板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法
【課題】従来技術では得られなかったｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶を工業的規模で製造するための技術の提供。
【解決手段】Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ヒドロキシアパタイトの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させ、次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取し、次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ヒドロキシアパタイト単結晶を得ることを特徴とする板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
【解決手段】Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ヒドロキシアパタイトの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させ、次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取し、次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ヒドロキシアパタイト単結晶を得ることを特徴とする板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ面配向した板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアパタイト（以下、ＨＡｐと略記する）は、一般に、結晶系が六方晶系に属し、ｃ軸方向に成長した結晶面（以下、この結晶面をａ面という）と、ａ軸およびｂ軸方向に成長した結晶面（以下、この結晶面をｃ面という）とをもつ。ａ面は正に帯電し、ｃ面は負に帯電している。この電荷の異なる２つの結晶面をもつため、ＨＡｐは、酸性基あるいは塩基性基を持つ化合物を吸着保持することができる。このような吸着特性を有するＨＡｐは、タンパク質などの生理活性物質の吸着材（例えば、クロマトグラフィ用充填材）に利用されている。
【０００３】
近年、ＨＡｐの結晶面を選択的に配向させて、その吸着特性に選択性を付与する試みがなされている。例えば、非特許文献１には、均一沈殿法により、ａ面配向した繊維状ＨＡｐを合成し、そのａ面配向した繊維状ＨＡｐが塩基性タンパク質（リゾチーム）よりも酸性タンパク質（アルブミン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸）をより多く吸着することが報告されている。
【０００４】
また、ｃ面配向した板状ＨＡｐの研究も進められている。特許文献１には、リン酸カルシウム粒子を、アミノ酸水溶液中にて加熱して、ＨＡｐに転化し、次いで該ＨＡｐをａ軸およびｂ軸方向に生長させることを特徴とする板状ＨＡｐの製造方法が開示されている。
【０００５】
さらに、非特許文献２には、ＣａＣＯ３、Ｈ３ＰＯ４、尿素およびウレアーゼを含む水溶液を５０℃で２４時間インキュベートし、溶液から均一な生成物を沈殿させ、次いでこの沈殿物に水熱処理を施してｃ面配向した板状ＨＡｐを合成する方法が開示されている。
ｃ面配向したＨＡｐは、前記ａ面配向した繊維状ＨＡｐとは異なり、酸性タンパク質よりも塩基性タンパク質をより多く吸着する吸着材として期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本セラミックス協会第１回生体関連セラミックス討論会講演要旨集（１９９７）１１頁
【非特許文献２】H. Yamamoto and M. Aizawa, Archives of Bioceramics Reseach, 6(2006), 212-215
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１５５９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述したａ面配向した繊維状ＨＡｐやｃ面配向した板状ＨＡｐを吸着材として用い、酸性タンパク質や塩基性タンパク質などの生理活性物質の分析、あるいは精製・単離を行う上で、使用するＨＡｐは単結晶であることが望ましい。多結晶のＨＡｐの場合、表面の電荷が均一にならず、生理活性物質に対する特異的な吸着性能が不十分であったり、分離能が悪くなるなどの問題がある。
しかしながら、前記特許文献１に開示された従来技術で得られた板状ＨＡｐは、Ｘ線回折等で結晶構造を調べた結果、多結晶のＨＡｐが主体であることが判明した。
また、前記非特許文献２に開示された従来技術で得られた板状ＨＡｐについても、単結晶に近い構造を有しているものの、多結晶パターンが混在していることが判明した。
このように、従来技術においては、ｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶を効率的に得ることができなかった。
【０００９】
本発明は、前記事情に鑑みてなされ、従来技術では得られなかったｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶を効率的に製造するための技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するため、本発明は、Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ＨＡｐの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させ、次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取し、次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ＨＡｐ単結晶を得ることを特徴とする板状ＨＡｐ単結晶の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明の板状ＨＡｐ単結晶の製造方法において、前記酸性水溶液中のＣａ２＋イオンの濃度を０．００２５〜０．０１００ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ＰＯ４３−イオンの濃度を０．００１５〜０．００６０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、尿素の濃度を１．０〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ウレアーゼの濃度を前記尿素１当量に対して０．２倍当量から３倍当量の範囲とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、板状ＨＡｐ単結晶を効率よく製造することができる。
本発明により得られる板状ＨＡｐ単結晶は、ｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶であり、これを用いて塩基性タンパク質などの生理活性物質の分析、あるいは精製・単離を行う場合に、多結晶ＨＡｐに比べて高い吸着性能及び分離性能が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で行ったＨＡｐ合成の手順を示すフロー図である。
【図２】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図３】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図４】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図５】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図６】尿素濃度変動の実験における気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図７】尿素濃度変動の実験における気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図８】尿素濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図９】尿素濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１０】ウレアーゼ添加量変動の実験おける気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１１】ウレアーゼ添加量変動の実験おける気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１２】ウレアーゼ添加量変動の実験おける水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１３】ウレアーゼ添加量変動の実験おける水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１４】溶液総濃度変動の実験における気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１５】溶液総濃度変動の実験における気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１６】溶液総濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１７】溶液総濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１８】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＴＥＭ画像及び電子線回折画像である。
【図１９】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）の格子像である。
【図２０】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＥＤＸ図である。
【図２１】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図２２】気液界面析出物の経時変化を示す画像である。
【図２３】気液界面析出物の経時変化のＸＲＤパターンである。
【図２４】気液界面析出物の経時変化のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図２５】気液界面析出物の経時変化のＳＥＭ画像である。
【図２６】ｐＨ変動調査用装置の概略構成図である。
【図２７】ｐＨの経時変化図である。
【図２８】気液界面析出物の加熱後のＸＲＤパターンである。
【図２９】気液界面析出物の加熱後のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図３０】気液界面析出物の加熱による相変化のＳＥＭ画像である。
【図３１】気液界面析出物の加熱による表面変化のＴＥＭ画像である。
【図３２】サンプルＮｏ．２の下層生成物のＸＲＤパターンである。
【図３３】サンプルＮｏ．２の下層生成物のＳＥＭ画像である。
【図３４】サンプルＮｏ．２の下層生成物（水熱処理後）のＴＥＭ写真および電子線回折画像である。
【図３５】サンプルＮｏ．２の下層生成物（水熱処理後）のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図３６】凝集体の上部のＳＥＭ画像である。
【図３７】凝集体の下部のＳＥＭ画像である。
【図３８】凝集体の側面のＳＥＭ画像である。
【図３９】凝集体の上部のＴＥＭ画像である。
【図４０】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ１を説明するための概略図である。
【図４１】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ２を説明するための概略図である。
【図４２】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ３を説明するための概略図である。
【図４３】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ４を説明するための概略図である。
【図４４】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ５を説明するための概略図である。
【図４５】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ６を説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の板状ＨＡｐ単結晶の製造方法は、
・Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を調製する工程（１）と、
・次いで、該水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ＨＡｐの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させる工程（２）と、
・次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取する工程（３）と、
・次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ＨＡｐ単結晶を得る工程（４）とを備えている。
【００１５】
前記工程（１）において、酸性水溶液の調製は、Ｃａ化合物とＰ化合物とをＨＡｐの合成に好適なモル比（例えば、Ｃａ／Ｐ＝１．６７）となるように秤量、採取し、尿素と共に精製水に加えて混合し、この水中に硝酸や塩酸などの無機酸、あるいは酢酸、クエン酸、乳酸などの有機酸を加え、ｐＨを酸性側にしてＣａ化合物、Ｐ化合物及び尿素を溶解させ、その後、適当量のウレアーゼを加えて調製することが好ましい。
【００１６】
前記酸性水溶液の調製に用いるＣａ化合物としては、酸性水溶液に溶解するものであればよく、特に制限されないが、ＨＡｐ結晶の析出や単結晶の成長を妨害するような妨害成分を含まないＣａ化合物を用いることが好ましく、例えば、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、乳酸カルシウム、酢酸カルシウムなどが好ましい。
【００１７】
前記酸性水溶液の調製に用いるＰ化合物としては、酸性水溶液に溶解するものであればよく、特に制限されないが、ＨＡｐ結晶の析出や単結晶の成長を妨害するような妨害成分を含まないＰ化合物を用いることが好ましく、例えば、オルトリン酸、ポリリン酸、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸三アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素アンモニウムなどが好ましい。
【００１８】
前記酸性水溶液の調製に用いるＣａ化合物とＰ化合物との比率は、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２で表されるヒドロキシアパタイトにおけるＣａとＰのモル比（Ｃａ／Ｐ）と同じか又は近似した値になるように計算して秤量、採取することが望ましい。
また、前記酸性水溶液中のＣａ２＋イオン濃度及びＰＯ４３−イオン濃度は特に限定されないが、綺麗な板状ＨＡｐ単結晶を合成するには、Ｃａ２＋イオンが０．００２５〜０．０１００ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲、ＰＯ４３−イオンが０．００１５〜０．００６０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とすることが好ましい。
【００１９】
前記酸性水溶液の調製に用いる尿素は、ウレアーゼにより分解されて生じるアンモニウムイオンによって酸性水溶液のｐＨが上昇し、ＨＡｐの析出に好適な中性〜弱アルカリ域に徐々に移行させるために好適な量が添加される。尿素の添加量は、酸性水溶液の酸性度などに応じて適宜設定されるが、通常は０．５〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲、好ましくは１．０〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とすることが好ましい。
【００２０】
前記酸性水溶液の調製に用いるウレアーゼは、酸性水溶液中の尿素に作用して加水分解し、アンモニウムイオンを生じて酸性水溶液のｐＨを上昇させ、ＨＡｐの析出に好適な中性〜弱アルカリ域に徐々に移行させるために好適な量が添加される。ウレアーゼの添加量は、特に限定されないが、綺麗な板状ＨＡｐ単結晶を合成するには、ウレアーゼを前記尿素１当量に対して０．２倍当量から３倍当量の範囲で添加することが好ましい。ここで、ウレアーゼ（酵素活性：１４０ｕｎｉｔ・ｍｇ−１）の１当量は、尿素の１当量を２４時間以内にすべて加水分解するに要する量に相当し、０．２倍当量は０．５４７ｃｍ３に、３倍当量は８．２０２ｃｍ３にそれぞれ相当する。
【００２１】
前記工程（１）において酸性水溶液を調製後、この酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ＨＡｐの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させる工程（２）を行う。この工程（２）を行うための容器や保持条件の詳細については、前述したＨＡｐの結晶生成・成長が可能であれば特に限定されない。ただし、保持温度は、２０〜５５℃の範囲、好ましくはウレアーゼの至適温度近辺に設定することが好ましい。また、反応時間は、２４〜１２０時間の範囲とすることが好ましい。
【００２２】
この工程（２）において、時間の経過とともに、容器の気液界面付近と、液の下層とにＨＡｐの結晶が析出し、成長していくが、本発明の製造方法において対象となる板状ＨＡｐ単結晶は、容器の気液界面付近に浮上した状態で成長していく。
【００２３】
次に、前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取する工程（３）を行う。この析出物の採取方法は特に限定されず、化学分野や製薬分野などで用いられる従来公知の採取法を適用して行うことができる。
容器から分離採取した析出物は、精製水等で十分に洗浄し、乾燥される。
【００２４】
このように得られた析出物は、Ｘ線回折等で調べると、製造目的とするＨＡｐの結晶以外に、リン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）などの他のリン酸カルシウム化合物が混在している。そこで、前記析出物に水熱処理を施してＨＡｐの単一相に転化して、目的とする板状ＨＡｐ単結晶を得る工程（４）を行う。
【００２５】
この水熱処理の条件は、リン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）などの他のリン酸カルシウム化合物をＨＡｐの単一相に転化できればよく、特に限定されないが、通常は温度１００〜２００℃の範囲、処理時間１〜３時間程度の条件で行うことが好ましい。この水熱処理により、目的とする板状ＨＡｐ単結晶が得られる。
【００２６】
本発明の製造方法によって得られる板状ＨＡｐ単結晶は、図１３等に示すように、比較的大きく明瞭な板状をなしており、図１２のＸＲＤパターンからわかるようにＨＡｐの単一相から形成されている。この板状ＨＡｐ単結晶は、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強く、ｃ面配向したＨＡｐ単結晶であることが実証された。
【００２７】
本発明の製造方法によって得られる板状ＨＡｐ単結晶は、ｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶であり、これを用いて塩基性タンパク質などの生理活性物質の分析、あるいは精製・単離を行う場合に、多結晶ＨＡｐに比べて高い吸着性能及び分離性能が得られる。
【実施例】
【００２８】
１．実験
（１−１）混合溶液の調製方法
まず、炭酸カルシウムとオルトリン酸及び尿素からなる懸濁液（１０００ｃｍ３）を調製し、２時間撹拌した。この混合懸濁液に、硝酸（１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３）をｐＨ３．００になるように添加した。更に１時間撹拌し、ウレアーゼを添加した。
出発材料の炭酸カルシウム、オルトリン酸（Ｈ３ＰＯ４）、尿素およびウレアーゼ（１４０ｕｎｉｔ・ｍｇ−１）の配合割合を表１に示す。なお、ウレアーゼの添加量は、０．１質量％水溶液の添加量で表す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
（１−２）混合溶液からの合成
前記（１−１）で得られた混合溶液（１０００ｃｍ３）を外径１２．３ｃｍのガラスシャーレ８個（各シャーレに１２５ｃｍ３）に入れ密封し、インキュベーターの中で５０℃、９６時間の反応を行った。反応後、吸引ろ過器で液面上に浮かぶ生成物だけを吸引ろ過・洗浄し、１１０℃、２４時間乾燥し、合成粉体を得た。ここでの合成の概略を図１に示す。
【００３１】
（１−３） 水熱処理
水熱処理では反応器にフッ素樹脂製内筒を有するオートクレーブ（耐圧硝子工業社製ＴＶＳ−１型（容積５０ｃｍ３））を用いた。前記（１−２）で得られた合成粉末０．１ｇを５０ｃｍ３の純水中に加え、１２０℃、２．５時間加熱して水熱処理を行った。その後、処理物をろ過・洗浄して１１０℃、４８時間で乾燥した。
【００３２】
２．実験結果
（２−１）気液界面の析出物のキャラクタリゼーション
（２−１−１）Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動（表１中のＮｏ．１−Ｎｏ．４）
尿素の濃度を１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３、添加する０．１質量％ウレアーゼ水溶液の体積を当量である２．７３４ｃｍ３に固定し、ＣａＣＯ３，Ｈ３ＰＯ４の濃度をパラメーターとして変動させ、５０℃，９６時間で加熱した。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、それぞれろ過・乾燥を行った。
なお、以下の記載において、Ｘ線回折法（又は装置）はＸＲＤと略記し、走査型電子顕微鏡法（又は装置）はＳＥＭと略記し、透過型電子顕微鏡法（又は装置）はＴＥＭと略記し、エネルギー分散型Ｘ線分析法（又は装置）はＥＤＸと略記し、赤外吸光法（又は装置）はＦＴ-ＩＲと略記する。
【００３３】
図２に界面の析出物のＸＲＤパターンを示す。図中、ＯＣＰはリン酸オクタカルシウム、ＨＡｐはヒドロキシアパタイトを表す。アパタイトの特徴パターンのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生成物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であることが確認できた。また、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−高濃度の場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、ＯＣＰの特徴ピークが非常に強いので、主生成物はＯＣＰであることが分かった。一方、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−低濃度の場合（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２）、ＯＣＰの特徴ピークが弱くなり、代わりにＨＡｐの２６°（（００２）面）および５３°（（００４）面）の特徴ピークが発達したことにより、主生成物はｃ面が多く露出しているＨＡｐであることが推察できる。
【００３４】
図３には、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。Ｃａ２＋，ＰＯ４３−高濃度の場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、析出物は短冊状あるいは周囲が崩れた板状の形態を呈したが、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−低濃度の場合（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２）、析出物形態は凝集しているものの綺麗な板状となった。
【００３５】
この析出物に対して１２０℃、２．５時間で水熱処理を行った。
水熱処理後のＸＲＤパターンを図４に示す。すべての粉体は水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐの単一相に転化した。Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度が低いほどＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなる傾向が見られる。また、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−高濃度の場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、ＨＡｐのａ面に相当する３２°（（３００）面）の特徴ピークも発達していることが検出された。
【００３６】
図５には水熱処理後のＮｏ．１〜Ｎｏ．４の界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度が低い場合（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２）生成物の形態が処理前と比べて多少崩れるが、板状である（ａ軸配向）ことが確認できた。また、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度が高い場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、生成物は板状のものではなく、短冊状の形態（ｃ軸配向）となった。ＳＥＭにより観察された生成物の特異的な配向性は、図３のＸＲＤの結果と一致している。
【００３７】
表２には、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の各条件における収量および収率を示す。収量および析出物形態から考えると、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３（Ｎｏ．２）は、Ｃａ，Ｐの最適濃度条件であると判断できる。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（２−１−２）尿素濃度変動（表１中のＮｏ．２，Ｎｏ．５−Ｎｏ．７）
前記（２−１−１）の実験結果より、Ｎｏ．２のＣａＣＯ３，Ｈ３ＰＯ４の濃度条件では効率よく高い配向性を持つ板状ＨＡｐを合成したため、ここではＣａＣＯ３，Ｈ３ＰＯ４の濃度およびウレアーゼの添加量を、それぞれ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３および２．７３４ｃｍ３に固定し、尿素の濃度をパラメーターとして変動させ、５０℃、９６時間で加熱した。なお、ウレアーゼはＮｏ．２の実験条件が当量添加となり、Ｎｏ．５では、ウレアーゼが２倍過剰、Ｎｏ．６及びＮｏ．７では、それぞれ２／３倍および０．５倍過剰となる。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、濾過・乾燥を行った。
【００４０】
図６に界面の析出物ＸＲＤパターンを示す。尿素濃度が低すぎる場合（Ｎｏ．５）は、気液界面では析出物が得られなかった。それは、尿素の濃度が不十分なので、溶液中のｐＨが上昇しにくいためであると考えられる。Ｎｏ．２，Ｎｏ．６，Ｎｏ．７の析出物に対してＸＲＤによりキャラクタリゼーションを行ったところ、アパタイトの特徴ピークのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生成物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であることが確認できた。
【００４１】
図７には界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。すべての生成物（Ｎｏ．２，Ｎｏ．６，Ｎｏ．７の析出物）は凝集した板状の析出物形態を持っており、尿素の濃度が低いほど、析出物のサイズが大きくなることが確認された。
【００４２】
界面の析出物（Ｎｏ．２，Ｎｏ．６，Ｎｏ．７の析出物）に対して１２０℃、２．５時間で水熱処理を行った。
水熱処理後のＸＲＤパターンを図８に示す。すべての粉体は水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなるＨＡｐの単一相に転化した。
【００４３】
水熱処理後の各粉体のＳＥＭ画像を図９に示す。すべての粉体は板状の形態を維持したが、尿素濃度の上昇とともに、生成した析出物の板状形態が崩れて悪くなる傾向が見られた。
表３には各条件における収量および収率を示す。収量および析出物形態から考えると、１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３（Ｎｏ．２）が尿素の最適値であると考えられる。
【００４４】
【表３】
【００４５】
（２−１−３）ウレアーゼ添加量の変動（表１中のＮｏ．２，Ｎｏ．８−Ｎｏ．１１）
前記（２−１−１）及び前記（２−１−２）の実験結果より、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−および尿素濃度をそれぞれ最適値に固定し、ウレアーゼの添加量をパラメーターとして変動させ、５０℃、９６時間で加熱した。液面の析出物とシャーレ底部の生成物に分けて、濾過・乾燥を行った。
図１０に生成物のＸＲＤパターンを示す。アパタイトに特徴的なピークのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生成物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であることが確認できた。また、アパタイトの２６°（（００２）面）および５３°（（００４）面）の特徴ピークが発達したことにより、生成したアパタイトはｃ面が多く露出していることが推察できる。
【００４６】
図１１には気液界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。水熱処理前では、生成物は何れも板状の形態であり、ウレアーゼの添加量の減少と共に、析出物のサイズが大きくなる傾向が見られた。０．１質量％ウレアーゼの添加量が０．５４６８ｃｍ３のとき（Ｎｏ．８）、最も配向性が良くかつサイズが大きな析出物が得られた。
【００４７】
図１２には、水熱処理後の各析出物のＸＲＤパターンを示す。水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなるＨＡｐの単一相に転化した。
【００４８】
図１３には、水熱処理後の各析出物のＳＥＭ画像を示す。水熱処理後、すべてのサンプルの配向性はやや低くなったことが確認され、図１２の水熱処理後のＸＲＤパターンの変化と一致している。ウレアーゼ添加量は０．５４６８ｃｍ３のとき（Ｎｏ．８）、最も配向性が良くかつサイズが大きな析出物が得られた。
【００４９】
表４には各条件における収量および収率を示す。収量及び析出物形態から考えると、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−および尿素濃度をそれぞれ最適値に設定した場合、反応系の尿素に対する当量添加である２．７３４ｃｍ３（Ｎｏ．２）がウレアーゼの最適添加量であると判断した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
（２−１−４）溶液総濃度の変動（表１中のＮｏ．２，Ｎｏ．１２−Ｎｏ．１４）
前記（２−１−１）、（２−１−２）及び（２−１−３）の実験結果より、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−、尿素濃度およびウレアーゼの添加量の最適比は、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３、尿素 １．０ｍｏｌ・ｄｍ−３、ウレアーゼ ２．７３４ｃｍ３となる。ここでは、各試薬の濃度および添加量の比をこのように固定し、溶液の総濃度を変動させて実験を行った。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、濾過・乾燥を行った。
【００５２】
図１４に、生成物のＸＲＤパターンを示す。アパタイトに特徴的なピークのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生産物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であり、総濃度の増大に伴い、４°付近のＯＣＰの解析強度も強くなることが確認できた。また、アパタイトの２６°（（００２）面）および５３°（（００４）面）の特徴ピークが発達したことにより、生成したアパタイトのｃ面が多く露出していることが推察される。
【００５３】
図１５に、気液界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。生成物の何れも板状の形態であり、溶液の総濃度の増大と共に、析出物のサイズが小さくなる傾向が見られた。
【００５４】
図１６に、前記各析出物の水熱処理後のＸＲＤパターンを示す。水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなるＨＡｐの単一相に転化した。
【００５５】
図１７に前記水熱処理後の各析出物のＳＥＭ画像を示す。溶液の総濃度の増大とともに、生成物の析出物サイズが小さくなり、析出物形態も崩れて悪くなる傾向が見られた。
【００５６】
また、各濃度条件における生成物の収量および収率を表４に示す。析出物形態および収量から総合的に考えると、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３および尿素 １．０ｍｏｌ・ｄｍ−３に、さらに０．１質量％ウレアーゼ水溶液を２．７３４ｃｍ３添加する溶液の最適濃度であると判断した。
【００５７】
【表５】
【００５８】
（２−１−５）サンプルＮｏ．２のキャラクタリゼーション
前記（２−１−１）〜（２−１−４）の実験結果より、サンプルＮｏ．２の合成条件、すなわち、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３および尿素１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３に、さらに０．１質量％ウレアーゼ水溶液を ２．７３４ｃｍ３添加した合成条件が最適であることが分かった。この濃度条件の生成物に対し、さらにＴＥＭ，ＥＤＸ、ＦＴ-ＩＲなどの装置を用いてキャラクタリゼーションを行った。
【００５９】
ＴＥＭ画像及び電子線回折の結果を図１８に示す。ＴＥＭ画像では、ＳＥＭ画像と同様に板状の形態であることが確認された。電子線回折では明確なスポットが認められ、この析出物が単結晶であることが確認できた。
【００６０】
図１９は水熱処理後の析出物をさらに、強拡大した格子像である。結晶内部に線状または、編み目のような模様が見られ、白い部分と黒い部分とが混在していた。この格子像から、結晶の方位を推測した。１０本分の空間の距離を測定したところ、３．４２４ｎｍであった。ＪＣＰＤＳカード検索により、最も近い値の格子面間隔のミラー指数は（００２）面であった。もし、この結晶が（００２）面の方向を向いているとしたら、格子定数は０．６８４８ｎｍとなるので、ｃ軸の格子定数（０．６８８３ｎｍ）に近い値であり、測定した方向はｃ軸、その垂直方向はａ軸と推測できる。
【００６１】
図２０は前記サンプルＮｏ．２の析出物のＥＤＸ図である。ＥＤＸを用いてキャラクタリゼーションを行ったところ、Ｃａ，Ｐ，Ｏ元素のほか、Ｃ元素のピークも発見されたため、この最終生成物は炭酸を含有していると判断した。
【００６２】
図２１に、サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＦＴ-ＩＲスペクトルを示す。ＨＡｐに特徴的なＯＨ−基に基づく吸収が３５７０ｃｍ−１付近に、またＰＯ４３−基に基づく吸収が１３００〜９００，６００および５７０ｃｍ−１付近に認められた。これらのＨＡｐに関係する吸収のほかに、ＣＯ３２−イオンに基づく吸収が１６００〜１４００および８８０ｃｍ−１付近において認められた。これらの吸収スペクトルから、Ｎｏ．２の生成物は炭酸含有（Ｔｙｐｅ ＡＢ）ＨＡｐであることがわかる。この結果は図２０のＥＤＸ結果と一致している。
【００６３】
また、このＮｏ．２の生成物のＣａ粉体のＣａ含有量を原子吸光法、Ｐ含有量をリンバナドモリブデン酸法により定量したところ、Ｃａ含有量は３６．８質量％、Ｐ含有量は１７．７質量％であった。これらの値からＣａ／Ｐ比を求めると１．５９となり、ＨＡｐの
化学量論組成のＣａ／Ｐ比である１．６７より低い値を示している。以上の結果を総合し、このＮｏ．２の条件で合成したＨＡｐは、凝集した板状ＨＡｐ単一相の単結晶であり、Ｃａ／Ｐ＝１．５９の炭酸を含有するカルシウム欠損型ヒドロキシアパタイトである。
【００６４】
（２−１−６）気液界面析出物の経時変化
図１に示すように、シャーレに各材料を入れて５０℃のインキュベーターに静置しておくと、反応の進行に伴い、図２２に示すように気液界面から白い膜状の物質が析出してくる。この析出物の構造・組成の経時変化について調べた。
【００６５】
図２３に、気液界面析出物の経時変化のＸＲＤパターンを示す。この析出物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であるが、インキュベート時間の経過に伴い４°付近のＯＣＰの回折強度が弱くなり、２６°付近のＨＡｐ回折強度が強くなる傾向が見られた。これについては、反応の進行に伴い、尿素が加水分解することにより、気液界面付近のｐＨ値が酸性からアルカリ性へシフトし、ＯＣＰがＨＡｐに転化したためであると考えられる。９６時間及び１２０時間の析出物のＸＲＤパターンがほぼ一致していることから、インキュベート時間９６時間が反応の終点と考えられた。
【００６６】
図２４は、図２３で用いたものと同じサンプルのＦＴ-ＩＲスペクトルである。このＦＴ-ＩＲスペクトルより、３５７０ｃｍ−１付近のＯＨ−の吸収が徐々に強くなることが認められ、それは時間が経つと、ＯＣＰからＨＡｐへの転換が進行するので、析出物中のＨＡｐの割合が大きくなったためであると考えられる。
【００６７】
図２５は、図２３で用いたものと同じサンプルのＳＥＭ画像である。このＳＥＭ画像より、２４〜４８時間の時間帯では、板状の析出物サイズが著しく成長したが、４８〜１２０時間の時間帯では、析出物サイズおよび形態にはほぼ変化が見られなかった。
なお、本プロセスでは、反応がガラスシャーレ中において進行するため、溶液中のｐＨの経時変化を測定することが困難であるが、図２６に示すように、フラスコを用いて溶液中のｐＨ変化を模擬した。
【００６８】
図２７に、前記の通り測定した溶液中のｐＨの経時変化を示す。反応の進行に従って、ｐＨはまず３．０付近から６．５付近まで上昇してから（第一段階）、一度ｐＨ６．２付近まで下がり（第二段階）、その後再び上昇する（第三段階）傾向が見られた。第一段階では、尿素の加水分解反応により溶液中のｐＨが上がり始め、第二段階では結晶核が生成するため、ｐＨが下がり、第三段階ではｐＨが再び上がり、結晶が成長していくと考えられる。
【００６９】
（２−１−７）気液界面析出物の加熱による相変化
サンプルＮｏ．２の析出物を水熱処理してから、６００℃、７００℃、８００℃、９００℃、１０００℃、１１００℃および１２００℃まで加熱し、それぞれの結晶相、形態を調べた。
【００７０】
図２８に水熱処理後の析出物の加熱による相変化を調べたＸＲＤパターンを示す。６００℃まで加熱した析出物は、配向性を維持したＨＡｐ単一相のＸＲＤパターンを示した。７００℃では、ＨＡｐのほかに、３１°付近においてβ-リン酸三カルシウム（β-Ｃａ３（ＰＯ４）２：β-ＴＣＰ）のピークが認められた。８００℃、９００℃および１０００℃の場合、β-ＴＣＰのピークは強められたが、ＨＡｐのピークはまだ残留していた。１１００℃および１２００℃になると、ＨＡｐ，β-ＴＣＰのほかに、高温型のα-ＴＣＰのピークも検出され、３つの相が共存していることが確認された。
【００７１】
図２９に、図２８と同じサンプルについてのＦＴ-ＩＲスペクトルを示す。加熱により、１６００〜１４００および８８０ｃｍ−１付近のＣＯ３２−イオンに基づく吸収が徐々に弱められていくことが確認された。
【００７２】
図３０は、図２８および図２９と同じサンプルのＳＥＭ画像である。７００℃まで加熱すると、析出物形態は多少崩れるが、一応板状を維持した。さらに加熱すると、析出物表面が融解していき、１２００℃加熱において、板状の形態が完全に観測できなくなった。
【００７３】
図３１に、未加熱粉体と１２００℃まで加熱した粉体のＴＥＭ画像を示す。加熱する前の滑らかな析出物表面に対し、１２００℃の加熱により、析出物表面が凹凸になっている様子が確認された。
【００７４】
前記の結果より、本プロセスから得られた板状ＨＡｐ粉体は、通常の化学量論的なＨＡｐに比べると、熱力学的に安定性が低いことが確認された。それは、カルシウム欠損のためであると考えられる。
【００７５】
（２−２）下層生成物のキャラクタリゼーション
表１に示したすべての濃度条件下で生成した、シャーレの下層の生成物は、配向性を持たない、ＯＣＰとＨＡｐの混合相であった。以下には、サンプルＮｏ．２の下層生成物のキャラクタリゼーションの結果を示す。
【００７６】
図３２に、サンプルＮｏ．２の下層生成物のＸＲＤパターンを示す。図３２より、この下層の合成粉体は、ＯＣＰとＨＡｐの混合相であり、ＸＲＤパターンでは、４°付近のＯＣＰの回折強度および３２°付近のＨＡｐの（３００）面の回折強度が発達した。
【００７７】
図３３に、前記合成粉体のＳＥＭ画像を示す。このＳＥＭ観察により、生成した析出物の形態は棒状、球状および板状であることがわかる。
【００７８】
水熱処理後、４°付近のＯＣＰの回折が消え、３２°付近のＨＡｐの（３００）面の回折も弱められ、ＨＡｐの単一相へ転化した。図３３のＳＥＭ画像では、特異的な配向性を失っていた。
【００７９】
図３４に、水熱処理後の粉体のＴＥＭ画像を示す。このＴＥＭ観察により、規則的でない一次析出物の形態が観察され、電子線回折では、スポットが認められたが、乱雑に配列しているため、多結晶であることもわかる。
【００８０】
図３５に、水熱処理後の粉体のＦＴ-ＩＲスペクトルを示す。このＦＴ-ＩＲスペクトルでは、ＨＡｐに特徴的なＯＨ−基に基づく吸収が３５７０ｃｍ−１付近に、またＰＯ４３−基に基づく吸収が１３００〜９００，６００および５７０ｃｍ−１付近に認められた。これらの吸収のほかにＣＯ３２−イオンに基づく吸収が１６００〜１４００および８８０ｃｍ−１付近において認められた。これらの吸収スペクトルから、下層から得られたＨＡｐは炭酸含有（Ｔｙｐｅ ＡＢ）ＨＡｐであることがわかる。
【００８１】
また、このＨＡｐ粉体のＣａ含有量を原子吸光法により、Ｐ含有量をリンバナドモリブデン酸法により定量したところ、Ｃａ含有量は３５．４質量％、Ｐ含有量は１８．２質量％であった。これらの値からＣａ／Ｐ比を求めると１．５１になり、ＨＡｐの化学量論組成でのＣａ／Ｐ比１．６７より低い値を示している。
【００８２】
３．考察
本実施例では、混合溶液の気液界面からＯＣＰを含有する膜状のＨＡｐを析出・成長させ、次いで、該析出物に水熱処理を行って、単一相の板状ＨＡｐを得た。アパタイトの理論密度は３．１６ｇ・ｃｍ−３であるため、通常では液面にＨＡｐが安定して存在することはあり得ない。以下、本プロセスの特異的なメカニズムについて検討した。
【００８３】
図３６は、シャーレ内の気液界面に生じた膜状析出物の上部（界面の上）から撮影したＳＥＭ画像である。互いに直交した板状析出物の上に、花の芯のような部分が見られる。それは、液面に沿って成長したＨＡｐの基盤に相当すると考えられる。
【００８４】
図３７は、シャーレ内の下層に生じた析出物のＳＥＭ画像である。下部の析出物では、直交した板状ＨＡｐしか観察されず、図３６の場合のようなＨＡｐの基盤が全く観察されなかった。
【００８５】
図３８は、シャーレ内の気液界面に生じた膜状析出物の側面から撮影したＳＥＭ画像である。図３８では、この膜状析出物の上部及び下部が明瞭に観察できた。
【００８６】
図３９は、この析出物の凝集体の上部から撮影したＴＥＭ画像である。凝集体の内部の板状析出物同士が互いに直交した構造をなしていることが明らかになった。
【００８７】
析出物の下部と上部の違いおよび気液界面という特別な環境から総合的に考える上で、気液界面合成プロセスのメカニズムを、次のように推測した。
【００８８】
ステップ１：図４０に示すように、気液界面付近の溶液の蒸発により、気液界面ではＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンの濃度が高くなる。
ステップ２：図４１に示すように、ＨＡｐの過飽和度を越えると、ＨＡｐの結晶核が生成し、気液界面付近のＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンの濃度が低くなるため、溶液中のイオンが気液界面に移動して補充する。
ステップ３：図４２に示すように、液面と溶液中のＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンの濃度差が生じ、結晶のｃ軸方向よりａ，ｂ軸方向にはＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンが大量に存在するため（ｐＨ値も高い）、析出したアパタイトはａ，ｂ軸に沿ってｃ面が優先的に成長していく。
ステップ４：図４３に示すように、気液界面から析出したＨＡｐの（−）に帯電するｃ面が溶液中のＨＡｐ核の（＋）に帯電するａ面を静電的に吸引し、凝集体（各結晶の間に新しい結合が生成する可能性がある）となる。
ステップ５：図４４に示すように、界面の底部に存在する微細なＨＡｐ結晶は、溶液中のＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンを取り込み、大きく成長する。ここでは、静電的な反発および立体空間の障害などの影響により、ａ軸方向はｃ軸方向より著しく成長していくと考えられる。
ステップ６：気液界面では、図４５に示すような小さい凝集体が多数生成し、互いにさらに凝集が起き、船のように気液界面で安定して浮かぶことができるようになる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、板状ＨＡｐ単結晶を工業的規模で製造することができる。この板状ＨＡｐ単結晶は、（−）に帯電するｃ面が広く露出しているものなので、塩基性タンパク質などの生理活性物質の吸着材（例えば、クロマトグラフィ用充填材）に利用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ面配向した板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシアパタイト（以下、ＨＡｐと略記する）は、一般に、結晶系が六方晶系に属し、ｃ軸方向に成長した結晶面（以下、この結晶面をａ面という）と、ａ軸およびｂ軸方向に成長した結晶面（以下、この結晶面をｃ面という）とをもつ。ａ面は正に帯電し、ｃ面は負に帯電している。この電荷の異なる２つの結晶面をもつため、ＨＡｐは、酸性基あるいは塩基性基を持つ化合物を吸着保持することができる。このような吸着特性を有するＨＡｐは、タンパク質などの生理活性物質の吸着材（例えば、クロマトグラフィ用充填材）に利用されている。
【０００３】
近年、ＨＡｐの結晶面を選択的に配向させて、その吸着特性に選択性を付与する試みがなされている。例えば、非特許文献１には、均一沈殿法により、ａ面配向した繊維状ＨＡｐを合成し、そのａ面配向した繊維状ＨＡｐが塩基性タンパク質（リゾチーム）よりも酸性タンパク質（アルブミン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸）をより多く吸着することが報告されている。
【０００４】
また、ｃ面配向した板状ＨＡｐの研究も進められている。特許文献１には、リン酸カルシウム粒子を、アミノ酸水溶液中にて加熱して、ＨＡｐに転化し、次いで該ＨＡｐをａ軸およびｂ軸方向に生長させることを特徴とする板状ＨＡｐの製造方法が開示されている。
【０００５】
さらに、非特許文献２には、ＣａＣＯ３、Ｈ３ＰＯ４、尿素およびウレアーゼを含む水溶液を５０℃で２４時間インキュベートし、溶液から均一な生成物を沈殿させ、次いでこの沈殿物に水熱処理を施してｃ面配向した板状ＨＡｐを合成する方法が開示されている。
ｃ面配向したＨＡｐは、前記ａ面配向した繊維状ＨＡｐとは異なり、酸性タンパク質よりも塩基性タンパク質をより多く吸着する吸着材として期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本セラミックス協会第１回生体関連セラミックス討論会講演要旨集（１９９７）１１頁
【非特許文献２】H. Yamamoto and M. Aizawa, Archives of Bioceramics Reseach, 6(2006), 212-215
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１５５９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述したａ面配向した繊維状ＨＡｐやｃ面配向した板状ＨＡｐを吸着材として用い、酸性タンパク質や塩基性タンパク質などの生理活性物質の分析、あるいは精製・単離を行う上で、使用するＨＡｐは単結晶であることが望ましい。多結晶のＨＡｐの場合、表面の電荷が均一にならず、生理活性物質に対する特異的な吸着性能が不十分であったり、分離能が悪くなるなどの問題がある。
しかしながら、前記特許文献１に開示された従来技術で得られた板状ＨＡｐは、Ｘ線回折等で結晶構造を調べた結果、多結晶のＨＡｐが主体であることが判明した。
また、前記非特許文献２に開示された従来技術で得られた板状ＨＡｐについても、単結晶に近い構造を有しているものの、多結晶パターンが混在していることが判明した。
このように、従来技術においては、ｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶を効率的に得ることができなかった。
【０００９】
本発明は、前記事情に鑑みてなされ、従来技術では得られなかったｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶を効率的に製造するための技術の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するため、本発明は、Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ＨＡｐの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させ、次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取し、次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ＨＡｐ単結晶を得ることを特徴とする板状ＨＡｐ単結晶の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明の板状ＨＡｐ単結晶の製造方法において、前記酸性水溶液中のＣａ２＋イオンの濃度を０．００２５〜０．０１００ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ＰＯ４３−イオンの濃度を０．００１５〜０．００６０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、尿素の濃度を１．０〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ウレアーゼの濃度を前記尿素１当量に対して０．２倍当量から３倍当量の範囲とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、板状ＨＡｐ単結晶を効率よく製造することができる。
本発明により得られる板状ＨＡｐ単結晶は、ｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶であり、これを用いて塩基性タンパク質などの生理活性物質の分析、あるいは精製・単離を行う場合に、多結晶ＨＡｐに比べて高い吸着性能及び分離性能が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で行ったＨＡｐ合成の手順を示すフロー図である。
【図２】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図３】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図４】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図５】Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図６】尿素濃度変動の実験における気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図７】尿素濃度変動の実験における気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図８】尿素濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図９】尿素濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１０】ウレアーゼ添加量変動の実験おける気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１１】ウレアーゼ添加量変動の実験おける気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１２】ウレアーゼ添加量変動の実験おける水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１３】ウレアーゼ添加量変動の実験おける水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１４】溶液総濃度変動の実験における気液界面の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１５】溶液総濃度変動の実験における気液界面の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１６】溶液総濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＸＲＤパターンである。
【図１７】溶液総濃度変動の実験における水熱処理後の析出物のＳＥＭ画像である。
【図１８】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＴＥＭ画像及び電子線回折画像である。
【図１９】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）の格子像である。
【図２０】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＥＤＸ図である。
【図２１】サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図２２】気液界面析出物の経時変化を示す画像である。
【図２３】気液界面析出物の経時変化のＸＲＤパターンである。
【図２４】気液界面析出物の経時変化のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図２５】気液界面析出物の経時変化のＳＥＭ画像である。
【図２６】ｐＨ変動調査用装置の概略構成図である。
【図２７】ｐＨの経時変化図である。
【図２８】気液界面析出物の加熱後のＸＲＤパターンである。
【図２９】気液界面析出物の加熱後のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図３０】気液界面析出物の加熱による相変化のＳＥＭ画像である。
【図３１】気液界面析出物の加熱による表面変化のＴＥＭ画像である。
【図３２】サンプルＮｏ．２の下層生成物のＸＲＤパターンである。
【図３３】サンプルＮｏ．２の下層生成物のＳＥＭ画像である。
【図３４】サンプルＮｏ．２の下層生成物（水熱処理後）のＴＥＭ写真および電子線回折画像である。
【図３５】サンプルＮｏ．２の下層生成物（水熱処理後）のＦＴ-ＩＲスペクトルである。
【図３６】凝集体の上部のＳＥＭ画像である。
【図３７】凝集体の下部のＳＥＭ画像である。
【図３８】凝集体の側面のＳＥＭ画像である。
【図３９】凝集体の上部のＴＥＭ画像である。
【図４０】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ１を説明するための概略図である。
【図４１】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ２を説明するための概略図である。
【図４２】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ３を説明するための概略図である。
【図４３】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ４を説明するための概略図である。
【図４４】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ５を説明するための概略図である。
【図４５】気液界面合成プロセスのメカニズムのうちステップ６を説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の板状ＨＡｐ単結晶の製造方法は、
・Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を調製する工程（１）と、
・次いで、該水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ＨＡｐの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させる工程（２）と、
・次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取する工程（３）と、
・次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ＨＡｐ単結晶を得る工程（４）とを備えている。
【００１５】
前記工程（１）において、酸性水溶液の調製は、Ｃａ化合物とＰ化合物とをＨＡｐの合成に好適なモル比（例えば、Ｃａ／Ｐ＝１．６７）となるように秤量、採取し、尿素と共に精製水に加えて混合し、この水中に硝酸や塩酸などの無機酸、あるいは酢酸、クエン酸、乳酸などの有機酸を加え、ｐＨを酸性側にしてＣａ化合物、Ｐ化合物及び尿素を溶解させ、その後、適当量のウレアーゼを加えて調製することが好ましい。
【００１６】
前記酸性水溶液の調製に用いるＣａ化合物としては、酸性水溶液に溶解するものであればよく、特に制限されないが、ＨＡｐ結晶の析出や単結晶の成長を妨害するような妨害成分を含まないＣａ化合物を用いることが好ましく、例えば、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、乳酸カルシウム、酢酸カルシウムなどが好ましい。
【００１７】
前記酸性水溶液の調製に用いるＰ化合物としては、酸性水溶液に溶解するものであればよく、特に制限されないが、ＨＡｐ結晶の析出や単結晶の成長を妨害するような妨害成分を含まないＰ化合物を用いることが好ましく、例えば、オルトリン酸、ポリリン酸、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸三アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素アンモニウムなどが好ましい。
【００１８】
前記酸性水溶液の調製に用いるＣａ化合物とＰ化合物との比率は、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２で表されるヒドロキシアパタイトにおけるＣａとＰのモル比（Ｃａ／Ｐ）と同じか又は近似した値になるように計算して秤量、採取することが望ましい。
また、前記酸性水溶液中のＣａ２＋イオン濃度及びＰＯ４３−イオン濃度は特に限定されないが、綺麗な板状ＨＡｐ単結晶を合成するには、Ｃａ２＋イオンが０．００２５〜０．０１００ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲、ＰＯ４３−イオンが０．００１５〜０．００６０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とすることが好ましい。
【００１９】
前記酸性水溶液の調製に用いる尿素は、ウレアーゼにより分解されて生じるアンモニウムイオンによって酸性水溶液のｐＨが上昇し、ＨＡｐの析出に好適な中性〜弱アルカリ域に徐々に移行させるために好適な量が添加される。尿素の添加量は、酸性水溶液の酸性度などに応じて適宜設定されるが、通常は０．５〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲、好ましくは１．０〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とすることが好ましい。
【００２０】
前記酸性水溶液の調製に用いるウレアーゼは、酸性水溶液中の尿素に作用して加水分解し、アンモニウムイオンを生じて酸性水溶液のｐＨを上昇させ、ＨＡｐの析出に好適な中性〜弱アルカリ域に徐々に移行させるために好適な量が添加される。ウレアーゼの添加量は、特に限定されないが、綺麗な板状ＨＡｐ単結晶を合成するには、ウレアーゼを前記尿素１当量に対して０．２倍当量から３倍当量の範囲で添加することが好ましい。ここで、ウレアーゼ（酵素活性：１４０ｕｎｉｔ・ｍｇ−１）の１当量は、尿素の１当量を２４時間以内にすべて加水分解するに要する量に相当し、０．２倍当量は０．５４７ｃｍ３に、３倍当量は８．２０２ｃｍ３にそれぞれ相当する。
【００２１】
前記工程（１）において酸性水溶液を調製後、この酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ＨＡｐの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させる工程（２）を行う。この工程（２）を行うための容器や保持条件の詳細については、前述したＨＡｐの結晶生成・成長が可能であれば特に限定されない。ただし、保持温度は、２０〜５５℃の範囲、好ましくはウレアーゼの至適温度近辺に設定することが好ましい。また、反応時間は、２４〜１２０時間の範囲とすることが好ましい。
【００２２】
この工程（２）において、時間の経過とともに、容器の気液界面付近と、液の下層とにＨＡｐの結晶が析出し、成長していくが、本発明の製造方法において対象となる板状ＨＡｐ単結晶は、容器の気液界面付近に浮上した状態で成長していく。
【００２３】
次に、前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取する工程（３）を行う。この析出物の採取方法は特に限定されず、化学分野や製薬分野などで用いられる従来公知の採取法を適用して行うことができる。
容器から分離採取した析出物は、精製水等で十分に洗浄し、乾燥される。
【００２４】
このように得られた析出物は、Ｘ線回折等で調べると、製造目的とするＨＡｐの結晶以外に、リン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）などの他のリン酸カルシウム化合物が混在している。そこで、前記析出物に水熱処理を施してＨＡｐの単一相に転化して、目的とする板状ＨＡｐ単結晶を得る工程（４）を行う。
【００２５】
この水熱処理の条件は、リン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）などの他のリン酸カルシウム化合物をＨＡｐの単一相に転化できればよく、特に限定されないが、通常は温度１００〜２００℃の範囲、処理時間１〜３時間程度の条件で行うことが好ましい。この水熱処理により、目的とする板状ＨＡｐ単結晶が得られる。
【００２６】
本発明の製造方法によって得られる板状ＨＡｐ単結晶は、図１３等に示すように、比較的大きく明瞭な板状をなしており、図１２のＸＲＤパターンからわかるようにＨＡｐの単一相から形成されている。この板状ＨＡｐ単結晶は、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強く、ｃ面配向したＨＡｐ単結晶であることが実証された。
【００２７】
本発明の製造方法によって得られる板状ＨＡｐ単結晶は、ｃ面配向した板状ＨＡｐ単結晶であり、これを用いて塩基性タンパク質などの生理活性物質の分析、あるいは精製・単離を行う場合に、多結晶ＨＡｐに比べて高い吸着性能及び分離性能が得られる。
【実施例】
【００２８】
１．実験
（１−１）混合溶液の調製方法
まず、炭酸カルシウムとオルトリン酸及び尿素からなる懸濁液（１０００ｃｍ３）を調製し、２時間撹拌した。この混合懸濁液に、硝酸（１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３）をｐＨ３．００になるように添加した。更に１時間撹拌し、ウレアーゼを添加した。
出発材料の炭酸カルシウム、オルトリン酸（Ｈ３ＰＯ４）、尿素およびウレアーゼ（１４０ｕｎｉｔ・ｍｇ−１）の配合割合を表１に示す。なお、ウレアーゼの添加量は、０．１質量％水溶液の添加量で表す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
（１−２）混合溶液からの合成
前記（１−１）で得られた混合溶液（１０００ｃｍ３）を外径１２．３ｃｍのガラスシャーレ８個（各シャーレに１２５ｃｍ３）に入れ密封し、インキュベーターの中で５０℃、９６時間の反応を行った。反応後、吸引ろ過器で液面上に浮かぶ生成物だけを吸引ろ過・洗浄し、１１０℃、２４時間乾燥し、合成粉体を得た。ここでの合成の概略を図１に示す。
【００３１】
（１−３） 水熱処理
水熱処理では反応器にフッ素樹脂製内筒を有するオートクレーブ（耐圧硝子工業社製ＴＶＳ−１型（容積５０ｃｍ３））を用いた。前記（１−２）で得られた合成粉末０．１ｇを５０ｃｍ３の純水中に加え、１２０℃、２．５時間加熱して水熱処理を行った。その後、処理物をろ過・洗浄して１１０℃、４８時間で乾燥した。
【００３２】
２．実験結果
（２−１）気液界面の析出物のキャラクタリゼーション
（２−１−１）Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度変動（表１中のＮｏ．１−Ｎｏ．４）
尿素の濃度を１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３、添加する０．１質量％ウレアーゼ水溶液の体積を当量である２．７３４ｃｍ３に固定し、ＣａＣＯ３，Ｈ３ＰＯ４の濃度をパラメーターとして変動させ、５０℃，９６時間で加熱した。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、それぞれろ過・乾燥を行った。
なお、以下の記載において、Ｘ線回折法（又は装置）はＸＲＤと略記し、走査型電子顕微鏡法（又は装置）はＳＥＭと略記し、透過型電子顕微鏡法（又は装置）はＴＥＭと略記し、エネルギー分散型Ｘ線分析法（又は装置）はＥＤＸと略記し、赤外吸光法（又は装置）はＦＴ-ＩＲと略記する。
【００３３】
図２に界面の析出物のＸＲＤパターンを示す。図中、ＯＣＰはリン酸オクタカルシウム、ＨＡｐはヒドロキシアパタイトを表す。アパタイトの特徴パターンのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生成物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であることが確認できた。また、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−高濃度の場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、ＯＣＰの特徴ピークが非常に強いので、主生成物はＯＣＰであることが分かった。一方、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−低濃度の場合（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２）、ＯＣＰの特徴ピークが弱くなり、代わりにＨＡｐの２６°（（００２）面）および５３°（（００４）面）の特徴ピークが発達したことにより、主生成物はｃ面が多く露出しているＨＡｐであることが推察できる。
【００３４】
図３には、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。Ｃａ２＋，ＰＯ４３−高濃度の場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、析出物は短冊状あるいは周囲が崩れた板状の形態を呈したが、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−低濃度の場合（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２）、析出物形態は凝集しているものの綺麗な板状となった。
【００３５】
この析出物に対して１２０℃、２．５時間で水熱処理を行った。
水熱処理後のＸＲＤパターンを図４に示す。すべての粉体は水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐの単一相に転化した。Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度が低いほどＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなる傾向が見られる。また、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−高濃度の場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、ＨＡｐのａ面に相当する３２°（（３００）面）の特徴ピークも発達していることが検出された。
【００３６】
図５には水熱処理後のＮｏ．１〜Ｎｏ．４の界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度が低い場合（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２）生成物の形態が処理前と比べて多少崩れるが、板状である（ａ軸配向）ことが確認できた。また、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−濃度が高い場合（Ｎｏ．３，Ｎｏ．４）、生成物は板状のものではなく、短冊状の形態（ｃ軸配向）となった。ＳＥＭにより観察された生成物の特異的な配向性は、図３のＸＲＤの結果と一致している。
【００３７】
表２には、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４の各条件における収量および収率を示す。収量および析出物形態から考えると、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３（Ｎｏ．２）は、Ｃａ，Ｐの最適濃度条件であると判断できる。
【００３８】
【表２】
【００３９】
（２−１−２）尿素濃度変動（表１中のＮｏ．２，Ｎｏ．５−Ｎｏ．７）
前記（２−１−１）の実験結果より、Ｎｏ．２のＣａＣＯ３，Ｈ３ＰＯ４の濃度条件では効率よく高い配向性を持つ板状ＨＡｐを合成したため、ここではＣａＣＯ３，Ｈ３ＰＯ４の濃度およびウレアーゼの添加量を、それぞれ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３および２．７３４ｃｍ３に固定し、尿素の濃度をパラメーターとして変動させ、５０℃、９６時間で加熱した。なお、ウレアーゼはＮｏ．２の実験条件が当量添加となり、Ｎｏ．５では、ウレアーゼが２倍過剰、Ｎｏ．６及びＮｏ．７では、それぞれ２／３倍および０．５倍過剰となる。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、濾過・乾燥を行った。
【００４０】
図６に界面の析出物ＸＲＤパターンを示す。尿素濃度が低すぎる場合（Ｎｏ．５）は、気液界面では析出物が得られなかった。それは、尿素の濃度が不十分なので、溶液中のｐＨが上昇しにくいためであると考えられる。Ｎｏ．２，Ｎｏ．６，Ｎｏ．７の析出物に対してＸＲＤによりキャラクタリゼーションを行ったところ、アパタイトの特徴ピークのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生成物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であることが確認できた。
【００４１】
図７には界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。すべての生成物（Ｎｏ．２，Ｎｏ．６，Ｎｏ．７の析出物）は凝集した板状の析出物形態を持っており、尿素の濃度が低いほど、析出物のサイズが大きくなることが確認された。
【００４２】
界面の析出物（Ｎｏ．２，Ｎｏ．６，Ｎｏ．７の析出物）に対して１２０℃、２．５時間で水熱処理を行った。
水熱処理後のＸＲＤパターンを図８に示す。すべての粉体は水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなるＨＡｐの単一相に転化した。
【００４３】
水熱処理後の各粉体のＳＥＭ画像を図９に示す。すべての粉体は板状の形態を維持したが、尿素濃度の上昇とともに、生成した析出物の板状形態が崩れて悪くなる傾向が見られた。
表３には各条件における収量および収率を示す。収量および析出物形態から考えると、１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３（Ｎｏ．２）が尿素の最適値であると考えられる。
【００４４】
【表３】
【００４５】
（２−１−３）ウレアーゼ添加量の変動（表１中のＮｏ．２，Ｎｏ．８−Ｎｏ．１１）
前記（２−１−１）及び前記（２−１−２）の実験結果より、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−および尿素濃度をそれぞれ最適値に固定し、ウレアーゼの添加量をパラメーターとして変動させ、５０℃、９６時間で加熱した。液面の析出物とシャーレ底部の生成物に分けて、濾過・乾燥を行った。
図１０に生成物のＸＲＤパターンを示す。アパタイトに特徴的なピークのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生成物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であることが確認できた。また、アパタイトの２６°（（００２）面）および５３°（（００４）面）の特徴ピークが発達したことにより、生成したアパタイトはｃ面が多く露出していることが推察できる。
【００４６】
図１１には気液界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。水熱処理前では、生成物は何れも板状の形態であり、ウレアーゼの添加量の減少と共に、析出物のサイズが大きくなる傾向が見られた。０．１質量％ウレアーゼの添加量が０．５４６８ｃｍ３のとき（Ｎｏ．８）、最も配向性が良くかつサイズが大きな析出物が得られた。
【００４７】
図１２には、水熱処理後の各析出物のＸＲＤパターンを示す。水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなるＨＡｐの単一相に転化した。
【００４８】
図１３には、水熱処理後の各析出物のＳＥＭ画像を示す。水熱処理後、すべてのサンプルの配向性はやや低くなったことが確認され、図１２の水熱処理後のＸＲＤパターンの変化と一致している。ウレアーゼ添加量は０．５４６８ｃｍ３のとき（Ｎｏ．８）、最も配向性が良くかつサイズが大きな析出物が得られた。
【００４９】
表４には各条件における収量および収率を示す。収量及び析出物形態から考えると、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−および尿素濃度をそれぞれ最適値に設定した場合、反応系の尿素に対する当量添加である２．７３４ｃｍ３（Ｎｏ．２）がウレアーゼの最適添加量であると判断した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
（２−１−４）溶液総濃度の変動（表１中のＮｏ．２，Ｎｏ．１２−Ｎｏ．１４）
前記（２−１−１）、（２−１−２）及び（２−１−３）の実験結果より、Ｃａ２＋，ＰＯ４３−、尿素濃度およびウレアーゼの添加量の最適比は、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３、尿素 １．０ｍｏｌ・ｄｍ−３、ウレアーゼ ２．７３４ｃｍ３となる。ここでは、各試薬の濃度および添加量の比をこのように固定し、溶液の総濃度を変動させて実験を行った。液面の析出物とシャーレ底部の生成物を分けて、濾過・乾燥を行った。
【００５２】
図１４に、生成物のＸＲＤパターンを示す。アパタイトに特徴的なピークのほか、４°付近のＯＣＰの特徴ピークも現れたため、すべての生産物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であり、総濃度の増大に伴い、４°付近のＯＣＰの解析強度も強くなることが確認できた。また、アパタイトの２６°（（００２）面）および５３°（（００４）面）の特徴ピークが発達したことにより、生成したアパタイトのｃ面が多く露出していることが推察される。
【００５３】
図１５に、気液界面の析出物のＳＥＭ画像を示す。生成物の何れも板状の形態であり、溶液の総濃度の増大と共に、析出物のサイズが小さくなる傾向が見られた。
【００５４】
図１６に、前記各析出物の水熱処理後のＸＲＤパターンを示す。水熱処理により、ＯＣＰが消滅され、ＨＡｐのｃ面に相当する２６°（（００２）面）の特徴ピークが強くなるＨＡｐの単一相に転化した。
【００５５】
図１７に前記水熱処理後の各析出物のＳＥＭ画像を示す。溶液の総濃度の増大とともに、生成物の析出物サイズが小さくなり、析出物形態も崩れて悪くなる傾向が見られた。
【００５６】
また、各濃度条件における生成物の収量および収率を表４に示す。析出物形態および収量から総合的に考えると、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３および尿素 １．０ｍｏｌ・ｄｍ−３に、さらに０．１質量％ウレアーゼ水溶液を２．７３４ｃｍ３添加する溶液の最適濃度であると判断した。
【００５７】
【表５】
【００５８】
（２−１−５）サンプルＮｏ．２のキャラクタリゼーション
前記（２−１−１）〜（２−１−４）の実験結果より、サンプルＮｏ．２の合成条件、すなわち、ＣａＣＯ３ ０．００５０ｍｏｌ・ｄｍ−３，Ｈ３ＰＯ４ ０．００３０ｍｏｌ・ｄｍ−３および尿素１．０ｍｏｌ・ｄｍ−３に、さらに０．１質量％ウレアーゼ水溶液を ２．７３４ｃｍ３添加した合成条件が最適であることが分かった。この濃度条件の生成物に対し、さらにＴＥＭ，ＥＤＸ、ＦＴ-ＩＲなどの装置を用いてキャラクタリゼーションを行った。
【００５９】
ＴＥＭ画像及び電子線回折の結果を図１８に示す。ＴＥＭ画像では、ＳＥＭ画像と同様に板状の形態であることが確認された。電子線回折では明確なスポットが認められ、この析出物が単結晶であることが確認できた。
【００６０】
図１９は水熱処理後の析出物をさらに、強拡大した格子像である。結晶内部に線状または、編み目のような模様が見られ、白い部分と黒い部分とが混在していた。この格子像から、結晶の方位を推測した。１０本分の空間の距離を測定したところ、３．４２４ｎｍであった。ＪＣＰＤＳカード検索により、最も近い値の格子面間隔のミラー指数は（００２）面であった。もし、この結晶が（００２）面の方向を向いているとしたら、格子定数は０．６８４８ｎｍとなるので、ｃ軸の格子定数（０．６８８３ｎｍ）に近い値であり、測定した方向はｃ軸、その垂直方向はａ軸と推測できる。
【００６１】
図２０は前記サンプルＮｏ．２の析出物のＥＤＸ図である。ＥＤＸを用いてキャラクタリゼーションを行ったところ、Ｃａ，Ｐ，Ｏ元素のほか、Ｃ元素のピークも発見されたため、この最終生成物は炭酸を含有していると判断した。
【００６２】
図２１に、サンプルＮｏ．２の生成物（水熱処理後）のＦＴ-ＩＲスペクトルを示す。ＨＡｐに特徴的なＯＨ−基に基づく吸収が３５７０ｃｍ−１付近に、またＰＯ４３−基に基づく吸収が１３００〜９００，６００および５７０ｃｍ−１付近に認められた。これらのＨＡｐに関係する吸収のほかに、ＣＯ３２−イオンに基づく吸収が１６００〜１４００および８８０ｃｍ−１付近において認められた。これらの吸収スペクトルから、Ｎｏ．２の生成物は炭酸含有（Ｔｙｐｅ ＡＢ）ＨＡｐであることがわかる。この結果は図２０のＥＤＸ結果と一致している。
【００６３】
また、このＮｏ．２の生成物のＣａ粉体のＣａ含有量を原子吸光法、Ｐ含有量をリンバナドモリブデン酸法により定量したところ、Ｃａ含有量は３６．８質量％、Ｐ含有量は１７．７質量％であった。これらの値からＣａ／Ｐ比を求めると１．５９となり、ＨＡｐの
化学量論組成のＣａ／Ｐ比である１．６７より低い値を示している。以上の結果を総合し、このＮｏ．２の条件で合成したＨＡｐは、凝集した板状ＨＡｐ単一相の単結晶であり、Ｃａ／Ｐ＝１．５９の炭酸を含有するカルシウム欠損型ヒドロキシアパタイトである。
【００６４】
（２−１−６）気液界面析出物の経時変化
図１に示すように、シャーレに各材料を入れて５０℃のインキュベーターに静置しておくと、反応の進行に伴い、図２２に示すように気液界面から白い膜状の物質が析出してくる。この析出物の構造・組成の経時変化について調べた。
【００６５】
図２３に、気液界面析出物の経時変化のＸＲＤパターンを示す。この析出物はＨＡｐとＯＣＰの混合相であるが、インキュベート時間の経過に伴い４°付近のＯＣＰの回折強度が弱くなり、２６°付近のＨＡｐ回折強度が強くなる傾向が見られた。これについては、反応の進行に伴い、尿素が加水分解することにより、気液界面付近のｐＨ値が酸性からアルカリ性へシフトし、ＯＣＰがＨＡｐに転化したためであると考えられる。９６時間及び１２０時間の析出物のＸＲＤパターンがほぼ一致していることから、インキュベート時間９６時間が反応の終点と考えられた。
【００６６】
図２４は、図２３で用いたものと同じサンプルのＦＴ-ＩＲスペクトルである。このＦＴ-ＩＲスペクトルより、３５７０ｃｍ−１付近のＯＨ−の吸収が徐々に強くなることが認められ、それは時間が経つと、ＯＣＰからＨＡｐへの転換が進行するので、析出物中のＨＡｐの割合が大きくなったためであると考えられる。
【００６７】
図２５は、図２３で用いたものと同じサンプルのＳＥＭ画像である。このＳＥＭ画像より、２４〜４８時間の時間帯では、板状の析出物サイズが著しく成長したが、４８〜１２０時間の時間帯では、析出物サイズおよび形態にはほぼ変化が見られなかった。
なお、本プロセスでは、反応がガラスシャーレ中において進行するため、溶液中のｐＨの経時変化を測定することが困難であるが、図２６に示すように、フラスコを用いて溶液中のｐＨ変化を模擬した。
【００６８】
図２７に、前記の通り測定した溶液中のｐＨの経時変化を示す。反応の進行に従って、ｐＨはまず３．０付近から６．５付近まで上昇してから（第一段階）、一度ｐＨ６．２付近まで下がり（第二段階）、その後再び上昇する（第三段階）傾向が見られた。第一段階では、尿素の加水分解反応により溶液中のｐＨが上がり始め、第二段階では結晶核が生成するため、ｐＨが下がり、第三段階ではｐＨが再び上がり、結晶が成長していくと考えられる。
【００６９】
（２−１−７）気液界面析出物の加熱による相変化
サンプルＮｏ．２の析出物を水熱処理してから、６００℃、７００℃、８００℃、９００℃、１０００℃、１１００℃および１２００℃まで加熱し、それぞれの結晶相、形態を調べた。
【００７０】
図２８に水熱処理後の析出物の加熱による相変化を調べたＸＲＤパターンを示す。６００℃まで加熱した析出物は、配向性を維持したＨＡｐ単一相のＸＲＤパターンを示した。７００℃では、ＨＡｐのほかに、３１°付近においてβ-リン酸三カルシウム（β-Ｃａ３（ＰＯ４）２：β-ＴＣＰ）のピークが認められた。８００℃、９００℃および１０００℃の場合、β-ＴＣＰのピークは強められたが、ＨＡｐのピークはまだ残留していた。１１００℃および１２００℃になると、ＨＡｐ，β-ＴＣＰのほかに、高温型のα-ＴＣＰのピークも検出され、３つの相が共存していることが確認された。
【００７１】
図２９に、図２８と同じサンプルについてのＦＴ-ＩＲスペクトルを示す。加熱により、１６００〜１４００および８８０ｃｍ−１付近のＣＯ３２−イオンに基づく吸収が徐々に弱められていくことが確認された。
【００７２】
図３０は、図２８および図２９と同じサンプルのＳＥＭ画像である。７００℃まで加熱すると、析出物形態は多少崩れるが、一応板状を維持した。さらに加熱すると、析出物表面が融解していき、１２００℃加熱において、板状の形態が完全に観測できなくなった。
【００７３】
図３１に、未加熱粉体と１２００℃まで加熱した粉体のＴＥＭ画像を示す。加熱する前の滑らかな析出物表面に対し、１２００℃の加熱により、析出物表面が凹凸になっている様子が確認された。
【００７４】
前記の結果より、本プロセスから得られた板状ＨＡｐ粉体は、通常の化学量論的なＨＡｐに比べると、熱力学的に安定性が低いことが確認された。それは、カルシウム欠損のためであると考えられる。
【００７５】
（２−２）下層生成物のキャラクタリゼーション
表１に示したすべての濃度条件下で生成した、シャーレの下層の生成物は、配向性を持たない、ＯＣＰとＨＡｐの混合相であった。以下には、サンプルＮｏ．２の下層生成物のキャラクタリゼーションの結果を示す。
【００７６】
図３２に、サンプルＮｏ．２の下層生成物のＸＲＤパターンを示す。図３２より、この下層の合成粉体は、ＯＣＰとＨＡｐの混合相であり、ＸＲＤパターンでは、４°付近のＯＣＰの回折強度および３２°付近のＨＡｐの（３００）面の回折強度が発達した。
【００７７】
図３３に、前記合成粉体のＳＥＭ画像を示す。このＳＥＭ観察により、生成した析出物の形態は棒状、球状および板状であることがわかる。
【００７８】
水熱処理後、４°付近のＯＣＰの回折が消え、３２°付近のＨＡｐの（３００）面の回折も弱められ、ＨＡｐの単一相へ転化した。図３３のＳＥＭ画像では、特異的な配向性を失っていた。
【００７９】
図３４に、水熱処理後の粉体のＴＥＭ画像を示す。このＴＥＭ観察により、規則的でない一次析出物の形態が観察され、電子線回折では、スポットが認められたが、乱雑に配列しているため、多結晶であることもわかる。
【００８０】
図３５に、水熱処理後の粉体のＦＴ-ＩＲスペクトルを示す。このＦＴ-ＩＲスペクトルでは、ＨＡｐに特徴的なＯＨ−基に基づく吸収が３５７０ｃｍ−１付近に、またＰＯ４３−基に基づく吸収が１３００〜９００，６００および５７０ｃｍ−１付近に認められた。これらの吸収のほかにＣＯ３２−イオンに基づく吸収が１６００〜１４００および８８０ｃｍ−１付近において認められた。これらの吸収スペクトルから、下層から得られたＨＡｐは炭酸含有（Ｔｙｐｅ ＡＢ）ＨＡｐであることがわかる。
【００８１】
また、このＨＡｐ粉体のＣａ含有量を原子吸光法により、Ｐ含有量をリンバナドモリブデン酸法により定量したところ、Ｃａ含有量は３５．４質量％、Ｐ含有量は１８．２質量％であった。これらの値からＣａ／Ｐ比を求めると１．５１になり、ＨＡｐの化学量論組成でのＣａ／Ｐ比１．６７より低い値を示している。
【００８２】
３．考察
本実施例では、混合溶液の気液界面からＯＣＰを含有する膜状のＨＡｐを析出・成長させ、次いで、該析出物に水熱処理を行って、単一相の板状ＨＡｐを得た。アパタイトの理論密度は３．１６ｇ・ｃｍ−３であるため、通常では液面にＨＡｐが安定して存在することはあり得ない。以下、本プロセスの特異的なメカニズムについて検討した。
【００８３】
図３６は、シャーレ内の気液界面に生じた膜状析出物の上部（界面の上）から撮影したＳＥＭ画像である。互いに直交した板状析出物の上に、花の芯のような部分が見られる。それは、液面に沿って成長したＨＡｐの基盤に相当すると考えられる。
【００８４】
図３７は、シャーレ内の下層に生じた析出物のＳＥＭ画像である。下部の析出物では、直交した板状ＨＡｐしか観察されず、図３６の場合のようなＨＡｐの基盤が全く観察されなかった。
【００８５】
図３８は、シャーレ内の気液界面に生じた膜状析出物の側面から撮影したＳＥＭ画像である。図３８では、この膜状析出物の上部及び下部が明瞭に観察できた。
【００８６】
図３９は、この析出物の凝集体の上部から撮影したＴＥＭ画像である。凝集体の内部の板状析出物同士が互いに直交した構造をなしていることが明らかになった。
【００８７】
析出物の下部と上部の違いおよび気液界面という特別な環境から総合的に考える上で、気液界面合成プロセスのメカニズムを、次のように推測した。
【００８８】
ステップ１：図４０に示すように、気液界面付近の溶液の蒸発により、気液界面ではＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンの濃度が高くなる。
ステップ２：図４１に示すように、ＨＡｐの過飽和度を越えると、ＨＡｐの結晶核が生成し、気液界面付近のＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンの濃度が低くなるため、溶液中のイオンが気液界面に移動して補充する。
ステップ３：図４２に示すように、液面と溶液中のＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンの濃度差が生じ、結晶のｃ軸方向よりａ，ｂ軸方向にはＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンが大量に存在するため（ｐＨ値も高い）、析出したアパタイトはａ，ｂ軸に沿ってｃ面が優先的に成長していく。
ステップ４：図４３に示すように、気液界面から析出したＨＡｐの（−）に帯電するｃ面が溶液中のＨＡｐ核の（＋）に帯電するａ面を静電的に吸引し、凝集体（各結晶の間に新しい結合が生成する可能性がある）となる。
ステップ５：図４４に示すように、界面の底部に存在する微細なＨＡｐ結晶は、溶液中のＣａ２＋，ＰＯ４３−およびＯＨ−イオンを取り込み、大きく成長する。ここでは、静電的な反発および立体空間の障害などの影響により、ａ軸方向はｃ軸方向より著しく成長していくと考えられる。
ステップ６：気液界面では、図４５に示すような小さい凝集体が多数生成し、互いにさらに凝集が起き、船のように気液界面で安定して浮かぶことができるようになる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、板状ＨＡｐ単結晶を工業的規模で製造することができる。この板状ＨＡｐ単結晶は、（−）に帯電するｃ面が広く露出しているものなので、塩基性タンパク質などの生理活性物質の吸着材（例えば、クロマトグラフィ用充填材）に利用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ヒドロキシアパタイトの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させ、次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取し、次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ヒドロキシアパタイト単結晶を得ることを特徴とする板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
【請求項２】
前記酸性水溶液中のＣａ２＋イオンの濃度を０．００２５〜０．０１００ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ＰＯ４３−イオンの濃度を０．００１５〜０．００６０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、尿素の濃度を１．０〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ウレアーゼの濃度を前記尿素１当量に対して０．２倍当量から３倍当量の範囲とすることを特徴とする請求項１に記載の板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
【請求項１】
Ｃａ２＋イオン、ＰＯ４３−イオン、尿素及びウレアーゼを含む酸性水溶液を容器に入れ、該酸性水溶液と外気とが気液接触した状態で保持し、ウレアーゼによる尿素の加水分解による水溶液のｐＨ上昇にしたがって、ヒドロキシアパタイトの結晶核を生成させ、さらに該結晶核をａ軸及びｂ軸方向に成長させ、次いで前記水溶液に浮上している析出物を水溶液から分離採取し、次いで前記析出物に水熱処理を施して板状ヒドロキシアパタイト単結晶を得ることを特徴とする板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
【請求項２】
前記酸性水溶液中のＣａ２＋イオンの濃度を０．００２５〜０．０１００ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ＰＯ４３−イオンの濃度を０．００１５〜０．００６０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、尿素の濃度を１．０〜２．０ｍｏｌ・ｄｍ−３の範囲とし、ウレアーゼの濃度を前記尿素１当量に対して０．２倍当量から３倍当量の範囲とすることを特徴とする請求項１に記載の板状ヒドロキシアパタイト単結晶の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【公開番号】特開２０１０−２０８８９６（Ｐ２０１０−２０８８９６Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５７１６１（Ｐ２００９−５７１６１）
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【出願人】（８０１００００２７）学校法人明治大学 (161)
【Ｆターム（参考）】
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