている。
【０００３】
その構造的な差異にもかかわらず、（Ｎｏｇｏ６６を含む）３種全ての阻害性タンパク質は、Ｎｏｇｏレセプター（ＮｇＲ；Ｎｏｇｏレセプタ−１又はＮｇＲ１としても知られている）と呼ばれる同じＧＰＩアンカーレセプターに結合することが示されており、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐの阻害作用の媒介にＮｇＲが必要とされているかも知れないことが提案されている。Fournier等, Nature 409: 341-346 (2001)。２種のＮｇＲ１ホモログ（ＮｇＲ２及びＮｇＲ３）もまた同定されている。２００５年３月３日公開のＵＳ２００５／００４８５２０Ａ１（Strittmatter等）。ＮｇＲはＧＰＩアンカー細胞表面タンパク質であることになったので、それが直接のシグナル伝達体であることはない（Zheng等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1205-1210 (2005)）。ニューロトロフィンレセプターｐ７５ＮＴＲがＮｇＲに対するコレセプターとして作用し、レセプター複合体中のシグナル伝達部分を提供することも示唆されている（Wang等, Nature 420:74-78 (2002)；Wong等, Nat. Neurosci. 5:1302-1308 (2002)）。
【０００４】
ＰｉｒＢ及びヒトオルソログ
主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩは、元々は免疫系に重要である分子ファミリーをコードする領域として元々は同定された。最近の証拠は、ＭＨＣクラスＩ分子が発達及び成体ＣＮＳにおいて更なる機能を有していることを示している。Boulanger及びShatz, Nature Rev Neurosci. 5:521-531 (2004)；２００３年９月１１日公開のＵＳ２００３／０１７０６９０（Shatz及びSyken）。ＭＨＣクラスＩメンバー及びその結合パートナーの多くがＣＮＳニューロン中に発現されることが見出されている。最近の遺伝子及び分子研究はＣＮＳ ＭＨＣクラスＩの生理学的機能に焦点を当てており、初期の結果は、ＭＨＣクラスＩ分子が、その間に既存のシナプス結合の強さがニューロン活動に応答して増加又は減少し、回路に長期間の構造的変化が続くプロセスである活動依存的シナプス可塑性に関与しているかも知れないことを示唆していた。更に、ＭＨＣクラスＩコード領域は神経学的徴候を有する広範囲の疾患に遺伝学的にまた関連しており、ＭＨＣクラスＩ分子の異常な機能は正常な脳発達及び可塑性の破壊に寄与すると考えられている。
【０００５】
免疫設定における既知のＭＨＣクラスＩレセプターの一つは、Kubagawa等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)によって最初に開示されたマウスポリペプチドのＰｉｒＢである。マウスＰｉｒＢは幾つかのヒトオルソログを有しており、これらは白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリーＢ（ＬＩＬＲＢ）のメンバーであり、「免疫グロブリン様転写物」（ＩＬＴｓ）とも称されている。ヒトオルソログは、最も高いものから最も低いものまで次の順：ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３、ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４でマウス配列と有意な相同性を示し、丁度ＰｉｒＢのように、全てが抑制性レセプターである。ＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５（ＮＰ＿００６８５５）及びＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２（ＮＰ＿００６６６０）は最初にSamaridis及びColonna, Eur. J. Immunol. 27(3):660-665 (1997)によって記載された。ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３（ＮＰ＿００６８３１）は Borges等, J. Immunol. 159(11):5192-5196 (1997)によって同定された。ＬＩＬＲＢ２／ＩＬＴ４（ＭＩＲ１０としても知られている）は、Colonna等, J. Exp. Med. 186:1809-18 (1997)によって同定された。ＰｉｒＢとそのヒトオルソログは大きな度合いの構造可変性を示す。様々な選択的スプライシング型の配列がＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋから利用でき、例えばヒトＩＬＴ４ ｃＤＮＡに対する次の受託番号を含む：ＩＬＴ４−ｃ１１ ＡＦ００９６３４；ＩＬＴ４−ｃ１１７ ＡＦ１１５６６；ＩＬＴ４−ｃ１２６ ＡＦ１１５６５。上に記載したように、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢポリペプチドはＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）阻害性レセプターであり、免疫細胞活性化におけるその役割で知られている（上掲のKubagawa等；Hayami等, J. Biol. Chem. 272:7320 (1997)；Takai等, Immunology 115:433 (2005)；Takai等, Immunol. Rev. 181:215 (2001)；Nakamura等 Nat. Immunol. 5:623 (2004)；Liang等, Eur. J. Immunol. 32:2418 (2002)）。
【０００６】
Syken等（Science 313:1795-800 (2006)）による最近の研究では、ＰｉｒＢが脳全体のニューロンサブセット中に発現されることが報告されている。機能的ＰｉｒＢを欠く変異マウスでは、皮質眼球優位性（ＯＤ）可塑性が全ての年齢で有意に亢進され、視覚野における活動依存的可塑性の制限におけるＰｉｒＢの機能を示唆している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、機能ブロック性抗ＰｉｒＢ抗体を使用してＰｉｒＢ活性を妨げることがＮｏｇｏ６６及びミエリンによる神経突起の伸長阻害のレスキューを助けること、及びＰｉｒＢ及びＮｇＲ活性を同時にブロックすることでミエリン阻害からの略完全な解放に至ることに少なくとも部分的に基づいている。
【０００８】
一態様では、本発明は、ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体と同じヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）上のエピトープに本質的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に関する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体とヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）への結合について競合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に関する。
【００１０】
また他の態様では、本発明は、ＹＷ２５９．２重鎖（配列番号４又は１１）、ＹＷ２５９．９重鎖（配列番号５又は１２）、及びＹＷ２５９．１２重鎖（配列番号６又は１３）からなる群から選択される重鎖由来の一、二、又は三の高頻度可変領域配列を含む単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に関する。
【００１１】
ある実施態様では、抗体は、ＹＷ２５９．２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号４又は１１）を含む。
【００１２】
他の実施態様では、抗体は、ＹＷ２５９．９抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号５又は１２）を含む。
【００１３】
更に他の実施態様では、抗体は、ＹＷ２５９．１２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号６又は１３）を含む。
【００１４】
更なる実施態様では、抗体は軽鎖を含む。
【００１５】
また更なる実施態様では、抗体は、配列番号７のポリペプチド配列由来の軽鎖の一、二又は三の高頻度可変領域配列を含む。
【００１６】
更に他の実施態様では、抗体は、配列番号７又は１５のポリペプチド配列を含む軽鎖の全ての高頻度可変領域配列を含む。
【００１７】
特定の実施態様では、抗体は重鎖及び軽鎖を含み、重鎖がＹＷ２５９．２重鎖（配列番号４又は１１）、ＹＷ２５９．９重鎖（配列番号５又は１２）、及びＹＷ２５９．１２重鎖（配列番号６又は１３）からなる群から選択される重鎖由来の一、二、又は三の高頻度可変領域配列を含み、及び／又は軽鎖が配列番号７又は１５のポリペプチド配列由来の軽鎖の一、二又は三の高頻度可変領域配列を含む。
【００１８】
更なる実施態様では、抗体は、抗体ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９、及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される。
【００１９】
更なる態様では、本発明は、抗体の完全長ＩｇＧ型が５ｎＭ又はそれ以上、又は１ｎＭ又はそれ以上の結合親和性でヒトＰｉｒＢに特異的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ抗体に関する。
【００２０】
ある実施態様では、抗体は、ＣＮＳニューロンの再生のような軸索再生を促進する。
【００２１】
他の実施態様では、抗体は、Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる神経突起伸長阻害を少なくとも部分的に解放（レスキュー）する。
【００２２】
全ての態様において、抗体は好ましくはモノクローナル抗体であり、これは、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、又は二重特異性抗体、抗体断片又はイムノコンジュゲートでありうる。
【００２３】
更なる態様では、 本発明はここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００２４】
他の態様では、本発明は、ここでの（一又は複数の抗体鎖のコード配列を含む）抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。該宿主細胞は、原核生物、真核生物及び哺乳動物宿主を含む。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を製造するための方法であって、（ａ）抗体をコードする核酸を含むベクターを適切な宿主細胞中において発現させ、（ｂ）抗体を回収することを含む方法に関する。
【００２６】
また更なる態様では、本発明は、ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含有する組成物に関する。場合によっては、該組成物は第二の医薬を含み、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体が第一の医薬である。第二の医薬は、例えばＮｇＲ阻害剤、例えば抗ＮｇＲ抗体でありうる。
【００２７】
異なる態様では、本発明はここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を含むキットに関する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、有効量のここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を必要とする被験者に投与することを含む軸索再生の促進方法。に関する。好ましくは、被験者はヒト患者である。
【００２９】
実施態様では、ここでの治療方法は生存又はニューロンを亢進し、及び／又はニューロン伸長を誘導する。
【００３０】
また他の態様では、本発明は、ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の有効量を、必要とする被験者に投与することを含む、神経変性疾患の治療方法に関する。神経変性疾患は、例えば中枢神経系への物理的損傷によって特徴付けられ得、限定しないが、脳卒中に伴う脳損傷を含む。
【００３１】
特定の実施態様では、神経変性疾患は、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、身体的傷害（例えば火傷、創傷）又は疾患状態、例えば糖尿病、腎不全又は癌及びＡＩＤＳの治療に使用される化学療法剤の毒作用によって引き起こされる末梢神経損傷、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものからなる群から選択される。
【００３２】
本発明は、ここでの抗ＰｉｒＢ抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体に更に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１ＡはマウスＰｉｒＢ配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】図１ＢはヒトＬＩＬＲＢ２配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。（Ａ）代表的な顕微鏡写真。
【図２Ｂ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。（Ｂ）一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフ。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ａ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ｂ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ｃ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図３Ｄ】ブロックＰｉｒＢはＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンでのＣＧＮ伸長の抑制を逆転させる。解離されたマウスＰ７ＣＧＮをＰＤＬ／ラミニン（コントロール）、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種してこれらの基質による抑制を試験した。代表的な顕微鏡写真を図３Ａ及び３Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を測定するグラフを図３Ｂ及び３Ｄに示す。ＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンで成長させたニューロンをＰｉｒＢに対する機能ブロック抗体（ａＰＢ１；５０μｍ／ｍｌ）の存在又は不存在下で培養した。ａＰＢ１は何れの基質によっても阻害を有意に低減させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，５０μｍ）。
【図４Ａ】ＰｉｒＢ及びＮｇＲは両方とも、ミエリン阻害剤による成長円錐破壊を媒介するために必要とされる。出生後ＤＲＧ軸索の成長円錐を、破壊を刺激するために、３０分間、培地単独（コントロール）、ミエリン（３ｍｇ／ｍｌ）、又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（１００ｎＭ）で処理し、成長円錐を可視化するためにローダミン−ファロイジンで染色した。（Ａ）代表的な顕微鏡写真、（Ｂ）累積的実験からの成長円錐破壊（±ＳＥＭ）を測定するグラフ。抗ＰｉｒＢ処理によるＮｇＲの遺伝子的喪失又はＰｉｒＢの阻害の何れかが、ミエリン又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の成長円錐破壊活性を防止するのに十分なだけであった。双方の経路の阻害が破壊をまた十分にブロックした。（スケールバー，５０μｍ）。
【図４Ｂ】ＰｉｒＢ及びＮｇＲは両方とも、ミエリン阻害剤による成長円錐破壊を媒介するために必要とされる。出生後ＤＲＧ軸索の成長円錐を、破壊を刺激するために、３０分間、培地単独（コントロール）、ミエリン（３ｍｇ／ｍｌ）、又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（１００ｎＭ）で処理し、成長円錐を可視化するためにローダミン−ファロイジンで染色した。（Ａ）代表的な顕微鏡写真、（Ｂ）累積的実験からの成長円錐破壊（±ＳＥＭ）を測定するグラフ。抗ＰｉｒＢ処理によるＮｇＲの遺伝子的喪失又はＰｉｒＢの阻害の何れかが、ミエリン又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６の成長円錐破壊活性を防止するのに十分なだけであった。双方の経路の阻害が破壊をまた十分にブロックした。（スケールバー，５０μｍ）。
【図５Ａ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図５Ｂ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図５Ｃ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図５Ｄ】ブロックＰｉｒＢは基質ＭＡＧ上のＤＲＧニューロン中の神経突起伸長を部分的に脱抑制する。代表的な顕微鏡写真を図５Ａ及び５Ｃに示し、一つの代表的な実験からの平均神経突起長（±ＳＥ）を示すグラフを図５Ｂ及び５Ｄに示す。（Ａ）及び（Ｂ）解離されたＰ１０ＤＲＧニューロンを抗ＰｉｒＢの存在下又は不存在下でＰＤＬ／ラミニン、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、又はミエリンに播種した。ａＰＢ１によるＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる抑制に有意な減少があった。（Ｃ）及び（Ｄ）解離されたＰ７ＣＧＮ培養物を、ａＰＢ１と共に又はａＰＢ１を伴わないで、ＰＤＬ／ラミニン又はＭＡＧ−Ｆｃ上に播種した。ＰｉｒＢに対する抗体はＭＡＧ−Ｆｃによる神経突起伸長の阻害を減少させた。（＊ｐ＜０．０１；スケールバー，２００μｍＡ，Ｂ；５０μｍＣ）。
【図６】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２重鎖のＤＮＡ配列（配列番号８）。
【図７】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．９重鎖のＤＮＡ配列（配列番号９）。
【図８】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．１２重鎖のＤＮＡ配列（配列番号３）。
【図９】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２重鎖のタンパク質配列（配列番号４）。
【図１０】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．９重鎖のタンパク質配列（配列番号５）。
【図１１】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．１２重鎖のタンパク質配列（配列番号６）。
【図１２】全てのＹＷ２５９抗体の軽鎖のタンパク質配列（配列番号７）。
【図１３】ＨｉｓタグマウスＰｉｒＢの活性を阻害する抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（ＩｇＧ）の能力。
【図１４】ＨｉｓタグマウスＰｉｒＢの活性を阻害する抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．９（ＩｇＧ）の能力。
【図１５】ＨｉｓタグマウスＰｉｒＢの活性を阻害する抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．１２（ＩｇＧ）の能力。
【図１６】ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９、及びＹＷ２５９．１２を含む抗ＰｉｒＢ抗体パネルの相対的ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６結合性。
【図１７Ａ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１１）；ＹＷ２５９．９（配列番号１２）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１３）の重鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｈドメイン及び接触ＣＤＲ Ｈドメインと共に、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１７Ｂ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１１）；ＹＷ２５９．９（配列番号１２）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１３）の重鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｈドメイン及び接触ＣＤＲ Ｈドメインと共に、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１７Ｃ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１１）；ＹＷ２５９．９（配列番号１２）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１３）の重鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｈドメイン及び接触ＣＤＲ Ｈドメインと共に、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３配列にボックスを付している。Ｈｕｍ ＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１８Ａ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１５）；ＹＷ２５９．９（配列番号１５）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１５），及びＨｕｋＩ（配列番号１４）の軽鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｌドメイン及び接触ＣＤＲ Ｌドメインと共に、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１８Ｂ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１５）；ＹＷ２５９．９（配列番号１５）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１５）、及びＨｕｋＩ（配列番号１４）の軽鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｌドメイン及び接触ＣＤＲ Ｌドメインと共に、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１８Ｃ】抗ＰｉｒＢ抗体ＹＷ２５９．２（配列番号１５）；ＹＷ２５９．９（配列番号１５）及びＹＷ２５９．１２（配列番号１５）、及びＨｕｋＩ（配列番号１４）の軽鎖配列のアラインメント。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲ Ｌドメイン及び接触ＣＤＲ Ｌドメインと共に、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３配列にボックスを付している。ＨｕｍＩＩＩは配列番号１０として開示されている。
【図１９】Ｃ１ＱＴＮＦ５（ＣＴＲＰ５；ＮＰ＿０５６４６）が後根神経節ニューロンの神経突起伸長を阻害し、この阻害は、ＰｉｒＢがＰｉｒＢ機能ブロック抗体ＹＷ２５９．２によってブロックされる場合に低減される。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
ペアード免疫グロブリン様レセプターＢ」及び「ＰｉｒＢ」なる用語はここでは交換可能に使用され、配列番号１（図１）（ＮＰ＿０３５２２５）の天然配列の８４１アミノ酸マウス抑制タンパク質、及び全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含むラット及び他の非ヒト哺乳動物におけるその天然配列ホモログを意味する。更なる詳細については、Kubagawa等, Proc Natl Acad Sci USA 94, 5261 (1997)を参照のこと。
【００３５】
「ＬＩＬＲＢ」、「ＩＬＴ」及び「ＭＩＲ」なる用語はここでは交換可能に使用され、全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含む、ヒト「白血球免疫グロブリン様レセプター、サブファミリーＢ」の全てのメンバーを意味する。ＬＩＬＲレセプターのこのＢ型サブファミリー内の個々のメンバーは、例えばＬＩＬＲＢ３／ＩＬＴ５、ＬＩＬＲＢ１／ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ５／ＩＬＴ３、及びＩＬＩＲＢ２／ＩＬＴ４のように、アクロニムに続く数字によって命名され、ここで、別の定義をしない限り、任意の個々のメンバーに対する言及は、全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型に対する言及をまた含む。よって、例えば、「ＬＩＬＲＢ２」「ＬＩＲ２」及び「ＭＩＲ１０」はここでは交換可能に使用され、配列番号２（図１）（ＮＰ＿００５８６５）の５９８アミノ酸ポリペプチド、及びその天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含むを意味する。更なる詳細については、Martin等, Trends Immunol. 23, 81 (2002)を参照のこと。
【００３６】
「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ」なる用語は、全ての天然に生じる変異体、例えば選択的スプライシング及びアレル変異体及びアイソフォーム、並びにその可溶型を含む、対応するマウス及びヒトタンパク質及び他の非ヒト哺乳動物における天然配列ホモログを併せて意味するためにここで使用される。
【００３７】
「ミエリン関連タンパク質」なる用語は最も広い意味に使用され、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ及びＯＭｇｐを含む、ニューロン再生を抑制するＣＮＳミエリン中に存在する全てのタンパク質を含む。
【００３８】
「単離された」は、ここに開示された様々なタンパク質を記述するために使用される場合、同定されその自然環境の成分から分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、典型的にはそのタンパク質の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。好ましい実施態様では、タンパク質は、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、又は（２）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性まで、又は（３）質量分析又はペプチドマッピング技術により均一性まで、精製される。単離されたタンパク質には、当該タンパク質の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００３９】
「単離された」核酸分子は、当該核酸の天然源に通常は伴う少なくとも一種の汚染核酸分子から同定され分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態又は設定以外のものである。従って、単離された核酸分子は、それが天然の細胞中に存在している核酸分子から区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞の位置とは異なる染色体位置にあるコードされたかかる核酸を通常は発現する細胞中に含まれる核酸分子を含む。
【００４０】
ここで使用される場合、「ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニスト」なる用語は、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ活性をブロックし、中和し、阻害し、抑制し、低減させ又は妨害することのできる薬剤を指すために使用される。特に、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ミエリン関連阻害活性を妨害し、よって、神経突起伸長を亢進し、及び／又はニューロン成長、修復及び／又は再生を促進する。好ましい実施態様では、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに結合することにより、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢのＮｏｇｏ６６及び／又はＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐへの結合を阻害する。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは、例えば、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する抗体及びその抗原結合断片、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＮｏｇｏ６６との間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＭＡＧとの間、又はＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢとＯＭｇｐとの間の結合を隔絶することができるＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ、Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ又はＯＭｇｐの切断型は可溶型断片及びＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ関連阻害経路の小分子阻害剤を含む。ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストはまたＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ ｍＲＮＡの発現を阻害し又は減少させることができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を含む。好ましいＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢアンタゴニストは抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体である。
【００４１】
ここでの「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にインタクトな抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二のインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。
【００４２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、少量で存在しうる可能な天然に生じる変異を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の抗体によって汚染されないで合成されうる点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を示すものであり、抗体が何か特定の方法による生産を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256: 495 (1975)よって記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製されうる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」はまた例えばClackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離することもまたできる。
【００４３】
抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に一致するか又は相同するが、残りの鎖が、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列に一致するか又は相同するものである「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を特に含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。ここで興味のあるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含むプリマタイズ抗体を含む。
【００４４】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４５】
「インタクト」抗体は抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、インタクト抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００４６】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は、抗体の性能を更に洗練させるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００４７】
ここで使用される「高頻度可変領域」なる用語は、配列が高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４、５０−５６、及び８９−９７、及び重鎖可変ドメインの３１−３５、５０−６５、及び９５−１０２；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２、５０−５２、及び９１−９６及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２、５３−５５、及び９６−１０１；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917(1987)）を含む。双方の場合、以下に更に詳細に検討するように、上掲のKabat等に従って可変ドメイン残基の番号を付ける。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義する高頻度可変領域中の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４８】
「親抗体」又は「野生型」抗体は、ここに開示された抗体変異体と比較して一又は複数のアミノ酸配列改変を欠くアミノ酸配列を含む抗体である。よって、親抗体は一般にここに開示された抗体変異体の対応する高頻度可変領域のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる少なくとも一つの高頻度可変領域を有している。親ポリペプチドは、天然配列（つまり天然に生じる）抗体（天然に生じる対立遺伝子変異体）、又は天然に生じる配列の既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失及び／又は他の改変）を有する抗体を含みうる。開示全体を通して、「野生型」、「ＷＴ」、「ｗｔ」及び「親」又は「親の」抗体は交換可能に使用される。
【００４９】
ここで使用される場合、「抗体変異体」又は「変異体抗体」は、親抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する抗体を意味する。好ましくは、抗体変異体は、天然には見出されないアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含む。かかる変異体は親抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性を必ず有している。好ましい実施態様では、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、約７５％から１００％未満、より好ましくは約８０％から１００％未満、より好ましくは約８５％から１００％未満、より好ましくは約９０％から１００％未満、及び最も好ましくは約９５％から１００％未満のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有する。抗体変異体は一般に一又は複数のその高頻度可変領域中に又はそれに隣接して一又は複数のアミノ酸変更を含むものである。
【００５０】
「アミノ酸改変」とは、予め定まったアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を意味する。例示的な変更は、挿入、置換及び欠失を含む。「アミノ酸置換」とは、予め定まったアミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基を他の異なったアミノ酸残基で置換することを意味する。
【００５１】
「置換」アミノ酸残基とは、アミノ酸配列中の別のアミノ酸残基を置換又は置き換えるアミノ酸残基を意味する。置換残基は天然に生じるアミノ酸残基又は天然には生じないアミノ酸残基でありうる。
【００５２】
「アミノ酸挿入」とは、予め定まったアミノ酸配列中への一又は複数のアミノ酸残基の導入を意味する。アミノ酸挿入はペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドが予め定まったアミノ酸配列に導入される「ペプチド挿入」を含んでいてもよい。アミノ酸挿入がペプチド挿入を含む場合、挿入されたペプチドは天然には存在しないアミノ酸配列を持つようにランダム突然変異によって産生され得る。「高頻度可変領域の近傍」におけるアミノ酸変更は、挿入又は置換されたアミノ酸残基の少なくとも一つが当該高頻度可変領域のＮ末端又はＣ末端アミノ酸残基とペプチド結合を形成するような、高頻度可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端への一又は複数のアミノ酸残基の導入を意味する。
【００５３】
「天然に生じるアミノ酸残基」は、一般に、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される、遺伝子暗号にコードされたものである。
【００５４】
ここでの「天然に生じないアミノ酸残基」とは、上に列挙した天然に生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を意味し、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基（群）に共有的に結合可能である。天然に生じないアミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及びEllman等, Meth. Enzym. 202:301-336(1991)に記載のもののような他のアミノ酸残基アナログが含まれる。そのような天然に生じないアミノ酸残基を産生するには、Noren 等 Science 244:182(1989)と上掲のEllman等の手順を使用することができる。簡単にいうと、これらの手順は、天然に生じないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性させ、ついでインビトロのＲＮＡ転写と翻訳を行うことを含む。
【００５５】
本明細書にわたって、Kabat, E. A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及び(1991)からの番号付けシステムが参照される。これらの概論において、カバットは、各サブクラスに対して多くのアミノ酸配列を列挙し、そのサブクラスにおける各残基一に対して最も頻繁に生じるアミノ酸を列挙している。カバットは列挙された配列中の各アミノ酸に対して残基番号を割り当てる方法を使用し、残基番号を割り当てるこの方法は当該分野で標準的になった。この明細書では、カバット番号付けスキームに従う。本発明の目的に対しては、カバットの概論に含まれていない候補抗体アミノ酸配列に残基番号を割り当てる場合は、次の工程に従う。一般に、候補配列をカバットで任意の免疫グロブリン配列又は任意のコンセンサス配列と整列させる。アラインメントは手作業で行うか、又は一般的に許容されるコンピュータプログラムを使用してコンピュータによってなされ得、かかるプログラムの一例はＡｌｉｇｎ２プログラムである。アラインメントは、殆どのＦａｂ配列に共通である幾らかのアミノ酸残基を使用することによって容易にすることができる。例えば、軽鎖及び重鎖はそれぞれ典型的には同じ残基番号を有している二つのシステインを有している；ＶＬドメインにおいてその二つのシステインは典型的には残基番号２３及び８８であり、ＶＨドメインでは、その二つのシステインは典型的には２２及び９２と番号付けされる。フレームワーク残基は一般的には、必ずしも全てではないが、およそ同じ残基番号を有しており、ＣＤＲｓはサイズが変化しうる。例えば、それが整列されるカバットの配列中のＣＤＲより長い候補配列からのＣＤＲの場合には、典型的には、更なる残基の挿入を示すために残基番号に接尾語が付加される（例えば、図１Ｂの残基１００ａｂｃを参照）。残基３４及び３６のカバット配列とアラインするが残基３５とアラインする残基をその間に持たない候補配列では、番号３５は単に残基には単に割り当てられない。
【００５６】
ここで使用される場合、「高親和性」を有する抗体は、ナノモル（ｎＭ）範囲又はそれより良いＫＤ、又は解離定数を有する抗体である。「ナノモル（ｎＭ）範囲又はそれより良い」ＫＤはＸｎＭによって表すことができ、ここで、Ｘは約１０未満の数である。
【００５７】
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数のＣＤＲに一又は複数の変更を有するものであって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の又は更にはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において既知の方法により生産される。Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992)は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas等, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００５８】
抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。
【００５９】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体からそれを区別するその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
【００６０】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編 (1988)に記載されたもののような常套的な交差ブロックアッセイ法を実施することができる。
【００６１】
「糸状ファージ」なる用語は、その表面に異種性ポリペプチドをディスプレイすることができるウイルス粒子を意味し、限定するものではないが、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、及びＭ１３を含む。糸状ファージはテトラサイクリンのような選択可能マーカーを含みうる（例えば「ｆｄ−ｔｅｔ」）。様々な糸状ファージディスプレイは当業者によく知られている（例えばZacher等 Gene 9: 127-140 (1980), Smith等 Science 228: 1315-1317 (1985);及びParmley及びSmith Gene 73: 305-318 (1988)を参照）。
【００６２】
「パニング」なる用語は、標的に対して高い親和性及び特異性を持つ抗体のような化合物を有するファージの同定及び単離において複数回のスクリーニング方法を指すために使用される。
【００６３】
「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」なる用語は、遺伝子発現を妨害する小さい二本鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡｓは、二本鎖ＲＮＡが相同遺伝子を発現停止させるプロセスであるＲＮＡ干渉の中間体である。ｓｉＲＮＡｓは典型的には一本鎖オーバーハングを含みうる二重鎖を形成する約１５−２５ヌクレオチド長の二つの一本鎖ＲＮＡｓから構成される。例えばポリメラーゼのような酵素複合体による二本鎖ＲＮＡのプロセシングは二本鎖ＲＮＡの開裂を生じ、ｓｉＲＮＡｓを生産する。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ｍＲＮＡ開裂をガイドするためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）サイレンシング複合体によって使用され、それによってｍＲＮＡ分解が促進される。例えば哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡｓを使用して特異的な遺伝子の発現を停止させるために、塩基対形成領域が、未関連ｍＲＮＡに対する偶然の相補性を避けるために選択される。ＲＮＡｉサイレンシング複合体は、例えばFire等, Nature 391:806-811 (1998)及びMcManus等, Nat. Rev. Genet. 3(10):737-47 (2002)によるように当該分野で同定されている。
【００６４】
「干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）」なる用語は、ここでは、特定のｍＲＮＡｓの触媒的分解を生じる二本鎖ＲＮＡを意味するために使用され、よって特定の遺伝子の発現を阻害／低下させるために使用することができる。
【００６５】
「遺伝子多型」なる用語は、遺伝子又はその一部（例えばアレル変異体）の一を越える形態を意味するためにここで使用される。少なくとも２つの異なった形態にある遺伝子の一部は遺伝子の「遺伝子多型領域」と称される。遺伝子の多型領域の特定の遺伝子配列は「アレル」である。多型領域は、異なるアレルで異なるか又は幾つかのヌクレオチド長でありうる単一のヌクレオチドでありうる。
【００６６】
ここで使用される場合、一般に「疾患」なる用語は、軸索再生治療法から恩恵を受けることが期待される任意の症状、及び／又は神経系におけるシナプス可塑性の改善を含む、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ２のアンタゴニスト、例えば抗ＰｉｒＢ抗体での治療から恩恵を受ける任意の症状を意味する。ここで治療される疾患の非限定的な例には、限定しないが、例えば物理的に損傷を受けた神経及び神経変性疾患のような神経障害を含む、神経突起伸長の亢進、ニューロン成長、修復又は再生の促進から恩恵を受ける疾病及び症状を含む。かかる疾患は特に中枢神経系に対する物理的損傷（例えば、脊髄損傷及び頭部外傷）；脳卒中に伴う脳損傷；及び神経変性に関連する神経障害、例えば三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、多発性硬化症（ＭＳ）、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板(invertebrate disk)症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、身体的傷害又は糖尿病のような疾患状態によって引き起こされる末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものを含む。
【００６７】
ここで使用される「治療する」、「治療」及び「治療法」なる用語は、治癒的治療、予防的療法及び防護的療法を意味する。連続的治療又は投与は、一又は複数の日数による治療の中断なく少なくとも毎日の基準での治療を意味する。間欠的治療又は投与、又は間欠的な形式での治療又は投与は、連続的ではなくむしろ周期的な性質である治療を意味する。
【００６８】
ここで使用される「神経変性を予防する」なる用語は、（１）神経変性疾患を持つと新たに診断された又は新たな神経変性疾患が発症するリスクにある患者において神経変性を阻害又は予防する能力及び（２）神経変性疾患に既に罹っているか又は神経変性疾患の徴候を有している患者において更なる神経変性を阻害又は予防する能力を含む。
【００６９】
ここで使用される「哺乳動物」なる用語は、ヒト、高等の非ヒト霊長類、家庭及び酪農用動物、例えばウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳類に分類される任意の哺乳動物を意味する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００７０】
一又は複数の治療剤と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００７１】
「有効量」とは、有益な又は所望の治療（予防を含む）結果を達成するのに十分な量である。有効量は一又は複数の投与で投与されうる。
【００７２】
ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる表現は交換可能に使用され、かかる全ての標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」なる言葉は、移行数にかかわらず、初代対象細胞及びそれから誘導された培養物を含む。全ての子孫が、意図的な変異あるいは意図しない変異の影響で、ＤＮＡ含量において正確に同一でなくともよいこともまた理解される。「子孫」なる用語は、元々の形質転換細胞又は細胞株に続くあらゆる世代の任意の及び全ての子孫を意味する。元々の形質転換細胞おいてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。区別する標記が意図される場合は、それは文脈から明らかであろう。
【００７３】
ここで同定される配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成することができ、当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のためには、パーセントアミノ酸配列同一性値は、ジェネンテック社によって著作され、そのソースコードが米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用して得ることができる。ＡＬＩＧＮ-２はジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能である。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間で所望される同一性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００７５】
ここで定義される「高ストリンジェンシー条件」は、（１）５０℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと、洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる；（２）４２℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドに０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムの変性剤をハイブリダイゼーションに用いる；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）での４２℃での洗浄と５０％のホルムアミドでの５５℃での洗浄に、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄が続くものによって、同定されうる。
【００７６】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているようにして特定され、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜のインキュベーション後に、３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルター洗浄を行うことを含む。プローブ長などの因子に必要に応じて適合させるには、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは当業者であれば分かるであろう。
【００７７】
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００７８】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の実務に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
【００７９】
「小分子」はここでは約１０００ダルトン以下、好ましくは約５００ダルトン以下の分子量を有するものと定義される。
【００８０】
Ｂ．抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の生産
本発明の抗ＰｉｒＢ抗体は、組換えＤＮＡ法の技術を含む当該分野で知られている方法によって製造することができる。
ｉ）抗原調製
他の分子と結合されていてもよい可溶型抗原又はその断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。レセプターのような膜貫通分子では、これらの断片（例えばレセプターの細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。別法では、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することができる。かかる細胞は、天然源（例えば癌細胞株）から誘導することができ、又は膜貫通分子を発現させるために組換え技術によって形質転換されている細胞でありうる。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は当業者には明らかであろう。
【００８１】
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物において産生させる。関連抗原を、二官能性又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣＩ２、又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、Ｒ及びＲ１は異なったアルキル基である）を使用して、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシン阻害剤に結合させるのが有用でありうる。
【００８２】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８３】
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで作製することができ、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又はマカクザル等の他の適切な宿主動物を上述のようにして免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を生産するか又は生産可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【００８４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含む適切な培養培地に播種され増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００８５】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。これらのなかで、より好ましいミエローマ細胞株はマウスミエローマ株、例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerから入手可能であるMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍から誘導されたものやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能であるSP-2又はX63-Ag8-653細胞である。ヒトモノクローナル抗体を生産するためにヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた開示されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００８６】
ハイブリドーマ細胞が増殖される培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合アッセイによって測定する。
【００８７】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる（Goding, MonoclonalAntibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的のための適当な培地には、例えば、D-MEM又はＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物においてインビボで腹水腫瘍として増殖させることもできる。
【００８８】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の一般的な免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から好適に分離される。
【００８９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しないミエローマ細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。抗体の組換え生産は以下により詳細に記載される。
【００９０】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。
【００９１】
Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体のそれぞれの単離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフッリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００９２】
また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより、修飾することができる。
【００９３】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換でき、あるいはそれらは抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、抗原に対して特異性を有する抗原結合部位と異なった抗原に対して特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ性二価抗体を産生する。
【００９４】
（ｉｖ）ヒト及びヒト化抗体
ヒト化抗体には非ヒトである由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の対応する配列に齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することにより、ウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾らかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【００９５】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を作製する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993)）。
【００９６】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムが購入可能である。これら表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００９７】
別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えばJakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる (Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。抗体ファージディスプレイライブラリーからのヒト抗体の生産を以下に更に記載する。
【００９８】
（ｖ）抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照)。しかし、これらの断片は今は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。以下の実施例に記載される他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２は、Ｆ(ａｂ')２分子の構築を促進するためにロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成される。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号を参照。
【００９９】
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、エピトープが通常は異なった抗原由来である少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する。このような分子は通常は二つのエピトープを結合させるのみであるが(すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂｓ)、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。ＢｓＡｂｓの例には、一方のアームがＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ２に向けられ他方のアームがＮｏｇｏ又はＭＡＧ又はＯＭｇｐに向けられたものが含まれる。ＢｓＡｂｓの更なる例には、一方のアームがＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ２に向けられ他方のアームがＮｇＲに向けられたものが含まれる。
【０１００】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な生産は、二つの鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein等, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成されるが、かなり面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順が国際公開第93/08829号、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-36569(1991)に開示されている。異なるアプローチ法では、所望の結合特異性(抗体抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１０１】
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１０２】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１０３】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号）。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１０４】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１０５】
大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することもでき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。
【０１０６】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。該断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１０７】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１０８】
（ｖｉｉ）エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の有効性を向上させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成されたホモ二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体は、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１０９】
(ｖｉｉｉ）抗体-サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様では、例えば腫瘍浸透性を増大させるためにインタクト名抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを導入することにより(例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを導入することにより)、達成できる。
【０１１０】
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に移動させられた領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のループ由来の３以上の残基が移動する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域の（例えばＩｇＧの）ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域又はＶＬ領域、又はその両方に移動する。
【０１１１】
（ｉｘ）抗体の他の共有的修飾
抗体の共有的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされうる。抗体の共有的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。共有的修飾の例は、特に出典明示によりここに援用される米国特許第５５３４６１５号に記載されている。抗体の共有的修飾の好ましいタイプは、米国特許第４６４０８３５号；同第４４９６６８９号；同第４３０１１４４号；同第４６７０４１７号；同第４７９１１９２号又は同第４１７９３３７号に記載されているようにして、様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン類の一つに抗体を結合させることを含む。
【０１１２】
（ｘ）合成抗体ファージライブラリーからの抗体の産生
ある好適な実施態様では、本発明は特有のファージディスプレイアプローチ法を使用して新規な抗体を産生し選択する方法を提供する。該アプローチ法は、単一フレームワーク鋳型に基づく合成抗体ファージライブラリーの産生、可変ドメイン内の十分な多様性の設計、多様化した可変ドメインを有するポリペプチドのディスプレイ、抗原を標的とする高親和性を持つ候補抗体の選択、及び選択された抗体の単離を含む。
【０１１３】
ファージディスプレイ法の詳細は、例えば出典明示によりここに明示的に援用される２００３年１２月１１日公開の国際公開第０３／１０２１５７号に見出すことができる。
【０１１４】
一態様では、本発明において使用される抗体ライブラリーは抗体可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲにおいて溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置を変異させることによって産生させることができる。ＣＤＲの幾らか又は全てをここに提供した方法を使用して変異させることができる。ある実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリーを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリーを形成するか、又はＣＤＲＬ３及びＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３中の位置に変異を施して単一のライブラリを形成することにより、多様な抗体ライブラリを創ることが好ましい場合がある。
【０１１５】
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の溶媒接近可能な及び／又は高度に多様性の位置に変異を有する抗体可変ドメインのライブラリーをつくることができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に変異を有する他のライブラリーをつくることができる。これらのライブラリーは所望の親和性の結合体をつくるために互いに関連させて使用することもできる。例えば、標的抗原への結合についての重鎖ライブラリーの一又は複数回の選択後に、軽鎖ライブラリを結合体の親和性を増加させるために更なる選択回数に対して重鎖結合体の集団中に置き換えることができる。
【０１１６】
好ましくは、ライブラリーは重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域における変異アミノ酸での元のアミノ酸の置換によりつくられる。得られたライブラリーは複数の抗体配列を含み得、ここで配列多様性は主として重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
【０１１７】
一態様では、ライブラリーはヒト化抗体４Ｄ５配列、又はヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸の配列の態様でつくり出す。好ましくは、ライブラリーはＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で重鎖の少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられ、ここでＤＶＫコドンセットはこれらの位置の各一に対して変異アミノ酸セットをコードするために使用される。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの一例は配列(ＤＶＫ)７を含む。ある実施態様では、ライブラリーはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)６(ＮＮＫ)を含む。他の実施態様では、ライブラリーはＤＶＫとＮＮＫの双方のコドンセットによってコードされるアミノ酸で少なくとも残基９５−１００ａを置換することによりつくられる。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの例は配列(ＤＶＫ)５(ＮＮＫ)を含む。これらの置換をつくるのに有用なオリゴヌクレオチドセットの他の例は配列(ＮＮＫ)６を含む。好適なオリゴヌクレオチド配列の他の例はここに記載された基準に従って当業者によって決定することができる。
【０１１８】
他の実施態様では、異なったＣＤＲＨ３設計を使用して高親和性結合体を単離し様々なエピトープに対して結合体を単離する。このライブラリーにおいて産生されたＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３アミノ酸であるが、これとは異なった長さも産生することができる。Ｈ３多様性はＮＮＫ、ＤＶＫ及びＮＶＫコドンセットを使用し、並びにＮ及び／又はＣ末端での多様性をより制限して、拡張することができる。
【０１１９】
多様性をＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２においてまた生じさせることができる。ＣＤＲ-Ｈ１及びＨ２多様性の設計は、過去の設計よりも天然の多様性により密に適合する多様性に焦点を当てる変更をした上で、上述の天然抗体レパートリーを模倣するターゲティング方策に従う。
【０１２０】
ＣＤＲＨ３での多様性に対しては、複数のライブラリーを、異なった長さのＨ３と別個に構築し、ついで、標的抗原に対する結合体を選択するために組み合わせる。複数のライブラリーをプール化し、過去に記載され以下に記載されたような固体支持体選別及び溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を用いることができる。例えば、一つの変異は固体に結合した標的での選別を含み、融合ポリペプチド上に存在しうるタグ(例えば抗ｇＤタグ)の選別が続く。別法として、ライブラリーは固体表面に結合した標的で先ず選別することができ、溶出した結合体がついで標的抗原の濃度を減少させた溶液相結合を使用して選別される。異なった選別法を併用することにより高度に発現した配列のみの選択の最小化がもたらされ、多くの異なった高親和性クローンの選択をもたらす。
【０１２１】
標的抗原に対する高親和性結合体はライブラリーから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域における多様性の制限は約１０４から１０５倍縮重を減少させ、より多くのＨ３多様性を許容することによりより多くの高親和性結合体をもたらす。ＣＤＲＨ３において異なったタイプの多様性を持つライブラリーを利用することにより(例えばＤＶＫ又はＮＶＴを利用して)標的抗原の異なったエピトープに結合しうる結合体の単離をもたらす。
【０１２２】
上述のプールされたライブラリーから単離された結合体において、軽鎖において制限された多様性を提供することによって親和性を更に改善することができることが発見された。軽鎖多様性はこの実施態様では以下のように生成される。ＣＤＲＬ１においては：アミノ酸位置２８がＲＤＴによってコードされる；アミノ酸位置２９がＲＫＴによってコードされる；アミノ酸位置３０がＲＶＷによってコードされる；アミノ酸位置３１がＡＮＷによってコードされる；アミノ酸位置３２がＴＨＴによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置３３がＣＴＧによってコードされる；ＣＤＲＬ２においては：アミノ酸位置５０がＫＢＧによってコードされる；アミノ酸位置５３がＡＶＣによってコードされる；場合によっては、アミノ酸位置５５がＧＭＡによってコードされる；ＣＤＲＬ３においては：アミノ酸位置９１がＴＭＴ又はＳＲＴ又はその両方によってコードされる；アミノ酸位置９２がＤＭＣによってコードされる；アミノ酸位置９３がＲＶＴによってコードされる；アミノ酸位置９４がＮＨＴによってコードされる；アミノ酸位置９６がＴＷＴ又はＹＫＧ又は両方によってコードされる。
【０１２３】
他の実施態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域に多様性を持つライブラリー又はライブラリー群が作成される。この実施態様では、ＣＤＲＨ３における多様性は様々な長さのＨ３領域を用い、主にコドンセットＸＹＺ及びＮＮＫ又はＮＮＳを用いてつくり出される。ライブラリーは個々のオリゴヌクレオチドを使用して形成しプールすることができ、又はオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーのサブセットを形成することができる。この実施態様のライブラリーは固体に結合した標的に対して選別することができる。多重選別から単離されたクローンをＥＬＩＳＡアッセイを使用して特異性及び親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンを所望の標的抗原並びに他の非標的抗原に対してスクリーニングすることができる。標的抗原に対する結合体をついで溶液結合競合ＥＬＩＳＡアッセイ又はスポット競合アッセイでの親和性についてスクリーニングすることができる。高親和性結合体は上に記載したようにして調製されたＸＹＺコドンセットを使用してライブラリーから単離することができる。これらの結合体は抗体又は抗原結合断片として細胞培養物中に高収量で直ぐに産生されうる。
【０１２４】
ある実施態様では、ＣＤＲＨ３領域の長さに大なる多様性を持つライブラリを作成することが望まれる場合がある。例えば、約７から１９アミノ酸の範囲のＣＤＲＨ３領域を持つライブラリーを作成することが望ましい場合がある。
【０１２５】
これらの実施態様のライブラリーから単離された高親和性結合体は細菌及び真核生物細胞培養で高収量で直ぐに産生される。ベクターはｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列のような配列を直ぐに除去し、及び／又は定常領域配列に加えて完全長抗体又は抗原結合断片を高収量で生産するように設計することができる。
【０１２６】
ＣＤＲＨ３での変異を持つライブラリーを、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２のような他のＣＤＲの変異型を含むライブラリーと組み合わせることができる。よって、例えば、一実施態様では、ＣＤＲＨ３ライブラリーは予め定まったコドンセットを使用して位置２８、２９、３０、３１、及び／又は３２に変異アミノ酸を持つヒト化４Ｄ５抗体配列の形態において作りだしたＣＤＲＬ３ライブラリーと組み合わせられる。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３に対する変異のライブラリーは変異ＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２重鎖可変ドメインを含むライブラリーと組み合わせることができる。一実施態様では、ＣＤＲＨ１ライブラリーは位置２８、３０、３１、３２及び３３に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５配列を用いてつくり出される。ＣＤＲＨ２ライブラリーは予め定まったコドンセットを使用して位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８に変異アミノ酸を持つヒト化抗体４Ｄ５の配列を用いてつくり出すことができる。
【０１２７】
抗体変異体
ファージライブラリーから生成される新規な抗体を更に修飾して、親抗体よりも改善した物理学的、化学的及び／又は生物学的特性を有する抗体変異体を生産することができる。使用するアッセイが生物学的活性アッセイである場合、抗体変異体は、選択したアッセイにおいて、該アッセイにおける親抗体の生物学的活性よりも少なくとも約１０倍良好な、好ましくは少なくとも約２０倍良好な、より好ましくは少なくとも約５０倍良好な、時には少なくとも約１００倍又は２００倍良好な生物学的活性を有する。例えば、抗体変異体は、親抗体の結合親和性より、少なくとも約１０倍強力な、好ましくは少なくとも約２０倍強力な、より好ましくは少なくとも約５０倍強力な、時には少なくとも約１００倍又は２００倍強力な、ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢに対する結合親和性を有することが好ましい。
【０１２８】
抗体変異体を産生するためには、親抗体の高頻度可変領域の一又は複数中に一又は複数のアミノ酸修飾(例えば置換)が導入される。別法として、又は加えて、フレームワーク領域残基の一又は複数の修飾(例えば置換)を親抗体に導入することができ、これらにより第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗体変異体の結合親和性が改善される。修飾するためのフレームワーク領域残基の例には、抗原に非共有的に結合するもの(Amit等 (1986) Science 233:747-753)；ＣＤＲと相互作用し／そのコンホメーションに影響を及ぼすもの(Chothia等 (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)；及び／又はＶＬ−ＶＨ界面に関与するもの(欧州特許第２３９４００号Ｂ１)が含まれる。ある実施態様では、そのようなフレームワーク領域残基の一又は複数の修飾により第二の哺乳動物種由来の抗原に対する抗原の結合親和性が向上する。例えば、約１から約５のフレームワーク残基を本発明のこの実施態様において改変することができる。しばしば、これは、高頻度可変領域が何ら改変されていない場合でさえ、前臨床試験に使用するのに適した抗体変異体を生じるのに十分でありうる。しかしながら、通常は、抗体は更なる高頻度可変領域の改変を含む。
【０１２９】
改変される高頻度可変領域残基は、特に親抗体の出発結合親和性が、無作為に生産された抗体変異体を直ぐにスクリーニングすることができるものである場合には、無作為に変化させることができる。
【０１３０】
そのような抗体変異体を産生するための一つの有用な方法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」(Cunningham及びWells Science 244:1081-1085 (1989))と呼ばれる。ここで、高頻度可変領域残基（群）の一又は複数が、第二の哺乳動物種からの抗原とのアミノ酸の相互作用をなすためにアラニン又はポリアラニン残基（群）によって置換される。ついで、置換に対する機能的感受性を示す高頻度可変領域残基（群）は、置換部位に又はそれに対して更なる又は他の変異を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異の種類自体は予め決める必要はない。このようにして産生されるａｌａ変異体がここに記載したその生物活性についてスクリーニングされる。
【０１３１】
通常は、「好ましい置換」の表題で以下に示されているもののような保存的置換で始める。そのような置換が生物活性(例えば結合親和性)の変化を生じるならば、次の表において「例示的置換」と命名され、又はアミノ酸クラスを参照して以下に更に記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされる。
【０１３２】
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けされる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とする。
他の実施態様では、修飾のために選択される部位がファージディスプレイを使用して親和性成熟される（上を参照）。
アミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、限定されるものではないが、親抗体の先に調製された変異体又は非変異体型のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発を含む。変異体を作製するための好ましい方法は部位特異的突然変異誘発(例えばKunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488を参照)である。
ある実施態様では、抗体変異体は単一の高頻度可変領域残基が置換されただけのものである。他の実施態様では、親抗体の高頻度可変領域残基の二以上が置換され、例えば約２から約１０の高頻度可変領域置換である。
【０１３３】
通常、抗体変異体は、親抗体の重鎖又は軽鎖の何れかの可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に親抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、上を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
【０１３４】
抗体変異体の産生後に、親抗体に対するその分子の生物活性が決定される。上に述べたように、これは抗体の結合親和性及び／又は他の生物活性を決定することを含みうる。本発明の好適な実施態様では、抗体変異体のパネルを調製し、抗原又はその断片に対する結合親和性についてスクリーニングする。この最初のスクリーニングから選択される抗体変異体の一又は複数に場合によっては一又は複数の更なる生物活性アッセイを施して、結合親和性が向上した抗体変異体が例えば前臨床研究に確かに有用であることが確認される。
【０１３５】
このように選択された抗体変異体は、しばしば抗体の意図される用途に応じて更なる修飾を受けることができる。そのような修飾は以下に詳細を記載したもののようなアミノ酸配列の更なる改変、異種ポリペプチドに対する融合及び／又は共有的修飾を含む。アミノ酸配列改変については例示的な修飾を上に詳細に説明した。例えば、抗体変異体の正しいコンホメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基はまた一般にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に加えてその安定性を改善することができる(特に抗体がＦｖ断片のような抗体断片である場合)。他のタイプのアミノ酸変異体は改変されたグリコシル化パターンを有する。これは抗体に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は抗体中に存在していない一又は複数のグリコシル化部位を加えることによって達成することができる。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とはアスパラギン残基の側鎖への糖鎖部分の付着を意味する。トリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)がアスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的付着に対する認識配列である。よって、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると潜在的なグリコシル化部位をつくる。Ｏ結合グリコシル化はヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(但し５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた使用できる)への糖Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの付着を意味する。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位に対する)の一又は複数を含むようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。改変はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加又は置換によって行うこともできる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
【０１３６】
（ｘｉｉ）抗体の組換え生産
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離されるか合成されて、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列（例えば出典明示によりここに特に援用される米国特許第５５３４６１５号に記載のもの）である。
【０１３７】
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなくむしろ例示的なものである。
【０１３８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【０１３９】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞はまた多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養をまた宿主として利用することができる。
【０１４０】
しかしながら、脊椎動物細胞における興味が最もあり、培養(組織培養)中の脊椎細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚腎細胞系(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol. 36:59(1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【０１４１】
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された一般的栄養培地で培養される。
【０１４２】
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ)、(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４３】
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌される場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１４４】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（登録商標）樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）クロマトグラフィー（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
【０１４５】
Ｃ．抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の用途
本発明の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は、神経細胞の生存を亢進し又は伸長を誘導するための薬剤としての用途が見出されると考えられる。それらは、従って、例えば中枢神経系（脊髄及び脳）への物理的損傷；脳卒中に伴う脳損傷；及び神経変性に関連する神経障害、例えば三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、身体的傷害（例えば火傷、創傷）又は疾患状態、例えば糖尿病、腎不全又は癌及びＡＩＤＳの治療に使用される化学療法剤の毒作用によって引き起こされる末梢神経損傷、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板(invertebrate disk)症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものを含む、神経系の変性疾患（「神経変性疾患」）の治療に有用である。
【０１４６】
ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体はまたインビトロで神経細胞を培養するのに使用される培養培地の成分としても有用である。
【０１４７】
最後に、ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を含む調製物は、放射性ヨウ素、酵素、フルオロフォア、スピン標識等で標識される場合、競合的結合アッセイにおける標準物質として有用である。
【０１４８】
ここでの抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の治療的製剤は、所望の程度の純度を持つ抗体を、場合によって生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osol., A., Ed., (1980)）と、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で混合することにより貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｔｏｎｉｃｓ、又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４９】
インビボ投与のために使用される抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、濾過滅菌膜による濾過によって容易に達成されうる。
【０１５０】
治療用組成物は、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配されうる。
【０１５１】
本発明の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は、ＮＧＦ、ＮＴ−３、及び／又はＢＤＮＦを含む神経栄養因子と場合によっては組み合わされ、又は併用して投与され、神経変性疾患のための他の一般的治療法と共に使用されうる。また、本発明の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体は、有利には、ＮｇＲ阻害剤、例えばＮｇＲに対するＮｏｇｏ−６６、ＭＡＧ及び／又はＯＭｇｐの結合をブロックする抗体、小分子又はペプチドと併用して投与されうる。
【０１５２】
投与経路は既知の方法、例えば、以下に説明するように、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
【０１５３】
脳内投与の場合、化合物は、ＣＮＳの液貯留部(fluid reservoirs)中に注入により連続的に投与されうるが、ボーラス注入も許容できる。化合物は好ましくは脳の脳室中に投与されるか又はＣＮＳ又は髄液中に導入等される。投与は、ポンプのような連続投与手段を使用する留置カテーテルにより実施することができ、又は徐放性ビヒクルの移植、例えば脳内移植によって投与することができる。より詳細には、化合物は、慢性移植カニューレを通して注入されるか、又は浸透圧ミニポンプの補助で慢性的に注入されうる。脳室に小さなチュービングを通してタンパク質をデリバーする皮下ポンプを利用できる。非常に複雑なポンプは皮膚から再充填でき、そのデリバリー速度は外科的介入なしにセットできる。皮下ポンプ装置又は全体的に移植されたドラッグデリバリー系による連続側脳室内注入を含む適切な投与プロトコル及びデリバリー系の例は、Harbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271 (1987)；及びDeYebenes等, Mov. Disord. 2:143 (1987)によって記載されているアルツハイマー患者及びパーキンソン病の動物モデルに対するドーパミン、ドーパミンアゴニスト、及び抗コリン性アゴニストの投与に対して使用されているものである。
【０１５４】
持続放出調製物の好適な例は、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態で半透過性ポリマーマトリクスを含む。持続放出マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman,等, 1983, Biopolymers 22:547）、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)（Langer,等, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167；Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98）、エチレン酢酸ビニル（Langer等, 同上）又はポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８Ａ）を含む。持続放出組成物は、リポソームに捕捉された化合物をまた含み、これは、それ自体知られた方法により調製することができる。（Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；米国特許第４４８５０４５号及び第４５４４５４５号；及びＥＰ１０２３２４Ａ）。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％コレステロール以上であり、選択される割合が最適な治療法に対して調整される微小（約２００−８００オングストローム）な単ラメラ状のものである。
【０１５５】
治療的に用いられる活性化合物の有効量は、例えば治療目的、投与経路、及び患者の状態に依存する。従って、治療専門家は、最適な治療効果が得られるように、投与量を滴定し投与経路を修正する必要がある。典型的な毎日の投薬量は、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であるかも知れない。典型的には、臨床医は、ニューロン機能を修復し、維持し、最適には再樹立する投薬量に達するまで活性化合物を投与する。この治療法の進行は常套的なアッセイによって容易にモニターされる。
【０１５６】
本発明の更なる詳細を次の非限定的な実施例によって例証する。
【０１５７】
実施例１
発現クローニングＬＩＬＲＢ２
阻害性ミエリンタンパク質のための新規レセプターを同定するために、発現クローニングアプローチ法を採用した。ベイトとして、次の特徴付けられたミエリン阻害剤（ヒトｃＤＮＡを使用）：Ｎｏｇｏ６６、ＮｏｇｏＡの二つの更なる阻害ドメイン（ＮｉＲ＜デルタ＞Ｄ２及びＮｉＧ＜デルタ＞２０）（Oertle T, J Neurosci. 2003, 23(13): 5393-406）、ＭＡＧ，及びＯＭｇｐのＮ−及び／又はＣ−末端にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を融合させたコンストラクトを生成させた。これらのコンストラクトを２９３細胞に形質移入して、ベイトタンパク質を含む条件培地（ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ中）を製造した。スクリーニングに使用されたｃＤＮＡライブラリーは、Ｏｒｉｇｅｎｅによって製造された発現準備済みベクター中の完全長ヒトｃＤＮＡから構成されていた。これらのｃＤＮＡｓを収集し、整列化させ、プール化した。およそ１００のｃＤＮＡのプールをＣＯＳ７細胞中に一過性に形質移入した。
【０１５８】
特に、１日目に、ＣＯＳ７細胞を１２ウェルプレート中に１ウェル当たり８５０００細胞の密度で播種した。２日目に、プール化ｃＤＮＡの１ｍｇを、脂質ベースの形質移入試薬ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して１ウェル毎に形質移入した。４日目に、スクリーニングを実施した。簡単に述べると、培養培地を細胞から取り除き、ＡＰ−融合ベイトタンパク質（２０−５０ｎＭ）を含む２９３細胞条件培地の０．５ｍｌで置換した。細胞を室温で９０分間、インキュベートした。ついで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで７分間固定し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）で３回洗浄し、６５℃で９０分間、熱失活させ、内在性ＡＰ活性を破壊した。細胞をＡＰバッファー（１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ９．５）で一回洗浄し、発色基質（Western Blue, Promega）中でインキュベートし、インキュベーションの１時間後と一晩のインキュベーション後に再び反応生成物の存在について分析した。陽性細胞を膜表面にわたる暗青色の沈殿物の存在によって同定した。陽性プールを更に破壊して、続くスクリーニング実験によって個々の陽性クローンを同定した。
【０１５９】
スクリーニングから、次の陽性ヒット（的中）を同定した：
ＭＡＧ−ＡＰベイトは４つの陽性ヒットを生じた。一つは過去に特徴付けられたＮｏｇｏレセプター（Fournier等, Nature 409, 342-346 (2001)）であった。これらのヒットの二つは糖分解プロセス酵素であり、関連性はないように思われた。第四のものは「クローン６４３由来ホモサピエンス仮説タンパク質（ＬＯＣ５７２２８）ｍＲＮＡ」と注釈された。ｃＤＮＡの密な分析により、過去に記載されたタンパク質ＳＭＡＧと相同であった他のＯＲＦが明らかになった。
【０１６０】
ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６ベイトは２つの陽性ヒットを生じた。一つは過去に特徴付けられたＮｏｇｏレセプターであった。他のものは「ホモサピエンス白血球免疫グロブリン様レセプター，サブファミリーＢ（ＴＭ及びＩＴＩＭドメインを含む）メンバー２（ＬＩＬＲＢ２）ｍＲＮＡ」（配列番号２）であった。この遺伝子はまたＭＩＧ１０、ＩＬＴ４、及びＬＩＲ２を含む複数の別名でも知られている（Kubagawa等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5261-6 (1997)；Colonna等, J. Exp. Med. 186:1809-18 (1997)）。
【０１６１】
実施例２
ＰｉｒＢ機能ブロック抗体の調製及び試験
ＰｉｒＢ機能ブロック抗体
ＰｉｒＢに対する抗体を、ＰｉｒＢ細胞外ドメインに対して合成ファージ抗体ライブラリーをパンニングすることによって産生させた（W. C. Liang等, J Mol Biol 366, 815 (2007))。ついで、抗体クローン（１０ｍｇ／ｍｌ）を、ＰｉｒＢ発現ＣＯＳ７細胞に対するＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（５０ｎＭ）の結合をブロックするその能力についてインビトロで試験した。様々なＹＷ２５９抗マウスＰｉｒＢ（抗ｍＰｉｒＢ）抗体の重鎖及び軽鎖配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図６−１６、及び１７及び１８に示す。図１７及び１８はまたそれぞれＹＷ２５９．２、ＹＷ２５０．９及びＹＷ２５９．１２の重鎖及び軽鎖内の高頻度可変領域配列を示す。
【０１６２】
神経突起伸長アッセイ
ポリ−Ｄ−リジンで前もって被覆された９６ウェルプレート（Biocoat, BD）をミエリン（０．７５μｇ／ｍｌ）で一晩又はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はＭＡＧ−Ｆｃ（１５０−３００ｎｇ／スポット）で２時間被覆し、ついでラミニン（Ｆ−１２中１０μｇ／ｍｌ）で２時間（ＣＧＮ培養）又は４時間（ＤＲＧ培養）処理した。マウスＰ７小脳ニューロンを過去に記載されているようにして（B. Zheng等, Proc Natl Acad Sci U S A 102, 1205 (2005)）培養し、１ウェル当たり〜２×１０４細胞で蒔いた。マウスＰ１０ＤＲＧニューロンを過去に記載されているようにして（上掲のZheng等, 2005）培養し、１ウェル当たり〜５×１０３細胞で蒔いた。培養物を５％のＣＯ２を用いて３７℃で２２時間増殖させた後、４％のパラホルムアルデヒド／１０％のスクロースで固定し、抗βＩＩＩ−チューブリン（TuJ1, Covance）で染色した。各実験では、全ての条件は６通りの複製ウェルで実施し、それから最大の神経突起長を測定し、平均値を６ウェル間で決定した。各実験は少なくとも三回実施し、同様の結果であった。ｐ値はスチューデント検定を使用して決定した。
【０１６３】
成長円錐崩壊アッセイ
ＤＲＧ外植片を、３週齢のマウスからＤＲＧを解体し、それを３つにスライスすることにより単離した。ついで、各ＤＲＧ外植片を、８ウェルプレートから個々のＰＤＬ（１００μｇ／ｍｌ）被覆及びラミニン（１０μｇ／ｍｌ）被覆ウェル中で培養した。播種後７２時間で、外植片をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６（１００ｎＭ）又はミエリン（３ｍｇ／ｍｌ）と共に３０分インキュベートして破壊を刺激した。培養物を４％のパラホルムアルデヒド／１０％のスクロースで固定し、ついで、成長円錐をローダミン−ファロイジン（Molecular Probes）染色によって可視化し、破壊についてスコア化した。平均成長円錐破壊を、少なくとも３つの複製ウェルを平均することによって決定した。
【０１６４】
結果
ＰｉｒＢがＮｏｇｏ６６に対する機能的レセプターであるかどうかに取り組むために、我々は、神経突起伸長がＡＰ−Ｎｏｇｏ６６で増殖されるときに阻害される（K.C. Wang等, Nature 420,74 (2002)）若年性（Ｐ７）小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）に焦点を当てた。成人ＣＧＮはＰｉｒＢを発現することが示されており（J. Syken等, Science 313,1795 (2006)）、我々は、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーションによって評価して若年性ＣＧＮの場合も同じであることを見出した（データは示さず）。
【０１６５】
先ず、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６阻害を妨害するＰｉｒＢ（ＰｉｒＢ−Ｈｉｓ）の可溶性外部ドメインの能力をインビトロで試験した。図２Ａに示されるように、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６は、未処理コントロールレベルのおよそ６６％までＰ７ＣＧＮの神経突起伸長を阻害する。このアッセイにおけるＰｉｒＢ−Ｈｉｓの含有はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６阻害を逆にし、神経突起伸長は本質的にコントロールレベルに戻る。これらの結果は、Ｎｏｇｏ６６による阻害をブロックするためにＮｇＲの外部ドメインを使用して報告されたものと同様であり（B Zgeng等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1205 (2005)；A. E. Fournier等, J. Neurosci. 22, 8876 (200)；Z. L. He等, Neuron 38, 177 (2003)）、ＰｉｒＢがＮｏｇｏ６６の機能的に阻害性のドメインに結合可能であるが、ＣＧＮ中の内在性ＰｉｒＢがＡＰ−Ｎｏｇｏ６６による阻害を媒介するかどうかには対処できないことを示している。
【０１６６】
従って、ＰｉｒＢ−Ｎｏｇｏ６６相互作用を妨害することができる抗体をＰｉｒＢ（抗ＰｉｒＢ）に対して産生させた。ＰｉｒＢの細胞外ドメインに対してファージディスプレイプラットフォーム（W.C. Liang等, J. Mol. Biol. 366, 815 (2007)）を使用して、複数のクローンを、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６のＰｉｒＢへの結合を阻害するその能力についてスクリーニングした。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６−ＰｉｒＢ結合を最も妨害したクローンＹＷ２５９．２（ここではａＰＢ１と称する）は、ＰｉｒＢに対して５ｎＭのＫｄを有していた（図１３−１６を参照）。
【０１６７】
ａＰＢ１はＣＧＮｓのベースライン軸索伸長には効果がなかった。しかしながら、ａＰＢ１は培養されたＣＧＮ中においてＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンによる阻害を有意に低減させ（図２Ｂ）、神経突起伸長をＡＰ−Ｎｏｇｏ６６で４１％から５９％まで、ミエリンで４７％から６２％までレスキューした。同様の結果が、阻害性基質としてＭＡＧを使用して、又は異なった細胞型（後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン）を使用して（図５）、見られた。これらの結果は、ＰｉｒＢが神経突起伸長の長期の阻害を媒介する機能的レセプターであると反論する。
【０１６８】
この結果を確認するために、膜貫通ドメイン及びＰｉｒＢ細胞内ドメインの一部をコードする４つのエキソンが除去されたＰｉｒＢＴＭマウス由来のニューロンを培養することにより（J. Syken等, Science 313,1795 (2006)）、細胞表面ＰｉｒＢの遺伝子的除去がまたＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンによる阻害を逆にするかどうかを試験した。ＰｉｒＢＴＭマウス又は野生型（ＷＴ）同腹仔由来のＣＧＮをコントロール基質、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンで培養した。コントロール基質（ＰＤＬ／ラミニン）では、ＰｉｒＢＴＭニューロンはＷＴニューロンと同様に挙動した（図２Ｃ）。しかしながら、ＰｉｒＢＴＭニューロンからの神経突起伸長は、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンの何れかでのＷＴニューロン由来よりも顕著に阻害が少なかった。ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６では、ＷＴニューロンからの伸長はコントロールレベルの５０％まで阻害されたが、ＰｉｒＢＴＭニューロンは６６％までだけ阻害された。同様に、ミエリンでは、ＷＴニューロンはコントロールレベルの５２％まで阻害されたが、ＰｉｒＢＴＭニューロンは７０％までだえ阻害された。再び、我々はミエリン及びＡＰ−Ｎｏｇｏ６６双方でのＰｉｒＢＴＭ ＤＲＧニューロンの同様な部分的な脱抑制を観察した（図５）。これらの知見は、ＰｉｒＢが確かに神経突起成長のＡＰ−Ｎｏｇｏ６６及びミエリン媒介阻害に対する機能的レセプターであることをを示している。しかしながら、ＰｉｒＢ活性の喪失は伸長を完全にはレスキューしない。
【０１６９】
ＮｇＲは過去にミエリン阻害剤のレセプターとして記載されているので、ＰｉｒＢ及びＮｇＲが共に機能して神経突起伸長の阻害を媒介することが可能である。これに取り組むために、抗ＰｉｒＢの存在下でＮｇＲ欠損マウス由来のニューロンを培養することによりＣＧＮにおいてＰｉｒＢ及びＮｇＲ機能の双方をブロックした。我々が過去に報告したように（上掲のB. Cheng等, PNAS 2005）、ＮｇＲ−／−ＣＧＮ神経突起伸長はＷＴニューロンにおけるものと同じ程度までＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンによって阻害される（５０％及び４９％；図３）。ＮｇＲ＋／−ニューロンのａＰＢ１抗体処置が、ＷＴニューロンのａＰＢ１処理に対して上で見られるように、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６又はミエリンの何れかによる阻害を部分的に逆にした。同様に、ＮｇＲ−／−ニューロンのａＰＢ１処置はＡＰ−Ｎｏｇｏ６６による阻害を部分的に逆にしたが、ＮｇＲ＋／−ニューロン又はＷＴニューロンのａＰＢ１処理で見られるものよりも更なるレスキューはもたらさなかった。これに対して、ＮｇＲ−／−ニューロンのａＰＢ１処理は、略コントロールレベルまでミエリンでの神経突起伸長を回復させた。よって、ＮｇＲではないが、ＰｉｒＢはＣＧＮにおけるＡＰＮｏｇｏ６６による基質阻害に必要とされるが、部分的にだけであると思われる。更に、ＰｉｒＢ及びＮｇＲの双方がミエリンにより付与される基質阻害に寄与する。
【０１７０】
ＮｇＲは様々なミエリン阻害剤に応答して成長円錐破壊に必要とされること考えられるので（J.E. Kim等, Neuron 44, 439 (2004), O.Chivatakarn等, J. Neurosci. 27, 7117 (2007)）、ＰｉｒＢがまたこのより急性の応答に関与していることが可能である。ＰｉｒＢを発現することが確認された３週齢のマウスの後根神経節（ＤＲＧ）からの感覚ニューロンをこの実験に使用した。この培養系における成長円錐は高いベースラインレベルの破壊（〜３０％）を有しており、これはＡＰＮｏｇｏ６６又はミエリンとのインキュベーションによって更に増加する（図４）ことが見出された。この破壊はＮｇＲ−／−ニューロンにおいて大きく消滅した。加えて、ａＰＢ１でのブロックＰｉｒＢ機能はまたこれら阻害剤による成長円錐破壊を逆にするのに十分である。ＰｉｒＢ及びＮｇＲ経路双方の阻害（ＮｇＲ−／−マウス由来のニューロンへのａＰＢ１処理を使用）はまた成長円錐破壊を完全に逆にしたが、この結果は、何れの処置もこのアッセイでは完全なレスキューを与えたので、情報価値はなかった。
【０１７１】
他の実験では、Ｃ１ＱＴＮＦ５が小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）の神経突起伸長を阻害し、この阻害はＰｉｒＢ機能ブロック抗体ＹＷ２５９．２によって逆になった。結果は図１９に示す。
【０１７２】
併せて、これらの結果は、ミエリン抽出物、より詳細にはミエリン関連阻害剤Ｎｏｇｏ６６及びＭＡＧによる神経突起阻害のための必要なレセプターとしてのＰｉｒＢの新規な役割を支援する。実際、ＰｉｒＢは、ＰｉｒＢ機能単独の除去（遺伝的に又は抗体を使用して）がミエリン抽出物及びミエリン阻害剤双方での成長を部分的に脱抑制する一方、ＮｇＲ単独の遺伝子除去はこれらの基質の何れでも脱抑制しないので、ＮｇＲよりも基質阻害のより有意なメディエーターであると思われる。しかしながら、ＮｇＲは、ＮｇＲの遺伝子除去がミエリン（しかしＮｏｇｏ６６でではない）への抗ＰｉｒＢ抗体によって引き起こされる脱抑制を増強しうるので、ミエリン抽出物（しかしＮｏｇｏ６６ではない）による阻害の媒介に補助的役割を担っているようである。我々の知見は、ＮｇＲ外部ドメインが注入された齧歯類に見られる報告された再生又は出芽にもかかわらず（S. Li等, J. Neurosci. 24, 10511 (2004)）、ＮｇＲノックアウトマウスにおける亢進されたＣＳＴ再生の驚くべき欠如を説明するのに役立ちうる（上掲のJ.E. Kim等, B. Zheng等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1205 (2005)）。よって、インビボでの有意な再生を達成するためにはＰｉｒＢ及びＮｇＲの双方を取り除くことが必要であるかも知れない。加えて、Ｎｏｇｏ６６基質では、ＮｇＲの遺伝子除去がＰｉｒＢ除去の部分的な脱抑制効果を更に増強することはないので、Ｎｏｇｏ６６に対して更なる結合レセプターが存在するようである。
【０１７３】
ＰｉｒＢはＮｇＲよりも基質阻害のためのより有意なレセプターであるようであるが、ＰｉｒＢ又はＮｇＲの何れか単独の不活性化が、ミエリン阻害剤の添加によって引き起こされる急性成長円錐破壊をブロックするのに十分である。この知見は、破壊がより要望されるプロセスで、ＰｉｒＢ及びＮｇＲ活性の双方を必要とし、平行にあるいは一緒に作用することを示唆している。この文脈において、ＰｉｒＢ及びＮｇＲレセプターが視覚野におけるシナプス結合の可塑性の制限に同様の役割を果たしていることが最近示されていることは興味深い：何れかのレセプターを欠くマウスでは、重要な発達期間中の眼の閉鎖が開いた眼を介する結合の過剰な強化を生じる（上掲のJ. Syken等, 2006, 上掲のA.W. McGee等, Science 309, 2222 (2005)）。成長円錐破壊の媒介における双方のレセプターの効果の原因となっている機序はまた眼球優位性可塑性におけるその役割の共有性の基礎にありうる。
【０１７４】
損傷後に成体軸索を再生できないことは、ＣＮＳへの外傷性侵襲後における機能の再獲得に対する主要な障害である。過剰な又は過剰増殖性シナプス結合の発達を制限する目的で、シナプス可塑性の能力が年齢と共に限られてくると、再生潜在力が減退することが推測されている。この推測は、発育中及び成人期の双方におけるシナプス可塑性の制限に過去に関係付けられている（上掲のJ. Syken等, 2006）ＰｉｒＢがまたミエリンによる軸索阻害のメディエーターであるという知見からサポートを獲得しており、初期に軸索阻害に関係付けられているＮｇＲがシナプス可塑性を同様に調節するという知見を平行に提供する（S. Li等, J. Neurosci. 24, 10511 (2004)）。
【０１７５】
我々の知見はまたクラスＩ ＭＨＣ分子の範囲を超えて潜在的なＰｉｒＢリガンドのレパートリーを広くし、ニューロン再成長阻害剤を含む。逆に、既知のミエリン阻害剤Ｎｏｇｏ又はＭＡＧの遺伝子欠失がミエリンによる阻害の最も少ない減少を生じるだけなので（他の阻害剤が存在することを意味する）、我々の知見は、正常にはオリゴデンドロサイトによって低レベルで発現されるＭＨＣＩ分子が、損傷後にアップレギュレートされ、中枢ミエリンによるＮｏｇｏ及びＭＡＧと一致して伸長阻害に寄与しうる可能性を提起する。
【０１７６】
ＰｉｒＢがミエリン阻害剤に応答して軸索伸長を阻害するシグナルを発する機序は明らかではない。しかしながら、ＰｉｒＢはインテグリンレセプターの機能をアンタゴナイズ（S. Pereira等, J. Immunol. 173:5757 (2004)）し、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２ホスファターゼの双方を補充することが示された；これらの事象の何れか又は双方が正常な神経突起伸長を減弱できた。ここでの抗ＰｉｒＢ抗体を使用するか又は他の手段によるＰｉｒＢ活性のブロックは、軸索再生を刺激するための治療介入の重要な新規標的を提供する。
【０１７７】
該開示を通して引用された全ての文献は出典明示によりその全体をここに明示的に援用する。
【０１７８】
本発明を特定の実施態様であると考えられるものを参照して説明したが、本発明はそのような実施態様には限定されないことが理解されなければならない。それとは反対に、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な変形例及び均等物をカバーするものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体と同じヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）上のエピトープに結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項２】
ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体とヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）への結合について競合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項３】
ＹＷ２５９．２重鎖（配列番号４又は１１）、ＹＷ２５９．９重鎖（配列番号５又は１２）、及びＹＷ２５９．１２重鎖（配列番号６又は１３）からなる群から選択される重鎖由来の一、二、又は三の高頻度可変領域配列を含む単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項４】
抗体がＹＷ２５９．２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号４又は１１）を含む請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
抗体がＹＷ２５９．９抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号５又は１２）を含む請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がＹＷ２５９．１２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号６又は１３）を含む請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖を更に含む請求項３から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記軽鎖が配列番号１５のポリペプチド配列の一、二又は三の高頻度可変配列を含む請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記軽鎖が配列番号７又は１５のポリペプチド配列の全ての高頻度可変領域配列を含む請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９，及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される請求項３に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体の完全長ＩｇＧ型が５ｎＭ又はそれ以上の結合親和性でヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）に特異的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項１２】
抗体の完全長ＩｇＧ型が１ｎＭ又はそれ以上の結合親和性でヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）に特異的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項１３】
軸索再生を促進する請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１４】
ＣＮＳニューロンの再生を促進する請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１５】
Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる神経突起伸長阻害を少なくとも部分的にレスキューする請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１７】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体からなる群から選択される請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１８】
抗体が抗体断片である請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１９】
抗体がイムノコンジュゲートである請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項２０】
請求項１−１２の何れか一項の抗体、又はそのその重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項２２】
ベクターが発現ベクターである請求項２１のベクター。
【請求項２３】
請求項２１のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２４】
宿主細胞が原核生物である請求項２３の宿主細胞。
【請求項２５】
宿主細胞が真核生物である請求項２３の宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞が哺乳動物である請求項２５の宿主細胞。
【請求項２７】
抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を製造するための方法であって、（ａ）請求項２２のベクターを適切な宿主細胞中において発現させ、（ｂ）抗体を回収することを含む方法。
【請求項２８】
宿主細胞が原核生物である請求項２７の方法。
【請求項２９】
宿主細胞が真核生物である請求項２７の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体と薬学的に許容可能な賦形剤を含有する組成物。
【請求項３１】
組成物が第二医薬を更に含み、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体が第一医薬である、請求項３０の組成物。
【請求項３２】
第二医薬がＮｇＲ阻害剤である請求項３１の組成物。
【請求項３３】
ＮｇＲ阻害剤が抗ＮｇＲ抗体である請求項３２の組成物。
【請求項３４】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を含んでなるキット。
【請求項３５】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の有効量を、必要とする被験者に投与することを含む軸索再生促進方法。
【請求項３６】
被験者がヒト患者である請求項３５の方法。
【請求項３７】
生存又はニューロンが亢進される請求項３６の方法。
【請求項３８】
ニューロン伸長が誘導される請求項３６の方法。
【請求項３９】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の有効量を、必要とする被験者に投与することを含む神経変性疾患の治療方法。
【請求項４０】
神経変性疾患が中枢神経系に対する物理的損傷により特徴付けられる請求項３９の方法。
【請求項４１】
神経変性疾患が脳卒中に伴う脳損傷である請求項４０の方法。
【請求項４２】
神経変性疾患が、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、身体的傷害（例えば火傷、創傷）又は疾患状態、例えば糖尿病、腎不全又は癌及びＡＩＤＳの治療に使用される化学療法剤の毒作用によって引き起こされる末梢神経損傷、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものからなる群から選択される請求項３９の方法。
【請求項４３】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体。
【請求項１】
ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体と同じヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）上のエピトープに結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項２】
ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される抗体とヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）への結合について競合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項３】
ＹＷ２５９．２重鎖（配列番号４又は１１）、ＹＷ２５９．９重鎖（配列番号５又は１２）、及びＹＷ２５９．１２重鎖（配列番号６又は１３）からなる群から選択される重鎖由来の一、二、又は三の高頻度可変領域配列を含む単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項４】
抗体がＹＷ２５９．２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号４又は１１）を含む請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
抗体がＹＷ２５９．９抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号５又は１２）を含む請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がＹＷ２５９．１２抗体重鎖の全ての高頻度可変領域配列（配列番号６又は１３）を含む請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖を更に含む請求項３から６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記軽鎖が配列番号１５のポリペプチド配列の一、二又は三の高頻度可変配列を含む請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記軽鎖が配列番号７又は１５のポリペプチド配列の全ての高頻度可変領域配列を含む請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体ＹＷ２５９．２、ＹＷ２５９．９，及びＹＷ２５９．１２からなる群から選択される請求項３に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体の完全長ＩｇＧ型が５ｎＭ又はそれ以上の結合親和性でヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）に特異的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項１２】
抗体の完全長ＩｇＧ型が１ｎＭ又はそれ以上の結合親和性でヒトＰｉｒＢ（ＬＩＬＲＢ）に特異的に結合する単離された抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体。
【請求項１３】
軸索再生を促進する請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１４】
ＣＮＳニューロンの再生を促進する請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１５】
Ｎｏｇｏ６６及びミエリンによる神経突起伸長阻害を少なくとも部分的にレスキューする請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１７】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体からなる群から選択される請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１８】
抗体が抗体断片である請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項１９】
抗体がイムノコンジュゲートである請求項１−１２の何れか一項の抗体。
【請求項２０】
請求項１−１２の何れか一項の抗体、又はそのその重鎖又は軽鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項２２】
ベクターが発現ベクターである請求項２１のベクター。
【請求項２３】
請求項２１のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２４】
宿主細胞が原核生物である請求項２３の宿主細胞。
【請求項２５】
宿主細胞が真核生物である請求項２３の宿主細胞。
【請求項２６】
宿主細胞が哺乳動物である請求項２５の宿主細胞。
【請求項２７】
抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を製造するための方法であって、（ａ）請求項２２のベクターを適切な宿主細胞中において発現させ、（ｂ）抗体を回収することを含む方法。
【請求項２８】
宿主細胞が原核生物である請求項２７の方法。
【請求項２９】
宿主細胞が真核生物である請求項２７の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体と薬学的に許容可能な賦形剤を含有する組成物。
【請求項３１】
組成物が第二医薬を更に含み、抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体が第一医薬である、請求項３０の組成物。
【請求項３２】
第二医薬がＮｇＲ阻害剤である請求項３１の組成物。
【請求項３３】
ＮｇＲ阻害剤が抗ＮｇＲ抗体である請求項３２の組成物。
【請求項３４】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体を含んでなるキット。
【請求項３５】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の有効量を、必要とする被験者に投与することを含む軸索再生促進方法。
【請求項３６】
被験者がヒト患者である請求項３５の方法。
【請求項３７】
生存又はニューロンが亢進される請求項３６の方法。
【請求項３８】
ニューロン伸長が誘導される請求項３６の方法。
【請求項３９】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体の有効量を、必要とする被験者に投与することを含む神経変性疾患の治療方法。
【請求項４０】
神経変性疾患が中枢神経系に対する物理的損傷により特徴付けられる請求項３９の方法。
【請求項４１】
神経変性疾患が脳卒中に伴う脳損傷である請求項４０の方法。
【請求項４２】
神経変性疾患が、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性筋萎縮症、進行性延髄遺伝性筋萎縮症、身体的傷害（例えば火傷、創傷）又は疾患状態、例えば糖尿病、腎不全又は癌及びＡＩＤＳの治療に使用される化学療法剤の毒作用によって引き起こされる末梢神経損傷、遺伝性、破裂性又は脱出性無脊椎動物椎間板症候群、頸部脊椎症、神経叢疾患、胸郭出口破壊症候群、末梢神経障害、例えば鉛、ダプソン、ダニ、ポルフィリン症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びパーキンソン病によって引き起こされるものからなる群から選択される請求項３９の方法。
【請求項４３】
請求項１−１２の何れか一項の抗ＰｉｒＢ／ＬＩＬＲＢ抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【公表番号】特表２０１１−５２３３５９（Ｐ２０１１−５２３３５９Ａ）
【公表日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０９６４２（Ｐ２０１１−５０９６４２）
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４３７５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４０３６１
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１３日（２００９．５．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４３７５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４０３６１
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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