新規β−セリネン誘導体および当該誘導体を含むアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤
【課題】本発明は、新規なβ−セリネン誘導体、好ましくはアセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有する新規なβ−セリネン誘導体、及び当該誘導体の製造方法、並びに当該誘導体を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤を提供することを目的とする
【解決手段】β−セリネンをアスペルギルス属に属する微生物またはその生体内酵素で処理することにより微生物変換して、得られたβ−セリネン誘導体を採取することによって、新規なβ−セリネン誘導体を得ることができる。
【解決手段】β−セリネンをアスペルギルス属に属する微生物またはその生体内酵素で処理することにより微生物変換して、得られたβ−セリネン誘導体を採取することによって、新規なβ−セリネン誘導体を得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なβ−セリネン誘導体、当該β−セリネン誘導体を有効成分とするアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤、およびβ−セリネン誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−セリネンは、オイデスマン骨格を有する、セスキテルペン類に属するテルペノイド化合物の一種であり、セロリー油の成分である（A.J.MacLeod, G.MacLeod and G.Subramanian, (1988), Phytochemistry, 27, 373-375）。β−セリネンは整腸作用や強壮作用を有する。また、β−セリネンの自動酸化生成物は、抗マラリア活性を呈することが知られている（H.Weenen, M.H.H.Nkunya and L.B.Mwasumbi, (1990), Planta Medica, 56, 371-373）。
【０００３】
また、テルペノイド化合物は微生物変換によりテルペノイド誘導体とすることができることも知られている。微生物変換とは、目的の化合物を得るために、生物触媒として生体中の酵素類を使用した生物学的な合成プロセスであり、穏和な条件下で位置特異的に化合物を産生することを特徴とする。ゆえに微生物変換は、生物活性化合物の選択的製造のための有利な方法である。
【０００４】
例えば、真菌の一種であるアスペルギルス ニガーは、（＋）−フェンコン（M.Miyazawa, K.Yamamoto, Y.Noma and H.Kameoka, (1990), Chemistry Express, 5, 237-430）、１，４−シネオール（M.Miyazawa, Y.Noma, K.Yamamoto and H.Kameoka, (1992), Chemistry Express, 7, 305-308）、（−）−α−ビサボロール（M.Miyazawa, Y.Funatsu and H Kameoka, (1992), Chemistry Express, 7, 573-576）、（−）−ｃｉｓ−ローズオキサイド（M.Miyazawa, K.Yokote and H.Kameoka, (1995), Phytochemistry, 39, 85-89）、（＋）−ｔｒａｎｓ−ローズオキサイド（M.Miyazawa, K.Yokote and H.Kameoka, (1995), Phytochemistry, 39, 85-89）等の種々の天然テルペノイド類を立体選択的に酸化し、テルペノイド誘導体に変換することが知られている。
【０００５】
アガーウッド（和名：沈香）は、古くから日本の伝統的な香料として、またアジア地域における漢方薬として広く用いられてきた。沈香由来のジンコウ−エレモールおよびアガロスピロールは、中枢神経系に対して鎮静作用や鎮痛作用を有することが知られている（H.Okukawa, K.Kawanishi and A.Kato, (2000), Aroma research, 1, 34-38、H.Okukawa, R.Ueda, K.Matsumoto, K.Kawanishi and A.Kato, (2000), Phytomedicine, 7, 417-422）。
【０００６】
中でもヴェトナムやカンボジアの山地でのみ産出する伽楠香（和名：伽羅）は、最高級の沈香とされており、神秘的かつ東洋的な香りが高く評価されている（E.Yamagata and K.Yoneda, (1987), Shoyakugaku Zassi, 41, 142-146、M.Ishihara, T.Tsuneya and K.Uneyama, (1993), Phytochemistry, 33, 1147-1155）。
【０００７】
一般に伽羅は、多種の酸化されたセスキテルペン類（T.Nagashima, I.Kawasaki,T.Yoshida, T.Nakanishi, K.Yoneda and I.Miura, (1983), 9th International Congress of Essential Oil, Singapore, 3, 12-16）やクロモン誘導体（K.Hashimoto, S.Nakahara, T.Inoue, Y.Sumida, M.Takahashi and Y.Masada, (1985), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33, 5088-5091、T.Nakanishi, A.Inada, M.Nishi, E.Yamagata and K.Yoneda, (1986), Journal of Natural Products, 49, 1106-1108、E.Yamagata and K.Yoneda, (1986), Shoyakugaku Zassi, 40, 271-274）からなる多量の樹脂を含有している。
【０００８】
沈香は、Aquilaria agallocha Roxb.（ジンコウ）、A. sinensis (Lour.) Gilg.（土沈香）、A. malaccensis Lam.（マラッカ沈香）のような多種類のAquilaria（アキラリア）属（ジンチョウゲ科）の古木が菌類に感染して精油成分が変質して、生じると考えられている（K.Yoneda, E.Yamagata and M.Mizuno, (1986), Shoyakugaku Zassi, 40, 259-265、R.Nakashima, S.Nishi, T.Ishida and J.Yamamoto, (1990), Yukagaku, 39, 191-195）。例えば、沈香が生ずる要因の一つとして、アスペルギルス属に属する真菌の一種であるAspergillus wentii（アスペルギルス ウェンティー）菌による精油成分の変性が考えられている。
【０００９】
以前に本発明者らは、植物病原性菌であるGlomerella cingulata（グロメレーラ シングラータ）菌によるβ−セリネンの生物変換で、（１Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１１ＲＳ）−１，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネンの１１位炭素のエピマー混合物の２種のアイソマーがほぼ等量の比率で生成することを見出した（M.Miyazawa, Y.Honjo and H.Kameoka, (1997), Phytochemistry, 44, 433-436）。しかしながら、アスペルギルス属に属する微生物によるβ−セリネンの生物変換は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規なβ−セリネン誘導体、特にアセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有するβ−セリネン誘導体を提供することを目的とする。また、本発明は、当該β−セリネン誘導体を有効成分とするアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、β−セリネン誘導体の位置特異的かつ立体選択的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、新規な生理活性物質の創製を目的として、種々の天然物化合物を様々な微生物により微生物変換し、その代謝産物を探索してきた。そして、沈香を産生すると考えられている真菌類によるセスキテルペノイド類の微生物変換について検討したところ、β−セリネンを基質としたアスペルギルス属に属する微生物の培養物中に、強いアセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有する物質が産生されていることを見出した。このβ−セリネンを基質としたアスペルギルス属に属する微生物の培養物中に産生されるアセチルコリンエステラーゼ活性阻害物質を詳細に検討した結果、β−セリネン骨格を有する化合物であることを確認すると共に、その単離、精製に成功した。
【００１２】
したがって、第１の態様において本発明は、式
【化１】
〔一般名：
化合物〔ＩＩ〕：（２Ｓ，６Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ）−２，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネン〕
により表されるβ−セリネン誘導体を提供する。
【００１３】
また、別の態様において、本発明は有効成分として上記β−セリネン誘導体を含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤を提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は式
【化２】
で表されるβ−セリネン誘導体の製造方法であって、式
【化３】
で表されるβ−セリネンを基質として、当該β−セリネン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物と接触、処理することを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
おどろくべきことに、本発明で得られるβ−セリネン誘導体は、アセチルコリンエステラーゼに対して顕著な活性抑制作用を示す。したがって、本発明のβ−セリネン誘導体はアルツハイマー病治療薬として有用である。
【００１６】
通常、アセチルコリンは、神経シナプス間隙において、酵素アセチルコリンエステラーゼの作用でコリンと酢酸に分解することで、作用した後すぐに除去される。一方、脳内のアセチルコリンの不足はアルツハイマー病と関連があるとされ、アセチルコリンエステラーゼの阻害剤はアルツハイマー病の治療薬として用いられる。
【００１７】
用語の定義
本明細書中において使用される用語は、指示がない限り、当業者によって通常理解される通りの意味で用いられている。
【００１８】
β−セリネン誘導体の製造方法
本発明の目的物質であるβ−セリネン誘導体を製造するには、基質β−セリネンを真菌の一種であるアスペルギルス属に属するβ−セリネン誘導体産生菌またはその生体内酵素で処理し、産生された当該β−セリネン誘導体を採取すればよい。ここで言う「処理」とは、β−セリネンと菌体との接触、β−セリネンを菌体の培養培地に含有させて行う培養、発酵等の常套の微生物変換手段を含む意味で用いられており、「採取」とは、常套の分離、抽出および精製手段を含む工程を意味している。
【００１９】
β−セリネン誘導体の製造に使用されるアスペルギルス属微生物の一例としては、アスペルギルス ウェンティー（Aspergillus wentii）があり、これは独立行政法人製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ８８６４として寄託されている。その他のアスペルギルス属微生物の例としては、アスペルギルス ルーバー、アスペルギルス ニガーなどを挙げることができる。
【００２０】
生体内酵素とは、菌が当該反応工程に利用している酵素として同定されるあらゆる酵素を意味し、適当な条件下、例えば菌体内の条件下におくことにより、菌そのものを利用している場合と同様に反応を進行させることが可能である。
【００２１】
β−セリネン誘導体産生菌の培養に用いられる培地としては、使用する菌の育成あるいは所望の微生物変換に適した常套の培地を適宜選択することができ、当該菌が利用し得る栄養源を含むものであれば液状でも固状でもよいが、大量のβ−セリネン誘導体を得るためには液体培地を用いるのが好ましい。
【００２２】
この培地には、当該菌を培養するために必要な物質、例えば当該菌が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源および無機物等が適宜配合される。炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖、デンプンなどが、窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキストラクト、硝酸ナトリウムなどが用いられる。また培地にはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの塩類が含まれ得る。
【００２３】
培地のｐＨおよび温度条件は使用する菌の育成に好適な範囲であればどのような条件でも使用することができ、このような条件は公知であるか、当業者であれば常套の手段により適宜設定することができる。例えば菌がアスペルギルス ウェンティーである場合、初発ｐＨは約６〜約８、好ましくは７．２の条件が、また、培養温度は約１５〜約３５℃、好ましくは２５〜３０℃の範囲が適当である。
【００２４】
β−セリネン誘導体生産菌は静止した物体に付着して増殖する性質があるので静置培養が望ましく、また、当該菌が付着するような物体、例えばアルミ箔を液体培地中に入れておくと増殖が促進される。培養期間は一定しないが、生産されるべきβ−セリネン誘導体の濃度が最大となるまで培養するのが望ましい。これに要する日数は、液体培地を用いる静置培養の場合、通常１０日間前後が適当である。
【００２５】
得られた培養液は遠心分離または濾過などの手段により、菌体と培養液とに分離する。この両者は共にアセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を示すが、β−セリネン誘導体は培養液により多く含まれている。集められた培養液からβ−セリネン誘導体を抽出するには、塩化ナトリウム等の飽和溶液とした後、水と混和する有機溶媒、例えばメタノール、エタノールなどの低級アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどを使用すればよい。また、水と混和しない有機溶媒、例えばクロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチルなどを使用してもよい。
【００２６】
このようにして得られた抽出液から減圧下に溶媒を留去すれば、β−セリネン誘導体を含む粗抽出物を得ることができる。
【００２７】
この粗抽出物からβ−セリネン誘導体を単離、精製するには、通常の脂溶性低分子物質の単離、精製手段を適用することができる。すなわち、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア製、登録商標）などを用いるゲル濾過型クロマトグラフィー、シリカゲルなどの吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相系担体を用いる高速液体クロマトグラフィーなどを単独または組み合わせて実施すればよい。
【００２８】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合は、一般に極性有機溶媒と非極性有機溶媒との組み合わせ、例えばメタノールとクロロホルムまたは塩化メチレンなどの混合溶媒により溶出される。
【００２９】
シリカゲルを用いる吸着クロマトグラフィーを使用する場合は、ヘキサンとクロロホルム、酢酸エチルまたは塩化メチレンなどの混合溶媒を溶出溶媒とするのが適している。
【００３０】
シリカゲルを担体とする高速液体クロマトグラフィーの場合には、塩化メチレンとベンゼンまたはメタノールの混合溶媒あるいは塩化メチレン単独を溶出溶媒として用いる。このような精製手段を適用することにより、前記に示されるβ−セリネン誘導体が単離される。
【００３１】
アセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤
本発明で得られるβ−セリネン誘導体は、アセチルコリンエステラーゼに対して顕著な活性抑制作用を示す。当該活性は適当なｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏ試験、例えば実施例２に記載の試験により容易に確認することができる。本発明のβ−セリネン誘導体は、好ましくは化合物１７μＬをアセチルコリンエステラーゼ（シグマ製）溶液（０．０４ユニット／ｍＬ）に加え、２５℃で５分間インキュベートし、さらに続いて７５ｍＬのＡＴＣを１３μＬ加えて２５℃で２０分間インキュベートしたとき、アセチルコリンエステラーゼの活性を１０％以上、好ましくは２０％以上、とりわけ好ましくは３０％以上阻害することができる。
【００３２】
したがって、本発明のβ−セリネン誘導体はアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤として使用することができる。好ましくは、本発明のβ−セリネン誘導体は、常套の製剤化手段により、賦形剤、ｐＨ調整剤、香料、界面活性剤、キレート剤、増粘剤、防腐剤等の常套の助剤を適宜使用して、液体、乳液、粉末、顆粒、錠剤、ローション、軟膏、注射溶液、クリームなど、任意の剤型に調製して用いることができる。例えば化粧料として本発明のβ−セリネン誘導体を製剤するとき、ローション、乳液、クリーム等の剤型が好ましい。
【００３３】
また、本発明のβ−セリネン誘導体を含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤は、動物に投与することを意図するとき、任意の形態で、例えば経口、経腸、非経腸、局所または経皮投与することができ、食品に配合することを意図するとき、常套の混合等の手段により食品中に配合することができる。
【実施例１】
【００３４】
実験手法
β−セリネンはセロリー油（三栄源エフ・エフ・アイ製）の真空蒸留およびシリカゲルクロマトグラフィーにより調製した。
簿層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０ＧＦ２５４を塗布したＴＬＣプレート（メルク製：層厚０．２５ｍｍ）を用いた。シリカゲルカラムクロマトの展開溶媒は、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）を用いた。
【００３５】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）は水素炎イオン化型検出器、キャピラリーカラム（ＤＢ−５、島津製作所製：長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）、および２０：１のスプリット注入ユニットを備えたＨＰ ５８９０Ａガスクロマトグラフ（ヒューレット・パッカード製）を使用した。移動相はヘリウムガスを０．６ｃｍ３／分の流量で用いた。オーブン温度は４℃／分の昇温速度で９０℃〜２３０℃にプログラムされた。注入口温度は２７０℃、検出器温度は２８０℃に設定した。ピーク面積はＨＰ ３３９６ ＳｅｒｉｅｓII検出器（ヒューレット・パッカード製）により計算した。
【００３６】
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）は、スプリット注入ユニット、キャピラリーカラム（ＨＰ−５ＭＳ、ヒューレット・パッカード製：長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＨＰ ５８９０Ａ、ヒューレット・パッカード製）を質量分析計（ＨＰ ５９７２Ａ、ヒューレット・パッカード製）に直結した。昇温プログラムはＧＣと同一である。移動相はヘリウムガスを０．６ｃｍ３／分の流量で用いた。イオン源部温度は２８０℃、電子エネルギーは７０電子ボルト（ｅＶ）であった。イオン化法は電子衝撃法（ＥＩ）を使用した。
【００３７】
高分解能質量分析（ＨＲ−ＭＳ）は、二重収束タンデム質量分析計（ＪＥＯＬ−ＨＸ１００、日本電子製）を用い、データ処理には日本電子製ＪＡＭ−ＤＡ５０００を使用した。
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）はパーキン・エルマー製１７６０Ｘ型分光器により得た。溶媒にはクロロホルムを使用した。
核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）は、日本電子製ＦＸ−５００（５００ＭＨｚ（１Ｈ）、１２５．６５ＭＨｚ（１３Ｃ）を用い、ＴＭＳ（１Ｈ）またはクロロホルム（１３Ｃ）を内部標準とし、ＣＤＣｌ３で測定した。
【００３８】
アスペルギルス ウェンティーの前培養
４℃で保存されたアスペルギルス ウェンティー（ＮＢＲＣ８８６４）の胞子を、滅菌した培養培地（ショ糖１．５％、グルコース０．５％、ポリペプトン０．０５％、硫酸マグネシウム（七水和物）０．０５％、塩化カリウム０．０５％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸第一鉄（七水和物）０．００１％、および蒸留水、ｐＨ７．２）を入れた振盪フラスコ中に植え付け、２７℃で３日間培養した。
【００３９】
経時変化
前培養したアスペルギルス ウェンティーの菌糸体を培養培地（５０ｍＬのペトリ皿中２０ｍＬ）に移植し、２日間（菌糸体が培養培地の表面積の６０〜８０％を占めるまで）同じ条件下で培養した。アスペルギルス ウェンティーが成長した後、５ｍＬのＤＭＳＯに溶かしたβ−セリネン〔Ｉ〕３５０ｍｇを培地に加えて２７℃で１４日間静置培養を続けた。β−セリネンを添加しなかったアスペルギルス ウェンティー培養群（陽性対照）および培地にβ−セリネンのみを加えた群（陰性対照）をコントロールとした。
【００４０】
培養液は、種々の間隔で数回酢酸エチルにより抽出した。粗抽出物をＴＬＣ、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳで分析した。化合物〔ＩＩ〕は、β−セリネンを全く添加しなかったアスペルギルス ウェンティー培養培地のＴＬＣ、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳ分析では検出されなかった。また、化合物〔ＩＩ〕以外の代謝産物はＴＬＣおよびＧＣ分析では検出されなかった。基質および代謝産物の経時変化を図１に示す。〔Ｉ〕と化合物〔ＩＩ〕間の比率は、ＧＣとＧＣ／ＭＳのピーク面積に基づいて決定した。１４日後にβ−セリネンの約２０％が化合物〔ＩＩ〕に代謝された（図１）。
図１中、■：β−セリネン、△：化合物〔ＩＩ〕である。
【００４１】
β−セリネンの１４日間の微生物変換
実施例１にて前培養したアスペルギルス ウェンティーを実施例１と同様の培地９００ｍＬに移植し、２７℃で曝気条件下にて２日間攪拌培養した。アスペルギルス ウェンティーが成長した後、β−セリネン３５０ｍｇを培地に添加し、１４日間培養を続けた。
【００４２】
代謝産物の単離
上記のように、β−セリネン〔Ｉ〕３５０ｍｇを培地に加えて２７℃で１４日間静置培養を続けた後、濾過により培養液と菌糸体を分離した。培養液を塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。さらに菌糸体を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を混ぜ、硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下に溶媒を留去し、粗抽出物４１１ｍｇを得た。抽出物をヘキサン−酢酸エチル混液とシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供した。未反応のβ−セリネン２１３ｍｇが回収された。化合物〔ＩＩ〕５１ｍｇが単離された。
【００４３】
化合物〔ＩＩ〕
化合物〔ＩＩ〕、（２Ｓ，６Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ）−２，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネン構造は以下のＭＳ、ＩＲ、およびＮＭＲデータから決定した。
化合物〔ＩＩ〕([α]D23.1 +23.7°(c=1.00,CHCl3))は、１１位炭素のシングルアイソマーとして得られた。〔ＩＩ〕のＨＲ−ＥＩＭＳ（高分解能電子衝撃型四重極質量分析法）では、ｍ／ｚ値２５４．１８９５、分子式Ｃ１５Ｈ２６Ｏ３であった。
化合物〔ＩＩ〕のＩＲスペクトルでは、水酸基（３３５５ｃｍ−１）の存在が示された。
１Ｈ−ＮＭＲではイソプロペニル基のオレフィン性プロトンのシグナルは観察されなかった。１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲでは、２級アルコールの存在が示された（δＨ３．８７(１Ｈ,dddd,Ｊ＝４．８，４．８，１１．４，１１．５Ｈｚ)；δＣ６７．９（ＣＨ））および１１，１３−ジオール（δＨ３．４１，３．４６（ｅａｃｈ １Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８ Ｈｚ）；δＣ６８．５（ＣＨ２），７４．７（Ｃ））。
化合物〔ＩＩ〕は、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ：heteronuclear multiple bond correlation）スペクトルの帰属において、（ｉ）Ｈ−１／Ｃ−２，Ｃ−８とＣ−１０、（ｉｉ）Ｈ−３／Ｃ−２，Ｃ−４とＣ−１４、（ｉｉｉ）Ｈ−１２／Ｃ−６，Ｃ−１１とＣ−１３、（ｉｖ）Ｈ−１４／Ｃ−３，Ｃ−４とＣ−９の間に相関シグナルが観察された。化合物〔ＩＩ〕の２位の炭素の配位は、Ｈ−２／Ｈ−１とＨ−１５間のＮＯＥｓスペクトルの解析よりＳ体であると確認された（図２）。これらのデータから、化合物〔ＩＩ〕の構造は新規化合物である（２Ｓ，６Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ）−２，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネンであると決定した。１１位の炭素の立体配置は維持されていた。
【００４４】
化合物〔ＩＩ〕：無色油状、[α]D23.1 +23.7(CHCl3; c=1.00)、HR-EIMS m/z:254.1895[M] +、分子式 C15H26O3 254.1882、EIMS m/z:254 [M]+ (2), 236 (24), 223 (37), 205 (86), 187 (base), 161 (75), 147 (63), 119 (61), 105 (78), 75 (63), 57 (25), 43 (55)、ＩＲ(ＫＢｒ法)νmaxcm-1:3355, 2937, 2845, 1455, 1041、１Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3), 4.82 (1H, d, J=1.8 Hz, H-14), 4.52 (1H, d, J=1.8 Hz, H-14), 3.87 (1H, dddd, J=4.8, 4.8, 11.4, 11.5 Hz, H-2), 3.46 (1H, d, J=10.8 Hz, H-13), 3.41 (1H, d, J=10.8 Hz, H-13), 2.66 (1H, ddd, J=1.8, 5.4, 12.0 Hz, H-3), 1.97 (1H, dd, J=11.5, 12.0 Hz, H-3), 1.82 (1H, ddd, J=1.8, 4.8, 12.6 Hz, H-1), 1.77 (1H, dd, J=2.9, 12.1 Hz, H-9), 1.66 (1H, m, H-7), 1.60 (1H, m, H-6), 1.58 (1H, m, H-8),1.56 (1H, m, H-5), 1.38 (1H, m, H-7), 1.28 (1H, m, H-8), 1.20 (1H, dd, J=11.4, 12.6 Hz, H-1), 1.15 (3H, s, H-12), 1.07 (1H, ddd, J=12.1 12.5, 12.6 Hz, H-5), 0.99 (3H, s, H-15)、１３Ｃ−ＮＭＲを表１に示す。
【００４５】
【表１】
【実施例２】
【００４６】
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性はEllmanらの分光光度法（G.L.Ellman, K.D.Courtney, V.Andres Jr., R.M.Featherstone, (1961), Biochem.Pharmacol., 7, 88-95）により測定した。１７μＬの化合物〔Ｉ〕または化合物〔ＩＩ〕（エチルアルコール溶液）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かした０．０１Ｍのイールマン試薬（ＤＴＮＢ：東京化成製）３３μＬ、アセチルコリンエステラーゼ（シグマ製）１６７μＬ（０．０４ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解）、および０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）８００μＬを試験管に加え、２５℃で５分間インキュベートした。その後、７５ｍＭのアセチルチオコリン アイオダイド（ＡＴＣ：東京化成製）１３μＬを加え、２５℃で２０分間インキュベートした。吸光光度計により４７５ｎｍの吸光度を測定した。化合物を含まない対照試験は、非酵素的加水分解のためにブランクにより補正された。各測定は少なくとも３回繰り返した。アセチルコリンエステラーゼ阻害活性は以下の式により決定した。
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性（％）＝［（Ａ−Ｂ）／（Ｃｐ−Ｃｎ］×１００
Ａ：試料（化合物〔Ｉ〕または化合物〔ＩＩ〕、ＤＴＮＢ、アセチルコリンエステラーゼ、０．１Ｍリン酸緩衝液、およびＡＴＣ）の吸光度
Ｂ：ブランク（化合物〔Ｉ〕、化合物〔ＩＩ〕または（(-)-プレゴン）、ＤＴＮＢ、および０．１Ｍリン酸緩衝液）の吸光度
Ｃｐ：陽性対照（エチルアルコール、ＤＴＮＢ、アセチルコリンエステラーゼ、および０．１Ｍリン酸緩衝液）の吸光度
Ｃｎ：陰性対照（エチルアルコール、ＤＴＮＢ、および０．１Ｍリン酸緩衝液）の吸 光度
結果を表２に示す。
【表２】
【００４７】
したがって、化合物〔ＩＩ〕は、(-)-プレゴンよりも顕著なアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】β−セリネン〔Ｉ〕をアスペルギルス ウェンティーによって微生物変換したときの、β−セリネン〔Ｉ〕および化合物〔ＩＩ〕それぞれの相対存在量についての経時変化を示す。
【図２】化合物〔ＩＩ〕の主要なＨＭＢＣおよびＮＯＥｓスペクトルを示す。
【符号の説明】
【００４９】
■ β−セリネン
△ 化合物〔ＩＩ〕
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なβ−セリネン誘導体、当該β−セリネン誘導体を有効成分とするアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤、およびβ−セリネン誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−セリネンは、オイデスマン骨格を有する、セスキテルペン類に属するテルペノイド化合物の一種であり、セロリー油の成分である（A.J.MacLeod, G.MacLeod and G.Subramanian, (1988), Phytochemistry, 27, 373-375）。β−セリネンは整腸作用や強壮作用を有する。また、β−セリネンの自動酸化生成物は、抗マラリア活性を呈することが知られている（H.Weenen, M.H.H.Nkunya and L.B.Mwasumbi, (1990), Planta Medica, 56, 371-373）。
【０００３】
また、テルペノイド化合物は微生物変換によりテルペノイド誘導体とすることができることも知られている。微生物変換とは、目的の化合物を得るために、生物触媒として生体中の酵素類を使用した生物学的な合成プロセスであり、穏和な条件下で位置特異的に化合物を産生することを特徴とする。ゆえに微生物変換は、生物活性化合物の選択的製造のための有利な方法である。
【０００４】
例えば、真菌の一種であるアスペルギルス ニガーは、（＋）−フェンコン（M.Miyazawa, K.Yamamoto, Y.Noma and H.Kameoka, (1990), Chemistry Express, 5, 237-430）、１，４−シネオール（M.Miyazawa, Y.Noma, K.Yamamoto and H.Kameoka, (1992), Chemistry Express, 7, 305-308）、（−）−α−ビサボロール（M.Miyazawa, Y.Funatsu and H Kameoka, (1992), Chemistry Express, 7, 573-576）、（−）−ｃｉｓ−ローズオキサイド（M.Miyazawa, K.Yokote and H.Kameoka, (1995), Phytochemistry, 39, 85-89）、（＋）−ｔｒａｎｓ−ローズオキサイド（M.Miyazawa, K.Yokote and H.Kameoka, (1995), Phytochemistry, 39, 85-89）等の種々の天然テルペノイド類を立体選択的に酸化し、テルペノイド誘導体に変換することが知られている。
【０００５】
アガーウッド（和名：沈香）は、古くから日本の伝統的な香料として、またアジア地域における漢方薬として広く用いられてきた。沈香由来のジンコウ−エレモールおよびアガロスピロールは、中枢神経系に対して鎮静作用や鎮痛作用を有することが知られている（H.Okukawa, K.Kawanishi and A.Kato, (2000), Aroma research, 1, 34-38、H.Okukawa, R.Ueda, K.Matsumoto, K.Kawanishi and A.Kato, (2000), Phytomedicine, 7, 417-422）。
【０００６】
中でもヴェトナムやカンボジアの山地でのみ産出する伽楠香（和名：伽羅）は、最高級の沈香とされており、神秘的かつ東洋的な香りが高く評価されている（E.Yamagata and K.Yoneda, (1987), Shoyakugaku Zassi, 41, 142-146、M.Ishihara, T.Tsuneya and K.Uneyama, (1993), Phytochemistry, 33, 1147-1155）。
【０００７】
一般に伽羅は、多種の酸化されたセスキテルペン類（T.Nagashima, I.Kawasaki,T.Yoshida, T.Nakanishi, K.Yoneda and I.Miura, (1983), 9th International Congress of Essential Oil, Singapore, 3, 12-16）やクロモン誘導体（K.Hashimoto, S.Nakahara, T.Inoue, Y.Sumida, M.Takahashi and Y.Masada, (1985), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33, 5088-5091、T.Nakanishi, A.Inada, M.Nishi, E.Yamagata and K.Yoneda, (1986), Journal of Natural Products, 49, 1106-1108、E.Yamagata and K.Yoneda, (1986), Shoyakugaku Zassi, 40, 271-274）からなる多量の樹脂を含有している。
【０００８】
沈香は、Aquilaria agallocha Roxb.（ジンコウ）、A. sinensis (Lour.) Gilg.（土沈香）、A. malaccensis Lam.（マラッカ沈香）のような多種類のAquilaria（アキラリア）属（ジンチョウゲ科）の古木が菌類に感染して精油成分が変質して、生じると考えられている（K.Yoneda, E.Yamagata and M.Mizuno, (1986), Shoyakugaku Zassi, 40, 259-265、R.Nakashima, S.Nishi, T.Ishida and J.Yamamoto, (1990), Yukagaku, 39, 191-195）。例えば、沈香が生ずる要因の一つとして、アスペルギルス属に属する真菌の一種であるAspergillus wentii（アスペルギルス ウェンティー）菌による精油成分の変性が考えられている。
【０００９】
以前に本発明者らは、植物病原性菌であるGlomerella cingulata（グロメレーラ シングラータ）菌によるβ−セリネンの生物変換で、（１Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１１ＲＳ）−１，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネンの１１位炭素のエピマー混合物の２種のアイソマーがほぼ等量の比率で生成することを見出した（M.Miyazawa, Y.Honjo and H.Kameoka, (1997), Phytochemistry, 44, 433-436）。しかしながら、アスペルギルス属に属する微生物によるβ−セリネンの生物変換は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規なβ−セリネン誘導体、特にアセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有するβ−セリネン誘導体を提供することを目的とする。また、本発明は、当該β−セリネン誘導体を有効成分とするアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、β−セリネン誘導体の位置特異的かつ立体選択的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、新規な生理活性物質の創製を目的として、種々の天然物化合物を様々な微生物により微生物変換し、その代謝産物を探索してきた。そして、沈香を産生すると考えられている真菌類によるセスキテルペノイド類の微生物変換について検討したところ、β−セリネンを基質としたアスペルギルス属に属する微生物の培養物中に、強いアセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有する物質が産生されていることを見出した。このβ−セリネンを基質としたアスペルギルス属に属する微生物の培養物中に産生されるアセチルコリンエステラーゼ活性阻害物質を詳細に検討した結果、β−セリネン骨格を有する化合物であることを確認すると共に、その単離、精製に成功した。
【００１２】
したがって、第１の態様において本発明は、式
【化１】
〔一般名：
化合物〔ＩＩ〕：（２Ｓ，６Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ）−２，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネン〕
により表されるβ−セリネン誘導体を提供する。
【００１３】
また、別の態様において、本発明は有効成分として上記β−セリネン誘導体を含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤を提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は式
【化２】
で表されるβ−セリネン誘導体の製造方法であって、式
【化３】
で表されるβ−セリネンを基質として、当該β−セリネン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物と接触、処理することを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
おどろくべきことに、本発明で得られるβ−セリネン誘導体は、アセチルコリンエステラーゼに対して顕著な活性抑制作用を示す。したがって、本発明のβ−セリネン誘導体はアルツハイマー病治療薬として有用である。
【００１６】
通常、アセチルコリンは、神経シナプス間隙において、酵素アセチルコリンエステラーゼの作用でコリンと酢酸に分解することで、作用した後すぐに除去される。一方、脳内のアセチルコリンの不足はアルツハイマー病と関連があるとされ、アセチルコリンエステラーゼの阻害剤はアルツハイマー病の治療薬として用いられる。
【００１７】
用語の定義
本明細書中において使用される用語は、指示がない限り、当業者によって通常理解される通りの意味で用いられている。
【００１８】
β−セリネン誘導体の製造方法
本発明の目的物質であるβ−セリネン誘導体を製造するには、基質β−セリネンを真菌の一種であるアスペルギルス属に属するβ−セリネン誘導体産生菌またはその生体内酵素で処理し、産生された当該β−セリネン誘導体を採取すればよい。ここで言う「処理」とは、β−セリネンと菌体との接触、β−セリネンを菌体の培養培地に含有させて行う培養、発酵等の常套の微生物変換手段を含む意味で用いられており、「採取」とは、常套の分離、抽出および精製手段を含む工程を意味している。
【００１９】
β−セリネン誘導体の製造に使用されるアスペルギルス属微生物の一例としては、アスペルギルス ウェンティー（Aspergillus wentii）があり、これは独立行政法人製品評価技術基盤機構にＮＢＲＣ８８６４として寄託されている。その他のアスペルギルス属微生物の例としては、アスペルギルス ルーバー、アスペルギルス ニガーなどを挙げることができる。
【００２０】
生体内酵素とは、菌が当該反応工程に利用している酵素として同定されるあらゆる酵素を意味し、適当な条件下、例えば菌体内の条件下におくことにより、菌そのものを利用している場合と同様に反応を進行させることが可能である。
【００２１】
β−セリネン誘導体産生菌の培養に用いられる培地としては、使用する菌の育成あるいは所望の微生物変換に適した常套の培地を適宜選択することができ、当該菌が利用し得る栄養源を含むものであれば液状でも固状でもよいが、大量のβ−セリネン誘導体を得るためには液体培地を用いるのが好ましい。
【００２２】
この培地には、当該菌を培養するために必要な物質、例えば当該菌が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源および無機物等が適宜配合される。炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖、デンプンなどが、窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキストラクト、硝酸ナトリウムなどが用いられる。また培地にはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの塩類が含まれ得る。
【００２３】
培地のｐＨおよび温度条件は使用する菌の育成に好適な範囲であればどのような条件でも使用することができ、このような条件は公知であるか、当業者であれば常套の手段により適宜設定することができる。例えば菌がアスペルギルス ウェンティーである場合、初発ｐＨは約６〜約８、好ましくは７．２の条件が、また、培養温度は約１５〜約３５℃、好ましくは２５〜３０℃の範囲が適当である。
【００２４】
β−セリネン誘導体生産菌は静止した物体に付着して増殖する性質があるので静置培養が望ましく、また、当該菌が付着するような物体、例えばアルミ箔を液体培地中に入れておくと増殖が促進される。培養期間は一定しないが、生産されるべきβ−セリネン誘導体の濃度が最大となるまで培養するのが望ましい。これに要する日数は、液体培地を用いる静置培養の場合、通常１０日間前後が適当である。
【００２５】
得られた培養液は遠心分離または濾過などの手段により、菌体と培養液とに分離する。この両者は共にアセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を示すが、β−セリネン誘導体は培養液により多く含まれている。集められた培養液からβ−セリネン誘導体を抽出するには、塩化ナトリウム等の飽和溶液とした後、水と混和する有機溶媒、例えばメタノール、エタノールなどの低級アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどを使用すればよい。また、水と混和しない有機溶媒、例えばクロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチルなどを使用してもよい。
【００２６】
このようにして得られた抽出液から減圧下に溶媒を留去すれば、β−セリネン誘導体を含む粗抽出物を得ることができる。
【００２７】
この粗抽出物からβ−セリネン誘導体を単離、精製するには、通常の脂溶性低分子物質の単離、精製手段を適用することができる。すなわち、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア製、登録商標）などを用いるゲル濾過型クロマトグラフィー、シリカゲルなどの吸着剤を用いる吸着クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相系担体を用いる高速液体クロマトグラフィーなどを単独または組み合わせて実施すればよい。
【００２８】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合は、一般に極性有機溶媒と非極性有機溶媒との組み合わせ、例えばメタノールとクロロホルムまたは塩化メチレンなどの混合溶媒により溶出される。
【００２９】
シリカゲルを用いる吸着クロマトグラフィーを使用する場合は、ヘキサンとクロロホルム、酢酸エチルまたは塩化メチレンなどの混合溶媒を溶出溶媒とするのが適している。
【００３０】
シリカゲルを担体とする高速液体クロマトグラフィーの場合には、塩化メチレンとベンゼンまたはメタノールの混合溶媒あるいは塩化メチレン単独を溶出溶媒として用いる。このような精製手段を適用することにより、前記に示されるβ−セリネン誘導体が単離される。
【００３１】
アセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤
本発明で得られるβ−セリネン誘導体は、アセチルコリンエステラーゼに対して顕著な活性抑制作用を示す。当該活性は適当なｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏ試験、例えば実施例２に記載の試験により容易に確認することができる。本発明のβ−セリネン誘導体は、好ましくは化合物１７μＬをアセチルコリンエステラーゼ（シグマ製）溶液（０．０４ユニット／ｍＬ）に加え、２５℃で５分間インキュベートし、さらに続いて７５ｍＬのＡＴＣを１３μＬ加えて２５℃で２０分間インキュベートしたとき、アセチルコリンエステラーゼの活性を１０％以上、好ましくは２０％以上、とりわけ好ましくは３０％以上阻害することができる。
【００３２】
したがって、本発明のβ−セリネン誘導体はアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤として使用することができる。好ましくは、本発明のβ−セリネン誘導体は、常套の製剤化手段により、賦形剤、ｐＨ調整剤、香料、界面活性剤、キレート剤、増粘剤、防腐剤等の常套の助剤を適宜使用して、液体、乳液、粉末、顆粒、錠剤、ローション、軟膏、注射溶液、クリームなど、任意の剤型に調製して用いることができる。例えば化粧料として本発明のβ−セリネン誘導体を製剤するとき、ローション、乳液、クリーム等の剤型が好ましい。
【００３３】
また、本発明のβ−セリネン誘導体を含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤は、動物に投与することを意図するとき、任意の形態で、例えば経口、経腸、非経腸、局所または経皮投与することができ、食品に配合することを意図するとき、常套の混合等の手段により食品中に配合することができる。
【実施例１】
【００３４】
実験手法
β−セリネンはセロリー油（三栄源エフ・エフ・アイ製）の真空蒸留およびシリカゲルクロマトグラフィーにより調製した。
簿層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０ＧＦ２５４を塗布したＴＬＣプレート（メルク製：層厚０．２５ｍｍ）を用いた。シリカゲルカラムクロマトの展開溶媒は、ヘキサン−酢酸エチル（１：１）を用いた。
【００３５】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）は水素炎イオン化型検出器、キャピラリーカラム（ＤＢ−５、島津製作所製：長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）、および２０：１のスプリット注入ユニットを備えたＨＰ ５８９０Ａガスクロマトグラフ（ヒューレット・パッカード製）を使用した。移動相はヘリウムガスを０．６ｃｍ３／分の流量で用いた。オーブン温度は４℃／分の昇温速度で９０℃〜２３０℃にプログラムされた。注入口温度は２７０℃、検出器温度は２８０℃に設定した。ピーク面積はＨＰ ３３９６ ＳｅｒｉｅｓII検出器（ヒューレット・パッカード製）により計算した。
【００３６】
ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）は、スプリット注入ユニット、キャピラリーカラム（ＨＰ−５ＭＳ、ヒューレット・パッカード製：長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＨＰ ５８９０Ａ、ヒューレット・パッカード製）を質量分析計（ＨＰ ５９７２Ａ、ヒューレット・パッカード製）に直結した。昇温プログラムはＧＣと同一である。移動相はヘリウムガスを０．６ｃｍ３／分の流量で用いた。イオン源部温度は２８０℃、電子エネルギーは７０電子ボルト（ｅＶ）であった。イオン化法は電子衝撃法（ＥＩ）を使用した。
【００３７】
高分解能質量分析（ＨＲ−ＭＳ）は、二重収束タンデム質量分析計（ＪＥＯＬ−ＨＸ１００、日本電子製）を用い、データ処理には日本電子製ＪＡＭ−ＤＡ５０００を使用した。
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）はパーキン・エルマー製１７６０Ｘ型分光器により得た。溶媒にはクロロホルムを使用した。
核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）は、日本電子製ＦＸ−５００（５００ＭＨｚ（１Ｈ）、１２５．６５ＭＨｚ（１３Ｃ）を用い、ＴＭＳ（１Ｈ）またはクロロホルム（１３Ｃ）を内部標準とし、ＣＤＣｌ３で測定した。
【００３８】
アスペルギルス ウェンティーの前培養
４℃で保存されたアスペルギルス ウェンティー（ＮＢＲＣ８８６４）の胞子を、滅菌した培養培地（ショ糖１．５％、グルコース０．５％、ポリペプトン０．０５％、硫酸マグネシウム（七水和物）０．０５％、塩化カリウム０．０５％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸第一鉄（七水和物）０．００１％、および蒸留水、ｐＨ７．２）を入れた振盪フラスコ中に植え付け、２７℃で３日間培養した。
【００３９】
経時変化
前培養したアスペルギルス ウェンティーの菌糸体を培養培地（５０ｍＬのペトリ皿中２０ｍＬ）に移植し、２日間（菌糸体が培養培地の表面積の６０〜８０％を占めるまで）同じ条件下で培養した。アスペルギルス ウェンティーが成長した後、５ｍＬのＤＭＳＯに溶かしたβ−セリネン〔Ｉ〕３５０ｍｇを培地に加えて２７℃で１４日間静置培養を続けた。β−セリネンを添加しなかったアスペルギルス ウェンティー培養群（陽性対照）および培地にβ−セリネンのみを加えた群（陰性対照）をコントロールとした。
【００４０】
培養液は、種々の間隔で数回酢酸エチルにより抽出した。粗抽出物をＴＬＣ、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳで分析した。化合物〔ＩＩ〕は、β−セリネンを全く添加しなかったアスペルギルス ウェンティー培養培地のＴＬＣ、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳ分析では検出されなかった。また、化合物〔ＩＩ〕以外の代謝産物はＴＬＣおよびＧＣ分析では検出されなかった。基質および代謝産物の経時変化を図１に示す。〔Ｉ〕と化合物〔ＩＩ〕間の比率は、ＧＣとＧＣ／ＭＳのピーク面積に基づいて決定した。１４日後にβ−セリネンの約２０％が化合物〔ＩＩ〕に代謝された（図１）。
図１中、■：β−セリネン、△：化合物〔ＩＩ〕である。
【００４１】
β−セリネンの１４日間の微生物変換
実施例１にて前培養したアスペルギルス ウェンティーを実施例１と同様の培地９００ｍＬに移植し、２７℃で曝気条件下にて２日間攪拌培養した。アスペルギルス ウェンティーが成長した後、β−セリネン３５０ｍｇを培地に添加し、１４日間培養を続けた。
【００４２】
代謝産物の単離
上記のように、β−セリネン〔Ｉ〕３５０ｍｇを培地に加えて２７℃で１４日間静置培養を続けた後、濾過により培養液と菌糸体を分離した。培養液を塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。さらに菌糸体を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を混ぜ、硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下に溶媒を留去し、粗抽出物４１１ｍｇを得た。抽出物をヘキサン−酢酸エチル混液とシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供した。未反応のβ−セリネン２１３ｍｇが回収された。化合物〔ＩＩ〕５１ｍｇが単離された。
【００４３】
化合物〔ＩＩ〕
化合物〔ＩＩ〕、（２Ｓ，６Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ）−２，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネン構造は以下のＭＳ、ＩＲ、およびＮＭＲデータから決定した。
化合物〔ＩＩ〕([α]D23.1 +23.7°(c=1.00,CHCl3))は、１１位炭素のシングルアイソマーとして得られた。〔ＩＩ〕のＨＲ−ＥＩＭＳ（高分解能電子衝撃型四重極質量分析法）では、ｍ／ｚ値２５４．１８９５、分子式Ｃ１５Ｈ２６Ｏ３であった。
化合物〔ＩＩ〕のＩＲスペクトルでは、水酸基（３３５５ｃｍ−１）の存在が示された。
１Ｈ−ＮＭＲではイソプロペニル基のオレフィン性プロトンのシグナルは観察されなかった。１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲでは、２級アルコールの存在が示された（δＨ３．８７(１Ｈ,dddd,Ｊ＝４．８，４．８，１１．４，１１．５Ｈｚ)；δＣ６７．９（ＣＨ））および１１，１３−ジオール（δＨ３．４１，３．４６（ｅａｃｈ １Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８ Ｈｚ）；δＣ６８．５（ＣＨ２），７４．７（Ｃ））。
化合物〔ＩＩ〕は、二次元ＮＭＲ（ＨＭＢＣ：heteronuclear multiple bond correlation）スペクトルの帰属において、（ｉ）Ｈ−１／Ｃ−２，Ｃ−８とＣ−１０、（ｉｉ）Ｈ−３／Ｃ−２，Ｃ−４とＣ−１４、（ｉｉｉ）Ｈ−１２／Ｃ−６，Ｃ−１１とＣ−１３、（ｉｖ）Ｈ−１４／Ｃ−３，Ｃ−４とＣ−９の間に相関シグナルが観察された。化合物〔ＩＩ〕の２位の炭素の配位は、Ｈ−２／Ｈ−１とＨ−１５間のＮＯＥｓスペクトルの解析よりＳ体であると確認された（図２）。これらのデータから、化合物〔ＩＩ〕の構造は新規化合物である（２Ｓ，６Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ）−２，１１，１３−トリヒドロキシ−β−セリネンであると決定した。１１位の炭素の立体配置は維持されていた。
【００４４】
化合物〔ＩＩ〕：無色油状、[α]D23.1 +23.7(CHCl3; c=1.00)、HR-EIMS m/z:254.1895[M] +、分子式 C15H26O3 254.1882、EIMS m/z:254 [M]+ (2), 236 (24), 223 (37), 205 (86), 187 (base), 161 (75), 147 (63), 119 (61), 105 (78), 75 (63), 57 (25), 43 (55)、ＩＲ(ＫＢｒ法)νmaxcm-1:3355, 2937, 2845, 1455, 1041、１Ｈ−ＮＭＲ(CDCl3), 4.82 (1H, d, J=1.8 Hz, H-14), 4.52 (1H, d, J=1.8 Hz, H-14), 3.87 (1H, dddd, J=4.8, 4.8, 11.4, 11.5 Hz, H-2), 3.46 (1H, d, J=10.8 Hz, H-13), 3.41 (1H, d, J=10.8 Hz, H-13), 2.66 (1H, ddd, J=1.8, 5.4, 12.0 Hz, H-3), 1.97 (1H, dd, J=11.5, 12.0 Hz, H-3), 1.82 (1H, ddd, J=1.8, 4.8, 12.6 Hz, H-1), 1.77 (1H, dd, J=2.9, 12.1 Hz, H-9), 1.66 (1H, m, H-7), 1.60 (1H, m, H-6), 1.58 (1H, m, H-8),1.56 (1H, m, H-5), 1.38 (1H, m, H-7), 1.28 (1H, m, H-8), 1.20 (1H, dd, J=11.4, 12.6 Hz, H-1), 1.15 (3H, s, H-12), 1.07 (1H, ddd, J=12.1 12.5, 12.6 Hz, H-5), 0.99 (3H, s, H-15)、１３Ｃ−ＮＭＲを表１に示す。
【００４５】
【表１】
【実施例２】
【００４６】
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性はEllmanらの分光光度法（G.L.Ellman, K.D.Courtney, V.Andres Jr., R.M.Featherstone, (1961), Biochem.Pharmacol., 7, 88-95）により測定した。１７μＬの化合物〔Ｉ〕または化合物〔ＩＩ〕（エチルアルコール溶液）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かした０．０１Ｍのイールマン試薬（ＤＴＮＢ：東京化成製）３３μＬ、アセチルコリンエステラーゼ（シグマ製）１６７μＬ（０．０４ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解）、および０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）８００μＬを試験管に加え、２５℃で５分間インキュベートした。その後、７５ｍＭのアセチルチオコリン アイオダイド（ＡＴＣ：東京化成製）１３μＬを加え、２５℃で２０分間インキュベートした。吸光光度計により４７５ｎｍの吸光度を測定した。化合物を含まない対照試験は、非酵素的加水分解のためにブランクにより補正された。各測定は少なくとも３回繰り返した。アセチルコリンエステラーゼ阻害活性は以下の式により決定した。
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性（％）＝［（Ａ−Ｂ）／（Ｃｐ−Ｃｎ］×１００
Ａ：試料（化合物〔Ｉ〕または化合物〔ＩＩ〕、ＤＴＮＢ、アセチルコリンエステラーゼ、０．１Ｍリン酸緩衝液、およびＡＴＣ）の吸光度
Ｂ：ブランク（化合物〔Ｉ〕、化合物〔ＩＩ〕または（(-)-プレゴン）、ＤＴＮＢ、および０．１Ｍリン酸緩衝液）の吸光度
Ｃｐ：陽性対照（エチルアルコール、ＤＴＮＢ、アセチルコリンエステラーゼ、および０．１Ｍリン酸緩衝液）の吸光度
Ｃｎ：陰性対照（エチルアルコール、ＤＴＮＢ、および０．１Ｍリン酸緩衝液）の吸 光度
結果を表２に示す。
【表２】
【００４７】
したがって、化合物〔ＩＩ〕は、(-)-プレゴンよりも顕著なアセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】β−セリネン〔Ｉ〕をアスペルギルス ウェンティーによって微生物変換したときの、β−セリネン〔Ｉ〕および化合物〔ＩＩ〕それぞれの相対存在量についての経時変化を示す。
【図２】化合物〔ＩＩ〕の主要なＨＭＢＣおよびＮＯＥｓスペクトルを示す。
【符号の説明】
【００４９】
■ β−セリネン
△ 化合物〔ＩＩ〕
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
で表されるβ−セリネン誘導体。
【請求項２】
アセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有する、請求項１に記載の誘導体。
【請求項３】
請求項１に記載のβ−セリネン誘導体を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
【化２】
で表されるβ−セリネン誘導体を製造するにあたり、基質としてのβ−セリネンを当該β−セリネン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物または当該微生物の生体酵素と接触させることを特徴とする方法。
【請求項５】
β−セリネン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物がアスペルギルス ウェンティーである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
アスペルギルス ウェンティーが寄託番号ＮＢＲＣ８８６４の株種である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項１】
式
【化１】
で表されるβ−セリネン誘導体。
【請求項２】
アセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有する、請求項１に記載の誘導体。
【請求項３】
請求項１に記載のβ−セリネン誘導体を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
【化２】
で表されるβ−セリネン誘導体を製造するにあたり、基質としてのβ−セリネンを当該β−セリネン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物または当該微生物の生体酵素と接触させることを特徴とする方法。
【請求項５】
β−セリネン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物がアスペルギルス ウェンティーである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
アスペルギルス ウェンティーが寄託番号ＮＢＲＣ８８６４の株種である、請求項５に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１１４０８９（Ｐ２００９−１１４０８９Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８６４２５（Ｐ２００７−２８６４２５）
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（０００２３８２０１）扶桑薬品工業株式会社 (42)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（０００２３８２０１）扶桑薬品工業株式会社 (42)
【Ｆターム（参考）】
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