新規なヘプタペプチド及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤
【目的】クラゲコラーゲンからプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する新規なペプチドを提供する。
【構成】クラゲコラーゲンを酵素分解して得られるヘプタペプチドはＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａであり、プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、かつ生体内での抗健忘症効果を有し、毒性も極めて低い。
【構成】クラゲコラーゲンを酵素分解して得られるヘプタペプチドはＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａであり、プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、かつ生体内での抗健忘症効果を有し、毒性も極めて低い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヘプタペプチド及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘプタペプチドは、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤及び抗健忘症剤としての利点を持つ。
【特許文献１】特開２００３−２６７９９５
【特許文献２】特開２００３−３０６４９８
【特許文献３】特開２００５−２０６４６９
【特許文献４】特願２００５−４１２６７
【特許文献５】特願２００５−４１２６８
【非特許文献１】Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０巻，３５８−３５９頁（１９９６年）．
【非特許文献２】Ｋｉｍｕｒａ，Ｋ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１巻，１７５４−１７５６頁（１９９７年）．
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．等：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５６９巻，１８４−１８９頁（１９７９年）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
老人性痴呆症はアルツハイマー病と、脳血管痴呆症は脳梗塞や脳内出血、くも膜下出血などが起因となる脳血管性痴呆との２種類に大別される。健忘症や痴呆症の患者の脳内では、プロリルエンドペプチダーゼという酵素の活性が亢進していると報告され、この酵素の働きを弱めれば健忘症や痴呆症の予防や治療が期待できる［非特許文献１］［非特許文献２］。一方、これまで発明者は、水産加工廃棄物として処理されてきた魚鱗を酵素分解して得られる魚鱗由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＧｌｙおよびＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献１］、同じく、魚鱗由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ及びオクタペプチドＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕに活性化酸素阻害能を見出してきた［特許文献２］。更に、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献３］、同じく、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎに活性化酸素阻害能を見出し［特許文献４］、又、鰻骨由来トリペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出してきた［特許文献５］。しかしながら、クラゲコラーゲン由来のペプチドに関するプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用並びに経口投与による抗健忘症効果については未だ不明であり、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、前記の課題を解決するために鋭意研究した結果、クラゲコラーゲンから得られた本発明に係る新規なヘプタペプチドが抗健忘症効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、クラゲコラーゲンから薬理作用を有する物質を検索し、この新規なクラゲコラーゲン由来のヘプタペプチドが強いプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有することを見出した。そして、この新規なクラゲコラーゲン由来のヘプタペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行い、その結果、この新規なクラゲコラーゲン由来のヘプタペプチドが抗健忘症効果を有し、天然物由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係るクラゲコラーゲン由来ペプチドは、次式、
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘプタペプチドであり、常温における性状は白色の粉末である。
【０００５】
本発明に係る新規なヘプタペプチドは、化学的に合成する方法、又はクラゲコラーゲンから分離精製する方法をあげることができる。本発明に係る新規なヘプタペプチドを化学的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常の合成方法によって行うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ当該ペプチドのカルボキシル末端側からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良い。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素などを用いてポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などを用いた通常の方法で精製することができる。
【０００６】
上記したように、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、クラゲコラーゲンから分離精製することができるが、その場合には、例えば以下のようにして行うことができる。
本発明に係る新規なヘプタペプチドを含有しているクラゲコラーゲンを用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、クラゲホモジネートを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。この加水分解物を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からプロリルエンドペプチダーゼ（以下、ＰＥＰと略記する）阻害活性を有する成分を含有する分画を得、その得られたＰＥＰ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５など）によって分画し、その得られたＰＥＰ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５など）によって分画し、最終的に得られたＰＥＰ阻害活性画分を逆相ＨＰＬＣによって分離することによって単離精製を行うことができる。
【０００７】
本発明に係る新規なヘプタペプチドの製法において用いるクラゲコラーゲンとしては、本発明の目的を達成できる限りいかなるクラゲを用いても良いが、好ましくはミズクラゲ、ビゼンクラゲ、ヒゼンクラゲ、エチゼンクラゲ等を用いるのが良い。以上のようにして得られた新規なヘプタペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、新規なヘプタペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。新規なヘプタペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することができる。投与方法としては、通常は、哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重当たりヘプタペプチドを０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整することができる。
【０００８】
上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、潤沢剤の種類は、とくに限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロースおよびそのカリウム塩類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なヘプタペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。新規なヘプタペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもできる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る新規なヘプタペプチドは、優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有し、抗健忘症効果、抗痴呆症効果を示す。従って、軽度から中程度のアルツハイマー型痴呆症、及び脳梗塞後遺症としての、脳血管型痴呆症の痴呆症状の進行を遅らせることができることから、健忘症の予防剤又は症状改善剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【００１０】
本発明は、医薬品としての有用性を有する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプチド及びこのペプチドを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１１】
製造例１
東南アジアで採取し、塩蔵処理したクラゲ（Ｌｏｂｏｎｅｍａ ｍａｙｅｒｉ）を脱塩したクラゲ１２００ｇに脱イオン水９００ｍＬを加え、オートクレーブによる熱水抽出（１２０℃、２０分間）した。冷却後、吸引ろ過によりクラゲ抽出液１５００ｍＬを得た。更に、限外ろ過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、φ７６ｍｍ、分画分子量１万）を用い限外ろ過した内液４５０ｍＬをクラゲコラーゲン液とした。このクラゲコラーゲン液を１規定の塩酸にてｐＨ２．０に調整し、ペプシン（豚由来、和光純薬工業社製）３ｇを添加後、３７℃で２４時間酵素分解した。酵素分解終了後、直ちに反応液を限外ろ過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、φ７６ｍｍ、分画分子量１万）を用い限外ろ過して得た通過液４３０ｍＬをＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．５×２０ｃｍ）に加え負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗滌した後、２規定のアンモニウム水５００ｍＬを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液４０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（φ２．３×１４０ｃｍ）に負荷し、流速３０ｍＬ／ｈｒ、各分画量８．７ｍＬでゲルろ過を行った。ゲルろ過の結果を図１に示す。ゲルろ過を繰り返して大量分取したペプチド画分を集めて凍結乾燥しクラゲコラーゲンペプチド粉末とした。このペプチド粉末３ｇを脱イオン水２０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム（φ１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍＬから１．５％塩化ナトリウム水５００ｍＬの濃度勾配法を行い溶出した。流速８０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィーを行った。その結果を図２に示す。クロマトグラフ中、ＰＥＰ阻害活性の高い画分（ＳＰ−ＩＩ画分；分画番号５３〜７０）を集めて凍結乾燥し精製クラゲコラーゲンペプチド粉末を得た。この精製ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣを行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ検出波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣの結果を図３に示す。溶出時間３１．８分に強いＰＥＰ阻害活性を有するペプチドフラグメントを得た。このペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本発明に係る新規なペプチドは、次式、
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なヘプタペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なヘプタペプチドをＰＥＰ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼クラゲコラーゲンペプチド１６ｇ、▲２▼乳糖９１ｇ、▲３▼コーンスターチ２９ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．３ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び１５ｇのコーンスターチを混和し、８ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に４．７ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１２】
製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａの合成法
アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のアラニンからクロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が９３分間で７８％→２５％の濃度勾配法により流速１．７ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２２１ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘプタペプチド（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）を得た。
【００１３】
この合成ヘプタペプチドをアミノ酸分析したところＩｌｅ：１．０６（理論値：１）、Ｖａｌ：１．０７（理論値：１）、Ａｌａ：１．０３（理論値：１）Ｐｒｏ：１．８８（理論値：２）及びＧｌｙ：２．０４（理論値：２）を示し、又、マススペクトルの結果を図４に示す。これらの結果、アミノ酸組成及び質量分析値（Ｍ＋１＝４８４）が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘプタペプチドであることが確認された。更に、この合成ペプチドのプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を測定したところ、ＩＣ５０値；２０．７μＭであった。
このように合成によって得られた本発明に係る新規なヘプタペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。
【００１４】
試験例１（プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性測定法）
酵素：プロリルエンドペプチダーゼ（生化学工業社製、酵素番号ＥＣ３．４．２１．２６）０．１Ｕ／ｍＬ、合成基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（生化学工業社製）２ｍＭを用い、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ等の方法［非特許文献３］に準じて測定した。すなわち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０００μＬ、被検液１００μＬ、酵素溶液（４０％ジオキサンを含む）１００μＬを順次加え、３０℃で５分間プリインキュベーションした。更に、基質溶液１００μＬを加え、３０℃で１０分間インキュベーションした。その後、１Ｎ ＨＣｌ ５００μＬを加えることにより反応を止め、４１０ｎｍの吸光度を測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、プロリルエンドペプチダーゼの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な被検液の濃度（Ｍ）で示した。
【００１５】
試験例２（ラットによる抗健忘症効果試験）
本発明に係る新規な合成ペプチド（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）の抗健忘症効果試験は、ラットの受動的回避学習装置、すなわちフットショックストレス・システム（室町機械社製、ＭＦＳ−０１型）を用いて行った。実験動物は（株）九動より４週令雄性ラット（平均体重１６０ｇ）３群各３匹を購入後、受動的回避学習試験を行った。インタクト・コントロールとして生理食塩水を経口投与したラット（生理食塩水群）、コントロールとして塩酸ドネペジル（エーザイ社製）を０．２ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（塩酸ドネペジル群）、及び合成ペプチドを２００ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ群）を用いて実験を行った。これら３群のラット各々を台上に乗せ、床に降りた瞬間から電流を流し、電気ショックを避けるために台上に戻り、もはや床へ降りなくなるまでの受動的回避学習をさせる。次に、これら３群のラットに、痴呆症を引き起こすスコポラミン２０ｍｇ／ｋｇ投与すると、先の電気ショックを忘れ、床に降りるようになる。ラットが床へ降りるまでの滞在時間（秒）を測定することにより、学習前に投与した合成ペプチド（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）がこの記憶喪失をどの程度予防するかをみた。
【表１】
以上の試験の結果、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）においてプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な抗健忘症効果を示すことが確認された。従って、本発明に係る新規なヘプタペプチドは痴呆症の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る製造例１におけるクラゲコラーゲンのペプシン分解物を、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ［Ｈ＋］吸着・脱着して得たペプチド画分を、更に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムクロマトグラフィーした図である。
【図２】本発明に係る製造例１におけるクラゲコラーゲンペプチドをＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラムクロマトグラフィーした図である。
【図３】本発明に係る製造例１におけるクラゲコラーゲンペプチドの逆相ＨＰＬＣによるＰＥＰ阻害ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図４】本発明に係る製造例２におけるヘプタペプチドのマススペクトルを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヘプタペプチド及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘプタペプチドは、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤及び抗健忘症剤としての利点を持つ。
【特許文献１】特開２００３−２６７９９５
【特許文献２】特開２００３−３０６４９８
【特許文献３】特開２００５−２０６４６９
【特許文献４】特願２００５−４１２６７
【特許文献５】特願２００５−４１２６８
【非特許文献１】Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０巻，３５８−３５９頁（１９９６年）．
【非特許文献２】Ｋｉｍｕｒａ，Ｋ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１巻，１７５４−１７５６頁（１９９７年）．
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．等：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５６９巻，１８４−１８９頁（１９７９年）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
老人性痴呆症はアルツハイマー病と、脳血管痴呆症は脳梗塞や脳内出血、くも膜下出血などが起因となる脳血管性痴呆との２種類に大別される。健忘症や痴呆症の患者の脳内では、プロリルエンドペプチダーゼという酵素の活性が亢進していると報告され、この酵素の働きを弱めれば健忘症や痴呆症の予防や治療が期待できる［非特許文献１］［非特許文献２］。一方、これまで発明者は、水産加工廃棄物として処理されてきた魚鱗を酵素分解して得られる魚鱗由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＧｌｙおよびＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献１］、同じく、魚鱗由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ及びオクタペプチドＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕに活性化酸素阻害能を見出してきた［特許文献２］。更に、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献３］、同じく、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎに活性化酸素阻害能を見出し［特許文献４］、又、鰻骨由来トリペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出してきた［特許文献５］。しかしながら、クラゲコラーゲン由来のペプチドに関するプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用並びに経口投与による抗健忘症効果については未だ不明であり、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、前記の課題を解決するために鋭意研究した結果、クラゲコラーゲンから得られた本発明に係る新規なヘプタペプチドが抗健忘症効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、クラゲコラーゲンから薬理作用を有する物質を検索し、この新規なクラゲコラーゲン由来のヘプタペプチドが強いプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有することを見出した。そして、この新規なクラゲコラーゲン由来のヘプタペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行い、その結果、この新規なクラゲコラーゲン由来のヘプタペプチドが抗健忘症効果を有し、天然物由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係るクラゲコラーゲン由来ペプチドは、次式、
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なヘプタペプチドであり、常温における性状は白色の粉末である。
【０００５】
本発明に係る新規なヘプタペプチドは、化学的に合成する方法、又はクラゲコラーゲンから分離精製する方法をあげることができる。本発明に係る新規なヘプタペプチドを化学的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常の合成方法によって行うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ当該ペプチドのカルボキシル末端側からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良い。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素などを用いてポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などを用いた通常の方法で精製することができる。
【０００６】
上記したように、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、クラゲコラーゲンから分離精製することができるが、その場合には、例えば以下のようにして行うことができる。
本発明に係る新規なヘプタペプチドを含有しているクラゲコラーゲンを用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、クラゲホモジネートを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。この加水分解物を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からプロリルエンドペプチダーゼ（以下、ＰＥＰと略記する）阻害活性を有する成分を含有する分画を得、その得られたＰＥＰ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５など）によって分画し、その得られたＰＥＰ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５など）によって分画し、最終的に得られたＰＥＰ阻害活性画分を逆相ＨＰＬＣによって分離することによって単離精製を行うことができる。
【０００７】
本発明に係る新規なヘプタペプチドの製法において用いるクラゲコラーゲンとしては、本発明の目的を達成できる限りいかなるクラゲを用いても良いが、好ましくはミズクラゲ、ビゼンクラゲ、ヒゼンクラゲ、エチゼンクラゲ等を用いるのが良い。以上のようにして得られた新規なヘプタペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、新規なヘプタペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。新規なヘプタペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することができる。投与方法としては、通常は、哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重当たりヘプタペプチドを０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整することができる。
【０００８】
上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、潤沢剤の種類は、とくに限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロースおよびそのカリウム塩類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なヘプタペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。新規なヘプタペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもできる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る新規なヘプタペプチドは、優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有し、抗健忘症効果、抗痴呆症効果を示す。従って、軽度から中程度のアルツハイマー型痴呆症、及び脳梗塞後遺症としての、脳血管型痴呆症の痴呆症状の進行を遅らせることができることから、健忘症の予防剤又は症状改善剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【００１０】
本発明は、医薬品としての有用性を有する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプチド及びこのペプチドを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１１】
製造例１
東南アジアで採取し、塩蔵処理したクラゲ（Ｌｏｂｏｎｅｍａ ｍａｙｅｒｉ）を脱塩したクラゲ１２００ｇに脱イオン水９００ｍＬを加え、オートクレーブによる熱水抽出（１２０℃、２０分間）した。冷却後、吸引ろ過によりクラゲ抽出液１５００ｍＬを得た。更に、限外ろ過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、φ７６ｍｍ、分画分子量１万）を用い限外ろ過した内液４５０ｍＬをクラゲコラーゲン液とした。このクラゲコラーゲン液を１規定の塩酸にてｐＨ２．０に調整し、ペプシン（豚由来、和光純薬工業社製）３ｇを添加後、３７℃で２４時間酵素分解した。酵素分解終了後、直ちに反応液を限外ろ過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、φ７６ｍｍ、分画分子量１万）を用い限外ろ過して得た通過液４３０ｍＬをＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．５×２０ｃｍ）に加え負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗滌した後、２規定のアンモニウム水５００ｍＬを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液４０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０（φ２．３×１４０ｃｍ）に負荷し、流速３０ｍＬ／ｈｒ、各分画量８．７ｍＬでゲルろ過を行った。ゲルろ過の結果を図１に示す。ゲルろ過を繰り返して大量分取したペプチド画分を集めて凍結乾燥しクラゲコラーゲンペプチド粉末とした。このペプチド粉末３ｇを脱イオン水２０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム（φ１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍＬから１．５％塩化ナトリウム水５００ｍＬの濃度勾配法を行い溶出した。流速８０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィーを行った。その結果を図２に示す。クロマトグラフ中、ＰＥＰ阻害活性の高い画分（ＳＰ−ＩＩ画分；分画番号５３〜７０）を集めて凍結乾燥し精製クラゲコラーゲンペプチド粉末を得た。この精製ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣを行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ検出波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣの結果を図３に示す。溶出時間３１．８分に強いＰＥＰ阻害活性を有するペプチドフラグメントを得た。このペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本発明に係る新規なペプチドは、次式、
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なヘプタペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なヘプタペプチドをＰＥＰ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼クラゲコラーゲンペプチド１６ｇ、▲２▼乳糖９１ｇ、▲３▼コーンスターチ２９ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．３ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び１５ｇのコーンスターチを混和し、８ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に４．７ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１２】
製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａの合成法
アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のアラニンからクロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が９３分間で７８％→２５％の濃度勾配法により流速１．７ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２２１ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘプタペプチド（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）を得た。
【００１３】
この合成ヘプタペプチドをアミノ酸分析したところＩｌｅ：１．０６（理論値：１）、Ｖａｌ：１．０７（理論値：１）、Ａｌａ：１．０３（理論値：１）Ｐｒｏ：１．８８（理論値：２）及びＧｌｙ：２．０４（理論値：２）を示し、又、マススペクトルの結果を図４に示す。これらの結果、アミノ酸組成及び質量分析値（Ｍ＋１＝４８４）が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘプタペプチドであることが確認された。更に、この合成ペプチドのプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を測定したところ、ＩＣ５０値；２０．７μＭであった。
このように合成によって得られた本発明に係る新規なヘプタペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。
【００１４】
試験例１（プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性測定法）
酵素：プロリルエンドペプチダーゼ（生化学工業社製、酵素番号ＥＣ３．４．２１．２６）０．１Ｕ／ｍＬ、合成基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（生化学工業社製）２ｍＭを用い、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ等の方法［非特許文献３］に準じて測定した。すなわち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０００μＬ、被検液１００μＬ、酵素溶液（４０％ジオキサンを含む）１００μＬを順次加え、３０℃で５分間プリインキュベーションした。更に、基質溶液１００μＬを加え、３０℃で１０分間インキュベーションした。その後、１Ｎ ＨＣｌ ５００μＬを加えることにより反応を止め、４１０ｎｍの吸光度を測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、プロリルエンドペプチダーゼの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な被検液の濃度（Ｍ）で示した。
【００１５】
試験例２（ラットによる抗健忘症効果試験）
本発明に係る新規な合成ペプチド（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）の抗健忘症効果試験は、ラットの受動的回避学習装置、すなわちフットショックストレス・システム（室町機械社製、ＭＦＳ−０１型）を用いて行った。実験動物は（株）九動より４週令雄性ラット（平均体重１６０ｇ）３群各３匹を購入後、受動的回避学習試験を行った。インタクト・コントロールとして生理食塩水を経口投与したラット（生理食塩水群）、コントロールとして塩酸ドネペジル（エーザイ社製）を０．２ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（塩酸ドネペジル群）、及び合成ペプチドを２００ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ群）を用いて実験を行った。これら３群のラット各々を台上に乗せ、床に降りた瞬間から電流を流し、電気ショックを避けるために台上に戻り、もはや床へ降りなくなるまでの受動的回避学習をさせる。次に、これら３群のラットに、痴呆症を引き起こすスコポラミン２０ｍｇ／ｋｇ投与すると、先の電気ショックを忘れ、床に降りるようになる。ラットが床へ降りるまでの滞在時間（秒）を測定することにより、学習前に投与した合成ペプチド（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ）がこの記憶喪失をどの程度予防するかをみた。
【表１】
以上の試験の結果、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）においてプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な抗健忘症効果を示すことが確認された。従って、本発明に係る新規なヘプタペプチドは痴呆症の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る製造例１におけるクラゲコラーゲンのペプシン分解物を、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ［Ｈ＋］吸着・脱着して得たペプチド画分を、更に、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムクロマトグラフィーした図である。
【図２】本発明に係る製造例１におけるクラゲコラーゲンペプチドをＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラムクロマトグラフィーした図である。
【図３】本発明に係る製造例１におけるクラゲコラーゲンペプチドの逆相ＨＰＬＣによるＰＥＰ阻害ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図４】本発明に係る製造例２におけるヘプタペプチドのマススペクトルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチド。
【請求項２】
次式；Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチドを有効成分として含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【請求項１】
次式；Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチド。
【請求項２】
次式；Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチドを有効成分として含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２９１０５３（Ｐ２００７−２９１０５３Ａ）
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４７４２５（Ｐ２００６−１４７４２５）
【出願日】平成１８年４月２５日（２００６．４．２５）
【出願人】（５０５４４７１５７）
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２５日（２００６．４．２５）
【出願人】（５０５４４７１５７）
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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