改良されたヒアルロン酸の製造方法
【課題】効率良くヒアルロン酸を製造する方法の提供。
【解決手段】植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；並びに植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は／及び植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得、得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を含むヒアルロン酸の製造方法。
【解決手段】植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；並びに植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は／及び植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得、得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程を含むヒアルロン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物によりヒアルロン酸を製造する方法、及びヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞又は形質転換植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、１９３４年にＭｅｙｅｒとＰａｌｍｅｒが、牛の眼球の硝子体から単離したグリコサミノグリカン（ムコ多糖）である（非特許文献１参照）。高分子のヒアルロン酸は、変形関節症の治療や眼科用手術補助剤、癒着防止や創傷治癒促進効果等に使用されている。また、低分子のヒアルロン酸は生理活性効果があることが報告されている。また、ヒアルロン酸は、保水力に優れていることから化粧品用途にも使用されている。さらに、ヒアルロン酸は、バイオマテリアル素材や、新たな医療用途への応用も期待されている。
【０００３】
これまで、ヒアルロン酸の製造方法としては、動物組織からの抽出（特許文献１参照）または微生物発酵（特許文献２〜５参照）による製造方法が開発されてきた。しかしながら、動物組織からの抽出では、ウイルス等の混入の危険性が懸念されている。一方、微生物発酵では設備投資が必要であり、また、治療用物質を微生物で生産する場合、エンドトキシンの混入等を防ぐために精製コストが高くなる。
【０００４】
一方、植物は、光合成を利用して水と二酸化炭素から糖を合成する、エネルギー負荷の低い理想的な糖質生産系である。特許文献６及び７に記載の発明では、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子を植物体または植物細胞に導入（形質転換）することによって、ヒアルロン酸の生産が可能なことが示されている。さらに、特許文献８及び９に記載の発明では、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子に加えて、ヒアルロン酸の合成原料の糖ヌクレオチドを合成する酵素の遺伝子であるグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、植物体または植物細胞におけるヒアルロン酸の生産性が向上することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０５−１２５１０３号公報
【特許文献２】特開昭５８−０５６６９２号公報
【特許文献３】特開平０６−３１９５７９号公報
【特許文献４】特開平０６−３１９５８０号公報
【特許文献５】特開平０９−０５６３９４号公報
【特許文献６】国際公開第０５／０１２５２９号
【特許文献７】国際公開第０６／０３２５３８号
【特許文献８】国際公開第０７／０２３６８２号
【特許文献９】国際公開第０７／０３９３１６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｅｙｅｒ，Ｋ． ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９３４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０７，６２９−６３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、植物においてヒアルロン酸を製造する公知の方法を改良することによって、従来より更に効率良くヒアルロン酸を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために形質転換に用いる発現用組換えベクター中の転写終結領域の転写効率を向上させることについて鋭意検討した結果、従来の特許文献８又は９等において転写終結領域として用いられているＮＯＳ（ノパリン合成酵素遺伝子）由来の転写終結領域を、シロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域に代えることにより、導入遺伝子の発現効率が増大し、ヒアルロン酸が効率良く生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に記載されるものを要旨とする。
１．（１）以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る工程：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（２）得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程
を含むヒアルロン酸の製造方法において、転写終結領域の塩基配列が、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列であることを特徴とするヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
２．以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて形質転換された、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
ただし、転写終結領域の塩基配列は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
３．２．に記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織から得られる植物抽出物。
４．１．に記載の方法によって得られる、分子量１００万以上のヒアルロン酸。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のヒアルロン酸の製造方法は、形質転換に用いる発現用組換えベクター中の転写終結領域として、従来一般的に用いられているＮＯＳ由来の転写終結領域の代わりに、シロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域を用いているので、植物中に導入された（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、並びに（ｉｉ）グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は／及び（ｉｉｉ）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が植物内で効率良く発現され、植物内で高分子のヒアルロン酸が従来よりも多量に生産される。さらに、本発明によれば、ヒアルロン酸を効率良く生産可能な植物体または植物培養細胞を提供することができる。従って、本発明によれば、植物で生産された安全性の高い高分子のヒアルロン酸を低コストで提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、発現用組換えベクターの概略図である。
【図２】図２は、タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体のヒアルロン酸生産性を示すグラフである。
【図３】図３は、タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の生産したヒアルロン酸の分子量を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法の特徴は、転写終結領域としてシロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域を用いることにより、植物細胞又は植物体中で高分子のヒアルロン酸を効率良く製造することにある。
【００１３】
本発明のヒアルロン酸の製造方法では、まず、以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る（工程（１））：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
まず、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質について説明する。
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−グルクロン酸とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基質としてグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの繰り返し構造からなる直鎖状ポリマーのヒアルロン酸を合成するタンパク質である。
【００１５】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、上記の性質を有していれば特に限定はされず、動物や、微生物やウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素（以下、ＨＡＳと略すことがある）等であることができる。詳しくは、ヒト、マウス、ウサギ、ニワトリ、ウシ、アフリカツメガエル等の脊椎動物由来のヒアルロン酸合成酵素や、ストレプトコッカス属、パスチュレラ属等の微生物由来のヒアルロン酸合成酵素や、クロレラウイルス等のウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等であることができる。
【００１６】
より具体的には、クロレラウイルス ＰＢＣＶ−１系統由来のＨＡＳ（Ａ９８Ｒ）、ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素（ｈＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、マウス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｍＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ニワトリ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｇＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ラット由来のヒアルロン酸合成酵素（ｒＨＡＳ）のＨＡＳ２、ウシ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｂＨＡＳ）のＨＡＳ２、アフリカツメガエル由来のヒアルロン酸合成酵素（ｘＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｐｍＨＡＳ）、ストレプトコッカス ピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｐＨＡＳ）、ストレプトコッカス エクイリシミリス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｅＨＡＳ）等が挙げられる。ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）遺伝子には、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３等の各種タイプを有するものがあるが、タイプの種類は特に限定されない。
【００１７】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、上記記載のＨＡＳであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来のＨＡＳが良く、特に好ましくは、配列番号３または５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＨＡＳが良い。
【００１８】
また、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、配列番号３または５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、ヒアルロン酸合成活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。一例として、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素は、膜結合領域および膜貫通領域と推定される約２７０アミノ酸を欠失してもヒアルロン酸合成酵素活性を持つことが報告されている（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０，８８３−８８９）。変異したアミノ酸の数は、ヒアルロン酸合成活性を失わない限り、その個数は制限されない。
【００１９】
ヒアルロン酸合成活性の測定は、次のように実施すればよい。試料と、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸、１５％グリセロール、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＡと略する）、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略する）、０．１μＭ ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＡ、０．２４μＭ ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、グルクロン酸１２５μｇを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを３７℃で１時間インキュベーションすることにより反応させる。反応後、反応液を１０分間煮沸させることにより反応を停止させる。反応液を二分して、片方に０．５単位のストレプトコッカス ジスガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業製）を添加し、３０℃で４時間さらにインキュベーションする。反応後、１０分間煮沸させることによりヒアルロニダーゼを失活させる。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３０（アマシャムファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ酢酸アンモニウム）で、０．５ｍｌずつ分画し、各画分の放射活性を測定する。その結果、試料を用いた反応液から、ヒアルロニダーゼで低分子化される産物の量によりヒアルロン酸合成活性を測定すればよい。また、ヒアルロン酸結合タンパク質を利用した市販のヒアルロン酸測定用プレート（例えば、ＥＣＨＥＬＯＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社 Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ＥＬＩＳＡ）により、反応液中のヒアルロン酸濃度を測定することにより、ヒアルロン酸合成酵素活性の測定が可能である。
【００２０】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。
【００２１】
次に、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質について説明する。
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、Ｌ−グルタミンとフルクトース−６−リン酸を基質として、グルコサミン−６−リン酸を合成するタンパク質である。
【００２２】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＧＦＡＴと略すことがある）は上記の性質を有していれば特に限定はされず、真核生物由来、原核生物由来、ウイルス由来等のＧＦＡＴが挙げられる。真核生物由来としてはヒト、マウス、トウモロコシ、シロイヌナズナ、線虫、酵母等に由来するＧＦＡＴ、原核生物由来としては枯草菌、大腸菌に等由来するＧＦＡＴ、ウイルス由来としてはクロレラウイルスのＧＦＡＴを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
ＧＦＡＴは、上記記載のＧＦＡＴであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来のＧＦＡＴが良く、特に好ましくは、配列番号７または９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＧＦＡＴが良い。
【００２４】
また、ＧＦＡＴは、配列番号７または９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じた変異のほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ＧＦＡＴ活性を失わない限り、その個数は特に制限されない。天然の変異例として、配列番号７のクロレラウイルス弘前系統のＧＦＡＴと、公知のクロレラウイルスＰＢＣＶ−１系統、Ｋ２系統のＧＦＡＴとは、少なくともアミノ酸レベルで２％が変異している例がある。
【００２５】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼの活性は、フルクトース−６−リン酸（１５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（１５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（６０ｍＭ）を含む溶液（ｐＨ７．０）に酵素液を添加して、３７℃で数時間反応させ、生成物であるグルコサミン−６−リン酸またはグルタミン酸の量を測定することにより評価できる。具体的には、グルコサミン−６−リン酸を測定する方法としては、Ｍｏｒｇａｎ＆Ｅｌｓｏｎ法の改良法であるＲｅｉｓｓｉｇ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９５５，２１７，９５９−９６６）、グルタミン酸を測定する方法としては、グルタミン酸脱水素酵素を利用した酵素法（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，５９，２０１−２０８）等が例示される。
【００２６】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。
【００２７】
次に、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質について説明する。
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−グルコースを基質として、ＵＤＰ−グルクロン酸を合成するタンパク質である。
【００２８】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＵＧＤと略すことがある）は、上記の性質を有していれば特に限定はされず、真核生物由来、原核生物由来、ウイルス由来等のＵＧＤが挙げられる。真核生物由来としては、ヒト、ウシ、マウス、ポプラ、サトウキビやシロイヌナズナ由来等のＵＧＤ、原核生物由来としては、大腸菌、パスツレラ・ムルトシダや乳酸菌由来等のＵＧＤ、ウイルス由来としては、クロレラウイルス由来等のＵＧＤを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
ＵＧＤは、上記記載のＵＧＤであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来またはシロイヌナズナ由来のＵＧＤが良く、特に好ましくは、配列番号１１または１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＵＧＤが良い。
【００３０】
また、ＵＧＤは、配列番号１１または１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ＵＧＤ活性を失わない限り、その個数は特に制限されない。
【００３１】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は、ＵＤＰ−グルコース（４ｍＭ）、ＮＡＤ＋（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ）を含む溶液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加し、３７℃で反応を行い、生成物であるＵＤＰ−グルクロン酸またはＮＡＤＨの量を測定することにより評価できる。具体的には、ＮＡＤＨの測定法はＴｅｎｈａｋｅｎ ａｎｄ Ｔｈｕｌｋｅの報告（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６，１１２：１１２７−３４）に従い、Ａｂｓ３４０の増加を測定することで実施できる。
【００３２】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。
【００３３】
本発明の方法では、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及びＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡはいずれも、植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にあることが必要である。
【００３４】
本発明の方法で用いるプロモーターは、植物中で機能し得る限り、いかなる従来公知のプロモーターであることもできるが、植物体を形質転換する場合は、器官特異的又は組織特異的プロモーターを用いることが好ましく、植物細胞を形質転換する場合は、構成的高発現プロモーターを用いることが好ましい。
【００３５】
器官特異的プロモーターとしては、例えば、根特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、茎特異的プロモーター等がある。根特異的プロモーターとしては、ヒヨシアミン６ｂ−ヒドロキラーゼ遺伝子のＡ６Ｈ６Ｈプロモーター、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼのＰＭＴプロモーター等が挙げられる。種子特異的プロモーターとしては、リポキシゲナーゼ遺伝子のＬＯＸプロモーター、レクチン遺伝子のＰｓｌプロモーター、アミラーゼ遺伝子のＡｍｙｌＡプロモーター等が挙げられる。茎特異的プロモーターとしては、スクロースシンターゼのＳｕｓ４遺伝子プロモーター、グリコプロテインをコードするパタチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００３６】
また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、緑色組織特異的プロモーター等がある。緑色組織特異的プロモーターとしては、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットタンパク質をコードするｒｂｓ遺伝子のプロモーターやクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするＣＡＢ遺伝子のプロモーター、グルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼＡサブユニットタンパク質をコードするＧａｐＡ遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００３７】
構成的高発現プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡ遺伝子のプロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が挙げられる。
【００３８】
次に、本発明の方法で用いる転写終結領域について説明する。
転写終結領域（以下ターミネーターと記すこともある）は、転写物の成熟化（ｐｒｅ−ｍＲＮＡの切断とポリアデニレーション）および転写の終結（ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡからの解離）に関わる領域であり、植物細胞で転写産物の安定化および核外輸送に必要なポリアデニレーション部位を含む領域である。
【００３９】
本発明の方法では、転写終結領域として、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を用いることが必要である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
【００４０】
（ａ）の配列番号１で示される塩基配列は、シロイヌナズナ由来の熱ショックタンパク質遺伝子の転写終結領域に相当する。この転写終結領域は、従来用いられているＮＯＳの転写終結領域と比較して導入遺伝子の発現効率が高い。そのため、この転写終結領域を用いると、ヒアルロン酸を効率良く生産することができる。
【００４１】
本発明の方法において用いられる転写終結領域は、（ａ）の配列番号１で示される塩基配列に限られず、（ｂ）の配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であることもできる。
【００４２】
上記において、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１で示される塩基配列と同等の転写終結領域機能を有する塩基配列のみが配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる特異的ハイブリッド）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる非特異的ハイブリッド）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ）・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
該ストリンジェントな条件は、好ましくはハイストリンジェントな条件である。ハイストリンジェントな条件とは、例えば０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である。
【００４４】
本発明の方法では、発現用組換えベクターの構築は、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」等の植物細胞又は植物体の形質転換に通常用いられているベクターを基にして常法に従って行うことができる。
【００４５】
また、得られたベクターを用いた植物細胞又は植物体の形質転換も、常法に従って行うことができる。例えば、植物培養細胞を宿主として用いる場合、形質転換は、エレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法もしくはパーティクルボンバードメント法により、行うことができる。発現ベクターを導入された植物細胞は、例えば、カナマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選択される。形質転換された植物細胞は、細胞培養、組織培養、器官培養に用いることができ、また、従来知られている植物組織培養法等を用いて、植物体を再生することもできる。
【００４６】
形質転換の対象となる植物細胞の例としては、例えば、タバコ由来ＢＹ−２細胞やＴ−１３細胞、ニンジン由来ｋｕｒｏｄａｇｏｓｕｎ細胞、ブドウ由来ＶＲ細胞やＶＷ細胞、ヨウシュヤマゴボウ由来ＰＡＲ細胞やＰＡＰ細胞やＰＡＷ細胞、シロイヌナズナ由来Ｔ８７細胞、アスパラガス由来Ａｓｐ−８６細胞やＡ．ｐｅｒ細胞やＡ．ｐａｓ細胞やＡ．ｐｌｏ細胞、スイカ由来Ｃｂａ−１細胞、トマト由来Ｓｌｙ−１細胞、ハッカ由来１−Ｍａｒ細胞、ニチニチソウ由来ＣＲＡ細胞やＶ２０８細胞や、ホウレンソウ由来Ｓｐｉ−ＷＴ細胞やＳｐｉ−Ｉ−１細胞やＳｐｉ−１２Ｆ細胞、ヘチマ由来Ｌｃｙ−１細胞やＬｃｙＤ６細胞やＬｃｙＤ７細胞や、イネ由来ＯＳ−１細胞、ツルニチニチソウ由来Ｖｍａ−１細胞、ゴマ由来ＰＳＢ細胞やＰＳＷ細胞やＰＳＧ細胞、ヒャクニチソウ由来ＺＥ３細胞等が挙げられる。
【００４７】
植物体、植物器官又は植物組織を宿主として用いる場合、形質転換は、採取した植物切片に、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法によって、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法によって発現用組換えベクターを導入し、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根等を分離することにより行われる。
【００４８】
こうして得られる腫瘍組織やシュート、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与等により植物体に再生させることができる。
【００４９】
形質転換された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地等に培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なるが、従来知られている植物組織培養法を適宜用いることができる。
【００５０】
形質転換の対象となる植物体には、遺伝子導入の可能ないずれの植物も包含され、具体的には、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、フトモト科、ヒルガオ科の植物等が挙げられる。
【００５１】
これらの方法により作製された形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体、またはそれと同じ性質を有するその子孫（繁殖媒体、例えば種子、塊茎、切穂等から得た植物体）も本発明の対象である。
【００５２】
次に、以上のようにして得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する（工程（２））。
【００５３】
ヒアルロン酸の分離は、常法に従って行えばよい。例えば、形質転換体が植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織等である場合は、これらを収穫して、乾燥させた後に粉砕して、適当な有機溶媒によりヒアルロン酸を含む植物抽出液を抽出する。次に、そのヒアルロン酸を含む植物抽出液を濾過し、植物細胞を含まないヒアルロン酸の濾過溶液を得る。次に、この溶液をダイアフィルトレーションによって精製し、低分子量の不純物を除去する。次に、溶解したヒアルロン酸を含む濾過溶液を純水でダイアフィルトレーションし、濾液を連続して捨てることによりヒアルロン酸を分離することができる。
【００５４】
形質転換体が植物細胞である場合は、植物細胞の培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を、公知の分離法を用いて精製することによりヒアルロン酸を分離することができる。
【００５５】
本発明の方法によって得られるヒアルロン酸は、１００万以上の分子量を有し、化粧品及び医薬品の成分、又はバイオマテリアル素材等の用途に有用に利用できる。具体的には、化粧品の保湿成分、又は、関節炎や慢性リウマチ、火傷や切り傷の治療薬や目薬の成分等として、有用に利用できる。また、皮膚の老化を防止及び／又は改善する上で有用な機能性食品としても利用できる。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５７】
（１）発現用組換えベクターの構築
クロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成酵素（ｃｖＨＡＳ、配列番号３）をコードするＤＮＡ（配列番号２）、クロレラウイルス由来ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ｃｖＵＧＤ、配列番号１１）をコードするＤＮＡ（配列番号１０）およびクロレラウイルス由来グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ｃｖＧＦＡＴ、配列番号７）をコードするＤＮＡ（配列番号６）は、既報（ＷＯ ０５／０１２５２９、ＷＯ ０６／０３２５３８）に従い単離した。プロモーターとして用いたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、およびコントロールの転写終結領域として用いたＮＯＳターミネーターは、ｐＢＩ１２１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から単離した。本発明例の転写終結領域として用いた配列番号１で示される塩基配列（以下、ＨＳＰターミネーターと称する）は、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡから公知の方法で単離した。これらを用いて、図１のＡ及びＢに示した、転写終結領域の異なる２種類の発現用組換えベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ及びｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを公知の方法（特開平０６−３１９５８０号公報）に従い、構築した。図１において、ＨＳＰターミネーターはＨＳＰ−Ｔ、ＮＯＳターミネーターはＮＯＳ−Ｔと記した。これらのベクターは、植物中で機能し得るプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを上流に、転写終結領域としてＨＳＰターミネーター（図１のＡ）またはＮＯＳターミネーター（図１のＢ）を下流に連結したｃｖＨＡＳ遺伝子のＤＮＡカセット、同様の構成のｃｖＵＧＤ遺伝子のＤＮＡカセットおよび同様の構成のＧＦＡＴ遺伝子のＤＮＡカセットから成る多重遺伝子を含むベクターである。また、図１のＣに示す構造の発現用組換えベクターｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳを同様にして構築した。このベクターは、植物中で機能し得るプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを上流に、転写終結領域としてＮＯＳターミネーターを下流に連結したｃｖＨＡＳ遺伝子のＤＮＡカセットを含む公知（ＷＯ ０５／０１２５２９）のベクターである。
【００５８】
（２）タバコＢＹ−２培養細胞の形質転換
上記（１）で構築した３種類の発現用組換えベクターをそれぞれアグロバクテリム ツメファシエンス ＬＢＡ４４０４のエレクトロポレーションコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入した。既知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８５ ７９：５６８−５７０）に従い、得られた形質転換アグロバクテリムを用い、タバコＢＹ−２培養細胞を形質転換した。この操作によって、図１ＡのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰを導入した２１個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ＨＳＰ−１〜ＨＳＰ−２１）、図１ＢのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを導入した２１個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ＮＯＳ−１〜ＮＯＳ−２１）、及び図１ＣのベクターｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳを導入した５個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ｃＨＡＳ−１〜ｃＨＡＳ−５）を得た。
【００５９】
（３）ヒアルロン酸高生産性タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の選抜
上記（２）で得られた形質転換カルスを、スクロース（３０ｇ／Ｌ）、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含む改変ＬＳ液体培地（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８１ １８４：１６１−１６５）で液体培養した。１ヶ月間の液体培養で馴化し生育した細胞の培地を回収し、市販のヒアルロン酸測定キット（ＥＣＨＥＬＯＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社 Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ＥＬＩＳＡ）を用い、ヒアルロン酸濃度を測定し、各形質転換体のヒアルロン酸生産性を調査した。この調査結果に基づき、高いヒアルロン酸生産性を示したクローンを液体培地でさらに２ヶ月間継代培養し、正常に生育したクローンを選抜し、培養開始６日後のヒアルロン酸生産性を比較した。その結果を図２に示す。また、これらのクローンのヒアルロン酸生産性を細胞湿重量当たりのヒアルロン酸生産量に換算した値を表１に示す。図２及び表１から明らかな通り、図１ＡのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰを導入したクローンは、図１ＢのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを導入したクローンよりも明らかに高い生産性を維持し、安定な形質転換体である。
【００６０】
【表１】
【００６１】
（４）タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の生産したヒアルロン酸の分子量
上記（３）で高いヒアルロン酸生産性を示したｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンの生産するヒアルロン酸の分子量を、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンおよびｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳ導入クローンの分子量と比較した。具体的には、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンから系統Ｎｏ．ＨＳＰ−１９、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンから系統Ｎｏ．ＮＯＳ−３およびｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳ導入クローンから系統Ｎｏ．ｃｖＨＡＳ−５を選択し、これらの系統の培地を公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９ ２７４：２５０８５−２５０９２）に従い、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＰＶＤＦメンブレンにブロッティングし、ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質および化学発光法を用いることにより、培地中のヒアルロン酸の分子量を調査した。対照として、タバコＢＹ−２培養細胞の非形質転換体（ＷＴ）の培地を用いた。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンは、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンおよびｃｖＨＡＳ導入クローンよりも高い分子量のヒアルロン酸を生産した。具体的には、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローン（ＨＳＰ−１９）の生産するヒアルロン酸の分子量は１００万以上であり、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローン（ＮＯＳ−３）の生産するヒアルロン酸の分子量は１００万未満であり、ｃｖＨＡＳ導入クローン（ｃｖＨＡＳ−５）の生産するヒアルロン酸の分子量は５０万未満であった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の方法によれば、植物で生産された安全なヒアルロン酸を低コストで提供することができる。従って、本発明の方法は、化粧品や医薬品、バイオマテリアル素材等の分野で広く利用することができ、産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物によりヒアルロン酸を製造する方法、及びヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞又は形質転換植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、１９３４年にＭｅｙｅｒとＰａｌｍｅｒが、牛の眼球の硝子体から単離したグリコサミノグリカン（ムコ多糖）である（非特許文献１参照）。高分子のヒアルロン酸は、変形関節症の治療や眼科用手術補助剤、癒着防止や創傷治癒促進効果等に使用されている。また、低分子のヒアルロン酸は生理活性効果があることが報告されている。また、ヒアルロン酸は、保水力に優れていることから化粧品用途にも使用されている。さらに、ヒアルロン酸は、バイオマテリアル素材や、新たな医療用途への応用も期待されている。
【０００３】
これまで、ヒアルロン酸の製造方法としては、動物組織からの抽出（特許文献１参照）または微生物発酵（特許文献２〜５参照）による製造方法が開発されてきた。しかしながら、動物組織からの抽出では、ウイルス等の混入の危険性が懸念されている。一方、微生物発酵では設備投資が必要であり、また、治療用物質を微生物で生産する場合、エンドトキシンの混入等を防ぐために精製コストが高くなる。
【０００４】
一方、植物は、光合成を利用して水と二酸化炭素から糖を合成する、エネルギー負荷の低い理想的な糖質生産系である。特許文献６及び７に記載の発明では、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子を植物体または植物細胞に導入（形質転換）することによって、ヒアルロン酸の生産が可能なことが示されている。さらに、特許文献８及び９に記載の発明では、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子に加えて、ヒアルロン酸の合成原料の糖ヌクレオチドを合成する酵素の遺伝子であるグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ遺伝子及び／又はＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、植物体または植物細胞におけるヒアルロン酸の生産性が向上することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０５−１２５１０３号公報
【特許文献２】特開昭５８−０５６６９２号公報
【特許文献３】特開平０６−３１９５７９号公報
【特許文献４】特開平０６−３１９５８０号公報
【特許文献５】特開平０９−０５６３９４号公報
【特許文献６】国際公開第０５／０１２５２９号
【特許文献７】国際公開第０６／０３２５３８号
【特許文献８】国際公開第０７／０２３６８２号
【特許文献９】国際公開第０７／０３９３１６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｅｙｅｒ，Ｋ． ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９３４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０７，６２９−６３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、植物においてヒアルロン酸を製造する公知の方法を改良することによって、従来より更に効率良くヒアルロン酸を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために形質転換に用いる発現用組換えベクター中の転写終結領域の転写効率を向上させることについて鋭意検討した結果、従来の特許文献８又は９等において転写終結領域として用いられているＮＯＳ（ノパリン合成酵素遺伝子）由来の転写終結領域を、シロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域に代えることにより、導入遺伝子の発現効率が増大し、ヒアルロン酸が効率良く生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に記載されるものを要旨とする。
１．（１）以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る工程：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（２）得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程
を含むヒアルロン酸の製造方法において、転写終結領域の塩基配列が、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列であることを特徴とするヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
２．以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて形質転換された、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
ただし、転写終結領域の塩基配列は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
３．２．に記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織から得られる植物抽出物。
４．１．に記載の方法によって得られる、分子量１００万以上のヒアルロン酸。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のヒアルロン酸の製造方法は、形質転換に用いる発現用組換えベクター中の転写終結領域として、従来一般的に用いられているＮＯＳ由来の転写終結領域の代わりに、シロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域を用いているので、植物中に導入された（ｉ）ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、並びに（ｉｉ）グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は／及び（ｉｉｉ）ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が植物内で効率良く発現され、植物内で高分子のヒアルロン酸が従来よりも多量に生産される。さらに、本発明によれば、ヒアルロン酸を効率良く生産可能な植物体または植物培養細胞を提供することができる。従って、本発明によれば、植物で生産された安全性の高い高分子のヒアルロン酸を低コストで提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、発現用組換えベクターの概略図である。
【図２】図２は、タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体のヒアルロン酸生産性を示すグラフである。
【図３】図３は、タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の生産したヒアルロン酸の分子量を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法の特徴は、転写終結領域としてシロイヌナズナの熱ショックタンパク質由来の転写終結領域を用いることにより、植物細胞又は植物体中で高分子のヒアルロン酸を効率良く製造することにある。
【００１３】
本発明のヒアルロン酸の製造方法では、まず、以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る（工程（１））：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
まず、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質について説明する。
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−グルクロン酸とＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基質としてグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの繰り返し構造からなる直鎖状ポリマーのヒアルロン酸を合成するタンパク質である。
【００１５】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、上記の性質を有していれば特に限定はされず、動物や、微生物やウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素（以下、ＨＡＳと略すことがある）等であることができる。詳しくは、ヒト、マウス、ウサギ、ニワトリ、ウシ、アフリカツメガエル等の脊椎動物由来のヒアルロン酸合成酵素や、ストレプトコッカス属、パスチュレラ属等の微生物由来のヒアルロン酸合成酵素や、クロレラウイルス等のウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等であることができる。
【００１６】
より具体的には、クロレラウイルス ＰＢＣＶ−１系統由来のＨＡＳ（Ａ９８Ｒ）、ヒト由来のヒアルロン酸合成酵素（ｈＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、マウス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｍＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ニワトリ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｇＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ラット由来のヒアルロン酸合成酵素（ｒＨＡＳ）のＨＡＳ２、ウシ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｂＨＡＳ）のＨＡＳ２、アフリカツメガエル由来のヒアルロン酸合成酵素（ｘＨＡＳ）のＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素（ｐｍＨＡＳ）、ストレプトコッカス ピオゲネス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｐＨＡＳ）、ストレプトコッカス エクイリシミリス由来のヒアルロン酸合成酵素（ｓｅＨＡＳ）等が挙げられる。ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）遺伝子には、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３等の各種タイプを有するものがあるが、タイプの種類は特に限定されない。
【００１７】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、上記記載のＨＡＳであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来のＨＡＳが良く、特に好ましくは、配列番号３または５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＨＡＳが良い。
【００１８】
また、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質は、配列番号３または５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、ヒアルロン酸合成活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号３または５で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。一例として、パスチュレラ ムルトシダ由来のヒアルロン酸合成酵素は、膜結合領域および膜貫通領域と推定される約２７０アミノ酸を欠失してもヒアルロン酸合成酵素活性を持つことが報告されている（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０，８８３−８８９）。変異したアミノ酸の数は、ヒアルロン酸合成活性を失わない限り、その個数は制限されない。
【００１９】
ヒアルロン酸合成活性の測定は、次のように実施すればよい。試料と、１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラ酢酸、１５％グリセロール、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホグルクロン酸（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＡと略する）、０．５ｍＭウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略する）、０．１μＭ ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＡ、０．２４μＭ ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ、グルクロン酸１２５μｇを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）０．２ｍｌを３７℃で１時間インキュベーションすることにより反応させる。反応後、反応液を１０分間煮沸させることにより反応を停止させる。反応液を二分して、片方に０．５単位のストレプトコッカス ジスガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）由来ヒアルロニダーゼ（生化学工業製）を添加し、３０℃で４時間さらにインキュベーションする。反応後、１０分間煮沸させることによりヒアルロニダーゼを失活させる。反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ１０／３０（アマシャムファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ酢酸アンモニウム）で、０．５ｍｌずつ分画し、各画分の放射活性を測定する。その結果、試料を用いた反応液から、ヒアルロニダーゼで低分子化される産物の量によりヒアルロン酸合成活性を測定すればよい。また、ヒアルロン酸結合タンパク質を利用した市販のヒアルロン酸測定用プレート（例えば、ＥＣＨＥＬＯＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社 Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ＥＬＩＳＡ）により、反応液中のヒアルロン酸濃度を測定することにより、ヒアルロン酸合成酵素活性の測定が可能である。
【００２０】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。
【００２１】
次に、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質について説明する。
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、Ｌ−グルタミンとフルクトース−６−リン酸を基質として、グルコサミン−６−リン酸を合成するタンパク質である。
【００２２】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＧＦＡＴと略すことがある）は上記の性質を有していれば特に限定はされず、真核生物由来、原核生物由来、ウイルス由来等のＧＦＡＴが挙げられる。真核生物由来としてはヒト、マウス、トウモロコシ、シロイヌナズナ、線虫、酵母等に由来するＧＦＡＴ、原核生物由来としては枯草菌、大腸菌に等由来するＧＦＡＴ、ウイルス由来としてはクロレラウイルスのＧＦＡＴを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
ＧＦＡＴは、上記記載のＧＦＡＴであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来のＧＦＡＴが良く、特に好ましくは、配列番号７または９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＧＦＡＴが良い。
【００２４】
また、ＧＦＡＴは、配列番号７または９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号７または９で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じた変異のほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ＧＦＡＴ活性を失わない限り、その個数は特に制限されない。天然の変異例として、配列番号７のクロレラウイルス弘前系統のＧＦＡＴと、公知のクロレラウイルスＰＢＣＶ−１系統、Ｋ２系統のＧＦＡＴとは、少なくともアミノ酸レベルで２％が変異している例がある。
【００２５】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼの活性は、フルクトース−６−リン酸（１５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（１５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、ＫＨ２ＰＯ４（６０ｍＭ）を含む溶液（ｐＨ７．０）に酵素液を添加して、３７℃で数時間反応させ、生成物であるグルコサミン−６−リン酸またはグルタミン酸の量を測定することにより評価できる。具体的には、グルコサミン−６−リン酸を測定する方法としては、Ｍｏｒｇａｎ＆Ｅｌｓｏｎ法の改良法であるＲｅｉｓｓｉｇ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９５５，２１７，９５９−９６６）、グルタミン酸を測定する方法としては、グルタミン酸脱水素酵素を利用した酵素法（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，５９，２０１−２０８）等が例示される。
【００２６】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。
【００２７】
次に、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質について説明する。
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質は、ＵＤＰ−グルコースを基質として、ＵＤＰ−グルクロン酸を合成するタンパク質である。
【００２８】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、ＵＧＤと略すことがある）は、上記の性質を有していれば特に限定はされず、真核生物由来、原核生物由来、ウイルス由来等のＵＧＤが挙げられる。真核生物由来としては、ヒト、ウシ、マウス、ポプラ、サトウキビやシロイヌナズナ由来等のＵＧＤ、原核生物由来としては、大腸菌、パスツレラ・ムルトシダや乳酸菌由来等のＵＧＤ、ウイルス由来としては、クロレラウイルス由来等のＵＧＤを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
ＵＧＤは、上記記載のＵＧＤであれば使用できるが、より好ましくはクロレラウイルス由来またはシロイヌナズナ由来のＵＧＤが良く、特に好ましくは、配列番号１１または１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質によって示されるクロレラウイルス由来のＵＧＤが良い。
【００３０】
また、ＵＧＤは、配列番号１１または１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を失わない程度の変異がなされたタンパク質であっても良い。例えば、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１１または１３で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよいが、特にこれに限定されるものではない。このような変異は、自然界において生じるほかに、人為的な変異も含む。変異したアミノ酸の数は、ＵＧＤ活性を失わない限り、その個数は特に制限されない。
【００３１】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法は、ＵＤＰ−グルコース（４ｍＭ）、ＮＡＤ＋（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ）を含む溶液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加し、３７℃で反応を行い、生成物であるＵＤＰ−グルクロン酸またはＮＡＤＨの量を測定することにより評価できる。具体的には、ＮＡＤＨの測定法はＴｅｎｈａｋｅｎ ａｎｄ Ｔｈｕｌｋｅの報告（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６，１１２：１１２７−３４）に従い、Ａｂｓ３４０の増加を測定することで実施できる。
【００３２】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、このタンパク質を生産する生物から、常法に従って容易に単離することができる。
【００３３】
本発明の方法では、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及びＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡはいずれも、植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にあることが必要である。
【００３４】
本発明の方法で用いるプロモーターは、植物中で機能し得る限り、いかなる従来公知のプロモーターであることもできるが、植物体を形質転換する場合は、器官特異的又は組織特異的プロモーターを用いることが好ましく、植物細胞を形質転換する場合は、構成的高発現プロモーターを用いることが好ましい。
【００３５】
器官特異的プロモーターとしては、例えば、根特異的プロモーター、塊茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、種子特異的プロモーター、茎特異的プロモーター等がある。根特異的プロモーターとしては、ヒヨシアミン６ｂ−ヒドロキラーゼ遺伝子のＡ６Ｈ６Ｈプロモーター、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼのＰＭＴプロモーター等が挙げられる。種子特異的プロモーターとしては、リポキシゲナーゼ遺伝子のＬＯＸプロモーター、レクチン遺伝子のＰｓｌプロモーター、アミラーゼ遺伝子のＡｍｙｌＡプロモーター等が挙げられる。茎特異的プロモーターとしては、スクロースシンターゼのＳｕｓ４遺伝子プロモーター、グリコプロテインをコードするパタチン遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００３６】
また、組織特異的プロモーターとしては、例えば、緑色組織特異的プロモーター等がある。緑色組織特異的プロモーターとしては、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットタンパク質をコードするｒｂｓ遺伝子のプロモーターやクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするＣＡＢ遺伝子のプロモーター、グルセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼＡサブユニットタンパク質をコードするＧａｐＡ遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【００３７】
構成的高発現プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡ遺伝子のプロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等が挙げられる。
【００３８】
次に、本発明の方法で用いる転写終結領域について説明する。
転写終結領域（以下ターミネーターと記すこともある）は、転写物の成熟化（ｐｒｅ−ｍＲＮＡの切断とポリアデニレーション）および転写の終結（ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡからの解離）に関わる領域であり、植物細胞で転写産物の安定化および核外輸送に必要なポリアデニレーション部位を含む領域である。
【００３９】
本発明の方法では、転写終結領域として、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を用いることが必要である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
【００４０】
（ａ）の配列番号１で示される塩基配列は、シロイヌナズナ由来の熱ショックタンパク質遺伝子の転写終結領域に相当する。この転写終結領域は、従来用いられているＮＯＳの転写終結領域と比較して導入遺伝子の発現効率が高い。そのため、この転写終結領域を用いると、ヒアルロン酸を効率良く生産することができる。
【００４１】
本発明の方法において用いられる転写終結領域は、（ａ）の配列番号１で示される塩基配列に限られず、（ｂ）の配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であることもできる。
【００４２】
上記において、「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１で示される塩基配列と同等の転写終結領域機能を有する塩基配列のみが配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる特異的ハイブリッド）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は配列番号１に対して相補的な塩基配列とハイブリッド（いわゆる非特異的ハイブリッド）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ）・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
該ストリンジェントな条件は、好ましくはハイストリンジェントな条件である。ハイストリンジェントな条件とは、例えば０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である。
【００４４】
本発明の方法では、発現用組換えベクターの構築は、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」等の植物細胞又は植物体の形質転換に通常用いられているベクターを基にして常法に従って行うことができる。
【００４５】
また、得られたベクターを用いた植物細胞又は植物体の形質転換も、常法に従って行うことができる。例えば、植物培養細胞を宿主として用いる場合、形質転換は、エレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法もしくはパーティクルボンバードメント法により、行うことができる。発現ベクターを導入された植物細胞は、例えば、カナマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選択される。形質転換された植物細胞は、細胞培養、組織培養、器官培養に用いることができ、また、従来知られている植物組織培養法等を用いて、植物体を再生することもできる。
【００４６】
形質転換の対象となる植物細胞の例としては、例えば、タバコ由来ＢＹ−２細胞やＴ−１３細胞、ニンジン由来ｋｕｒｏｄａｇｏｓｕｎ細胞、ブドウ由来ＶＲ細胞やＶＷ細胞、ヨウシュヤマゴボウ由来ＰＡＲ細胞やＰＡＰ細胞やＰＡＷ細胞、シロイヌナズナ由来Ｔ８７細胞、アスパラガス由来Ａｓｐ−８６細胞やＡ．ｐｅｒ細胞やＡ．ｐａｓ細胞やＡ．ｐｌｏ細胞、スイカ由来Ｃｂａ−１細胞、トマト由来Ｓｌｙ−１細胞、ハッカ由来１−Ｍａｒ細胞、ニチニチソウ由来ＣＲＡ細胞やＶ２０８細胞や、ホウレンソウ由来Ｓｐｉ−ＷＴ細胞やＳｐｉ−Ｉ−１細胞やＳｐｉ−１２Ｆ細胞、ヘチマ由来Ｌｃｙ−１細胞やＬｃｙＤ６細胞やＬｃｙＤ７細胞や、イネ由来ＯＳ−１細胞、ツルニチニチソウ由来Ｖｍａ−１細胞、ゴマ由来ＰＳＢ細胞やＰＳＷ細胞やＰＳＧ細胞、ヒャクニチソウ由来ＺＥ３細胞等が挙げられる。
【００４７】
植物体、植物器官又は植物組織を宿主として用いる場合、形質転換は、採取した植物切片に、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法によって、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法によって発現用組換えベクターを導入し、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根等を分離することにより行われる。
【００４８】
こうして得られる腫瘍組織やシュート、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与等により植物体に再生させることができる。
【００４９】
形質転換された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地等に培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なるが、従来知られている植物組織培養法を適宜用いることができる。
【００５０】
形質転換の対象となる植物体には、遺伝子導入の可能ないずれの植物も包含され、具体的には、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、フトモト科、ヒルガオ科の植物等が挙げられる。
【００５１】
これらの方法により作製された形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体、またはそれと同じ性質を有するその子孫（繁殖媒体、例えば種子、塊茎、切穂等から得た植物体）も本発明の対象である。
【００５２】
次に、以上のようにして得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する（工程（２））。
【００５３】
ヒアルロン酸の分離は、常法に従って行えばよい。例えば、形質転換体が植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織等である場合は、これらを収穫して、乾燥させた後に粉砕して、適当な有機溶媒によりヒアルロン酸を含む植物抽出液を抽出する。次に、そのヒアルロン酸を含む植物抽出液を濾過し、植物細胞を含まないヒアルロン酸の濾過溶液を得る。次に、この溶液をダイアフィルトレーションによって精製し、低分子量の不純物を除去する。次に、溶解したヒアルロン酸を含む濾過溶液を純水でダイアフィルトレーションし、濾液を連続して捨てることによりヒアルロン酸を分離することができる。
【００５４】
形質転換体が植物細胞である場合は、植物細胞の培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を、公知の分離法を用いて精製することによりヒアルロン酸を分離することができる。
【００５５】
本発明の方法によって得られるヒアルロン酸は、１００万以上の分子量を有し、化粧品及び医薬品の成分、又はバイオマテリアル素材等の用途に有用に利用できる。具体的には、化粧品の保湿成分、又は、関節炎や慢性リウマチ、火傷や切り傷の治療薬や目薬の成分等として、有用に利用できる。また、皮膚の老化を防止及び／又は改善する上で有用な機能性食品としても利用できる。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５７】
（１）発現用組換えベクターの構築
クロレラウイルス由来ヒアルロン酸合成酵素（ｃｖＨＡＳ、配列番号３）をコードするＤＮＡ（配列番号２）、クロレラウイルス由来ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ｃｖＵＧＤ、配列番号１１）をコードするＤＮＡ（配列番号１０）およびクロレラウイルス由来グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ｃｖＧＦＡＴ、配列番号７）をコードするＤＮＡ（配列番号６）は、既報（ＷＯ ０５／０１２５２９、ＷＯ ０６／０３２５３８）に従い単離した。プロモーターとして用いたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、およびコントロールの転写終結領域として用いたＮＯＳターミネーターは、ｐＢＩ１２１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から単離した。本発明例の転写終結領域として用いた配列番号１で示される塩基配列（以下、ＨＳＰターミネーターと称する）は、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡから公知の方法で単離した。これらを用いて、図１のＡ及びＢに示した、転写終結領域の異なる２種類の発現用組換えベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ及びｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを公知の方法（特開平０６−３１９５８０号公報）に従い、構築した。図１において、ＨＳＰターミネーターはＨＳＰ−Ｔ、ＮＯＳターミネーターはＮＯＳ−Ｔと記した。これらのベクターは、植物中で機能し得るプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを上流に、転写終結領域としてＨＳＰターミネーター（図１のＡ）またはＮＯＳターミネーター（図１のＢ）を下流に連結したｃｖＨＡＳ遺伝子のＤＮＡカセット、同様の構成のｃｖＵＧＤ遺伝子のＤＮＡカセットおよび同様の構成のＧＦＡＴ遺伝子のＤＮＡカセットから成る多重遺伝子を含むベクターである。また、図１のＣに示す構造の発現用組換えベクターｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳを同様にして構築した。このベクターは、植物中で機能し得るプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを上流に、転写終結領域としてＮＯＳターミネーターを下流に連結したｃｖＨＡＳ遺伝子のＤＮＡカセットを含む公知（ＷＯ ０５／０１２５２９）のベクターである。
【００５８】
（２）タバコＢＹ−２培養細胞の形質転換
上記（１）で構築した３種類の発現用組換えベクターをそれぞれアグロバクテリム ツメファシエンス ＬＢＡ４４０４のエレクトロポレーションコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入した。既知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８５ ７９：５６８−５７０）に従い、得られた形質転換アグロバクテリムを用い、タバコＢＹ−２培養細胞を形質転換した。この操作によって、図１ＡのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰを導入した２１個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ＨＳＰ−１〜ＨＳＰ−２１）、図１ＢのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを導入した２１個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ＮＯＳ−１〜ＮＯＳ−２１）、及び図１ＣのベクターｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳを導入した５個の形質転換カルス（系統Ｎｏ．ｃＨＡＳ−１〜ｃＨＡＳ−５）を得た。
【００５９】
（３）ヒアルロン酸高生産性タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の選抜
上記（２）で得られた形質転換カルスを、スクロース（３０ｇ／Ｌ）、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含む改変ＬＳ液体培地（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８１ １８４：１６１−１６５）で液体培養した。１ヶ月間の液体培養で馴化し生育した細胞の培地を回収し、市販のヒアルロン酸測定キット（ＥＣＨＥＬＯＮ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社 Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ＥＬＩＳＡ）を用い、ヒアルロン酸濃度を測定し、各形質転換体のヒアルロン酸生産性を調査した。この調査結果に基づき、高いヒアルロン酸生産性を示したクローンを液体培地でさらに２ヶ月間継代培養し、正常に生育したクローンを選抜し、培養開始６日後のヒアルロン酸生産性を比較した。その結果を図２に示す。また、これらのクローンのヒアルロン酸生産性を細胞湿重量当たりのヒアルロン酸生産量に換算した値を表１に示す。図２及び表１から明らかな通り、図１ＡのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰを導入したクローンは、図１ＢのベクターｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳを導入したクローンよりも明らかに高い生産性を維持し、安定な形質転換体である。
【００６０】
【表１】
【００６１】
（４）タバコＢＹ−２培養細胞形質転換体の生産したヒアルロン酸の分子量
上記（３）で高いヒアルロン酸生産性を示したｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンの生産するヒアルロン酸の分子量を、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンおよびｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳ導入クローンの分子量と比較した。具体的には、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンから系統Ｎｏ．ＨＳＰ−１９、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンから系統Ｎｏ．ＮＯＳ−３およびｐＢＩ１２１−ｃｖＨＡＳ導入クローンから系統Ｎｏ．ｃｖＨＡＳ−５を選択し、これらの系統の培地を公知の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９ ２７４：２５０８５−２５０９２）に従い、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＰＶＤＦメンブレンにブロッティングし、ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質および化学発光法を用いることにより、培地中のヒアルロン酸の分子量を調査した。対照として、タバコＢＹ−２培養細胞の非形質転換体（ＷＴ）の培地を用いた。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローンは、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローンおよびｃｖＨＡＳ導入クローンよりも高い分子量のヒアルロン酸を生産した。具体的には、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＨＳＰ導入クローン（ＨＳＰ−１９）の生産するヒアルロン酸の分子量は１００万以上であり、ｐＢＩ１０１−ＨＵＧ−ＮＯＳ導入クローン（ＮＯＳ−３）の生産するヒアルロン酸の分子量は１００万未満であり、ｃｖＨＡＳ導入クローン（ｃｖＨＡＳ−５）の生産するヒアルロン酸の分子量は５０万未満であった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の方法によれば、植物で生産された安全なヒアルロン酸を低コストで提供することができる。従って、本発明の方法は、化粧品や医薬品、バイオマテリアル素材等の分野で広く利用することができ、産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る工程：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（２）得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程
を含むヒアルロン酸の製造方法において、転写終結領域の塩基配列が、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列であることを特徴とするヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
【請求項２】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号３又は５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１１又は１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
プロモーターが器官特異的又は組織特異的プロモーターであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項６】
以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて形質転換された、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
ただし、転写終結領域の塩基配列は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
【請求項７】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項６に記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ａ）配列番号３又は５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項８】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項６又は７に記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ａ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ａ）配列番号１１又は１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
プロモーターが器官特異的又は組織特異的プロモーターであることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれかに記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織から得られる植物抽出物。
【請求項１２】
植物抽出物がヒアルロン酸を含むことを特徴とする請求項１１記載の植物抽出物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって得られる、分子量１００万以上のヒアルロン酸。
【請求項１】
（１）以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを構築し、このベクターを用いて、植物細胞又は植物体を形質転換して形質転換体を得る工程：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（２）得られた形質転換体を培養し、該形質転換体により生産されたヒアルロン酸を分離する工程
を含むヒアルロン酸の製造方法において、転写終結領域の塩基配列が、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列であることを特徴とするヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
【請求項２】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号３又は５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法：
（ａ）配列番号１１又は１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
プロモーターが器官特異的又は組織特異的プロモーターであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のヒアルロン酸の製造方法。
【請求項６】
以下の（ｉ）並びに（ｉｉ）又は／及び（ｉｉｉ）のＤＮＡを含む発現用組換えベクターを用いて形質転換された、ヒアルロン酸生産能を有する形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）植物中で機能し得るプロモーターと転写終結領域との制御下にある、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
ただし、転写終結領域の塩基配列は、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列である：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
【請求項７】
ヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項６に記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ａ）配列番号３又は５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒアルロン酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項８】
グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項６又は７に記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ａ）配列番号７又は９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織：
（ａ）配列番号１１又は１３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
プロモーターが器官特異的又は組織特異的プロモーターであることを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれかに記載の形質転換植物細胞もしくは形質転換植物体又はそれと同じ性質を有する子孫もしくはそれらの器官もしくはそれらの組織から得られる植物抽出物。
【請求項１２】
植物抽出物がヒアルロン酸を含むことを特徴とする請求項１１記載の植物抽出物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって得られる、分子量１００万以上のヒアルロン酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２００６６３（Ｐ２０１０−２００６６３Ａ）
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４８９８３（Ｐ２００９−４８９８３）
【出願日】平成２１年３月３日（２００９．３．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構 植物利用エネルギー使用合理化工業原料生産技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願の成果
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３日（２００９．３．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構 植物利用エネルギー使用合理化工業原料生産技術開発／植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願の成果
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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