改変毒素を選択および生産する方法、改変毒素を含む複合体、およびそれらの使用
改変毒素およびその複合体を選択および同定する方法が提供される。方法は、それが発現される宿主細胞に対して毒性の低下を示す毒素を選択する。毒素、例えば、 改変毒素またはその複合体の生産を上昇させる方法も提供される。特に、方法において、毒素またはその複合体は阻害剤分子の存在下で生産される。改変毒素およびその複合体も提供される。かかる複合体は、免疫または炎症応答に関与する細胞の増殖、遊走、および生理活性に関連する様々な 疾患または障害の治療において利用できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、改変リボゾーム不活性化タンパク質 (RIP)またはその活性の断片を選択する方法:
a) RIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
b)細胞を培養する工程;
c)生育した細胞を単離する工程; および
d)生育した細胞のなかから、RIP、またはその活性の断片を発現する細胞を単離する工程、ここで、RIPまたは断片は、工程 a)において導入された核酸分子によってコードされるものと比較して改変を含む。
【請求項２】
さらに以下の工程を含む、請求項 1の方法:
e)単離された細胞において発現された改変RIP、またはその活性の断片を同定または単離または精製する工程。
【請求項３】
細胞が選択的モジュレーターを含まない培地で培養される請求項 1または請求項 2の方法。
【請求項４】
細胞が培養される培地 がアデニン 類似体を含まない、請求項 1の方法。
【請求項５】
アデニン 類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)である請求項 4の方法。
【請求項６】
工程 c)またはd)の後に、さらに以下の工程を含む請求項1-5のいずれかの方法:
RIPを発現する単離された細胞を拡張させる工程。
【請求項７】
改変RIPがその配列またはその分子量によってまたは配列決定によって同定される、請求項1- 6のいずれかの方法。
【請求項８】
工程 b)において選択的モジュレーターの存在下で細胞を培養することをさらに含む請求項 1 または請求項 2の方法。
【請求項９】
選択的モジュレーターがRIP 阻害剤である請求項 8の方法。
【請求項１０】
RIP 阻害剤がアデニン 類似体である請求項 9の方法。
【請求項１１】
アデニン 類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)である請求項 10の方法。
【請求項１２】
RIP 阻害剤、アデニン 類似体、または4-APPの濃度が宿主細胞に対して毒性ではないものである請求項9-11のいずれかの方法。
【請求項１３】
RIP 阻害剤、アデニン 類似体、または4-APPの濃度が宿主細胞に対するRIPの毒性を阻害または低減するものである請求項9-12のいずれかの方法。
【請求項１４】
毒性の阻害または低減が、RIP 阻害剤、アデニン 類似体、または 4-APPの非存在下と比較して、発現されるRIPの量を上昇させるのに十分なものである請求項 13の方法。
【請求項１５】
RIPの毒性が少なくとも 1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%阻害される請求項 13 または請求項 14の方法。
【請求項１６】
4-APPの濃度が約0.1 mMまたは 0.1 mMから約5.0 mMまたは 5.0 mMである請求項11-15のいずれかの方法。
【請求項１７】
4-APP の濃度が、約0.1 または 0.1から2、3、または4 mMの間、または約0.2または0.2、約0.3または0.3、約0.4または0.4、約0.5または0.5、約0.6または0.6、約0.7または0.7、約0.8または0.8、約0.9または0.9、または約1 mMまたは1 mMである、請求項11-16のいずれかの方法。
【請求項１８】
4-APPの濃度が約0.5 mMまたは0.5 mMである請求項11-17のいずれかの方法。
【請求項１９】
宿主細胞が真核細胞である請求項1-18のいずれかの方法。
【請求項２０】
宿主細胞が原核細胞である請求項1-18のいずれかの方法。
【請求項２１】
原核細胞が大腸菌である請求項 20の方法。
【請求項２２】
導入された核酸分子によってコードされるRIP がI型RIP、またはその活性の断片である請求項1-21のいずれかの方法。
【請求項２３】
RIPが、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、ミラビリス属 抗ウイルスタンパク質 (MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP I、オオムギ RIP II、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP 3、トウモロコシ RIP 9、トウモロコシ RIP X、アスパリン-1、およびアスパリン 2から選択される請求項 22の方法。
【請求項２４】
導入された核酸分子によってコードされるRIP がII型RIP、その触媒サブユニットまたはその活性の断片である請求項1-21のいずれかの方法。
【請求項２５】
RIP が、志賀毒素 (Stx)、志賀様毒素 II (Stx2)、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択される請求項 24の方法。
【請求項２６】
RIPがサブユニット A、またはその活性の断片を含む請求項 25の方法。
【請求項２７】
志賀毒素がサブユニット A1 (SA1)またはその活性の断片を含むか、または、サブユニット A1 またはその活性の断片からなる、請求項 25の方法。
【請求項２８】
SA1が切型のものである請求項 27の方法。
【請求項２９】
SA1がC-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 または12の連続するアミノ酸の欠失により切型となっている請求項 28の方法。
【請求項３０】
SA1が Cysの別のアミノ酸による置換によってさらに改変されている請求項27-29のいずれかの方法。
【請求項３１】
置換するアミノ酸がSerである請求項 30の方法。
【請求項３２】
SA1が配列番号22または配列番号24に示すアミノ酸 残基の配列を含む請求項27-29のいずれかの方法。
【請求項３３】
SA1が配列番号23または配列番号25に示す配列を含む核酸分子によってコードされている請求項27-29のいずれかの方法。
【請求項３４】
導入された核酸分子によってコードされるRIPがリガンドと複合体となってリガンド-毒素 複合体を形成している請求項1-33のいずれかの方法。
【請求項３５】
複合体におけるRIPおよびリガンドが直接的にまたは共有結合またはイオン結合を介して間接的に結合している請求項 34の方法。
【請求項３６】
RIPおよびリガンドがリンカーを介して連結している請求項 35の方法。
【請求項３７】
リンカーが、ペプチド、ポリペプチドまたはアミノ酸である請求項 36の方法。
【請求項３８】
リンカー が Ala-Met リンカーである請求項 37の方法。
【請求項３９】
リガンド-毒素 複合体が融合タンパク質である請求項 34の方法。
【請求項４０】
リガンドが、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体 (PRR) リガンドから選択される請求項34-39のいずれかの方法。
【請求項４１】
増殖因子がVEGFである請求項 40の方法。
【請求項４２】
ケモカイン 受容体 標的化剤が、ケモカイン、またはケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、または抗体の断片であり、ここで断片はケモカイン 受容体に結合するものである、請求項 40の方法。
【請求項４３】
抗体がモノクローナル抗体、またはその抗原特異的断片である請求項 42の方法。
【請求項４４】
モノクローナル抗体が、(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、およびXCR1から選択される抗原に特異的に結合する請求項 43の方法。
【請求項４５】
モノクローナル抗体がCXCR-6およびCXCR-7から選択される抗原に特異的に結合する請求項 43の方法。
【請求項４６】
ケモカイン 受容体 標的化剤がケモカインである請求項 42の方法。
【請求項４７】
ケモカインが、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β (SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種 変異体から選択される請求項 46の方法。
【請求項４８】
ケモカイン が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、および BCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 46 または請求項 47の方法。
【請求項４９】
ケモカインが MCP-1である請求項46-48のいずれかの方法。
【請求項５０】
リガンド-毒素 複合体が、配列番号38または配列番号40に示すアミノ酸 残基の配列を含む、請求項38-49のいずれかの方法。
【請求項５１】
リガンド-毒素 複合体が、配列番号37または配列番号39に示す配列を含む核酸分子によってコードされる請求項38-49のいずれかの方法。
【請求項５２】
同定されたRIPが導入された核酸分子によってコードされるRIPと比較して突然変異を含む請求項1-51のいずれかの方法。
【請求項５３】
同定されたRIPの毒性を評価する工程をさらに含む請求項 1-52のいずれかの方法。
【請求項５４】
毒性がタンパク質合成アッセイ、脱プリン アッセイ、および細胞増殖/生存度アッセイから選択されるアッセイにおいて評価される請求項 53の方法。
【請求項５５】
同定されたRIPが導入された核酸分子によってコードされるRIPと比較して毒性を保持している請求項1-54のいずれかの方法。
【請求項５６】
同定されたRIPが0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれを超える毒性を保持している請求項 55の方法。
【請求項５７】
さらに以下の工程を含む請求項1-56のいずれかの方法:
a) 同定されたRIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
b) 細胞をRIP 阻害剤の存在下でインキュベートする工程、ここでRIP 阻害剤の量はRIP ポリペプチドの毒性を低下させるように選択される;および、
c) RIP、またはその活性の断片が生産される条件下で細胞を培養する工程。
【請求項５８】
工程 c)のRIPを精製する工程をさらに含むことにより、発現または精製またはその両方をされたRIP の量が、 RIP 阻害剤の非存在下での量よりも多くなる請求項 57の方法。
【請求項５９】
以下の工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)、またはその活性の断片の生産を上昇させる方法:
a) RIP、またはその活性の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入する工程;
b) RIP 阻害剤の存在下で細胞をインキュベートする工程、ここでRIP 阻害剤の量はRIPの毒性を低減するように選択される;
c) RIP 阻害剤の非存在下で培養された場合と比べて、RIP、またはその活性の断片がより多い量にて生産される条件下で細胞を培養する工程。
【請求項６０】
工程 c)のRIPを精製する工程をさらに含むことにより、発現または精製またはその両方をされたRIP の量が、 RIP 阻害剤の非存在下での量よりも多くなる請求項 59の方法。
【請求項６１】
導入された核酸によってコードされる RIPが I型RIP、またはその活性の断片である請求項 59または請求項 60の方法。
【請求項６２】
RIP が、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、ミラビリス属 抗ウイルスタンパク質 (MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP I、オオムギ RIP II、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP 3、トウモロコシ RIP 9、トウモロコシ RIP X、アスパリン-1、およびアスパリン 2から選択される請求項 61の方法。
【請求項６３】
導入された核酸によってコードされる RIP が、II型RIP、その 触媒サブユニットまたはその活性の断片である請求項 59または請求項 60の方法。
【請求項６４】
RIP が、志賀毒素 (Stx)、志賀様毒素 II (Stx2)、志賀様毒素 I、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択される請求項 63の方法。
【請求項６５】
RIPがサブユニット A、またはその活性の断片を含む請求項 64の方法。
【請求項６６】
志賀毒素がサブユニット A1 (SA1)またはその活性の断片を含む請求項 64の方法。
【請求項６７】
SA1が切型のものである請求項 66の方法。
【請求項６８】
SA1がC-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12の連続するアミノ酸の欠失により切型となっている請求項 67の方法。
【請求項６９】
RIPが改変されている請求項59-65のいずれかの方法。
【請求項７０】
SA1が改変されている請求項66-69のいずれかの方法。
【請求項７１】
SA1が１以上の アミノ酸の置換により改変されている請求項 70の方法。
【請求項７２】
SA1がCysの別のアミノ酸による置換により改変されている請求項 71の方法。
【請求項７３】
置換するアミノ酸が Serである請求項 72の方法。
【請求項７４】
SA1 が位置 38 または位置 219の一方または両方の置換により改変されており;そして、該位置が、 配列番号22に示すアミノ酸配列を有するSA1におけるアミノ酸 位置を参照した位置である請求項 71の方法。
【請求項７５】
アミノ酸 置換がL38R および/またはV219Aに対応する請求項 74の方法。
【請求項７６】
アミノ酸 置換がV219Aに対応する請求項 75の方法。
【請求項７７】
SA1 が配列番号26 または28に示すアミノ酸配列を有する請求項 74または請求項 75の方法。
【請求項７８】
SA1が配列番号27または29に示す核酸配列によってコードされるものである請求項 74または請求項 75の方法。
【請求項７９】
RIP 阻害剤がアデニン 類似体である請求項59-78のいずれかの方法。
【請求項８０】
アデニン 類似体が 4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)である請求項 79の方法。
【請求項８１】
RIP 阻害剤、アデニン 類似体または4-APPの濃度が、RIP の毒性を約 10%または10%、約20%または20%、約30%または30%、約40%または40%、約50%または50%、約60%または60%、約70%または70%、約80%または80%、約90%または90%、約91%または91%、約92%または92%、約93%または93%、約94%または94%、約95%または95%、約96%または96%、約97%または97%、約98%または98%、約99%または99%、または約100%または100%低下させるのに効果的な濃度である請求項 59、79または80の方法。
【請求項８２】
4-APPの濃度が約1 mMまたは1 mMから約40.0 mMまたは40.0 mMである請求項 80または 81の方法。
【請求項８３】
4-APP の濃度が約2.0 mMまたは2.0 mM、約3.0 mMまたは3.0 mM、約4.0 mMまたは4.0 mM、約5.0 mMまたは5.0 mM、約6.0 mMまたは6.0 mM、約7.0 mMまたは7.0 mM、約8.0 mMまたは8.0 mM、約9.0 mMまたは9.0 mM、約10.0 mMまたは10.0 mM、約15.0 mMまたは15.0 mM、または約20.0 mMまたは20.0 mMの間である請求項81-82のいずれかの方法。
【請求項８４】
宿主細胞が真核細胞である請求項59-83のいずれかの方法。
【請求項８５】
宿主細胞が原核細胞である請求項59-83のいずれかの方法。
【請求項８６】
宿主細胞が大腸菌である請求項 85の方法。
【請求項８７】
RIP ポリペプチドが誘導物質による誘導の後に発現する請求項59-86のいずれかの方法。
【請求項８８】
誘導物質がIPTGである請求項 87の方法。
【請求項８９】
RIP 阻害剤が誘導物質の添加の前、最中および/または後に添加される請求項87または 88の方法。
【請求項９０】
RIPをコードする核酸分子がリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより分子がリガンド-毒素 複合体をコードする請求項59-89のいずれかの方法。
【請求項９１】
複合体におけるRIPおよびリガンドが共有結合またはイオン結合を介して直接結合している請求項 90の方法。
【請求項９２】
RIPおよびリガンドがリンカーを介して連結している請求項 91の方法。
【請求項９３】
リンカーが、ペプチド、ポリペプチドまたはアミノ酸である請求項 92の方法。
【請求項９４】
リンカーがAla-Met リンカーである請求項 93の方法。
【請求項９５】
リガンド-毒素 複合体が融合タンパク質である請求項 90の方法。
【請求項９６】
リガンド-毒素 複合体におけるリガンド が、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体 (PRR) リガンドから選択される請求項90-95のいずれかの方法。
【請求項９７】
増殖因子がVEGFである請求項 96の方法。
【請求項９８】
ケモカイン 受容体 標的化剤が、ケモカイン、またはケモカイン 受容体に結合するケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、または該受容体に結合する抗体の断片である請求項 96の方法。
【請求項９９】
抗体がモノクローナル抗体、またはその抗原特異的 断片である請求項 98の方法。
【請求項１００】
モノクローナル抗体が(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、およびXCR1から選択される抗原に対して特異的である請求項 99の方法。
【請求項１０１】
モノクローナル抗体がCXCR-6およびCXCR-7から選択される抗原に対して特異的である請求項 99の方法。
【請求項１０２】
ケモカイン 受容体 標的化剤がケモカインである請求項 98の方法。
【請求項１０３】
ケモカイン が、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β (SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 102の方法。
【請求項１０４】
ケモカイン が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 102または請求項 103の方法。
【請求項１０５】
ケモカインが MCP-1である請求項102-104のいずれかの方法。
【請求項１０６】
RIP が志賀毒素、または その活性の断片; または 改変志賀毒素または改変を含むその活性の断片である請求項90-105のいずれかの方法。
【請求項１０７】
志賀毒素が A1 サブユニット (SA1)を含む請求項 106の方法。
【請求項１０８】
リガンド-毒素 複合体が配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、または67のいずれかに示すアミノ酸 残基の配列を含む請求項90-107のいずれかの方法。
【請求項１０９】
リガンド-毒素 複合体が配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65 または66のいずれかに示す配列を含む核酸分子によってコードされる請求項90-107のいずれかの方法。
【請求項１１０】
同定されたRIPを含む複合体を調製することをさらに含む請求項1-58のいずれかの方法。
【請求項１１１】
複合体を合成することを含む請求項 110の方法。
【請求項１１２】
請求項1-58のいずれかの方法によって選択される改変リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)。
【請求項１１３】
志賀毒素、その対立遺伝子または種 変異体、その触媒的に活性の断片、またはその活性の断片において１以上の アミノ酸 改変を含む改変志賀毒素 ポリペプチドまたはその活性の断片、ここで該１以上の アミノ酸 改変は、配列番号22に示すアミノ酸配列を含む志賀毒素 A1 サブユニット (SA1)におけるアミノ酸 位置を参照して位置 38 および/または219に対応する位置の一方または両方の置換である。
【請求項１１４】
配列番号22に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド に対して少なくとも 約 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の配列 同一性を有し、かつ、アミノ酸 位置 38 および/または219に対応する部位にて改変を含む、請求項 113の改変志賀毒素。
【請求項１１５】
改変が L38R および/またはV219Aに対応する請求項 113 または114の改変志賀毒素。
【請求項１１６】
志賀毒素がA サブユニットを含む請求項113-115のいずれかの改変志賀毒素。
【請求項１１７】
志賀毒素が志賀毒素 A1 鎖 (SA1)またはその活性の断片を含む請求項113-116のいずれかの改変志賀毒素 ポリペプチド。
【請求項１１８】
SA1が切型のものである請求項 117の改変志賀毒素。
【請求項１１９】
切型されたSA1がC-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 または12の連続するアミノ酸の欠失により切型されている請求項 118の改変志賀毒素。
【請求項１２０】
SA1が配列番号26 または28に示すアミノ酸配列を含むか、またはその対立遺伝子または種 変異体である請求項117-119のいずれかの改変志賀毒素。
【請求項１２１】
以下を含む複合体:
請求項 112の改変リボソーム不活性化タンパク質 (RIP) または請求項113-120のいずれかの改変志賀毒素、またはその活性の断片である標的化物質;および
標的化剤、またはその部分、ここで、該複合体が細胞表面受容体に結合する結果、標的化物質の受容体を担持する細胞へのインターナリゼーションが起こる。
【請求項１２２】
以下の成分: (標的化剤)n、(L)q、および (標的化物質)m、を含む請求項 121の複合体、ここで:
Lは、標的化剤の標的化物質への結合のためのリンカー;
標的化剤は、細胞表面受容体に選択的に結合するいずれかの部分;
mおよびnは、独立に選択され、少なくとも 1;および、
qは、結果として複合体が標的化受容体に結合し、インターナライズされ、標的化物質が送達される限り、0以上;
結果として得られる複合体は標的化剤と相互作用し標的化剤をインターナライズする受容体に結合し、それにより標的化物質が受容体を担持する細胞にインターナライズされる;および、
複合体が複数の標的化物質を含む場合、標的化物質は同一または異なっており、複合体が複数の標的化剤を含む場合、標的化剤は同一または異なっている、複合体。
【請求項１２３】
独立に選択されるmおよびnが1-6である請求項 122の複合体。
【請求項１２４】
qが1、nが2 およびmが1である請求項 122の複合体。
【請求項１２５】
標的化剤 が、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体 (PRR) リガンドから選択される請求項121-124のいずれかの複合体。
【請求項１２６】
増殖因子がVEGFである請求項 125の複合体。
【請求項１２７】
ケモカイン 受容体 標的化剤が、ケモカイン、またはケモカイン 受容体に結合するケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体の断片である請求項125の複合体。
【請求項１２８】
ケモカイン 受容体 標的化剤がケモカインである請求項 127の複合体。
【請求項１２９】
ケモカイン が、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β (SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、 血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、またはそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 128の複合体。
【請求項１３０】
ケモカイン が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、またはそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項128または請求項 129の複合体。
【請求項１３１】
標的化剤が、１以上の 免疫エフェクター細胞または免疫または炎症応答に関連するその他の細胞上の１以上の 細胞表面受容体に特異的に結合する、請求項121-130のいずれかの複合体。
【請求項１３２】
１以上の免疫エフェクター細胞が白血球である請求項 131の複合体。
【請求項１３３】
細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、T 細胞、B 細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、および好中球から選択される請求項 131または請求項 132の複合体。
【請求項１３４】
マクロファージが、肺胞マクロファージ、小膠細胞、およびクッパー細胞から選択される組織 マクロファージである請求項 133の複合体。
【請求項１３５】
樹状細胞が、未熟 樹状細胞、成熟 樹状細胞、およびランゲルハンス 細胞から選択される請求項 133の複合体。
【請求項１３６】
T 細胞がCD4+ およびCD8+ T 細胞から選択される請求項 133の複合体。
【請求項１３７】
CD4+ T 細胞がTh1またはTh2 細胞である請求項 136の複合体。
【請求項１３８】
１以上の 細胞が免疫または炎症症状に関連する別の細胞であり、組織固有細胞 (TRC)であり;および、
TRCがメサンギウム細胞、グリア細胞、内皮 細胞、上皮 細胞、腫瘍 細胞、線維芽細胞、および 滑膜細胞から選択される、
請求項 131の複合体。
【請求項１３９】
細胞が活性化されている請求項131-138のいずれかの複合体。
【請求項１４０】
活性化が１以上の 細胞表面受容体の発現を誘導する請求項 139の複合体。
【請求項１４１】
細胞表面受容体が、 CXCR1、CXCR2、CXCR3A、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、XCR1および CX3CR-1から選択されるケモカイン 受容体であり:
ケモカインが受容体への結合を実行することにより、複合体が受容体を担持する細胞にインターナライズされる、請求項121-140のいずれかの複合体。
【請求項１４２】
標的化剤および標的化物質、またはその活性の断片が、共有結合またはイオン結合を介して直接結合している請求項121-141のいずれかの複合体。
【請求項１４３】
標的化剤および標的化物質がリンカーを介して連結している請求項141-142のいずれかの複合体。
【請求項１４４】
リンカーがペプチド、ポリペプチドまたは化学リンカーである請求項 143の複合体。
【請求項１４５】
リンカー が、N-スクシンイミジル (4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル (4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α- (2-ピリジルジチオ)トルエン 、スルホスクシンイミジル-6-(α-メチル-α-(ピリジルジチオール)-トルアミド) ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ) - プロプリオネート、スクシンイミジル 6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロプリオンアミド) ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル 6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド) ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニル ヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、およびS-(2-チオピリジル)-L-システインから選択される請求項 144の複合体。
【請求項１４６】
リンカーがペプチドまたはアミノ酸である請求項 144の複合体。
【請求項１４７】
リンカーがAla-Met リンカーである請求項 146の複合体。
【請求項１４８】
配列番号44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 または 67のいずれかに示すアミノ酸配列を有する請求項121-147のいずれかの複合体。
【請求項１４９】
請求項121-148のいずれかの複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１５０】
請求項 149の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項１５１】
請求項 150のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１５２】
治療上有効濃度または量の請求項121-148のいずれかの複合体を医薬上許容される媒体中に含む医薬組成物。
【請求項１５３】
複合体を投与することを含む、細胞に毒素を標的化する方法であって:
複合体が請求項113-120のいずれかの改変毒素、 および細胞表面受容体 標的化剤を含み;および、
細胞が標的化される細胞表面受容体を発現する、方法。
【請求項１５４】
請求項 152の組成物を投与することを含む免疫または炎症性疾患または障害の治療方法であって、該組成物が二次組織 損傷促進性 炎症細胞の増殖、遊走または生理活性を阻害する方法。
【請求項１５５】
請求項121-148のいずれかの複合体を動物に投与することを含む疾患または障害の阻害方法であって:
疾患または障害が炎症反応に関連する免疫または炎症症状および/または１以上の 細胞の活性化、増殖および遊走に関連する二次組織 損傷であり;
複合体が１以上の 細胞上に発現する１以上の 細胞表面受容体に結合する結果、標的化物質の受容体を担持する細胞へのインターナリゼーションが起こり; および、
複合体が１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、方法。
【請求項１５６】
１以上の 細胞が、免疫エフェクター細胞、または免疫または炎症症状に関係するその他の細胞である請求項 155 の方法。
【請求項１５７】
免疫エフェクター細胞が白血球である請求項 156の方法。
【請求項１５８】
１以上の 細胞が、免疫または炎症症状に関係する別の細胞であり、組織固有細胞 (TRC)である請求項 156の方法。
【請求項１５９】
１以上の 細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、T 細胞、B 細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、好中球から選択される免疫エフェクター細胞である請求項156-158のいずれかの方法。
【請求項１６０】
１以上の 細胞が肺胞マクロファージ、小膠細胞、およびクッパー細胞から選択される組織 マクロファージであるマクロファージである請求項 159の方法。
【請求項１６１】
１以上の 細胞が未熟 樹状細胞、成熟 樹状細胞およびランゲルハンス 細胞から選択される樹状細胞である請求項 159の方法。
【請求項１６２】
１以上の 細胞がCD4+および CD8+ T 細胞から選択されるT 細胞である請求項 159の方法。
【請求項１６３】
細胞がTh1またはTh2 細胞であるCD4+ T 細胞である請求項 162の方法。
【請求項１６４】
TRC がメサンギウム細胞、グリア細胞、上皮 細胞、腫瘍 細胞、線維芽細胞、および滑膜細胞から選択される請求項 158の方法。
【請求項１６５】
１以上の 細胞が活性化されている請求項155-164のいずれかの方法。
【請求項１６６】
動物が哺乳類である請求項155-165のいずれかの方法。
【請求項１６７】
動物がヒトである請求項155-165のいずれかの方法。
【請求項１６８】
複合体が、CNS 傷害、CNS 炎症性疾患、神経変性障害、心疾患、炎症性眼 疾患、炎症性腸 疾患、炎症性関節 疾患、炎症性腎臓または腎 疾患、 炎症性皮膚 疾患、炎症性肺 疾患、炎症性鼻 疾患、炎症性全身 疾患、肥満および関連する疾患における炎症、炎症性甲状腺 疾患、細菌またはウイルス感染に関連する炎症反応、癌、自己免疫 疾患および血管新生媒介 疾患から選択される疾患または障害に関与する１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、請求項155-165のいずれかの方法。
【請求項１６９】
疾患または障害がCNS 炎症性疾患 および/または神経変性障害であり、脳卒中、閉鎖性頭部外傷、白質脳症、脈絡髄膜炎、髄膜炎、副腎白質ジストロフィー、エイズによる認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、慢性疲労症候群、脳炎、脳脊髄炎、海綿状脳症、多発性硬化症、パーキンソン病および脊髄 傷害/外傷 (SCI) から選択される請求項 168の方法。
【請求項１７０】
疾患または障害 が心疾患およびアテローム性動脈硬化症である請求項 168の方法。
【請求項１７１】
疾患または障害が、増殖性糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、網膜炎、強膜炎、強膜虹彩炎、脈絡膜炎 およびブドウ膜炎から選択される炎症性眼 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７２】
疾患または障害が、慢性大腸炎、クローン病 および潰瘍性大腸炎から選択される炎症性腸 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７３】
疾患または障害が、若年性関節リウマチ、変形性関節症、関節リウマチおよび脊椎関節症から選択される炎症性関節 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７４】
炎症性関節 疾患が、強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎炎、未分化性脊椎関節症およびベーチェット症候群から選択される脊椎関節症である請求項 173の方法。
【請求項１７５】
疾患または障害が、糸球体腎炎、IgA 腎症 およびループス腎炎から選択される炎症性腎臓または腎 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７６】
１以上の 細胞が免疫または炎症症状に関連する別の細胞であり、組織固有細胞 (TRC)である請求項 131の複合体。
【請求項１７７】
I-309、 MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8、MIG、IP-10、I-TAC、SDF-1α、SDF-1β、BCA-1、エオタキシン、MCP-4、MCP-5、C10、LEC およびMIP-1b2またはそれらの断片から選択されるケモカインを、直接またはリンカーを介して、請求項113-120のいずれかの改変志賀毒素またはそのSA1 サブユニットまたはその活性の断片と結合して含んでいる複合体。
【請求項１７８】
疾患または障害が、急性呼吸促迫症候群、好酸球性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、気管支収縮、気管支肺異形成症、気管支肺胞 好酸球増加症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺炎および線維性肺 疾患から選択される炎症性肺 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７９】
疾患または障害が、ポリープ症、副鼻腔炎および鼻炎から選択される炎症性鼻 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１８０】
疾患または障害が甲状腺炎である炎症性甲状腺 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１８１】
疾患または障害 が、神経膠腫、アテローム癌、腺癌、肉芽腫、神経膠芽腫、肉芽腫症、リンパ腫、白血病、肺癌、 黒色腫、骨髄腫、肉腫、サルコイドーシス、小膠細胞腫、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、消化器 癌を含む胃癌、膵臓 癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸 癌、直腸 癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺 癌、外陰癌、甲状腺 癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、および 頭頚部癌から選択される癌である請求項 168の方法。
【請求項１８２】
疾患または障害 が、腎臓 疾患、脊髄 傷害、および遅発性過敏症から選択される請求項 168の方法。
【請求項１８３】
複合体の標的化剤が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択され、標的化物質が、改変志賀毒素 またはその活性の断片である請求項155-175 および178-182のいずれかの方法。
【請求項１８４】
標的化剤がMCP-1である請求項155-175および178-183のいずれかの方法。
【請求項１８５】
複合体 が、LPM1c、LPM1d、LPM2、LPM3、LPM4、LPM5、LPM6、LPM7、LPM8、LPM9、LPM10、およびLPM11から選択される請求項155-175 および 178-184のいずれかの方法。
【請求項１８６】
複合体の標的化剤がPF-4 またはその対立遺伝子または種変異体であり、疾患または症状が血管新生媒介 疾患である請求項155-168のいずれかの方法。
【請求項１８７】
複合体の標的化剤がVEGF またはその対立遺伝子または種変異体であり、疾患または症状が血管新生媒介 疾患である請求項155-168のいずれかの方法。
【請求項１８８】
複合体がMSの病因または病理に関与する細胞を標的化する請求項155-169のいずれかの方法。
【請求項１８９】
細胞がCCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3、5、6およびCXCR1-3、4から選択される１以上の受容体を発現する請求項 188の方法。
【請求項１９０】
複合体がCCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3、5、6 およびCXCR1-3、4から選択される少なくとも２つの受容体を標的化する請求項 188 または請求項 189の方法。
【請求項１９１】
複合体がケモカインまたはその受容体への結合および受容体によるインターナリゼーションのために十分なその断片を含み;および、
ケモカイン が、I-309、 MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8、MIG、IP-10、I-TAC、SDF-1α、SDF-1β、BCA-1、エオタキシン、MCP-4、MCP-5、C10、LECおよびMIP-1b2から選択される、
請求項 188または請求項 189の方法。
【請求項１９２】
複合体がLPM7またはLPM1dである請求項188-191のいずれかの方法。
【請求項１９３】
RIPの精製または単離をさらに含む請求項1-34のいずれかの方法。
【請求項１９４】
請求項69-111のいずれかの方法によって産生される改変RIP。
【請求項１９５】
CD4+ T 細胞がTh17 細胞である請求項 136の複合体。
【請求項１９６】
疾患が、乾癬、湿疹および皮膚炎から選択される炎症性皮膚 疾患、または移植片拒絶および 移植片対宿主病から選択される自己免疫 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１９７】
細胞に毒素を標的化するための複合体の使用であって、
複合体が請求項113-120のいずれかの改変毒素、および細胞表面受容体 標的化剤を含み; および
細胞が標的化される細胞表面受容体を発現する、使用。
【請求項１９８】
細胞に毒素を標的化するための医薬の製剤のための複合体の使用であって、
複合体が請求項113-120のいずれかの改変毒素、および細胞表面受容体 標的化剤を含み; および、
細胞が標的化される細胞表面受容体を発現する、使用。
【請求項１９９】
免疫または炎症性疾患または障害の治療のための請求項 152の組成物の使用。
【請求項２００】
免疫または炎症性疾患または障害の治療用医薬の製剤のための請求項 152の組成物の使用。
【請求項２０１】
疾患または障害を阻害するための請求項121-148のいずれかの複合体の使用であって、疾患または障害が炎症反応に関連する免疫または炎症症状および/または１以上の 細胞の活性化、増殖および遊走に関連する二次組織 損傷であり;
複合体が１以上の 細胞上に発現する１以上の 細胞表面受容体に結合する結果、受容体を担持する細胞中への標的化物質のインターナリゼーションが起こり;
複合体が１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、使用。
【請求項２０２】
疾患または障害を阻害するための医薬の製剤のための請求項121-148のいずれかの複合体の使用であって、疾患または障害が、炎症反応に関連する免疫または炎症症状および/または１以上の 細胞の活性化、増殖および遊走に関連する二次組織 損傷であり;
複合体が１以上の 細胞上に発現する１以上の 細胞表面受容体に結合する結果、受容体を担持する細胞中への標的化物質のインターナリゼーションが起こり;
複合体が１以上の 細胞の活性化、増殖 または遊走を阻害する、使用。
【請求項２０３】
複合体が、CNS 傷害、CNS 炎症性疾患、神経変性障害、心疾患、炎症性眼 疾患、炎症性腸 疾患、炎症性関節 疾患、炎症性腎臓または腎 疾患、 炎症性皮膚 疾患、炎症性肺 疾患、炎症性鼻 疾患、炎症性全身 疾患、肥満および関連する疾患における炎症、炎症性甲状腺 疾患、細菌またはウイルス感染に関連する炎症反応、癌、自己免疫 疾患および血管新生媒介 疾患から選択される疾患または障害に関与する１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、請求項197-202のいずれかの使用。
【請求項２０４】
疾患または障害が、脳卒中、閉鎖性頭部外傷、白質脳症、脈絡髄膜炎、髄膜炎、副腎白質ジストロフィー、エイズによる認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、慢性疲労症候群、脳炎、脳脊髄炎、海綿状脳症、多発性硬化症、パーキンソン病および 脊髄 傷害/外傷 (SCI) から選択されるCNS 炎症性疾患 および/または神経変性障害である請求項 203の使用。
【請求項２０５】
疾患または障害が 、乾癬、湿疹および皮膚炎から選択される炎症性皮膚 疾患、または移植片拒絶および移植片対宿主病から選択される自己免疫 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２０６】
疾患または障害が心疾患および アテローム性動脈硬化症である請求項 203の使用。
【請求項２０７】
疾患または障害が、増殖性糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、網膜炎、強膜炎、強膜虹彩炎、脈絡膜炎およびブドウ膜炎から選択される炎症性眼 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２０８】
疾患または障害が、慢性大腸炎、クローン病および潰瘍性大腸炎から選択される炎症性腸 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２０９】
疾患または障害が、若年性関節リウマチ、変形性関節症、関節リウマチおよび脊椎関節症から選択される炎症性関節 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２１０】
疾患または障害が、強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎炎、未分化性脊椎関節症および ベーチェット症候群から選択される脊椎関節症である請求項 209の使用。
【請求項２１１】
疾患または障害が、糸球体腎炎、IgA 腎症およびループス腎炎から選択される炎症性腎臓または腎 疾患である請求項 203の使用。
【請求項１】
以下の工程を含む、改変リボゾーム不活性化タンパク質 (RIP)またはその活性の断片を選択する方法:
a) RIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
b)細胞を培養する工程;
c)生育した細胞を単離する工程; および
d)生育した細胞のなかから、RIP、またはその活性の断片を発現する細胞を単離する工程、ここで、RIPまたは断片は、工程 a)において導入された核酸分子によってコードされるものと比較して改変を含む。
【請求項２】
さらに以下の工程を含む、請求項 1の方法:
e)単離された細胞において発現された改変RIP、またはその活性の断片を同定または単離または精製する工程。
【請求項３】
細胞が選択的モジュレーターを含まない培地で培養される請求項 1または請求項 2の方法。
【請求項４】
細胞が培養される培地 がアデニン 類似体を含まない、請求項 1の方法。
【請求項５】
アデニン 類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)である請求項 4の方法。
【請求項６】
工程 c)またはd)の後に、さらに以下の工程を含む請求項1-5のいずれかの方法:
RIPを発現する単離された細胞を拡張させる工程。
【請求項７】
改変RIPがその配列またはその分子量によってまたは配列決定によって同定される、請求項1- 6のいずれかの方法。
【請求項８】
工程 b)において選択的モジュレーターの存在下で細胞を培養することをさらに含む請求項 1 または請求項 2の方法。
【請求項９】
選択的モジュレーターがRIP 阻害剤である請求項 8の方法。
【請求項１０】
RIP 阻害剤がアデニン 類似体である請求項 9の方法。
【請求項１１】
アデニン 類似体が4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)である請求項 10の方法。
【請求項１２】
RIP 阻害剤、アデニン 類似体、または4-APPの濃度が宿主細胞に対して毒性ではないものである請求項9-11のいずれかの方法。
【請求項１３】
RIP 阻害剤、アデニン 類似体、または4-APPの濃度が宿主細胞に対するRIPの毒性を阻害または低減するものである請求項9-12のいずれかの方法。
【請求項１４】
毒性の阻害または低減が、RIP 阻害剤、アデニン 類似体、または 4-APPの非存在下と比較して、発現されるRIPの量を上昇させるのに十分なものである請求項 13の方法。
【請求項１５】
RIPの毒性が少なくとも 1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%阻害される請求項 13 または請求項 14の方法。
【請求項１６】
4-APPの濃度が約0.1 mMまたは 0.1 mMから約5.0 mMまたは 5.0 mMである請求項11-15のいずれかの方法。
【請求項１７】
4-APP の濃度が、約0.1 または 0.1から2、3、または4 mMの間、または約0.2または0.2、約0.3または0.3、約0.4または0.4、約0.5または0.5、約0.6または0.6、約0.7または0.7、約0.8または0.8、約0.9または0.9、または約1 mMまたは1 mMである、請求項11-16のいずれかの方法。
【請求項１８】
4-APPの濃度が約0.5 mMまたは0.5 mMである請求項11-17のいずれかの方法。
【請求項１９】
宿主細胞が真核細胞である請求項1-18のいずれかの方法。
【請求項２０】
宿主細胞が原核細胞である請求項1-18のいずれかの方法。
【請求項２１】
原核細胞が大腸菌である請求項 20の方法。
【請求項２２】
導入された核酸分子によってコードされるRIP がI型RIP、またはその活性の断片である請求項1-21のいずれかの方法。
【請求項２３】
RIPが、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、ミラビリス属 抗ウイルスタンパク質 (MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP I、オオムギ RIP II、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP 3、トウモロコシ RIP 9、トウモロコシ RIP X、アスパリン-1、およびアスパリン 2から選択される請求項 22の方法。
【請求項２４】
導入された核酸分子によってコードされるRIP がII型RIP、その触媒サブユニットまたはその活性の断片である請求項1-21のいずれかの方法。
【請求項２５】
RIP が、志賀毒素 (Stx)、志賀様毒素 II (Stx2)、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択される請求項 24の方法。
【請求項２６】
RIPがサブユニット A、またはその活性の断片を含む請求項 25の方法。
【請求項２７】
志賀毒素がサブユニット A1 (SA1)またはその活性の断片を含むか、または、サブユニット A1 またはその活性の断片からなる、請求項 25の方法。
【請求項２８】
SA1が切型のものである請求項 27の方法。
【請求項２９】
SA1がC-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 または12の連続するアミノ酸の欠失により切型となっている請求項 28の方法。
【請求項３０】
SA1が Cysの別のアミノ酸による置換によってさらに改変されている請求項27-29のいずれかの方法。
【請求項３１】
置換するアミノ酸がSerである請求項 30の方法。
【請求項３２】
SA1が配列番号22または配列番号24に示すアミノ酸 残基の配列を含む請求項27-29のいずれかの方法。
【請求項３３】
SA1が配列番号23または配列番号25に示す配列を含む核酸分子によってコードされている請求項27-29のいずれかの方法。
【請求項３４】
導入された核酸分子によってコードされるRIPがリガンドと複合体となってリガンド-毒素 複合体を形成している請求項1-33のいずれかの方法。
【請求項３５】
複合体におけるRIPおよびリガンドが直接的にまたは共有結合またはイオン結合を介して間接的に結合している請求項 34の方法。
【請求項３６】
RIPおよびリガンドがリンカーを介して連結している請求項 35の方法。
【請求項３７】
リンカーが、ペプチド、ポリペプチドまたはアミノ酸である請求項 36の方法。
【請求項３８】
リンカー が Ala-Met リンカーである請求項 37の方法。
【請求項３９】
リガンド-毒素 複合体が融合タンパク質である請求項 34の方法。
【請求項４０】
リガンドが、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体 (PRR) リガンドから選択される請求項34-39のいずれかの方法。
【請求項４１】
増殖因子がVEGFである請求項 40の方法。
【請求項４２】
ケモカイン 受容体 標的化剤が、ケモカイン、またはケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、または抗体の断片であり、ここで断片はケモカイン 受容体に結合するものである、請求項 40の方法。
【請求項４３】
抗体がモノクローナル抗体、またはその抗原特異的断片である請求項 42の方法。
【請求項４４】
モノクローナル抗体が、(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、およびXCR1から選択される抗原に特異的に結合する請求項 43の方法。
【請求項４５】
モノクローナル抗体がCXCR-6およびCXCR-7から選択される抗原に特異的に結合する請求項 43の方法。
【請求項４６】
ケモカイン 受容体 標的化剤がケモカインである請求項 42の方法。
【請求項４７】
ケモカインが、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β (SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種 変異体から選択される請求項 46の方法。
【請求項４８】
ケモカイン が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、および BCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 46 または請求項 47の方法。
【請求項４９】
ケモカインが MCP-1である請求項46-48のいずれかの方法。
【請求項５０】
リガンド-毒素 複合体が、配列番号38または配列番号40に示すアミノ酸 残基の配列を含む、請求項38-49のいずれかの方法。
【請求項５１】
リガンド-毒素 複合体が、配列番号37または配列番号39に示す配列を含む核酸分子によってコードされる請求項38-49のいずれかの方法。
【請求項５２】
同定されたRIPが導入された核酸分子によってコードされるRIPと比較して突然変異を含む請求項1-51のいずれかの方法。
【請求項５３】
同定されたRIPの毒性を評価する工程をさらに含む請求項 1-52のいずれかの方法。
【請求項５４】
毒性がタンパク質合成アッセイ、脱プリン アッセイ、および細胞増殖/生存度アッセイから選択されるアッセイにおいて評価される請求項 53の方法。
【請求項５５】
同定されたRIPが導入された核酸分子によってコードされるRIPと比較して毒性を保持している請求項1-54のいずれかの方法。
【請求項５６】
同定されたRIPが0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%またはそれを超える毒性を保持している請求項 55の方法。
【請求項５７】
さらに以下の工程を含む請求項1-56のいずれかの方法:
a) 同定されたRIP、またはその活性の断片をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する工程;
b) 細胞をRIP 阻害剤の存在下でインキュベートする工程、ここでRIP 阻害剤の量はRIP ポリペプチドの毒性を低下させるように選択される;および、
c) RIP、またはその活性の断片が生産される条件下で細胞を培養する工程。
【請求項５８】
工程 c)のRIPを精製する工程をさらに含むことにより、発現または精製またはその両方をされたRIP の量が、 RIP 阻害剤の非存在下での量よりも多くなる請求項 57の方法。
【請求項５９】
以下の工程を含む、リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)、またはその活性の断片の生産を上昇させる方法:
a) RIP、またはその活性の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入する工程;
b) RIP 阻害剤の存在下で細胞をインキュベートする工程、ここでRIP 阻害剤の量はRIPの毒性を低減するように選択される;
c) RIP 阻害剤の非存在下で培養された場合と比べて、RIP、またはその活性の断片がより多い量にて生産される条件下で細胞を培養する工程。
【請求項６０】
工程 c)のRIPを精製する工程をさらに含むことにより、発現または精製またはその両方をされたRIP の量が、 RIP 阻害剤の非存在下での量よりも多くなる請求項 59の方法。
【請求項６１】
導入された核酸によってコードされる RIPが I型RIP、またはその活性の断片である請求項 59または請求項 60の方法。
【請求項６２】
RIP が、ジアンチン 30、ジアンチン 32、リチニン、サポリン-1、サポリン-2、サポリン-3、サポリン-4、サポリン-5、サポリン-6、サポリン-7、サポリン-8、サポリン-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、マパルミン、ドデカンドリン、ブリョジン-L、ブリョジン、ブリョジン II、クラビン、コリシン-1、コリシン-2、ルフィン-A、ルフィン-B、ルフィン-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、アルファ-キリロウィン、ベータ-キリロウィン、ゲロニン、モモルディン 、モモルディン -II、モモルディン -Ic、ミラビリス属 抗ウイルスタンパク質 (MAP)、MAP-30、アルファ-モモルカリン、ベータ-モモルカリン、トリコサンチン、TAP-29、トリコキリン、オオムギ RIP I、オオムギ RIP II、トリチン、アマ RIP、トウモロコシ RIP 3、トウモロコシ RIP 9、トウモロコシ RIP X、アスパリン-1、およびアスパリン 2から選択される請求項 61の方法。
【請求項６３】
導入された核酸によってコードされる RIP が、II型RIP、その 触媒サブユニットまたはその活性の断片である請求項 59または請求項 60の方法。
【請求項６４】
RIP が、志賀毒素 (Stx)、志賀様毒素 II (Stx2)、志賀様毒素 I、ボルケンシン、リシン、ニグリン-CIP-29、アブリン、ヴィルクミン、モデッシン、エブリチン-α、エブリチン-β、エブルチン-γ、およびポルレクチンから選択される請求項 63の方法。
【請求項６５】
RIPがサブユニット A、またはその活性の断片を含む請求項 64の方法。
【請求項６６】
志賀毒素がサブユニット A1 (SA1)またはその活性の断片を含む請求項 64の方法。
【請求項６７】
SA1が切型のものである請求項 66の方法。
【請求項６８】
SA1がC-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12の連続するアミノ酸の欠失により切型となっている請求項 67の方法。
【請求項６９】
RIPが改変されている請求項59-65のいずれかの方法。
【請求項７０】
SA1が改変されている請求項66-69のいずれかの方法。
【請求項７１】
SA1が１以上の アミノ酸の置換により改変されている請求項 70の方法。
【請求項７２】
SA1がCysの別のアミノ酸による置換により改変されている請求項 71の方法。
【請求項７３】
置換するアミノ酸が Serである請求項 72の方法。
【請求項７４】
SA1 が位置 38 または位置 219の一方または両方の置換により改変されており;そして、該位置が、 配列番号22に示すアミノ酸配列を有するSA1におけるアミノ酸 位置を参照した位置である請求項 71の方法。
【請求項７５】
アミノ酸 置換がL38R および/またはV219Aに対応する請求項 74の方法。
【請求項７６】
アミノ酸 置換がV219Aに対応する請求項 75の方法。
【請求項７７】
SA1 が配列番号26 または28に示すアミノ酸配列を有する請求項 74または請求項 75の方法。
【請求項７８】
SA1が配列番号27または29に示す核酸配列によってコードされるものである請求項 74または請求項 75の方法。
【請求項７９】
RIP 阻害剤がアデニン 類似体である請求項59-78のいずれかの方法。
【請求項８０】
アデニン 類似体が 4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4-APP)である請求項 79の方法。
【請求項８１】
RIP 阻害剤、アデニン 類似体または4-APPの濃度が、RIP の毒性を約 10%または10%、約20%または20%、約30%または30%、約40%または40%、約50%または50%、約60%または60%、約70%または70%、約80%または80%、約90%または90%、約91%または91%、約92%または92%、約93%または93%、約94%または94%、約95%または95%、約96%または96%、約97%または97%、約98%または98%、約99%または99%、または約100%または100%低下させるのに効果的な濃度である請求項 59、79または80の方法。
【請求項８２】
4-APPの濃度が約1 mMまたは1 mMから約40.0 mMまたは40.0 mMである請求項 80または 81の方法。
【請求項８３】
4-APP の濃度が約2.0 mMまたは2.0 mM、約3.0 mMまたは3.0 mM、約4.0 mMまたは4.0 mM、約5.0 mMまたは5.0 mM、約6.0 mMまたは6.0 mM、約7.0 mMまたは7.0 mM、約8.0 mMまたは8.0 mM、約9.0 mMまたは9.0 mM、約10.0 mMまたは10.0 mM、約15.0 mMまたは15.0 mM、または約20.0 mMまたは20.0 mMの間である請求項81-82のいずれかの方法。
【請求項８４】
宿主細胞が真核細胞である請求項59-83のいずれかの方法。
【請求項８５】
宿主細胞が原核細胞である請求項59-83のいずれかの方法。
【請求項８６】
宿主細胞が大腸菌である請求項 85の方法。
【請求項８７】
RIP ポリペプチドが誘導物質による誘導の後に発現する請求項59-86のいずれかの方法。
【請求項８８】
誘導物質がIPTGである請求項 87の方法。
【請求項８９】
RIP 阻害剤が誘導物質の添加の前、最中および/または後に添加される請求項87または 88の方法。
【請求項９０】
RIPをコードする核酸分子がリガンドをコードするヌクレオチド配列を含み、それにより分子がリガンド-毒素 複合体をコードする請求項59-89のいずれかの方法。
【請求項９１】
複合体におけるRIPおよびリガンドが共有結合またはイオン結合を介して直接結合している請求項 90の方法。
【請求項９２】
RIPおよびリガンドがリンカーを介して連結している請求項 91の方法。
【請求項９３】
リンカーが、ペプチド、ポリペプチドまたはアミノ酸である請求項 92の方法。
【請求項９４】
リンカーがAla-Met リンカーである請求項 93の方法。
【請求項９５】
リガンド-毒素 複合体が融合タンパク質である請求項 90の方法。
【請求項９６】
リガンド-毒素 複合体におけるリガンド が、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体 (PRR) リガンドから選択される請求項90-95のいずれかの方法。
【請求項９７】
増殖因子がVEGFである請求項 96の方法。
【請求項９８】
ケモカイン 受容体 標的化剤が、ケモカイン、またはケモカイン 受容体に結合するケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、または該受容体に結合する抗体の断片である請求項 96の方法。
【請求項９９】
抗体がモノクローナル抗体、またはその抗原特異的 断片である請求項 98の方法。
【請求項１００】
モノクローナル抗体が(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、およびXCR1から選択される抗原に対して特異的である請求項 99の方法。
【請求項１０１】
モノクローナル抗体がCXCR-6およびCXCR-7から選択される抗原に対して特異的である請求項 99の方法。
【請求項１０２】
ケモカイン 受容体 標的化剤がケモカインである請求項 98の方法。
【請求項１０３】
ケモカイン が、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β (SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 102の方法。
【請求項１０４】
ケモカイン が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 102または請求項 103の方法。
【請求項１０５】
ケモカインが MCP-1である請求項102-104のいずれかの方法。
【請求項１０６】
RIP が志賀毒素、または その活性の断片; または 改変志賀毒素または改変を含むその活性の断片である請求項90-105のいずれかの方法。
【請求項１０７】
志賀毒素が A1 サブユニット (SA1)を含む請求項 106の方法。
【請求項１０８】
リガンド-毒素 複合体が配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、または67のいずれかに示すアミノ酸 残基の配列を含む請求項90-107のいずれかの方法。
【請求項１０９】
リガンド-毒素 複合体が配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65 または66のいずれかに示す配列を含む核酸分子によってコードされる請求項90-107のいずれかの方法。
【請求項１１０】
同定されたRIPを含む複合体を調製することをさらに含む請求項1-58のいずれかの方法。
【請求項１１１】
複合体を合成することを含む請求項 110の方法。
【請求項１１２】
請求項1-58のいずれかの方法によって選択される改変リボソーム不活性化タンパク質 (RIP)。
【請求項１１３】
志賀毒素、その対立遺伝子または種 変異体、その触媒的に活性の断片、またはその活性の断片において１以上の アミノ酸 改変を含む改変志賀毒素 ポリペプチドまたはその活性の断片、ここで該１以上の アミノ酸 改変は、配列番号22に示すアミノ酸配列を含む志賀毒素 A1 サブユニット (SA1)におけるアミノ酸 位置を参照して位置 38 および/または219に対応する位置の一方または両方の置換である。
【請求項１１４】
配列番号22に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド に対して少なくとも 約 40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の配列 同一性を有し、かつ、アミノ酸 位置 38 および/または219に対応する部位にて改変を含む、請求項 113の改変志賀毒素。
【請求項１１５】
改変が L38R および/またはV219Aに対応する請求項 113 または114の改変志賀毒素。
【請求項１１６】
志賀毒素がA サブユニットを含む請求項113-115のいずれかの改変志賀毒素。
【請求項１１７】
志賀毒素が志賀毒素 A1 鎖 (SA1)またはその活性の断片を含む請求項113-116のいずれかの改変志賀毒素 ポリペプチド。
【請求項１１８】
SA1が切型のものである請求項 117の改変志賀毒素。
【請求項１１９】
切型されたSA1がC-末端の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 または12の連続するアミノ酸の欠失により切型されている請求項 118の改変志賀毒素。
【請求項１２０】
SA1が配列番号26 または28に示すアミノ酸配列を含むか、またはその対立遺伝子または種 変異体である請求項117-119のいずれかの改変志賀毒素。
【請求項１２１】
以下を含む複合体:
請求項 112の改変リボソーム不活性化タンパク質 (RIP) または請求項113-120のいずれかの改変志賀毒素、またはその活性の断片である標的化物質;および
標的化剤、またはその部分、ここで、該複合体が細胞表面受容体に結合する結果、標的化物質の受容体を担持する細胞へのインターナリゼーションが起こる。
【請求項１２２】
以下の成分: (標的化剤)n、(L)q、および (標的化物質)m、を含む請求項 121の複合体、ここで:
Lは、標的化剤の標的化物質への結合のためのリンカー;
標的化剤は、細胞表面受容体に選択的に結合するいずれかの部分;
mおよびnは、独立に選択され、少なくとも 1;および、
qは、結果として複合体が標的化受容体に結合し、インターナライズされ、標的化物質が送達される限り、0以上;
結果として得られる複合体は標的化剤と相互作用し標的化剤をインターナライズする受容体に結合し、それにより標的化物質が受容体を担持する細胞にインターナライズされる;および、
複合体が複数の標的化物質を含む場合、標的化物質は同一または異なっており、複合体が複数の標的化剤を含む場合、標的化剤は同一または異なっている、複合体。
【請求項１２３】
独立に選択されるmおよびnが1-6である請求項 122の複合体。
【請求項１２４】
qが1、nが2 およびmが1である請求項 122の複合体。
【請求項１２５】
標的化剤 が、ケモカイン 受容体 標的化剤、非ケモカイン サイトカイン、ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体に特異的な抗体、TNF スーパーファミリーリガンド、およびパターン認識 受容体 (PRR) リガンドから選択される請求項121-124のいずれかの複合体。
【請求項１２６】
増殖因子がVEGFである請求項 125の複合体。
【請求項１２７】
ケモカイン 受容体 標的化剤が、ケモカイン、またはケモカイン 受容体に結合するケモカインの断片、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体、またはケモカイン受容体に特異的に結合する抗体の断片である請求項125の複合体。
【請求項１２８】
ケモカイン 受容体 標的化剤がケモカインである請求項 127の複合体。
【請求項１２９】
ケモカイン が、単球走化性タンパク質-1 (MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、好酸球走化性タンパク質 1(エオタキシン-1)、エオタキシン-2、エオタキシン-3、ストローマ細胞由来因子-1β (SDF-1β)、SDF-1α、SDF-2、マクロファージ 阻害タンパク質 1α (MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、ランテス (RANTES) タンパク質、インターロイキン-8 (IL-8)、増殖制御タンパク質 α (GRO-α)、インターフェロン誘導タンパク質 10 (IP-10)、マクロファージ由来ケモカイン (MDC)、顆粒球走化性 タンパク質 2 (GCP-2)、上皮由来 好中球活性化 タンパク質 78 (ENA-78)、血小板塩基性 タンパク質 (PBP)、ガンマインターフェロン誘導モノカイン (MIG)、 血小板因子 4 (PF-4)、ヘモフィルトレート CC ケモカイン 1 (HCC-1)、胸腺 および活性化制御 ケモカイン (TARC)、リンホタクチン、ルングキン、C10、肝臓発現 ケモカイン (LEC)、エクソダス-2 (SLC)、胸腺 発現ケモカイン (TECK)、皮膚 T-細胞 誘引ケモカイン (CTACK)、粘膜関連上皮 ケモカイン (MEC)、シングルCモチーフ 1-β (SCM-1β)、インターフェロン誘導 T-細胞 アルファ 化学誘引物質 (I-TAC)、乳房および腎臓-発現ケモカイン (BRAK)、フラクタルカイン、およびB 細胞-誘引ケモカイン 1 (BCA-1)、またはそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項 128の複合体。
【請求項１３０】
ケモカイン が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、またはそれらの対立遺伝子または種変異体から選択される請求項128または請求項 129の複合体。
【請求項１３１】
標的化剤が、１以上の 免疫エフェクター細胞または免疫または炎症応答に関連するその他の細胞上の１以上の 細胞表面受容体に特異的に結合する、請求項121-130のいずれかの複合体。
【請求項１３２】
１以上の免疫エフェクター細胞が白血球である請求項 131の複合体。
【請求項１３３】
細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、T 細胞、B 細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、および好中球から選択される請求項 131または請求項 132の複合体。
【請求項１３４】
マクロファージが、肺胞マクロファージ、小膠細胞、およびクッパー細胞から選択される組織 マクロファージである請求項 133の複合体。
【請求項１３５】
樹状細胞が、未熟 樹状細胞、成熟 樹状細胞、およびランゲルハンス 細胞から選択される請求項 133の複合体。
【請求項１３６】
T 細胞がCD4+ およびCD8+ T 細胞から選択される請求項 133の複合体。
【請求項１３７】
CD4+ T 細胞がTh1またはTh2 細胞である請求項 136の複合体。
【請求項１３８】
１以上の 細胞が免疫または炎症症状に関連する別の細胞であり、組織固有細胞 (TRC)であり;および、
TRCがメサンギウム細胞、グリア細胞、内皮 細胞、上皮 細胞、腫瘍 細胞、線維芽細胞、および 滑膜細胞から選択される、
請求項 131の複合体。
【請求項１３９】
細胞が活性化されている請求項131-138のいずれかの複合体。
【請求項１４０】
活性化が１以上の 細胞表面受容体の発現を誘導する請求項 139の複合体。
【請求項１４１】
細胞表面受容体が、 CXCR1、CXCR2、CXCR3A、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CCR1、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、XCR1および CX3CR-1から選択されるケモカイン 受容体であり:
ケモカインが受容体への結合を実行することにより、複合体が受容体を担持する細胞にインターナライズされる、請求項121-140のいずれかの複合体。
【請求項１４２】
標的化剤および標的化物質、またはその活性の断片が、共有結合またはイオン結合を介して直接結合している請求項121-141のいずれかの複合体。
【請求項１４３】
標的化剤および標的化物質がリンカーを介して連結している請求項141-142のいずれかの複合体。
【請求項１４４】
リンカーがペプチド、ポリペプチドまたは化学リンカーである請求項 143の複合体。
【請求項１４５】
リンカー が、N-スクシンイミジル (4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル (4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α- (2-ピリジルジチオ)トルエン 、スルホスクシンイミジル-6-(α-メチル-α-(ピリジルジチオール)-トルアミド) ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ) - プロプリオネート、スクシンイミジル 6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロプリオンアミド) ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル 6(3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド) ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニル ヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、およびS-(2-チオピリジル)-L-システインから選択される請求項 144の複合体。
【請求項１４６】
リンカーがペプチドまたはアミノ酸である請求項 144の複合体。
【請求項１４７】
リンカーがAla-Met リンカーである請求項 146の複合体。
【請求項１４８】
配列番号44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 または 67のいずれかに示すアミノ酸配列を有する請求項121-147のいずれかの複合体。
【請求項１４９】
請求項121-148のいずれかの複合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１５０】
請求項 149の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項１５１】
請求項 150のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１５２】
治療上有効濃度または量の請求項121-148のいずれかの複合体を医薬上許容される媒体中に含む医薬組成物。
【請求項１５３】
複合体を投与することを含む、細胞に毒素を標的化する方法であって:
複合体が請求項113-120のいずれかの改変毒素、 および細胞表面受容体 標的化剤を含み;および、
細胞が標的化される細胞表面受容体を発現する、方法。
【請求項１５４】
請求項 152の組成物を投与することを含む免疫または炎症性疾患または障害の治療方法であって、該組成物が二次組織 損傷促進性 炎症細胞の増殖、遊走または生理活性を阻害する方法。
【請求項１５５】
請求項121-148のいずれかの複合体を動物に投与することを含む疾患または障害の阻害方法であって:
疾患または障害が炎症反応に関連する免疫または炎症症状および/または１以上の 細胞の活性化、増殖および遊走に関連する二次組織 損傷であり;
複合体が１以上の 細胞上に発現する１以上の 細胞表面受容体に結合する結果、標的化物質の受容体を担持する細胞へのインターナリゼーションが起こり; および、
複合体が１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、方法。
【請求項１５６】
１以上の 細胞が、免疫エフェクター細胞、または免疫または炎症症状に関係するその他の細胞である請求項 155 の方法。
【請求項１５７】
免疫エフェクター細胞が白血球である請求項 156の方法。
【請求項１５８】
１以上の 細胞が、免疫または炎症症状に関係する別の細胞であり、組織固有細胞 (TRC)である請求項 156の方法。
【請求項１５９】
１以上の 細胞が、単球、マクロファージ、樹状細胞、T 細胞、B 細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、好中球から選択される免疫エフェクター細胞である請求項156-158のいずれかの方法。
【請求項１６０】
１以上の 細胞が肺胞マクロファージ、小膠細胞、およびクッパー細胞から選択される組織 マクロファージであるマクロファージである請求項 159の方法。
【請求項１６１】
１以上の 細胞が未熟 樹状細胞、成熟 樹状細胞およびランゲルハンス 細胞から選択される樹状細胞である請求項 159の方法。
【請求項１６２】
１以上の 細胞がCD4+および CD8+ T 細胞から選択されるT 細胞である請求項 159の方法。
【請求項１６３】
細胞がTh1またはTh2 細胞であるCD4+ T 細胞である請求項 162の方法。
【請求項１６４】
TRC がメサンギウム細胞、グリア細胞、上皮 細胞、腫瘍 細胞、線維芽細胞、および滑膜細胞から選択される請求項 158の方法。
【請求項１６５】
１以上の 細胞が活性化されている請求項155-164のいずれかの方法。
【請求項１６６】
動物が哺乳類である請求項155-165のいずれかの方法。
【請求項１６７】
動物がヒトである請求項155-165のいずれかの方法。
【請求項１６８】
複合体が、CNS 傷害、CNS 炎症性疾患、神経変性障害、心疾患、炎症性眼 疾患、炎症性腸 疾患、炎症性関節 疾患、炎症性腎臓または腎 疾患、 炎症性皮膚 疾患、炎症性肺 疾患、炎症性鼻 疾患、炎症性全身 疾患、肥満および関連する疾患における炎症、炎症性甲状腺 疾患、細菌またはウイルス感染に関連する炎症反応、癌、自己免疫 疾患および血管新生媒介 疾患から選択される疾患または障害に関与する１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、請求項155-165のいずれかの方法。
【請求項１６９】
疾患または障害がCNS 炎症性疾患 および/または神経変性障害であり、脳卒中、閉鎖性頭部外傷、白質脳症、脈絡髄膜炎、髄膜炎、副腎白質ジストロフィー、エイズによる認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、慢性疲労症候群、脳炎、脳脊髄炎、海綿状脳症、多発性硬化症、パーキンソン病および脊髄 傷害/外傷 (SCI) から選択される請求項 168の方法。
【請求項１７０】
疾患または障害 が心疾患およびアテローム性動脈硬化症である請求項 168の方法。
【請求項１７１】
疾患または障害が、増殖性糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、網膜炎、強膜炎、強膜虹彩炎、脈絡膜炎 およびブドウ膜炎から選択される炎症性眼 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７２】
疾患または障害が、慢性大腸炎、クローン病 および潰瘍性大腸炎から選択される炎症性腸 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７３】
疾患または障害が、若年性関節リウマチ、変形性関節症、関節リウマチおよび脊椎関節症から選択される炎症性関節 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７４】
炎症性関節 疾患が、強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎炎、未分化性脊椎関節症およびベーチェット症候群から選択される脊椎関節症である請求項 173の方法。
【請求項１７５】
疾患または障害が、糸球体腎炎、IgA 腎症 およびループス腎炎から選択される炎症性腎臓または腎 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７６】
１以上の 細胞が免疫または炎症症状に関連する別の細胞であり、組織固有細胞 (TRC)である請求項 131の複合体。
【請求項１７７】
I-309、 MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8、MIG、IP-10、I-TAC、SDF-1α、SDF-1β、BCA-1、エオタキシン、MCP-4、MCP-5、C10、LEC およびMIP-1b2またはそれらの断片から選択されるケモカインを、直接またはリンカーを介して、請求項113-120のいずれかの改変志賀毒素またはそのSA1 サブユニットまたはその活性の断片と結合して含んでいる複合体。
【請求項１７８】
疾患または障害が、急性呼吸促迫症候群、好酸球性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、急性好酸球性肺炎、気管支収縮、気管支肺異形成症、気管支肺胞 好酸球増加症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺炎および線維性肺 疾患から選択される炎症性肺 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１７９】
疾患または障害が、ポリープ症、副鼻腔炎および鼻炎から選択される炎症性鼻 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１８０】
疾患または障害が甲状腺炎である炎症性甲状腺 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１８１】
疾患または障害 が、神経膠腫、アテローム癌、腺癌、肉芽腫、神経膠芽腫、肉芽腫症、リンパ腫、白血病、肺癌、 黒色腫、骨髄腫、肉腫、サルコイドーシス、小膠細胞腫、髄膜腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、消化器 癌を含む胃癌、膵臓 癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸 癌、直腸 癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺 癌、外陰癌、甲状腺 癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、および 頭頚部癌から選択される癌である請求項 168の方法。
【請求項１８２】
疾患または障害 が、腎臓 疾患、脊髄 傷害、および遅発性過敏症から選択される請求項 168の方法。
【請求項１８３】
複合体の標的化剤が、MCP-1、エオタキシン-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、およびBCA-1、およびそれらの対立遺伝子または種変異体から選択され、標的化物質が、改変志賀毒素 またはその活性の断片である請求項155-175 および178-182のいずれかの方法。
【請求項１８４】
標的化剤がMCP-1である請求項155-175および178-183のいずれかの方法。
【請求項１８５】
複合体 が、LPM1c、LPM1d、LPM2、LPM3、LPM4、LPM5、LPM6、LPM7、LPM8、LPM9、LPM10、およびLPM11から選択される請求項155-175 および 178-184のいずれかの方法。
【請求項１８６】
複合体の標的化剤がPF-4 またはその対立遺伝子または種変異体であり、疾患または症状が血管新生媒介 疾患である請求項155-168のいずれかの方法。
【請求項１８７】
複合体の標的化剤がVEGF またはその対立遺伝子または種変異体であり、疾患または症状が血管新生媒介 疾患である請求項155-168のいずれかの方法。
【請求項１８８】
複合体がMSの病因または病理に関与する細胞を標的化する請求項155-169のいずれかの方法。
【請求項１８９】
細胞がCCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3、5、6およびCXCR1-3、4から選択される１以上の受容体を発現する請求項 188の方法。
【請求項１９０】
複合体がCCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3、5、6 およびCXCR1-3、4から選択される少なくとも２つの受容体を標的化する請求項 188 または請求項 189の方法。
【請求項１９１】
複合体がケモカインまたはその受容体への結合および受容体によるインターナリゼーションのために十分なその断片を含み;および、
ケモカイン が、I-309、 MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8、MIG、IP-10、I-TAC、SDF-1α、SDF-1β、BCA-1、エオタキシン、MCP-4、MCP-5、C10、LECおよびMIP-1b2から選択される、
請求項 188または請求項 189の方法。
【請求項１９２】
複合体がLPM7またはLPM1dである請求項188-191のいずれかの方法。
【請求項１９３】
RIPの精製または単離をさらに含む請求項1-34のいずれかの方法。
【請求項１９４】
請求項69-111のいずれかの方法によって産生される改変RIP。
【請求項１９５】
CD4+ T 細胞がTh17 細胞である請求項 136の複合体。
【請求項１９６】
疾患が、乾癬、湿疹および皮膚炎から選択される炎症性皮膚 疾患、または移植片拒絶および 移植片対宿主病から選択される自己免疫 疾患である請求項 168の方法。
【請求項１９７】
細胞に毒素を標的化するための複合体の使用であって、
複合体が請求項113-120のいずれかの改変毒素、および細胞表面受容体 標的化剤を含み; および
細胞が標的化される細胞表面受容体を発現する、使用。
【請求項１９８】
細胞に毒素を標的化するための医薬の製剤のための複合体の使用であって、
複合体が請求項113-120のいずれかの改変毒素、および細胞表面受容体 標的化剤を含み; および、
細胞が標的化される細胞表面受容体を発現する、使用。
【請求項１９９】
免疫または炎症性疾患または障害の治療のための請求項 152の組成物の使用。
【請求項２００】
免疫または炎症性疾患または障害の治療用医薬の製剤のための請求項 152の組成物の使用。
【請求項２０１】
疾患または障害を阻害するための請求項121-148のいずれかの複合体の使用であって、疾患または障害が炎症反応に関連する免疫または炎症症状および/または１以上の 細胞の活性化、増殖および遊走に関連する二次組織 損傷であり;
複合体が１以上の 細胞上に発現する１以上の 細胞表面受容体に結合する結果、受容体を担持する細胞中への標的化物質のインターナリゼーションが起こり;
複合体が１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、使用。
【請求項２０２】
疾患または障害を阻害するための医薬の製剤のための請求項121-148のいずれかの複合体の使用であって、疾患または障害が、炎症反応に関連する免疫または炎症症状および/または１以上の 細胞の活性化、増殖および遊走に関連する二次組織 損傷であり;
複合体が１以上の 細胞上に発現する１以上の 細胞表面受容体に結合する結果、受容体を担持する細胞中への標的化物質のインターナリゼーションが起こり;
複合体が１以上の 細胞の活性化、増殖 または遊走を阻害する、使用。
【請求項２０３】
複合体が、CNS 傷害、CNS 炎症性疾患、神経変性障害、心疾患、炎症性眼 疾患、炎症性腸 疾患、炎症性関節 疾患、炎症性腎臓または腎 疾患、 炎症性皮膚 疾患、炎症性肺 疾患、炎症性鼻 疾患、炎症性全身 疾患、肥満および関連する疾患における炎症、炎症性甲状腺 疾患、細菌またはウイルス感染に関連する炎症反応、癌、自己免疫 疾患および血管新生媒介 疾患から選択される疾患または障害に関与する１以上の 細胞の活性化、増殖または遊走を阻害する、請求項197-202のいずれかの使用。
【請求項２０４】
疾患または障害が、脳卒中、閉鎖性頭部外傷、白質脳症、脈絡髄膜炎、髄膜炎、副腎白質ジストロフィー、エイズによる認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、慢性疲労症候群、脳炎、脳脊髄炎、海綿状脳症、多発性硬化症、パーキンソン病および 脊髄 傷害/外傷 (SCI) から選択されるCNS 炎症性疾患 および/または神経変性障害である請求項 203の使用。
【請求項２０５】
疾患または障害が 、乾癬、湿疹および皮膚炎から選択される炎症性皮膚 疾患、または移植片拒絶および移植片対宿主病から選択される自己免疫 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２０６】
疾患または障害が心疾患および アテローム性動脈硬化症である請求項 203の使用。
【請求項２０７】
疾患または障害が、増殖性糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、網膜炎、強膜炎、強膜虹彩炎、脈絡膜炎およびブドウ膜炎から選択される炎症性眼 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２０８】
疾患または障害が、慢性大腸炎、クローン病および潰瘍性大腸炎から選択される炎症性腸 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２０９】
疾患または障害が、若年性関節リウマチ、変形性関節症、関節リウマチおよび脊椎関節症から選択される炎症性関節 疾患である請求項 203の使用。
【請求項２１０】
疾患または障害が、強直性脊椎炎、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎炎、未分化性脊椎関節症および ベーチェット症候群から選択される脊椎関節症である請求項 209の使用。
【請求項２１１】
疾患または障害が、糸球体腎炎、IgA 腎症およびループス腎炎から選択される炎症性腎臓または腎 疾患である請求項 203の使用。
【公表番号】特表２０１０−５１４４２５（Ｐ２０１０−５１４４２５Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３３１１（Ｐ２００９−５４３３１１）
【出願日】平成１９年１２月１７日（２００７．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２２７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０２１８
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０８２９６５３２）オスプレイ・ファーマシューティカルズ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＯＳＰＲＥＹ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＵＳＡ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１７日（２００７．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２２７８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８０２１８
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０８２９６５３２）オスプレイ・ファーマシューティカルズ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＯＳＰＲＥＹ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＵＳＡ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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