放射線照射によって抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞毒性が増加した高分子量のフィブロイン、その製造方法及びその使用方法
【課題】本発明は、放射線の照射により分子構造が変形されて分子量が増加され、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能、及び／又は癌細胞に対する細胞毒性が増加したフィブロイン、その製造方法及び前記放射線が照射されたフィブロインを抗酸化能、チロシナーゼ阻害能、及び／又は癌細胞に対する細胞毒性の機能を高める健康食品、美白用化粧品、または、医薬品の素材として使用する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、放射線の照射によって分子構造が変形されて分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上が増加したフィブロインである。
【解決手段】本発明は、放射線の照射によって分子構造が変形されて分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上が増加したフィブロインである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線照射によって抗酸化能、チロシナーゼ阻害能、又は癌細胞に対する細胞毒性が増加されるフィブロインと、その製造方法、及びその使用方法に関する。より詳細には、放射線照射によって分子構造の変形をもたらして分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能又は癌細胞に対する細胞毒性が増加されるフィブロインと、このような機能性を有するシルクフィブロインを食品、化粧品又は、医薬品の素材として使用する方法と前記フィブロインを有効成分として含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くからシルクは、専ら衣類用の繊維として使用されてきたが、最近、シルク蛋白質に対する生化学及び医学的用途への応用が活発に研究されるにつれて、新しい生体材料（ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）として注目を受けており、シルクフィブロインに対するいろいろな生理活性が報告されてきた。
【０００３】
シルクフィブロインを与えたマウスから血中コレステロール値と血糖値が低くなることと、アルコールの吸収が阻害される効果などが明らかになり（非特許文献１）、硫酸基で反応させたフィブロインの場合には、ａｎｔｉ−ＨＩＶ活性を示すことも報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
しかし、このような多くの研究成果が有り、かつ親環境的なシルク蛋白質であるにも係らず、フィブロインの機能性食品、化粧品素材及び医薬品素材への活用に供する機能性改善に対する研究は未だ全無の状態であった。
【０００５】
したがって、フィブロインの実用的な活用と、これを機能性食品や化粧品、医薬品の素材などに適用することのできる、前記のようなフィブロインの機能性を増大させる技術が、シルク産業から要望されている。
【非特許文献１】Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｋ．Ｃｈｅｎ，Ｑ．Ｘｕ，ａｎｄ Ｋ．Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ．１９９３．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｆｏｏｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，ｐｐ．７３−８７．Ｉｎ Ｔｈｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｉｌｋ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ
【非特許文献２】Ｇｏｔｏｈ，Ｋ．，Ｈ．Ｉｚｕｍｉ，Ｔ．Ｋａｎａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔａｍａｄａ，ａｎｄ Ｈ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ．２０００．Ｓｕｌｆａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｌｋ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏｏ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：１６６４−１６７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、生理的活性が増加したフィブロインに対して研究する中、フィブロインの溶液に放射線を照射するとき、分子構造に変形を来たし、ラジカル消去能、チロシナーゼ阻害効果、及び／又は癌細胞に対する細胞毒性が増加した高分子量のフィブロインが得られることを確認し、このような知見に基づいて本発明の完成に至った。
【０００７】
本発明の第１の目的は、放射線照射を通じて分子構造が変形されることにより生理的活性が増加したフィブロインを提供する。
また、本発明の第２の目的は、前記分子構造が変形されることにより生理的活性が増加されるフィブロインの製造方法を提供する。
本発明の第３の目的は、前記分子構造が変形されることにより生理的活性が増加したフィブロインの使用方法を提供する。
本発明の第４の目的は、前記分子構造が変形されることにより生理的活性が増加したフィブロインを有効成分として含有する組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記のような目的を達成するために、本発明は、放射線の照射によってフィブロインの分子構造が変形されて分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性が増加したフィブロインを提供する。
【０００９】
また、本発明は、フィブロインの放射線吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙになる範囲内で放射線が照射される工程を包含してなる、分子構造の変形により分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性が増加されるフィブロインの製造方法を提供する。
【００１０】
本発明は、前記の分子構造が変形されたフィブロインを、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる機能性食品の素材、化粧品の素材及び医薬品の素材として使用する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、前記の分子構造が変形されたフィブロインを有効成分として含有する抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明による放射線、例えば、ガンマ線などの照射により、非照射区との対比において、分子構造が変形されることによって高分子量になったフィブロインは、ラジカル消去能の増加、チロシナーゼ抑制効果及び／又は癌細胞に対する細胞毒性の増加などの優れた生物学的特性と、美白効果などを有しているため、食品、化粧品及び医薬品の素材として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施形態において使用されるフィブロインは、（カイコ）まゆから得られるが、まゆに炭酸ナトリウム水溶液などを加えてセリシン（シルクになるフィブロインを取り囲む蛋白質）を分離・除去した後、ろ過して得たフィブロイン溶液を透析などの方法によって不純物を除去して使用することができる。さらに、前記不純物が除去されたフィブロイン溶液を凍結乾燥して粉末形態のフィブロインにして使用することもできる。
【００１４】
また、本発明の実施形態において使用される前記放射線は、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択される１種以上の放射線を使用することができる。なお、放射線照射の後に得られるフィブロインにおける分子構造の変形とともに分子量の増加する効果の面から見てガンマ線または電子線を使用することが好ましい。
【００１５】
前記フィブロインにおける放射線の吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙの範囲、好ましくは、５〜５００ｋＧｙ、より好ましくは、５〜２００ｋＧｙになるように照射する。前記放射線の吸収線量が１ｋＧｙ以上とすることにより、放射線を照射する上述した所期の目的を効果的に達成することができるとともに、１，０００ｋＧｙ以下とすることにより、放射線照射によって物質が分解するなどの問題の発生を防止することができる。
【００１６】
前記の放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインに対して、ＵＶ（紫外線）吸収スペクトル分析により２８０ｎｍと３００ｎｍにおいて非照射区と対比するとき、ＵＶ吸収スペクトル値がそれぞれ１０５％及び５００％以上増加したことを実験例によって確認することができた。
【００１７】
前記フィブロインの分子構造の変形は、α−ヘリックスの２次構造の減少であるか、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加とすることができる。
【００１８】
また、前記フィブロインの分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加とすることができる。好ましくは、抗酸化能とチロシナーゼ阻害能、癌細胞に対する細胞毒性などを増加させる効果を極大化させるためには、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルの２次構造の増加であることが好ましい。
【００１９】
Ｌｅｅ等（Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｓ．，＆Ｓｏｎｇ，ＫＢ．（２００３）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇａｍｍａ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ８２；５２１−６）によれば、溶液相の蛋白質に対して放射線を照射させるとき、発生する酸素ラジカルによって蛋白質の共有結合が容易に分解されて整列された構造が崩れるため、２次と３次構造が変形されるということが報告されている。
【００２０】
β−ｔｕｒｎ構造は、蛋白質のｉ番目のカルボニル基と、ｉ＋３番目のアミン基との間に水素結合をなした４つの残基によって構成されているが、前記β−ｔｕｒｎは、球状蛋白質をなす一般的な要素であって、球状蛋白質の表面から容易に見ることができ、これらは、ポリペプチド鎖の方向を反転させることによって折り畳み構造を促進させる。したがって、β−ｔｕｒｎは、天然蛋白質の折り畳み構造において重要な要素として作用する。
【００２１】
前記放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインの分子量は、５ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、好ましくは、５ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、より好ましくは、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａである。しかし、前記のように、放射線を照射していない非照射区のフィブロインの分子量が５ｋＤａ以下であることを考慮すると、本発明によるフィブロインは放射線の照射によってその分子量がかなり大きく増加している分子構造の変形を確認することができる。
【００２２】
放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインによるラジカル消去能は、非照射区に比べて１０倍以上にまで増加する。これによって、抗酸化能のような生理活性を向上させることができる。
【００２３】
また、放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインによるチロシナーゼ阻害効果は、非照射区に比べて７倍以上にまで増加することによって、ヒト皮膚の美白効果を向上させることができる。
【００２４】
即ち、ヒトの皮膚にあるメラニン色素は、ＵＶによる皮膚の損傷を保護する重要なメカニズムを有するが、しみ、そばかす、光線角化症（ｓｅｎｉｌｅ ｌｅｎｔｉｇｉｎｅｓ）、または、過度色素のような非正常の色素形成など望ましくない問題を起すとともに、チロシナーゼは、ヒトの皮膚にメラニンの生合成を起すメカニズムがある。したがって、チロシナーゼ阻害剤などは、肌の美白効果のための化粧品に使用される重要な素材として知られている。
【００２５】
放射線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性が、非照射区に比べて４０倍以上にまで増加するため、癌細胞の成長を抑制する効果を増大させることができる。
【００２６】
次いで、上述の（カイコ）まゆ由来のフィブロインにおける放射線の吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙになる範囲内で放射線を照射する工程を包含してなるシルクフィブロインの製造方法に関して説明する。
【００２７】
前述のようなフィブロインを作製するときに使用される原料のシルクフィブロインは、まゆ（繭）から分離された天然のシルクフィブロインであるか、または、合成されたフィブロインであってもよい。本実施形態においては、前記まゆから分離された天然のフィブロインを使用する。まず、まゆを炭酸ナトリウム水溶液などを加えてセリシンを分離除去した後加熱し、さらに、ＣａＣｌ２−Ｈ２Ｏ−エタノールの３成分でなる溶液に溶解させた後、これをろ過して得たフィブロイン溶液を透析などの方法によって不純物を除去する。次いで、前記不純物が除去されたフィブロイン溶液を凍結乾燥して粉末形態のフィブロインにして使用する。
【００２８】
また、前記の合成フィブロインは、微生物を利用する生合成法による合成、または、通常のポリペプチド合成法によって得られた合成フィブロインを使用することがことができる。
【００２９】
なお、本発明におけるフィブロインの製造工程において、上述のように前記工程から得たフィブロインを凍結乾燥する工程をさらに包含してもよい。前記の凍結乾燥は、通常の方法によって行うことができる。
【００３０】
本実施形態のフィブロイン製造方法で使用される前記の放射線は、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択される１種以上を使用することができるが、放射線を照射した後に得られるフィブロインの分子量の増加に対する効果の面からガンマ線、または、電子線を使用することが好ましい。
【００３１】
また、前記フィブロイン分子構造の変形は、α−ヘリックスの２次構造の減少、または、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ、及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加であることを特徴とする。
【００３２】
なお、前述のように、前記フィブロインの分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加であるが、好ましくは、抗酸化能とチロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性の増加を極大化させることのできる側面から見るとき、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルの２次構造の増加とすることが好ましい。
【００３３】
また、放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインの分子量が、５ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、好ましくは、５ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、より好ましくは、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａになることを特徴とする。
【００３４】
前記のように分子構造が変形されたフィブロインを、抗酸化能とチロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる機能性の有る食品の素材や、化粧品の素材及び医薬品の素材として使用する方法に関して説明する。
【００３５】
また、前記の分子構造が変形されたフィブロインを有効成分として含有する抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる組成物についても下記でより詳細に説明する。
【００３６】
前記のような食品の素材、化粧品の素材または医薬品の素材として使用する方法は、まず、食品公典、食品添加物公典、化粧品原料の指定と基準及び試験方法などに関する公定の規程などによって許容される範囲内で、または必要に応じて多様に変形された方法を使用することができる。
【００３７】
前記のフィブロインを食品素材として使用することのできる食品類は、例えば、飲料類、麺類、冷凍食品、乳加工製品、肉加工製品、調味食品、生食品類などを挙げることができる。しかし、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、動物に対する飼料としても利用することができる。
【００３８】
前記のフィブロインを化粧品の素材として使用することのできる化粧品類は、例えば、ローション類、クリーム類、ゲル剤などを挙げることができる。しかし、必ずこれらに限定されるものではない。
【００３９】
前記のフィブロインを医薬品の素材として使用することのできる薬品類は、例えば、錠剤、顆粒剤、丸剤、液剤、注射剤、クリーム剤、軟膏剤などの剤型で使用されることを挙げることができる。しかし、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明による前記分子構造が変形されたフィブロインは、その作用、対象製品（食品、化粧品、医薬品）、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、一般成人（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につき約０．０１ｍｇ〜１００ｇの範囲で投与することができる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４１】
前記食品類の組成物、化粧品類の組成物または医薬品類の組成物の製造方法は、特別な制限なしに、前記各分野における公典の基準や諸規程によって許容される通常の製造方法によって製造することができる。
【００４２】
次に、本発明をより明確にするために、好適な実施例を例示する。ただし、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００４３】
実施例１(ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（１）)
本実施例で使用されるフィブロインは、まゆから分離させた天然シルクフィブロインである。
先ず、１０ｇのまゆに５％（ｗ／ｖ）濃度の炭酸ナトリウム水溶液５００ｍｌを加えて溶解させる。次いで、１時間加熱し、ろ過紙によってろ過して溶解されたセリシンを分離・除去した。その後、熱水を利用して残渣を数回洗浄することによって、残留セリシンと炭酸ナトリウムとを分離・除去した。これによりセリシンと炭酸ナトリウムが除去され、フィブロインのみが残存する（シルク）フィブロインを得た。前記シルクフィブロインは、さらにＣａＣｌ２−Ｈ２Ｏ−エタノールの３成分でなる溶液を使用して溶解させた。前記溶解されたフィブロイン溶液は、透析膜に入れて蒸留水の中で３日間透析した後、凍結乾燥して粉末形態のシルクフィブロインにして実験の試料にした。
【００４４】
前記のようにして得たシルクフィブロイン試料は、韓国原子力研究院の放射線科学研究所（Ｊｅｏｎｇｅｕｐ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）のコバルト−６０照射機によって照射した。このとき、線源のサイズは約３００ｋＣｉであり、線量率は時間当り１０ｋＧｙであった。
【００４５】
前記フィブロイン資料の放射吸収線量に対する確認は、５ｍｍ直径のアラニン放射線量計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、放射線量の測定システムは、国際原子力機関（ＩＡＥＡ）の規格に準じて標準化した後に使用した。
【００４６】
前記のようにして作製したシルクフィブロイン粉末試料を、蒸留水に１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させた後、Ｃｏ−６０ガンマ線照射施設（ＩＲ−７９，Ｎｏｒｄｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を利用して時間当り１０ｋＧｙの線量率で５ｋＧｙの総吸収線量が得られるように照射して分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００４７】
実施例２（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（２））
ガンマ線の総吸収線量が１０ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００４８】
実施例３（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（３））
ガンマ線の総吸収線量が５０ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００４９】
実施例４（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（４））
ガンマ線の総吸収線量が１００ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００５０】
実施例５（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（５））
ガンマ線の総吸収線量が１５０ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００５１】
実施例６（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（６））
ガンマ線の総吸収線量が２００ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００５２】
実施例７（放射線が照射されたフィブロインを含有する機能性食品の製造）
実施例４において製造した放射線が照射されたフィブロインを包含する機能性食品を下記のように製造した。
【００５３】
１．小麦粉食品の製造
小麦粉１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン２．５重量部を添加・混合した後、前記混合物を使用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類など健康増進用機能性食品を製造した。
【００５４】
２．スープ及び肉汁の製造
スープ及び肉汁１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン２．５重量部をそれぞれ添加して健康増進用スープと肉汁を製造した。
【００５５】
３．グラウンドビーフの製造
グラウンドビーフ１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン１０重量部を添加して健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【００５６】
４．乳製品の製造
牛乳１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン７．５重量部を添加し、前記牛乳を使用してバター及びアイスクリーム類など多様な乳製品を製造した。
【００５７】
５．健康食（韓国で「禪食」という）の製造
玄米、麦、もちごめ、ハトムギを公知の方法によってアルファ化させて乾燥させた後、粒度６０メッシュの粉砕機によって、それぞれ玄米３０重量％、ハトムギ１５重量％、麦２０重量％及びもちごめ３５重量％の比率に配合して穀物類の粉末を製造した。
また、黒豆、黒ごま、エゴマも公知の方法によって煮た後、乾燥させたものを配合し、粒度６０メッシュの粉砕機によって粉末を製造した。
次いで、放射線が照射されたフィブロインを真空濃縮器によって減圧・濃縮し、噴霧、熱風乾燥機で乾燥させて得た乾燥物を、粒度６０メッシュの粉砕機によって粉砕して乾燥粉末を得た。
【００５８】
上記のように製造した穀物類、種実類及び放射線が照射されたフィブロインの乾燥粉末を前記穀物類１００重量部に対して次の比率で配合して製造した。
種実類（エゴマ７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）
放射線が照射されたフィブロインの乾燥粉末（３重量部）
マンネンタケ（０．５重量部）
ジオウ（地黄）（０．５重量部）
【００５９】
６．健康飲料の製造
通常の健康飲料の製造方法によって、下記の成分を配・混合した後、略１時間の間、８５℃で攪拌・加熱した後、作製された溶液をろ取して滅菌された２リットル容器に収納した後、シール・滅菌させて健康飲料を製造した。
前記の配合組成比は、比較的嗜好飲料に適合する成分を次の好ましい実施例に従って配合組成することができるが、需要の階層、需要の国、使用用途など、地域的、民族的嗜好度によってその配合の比率を任意に変更して作製することもできる。
放射線が照射されたフィブロイン １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅の実の濃縮液 ２ｇ
タウリン １ｇ
ここに、精製水を加えた全量 ９００ｍｌにする。
【００６０】
７．野菜ジュースの製造
放射線が照射されたフィブロイン５ｇをトマトまたはニンジンジュース１０００ｍｌに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００６１】
８．果物ジュースの製造
放射線が照射されたフィブロイン１ｇをリンゴまたはブドウジュース１０００ｍｌに加えて健康増進用果物ジュースを製造した。
【００６２】
９．調理用調味料の製造
調理用調味料１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン４５重量部を添加し、前記調理用調味料を使用して機能性調理用調味料を製造した。
【００６３】
実施例８（放射線が照射されたフィブロインを含有する化粧品の製造）
実施例４において製造した放射線が照射されたフィブロインを有効成分として含有する美白及び抗酸化用機能性化粧品である、乳化剤型の化粧品及び可溶化剤型の化粧品を下記のように製造した。
【００６４】
１．乳化剤型化粧品の製造
下記表１に記載の組成によって乳化剤型の化粧品を製造した。製造方法は下記の通りである。
１）１〜９の原料を混合した混合物を６５〜７０℃で加熱した。
２）１０の原料を前記１）工程での混合物に投入した。
３）１１〜１３の原料混合物を６５〜７０℃で加熱、完全に溶解させた。
４）前記３）の工程中、前記２）工程での混合物を徐々に添加して８０００ｒｐｍで２〜３分間乳化させた。
５）１４の原料を少量の水に溶解させた後、前記４）工程での混合物に添加して２分間さらに乳化させた。
６）１５〜１７の原料をそれぞれ秤量した後、前記５）工程での混合物に入れて３０秒間さらに乳化させた。
７）前記６）工程での混合物を乳化させた後、脱気過程を経て２５〜３５℃で冷却させることによって乳化剤型の化粧品を製造した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
２．可溶化剤型の化粧品の製造
下記表２に記載の組成によって可溶化剤型の化粧品を製造した。製造方法は下記の通りである。
１）２〜６の原料を１の精製水に入れてミキサによって混合・溶解させた。
２）８〜１１の原料を７のアルコールに入れて完全に溶解させた。
３）前記２）工程での混合物を前記１）工程での混合物に徐々に添加しながら可溶化させた。
【００６７】
【表２】
【００６８】
実施例９（放射線が照射されたフィブロインを含有する医薬品の製造）
実施例４において製造した放射線が照射されたフィブロインを有効成分とする薬学的製剤を下記のように製造した。
【００６９】
１．散剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合、気密包に充填して散剤を製造した。
【００７０】
２．錠剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤製造方法によって打錠して錠剤を製造した。
【００７１】
３．カプセル剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤製造方法によってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００７２】
４．丸剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン １ｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸剤当り４ｇの丸剤を製造した。
【００７３】
５．顆粒の製造
放射線が照射されたフィブロイン １５０ｍｇ
大豆の抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
とうもろこし澱粉 ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％のエタノール１００ｍｇを添加して６０℃で乾燥して顆粒を造成した後、薬包に充填した。
【００７４】
実験例１（ＵＶスペクトル分析）
前記実施例１〜実施例６で製造したガンマ線が照射されたシルクフィブロイン溶液を４℃下保存しながらそれぞれ実験に使用した。
ガンマ線の照射によるシルクフィブロインの構造変形を確認するために、前記シルクフィブロイン溶液を２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解させた後、ガンマ線を照射して紫外線分光光度計（ＵＶ−１６０１ＰＣ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって１８０〜４００ｎｍ範囲のＵＶ−ＶＩＳスペクトル分析を行った。その結果を図１に示した。このときの対照群としてはガンマ線非照射区を使用した。
【００７５】
ＵＶ吸収スペクトルは、蛋白質の表面における芳香族アミノ酸の側鎖の吸光度によって構造的な変形を示す。フェニルアラニン、チロシン、または、トリプトファンのような前記３つのアミノ酸は、芳香族側鎖を有するが、結合環を有する大部分の化合物のような芳香族アミノ酸は、スペクトルの紫外線領域において光を吸収する。
チロシンとトリプトファンは、大部分のＵＶ吸光度が２８０ｎｍ領域であると知られているが、トリプトファンは、フェニルアラニンより１００倍程度吸収率が強く、フェニルアラニンは、大部分２６０ｎｍにおいて測定される。
【００７６】
図１を参照すると、ガンマ線が照射されたシルクフィブロインの吸光度（光学濃度）は、線量が増加するほど２６０ｎｍと２８０ｎｍで増加されるが、前記ＵＶ吸光度の変形は、放射線によって構造的な変形があることを示している。このような構造的な変形は、蛋白質構造の分裂によってトリプトファンとチロシンのような内部のアミノ酸らが外部に露出されるためであって、放射線の量が増加するほど混濁度も３３０ｎｍで増加されることを確認することができる。
報告された研究によれば、最大限の吸収波長の領域は２１４ｎｍであり、このような結果は、ペプチド結合らがＵＶ領域においてフィブロインが主に吸収されるグループであることを示し、本実験例１はこのような結果を裏付けると云える。
【００７７】
実験例２（円偏光二色性スペクトル分析）
円偏光二色性スペクトル（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒａ；以下、ＣＤスペクトルと略記する）は、１５０−Ｗキセノンランプ（ｘｅｎｏｎ ｌａｍｐ）が装着されたＪａｓｃｏ Ｊ−７１５分光偏光計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ；Ｊａｐａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ）を利用して測定した。
遠紫外線（ｆａｒ−ＵＶ）スペクトルは、１９０−２５０ｎｍの領域で測定し、試料（０．２ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液状態で分析したが、前記試料は窒素ガスで洗浄し、１ｍｍのキュベットを使用した。
３回の反復によって該当の領域を分析して平均を得て、ＰＢＳに対して測定された値を差し引きして計算したが、このときのＣＤスペクトルの単位は、残余楕円率（ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）（ｄｅｇｒｅｅ ｃｍ２／ｄｍｏｌ）で表示した。
ＣＤ分光法（ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を利用して構造不均衡から起因して発生する左回転偏光（ｌｅｆｔ−ｈａｎｄｅｄ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）と右回転偏光（ｒｉｇｈｔ−ｈａｎｄｅｄ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）の吸収差異を測定することができるが、前記ＣＤ分光法では、遠紫外線スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）で２次蛋白構造を測定することができる。この波長における発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）は蛋白質結合であり、この結合が定常折り畳み状態、α−ヘリックス、β−ｓｈｅｅｔ、または、ランダムコイル構造に位置するとき、それぞれ独特な模様とサイズのＣＤスペクトルを示す。
【００７８】
２０８、２２０ｎｍで示すそれぞれ２つの負ピークは、α−ヘリックスの２次構造形態の蛋白質であり、２１４ｎｍで示されるピークは、β−ｓｈｅｅｔの２次構造形態の蛋白質として知られている。
フィブロインは、放射線照射によって２次構造に変形されるが、図２のように、放射線照射量が増加するほど、α−ヘリックスの２次構造は減少する。反面、β−ｓｈｅｅｔ、ランダムコイルは、α−ヘリックスの２次構造の減少によって相対的に増加することを確認することができる。
【００７９】
実験例３（ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）を利用する分子量の分析）
ガンマ線を照射したフィブロインの分子量をゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）−高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を利用して測定した。
ＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏ．２６９０，ＭＡ，ＵＳＡ）にＰＬアクア・ゲル−ＯＨカラム（３００×７．５ｍｍ，８μｍ；Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用した。
０．１Ｍ硝酸ナトリウムを移動相にして１ｍＬ／ｍｉｎの流速で４０分間移動させた。ＧＰＣ用標準物質（Ｐｕｌｌｕｌａｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）は、昭和電工製品を実験に使用した。
図３は、互に異なる照射線量下で、照射効果の表現としてシルクフィブロインの分子量の変形を示したものである。
図３を参照すると、照射されていないシルクフィブロインの分子量は、５ｋＤａ以下を示し、５ｋＧｙと１０ｋＧｙで照射されたシルクフィブロインの分子量がそれぞれ３２０と、５７６５ｋＤａを示している。このような結果は、線量が増加するほど、構造的変形によって分子間の再結合が増加されていることを確認することができる。
【００８０】
実験例４（ガンマ線が照射されて分子構造が変形されたシルクフィブロインのラジカル消去能の測定）
前記実施例１〜実施例６で製造したフィブロイン試料の電子供与能の測定は、Ｂｌｏｉｓ法に準じてシルクフィブロインのＤＰＰＨ（２.２−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌ−ｈｙｄｒａｚｉｌ）に対する水素供与効果によって測定した。
一定濃度の各試料２ｍｌに、９９％エタノールで溶解させた２×１０４Ｍ ＤＰＰＨ溶液を１ｍｌ加えて、ボルテックス・ミキシング（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｉｎｇ）して３７℃で３０分間反応させた。前記反応液を５１７ｎｍで吸光度を測定し、電子供与効果は試料添加の前・後の吸光度差異を百分率（％）で示した。
５１７ｎｍで吸収される特徴を有する安定された遊離基であるＤＰＰＨは、シルクフィブロインのラジカル消去能力の研究のために使用されたが、放射線が照射されたシルクフィブロインの抗酸化効果を図４に示した。
図４を参照すると、放射線が照射されたシルクフィブロインのＤＰＰＨラジカル消去能力は、同じ濃度で０ｋＧｙのものより高く、線量が増加するほど抗酸化能力が増加することを確認することができた。
【００８１】
実験例５（ガンマ線が照射されて分子構造が変形されたフィブロインのチロシナーゼ阻害効果の測定）
ガンマ線照射によるシルクフィブロインの美白活性能力を確認するために、前記実施例１〜実施例６によって製造されたフィブロインのチロシナーゼ阻害効果を測定した。
０．１７５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｍｌに１０ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）を溶解させた基質液０．２ｍｌと、試料溶液０．１ｍｌを混合させた溶液にマッシュルーム・チロシナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ ＵＳＡ）０．２ｍｌを添加して２５℃で１５分間反応させた後、生成されたＤＯＰＡクロムを吸光度４７５ｎｍで測定した。チロシナーゼ阻害活性は、試料溶液添加区と無添加区とにおける吸光度減少率を百分率（％）で示した。
図５は、本発明によるフィブロインのチロシナーゼ阻害効果を示すものである。
図５を参照すると、ガンマ線が照射されたシルクフィブロインは、全てが非照射のものよりチロシナーゼ阻害効果が高く、照射線量が増加するほどチロシナーゼ阻害効果も増加することを確認することができる。
【００８２】
実験例６（ガンマ線が照射されて分子構造が変形されたシルクフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性の増加効果の測定）
ガンマ線照射によるシルクフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性の増加能を確認するために、前記実施例１〜実施例６によって製造されたフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性の増大効果を測定した。
本実験に使用された癌細胞は、Ｂ１６ＢＬ６（皮膚癌）、ＡＧＳ（胃癌）、ＨＴ−２９（結腸癌）、及びＲＡＷ２６４．７（マクロファージ細胞）であり、韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）から分譲を受けこれを培養しながら本実験に供した。
【００８３】
前記Ｂ１６ＢＬ６とＲＡＷ２６４．７細胞株は、１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が含有されたＥＭＥＭ及びＤＭＥＭ培地を使用し、ＡＧＳとＨＴ−２９は１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清が含有されたＲＰＭＩ１６４０培地を使用して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
シルクフィブロインによる癌細胞と正常細胞の比較評価は、ＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，ｓｉｇｍａ］ａｓｓａｙによって実験した。
それぞれの癌細胞と正常細胞を、９６ウェルプレートにウェル当り３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれ分株した。それぞれのシルクフィブロインの試料は、濃度５ｍｇ／ｍｌで９６ウェルプレートに加えた。
前記プレートを３７℃下で２４時間培養した後、５ｍｇ／ｍｌ濃度のＭＴＴ試薬をそれぞれのウェルに３０μｌずつ加えた後、３０℃下で２時間培養した後、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。その後、１００μｌのＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を添加し、３７℃下で５分間反応させた後、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００８４】
放射線が照射されたシルクフィブロインの癌細胞に対する成長抑制効果は、図６〜図８のグラフ図に示されている。本実験で使用した癌細胞は、前記のように、ＨＴ−２９（結腸癌）、Ｂ１６ＢＬ６（皮膚癌）及びＡＧＳ（胃癌）である。
前記癌細胞に対する抗癌効果を測定するために、ＭＴＴ還元検定法（ＭＴＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を利用して放射線を照射していない対照区と比較して癌細胞の成長抑制効果を確認した。
図示のように、放射線の照射線量が増加するほど、ＨＴ−２９の細胞毒性は、２００ｋＧｙで３９％まで増加し、Ｂ１６ＢＬ６の細胞毒性は、２００ｋＧｙで４８％まで増加した。最後にＡＧＳの細胞毒性は２００ｋＧｙで８７％まで増加した。
【００８５】
放射線が照射されたシルクフィブロインと非照射区のシルクフィブロインの細胞毒性を比較してみると、全ての線量で非照射区のシルクフィブロインより細胞毒性が増加されていることを確認することができる。このような結果から放射線の照射によって癌細胞に対する抵抗性が増加することを確認することができた。
実験例６の癌細胞に対する細胞毒性の増加は、放射線照射線量の増加によって増加することが確認されたが、ここで正常細胞に対する細胞毒性を確認する必要があるので、前記ＲＡＷ２６４．７細胞株を利用して正常細胞に対する毒性実験を実施した。
【００８６】
Ａｎｎａ Ｃｈｉａｒｉｎｉ等は、シルクフィブロインがヒト細胞の成長に役立つものと報告している（Ａｎｎａ Ｃｈｉａｒｉｎｉ，Ｐａｏｌａ Ｐｅｔｒｉｎｉ，Ｓａｂｒｉｎａ Ｂｏｚｚｉｎｉ，Ｉｌａｒｉａ Ｄａｌ Ｐｒａ ａｎｄ Ｕｂａｌｄｏ Ａｒｍａｔｏ（２００３）Ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ／ｐｏｌｙ（ｃａｒｂｏｎａｔｅ）−ｕｒｅｔｈａｎｅ ａｓ ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｐａｇｅｓ ７８９−７９９）。前記の先行研究に基づいて放射線が照射されたシルクフィブロインの正常細胞に対する細胞毒性の効果を実験した結果を図９に示した。
【００８７】
この実験の結果、放射線の照射によるシルクフィブロインの正常細胞に対する細胞毒性効果の減少を確認した。
図９を参照すると、照射線量が増加することによって５ｋＧｙでは細胞毒性が２９％まで減少し、１０ｋＧｙでは細胞毒性が２２％まで減少し、５０ｋＧｙでの細胞毒性は７％まで減少した。しかし、１００ｋＧｙ照射線量以上からは有意的な増加や減少の差異が無いことを確認することができた。
【００８８】
本実験を通じて放射線が照射されたシルクフィブロインは、非照射区と対比してみると、正常細胞に対する毒性は非常に少ないことを確認することができる。
また、図６〜８の実験結果と比較してみると、放射線が照射されたシルクフィブロインの癌細胞に対する毒性は増加するが、正常細胞に対する毒性は減少することを確認することができた。
前記の結果から放射線が照射されたシルクフィブロインは、非照射区と比較すると、より高い抗酸化効果、美白効果及び癌細胞に対する細胞毒性を有していることを確認することができる。
【００８９】
以上、本発明の好適な実施例を参照して説明したが、当該技術分野の当業者であれば、特許請求範囲に記載された本発明の思想及び領域を外さない範囲内で本発明を多様に修正或は変更させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によるガンマ線照射によって分子構造が変形された高分子量のシルクフィブロインは、ガンマ線の非照射区に比べてラジカル消去能の増加、チロシナーゼ抑制効果、及び／又は癌細胞に対する細胞毒性の増加などのような優れた生物学的特性と美白効果などを有しているため、機能性食品、化粧品、及び医薬品の産業分野において有用な素材として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の紫外線吸収スペクトルを確認した結果図である。
【図２】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の遠紫外線ＣＤスペクトルから２次構造を確認した結果図である。
【図３】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の分子量をＧＰＣを利用して測定した結果図である。
【図４】ガンマ線照射によるフィブロインのβグルカンにおけるラジカル消去能の増加を確認した結果図である。
【図５】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質のチロシナーゼ阻害効果の増加を確認した結果図である。
【図６】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の癌細胞に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図であって、結腸癌細胞のＨＴ−２９細胞株に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図である。
【図７】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の癌細胞に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図であって、メラノーマ細胞のＢ１６ＢＬ６細胞株に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図である。
【図８】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の癌細胞に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図であって、胃癌細胞のＡＧＳ細胞株に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図である。
【図９】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の正常細胞に対する細胞毒性効果の減少を確認した結果図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線照射によって抗酸化能、チロシナーゼ阻害能、又は癌細胞に対する細胞毒性が増加されるフィブロインと、その製造方法、及びその使用方法に関する。より詳細には、放射線照射によって分子構造の変形をもたらして分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能又は癌細胞に対する細胞毒性が増加されるフィブロインと、このような機能性を有するシルクフィブロインを食品、化粧品又は、医薬品の素材として使用する方法と前記フィブロインを有効成分として含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
古くからシルクは、専ら衣類用の繊維として使用されてきたが、最近、シルク蛋白質に対する生化学及び医学的用途への応用が活発に研究されるにつれて、新しい生体材料（ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）として注目を受けており、シルクフィブロインに対するいろいろな生理活性が報告されてきた。
【０００３】
シルクフィブロインを与えたマウスから血中コレステロール値と血糖値が低くなることと、アルコールの吸収が阻害される効果などが明らかになり（非特許文献１）、硫酸基で反応させたフィブロインの場合には、ａｎｔｉ−ＨＩＶ活性を示すことも報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
しかし、このような多くの研究成果が有り、かつ親環境的なシルク蛋白質であるにも係らず、フィブロインの機能性食品、化粧品素材及び医薬品素材への活用に供する機能性改善に対する研究は未だ全無の状態であった。
【０００５】
したがって、フィブロインの実用的な活用と、これを機能性食品や化粧品、医薬品の素材などに適用することのできる、前記のようなフィブロインの機能性を増大させる技術が、シルク産業から要望されている。
【非特許文献１】Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｋ．Ｃｈｅｎ，Ｑ．Ｘｕ，ａｎｄ Ｋ．Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ．１９９３．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｆｏｏｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，ｐｐ．７３−８７．Ｉｎ Ｔｈｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｉｌｋ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ
【非特許文献２】Ｇｏｔｏｈ，Ｋ．，Ｈ．Ｉｚｕｍｉ，Ｔ．Ｋａｎａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｔａｍａｄａ，ａｎｄ Ｈ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ．２０００．Ｓｕｌｆａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｌｋ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏｏ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：１６６４−１６７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、生理的活性が増加したフィブロインに対して研究する中、フィブロインの溶液に放射線を照射するとき、分子構造に変形を来たし、ラジカル消去能、チロシナーゼ阻害効果、及び／又は癌細胞に対する細胞毒性が増加した高分子量のフィブロインが得られることを確認し、このような知見に基づいて本発明の完成に至った。
【０００７】
本発明の第１の目的は、放射線照射を通じて分子構造が変形されることにより生理的活性が増加したフィブロインを提供する。
また、本発明の第２の目的は、前記分子構造が変形されることにより生理的活性が増加されるフィブロインの製造方法を提供する。
本発明の第３の目的は、前記分子構造が変形されることにより生理的活性が増加したフィブロインの使用方法を提供する。
本発明の第４の目的は、前記分子構造が変形されることにより生理的活性が増加したフィブロインを有効成分として含有する組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記のような目的を達成するために、本発明は、放射線の照射によってフィブロインの分子構造が変形されて分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性が増加したフィブロインを提供する。
【０００９】
また、本発明は、フィブロインの放射線吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙになる範囲内で放射線が照射される工程を包含してなる、分子構造の変形により分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性が増加されるフィブロインの製造方法を提供する。
【００１０】
本発明は、前記の分子構造が変形されたフィブロインを、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる機能性食品の素材、化粧品の素材及び医薬品の素材として使用する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、前記の分子構造が変形されたフィブロインを有効成分として含有する抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明による放射線、例えば、ガンマ線などの照射により、非照射区との対比において、分子構造が変形されることによって高分子量になったフィブロインは、ラジカル消去能の増加、チロシナーゼ抑制効果及び／又は癌細胞に対する細胞毒性の増加などの優れた生物学的特性と、美白効果などを有しているため、食品、化粧品及び医薬品の素材として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施形態において使用されるフィブロインは、（カイコ）まゆから得られるが、まゆに炭酸ナトリウム水溶液などを加えてセリシン（シルクになるフィブロインを取り囲む蛋白質）を分離・除去した後、ろ過して得たフィブロイン溶液を透析などの方法によって不純物を除去して使用することができる。さらに、前記不純物が除去されたフィブロイン溶液を凍結乾燥して粉末形態のフィブロインにして使用することもできる。
【００１４】
また、本発明の実施形態において使用される前記放射線は、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択される１種以上の放射線を使用することができる。なお、放射線照射の後に得られるフィブロインにおける分子構造の変形とともに分子量の増加する効果の面から見てガンマ線または電子線を使用することが好ましい。
【００１５】
前記フィブロインにおける放射線の吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙの範囲、好ましくは、５〜５００ｋＧｙ、より好ましくは、５〜２００ｋＧｙになるように照射する。前記放射線の吸収線量が１ｋＧｙ以上とすることにより、放射線を照射する上述した所期の目的を効果的に達成することができるとともに、１，０００ｋＧｙ以下とすることにより、放射線照射によって物質が分解するなどの問題の発生を防止することができる。
【００１６】
前記の放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインに対して、ＵＶ（紫外線）吸収スペクトル分析により２８０ｎｍと３００ｎｍにおいて非照射区と対比するとき、ＵＶ吸収スペクトル値がそれぞれ１０５％及び５００％以上増加したことを実験例によって確認することができた。
【００１７】
前記フィブロインの分子構造の変形は、α−ヘリックスの２次構造の減少であるか、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加とすることができる。
【００１８】
また、前記フィブロインの分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加とすることができる。好ましくは、抗酸化能とチロシナーゼ阻害能、癌細胞に対する細胞毒性などを増加させる効果を極大化させるためには、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルの２次構造の増加であることが好ましい。
【００１９】
Ｌｅｅ等（Ｌｅｅ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｓ．，＆Ｓｏｎｇ，ＫＢ．（２００３）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇａｍｍａ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ８２；５２１−６）によれば、溶液相の蛋白質に対して放射線を照射させるとき、発生する酸素ラジカルによって蛋白質の共有結合が容易に分解されて整列された構造が崩れるため、２次と３次構造が変形されるということが報告されている。
【００２０】
β−ｔｕｒｎ構造は、蛋白質のｉ番目のカルボニル基と、ｉ＋３番目のアミン基との間に水素結合をなした４つの残基によって構成されているが、前記β−ｔｕｒｎは、球状蛋白質をなす一般的な要素であって、球状蛋白質の表面から容易に見ることができ、これらは、ポリペプチド鎖の方向を反転させることによって折り畳み構造を促進させる。したがって、β−ｔｕｒｎは、天然蛋白質の折り畳み構造において重要な要素として作用する。
【００２１】
前記放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインの分子量は、５ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、好ましくは、５ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、より好ましくは、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａである。しかし、前記のように、放射線を照射していない非照射区のフィブロインの分子量が５ｋＤａ以下であることを考慮すると、本発明によるフィブロインは放射線の照射によってその分子量がかなり大きく増加している分子構造の変形を確認することができる。
【００２２】
放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインによるラジカル消去能は、非照射区に比べて１０倍以上にまで増加する。これによって、抗酸化能のような生理活性を向上させることができる。
【００２３】
また、放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインによるチロシナーゼ阻害効果は、非照射区に比べて７倍以上にまで増加することによって、ヒト皮膚の美白効果を向上させることができる。
【００２４】
即ち、ヒトの皮膚にあるメラニン色素は、ＵＶによる皮膚の損傷を保護する重要なメカニズムを有するが、しみ、そばかす、光線角化症（ｓｅｎｉｌｅ ｌｅｎｔｉｇｉｎｅｓ）、または、過度色素のような非正常の色素形成など望ましくない問題を起すとともに、チロシナーゼは、ヒトの皮膚にメラニンの生合成を起すメカニズムがある。したがって、チロシナーゼ阻害剤などは、肌の美白効果のための化粧品に使用される重要な素材として知られている。
【００２５】
放射線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性が、非照射区に比べて４０倍以上にまで増加するため、癌細胞の成長を抑制する効果を増大させることができる。
【００２６】
次いで、上述の（カイコ）まゆ由来のフィブロインにおける放射線の吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙになる範囲内で放射線を照射する工程を包含してなるシルクフィブロインの製造方法に関して説明する。
【００２７】
前述のようなフィブロインを作製するときに使用される原料のシルクフィブロインは、まゆ（繭）から分離された天然のシルクフィブロインであるか、または、合成されたフィブロインであってもよい。本実施形態においては、前記まゆから分離された天然のフィブロインを使用する。まず、まゆを炭酸ナトリウム水溶液などを加えてセリシンを分離除去した後加熱し、さらに、ＣａＣｌ２−Ｈ２Ｏ−エタノールの３成分でなる溶液に溶解させた後、これをろ過して得たフィブロイン溶液を透析などの方法によって不純物を除去する。次いで、前記不純物が除去されたフィブロイン溶液を凍結乾燥して粉末形態のフィブロインにして使用する。
【００２８】
また、前記の合成フィブロインは、微生物を利用する生合成法による合成、または、通常のポリペプチド合成法によって得られた合成フィブロインを使用することがことができる。
【００２９】
なお、本発明におけるフィブロインの製造工程において、上述のように前記工程から得たフィブロインを凍結乾燥する工程をさらに包含してもよい。前記の凍結乾燥は、通常の方法によって行うことができる。
【００３０】
本実施形態のフィブロイン製造方法で使用される前記の放射線は、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択される１種以上を使用することができるが、放射線を照射した後に得られるフィブロインの分子量の増加に対する効果の面からガンマ線、または、電子線を使用することが好ましい。
【００３１】
また、前記フィブロイン分子構造の変形は、α−ヘリックスの２次構造の減少、または、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ、及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加であることを特徴とする。
【００３２】
なお、前述のように、前記フィブロインの分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加であるが、好ましくは、抗酸化能とチロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性の増加を極大化させることのできる側面から見るとき、α−ヘリックスの２次構造の減少及びβ−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎとランダムコイルの２次構造の増加とすることが好ましい。
【００３３】
また、放射線照射によって分子構造が変形されたフィブロインの分子量が、５ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、好ましくは、５ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、より好ましくは、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａになることを特徴とする。
【００３４】
前記のように分子構造が変形されたフィブロインを、抗酸化能とチロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる機能性の有る食品の素材や、化粧品の素材及び医薬品の素材として使用する方法に関して説明する。
【００３５】
また、前記の分子構造が変形されたフィブロインを有効成分として含有する抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び／又は癌細胞に対する細胞毒性を増加させる組成物についても下記でより詳細に説明する。
【００３６】
前記のような食品の素材、化粧品の素材または医薬品の素材として使用する方法は、まず、食品公典、食品添加物公典、化粧品原料の指定と基準及び試験方法などに関する公定の規程などによって許容される範囲内で、または必要に応じて多様に変形された方法を使用することができる。
【００３７】
前記のフィブロインを食品素材として使用することのできる食品類は、例えば、飲料類、麺類、冷凍食品、乳加工製品、肉加工製品、調味食品、生食品類などを挙げることができる。しかし、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、動物に対する飼料としても利用することができる。
【００３８】
前記のフィブロインを化粧品の素材として使用することのできる化粧品類は、例えば、ローション類、クリーム類、ゲル剤などを挙げることができる。しかし、必ずこれらに限定されるものではない。
【００３９】
前記のフィブロインを医薬品の素材として使用することのできる薬品類は、例えば、錠剤、顆粒剤、丸剤、液剤、注射剤、クリーム剤、軟膏剤などの剤型で使用されることを挙げることができる。しかし、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明による前記分子構造が変形されたフィブロインは、その作用、対象製品（食品、化粧品、医薬品）、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、一般成人（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につき約０．０１ｍｇ〜１００ｇの範囲で投与することができる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４１】
前記食品類の組成物、化粧品類の組成物または医薬品類の組成物の製造方法は、特別な制限なしに、前記各分野における公典の基準や諸規程によって許容される通常の製造方法によって製造することができる。
【００４２】
次に、本発明をより明確にするために、好適な実施例を例示する。ただし、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００４３】
実施例１(ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（１）)
本実施例で使用されるフィブロインは、まゆから分離させた天然シルクフィブロインである。
先ず、１０ｇのまゆに５％（ｗ／ｖ）濃度の炭酸ナトリウム水溶液５００ｍｌを加えて溶解させる。次いで、１時間加熱し、ろ過紙によってろ過して溶解されたセリシンを分離・除去した。その後、熱水を利用して残渣を数回洗浄することによって、残留セリシンと炭酸ナトリウムとを分離・除去した。これによりセリシンと炭酸ナトリウムが除去され、フィブロインのみが残存する（シルク）フィブロインを得た。前記シルクフィブロインは、さらにＣａＣｌ２−Ｈ２Ｏ−エタノールの３成分でなる溶液を使用して溶解させた。前記溶解されたフィブロイン溶液は、透析膜に入れて蒸留水の中で３日間透析した後、凍結乾燥して粉末形態のシルクフィブロインにして実験の試料にした。
【００４４】
前記のようにして得たシルクフィブロイン試料は、韓国原子力研究院の放射線科学研究所（Ｊｅｏｎｇｅｕｐ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）のコバルト−６０照射機によって照射した。このとき、線源のサイズは約３００ｋＣｉであり、線量率は時間当り１０ｋＧｙであった。
【００４５】
前記フィブロイン資料の放射吸収線量に対する確認は、５ｍｍ直径のアラニン放射線量計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、放射線量の測定システムは、国際原子力機関（ＩＡＥＡ）の規格に準じて標準化した後に使用した。
【００４６】
前記のようにして作製したシルクフィブロイン粉末試料を、蒸留水に１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させた後、Ｃｏ−６０ガンマ線照射施設（ＩＲ−７９，Ｎｏｒｄｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を利用して時間当り１０ｋＧｙの線量率で５ｋＧｙの総吸収線量が得られるように照射して分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００４７】
実施例２（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（２））
ガンマ線の総吸収線量が１０ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００４８】
実施例３（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（３））
ガンマ線の総吸収線量が５０ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００４９】
実施例４（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（４））
ガンマ線の総吸収線量が１００ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００５０】
実施例５（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（５））
ガンマ線の総吸収線量が１５０ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００５１】
実施例６（ガンマ線の照射によって分子構造が変形されたフィブロインの製造（６））
ガンマ線の総吸収線量が２００ｋＧｙになるように照射したことの他は、実施例１と同様にして分子構造が変形されたフィブロイン溶液を製造した。
【００５２】
実施例７（放射線が照射されたフィブロインを含有する機能性食品の製造）
実施例４において製造した放射線が照射されたフィブロインを包含する機能性食品を下記のように製造した。
【００５３】
１．小麦粉食品の製造
小麦粉１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン２．５重量部を添加・混合した後、前記混合物を使用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類など健康増進用機能性食品を製造した。
【００５４】
２．スープ及び肉汁の製造
スープ及び肉汁１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン２．５重量部をそれぞれ添加して健康増進用スープと肉汁を製造した。
【００５５】
３．グラウンドビーフの製造
グラウンドビーフ１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン１０重量部を添加して健康増進用グラウンドビーフを製造した。
【００５６】
４．乳製品の製造
牛乳１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン７．５重量部を添加し、前記牛乳を使用してバター及びアイスクリーム類など多様な乳製品を製造した。
【００５７】
５．健康食（韓国で「禪食」という）の製造
玄米、麦、もちごめ、ハトムギを公知の方法によってアルファ化させて乾燥させた後、粒度６０メッシュの粉砕機によって、それぞれ玄米３０重量％、ハトムギ１５重量％、麦２０重量％及びもちごめ３５重量％の比率に配合して穀物類の粉末を製造した。
また、黒豆、黒ごま、エゴマも公知の方法によって煮た後、乾燥させたものを配合し、粒度６０メッシュの粉砕機によって粉末を製造した。
次いで、放射線が照射されたフィブロインを真空濃縮器によって減圧・濃縮し、噴霧、熱風乾燥機で乾燥させて得た乾燥物を、粒度６０メッシュの粉砕機によって粉砕して乾燥粉末を得た。
【００５８】
上記のように製造した穀物類、種実類及び放射線が照射されたフィブロインの乾燥粉末を前記穀物類１００重量部に対して次の比率で配合して製造した。
種実類（エゴマ７重量部、黒豆８重量部、黒ごま７重量部）
放射線が照射されたフィブロインの乾燥粉末（３重量部）
マンネンタケ（０．５重量部）
ジオウ（地黄）（０．５重量部）
【００５９】
６．健康飲料の製造
通常の健康飲料の製造方法によって、下記の成分を配・混合した後、略１時間の間、８５℃で攪拌・加熱した後、作製された溶液をろ取して滅菌された２リットル容器に収納した後、シール・滅菌させて健康飲料を製造した。
前記の配合組成比は、比較的嗜好飲料に適合する成分を次の好ましい実施例に従って配合組成することができるが、需要の階層、需要の国、使用用途など、地域的、民族的嗜好度によってその配合の比率を任意に変更して作製することもできる。
放射線が照射されたフィブロイン １０００ｍｇ
クエン酸 １０００ｍｇ
オリゴ糖 １００ｇ
梅の実の濃縮液 ２ｇ
タウリン １ｇ
ここに、精製水を加えた全量 ９００ｍｌにする。
【００６０】
７．野菜ジュースの製造
放射線が照射されたフィブロイン５ｇをトマトまたはニンジンジュース１０００ｍｌに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００６１】
８．果物ジュースの製造
放射線が照射されたフィブロイン１ｇをリンゴまたはブドウジュース１０００ｍｌに加えて健康増進用果物ジュースを製造した。
【００６２】
９．調理用調味料の製造
調理用調味料１００重量部に対して放射線が照射されたフィブロイン４５重量部を添加し、前記調理用調味料を使用して機能性調理用調味料を製造した。
【００６３】
実施例８（放射線が照射されたフィブロインを含有する化粧品の製造）
実施例４において製造した放射線が照射されたフィブロインを有効成分として含有する美白及び抗酸化用機能性化粧品である、乳化剤型の化粧品及び可溶化剤型の化粧品を下記のように製造した。
【００６４】
１．乳化剤型化粧品の製造
下記表１に記載の組成によって乳化剤型の化粧品を製造した。製造方法は下記の通りである。
１）１〜９の原料を混合した混合物を６５〜７０℃で加熱した。
２）１０の原料を前記１）工程での混合物に投入した。
３）１１〜１３の原料混合物を６５〜７０℃で加熱、完全に溶解させた。
４）前記３）の工程中、前記２）工程での混合物を徐々に添加して８０００ｒｐｍで２〜３分間乳化させた。
５）１４の原料を少量の水に溶解させた後、前記４）工程での混合物に添加して２分間さらに乳化させた。
６）１５〜１７の原料をそれぞれ秤量した後、前記５）工程での混合物に入れて３０秒間さらに乳化させた。
７）前記６）工程での混合物を乳化させた後、脱気過程を経て２５〜３５℃で冷却させることによって乳化剤型の化粧品を製造した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
２．可溶化剤型の化粧品の製造
下記表２に記載の組成によって可溶化剤型の化粧品を製造した。製造方法は下記の通りである。
１）２〜６の原料を１の精製水に入れてミキサによって混合・溶解させた。
２）８〜１１の原料を７のアルコールに入れて完全に溶解させた。
３）前記２）工程での混合物を前記１）工程での混合物に徐々に添加しながら可溶化させた。
【００６７】
【表２】
【００６８】
実施例９（放射線が照射されたフィブロインを含有する医薬品の製造）
実施例４において製造した放射線が照射されたフィブロインを有効成分とする薬学的製剤を下記のように製造した。
【００６９】
１．散剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン ２ｇ
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合、気密包に充填して散剤を製造した。
【００７０】
２．錠剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤製造方法によって打錠して錠剤を製造した。
【００７１】
３．カプセル剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン １００ｍｇ
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤製造方法によってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００７２】
４．丸剤の製造
放射線が照射されたフィブロイン １ｇ
乳糖 １．５ｇ
グリセリン １ｇ
キシリトール ０．５ｇ
前記の成分を混合した後、通常の方法によって１丸剤当り４ｇの丸剤を製造した。
【００７３】
５．顆粒の製造
放射線が照射されたフィブロイン １５０ｍｇ
大豆の抽出物 ５０ｍｇ
ブドウ糖 ２００ｍｇ
とうもろこし澱粉 ６００ｍｇ
前記の成分を混合した後、３０％のエタノール１００ｍｇを添加して６０℃で乾燥して顆粒を造成した後、薬包に充填した。
【００７４】
実験例１（ＵＶスペクトル分析）
前記実施例１〜実施例６で製造したガンマ線が照射されたシルクフィブロイン溶液を４℃下保存しながらそれぞれ実験に使用した。
ガンマ線の照射によるシルクフィブロインの構造変形を確認するために、前記シルクフィブロイン溶液を２ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解させた後、ガンマ線を照射して紫外線分光光度計（ＵＶ−１６０１ＰＣ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって１８０〜４００ｎｍ範囲のＵＶ−ＶＩＳスペクトル分析を行った。その結果を図１に示した。このときの対照群としてはガンマ線非照射区を使用した。
【００７５】
ＵＶ吸収スペクトルは、蛋白質の表面における芳香族アミノ酸の側鎖の吸光度によって構造的な変形を示す。フェニルアラニン、チロシン、または、トリプトファンのような前記３つのアミノ酸は、芳香族側鎖を有するが、結合環を有する大部分の化合物のような芳香族アミノ酸は、スペクトルの紫外線領域において光を吸収する。
チロシンとトリプトファンは、大部分のＵＶ吸光度が２８０ｎｍ領域であると知られているが、トリプトファンは、フェニルアラニンより１００倍程度吸収率が強く、フェニルアラニンは、大部分２６０ｎｍにおいて測定される。
【００７６】
図１を参照すると、ガンマ線が照射されたシルクフィブロインの吸光度（光学濃度）は、線量が増加するほど２６０ｎｍと２８０ｎｍで増加されるが、前記ＵＶ吸光度の変形は、放射線によって構造的な変形があることを示している。このような構造的な変形は、蛋白質構造の分裂によってトリプトファンとチロシンのような内部のアミノ酸らが外部に露出されるためであって、放射線の量が増加するほど混濁度も３３０ｎｍで増加されることを確認することができる。
報告された研究によれば、最大限の吸収波長の領域は２１４ｎｍであり、このような結果は、ペプチド結合らがＵＶ領域においてフィブロインが主に吸収されるグループであることを示し、本実験例１はこのような結果を裏付けると云える。
【００７７】
実験例２（円偏光二色性スペクトル分析）
円偏光二色性スペクトル（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒａ；以下、ＣＤスペクトルと略記する）は、１５０−Ｗキセノンランプ（ｘｅｎｏｎ ｌａｍｐ）が装着されたＪａｓｃｏ Ｊ−７１５分光偏光計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ；Ｊａｐａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ）を利用して測定した。
遠紫外線（ｆａｒ−ＵＶ）スペクトルは、１９０−２５０ｎｍの領域で測定し、試料（０．２ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．２のＰＢＳ溶液状態で分析したが、前記試料は窒素ガスで洗浄し、１ｍｍのキュベットを使用した。
３回の反復によって該当の領域を分析して平均を得て、ＰＢＳに対して測定された値を差し引きして計算したが、このときのＣＤスペクトルの単位は、残余楕円率（ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）（ｄｅｇｒｅｅ ｃｍ２／ｄｍｏｌ）で表示した。
ＣＤ分光法（ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を利用して構造不均衡から起因して発生する左回転偏光（ｌｅｆｔ−ｈａｎｄｅｄ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）と右回転偏光（ｒｉｇｈｔ−ｈａｎｄｅｄ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）の吸収差異を測定することができるが、前記ＣＤ分光法では、遠紫外線スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）で２次蛋白構造を測定することができる。この波長における発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）は蛋白質結合であり、この結合が定常折り畳み状態、α−ヘリックス、β−ｓｈｅｅｔ、または、ランダムコイル構造に位置するとき、それぞれ独特な模様とサイズのＣＤスペクトルを示す。
【００７８】
２０８、２２０ｎｍで示すそれぞれ２つの負ピークは、α−ヘリックスの２次構造形態の蛋白質であり、２１４ｎｍで示されるピークは、β−ｓｈｅｅｔの２次構造形態の蛋白質として知られている。
フィブロインは、放射線照射によって２次構造に変形されるが、図２のように、放射線照射量が増加するほど、α−ヘリックスの２次構造は減少する。反面、β−ｓｈｅｅｔ、ランダムコイルは、α−ヘリックスの２次構造の減少によって相対的に増加することを確認することができる。
【００７９】
実験例３（ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）を利用する分子量の分析）
ガンマ線を照射したフィブロインの分子量をゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）−高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を利用して測定した。
ＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏ．２６９０，ＭＡ，ＵＳＡ）にＰＬアクア・ゲル−ＯＨカラム（３００×７．５ｍｍ，８μｍ；Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ，ＵＫ）を使用した。
０．１Ｍ硝酸ナトリウムを移動相にして１ｍＬ／ｍｉｎの流速で４０分間移動させた。ＧＰＣ用標準物質（Ｐｕｌｌｕｌａｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）は、昭和電工製品を実験に使用した。
図３は、互に異なる照射線量下で、照射効果の表現としてシルクフィブロインの分子量の変形を示したものである。
図３を参照すると、照射されていないシルクフィブロインの分子量は、５ｋＤａ以下を示し、５ｋＧｙと１０ｋＧｙで照射されたシルクフィブロインの分子量がそれぞれ３２０と、５７６５ｋＤａを示している。このような結果は、線量が増加するほど、構造的変形によって分子間の再結合が増加されていることを確認することができる。
【００８０】
実験例４（ガンマ線が照射されて分子構造が変形されたシルクフィブロインのラジカル消去能の測定）
前記実施例１〜実施例６で製造したフィブロイン試料の電子供与能の測定は、Ｂｌｏｉｓ法に準じてシルクフィブロインのＤＰＰＨ（２.２−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌ−ｈｙｄｒａｚｉｌ）に対する水素供与効果によって測定した。
一定濃度の各試料２ｍｌに、９９％エタノールで溶解させた２×１０４Ｍ ＤＰＰＨ溶液を１ｍｌ加えて、ボルテックス・ミキシング（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｉｎｇ）して３７℃で３０分間反応させた。前記反応液を５１７ｎｍで吸光度を測定し、電子供与効果は試料添加の前・後の吸光度差異を百分率（％）で示した。
５１７ｎｍで吸収される特徴を有する安定された遊離基であるＤＰＰＨは、シルクフィブロインのラジカル消去能力の研究のために使用されたが、放射線が照射されたシルクフィブロインの抗酸化効果を図４に示した。
図４を参照すると、放射線が照射されたシルクフィブロインのＤＰＰＨラジカル消去能力は、同じ濃度で０ｋＧｙのものより高く、線量が増加するほど抗酸化能力が増加することを確認することができた。
【００８１】
実験例５（ガンマ線が照射されて分子構造が変形されたフィブロインのチロシナーゼ阻害効果の測定）
ガンマ線照射によるシルクフィブロインの美白活性能力を確認するために、前記実施例１〜実施例６によって製造されたフィブロインのチロシナーゼ阻害効果を測定した。
０．１７５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）０．５ｍｌに１０ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）を溶解させた基質液０．２ｍｌと、試料溶液０．１ｍｌを混合させた溶液にマッシュルーム・チロシナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ ＵＳＡ）０．２ｍｌを添加して２５℃で１５分間反応させた後、生成されたＤＯＰＡクロムを吸光度４７５ｎｍで測定した。チロシナーゼ阻害活性は、試料溶液添加区と無添加区とにおける吸光度減少率を百分率（％）で示した。
図５は、本発明によるフィブロインのチロシナーゼ阻害効果を示すものである。
図５を参照すると、ガンマ線が照射されたシルクフィブロインは、全てが非照射のものよりチロシナーゼ阻害効果が高く、照射線量が増加するほどチロシナーゼ阻害効果も増加することを確認することができる。
【００８２】
実験例６（ガンマ線が照射されて分子構造が変形されたシルクフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性の増加効果の測定）
ガンマ線照射によるシルクフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性の増加能を確認するために、前記実施例１〜実施例６によって製造されたフィブロインの癌細胞に対する細胞毒性の増大効果を測定した。
本実験に使用された癌細胞は、Ｂ１６ＢＬ６（皮膚癌）、ＡＧＳ（胃癌）、ＨＴ−２９（結腸癌）、及びＲＡＷ２６４．７（マクロファージ細胞）であり、韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）から分譲を受けこれを培養しながら本実験に供した。
【００８３】
前記Ｂ１６ＢＬ６とＲＡＷ２６４．７細胞株は、１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が含有されたＥＭＥＭ及びＤＭＥＭ培地を使用し、ＡＧＳとＨＴ−２９は１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ウシ胎仔血清が含有されたＲＰＭＩ１６４０培地を使用して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。
シルクフィブロインによる癌細胞と正常細胞の比較評価は、ＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，ｓｉｇｍａ］ａｓｓａｙによって実験した。
それぞれの癌細胞と正常細胞を、９６ウェルプレートにウェル当り３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれ分株した。それぞれのシルクフィブロインの試料は、濃度５ｍｇ／ｍｌで９６ウェルプレートに加えた。
前記プレートを３７℃下で２４時間培養した後、５ｍｇ／ｍｌ濃度のＭＴＴ試薬をそれぞれのウェルに３０μｌずつ加えた後、３０℃下で２時間培養した後、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。その後、１００μｌのＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を添加し、３７℃下で５分間反応させた後、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００８４】
放射線が照射されたシルクフィブロインの癌細胞に対する成長抑制効果は、図６〜図８のグラフ図に示されている。本実験で使用した癌細胞は、前記のように、ＨＴ−２９（結腸癌）、Ｂ１６ＢＬ６（皮膚癌）及びＡＧＳ（胃癌）である。
前記癌細胞に対する抗癌効果を測定するために、ＭＴＴ還元検定法（ＭＴＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を利用して放射線を照射していない対照区と比較して癌細胞の成長抑制効果を確認した。
図示のように、放射線の照射線量が増加するほど、ＨＴ−２９の細胞毒性は、２００ｋＧｙで３９％まで増加し、Ｂ１６ＢＬ６の細胞毒性は、２００ｋＧｙで４８％まで増加した。最後にＡＧＳの細胞毒性は２００ｋＧｙで８７％まで増加した。
【００８５】
放射線が照射されたシルクフィブロインと非照射区のシルクフィブロインの細胞毒性を比較してみると、全ての線量で非照射区のシルクフィブロインより細胞毒性が増加されていることを確認することができる。このような結果から放射線の照射によって癌細胞に対する抵抗性が増加することを確認することができた。
実験例６の癌細胞に対する細胞毒性の増加は、放射線照射線量の増加によって増加することが確認されたが、ここで正常細胞に対する細胞毒性を確認する必要があるので、前記ＲＡＷ２６４．７細胞株を利用して正常細胞に対する毒性実験を実施した。
【００８６】
Ａｎｎａ Ｃｈｉａｒｉｎｉ等は、シルクフィブロインがヒト細胞の成長に役立つものと報告している（Ａｎｎａ Ｃｈｉａｒｉｎｉ，Ｐａｏｌａ Ｐｅｔｒｉｎｉ，Ｓａｂｒｉｎａ Ｂｏｚｚｉｎｉ，Ｉｌａｒｉａ Ｄａｌ Ｐｒａ ａｎｄ Ｕｂａｌｄｏ Ａｒｍａｔｏ（２００３）Ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ／ｐｏｌｙ（ｃａｒｂｏｎａｔｅ）−ｕｒｅｔｈａｎｅ ａｓ ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｐａｇｅｓ ７８９−７９９）。前記の先行研究に基づいて放射線が照射されたシルクフィブロインの正常細胞に対する細胞毒性の効果を実験した結果を図９に示した。
【００８７】
この実験の結果、放射線の照射によるシルクフィブロインの正常細胞に対する細胞毒性効果の減少を確認した。
図９を参照すると、照射線量が増加することによって５ｋＧｙでは細胞毒性が２９％まで減少し、１０ｋＧｙでは細胞毒性が２２％まで減少し、５０ｋＧｙでの細胞毒性は７％まで減少した。しかし、１００ｋＧｙ照射線量以上からは有意的な増加や減少の差異が無いことを確認することができた。
【００８８】
本実験を通じて放射線が照射されたシルクフィブロインは、非照射区と対比してみると、正常細胞に対する毒性は非常に少ないことを確認することができる。
また、図６〜８の実験結果と比較してみると、放射線が照射されたシルクフィブロインの癌細胞に対する毒性は増加するが、正常細胞に対する毒性は減少することを確認することができた。
前記の結果から放射線が照射されたシルクフィブロインは、非照射区と比較すると、より高い抗酸化効果、美白効果及び癌細胞に対する細胞毒性を有していることを確認することができる。
【００８９】
以上、本発明の好適な実施例を参照して説明したが、当該技術分野の当業者であれば、特許請求範囲に記載された本発明の思想及び領域を外さない範囲内で本発明を多様に修正或は変更させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によるガンマ線照射によって分子構造が変形された高分子量のシルクフィブロインは、ガンマ線の非照射区に比べてラジカル消去能の増加、チロシナーゼ抑制効果、及び／又は癌細胞に対する細胞毒性の増加などのような優れた生物学的特性と美白効果などを有しているため、機能性食品、化粧品、及び医薬品の産業分野において有用な素材として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の紫外線吸収スペクトルを確認した結果図である。
【図２】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の遠紫外線ＣＤスペクトルから２次構造を確認した結果図である。
【図３】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の分子量をＧＰＣを利用して測定した結果図である。
【図４】ガンマ線照射によるフィブロインのβグルカンにおけるラジカル消去能の増加を確認した結果図である。
【図５】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質のチロシナーゼ阻害効果の増加を確認した結果図である。
【図６】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の癌細胞に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図であって、結腸癌細胞のＨＴ−２９細胞株に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図である。
【図７】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の癌細胞に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図であって、メラノーマ細胞のＢ１６ＢＬ６細胞株に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図である。
【図８】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の癌細胞に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図であって、胃癌細胞のＡＧＳ細胞株に対する細胞毒性効果の増加を確認した結果図である。
【図９】ガンマ線照射によるフィブロイン蛋白質の正常細胞に対する細胞毒性効果の減少を確認した結果図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線の照射によって分子構造が変形されて分子量が増加し、
抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上が増加したフィブロイン。
【請求項２】
前記放射線が、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択された１種以上である請求項１に記載のフィブロイン。
【請求項３】
前記放射線の吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙである請求項１又は２に記載のフィブロイン。
【請求項４】
前記分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少である請求項１〜３のいずれか１つに記載のフィブロイン。
【請求項５】
前記分子構造の変形が、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加である請求項請求項１〜４のいずれか１つに記載のフィブロイン。
【請求項６】
前記フィブロインの分子量が、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａである請求項１〜５のいずれか１つに記載のフィブロイン。
【請求項７】
フィブロインの放射線吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙになるように放射線を照射する工程を含む、分子構造が変形されて分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する毒性からなる群から選択される１種以上が増加したフィブロインの製造方法。
【請求項８】
前記放射線が照射されるフィブロインは、まゆ（繭）から分離されるか、または、合成される請求項７に記載のフィブロインの製造方法。
【請求項９】
前記の重合または分離される工程から得られたフィブロインを凍結乾燥する工程をさらに含む請求項７又は８に記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１０】
前記放射線が、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択された１種以上である請求項７〜９のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１１】
前記分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少である請求項７〜１０のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１２】
前記分子構造の変形が、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加である請求項７〜１１のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１３】
前記フィブロインの分子量が、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａである請求項７〜１２のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の食品の素材として使用する方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び抗細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の化粧品の素材として使用する方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の医薬品の素材として使用する方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを有効成分として含有する、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、食品、化粧品又は医薬品である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１】
放射線の照射によって分子構造が変形されて分子量が増加し、
抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上が増加したフィブロイン。
【請求項２】
前記放射線が、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択された１種以上である請求項１に記載のフィブロイン。
【請求項３】
前記放射線の吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙである請求項１又は２に記載のフィブロイン。
【請求項４】
前記分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少である請求項１〜３のいずれか１つに記載のフィブロイン。
【請求項５】
前記分子構造の変形が、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加である請求項請求項１〜４のいずれか１つに記載のフィブロイン。
【請求項６】
前記フィブロインの分子量が、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａである請求項１〜５のいずれか１つに記載のフィブロイン。
【請求項７】
フィブロインの放射線吸収線量が、１〜１，０００ｋＧｙになるように放射線を照射する工程を含む、分子構造が変形されて分子量が増加し、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する毒性からなる群から選択される１種以上が増加したフィブロインの製造方法。
【請求項８】
前記放射線が照射されるフィブロインは、まゆ（繭）から分離されるか、または、合成される請求項７に記載のフィブロインの製造方法。
【請求項９】
前記の重合または分離される工程から得られたフィブロインを凍結乾燥する工程をさらに含む請求項７又は８に記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１０】
前記放射線が、ガンマ線、電子線及びＸ線からなる群から選択された１種以上である請求項７〜９のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１１】
前記分子構造の変形が、α−ヘリックスの２次構造の減少である請求項７〜１０のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１２】
前記分子構造の変形が、β−ｓｈｅｅｔ、β−ｔｕｒｎ及びランダムコイルからなる群から選択される１種以上の２次構造の増加である請求項７〜１１のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１３】
前記フィブロインの分子量が、１０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａである請求項７〜１２のいずれか１つに記載のフィブロインの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の食品の素材として使用する方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び抗細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の化粧品の素材として使用する方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の医薬品の素材として使用する方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のフィブロインを有効成分として含有する、抗酸化能、チロシナーゼ阻害能及び癌細胞に対する細胞毒性からなる群から選択された１種以上の機能を向上させる用途の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、食品、化粧品又は医薬品である請求項１７に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２８０５６５（Ｐ２００９−２８０５６５Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１３０４１（Ｐ２００８−３１３０４１）
【出願日】平成２０年１２月９日（２００８．１２．９）
【出願人】（５０７２７２６０３）韓国原子力研究院 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月９日（２００８．１２．９）
【出願人】（５０７２７２６０３）韓国原子力研究院 (6)
【Ｆターム（参考）】
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