新規抗菌タンパク質、その製造方法およびその用途
【課題】新規抗菌タンパク質、その製造方法およびその用途を提供する。
【解決手段】Lactobacillus gasseri JCM1131Tから得られる２８８個の特定のヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、および特定のアミノ酸配列からなるタンパク質；該ＤＮＡを含む組換えプラスミド；該組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞；該宿主細胞を培養してタンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法；並びに該タンパク質を有効成分として含有する組成物、特には研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質。
【解決手段】Lactobacillus gasseri JCM1131Tから得られる２８８個の特定のヌクレオチド配列からなるＤＮＡからなる遺伝子、および特定のアミノ酸配列からなるタンパク質；該ＤＮＡを含む組換えプラスミド；該組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞；該宿主細胞を培養してタンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法；並びに該タンパク質を有効成分として含有する組成物、特には研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な抗菌タンパク質、その製造方法およびその用途に関する。より具体的には、溶原ファージφｇａＹを保有する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから得た遺伝子によりコードされる新規な抗菌タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから新規溶菌酵素であるＬｙｓｇａＹの構造遺伝子を単離した例が報告されている。（例えば、特許文献１）。
ＬｙｓｇａＹは、３１０個のアミノ酸からなるタンパク質であり、ムラミダーゼ族に属し、Lactobacillus属、Staphylococcus属等のグラム陽性菌に対し幅広い溶菌スペクトル
を示すことが示されている。
また、ＬｙｓｇａＹのアミノ酸配列及び該タンパク質をコードするＤＮＡの９３３のヌクレオチド配列も報告されている。
【０００３】
ＬｙｓｇａＹと他の溶菌酵素との相同性比較および三次元構造予測の結果より、ＬｙｓｇａＹの活性ドメインであるＮ末端領域は、β／α−バレル構造を有することが示唆され、一方、Ｃ末端領域は細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）を形成すると推測された。
ＬｙｓｇａＹのＣ末端領域である細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）と類似の細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）をＣ末端領域に有する他の溶菌酵素、それらの細胞壁に対する結合能に関する文献が、幾つか報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４）。
しかしながら、これらの類似ペプチド領域の抗菌活性に関する報告はなされていない。
【特許文献１】特開２００６−１２１９９３号公報
【非特許文献１】Lu JZ, Fujiwara T, Komatsuzawa H, Sugai M, Sakon J. Cell wall-targeting domain of glycylglycine endopeptidase distinguishes among peptidoglycan cross-bridges. J. Biol. Chem., 2006, Jan 6;281(1):p.549-58.
【非特許文献２】Low LY, Yang C, Perego M, Osterman A, Liddington RC.Structure and lytic activity of a Bacillus anthracis prophage endolysin. J. Biol. Chem. 2005 Oct 21;280(42):p.35433-9.
【非特許文献３】Donovan, D.M., Foster-Frey, J., Dong, S., Rousseau, G.M., Moineau, S., Pritchard, D.G., The Cell Lysis Activity of the Streptococcus agalactiae Bacteriophage B30 Endolysin Relies on the Cysteine, Histidine-Dependent Amidohydrolase/Peptidase Domain. Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, p.5108-12.
【非特許文献４】Donovan, D.M., Dong, S., Garrett, W., Rousseau, G.M., Moineau, S., Pritchard, D.G., Peptidoglycan hydrolase fusions maintain their parental specificities. Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, p.2988-96.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、新規抗菌タンパク質、その製造方法およびその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから単離された溶菌酵素であるＬｙｓｇａＹの構造遺伝子のＣ末端の細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）がコードするタンパク質（以後、ＳＨ３ｂｇａＹと記す。）が、植物病原細菌に対して強く且つ広いスペクトルの抗菌活性を有することを見い
出し、本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明は以下の１ないし１２の観点に関する；
１． 以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
atg tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
２． 以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
３． 以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質、
ｄ）前記１．記載のＤＮＡによりコードされ、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
４． 前記１．又は２．記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。
５． 発現ベクターであることを特徴とする、前記４．記載の組換えプラスミド。
６． 前記４．または５．に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
７． グラム陽性細菌であることを特徴とする、前記６．記載の宿主細胞。
８． 大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、前記６．記載の宿主細胞。
９． 以下の工程１）および２）を含む、前記３．に記載のタンパク質の製造方法；
１）前記６．ないし８．のうちの何れか１つに記載の宿主細胞を、抗菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、抗菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
１０． 前記９．記載の製造方法により得られるタンパク質。
１１． 前記３．記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
１２． 研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、前記１１．記載の組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、強い抗菌活性及び広い抗菌スペクトルを有する新規なタンパク質が提供される。そして該タンパク質は生命工学分野および医療分野の用途への適用、特に研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等の有効成分として好ましく使用することができる。
本発明の抗菌タンパク質（ＳＨ３ｂｇａＹ）は、加水分解活性を全く有さず、逆に、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの自己溶菌及びＬｙｓｇａＹの加水分解活性を阻害するものであった。
従って、ＳＨ３ｂｇａＹの抗菌活性は、ＬｙｓｇａＹの加水分解活性とは全く異なることが明らかとなった。
尚、ＳＨ３ｂｇａＹの抗菌活性は、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの対数増殖期における細胞分裂の最終段階である娘細胞の分離の阻害によるものと考えられるものであった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、ＳＨ３ｂｇａＹをコードする遺伝子部分を含むＤＮＡが組み込まれた組換えプラスミドを鋳型とし、ＳＨ３ｂｇａＹをコードする遺伝子が得られるよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。ＳＨ３ｂｇａＹをコードする遺伝子部分を含むＤＮＡは、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの菌体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ等で切断することにより得ることができる。得られたＤＮＡを用い、公知の方法、例えばサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）等に従って、前記ＤＮＡが組み込まれた組換えプラスミドを作成することができる。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＬｙｓｇａＹをコードする遺伝子のＣ末端部分と他の溶菌酵素の細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）をコードする遺伝子との相同性から予測して設計することができる。
【０００９】
得られたＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを作成し、該組換えプラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体からタンパク質の誘導発現を行うことにより、約９ｋＤａの分子量のＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を得ることができる。
得られたＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の植物病原細菌及び標準菌株に対する抗菌活性を評価したところ、使用した全ての菌株に対して強い抗菌活性を示した。
【００１０】
従って本発明の遺伝子の１つの例は、９５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする領域に相当する以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡである。以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡからなる遺伝子も、抗菌活性を示す限り本発明に包含される。
【００１１】
また、本発明の遺伝子の他の例は、下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるもの、および下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から２８
８に表されるヌクレオチド配列と９５％以上のヌクレオチド配列相同性を示し、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるものが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ等が含まれる。
【００１２】
本発明の遺伝子のさらなる例は、前記９５個のアミノ酸に相当する以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含される。ここで、各アミノ酸に対応するコドンは任意に選択でき、また例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。
【００１３】
他方、本発明のタンパク質の例としては、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質も本発明に包含される。
【００１４】
また、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、抗菌活性を有する限り本発明に包含される。ここで数個とは、１０個を超えない数であり、好ましくは５個以下である。
【００１５】
ここで、あるＤＮＡが以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば以下の手順により決定できる：先ず、目的とするＤＮＡをランダムプライマー法、ニックトランスレーション法等に従いプローブを用いて標識する。次いで、ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡを公知の方法、例えばニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、加熱あるいは紫外線照射により固相化する。その膜をその後、例えば６×ＳＳＣ、５％デンハート溶液および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、５５℃で４時間以上保温する。ここで先に作成した標識プローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１０６ｃｐｍ／ｍＬとなるように添加し、６０℃で一晩保温する。膜を５７℃で５分間洗浄する操作を５回繰り返し、さらに５７℃で２０分間洗浄後、オートラジオグラフィーを行うことにより、ハイブリダイズしたか否かを判定することができる。
【００１６】
ハイブリダイゼーションの条件は前記条件に限定されず、ストリンジェントな条件下であればよい。本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことからなるハイブリダイゼーションを指す。さらに０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うこともできる。
【００１７】
また、本発明のタンパク質が抗菌活性を有するか否かは、通常の方法により評価できる。より詳しくは、以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた抗菌活性試験を、アミノ酸の欠失、置換および／または付加により生成した改変タンパク質に対して行うことにより、該改変タンパク質の抗菌活性の有無を決定できる。
【００１８】
また本発明のＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミドも本発明に包含される。該ベクターとしては、一般に知られている様々なベクターを使用でき、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクター等があるが、これに限定されな
い。このような組換えプラスミドにより、原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換できる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることができ好ましい。
【００１９】
本発明の組換えプラスミドを各種細胞に導入することにより得られる宿主細胞も本発明に包含される。該宿主細胞として好ましいのは、グラム陽性細菌、特に大腸菌、乳酸菌、枯草菌、ブドウ球菌等である。
【００２０】
本発明のタンパク質は、前記組換えプラスミドにより形質転換した前記宿主細胞を、抗菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養し、該培養により得た培養物から抗菌活性を有するタンパク質を回収することにより製造できる。宿主細胞の培養方法およびタンパク質の回収方法としては従来一般に知られている方法が使用可能であり、例えば以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた方法により行うことができる。
【００２１】
本発明はまた、本発明のタンパク質を有効成分として含有してなる組成物に関する。該組成物は、細菌を死滅させることが必要となる様々な用途に適用できる。該用途としては、具体的には、研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等が挙げられる。
【００２２】
以下、本発明を具体的な例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定することを意図しない。
【実施例１】
【００２３】
ＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子の単離
ＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子を含む組換えプラスミドの作成は、特開２００６−１２１９９３号公報にて記述した組み換えプラスミドｐ１１９ｇａＹ３を用いて、以下のサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）に従って調製した。
組み換えプラスミドｐ１１９ｇａＹ３(約０．０１μｇ）を鋳型とし、ＧＹ１ＳＨ３２
Ｒプライマ（5'-AAAGCTCATATGTCTGTTGCACAATCAGCATCAGAA-3'）およびＭ１３ＦＷプライマ（5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3')を用い、ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲ法により、ＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子を含むＤＮＡ断片（４８０ｂｐ）を得た。
上記ＤＮＡ断片をＮｄｅＩで完全分解し、４７３ｂｐのＤＮＡ断片を回収、精製した。プラスミドｐＥＴ１５ｂ（５７０８ｂｐの大腸菌ベクター、Ａｍｐr、ｐＴ７）をＮｄｅ
Ｉ，ＢａｍＨＩで完全分解した後、得られた線状ＤＮＡのＢａｍＨＩサイトをＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢ社製）を用いて末端平滑化した。引き続き、該４７３ｂｐＤＮＡ断片と線状プラスミドｐＥＴ１５ｂを、ＤＮＡ結合酵素（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢ社製）を用いた１６℃、６時間の反応により結合させ、組換えプラスミドｐＨＳＨｇａＹ２（６１７０ｂｐ）を得た。
【実施例２】
【００２４】
プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２（６１７０ｂｐ）の塩基配列の確認
組換えプラスミドｐＨＳＨｇａＹ２（６１７０ｂｐ）の塩基配列は、Thermo Sequenase
Cy5.5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (アマシャム社製)を用いてサイクルシー
ケンス反応を行い、Long Read Tower シーケンサ（ベリタス社製）により泳動、解析した。本法によりプラスミドｐＨＳＨｇａＹ２の挿入断片（４７３ｂｐ）の全塩基配列を決定したところ、その配列は、鋳型にしたプラスミドｐ１１９ｇａＹ３並びに実施例１のプラ
イマの配列に一致し、目的のＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子を含む配列であった。プラスミドｐ１１９ｇａＹ３並びにｐＨＳＨｇａＹ２から発現されるタンパク質の領域を表した模式図を図１に示す。プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２から発現されるＳＨ３ｂｇａＹタンパク質は、プラスミドｐ１１９ｇａＹ３から発現されるｌｙｓｇａＹタンパク質（特開２００６−１２１９９３号公報）のＣ末端部分のみを有するものであることが判る。
【実施例３】
【００２５】
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の調製と確認
プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２を、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（ｈｓｄＳ、ｇａｌ〔λｃＩｔｓ８５７、ｉｎｄ１、Ｓａｍ７、ｎｉｎ５、ｌａｃＵＶ５−Ｔ７ ｇｅｎｅ１〕）にエレクトロポーレーション法により導入した。詳細には、先ず大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３をＬＢ（Luria-Bertain）培地を用い、３７℃で培養した。一晩（１２時間）経過後、培養菌２ｍ
Ｌを新鮮なＬＢ培地１００ｍＬに植え継ぎ、３７℃で培養した。菌数が５×１０8／ｍＬ
に達したとき、上記と同様の遠心分離法で集菌した。菌体を滅菌水で３度洗浄し、１００μＬの蒸留水に懸濁した。該懸濁液に１μＬの組換えプラスミドＤＮＡ（０．５μｇ／μＬ）とＰＥＧ６０００（１０％）を添加した。大腸菌体内への該組換えプラスミドの導入は、ジーンパルサー（登録商標、バイオラッド社製）を用い、電圧１．７５ｋＶ／ｃｍ、静電容量２５μＦ、抵抗６００Ωの電気パルス条件を用いたエレクトロポレーション法で行った。電気パルス処理後、ＬＢ培地を４倍量加え、３７℃で３０分間保温し、形質転換体を得た。
得られた形質転換体を１００ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン３０μｇ／ｍＬを含む）で培養した。対数期中期（濁度０．３）において、培養液中に終濃度０．４ｍＭになるようＩＰＴＧを加えて、さらに４時間培養した。その後集菌し、結合緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）で１回洗浄後、同緩衝液５ｍＬに懸濁した。この懸濁液を、超音波破砕装置（ソニックスアンドマテリアル社製）で、１回あたり３０秒づつ、計６回処理した。処理液は、遠心分離法（冷却遠心機、日立製作所製：１２０００ｒｐｍ、４℃、１０分）により不溶成分を除去した。
この菌体破砕上清を、ニッケルキレートアフィニティーカラム（ＧＥヘルスケア社製、カラム容量１mL）に供した。上記の結合緩衝液で洗浄後、溶出緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭＮａＣｌ、６００ｍＭイミダゾール）を、０−１００％の範囲で直線濃度勾配をつけて流して溶出した。ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を含む分画を収集し、精製ＳＨ３ｂｇａＹとした。引き続き、該精製ＳＨ３ｂｇａＹを0.05M酢酸buffer（ PH=5.0）にて透析処理し、４℃にて保存した。
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の大腸菌での誘導発現、および精製経過を、ＳＤＳ電気泳動（１５％ゲル濃度）により分析した結果を図２に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は誘導前の大腸菌、レーン３はＩＰＴＧにより発現誘導した大腸菌、レーン４は、タンパク質発現誘導した大腸菌の、菌体破砕上清、レーン５は精製ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を示す。この結果から、プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２により、約９ｋＤａの分子量のＳＨ３ｂｇａＹタンパク質が誘導され、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフにより、１段階のカラム操作でＳＨ３ｂｇａＹタンパク質が精製できることがわかる。
【実施例４】
【００２６】
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の抗菌活性評価
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の植物病原細菌及び標準菌株に対する抗菌活性を評価した。下記の供試菌株をＣＳＭ培地（YEAST NITROGEN BASE (DIFCO No.233520) 0.85 g、CSM (BIO 101 No.4500-022) 0.31 g、D-glucose 10g/ 0.1 Mリン酸buffer (pH 5.0) ）１０ｍＬにて２５℃３日間培養し、培養菌液を得た。本菌液をCSM培地で１００倍希釈した後、９
６穴タイタープレート（ヌンク社製）に１８０μＬ／ウェルずつ分注し、さらに0.05M酢
酸buffer（ PH=5.0） にて所定の濃度となる様希釈した試験サンプルを２０μＬ／ウェルずつ分注した。本プレートを２５℃にてインキュベートし、４日後の供試菌株の生育を目
視にて調査してサンプル無添加処理区と比較することにより生育阻害率を算出した。
Ecc：Erwinia carotovora subsp.carotovora (MAFF301052)
Bg：Burkholderia glumae (MAFF301169)
Rs：Ralstonia solanacearum (MAFF301485)
Xc：Xanthomonas campestris pv.citri (MAFF301078)
Bs：Bacillus subtilis (PCI-219)
Sa：Staphylococcus aureus (IFO-12732)
生育阻害率（％）を表１に示した。
【表１】
表１に示す試験結果から明らかなように、本発明のタンパク質であるＳＨ３ｂｇａＹは６種全ての菌株に対して抗菌活性を示した。特に、Burkholderia glumae、Ralstonia solanacearumに対しては、陽性対照であるクロラムフェニコールよりも強い抗菌活性を示し
た。これらの結果より、ＳＨ３ｂｇａＹが広い抗菌スペクトルを有することを確認できた。
ＳＨ３ｂｇａＹは、ＬｙｓｇａＹと全く異なり、加水分解活性を全く示さなかった。
そして、逆に、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの自己溶菌及びＬｙｓｇａＹの加水分解活性を阻害した。
従って、ＳＨ３ｂｇａＹの抗菌活性は、ＬｙｓｇａＹの加水分解活性とは全く異なるものであった。
尚、ＳＨ３ｂｇａＹは、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの対数増殖期における細胞分裂の最終段階である娘細胞の分離を顕著に阻害した。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例２において作成したプラスミドから発現されるタンパク質の領域を表す。
【図２】図２は、実施例３において形質転換大腸菌が産生したタンパク質を精製した際の電気泳動結果の写真を表す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は誘導前の大腸菌、レーン３はＩＰＴＧにより発現誘導した大腸菌、レーン４は、タンパク質発現誘導した大腸菌の、菌体破砕上清、レーン５は精製ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な抗菌タンパク質、その製造方法およびその用途に関する。より具体的には、溶原ファージφｇａＹを保有する乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから得た遺伝子によりコードされる新規な抗菌タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから新規溶菌酵素であるＬｙｓｇａＹの構造遺伝子を単離した例が報告されている。（例えば、特許文献１）。
ＬｙｓｇａＹは、３１０個のアミノ酸からなるタンパク質であり、ムラミダーゼ族に属し、Lactobacillus属、Staphylococcus属等のグラム陽性菌に対し幅広い溶菌スペクトル
を示すことが示されている。
また、ＬｙｓｇａＹのアミノ酸配列及び該タンパク質をコードするＤＮＡの９３３のヌクレオチド配列も報告されている。
【０００３】
ＬｙｓｇａＹと他の溶菌酵素との相同性比較および三次元構造予測の結果より、ＬｙｓｇａＹの活性ドメインであるＮ末端領域は、β／α−バレル構造を有することが示唆され、一方、Ｃ末端領域は細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）を形成すると推測された。
ＬｙｓｇａＹのＣ末端領域である細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）と類似の細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）をＣ末端領域に有する他の溶菌酵素、それらの細胞壁に対する結合能に関する文献が、幾つか報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４）。
しかしながら、これらの類似ペプチド領域の抗菌活性に関する報告はなされていない。
【特許文献１】特開２００６−１２１９９３号公報
【非特許文献１】Lu JZ, Fujiwara T, Komatsuzawa H, Sugai M, Sakon J. Cell wall-targeting domain of glycylglycine endopeptidase distinguishes among peptidoglycan cross-bridges. J. Biol. Chem., 2006, Jan 6;281(1):p.549-58.
【非特許文献２】Low LY, Yang C, Perego M, Osterman A, Liddington RC.Structure and lytic activity of a Bacillus anthracis prophage endolysin. J. Biol. Chem. 2005 Oct 21;280(42):p.35433-9.
【非特許文献３】Donovan, D.M., Foster-Frey, J., Dong, S., Rousseau, G.M., Moineau, S., Pritchard, D.G., The Cell Lysis Activity of the Streptococcus agalactiae Bacteriophage B30 Endolysin Relies on the Cysteine, Histidine-Dependent Amidohydrolase/Peptidase Domain. Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, p.5108-12.
【非特許文献４】Donovan, D.M., Dong, S., Garrett, W., Rousseau, G.M., Moineau, S., Pritchard, D.G., Peptidoglycan hydrolase fusions maintain their parental specificities. Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, p.2988-96.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、新規抗菌タンパク質、その製造方法およびその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、乳酸棹菌の１種であるLactobacillus gasseri JCM1131Tから単離された溶菌酵素であるＬｙｓｇａＹの構造遺伝子のＣ末端の細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）がコードするタンパク質（以後、ＳＨ３ｂｇａＹと記す。）が、植物病原細菌に対して強く且つ広いスペクトルの抗菌活性を有することを見い
出し、本発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本発明は以下の１ないし１２の観点に関する；
１． 以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
atg tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
２． 以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
３． 以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質、
ｄ）前記１．記載のＤＮＡによりコードされ、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
４． 前記１．又は２．記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。
５． 発現ベクターであることを特徴とする、前記４．記載の組換えプラスミド。
６． 前記４．または５．に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
７． グラム陽性細菌であることを特徴とする、前記６．記載の宿主細胞。
８． 大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、前記６．記載の宿主細胞。
９． 以下の工程１）および２）を含む、前記３．に記載のタンパク質の製造方法；
１）前記６．ないし８．のうちの何れか１つに記載の宿主細胞を、抗菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、抗菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
１０． 前記９．記載の製造方法により得られるタンパク質。
１１． 前記３．記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
１２． 研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、前記１１．記載の組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、強い抗菌活性及び広い抗菌スペクトルを有する新規なタンパク質が提供される。そして該タンパク質は生命工学分野および医療分野の用途への適用、特に研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等の有効成分として好ましく使用することができる。
本発明の抗菌タンパク質（ＳＨ３ｂｇａＹ）は、加水分解活性を全く有さず、逆に、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの自己溶菌及びＬｙｓｇａＹの加水分解活性を阻害するものであった。
従って、ＳＨ３ｂｇａＹの抗菌活性は、ＬｙｓｇａＹの加水分解活性とは全く異なることが明らかとなった。
尚、ＳＨ３ｂｇａＹの抗菌活性は、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの対数増殖期における細胞分裂の最終段階である娘細胞の分離の阻害によるものと考えられるものであった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、ＳＨ３ｂｇａＹをコードする遺伝子部分を含むＤＮＡが組み込まれた組換えプラスミドを鋳型とし、ＳＨ３ｂｇａＹをコードする遺伝子が得られるよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。ＳＨ３ｂｇａＹをコードする遺伝子部分を含むＤＮＡは、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの菌体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ等で切断することにより得ることができる。得られたＤＮＡを用い、公知の方法、例えばサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）等に従って、前記ＤＮＡが組み込まれた組換えプラスミドを作成することができる。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＬｙｓｇａＹをコードする遺伝子のＣ末端部分と他の溶菌酵素の細胞壁認識ドメイン（ＳＨ３ｂ）をコードする遺伝子との相同性から予測して設計することができる。
【０００９】
得られたＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドを作成し、該組換えプラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体からタンパク質の誘導発現を行うことにより、約９ｋＤａの分子量のＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を得ることができる。
得られたＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の植物病原細菌及び標準菌株に対する抗菌活性を評価したところ、使用した全ての菌株に対して強い抗菌活性を示した。
【００１０】
従って本発明の遺伝子の１つの例は、９５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする領域に相当する以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡである。以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡからなる遺伝子も、抗菌活性を示す限り本発明に包含される。
【００１１】
また、本発明の遺伝子の他の例は、下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるもの、および下記する配列番号１のヌクレオチド番号１から２８
８に表されるヌクレオチド配列と９５％以上のヌクレオチド配列相同性を示し、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡからなるものが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ等が含まれる。
【００１２】
本発明の遺伝子のさらなる例は、前記９５個のアミノ酸に相当する以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。下記する配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も本発明に包含される。ここで、各アミノ酸に対応するコドンは任意に選択でき、また例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる。
【００１３】
他方、本発明のタンパク質の例としては、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質も本発明に包含される。
【００１４】
また、以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、抗菌活性を有する限り本発明に包含される。ここで数個とは、１０個を超えない数であり、好ましくは５個以下である。
【００１５】
ここで、あるＤＮＡが以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズするか否かは、例えば以下の手順により決定できる：先ず、目的とするＤＮＡをランダムプライマー法、ニックトランスレーション法等に従いプローブを用いて標識する。次いで、ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡを公知の方法、例えばニトロセルロース膜やナイロン膜等に吸着させ、加熱あるいは紫外線照射により固相化する。その膜をその後、例えば６×ＳＳＣ、５％デンハート溶液および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むプレハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、５５℃で４時間以上保温する。ここで先に作成した標識プローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最終比活性１×１０６ｃｐｍ／ｍＬとなるように添加し、６０℃で一晩保温する。膜を５７℃で５分間洗浄する操作を５回繰り返し、さらに５７℃で２０分間洗浄後、オートラジオグラフィーを行うことにより、ハイブリダイズしたか否かを判定することができる。
【００１６】
ハイブリダイゼーションの条件は前記条件に限定されず、ストリンジェントな条件下であればよい。本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとは、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことからなるハイブリダイゼーションを指す。さらに０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うこともできる。
【００１７】
また、本発明のタンパク質が抗菌活性を有するか否かは、通常の方法により評価できる。より詳しくは、以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた抗菌活性試験を、アミノ酸の欠失、置換および／または付加により生成した改変タンパク質に対して行うことにより、該改変タンパク質の抗菌活性の有無を決定できる。
【００１８】
また本発明のＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミドも本発明に包含される。該ベクターとしては、一般に知られている様々なベクターを使用でき、原核細胞用ベクター、真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクター等があるが、これに限定されな
い。このような組換えプラスミドにより、原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換できる。さらに、適当なプロモーター配列および／または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いるか、もしくはそのような配列を導入することにより、発現ベクターとすることができ好ましい。
【００１９】
本発明の組換えプラスミドを各種細胞に導入することにより得られる宿主細胞も本発明に包含される。該宿主細胞として好ましいのは、グラム陽性細菌、特に大腸菌、乳酸菌、枯草菌、ブドウ球菌等である。
【００２０】
本発明のタンパク質は、前記組換えプラスミドにより形質転換した前記宿主細胞を、抗菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養し、該培養により得た培養物から抗菌活性を有するタンパク質を回収することにより製造できる。宿主細胞の培養方法およびタンパク質の回収方法としては従来一般に知られている方法が使用可能であり、例えば以下の実施例の何れかに詳述されるのと同じかまたはそれに準じた方法により行うことができる。
【００２１】
本発明はまた、本発明のタンパク質を有効成分として含有してなる組成物に関する。該組成物は、細菌を死滅させることが必要となる様々な用途に適用できる。該用途としては、具体的には、研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤、医療用抗生物質等が挙げられる。
【００２２】
以下、本発明を具体的な例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定することを意図しない。
【実施例１】
【００２３】
ＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子の単離
ＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子を含む組換えプラスミドの作成は、特開２００６−１２１９９３号公報にて記述した組み換えプラスミドｐ１１９ｇａＹ３を用いて、以下のサンブルック等の方法（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）に従って調製した。
組み換えプラスミドｐ１１９ｇａＹ３(約０．０１μｇ）を鋳型とし、ＧＹ１ＳＨ３２
Ｒプライマ（5'-AAAGCTCATATGTCTGTTGCACAATCAGCATCAGAA-3'）およびＭ１３ＦＷプライマ（5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA-3')を用い、ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、ＰＣＲ法により、ＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子を含むＤＮＡ断片（４８０ｂｐ）を得た。
上記ＤＮＡ断片をＮｄｅＩで完全分解し、４７３ｂｐのＤＮＡ断片を回収、精製した。プラスミドｐＥＴ１５ｂ（５７０８ｂｐの大腸菌ベクター、Ａｍｐr、ｐＴ７）をＮｄｅ
Ｉ，ＢａｍＨＩで完全分解した後、得られた線状ＤＮＡのＢａｍＨＩサイトをＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢ社製）を用いて末端平滑化した。引き続き、該４７３ｂｐＤＮＡ断片と線状プラスミドｐＥＴ１５ｂを、ＤＮＡ結合酵素（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢ社製）を用いた１６℃、６時間の反応により結合させ、組換えプラスミドｐＨＳＨｇａＹ２（６１７０ｂｐ）を得た。
【実施例２】
【００２４】
プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２（６１７０ｂｐ）の塩基配列の確認
組換えプラスミドｐＨＳＨｇａＹ２（６１７０ｂｐ）の塩基配列は、Thermo Sequenase
Cy5.5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (アマシャム社製)を用いてサイクルシー
ケンス反応を行い、Long Read Tower シーケンサ（ベリタス社製）により泳動、解析した。本法によりプラスミドｐＨＳＨｇａＹ２の挿入断片（４７３ｂｐ）の全塩基配列を決定したところ、その配列は、鋳型にしたプラスミドｐ１１９ｇａＹ３並びに実施例１のプラ
イマの配列に一致し、目的のＳＨ３ｂｇａＹ遺伝子を含む配列であった。プラスミドｐ１１９ｇａＹ３並びにｐＨＳＨｇａＹ２から発現されるタンパク質の領域を表した模式図を図１に示す。プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２から発現されるＳＨ３ｂｇａＹタンパク質は、プラスミドｐ１１９ｇａＹ３から発現されるｌｙｓｇａＹタンパク質（特開２００６−１２１９９３号公報）のＣ末端部分のみを有するものであることが判る。
【実施例３】
【００２５】
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の調製と確認
プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２を、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（ｈｓｄＳ、ｇａｌ〔λｃＩｔｓ８５７、ｉｎｄ１、Ｓａｍ７、ｎｉｎ５、ｌａｃＵＶ５−Ｔ７ ｇｅｎｅ１〕）にエレクトロポーレーション法により導入した。詳細には、先ず大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３をＬＢ（Luria-Bertain）培地を用い、３７℃で培養した。一晩（１２時間）経過後、培養菌２ｍ
Ｌを新鮮なＬＢ培地１００ｍＬに植え継ぎ、３７℃で培養した。菌数が５×１０8／ｍＬ
に達したとき、上記と同様の遠心分離法で集菌した。菌体を滅菌水で３度洗浄し、１００μＬの蒸留水に懸濁した。該懸濁液に１μＬの組換えプラスミドＤＮＡ（０．５μｇ／μＬ）とＰＥＧ６０００（１０％）を添加した。大腸菌体内への該組換えプラスミドの導入は、ジーンパルサー（登録商標、バイオラッド社製）を用い、電圧１．７５ｋＶ／ｃｍ、静電容量２５μＦ、抵抗６００Ωの電気パルス条件を用いたエレクトロポレーション法で行った。電気パルス処理後、ＬＢ培地を４倍量加え、３７℃で３０分間保温し、形質転換体を得た。
得られた形質転換体を１００ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン３０μｇ／ｍＬを含む）で培養した。対数期中期（濁度０．３）において、培養液中に終濃度０．４ｍＭになるようＩＰＴＧを加えて、さらに４時間培養した。その後集菌し、結合緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）で１回洗浄後、同緩衝液５ｍＬに懸濁した。この懸濁液を、超音波破砕装置（ソニックスアンドマテリアル社製）で、１回あたり３０秒づつ、計６回処理した。処理液は、遠心分離法（冷却遠心機、日立製作所製：１２０００ｒｐｍ、４℃、１０分）により不溶成分を除去した。
この菌体破砕上清を、ニッケルキレートアフィニティーカラム（ＧＥヘルスケア社製、カラム容量１mL）に供した。上記の結合緩衝液で洗浄後、溶出緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭＮａＣｌ、６００ｍＭイミダゾール）を、０−１００％の範囲で直線濃度勾配をつけて流して溶出した。ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を含む分画を収集し、精製ＳＨ３ｂｇａＹとした。引き続き、該精製ＳＨ３ｂｇａＹを0.05M酢酸buffer（ PH=5.0）にて透析処理し、４℃にて保存した。
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の大腸菌での誘導発現、および精製経過を、ＳＤＳ電気泳動（１５％ゲル濃度）により分析した結果を図２に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は誘導前の大腸菌、レーン３はＩＰＴＧにより発現誘導した大腸菌、レーン４は、タンパク質発現誘導した大腸菌の、菌体破砕上清、レーン５は精製ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を示す。この結果から、プラスミドｐＨＳＨｇａＹ２により、約９ｋＤａの分子量のＳＨ３ｂｇａＹタンパク質が誘導され、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフにより、１段階のカラム操作でＳＨ３ｂｇａＹタンパク質が精製できることがわかる。
【実施例４】
【００２６】
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の抗菌活性評価
ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質の植物病原細菌及び標準菌株に対する抗菌活性を評価した。下記の供試菌株をＣＳＭ培地（YEAST NITROGEN BASE (DIFCO No.233520) 0.85 g、CSM (BIO 101 No.4500-022) 0.31 g、D-glucose 10g/ 0.1 Mリン酸buffer (pH 5.0) ）１０ｍＬにて２５℃３日間培養し、培養菌液を得た。本菌液をCSM培地で１００倍希釈した後、９
６穴タイタープレート（ヌンク社製）に１８０μＬ／ウェルずつ分注し、さらに0.05M酢
酸buffer（ PH=5.0） にて所定の濃度となる様希釈した試験サンプルを２０μＬ／ウェルずつ分注した。本プレートを２５℃にてインキュベートし、４日後の供試菌株の生育を目
視にて調査してサンプル無添加処理区と比較することにより生育阻害率を算出した。
Ecc：Erwinia carotovora subsp.carotovora (MAFF301052)
Bg：Burkholderia glumae (MAFF301169)
Rs：Ralstonia solanacearum (MAFF301485)
Xc：Xanthomonas campestris pv.citri (MAFF301078)
Bs：Bacillus subtilis (PCI-219)
Sa：Staphylococcus aureus (IFO-12732)
生育阻害率（％）を表１に示した。
【表１】
表１に示す試験結果から明らかなように、本発明のタンパク質であるＳＨ３ｂｇａＹは６種全ての菌株に対して抗菌活性を示した。特に、Burkholderia glumae、Ralstonia solanacearumに対しては、陽性対照であるクロラムフェニコールよりも強い抗菌活性を示し
た。これらの結果より、ＳＨ３ｂｇａＹが広い抗菌スペクトルを有することを確認できた。
ＳＨ３ｂｇａＹは、ＬｙｓｇａＹと全く異なり、加水分解活性を全く示さなかった。
そして、逆に、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの自己溶菌及びＬｙｓｇａＹの加水分解活性を阻害した。
従って、ＳＨ３ｂｇａＹの抗菌活性は、ＬｙｓｇａＹの加水分解活性とは全く異なるものであった。
尚、ＳＨ３ｂｇａＹは、Lactobacillus gasseri JCM1131Tの対数増殖期における細胞分裂の最終段階である娘細胞の分離を顕著に阻害した。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例２において作成したプラスミドから発現されるタンパク質の領域を表す。
【図２】図２は、実施例３において形質転換大腸菌が産生したタンパク質を精製した際の電気泳動結果の写真を表す。レーン１は分子量マーカー、レーン２は誘導前の大腸菌、レーン３はＩＰＴＧにより発現誘導した大腸菌、レーン４は、タンパク質発現誘導した大腸菌の、菌体破砕上清、レーン５は精製ＳＨ３ｂｇａＹタンパク質を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
atg tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
【請求項２】
以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項３】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質、
ｄ）請求項１記載のＤＮＡによりコードされ、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。
【請求項５】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項４記載の組換えプラスミド。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
グラム陽性細菌であることを特徴とする、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項８】
大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項９】
以下の工程１）および２）を含む、請求項３に記載のタンパク質の製造方法；
１）請求項６ないし８のうちの何れか１項に記載の宿主細胞を、抗菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、抗菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
【請求項１０】
請求項９記載の製造方法により得られるタンパク質。
【請求項１１】
請求項３記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
【請求項１２】
研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、請求項１１記載の組成物。
【請求項１】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子；
ａ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
ｂ）以下の配列番号１のヌクレオチド番号１から２８８に表されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
ｃ）前記ａ）記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ、
ｄ）前記ａ）記載のＤＮＡと９５％のヌクレオチド配列相同性を示し、抗菌活性を有するタンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ。
atg tct gtt gca caa tca gca tca gaa aaa aca tgg act gat gta caa ggt atg act tgg cat gaa gaa cat ggt act ttc atc act ggt gga gcg att aat ctt cgc tgg ggc gct aat acg caa agc aca ctg att acc acc tta cca gca ggt tca gaa gtt aaa tac aat gct tgg gct aga gat agt gct ggg cgt gta tgg tta cag caa ccg aga gaa aat ggt aag aat ggc tat tta gtt ggt cgt gtc ggc agt gag ccg tgg gga act ttc aaa taa
【請求項２】
以下のａ）ないしｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項３】
以下のａ）ないしｄ）のいずれか１つのタンパク質；
ａ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
ｂ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）以下の配列番号２に表されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、抗菌活性を有するタンパク質、
ｄ）請求項１記載のＤＮＡによりコードされ、抗菌活性を有するタンパク質。
Met Ser Val Ala Gln Ser Ala Ser Glu Lys Thr Trp Thr Asp Val Gln Gly Met Thr Trp His Glu Glu His Gly Thr Phe Ile Thr Gly Gly Ala Ile Asn Leu Arg Trp Gly Ala Asn Thr Gln Ser Thr Leu Ile Thr Thr Leu Pro Ala Gly Ser Glu Val Lys Tyr Asn Ala Trp Ala Arg Asp Ser Ala Gly Arg Val Trp Leu Gln Gln Pro Arg Glu Asn Gly Lys Asn Gly Tyr Leu Val Gly Arg Val Gly Ser Glu Pro Trp Gly Thr Phe Lys
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子を含む組換えプラスミド。
【請求項５】
発現ベクターであることを特徴とする、請求項４記載の組換えプラスミド。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
グラム陽性細菌であることを特徴とする、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項８】
大腸菌、乳酸菌、枯草菌またはブドウ球菌であることを特徴とする、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項９】
以下の工程１）および２）を含む、請求項３に記載のタンパク質の製造方法；
１）請求項６ないし８のうちの何れか１項に記載の宿主細胞を、抗菌活性を有するタンパク質の産生が可能な条件下で培養する工程、
２）前記工程１）における培養により得た培養物から、抗菌活性を有するタンパク質を回収する工程。
【請求項１０】
請求項９記載の製造方法により得られるタンパク質。
【請求項１１】
請求項３記載のタンパク質を有効成分として含有する組成物。
【請求項１２】
研究用試薬、食品添加物、防腐剤、工業用殺菌剤、農業用殺菌剤または医療用抗生物質であることを特徴とする、請求項１１記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−９９６３５（Ｐ２００８−９９６３５Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８６４３２（Ｐ２００６−２８６４３２）
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【出願人】（０００００３９８６）日産化学工業株式会社 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【出願人】（０００００３９８６）日産化学工業株式会社 (510)
【Ｆターム（参考）】
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