活性のある溶解性の翻訳後修飾されたニューレグリン−アイソフォーム
本発明は、認知に関連した神経学的疾病、特に精神分裂病、アルツハイマー病及びパーキンソン病における薬物療法としての翻訳後ニューレグリン−１修飾を提示する溶解性ニューレグリン−１アイソフォームを参照する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、認知に関連した神経学的状態、例えば精神分裂病、アルツハイマー病及びパーキンソン病における薬物療法としての、翻訳後ニューレグリン−１修飾又はスプライス変異体を提示する、生理学的溶液中に溶解性のニューレグリン−１アイソフォームを参照する。
【０００２】
背景技術
ニューレグリン（ＮＲＧ）は、シナプス性シグナリングの鍵となる制御因子として出現した。この膜貫通型タンパク質は、４個の遺伝子（ＮＲＧ−１、−２、−３、及び−４）によりコードされ、この多様性は更に代替的ＲＮＡスプライスング及びプロモーターの使用により増加され、特にタンパク質加水分解性プロセッシングなどの翻訳後修飾により増加され、これは膜結合ホロタンパク質からの溶解性アイソフォームの放出を引き起こす。更に、リン酸化及びグリコシル化の証拠が存在する（Buonanno and Fischbach 2001）。これらは、異なる細胞外ドメインにより特徴付けられ、かつ、ＥｒｂＢレセプターチロシンキナーゼのリガンドであり、これは、神経炎症及び遺伝子転写に対する下流の暗示的意味合いを有する（Holbro and Hynes 2004）。特にＮＲＧ−１の溶解性アイソフォームは、ＮＲＧの膜貫通型形態から、電気的刺激の間のタンパク質加水分解性開裂を通じて産生され、引き続き活性依存性シナプス性調節因子として分泌される（Ozaki et al. 2004）。
【０００３】
ＮＲＧ−１の切断されたアイソフォーム、恐らくβ−１は、この全体の膜タンパク質のＮ末端の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有し、これは学習及び記憶に関連していることが見出されている（Schillo et al. 2005a; WO03/014156）。機能的研究は、ＮＲＧ−１が直接的にＮＭＤＡレセプターサブユニット成分を制御することを実証した（Ozaki et al. 1997; Eilam et al. 1998）。更に、この種のＮＲＧ−１断片が神経保護特性をｉｎ ｖｉｖｏで抗アポトーシス性作用により有することが示されている（Xu et al. 2005A; Xu et al. 2005B; Xu et al. 2004）。
【０００４】
極めて最近、ＮＲＧ−１が、ＮＭＤＡレセプターのＮＲＧ依存性制御（Schrattenholz and Soskic 2006）及び引き続く下流の現象、例えば興奮毒性、神経炎症及びアポトーシスのために中心的な役割をヒトの神経学的疾病において有することが明らかになった（要約のために図１を参照のこと）。これらは、ＮＲＧ−１が重要な役割を、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病から卒中及び精神分裂病にわたる範囲の状態において果たすことを示している（Britsch 2007）。
【０００５】
ＮＲＧ−１のこの根本的な重要性は、神経保護及び認知関連学習及び記憶におけるポジティブな役割の他に、ＮＲＧ−１が、種々の障害の後に、種々の特定の脳領域及び細胞種における、神経組織の再生における決定的な神経栄養性因子を提示することを示唆する。明らかに、これは神経関連回路の統合性の維持及び修復のための決定的な因子である：神経保護及び機能損失後の正しい再生における役割、また同様に活性に依存した神経的可塑性の形成における。
【０００６】
ニューレグリン−１βにおける興味は更に、Kastin et al., 2004が、ニューレグリン１βがこの血液脳関門を横断できることを示した時に、顕著に助長された。これにより、ニューレグリン１βの治療的使用のための展望が開かれた。
【０００７】
最近の研究は、神経保護における幅の広い適用を証明した。独立して、２つの刊行物においてニューレグリン１がＢＡＣＥ（β−セクレターゼ、β−アミロイド変換酵素）の基質でもあることを示し、これはニューレグリン−１のアルツハイマー病における関連性を示唆する（Glabe 2006; Schubert 2006）。
【０００８】
更に、シュワン細胞においてニューレグリン１が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素−Ａレダクターゼ、シュワン細胞におけるコレステロールの生合成のための速度制限酵素、の転写を増加させることが見出された（Pertusa et al. 2007）。これは、ミエリン鞘が影響を受ける全ての状態、例えば精神分裂病及び多発性硬化症、又はいわゆる「コレステロールリッチなラフト」が関与する認知関連機能のための広範囲にわたる示唆を有する（Schrattenholz and Soskic 2006）。軸索を取り囲むシュワン細胞は、ＮＲＧ−１レセプターＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３及び溶解性のＮＲＧ１α及びβを生理学的条件下で発現する。除神経に引き続き、成熟したシュワン細胞は軸索との接触を離れ、その形態を変化し、ＮＲＧ１βの発現を停止し、ＮＲＧ１α及びＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３発現を上方制御する（Geuna et al.2007; Karoutzou et al. 2007）。
【０００９】
加えて、遺伝的疫学的研究は、ニューレグリン１の精神分裂病及びアルツハイマー病、特にその精神病性形態への明らかな関与を示す（Farmer et al., 2007）。
【００１０】
いくつかの最近の遺伝学的集団分析は、特定のＮＲＧ−１−ＳＮＰ’ｓがアルツハイマー及び精神分裂病に関連することを示す（Go et al. 2005;Scolnick et al. 2006;Ross et al. 2006;Meeks et al. 2006;Farmer et al. 2007）。これらの知見の示唆するものは、図１に示した機能性ＮＲＧ含有複合体の他のタンパク質に関連する（ＥｒｂＢレセプター：（Benzel et al. 2007;Thomson et al. 2007;Hahn et al. 2006））。多発性硬化症におけるＮＲＧ１のための示唆もある（Esper et al. 2006）。
【００１１】
ＮＲＧ１リスクアレルと精神分裂病との間の関連の分子機構が、アルファ７サブタイプのニコチン性アセチルコリンレセプターの下方制御を含む可能性があることを暗示する結果がある（Mathew et al. 2007）。
【００１２】
本発明によれば、組み換え溶解性ニューレグリン１βアイソフォームが、学習及び記憶、精神分裂病、アルツハイマー病及びパーキンソン病のための動物モデルにおいて、医薬的有効性を示すことが見出された。ｉ．ｖ．投与後に、ニューレグリン１βアイソフォームは、対照医薬品の濃度に比較して顕著により低い濃度で活性があった。
【００１３】
このように、本発明の第１の観点は、神経学的状態、特に認知に関連した神経学的状態の治療のための医薬品の製造のための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用である。
【００１４】
本発明の更なる観点は、（ｉ）組み換え溶解性ニューレグリン１アイソフォーム及び（ｉｉ）特に神経学的状態、特に認知に関連した神経学的状態の治療のための更なる医薬品を含有する医薬組成物又はキットである。
【００１５】
本発明のまた更なる観点は、医薬品の製造のための記憶及び認知促進のための組み換え溶解性ニューレグリン１アイソフォームの使用である。
【００１６】
また更なる本発明の観点は、医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む神経学的状態の治療方法である。
【００１７】
また更なる本発明の観点は、医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む記憶及び認知の促進の治療方法である。
【００１８】
また更なる本発明の観点は、組み換え溶解性ニューレグリン１アイソフォームの更なる医薬品と一緒での共投与である。
【００１９】
本発明によれば、溶解性ニューレグリン１アイソフォームは、神経学的状態、特に状態、例えば精神疾患、例えば精神分裂病、双極性障害及びうつ病、神経変性性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん又は神経学的損傷、例えば卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷の治療のために有効であることが見出された。有利であるのは、精神分裂病、特に精神分裂病の認知に関連した観点、パーキンソン病及びアルツハイマー病の治療である。さらに、本発明は、記憶及び認知促進のための、特に神経学的状態、例えばアルツハイマー病及び精神分裂病に関連した記憶及び認知喪失を減少及び／又は抑制するための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用にも関する。
【００２０】
組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームは有利にはヒトのニューレグリン−１アイソフォームであり、すなわち、天然に生じるヒトのニューレグリン１−アイソフォームの１次アミノ酸配列又は少なくとも９０％、有利には少なくとも９５％、最も有利には少なくとも９８％の同一性を組み換えアイソフォームの全長に対して有する配列を含有する組み換えアイソフォームである。
【００２１】
本発明の溶解性組み換えニューレグリン−１アイソフォームは有利には、相応するニューレグリン−１の細胞外ドメインの少なくとも一部、例えばヒトのニューレグリン、例えばヒトのニューレグリン−１βの細胞外ドメインの少なくとも一部を含有する。
【００２２】
本発明の組み換え溶解性ニューレグリンアイソフォームは有利には、２５０アミノ酸までの、例えば１５０〜２５０アミノ酸の長さを有する。ニューレグリンアイソフォームの分子量は有利には、約１５〜約３５ＫＤ、有利には約２５〜約３２ＫＤであり、例えばこれはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）により測定される。組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム、特に組み換えニューレグリン−１βアイソフォームは、約４〜約９．５、有利には約４〜約６の等電点（ｐｌ）を有する。このアイソフォームは、修飾していないアミノ酸配列からなる修飾していないポリペプチド又は修飾ポリペプチドであってよく、その際この修飾は、リン酸化、グリコシル化、メチル化、ミリスチル化、酸化及びこの任意の組み合わせから選択されてよい。特に有利な一実施態様において、ニューレグリン−１アイソフォームは、少なくとも１のリン酸化したアミノ酸残基を含有する。更に、本発明は、非相同的（heterologous）残基、例えばポリ（アルキレンオキシド）残基、特にポリエチレングリコール残基に対するコンジュゲーションを包含する。
【００２３】
この組み換え溶解性アイソフォームは、標的とされる組織、例えば神経系、特に中枢神経系、例えば脳及び／又は脊髄中への有効な配送を達成する任意の経路により投与されてよい。ニューレグリンアイソフォームの医薬的に有効な濃度が、全身投与によって達成されてよいことが見出された。例えば、このアイソフォームは、注射又は注入、例えば静脈性注射により投与されてよい。このアイソフォームは有利には、０．１〜５０００ｎｇ／ｋｇの処置すべき被験体の体重の量で、特に２〜１０００ｎｇ／ｋｇの処置すべき被験体の体重の量で、より有利には３〜６００ｎｇ／ｋｇの処置すべき被験体の体重の量で、処置すべき状態の種類及び深刻度に依存して投与される。本発明の他の一実施態様においては、この溶解性アイソフォームは、局所的に投与されてもよく、例えば、中枢神経系への、例えば脊髄への及び／又は脳中への直接的な投与によって投与されてもよい。ｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射又は吸入装置による５００μｇ／ｋｇのより高い用量での投与も考慮されてよい。有利には、処置すべき被験体は、哺乳類、有利にはヒトの患者である。
【００２４】
この溶解性の組み換えニューレグリン−１アイソフォームは、独立薬物療法として、すなわち、単剤療法として又は共薬物療法として、すなわち、更なる医薬品、特に神経学的状態の治療に適している更なる医薬品との組み合わせにおいて投与されてよい。 更なる医薬品の例は、カテコールアミン代謝に作用する化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ−又はＣＯＭＴ−阻害剤、メマンチン型チャネル遮断剤、ドーパミン又はセロトニンレセプターアゴニスト又はアンタゴニスト、カテコールアミン又はセロトニン再取り込み阻害剤又は任意の種類の抗精神病薬、例えばクロザピン又はオランザピン又はガバペンチン様薬剤であり、とりわけアルツハイマー病及びパーキンソン病、精神分裂病、双極性障害、うつ病又はその他の神経学的状態の治療におけるものである。更なる医薬品の付加的な例は、神経保護剤、例えばＰＡＲＰ１阻害剤、例えばWO 2006/008118及びWO 2006/008119中に開示されているものであり、これは本願明細書により参照により組み込まれる。
【００２５】
したがって、本発明の一実施態様は、本願明細書に開示されたとおりの組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームと、精神学的疾病、例えば精神分裂病、双極性障害及びうつ病の治療のための医薬品、例えばオランザピン又はクロザピンとの組み合わせを参照する。更なる一実施態様は、組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム及び神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ＭＳ又はＡＬＳの治療のための医薬品との組み合わせを参照する。また更なる実施態様は、組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム及び神経学的損傷、例えば卒中、外傷性脳損傷又は脊髄損傷の治療のための医薬品の組み合わせを参照する。
【００２６】
この組み合わせ療法は、医薬組成物又はキットの形態にある組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム及び更なる医薬品の共投与により実施されてよく、その際、この個々の医薬品は、別個に又は共通の投与により投与される。
【００２７】
ニューレグリン−１アイソフォームは、ニューレグリン−１タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、又はタイプＶＩアイソフォーム、有利にはニューレグリン−１βアイソフォーム、ニューレグリン−１αアイソフォーム、又は、知覚及び運動神経由来因子（ＳＭＤＦ）アイソフォーム、特にニューレグリン−１β、より有利にはヒトのニューレグリン−１βアイソフォームであってよい。
【００２８】
ニューレグリン−１βアイソフォームは、血液脳関門を通じて能動的に輸送される。ｉ．ｖ．／ｉ．ｐ．注射後の脳中のニューレグリン−１βの傑出したバイオアベイラビリティは、実施例中に示されるとおり、ＮＲＧ１βの治療的適用に向けての道を開く。
【００２９】
抗アポトーシス性の、ミエリン安定性の抗炎症性特性の組み合わせにおいて、ＢＡＣＥとのその直接的な相互作用と一緒になって、卒中、アルツハイマー、ＭＳ及び精神分裂病及び他の神経学的状態の治療における機会を開く。
【００３０】
上で概要を示したとおり、本出願は、修飾されていない及び修飾されているニューレグリン−１アイソフォーム、特にニューレグリン−１βアイソフォームの使用を包含する。後翻訳修飾、例えばタンパク質加水分解性プロセッシング、リン酸化及びグリコシル化が、ニューレグリン−１、特にその細胞外ドメインの特定のアミノ酸残基で生じる証拠がある。特に、ニューレグリン−１の溶解性断片の放出は、報告されている（Buonanno and Fischbach 2001 ;Fischbach 2007）。可能性のある酸化も同様に報告されている（Nadri et al. 2007）。
【００３１】
本発明者らは、好ましい生理学的に活性のあるニューレグリン−１βアイソフォームが、ニューレグリン−１βの細胞外ドメイン又はその部分であって、翻訳後修飾されているものを含有することの証拠を得た。有利には、このアイソフォームは、リン酸化により修飾されていて、その際、１、２、３又はそれより多いアミノ酸側鎖残基、特にＯＨ基を有する側鎖残基、例えばＴｙｒ、Ｓｅｒ又はＴｈｒがリン酸化されている。有利なリン酸化部位は、アミノ酸位置７９〜８２、１３３〜１３６及び／又は１５８〜１６１（Falquet et al., 2002による命名法）に存在する。更に有利なリン酸化部位は、アミノ酸１２〜１４、３０〜３２及び／又は８５〜８７に存在する。更なる可能性のある修飾部位は、アミド化部位、有利には位置２２〜２５及び／又は３０〜３３にあるアミド化部位、位置１５０〜１５３、１５６〜１５９及び／又は２０４〜２０７にあるグリコシル化部位、及び、ミリスチル化部位、有利には位置９４〜９９、１４９〜１５４、１６８〜１７３、１７５〜１８０及び／又は２０２〜２０７にあるミリスチル化部位であり、これはFalquet et al. 2002による命名法による。
【００３２】
以下においては、本出願による実験データの関連性が、好ましい医薬的適応症に関して説明される。
【００３３】
精神分裂病
精神分裂病は、症状、例えば幻聴、障害された思考及び妄想、意欲消失、快感消失、鈍化された情動及び無関心を伴う深刻かつ不能化にする精神障害である。疫学的、臨床的、神経心理学的かつ神経生理学的研究は、脳の発達における異常性及び進行する神経可塑性が、前記疾患の病原論において重要な役割を果たすことについての実質的な証拠を提供している（Arnold et al. 2005）。
【００３４】
精神分裂病は、ドーパミン作動性の神経伝達の疾患を含むと考えられるが、しかしながら、グルタミン酸作動性神経伝達によるドーパミン作動性の系の調節が重要な役割を果たすように見える。この観点は、グルタミン酸作動性の系に対して機能的な作用を有するニューレグリン−及びジスビンジン遺伝子の遺伝的な知見により支持される（Muller and Schwarz 2006）。ますます明らかになったのは、精神分裂病に寄与する遺伝子（neuregulinsを含む）を含むようである幾つかの領域が、双極性情動障害にも関連することであり、知見は最近の一対のデータにより支持される（Farmer et al. 2007;Owen et al. 2007）。
【００３５】
ニューレグリン−１は、神経細胞移動、軸索誘導及びミエリン化に対する作用を有する精神病感受性遺伝子であり、これは精神分裂病及び双極性障害における異常な解剖学的及び機能的連結性の知見を有効に説明できる可能性がある（Mclntosh et al. 2007）。
【００３６】
ニューレグリン１の精神分裂病への遺伝学的連結のますます増加する一連の証拠が存在する（レビュー：Farmer et al., 2007）。ニューレグリン−１によるグルタマート、ＧＡＢＡ及びニコチン性神経伝達の促進（Fischbach 2007;Woo et al. 2007;Li et al. 2007）は、この文脈において関連し、脳炎症を有する掛かり合いも同様である（Hanninen et al. 2007）。
【００３７】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ−レダクターゼの制御、コレステロール生合成のための速度制限酵素（Pertusa et al. 2007）（ミエリン化にとって重要である）は、この状態において同様に掛かり合いを有すると推定される。
【００３８】
精神分裂病、双極性疾患及びうつ病に共通の遺伝子的危険因子の中で、ＮＲＧ１が傑出した役割を果たすという事実は、この精神病において示唆される遺伝子、例えばＮＲＧ−１が結局症状によるよりむしろ生物学に依存した分類のための基礎を提供する可能性があってよく、かつ、これらの複雑な脳疾患のための新規の治療戦略を生じることについて示唆を提起している（Blackwood et al. 2007;Bertram et al. 2007）。
【００３９】
本出願のこの実験的なデータは、精神分裂病の実験モデルにおける溶解性組み換えニューレグリン−１βアイソフォームの投与の有効性を実証する。
【００４０】
アルツハイマー病
本発明者らによる初期の研究は、ニューレグリン１βがアルツハイマー患者の脳の海馬の死後の切片において、年齢適合対照に比較して減少していること（Sommer et al., 2004）を、ニューレグリン１の溶解性の断片と放射状迷路試験における学習能力との明白な正の相関と一緒に示した（Sommer et al., 2004）。
【００４１】
シナプス性変化に依存した活性におけるＮＲＧ−１の役割（Xie et al. 2006;Kwon et al. 2005;Rimer et al. 2005;Bao et al. 2004;Yang et al. 2005）が、学習及び記憶のために重要であることを実証する数々の報告が存在する（Ozaki et al. 1997;Ozaki et al. 2004;Golub et al. 2004;Schillo et al. 2005b）。以下示すとおり、細胞外ドメインを含有するＮＲＧ１β断片は、行動的な動物モデルにおいて学習と明らかに関連していた。アルツハイマー患者の海馬領域（短期間記憶形成を担う）の死後の脳スライスにおいて、年齢適合した対照に比較してタンパク質の減少した発現を示すことは、明らかにいまだ健康な神経細胞の領域において、記憶に関連したシナプス性活性の非存在を実証できた。
【００４２】
極めて最近の発見（Hu et al. 2006;Glabe 2006;Schubert 2006）は、ＢＡＣＥ１（＝βセクレターゼ）によりＮＲＧ１がプロセッシングされることを示し、この酵素はアルツハイマー病を有する人の脳中でアミロイドβの凝集物の産生を助けるものであり、これは、アルツハイマー病への関連、ＮＲＧ１の神経栄養性特性に関するミエリン形成における同時発生する役割を説明する（Hu et al., 2006;Glabe 2006; Schubert 2006）。酵素、ＢＡＣＥ１（ベータ位置アミロイド前駆体タンパク質を開裂する酵素１）は、より大きな前駆体からアミロイドβを開裂することが要求される。（ＢＡＣＥ１媒介した開裂後に、プレセリニン含有複合体γセクレターゼは、最終的な開裂を生じ、アミロイドβを放出する。
【００４３】
セクレターゼによるＮＲＧの開裂は、神経のミエリン化にとって決定的である。アミロイド前駆体タンパク質とちょうど同じように、ニューレグリン１もまたβセクレターゼにより開裂される。βセクレターゼによるニューレグリン１のタンパク質加水分解的開裂は、シュワン細胞による末梢神経ミエリン化にとって決定的である。βセクレターゼを標的とする薬剤は、末梢神経発達及び機能に作用することができる。
【００４４】
この初期の観察は、ＢＡＣＥ１もミエリン化のために要求されるようであることを見出したHaass（Willem et al. 2006）のグループにより為された。末端神経ミエリン化は生涯の初期に生じ、したがってどのようにＢＡＣＥ１阻害がより高齢の動物に作用する可能性があるかは明らかでない。ＢＡＣＥ１もまた中心神経系のミエリン化において役割を有することについて示唆がある。ＢＡＣＥ−１を欠失しているトランスジェニック動物は、末梢神経においてミエリン欠陥を有していた。
【００４５】
神経変性及びアルツハイマー病の関連においても、ニューレグリン１によるグルタマート、ＧＡＢＡ及びニコチン性神経伝達の促進の最近の発見は関連する（Fischbach 2007;Woo et al. 2007;Li et al. 2007）。
【００４６】
本出願のこの実験データは、アルツハイマー病の実験モデルにおける溶解性組み換えニューレグリン１βアイソフォームの投与の有効性を実証する。
【００４７】
卒中、外傷性脳損傷
ＵＳにおける独立した外部研究による一連の卒中に関連したｉｎ ｖｉｖｏ実験は、自体で抗アポトーシス性であるニューレグリン１の神経保護を実証する（Xu et al., 2004, 2005 and 2006; Guo et al., 2006）。
【００４８】
ＮＲＧ−１は、中脳動脈閉塞（通常の卒中モデル）後の神経ダメージを減少し、神経学的結果を改善する（Xu et al. 2005b;Xu et al. 2004;Xu et al. 2006;Guo et al. 2006）。
【００４９】
虚血／再灌流による脳損傷を減弱させることにおける組み換えヒトＮＲＧ−１の治療的有効性及び機構についての同じ研究において、ＮＲＧが抗アポトーシス性であることが見出された。ＮＲＧ−１（３．０ｎｇ／ｋｇ）を中脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の１０分前に血管内に適用し、引き続き９０分間の局所脳虚血及び２４時間の再灌流をした。
【００５０】
本発明のデータは、組み換えの溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの低濃度での投与が、顕著な薬理学的作用を有すること、したがって卒中及び外傷性脳損傷のモデルにおいて有効であるようであることを実証する。
【００５１】
以下においては、本出願は以下に示す図面及び実施例によりより詳細に説明される。
【００５２】
図１：ニューレグリン１についての様々な総説及び数多くの研究論文は、神経変性疾患、神経学的疾病また同様に生理学的機能において中心的であると考えられる機構の上流の制御性原則としてのＮＲＧ１の鍵となる機能的位置を示す。
【００５３】
ＮＲＧは、機能性複合体の鍵となる部分であり、少なくともニューレグリン（ＮＲＧ）、レセプターチロシンキナーゼ（ＥｒｂＢレセプター）、へパランスルファートプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）及びＮＭＤＡレセプター（ＮＭＤＡＲ）からなり、これは一過的にかつ活性に依存してコレステロール（ＣＨＯ）リッチな膜マイクロドメイン中に一緒になって組み立てられる。特に、カルシウムシグナリングの形成は、翻訳後修飾によるシナプス下足場タンパク質との相互作用のために重要である（ＰＳＤ−９５、特定のリン酸化されたドメイン、例えばパートナータンパク質上のＰＤＺ又はＳＨドメインとの相互作用による）。このＰＳＤ９５複合体は、直接的に炎症促進性酵素、例えば酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ、ｉＮＯＳが誘導性であり、ｎＮＯＳは神経性である）及びＣｏｘ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）を制御し、これは関連するが、必ずしも下流でない機構との複雑な関係においてその作用を促進し、前記機構はＮＡＤ+依存性酵素、例えばＰＡＲＰ−１（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）及びＳｉｒ−２（シルツイン−２）を伴う；ＰＡＲＧは、ポリ（ＡＤＰリボース）グリコヒドロラーゼであり、ＰＡＲＰ−１に対する相補的かつアンタゴニスト性の酵素であり、ＨＤＡＣはヒストンジアセチラーゼであり、Ｓｉｒ−２を含む一般的な酵素クラスである。ＭＰＴＰは、ミトコンドリア透過性遷移孔を意味する。ＤＲＰ−２は、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質２である。また他の重要な膜タンパク質、例えば特定の二コチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲα７）、ＧＡＢＡAレセプター（ＧＡＢＡAＲ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及びプロテアーゼ（ＰＳ）は、脂質ラフトにおいて一過的に組織化され、かつ、様々な機能的特性をこの通常のリン脂質（ＰＬ）の環境の外側で必要とし、詳細は、（Schratten holz and Soskic 2006）中にある。
【００５４】
図２：モリス水迷路（Morris water maze）中の学習実験の要約：ニューレグリン１β（ＮＲＧ−１βＥＣＤ）の溶解性細胞外ドメインの一日量３ｎｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）で処置した動物は、ビヒクル処理動物に比較して学習が顕著により良好であった；ＩＡＥ：内部領域入場；ＩＡＥＦ内部領域入場頻度；ＴＳ：内部領域中で過ごした時間；ＤＴ：内部領域中で移動した距離。
【００５５】
図３：ＮＲＧ−１βＥＣＤによるアンフェタミン誘発された活動過剰の減少、精神分裂病のために広く許容されているモデル。濃度は１５〜６００ｎｇ／ｋｇ（アンフェタミン適用１５分前のｉ．ｖ．注射）にわたった。ハロペリドール０．１２５ｍｇ／ｋｇの正の対照を含めた。
【００５６】
ハロペリドールが他の非典型的及び典型的な抗精神病薬と同様に通常は活動を対照レベルより下に減少させる一方で（ここではｖｅｈ／ｖｅｈと記した点線で示した、青で横断、赤で立ち上がり（rear））、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ減少は漸近的に活動の対照レベルに近づくが、更なる減少は生じない。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの低い有効濃度及び好ましくない作用（ビヒクル対照レベル未満の活動の減少）の非存在は、このモデルにおける傑出した特性である。この作用は、ｐ＜０．０５で有意である。
【００５７】
図４：モリス水迷路中での脳のアミロイドーシス及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルを用いた学習実験の要約：ｉ．ｐ．のＮＲＧ−１β−ＥＣＤの一日量２００ｎｇ／ｋｇ処置した動物は、ビヒクル処理動物に比較して学習が顕著により良好であった；ＩＡＥ：内部領域入場；ＩＡＥＦ内部領域入場頻度；ＴＳ：内部領域中で過ごした時間；ＤＴ：内部領域中で移動した距離。
【００５８】
図５：ドーパミン及びその代謝産物のＨＰＬＣ定量化：アスタリスクで標識した縦欄は高度に有意である。
【００５９】
【表１】
【００６０】
図６：ＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴによるドーパミンの代謝
【００６１】
図７：ＭＰＴＰ暴露は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な損失を生じる（ａＭＰＴＰ、ｐ＝０．０００５；及びｃＭＰＴＰ、ｐ＝０．００７５）。２０ｎｇ／ｋｇのＮＲＧ−１β−ＥＣＤのｉｐ適用は、反転（ａＮＲ−ＭＰＴＰ；ｐ＝０．５７、すなわち、ビヒクル対照から相違しない）又は明白な又は顕著なＭＰＴＰ障害の改善を生じる（ｃＮＲ−ＭＰＴＰ；ｐ＝０．００９７）；慢性モデル（２０ｎｇ／ｋｇのＮＲＧ−１β−ＥＣＤの５日間毎日のｉｐ適用）においては、ドーパミン作動性ニューロンの数の顕著な作用もある（ｃＮＲ：ｐ＝０．０００２）。
【００６２】
【表２】
【００６３】
図８：ニューレグリン−１βについて染色したＡＰＰＰＳマウスの脳タンパク質の２Ｄウェスタンブロットの２個の代表画像は、それぞれの、処理しかつ良好な学習動物（上）及び未処理の劣った学習能力を有する動物（下）を示す。上方部分における数は、２Ｄゲルのｐｌ値である。
【００６４】
図９：ウェスタンブロット実験は、アルツハイマー患者及び対照からの死後の皮質材料における余剰のＮＲＧ−１β−ＥＣＤ断片を比較する。
【００６５】
図１０：２Ｄ−ＰＡＧＥは、約５〜５．５のｐｌ及び約２５〜３２ｋＤの分子量を有するＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性アイソフォームは、この実験においてアルツハイマー病の患者の脳において明白に減少していることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ニューレグリン１についての、神経変性疾患、神経学的疾病また同様に生理学的機能において中心的であると考えられる機構の上流の制御性原則としてのＮＲＧ１の鍵となる機能的位置を示す図である。
【図２】図２は、モリス水迷路（Morris water maze）中の学習実験の要約を示す図である。
【図３】図３は、ＮＲＧ−１βＥＣＤによるアンフェタミン誘発された活動過剰の減少を示す図である。
【図４】図４は、モリス水迷路中での脳のアミロイドーシス及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルを用いた学習実験の要約を示す図である。
【図５】図５は、ドーパミン及びその代謝産物のＨＰＬＣ定量化を示す図である。
【図６】図６は、ＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴによるドーパミンの代謝を示す図である。
【図７】図７は、ＭＰＴＰ暴露は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な損失を生じることを示す図である。
【図８】図８は、ニューレグリン−１βについて染色したＡＰＰＰＳマウスの脳タンパク質の２Ｄウェスタンブロットの２個の代表画像を示す図である。
【図９】図９は、ウェスタンブロット実験により、アルツハイマー患者及び対照からの死後の皮質材料における余剰のＮＲＧ−１β−ＥＣＤ断片を比較する図である。
【図１０】図１０は、約５〜５．５のｐｌ及び約２５〜３２ｋＤの分子量を有するＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性アイソフォームは、この実験においてアルツハイマー病の患者の脳において明白に減少していることを示す図である。
【図１１】図１１は、実験のセットアップを示す図である。
【図１２】図１２は、動物の経路記録からコンピューター計算されるべきパラメーターの定義のための区域を示す図である。
【００６７】
実施例
一般：
以下の全実験においては、ニューレグリン−１βの断片を使用しており、これは、ヒトのｎｒｇ−１遺伝子の全転写産物の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみを含有する。これは、リン酸化及び／又はグリコシル化状態に依存して約２５〜３２ｋＤの分子量及び約５〜９．５の等電点を有した。
【００６８】
ニューレグリン−１アイソフォームの生理学的に活性のある形態は、約５．５のｐｌを有する。この生理学的に活性のある形態は、約５．５のｐｌを有する（この実験のほとんどは、市販の、大腸菌（E.coli）中で産生されるアイソフォームを用いて実施され、これは２６ｋＤの分子量及び約９．０のｐｌを有する）。
【００６９】
このアイソフォームは、R & D Systems, Inc.から購入された（カタログ番号377-HB-CF）、ＮＲＧ−１βの最初の２４５アミノ酸からなる組み換え溶解性ヒトのＮＲＧ−１β断片である。以下においてはＮＲＧ−１β−ＥＣＤと名付けられる。この活性のあるアイソフォームは約９．０のｐｌを有する。
【００７０】
我々は、８ｋＤを有するＮＲＧ−１βの相応する断片も試験し、これはR&D Systemsから購入された（カタログ番号396-HB）ＥＧＦドメインのみを含有する。この断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもまた同様にｉｎ ｖｉｖｏでも神経保護性であるようであるが、発癌性に関する憂慮を惹起するより高度な増殖特性のために、詳細には調査しなかった。
【００７１】
実施例１
初期の毒物学的データは、ＮＲＧ１β（ＥＣＤ）が急性毒物学及びｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異性試験において不利な作用を有しないことを示す。
・ラットにおいて急性の静脈性毒性は存在しなかった：全ての動物は研究期間の終わりまで生存した。研究の経過の間に臨床徴候は観察されなかった。動物の体重は、この株及び年齢について一般的に記録される範囲内にあった。屍検では顕微鏡的知見は記録されなかった。１４日間の期間にわたり観察された、メスのラットへの単一静脈投与後のＮＲＧβ１（ＥＣＤ）の中央致死量は：ＬＤ50（メスのラット）：５０００ｎｇ／ｋｇ体重より多い。
・用量レベル５０、２００及び６００ｎｇ／ｋｇ体重／ｄでの７日間の期間にわたるニューレグリンの毎日の静脈投与は、いかなる未成熟な死も生じなかった。臨床徴候は観察されなかった。この処置は、餌消費及び体重発育に作用しなかった。この無影響レベル（ＮＯＥＬ）を６００ｎｇ／ｋｇ体重／ｄで確立した。
・細胞系Ｌ５１７８Ｙを使用した、OECD Guideline for the Testing of Chemicals, No. 476 "In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test"によるマウスリンパ腫チミジンキナーゼ遺伝子座（locus）アッセイにおいて、ＮＲＧ１Ｂ（ＥＣＤ）は非突然変異誘発性であった。
・OECD Guideline for the Testing of Chemicals, No. 473によるチャイニーズハムスターＶ７９細胞中での染色体異常試験において、ＮＲＧ１β（ＥＣＤ）は構造的な染色体異常を誘発しなかった。
【００７２】
更に、有効性に関して実施されたこの動物実験のいずれにおいても（この幾つかのものは毎日のｉｖ適用を用いて数ヶ月継続する）、ＮＲＧ１β（ＥＣＤ）の不利な作用は全く観察しなかった。
【００７３】
以下に説明する様々な動物モデルにおけるＮＲＧ１β（ＥＣＤ）の適用は、静脈（ｉｖ）又は腹腔内（ｉｐ）注射のいずれかにより行われた；濃度は３〜６００ｎｇ／ｋｇの範囲にわたった。
【００７４】
実施例２
学習及び記憶：ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ適用あり及び無しでの空間学習
方法：
モリス水迷路は、空間学習を評価する。これは、動物を水で満たしたプール中で泳がせ、かつ、この表面のすぐ下に沈められた救助足場（rescue platform）を見つけさせる。この足場が迷路の壁から離れて配置され、かつ、動物が位置の推定を可能にする水表面から可視できる参照点を有し、但し、これが連想学習を可能にするために標的に十分近すぎないことが必須である。動物は、足場を介した場合にのみ救助がくるように訓練され、これは足場を見いだせない全ての動物は足場に案内され、かつ、このセットアップから取り除かれる前に休息させることを意味する。したがって、マウスにとって最も重要な参照点の１つは、人間の操作者である。
【００７５】
実験は、ネズミの空間想起に関連した２つの鍵となるパラメーターの決定を目的とする：
・マウスがこの足場を配置し直す（relocate）ことを学習する速度、
・短期間でこの情報を保持する能力（訓練期間内又はオーバーナイト）。
【００７６】
動物
この研究をＡＰＰ／ＰＳマウス（Meyer-Luehmann et al. 2006;Radde et al. 2006）の２つの群を用いて実施し、このうちの一方をＮＲＧ−１β−ＥＣＤの毎日の用量により処置し、かつ、もう一方は対照として偽処置されている。それぞれの群は、最初の実験系列の開始時に９週齢の８匹の雄からなる。
【００７７】
この最初の実験系列は、４２週に８匹の処理したマウス及び８匹の未処理マウスの２つのサブグループで開始し、１５日間にわたり持続するものである。更なる同一の実験の系列は、６、１２等の週間後に実施されるものである。
【００７８】
第２の一対のサブグループ（８匹の処理及び８匹の未処理の９週齢の雄）については、同じ系列の実験を４８週に開始し、この結果このサブグループの実験はこの最初のサブグループの１つのちょうど６週間遅れである。
【００７９】
装置
この処理及び未処理ＡＰＰ／ＰＳマウスの学習適性を、円形のモリス水迷路を用いて評価し、これはマウスを消耗させることなく探索空間を提供するために十分大きい必要がある。最大限に注意を払うべきは、全ての実験を通じて実験のセットアップの各詳細を可能な限り変動しないように維持することである。
【００８０】
この現在の研究においては、１２０ｃｍの直径のプールを使用し、これは実験室中で常に同一の向きを有して正確に再現可能な位置に配置されている。プール中の固定された位置で、白色の半透明な円形の、１５、１０又は５ｃｍの直径の足場を配置し、これは水面のちょうど下へと延び（この結果この足場はマウスに見えない）、かつ、動物がよじ上れるように配置されている−これは水から出て休息するための唯一の手段である。よじ登りを評価するために、足場は金網グリップで被覆されている（図１１参照）。
【００８１】
以下説明するとおりに救助手順を検査試験において実施するために、足場に、直接的な操作者の介入なしに自動的に昇降可能にする機構を備える。このようにして、その高さに依存して、足場は水泳中のネズミにとってアクセス可能であるか又は「オンデマンド足場」（Buresova et al. 1985）ではない。
【００８２】
足場配置は環状に形成された、それぞれ〜４０ｃｍ及び〜８０ｃｍの内側直径及び外側直径を有するプールの同心状の領域中に常に配置されりる。４つの四分円は、足場がこのうちの１の中心領域を占めるように定義される（標的四分円）。足場サイズ及び位置についての更なる詳細については以下を参照のこと。
【００８３】
足場位置がこの実験の全系列を通じて正確に同じになることを確かにするために、ソケットをプール床に固く添え、この上に足場は最小限の空間的許容性でもって取り付けられることができる。足場の上部には、その中心に、水から突出する（隣接する）手がかりのための他の取り付けが存在し、これは、ビデオ録画で良好に可視可能であり、同様のことはプール中の水泳するマウスについても当てはまる。足場位置の確認のために、短いビデオ録画が動物なしではあるが足場中へとはめ込まれた手がかりありで行われるものであり、これは足場又はビデオカメラがいずれにせよ操作される場合にはいつでも当てはまる。
【００８４】
水は、低脂肪乳粉末を用いて不透明にしてある。水温は、出口の探索を促すために十分冷たいことが望ましいが、動物が苦しんだり又は消耗するほど冷たくはない。適正な妥協策として、水温はそれぞれの実験の開始時にモニターされ、かつ、温水又は氷片でもって１８℃に調節される。個々の試験の間に温度を必要に応じて再適合させる。
【００８５】
（異なる単純な幾何学的形状及び異なる色彩、高さ〜２０ｃｍの）４つの遠位の手がかりを、プールの側面の〜２０ｃｍ上方に取り付け、各四分円中に１つである。注意すべきであるのは、全ての実験を通じてこの正確に同じ配置中に手がかりが配置されていることである。全体のプールを白色の半透明のカーテンにより囲む。照明は薄暗くかつ散乱的である。
【００８６】
ビデオカメラをプール中心の上のちょうど垂直な位置に固く取り付け、この結果プールは完全にビデオ画像を満たす。ビデオ録画を少なくともＰＡＬ解像度でとる（７２０×５７６ピクセル、１秒間あたり２５フレーム）。ビデオを自動追跡システムにより評価し、この結果時間に伴う動物の運動の欠点のない検出が可能になる。
【００８７】
スティック上に取り付けられた特殊な装置を用いてマウスを水中に配置し、この結果これらは半透明なカーテン製の小屋に入る操作者なしにプールの縁にそって正確に定義されたスポットで水で湿潤されることができる。
【００８８】
実験的設計
各セッションにおいて、マウスを予め定義された部位でプール中に配置し、６０秒間水泳させる。動物の運動路をビデオ追跡システムにより記録し、パラメーターをコンピューター計算し、ここから動物の学習適性に関する結論が導き出される（最も明らかであるのは、マウスがこの足場に最初にぶつかるまでの時間＝「逃走潜時」；更なる詳細については以下参照のこと）。マウスが足場の発見に成功すると、短期間（〜１５ｓ）そこに休息させたままにする。さもなければ、水泳６０秒後、マウスを操作者により足場に案内し、〜１５秒間休息させる。その後、操作者により持ち上げ、優しく乾燥させ、その小屋に戻すか又は次の水泳のために準備させる。
【００８９】
実験のそれぞれの日に、マウスにつき１の試験を早朝に実施する。それぞれの試験は２つの連続的な水泳からなり、これは２つの異なる四分円から発生するが、標的四分円からでない。正確な水でぬらす部位（及び適用可能である場合には常に足場部位）は、それぞれの日のそれぞれの水泳についてランダムに割り当てられ、しかしながらこの日の間の個々のマウスの間で相違しない。
【００９０】
マウスが水泳の回数を極めて緩慢に学習することが分かった場合には１回の試験について又は１日につき複数の試験について増加してよい（逆も同じである）。さらに、多くのマウス株において若い動物は極めて迅速に学習し、このため訓練の４又は５日後に、逃走潜時は数秒間のみ一定のままであり、これは処理動物においても未処理動物においても等しく事実である。しかしながら、統計学的評価については、訓練日数にわたる逃走潜時の曲線が飽和せずむしろ単調に減少する場合に有利である。したがって、解決すべき問題が訓練の進行に伴いより困難になる実験的設計を使用する：予め定義された日に足場をより小さいものと置き換え、その一方でこの足場の中心座標は同じままである。足場が交換される場合又はその時は、実験のそれぞれの系列について独立して決定されてよく、かつ、先立つ系列の結果に依存すべきである。
【００９１】
実験のそれぞれの系列においてマウスに３つの異なる種類の課題を課す：
・合図された配置ナビゲーション。プラットフォームを手がかりでマークし、マウスを足場を見つけるまで泳がせる。この手順は連想的学習を試験し、マウスを可能な限り類似している学習適性である２つの実験群にわけるのに役立つ。更に、第２の及び更なる系列の実験において、合図された場所ナビゲーションは、先行する系列における足場の位置の薄れていく想起を支持する。
・隠された足場獲得訓練。足場はマウスに可視可能でなく、かつ、先行する水泳の間に同じ配置に位置される。この課題は、隠された足場の正確な配置を想起することについてのてマウスの進歩をモニターすることを可能にする（「空間的学習」）。
・検査試験実験。この課題において、オンデマンド足場を表面下に最大限低下させ、マウスをこれを自由に探索させながら泳がせる。検査試験実験は、動物の絶対的な想起を評価し、これは、この文脈においては、足場配置に関する信念、忍耐又は確信とも解釈されることができる。実験を解釈するための慣用的アプローチとは、足場の固く固定された場所を有する動物が、限定された場所においてより忍耐強く探索し、したがって足場の隣の区域においてより時間を費やすであろうことである。
・検査試験実験において、足場を見出すことについての不能性が足場区域へと泳ぐための刺激を減少させる可能性があるという危険が存在する。これらのいらだちを可能な限り小さく維持するために、ヒトの救助の調節は同じに維持されなくてはならず、この結果、足場の非存在にもかかわらず幾ばくかの空間的な不変性が存在する。したがって、水泳６０ｓ後足場を表面のちょうど下におろし、このマウスをここに操作者により案内し、この装置から取り出される前に〜１５ｓにわたり休息させる。
検査試験実験の全ての日に、ただ一回の水泳が実施される。
【００９２】
各試験の約６０分間前に、マウスを毎日ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ５ｎｇ／ｋｇ（黒色の６マウスの血清中に懸濁され、マウスにつき２０μｌの容量においてｉ．ｖ．で提供）又はビヒクル２０μｌでそれぞれｉ．ｖ．で処理した。
【００９３】
第１の系列の実験の１日目に、全てのマウスは研究において偽処理のみを受けた。この後でマウスをニューレグリン及び対照群に割り当て、この結果逃走潜時の分布が両者のグループで適合する。
【００９４】
それぞれの系列の実験において、以下の年代記を添付する：
１日目．１０ｃｍの大きさ及び各水泳毎に変化する位置の足場を用いた合図された足場探索。
２日目．１０ｃｍの大きさ及び各水泳毎に変化する位置の足場を用いた合図された足場探索。
３日目．１０ｃｍの大きさ及び各水泳毎に変化する位置の足場を用いた合図された足場探索。
４日目．１０ｃｍの大きさ及び３日目の最後のものと同じ位置の足場を用いた合図された足場探索。
５日目．１５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
６日目．１５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
７日目．１５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
８日目．１０ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
９日目．検査試験実験。
１０日目．１０ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１１日目．１０ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１２日目．５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１３日目．５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１４日目．５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１５日目．検査試験実験。
【００９５】
存在する足場なしにマウスを数日間自由に泳がせることにより、先行するセットの実験から足場の位置の反学習を助力することが必要であってよい。
【００９６】
学習速度を各訓練／試験セッションをモニターし、かつ、足場を見出すことにおける動物の成功また同様に、足場がある中心領域近辺において探索すべき側から移動して遠ざかるためのプールの側面を回避することからの探索戦略の進化に注意することにより評価する。
【００９７】
測定されたパラメーター
動物のビデオ記録から、それぞれのマウスの動き経路を抽出し、ｘ、ｙの系列及び時間軸として更なるプロセス処理のためエクスポートする。
【００９８】
信頼してそれぞれの経路の開始点を同定できるよう、かつ、追跡エラーを回避するように、注意しなくてはならない。同時に、パラメーターの数をコンピューター計算し、ここから動物の学習適性に関する結論が導かれることができる（以下参照のこと）。パラメーター記録は６０秒後又はマウスが足場を見出した場合に維持する（いずれかより早く起こった方）。
【００９９】
動物の経路記録からコンピューター計算されるべきパラメーターの定義のために以下の区域が定義される（図１２参照のこと）：
評価を可能な限り柔軟に維持するために、５．５〜３０ｃｍの直径の４つの同心標的区域（足場に関して中心にある）を利用する。
【０１００】
動物の経路記録からコンピューター計算されるパラメーターは次のものを含む：
・移動した全距離
・全体的な平均速度
・プール中心への入場の回数
・プール中心中での時間
・プール中心への最初の入場への潜時
・最初の入場からプール中心へと移動した距離
・内部領域への入場の回数
・内部領域中での時間
・内部領域中で移動した距離
・内部領域への最初の入場への潜時
・内部領域への最初の入口へ及び各標的区域１〜４及び標的四分円のために移動した距離
・区域への入場の回数
・区域中での時間
・区域中に移動した距離
・区域に最初に入場するための潜時
・区域に最初に入場するために移動した距離
・経路の開始から区域の最も近い点への距離
・区域の外側の場合の区域からの平均距離
・区域の外側の場合の区域からの最小距離
・区域の外側の場合の区域からの最小距離への時間
・区域に近づく時間
・区域から更に離れる時間
・区域にむかって移動する時間
・区域から離れて移動する時間
・区域へのヘッド（head）入場の回数
・区域中でのヘッドの時間
・ヘッドが区域中で移動した距離
・区域へのヘッドの最初の入場の潜時
・区域の外側の場合の区域からのヘッドの平均距離
・区域の外側の場合の区域からのヘッドの最小距離
・最初のヘッディングエラー
・平均のヘッディングエラー
・区域から出る回数。
【０１０１】
実験それぞれの日のために、処理および未処理の群中の学習進展のパラメーターの読み取りを、相互に統計学的に比較する。
【０１０２】
個々のマウスの経路記録を試験する場合に、ヒトの観察者は、足場を配置することについての動物の主張（assertiveness）の妥当に現実的な認知をすることができるようになり、これは測定されたパラメーター値において完全には反映されていない。したがって、経路記録をも手動で検査し、足場位置の動物の想起を評価した。
【０１０３】
結果：
一日量３ｎｇ／ｋｇのＮＲＧ−１β−ＥＣＤでｉ．ｖ．で訓練の３０分前に処理したこれらの動物は、ビヒクル処理群に比較して学習関連パラメーターにおいて顕著により良好であった。
【０１０４】
ニューレグリンは改善された学習のみでなく、しかしながら処理された動物は、より発達した探索戦略も有した。より多くの処理動物は、プールの内側領域に入り（１１ｖｓ．７、ｐ＝０．０１９）、内側領域への入場はより頻繁に生じ（２．１７ｖｓ．０．９２回、ｐ＝０．０２）、内側領域中を移動して費やした時間及び距離はより長かった（６．５１ｖｓ．２．１３ｓ、ｐ＝０．０９及び０．６４ｍ ｖｓ．０．２５ｍ、ｐ＝０．０３１、それぞれ）。
【０１０５】
モリス水迷路中での学習実験の結果を図２に要約する。
【０１０６】
実施例３
精神分裂病：ラット中でアンフェタミン誘発された活動過剰
方法：
抗精神病及び抗パーキンソン病活性を検出する方法は、Costall et al. 1978により説明された方法にならい、そしてBoissier and Simon 1966により説明されたものに類似する活動メーターを使用する。
【０１０７】
アンフェタミンはこの試験状況において活動過剰を誘発する。活動過剰は、辺縁系レベルでのドーパミン作動系に作用する典型的かつ非定型の（atypical）向精神病薬により拮抗され、かつ、抗パーキンソン薬により強化される。
【０１０８】
ラットにｄ−アンフェタミン（３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を注射し、すぐさま活動メーター中に配置する。
【０１０９】
この活動メーターは、１２個のカバー付きプレキシガラスケージ（４０×２５×２５ｃｍ）からなり、暗くしたキャビネット内に含まれる。それぞれのケージは、それぞれのケージの末端で、床の３ｃｍ上に２つのフォトセル組立を備え、これは、ケージの一端からもう一端へとそれぞれの動物（ケージにつき一匹）による動きの数を測定するためである。２つの更なるフォトセル組立を、立ち上がり（rearing）を記録するために床上２０ｃｍに配置する。活動及び立ち上がりのためのスコアを、１０分間の間隔でコンピューターにより記録し、３０分間の期間にわたり蓄積した。
【０１１０】
１５匹のラットを一群につき研究した。この試験を盲検的に実施した。この試験物質を、８の用量で評価し、アンフェタミンの１５分前にｉ．ｖ．投与し、ビヒクル対照群と比較する。実験は、アンフェタミンで未処理の対照群も含んだ。同じ実験状況で投与したハロペリドール（０．１２５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）を参照物質して使用した。この実験はしたがって１６群を含んだ。
【０１１１】
データを対応のないスチューデントのｔ試験を用いて処理群と適当な対照とを比較することにより分析した。
【０１１２】
結果：
図３に示されるとおり、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは用量依存的にアンフェタミンにより誘発された過剰活動を精神分裂病のための動物モデル中で抑制した。著しく、この実験はＮＲＧ−１β−ＥＣＤの傑出した特性を明らかにする：
・図３中に示される作用は、実験の第２の半分（２０〜４０分）において最強である。最初の２０分間においてはより小さな作用のみが見出されることができ、これはこのタンパク質の更なるプロセッシングへと作用点を遅延させた。
・ここで使用したＮＲＧ−１β−ＥＣＤの有効濃度は、典型的な対照神経遮断薬、例えばハロペリドール（１２５μｇ／ｋｇ）について使用したものよりも約２００〜１０００倍より低い。
・ハロペリドール、クロザピン、オランザピンその他とは対照的に、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤはビヒクル対照レベル未満に試験動物の活動を減少させないので、不利な作用は観察されない。
【０１１３】
実施例４
精神分裂病：プレパルス阻害
ＮＲＧ１ノックアウトを有する齧歯類は、顕著に損なわれたプレパルス阻害（ＰＰＩ）を示し、これはＮＲＧ１を精神分裂病につなげる。動物モデル中の精神病の広く使用される代理測定、ＰＰＩは、精神分裂病エンドフェノタイプと考えられる。精神分裂病及び健康な対照集団の両者において、広範なジェノタイピング後に、ＰＰＩに対して、ＮＲＧ１（rs3924999）上に配置されている非同義単一ヌクレオチド多形のミスセンス突然変異の神経生理学的作用があることが報告された（Hong et al. 2007）。ＰＰＩに対するＮＲＧ−１β−ＥＣＤの作用を試験した。これまでの結果は以下のように要約されてよい：
この作用は、１１５ｄＢで、統計学的有意には達せず、観察されなかったが、１０５ｄＢで、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、ＰＰＩの再確立に対して一般的な傾向を示した（＋２６％、＋２３％及び＋３６％、１５０、３００及び６００ｎｇ／ｋｇ、それぞれ）。これは１５０又は３００ｎｇ／ｋｇで刺激の非存在において自発的な動きに対する作用を有しなかったが、６００ｎｇ／ｋｇで刺激の非存在において自発的な動きを顕著に減少させた（−２０％及び−２９％、平均及びピーク強度に対して、それぞれ、ｐ＜０．０５、これはアリピラゾールに類似である）。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、プレパルス単独に対する反応に対して作用を有しなかった。
【０１１４】
これまでの結果は、１５０〜３００ｎｇ／ｋｇの用量範囲にわたるPropsy100についてのアポモルフィン誘発されたＰＰＩ欠失及び自発運動また同様にＰＰＩの再確立に対する傾向の減少に対する顕著な作用の非存在を示唆し、これはラットにおけるプレパルス抑制（ＰＰＩ）試験における６００ｎｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．でのものである（アポモルフィンにより誘発される欠失）。
【０１１５】
この実験系列において、参照物質、アリピプラゾールは、弱いが顕著な活性を３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．で有したが、同じ試験において１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．では有しなかった。
【０１１６】
一緒になってかつ使用した条件下で、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、約６００ｎｇ／ｋｇのより高い濃度でＰＰＩに作用するようである。これらの結果は、意外なことに、精神分裂病における有力な候補遺伝子の１つとして（ＮＲＧ１）を示唆する最近の神経生物学的研究の新規の理解を開く。
【０１１７】
実施例５
アルツハイマー病のための動物モデル（ＡＰＰＰＳ ｄｔマウス）における学習及び記憶
通常マウスについて上述したとおりのモリス水迷路セットアップにおけるニューレグリン１β（ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ）の溶解性細胞外ドメインの適用あり又はなしでの学習及び記憶を試験する動物実験を、大脳アミロイドーシスについてのダブルトランスジェニックマウスモデルに繰り返した（ＡＰＰＰＳマウス（Meyer-Luehmann et al. 2006;Radde et al. 2006））。
【０１１８】
ここでも、一日量のＮＲＧ−１β−ＥＣＤ（ここでは２００ｎｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．を適用）で訓練の３０分前に処理したこれら動物は、ビヒクル処理群に比較して学習関連パラメーターにおいて顕著により良好であった。
【０１１９】
ニューレグリンは改善された学習のみでなく、しかしながら処理された動物は、より進んだ探索戦略をも発達させた：より多くの処理された動物は、プールの内側領域に入り（１２ｖｓ．７、ｐ＝０．００９）、内側領域への入場はより頻繁に生じ（２．０ｖｓ．０．７回、ｐ＝０．０３）、内側領域中を移動して費やした時間及び距離はより長かった（５．３ｖｓ．２．１ｓ、ｐ＝０．０９及び０．７ｍ ｖｓ．０．３ｍ、ｐ＝０．０２５、それぞれ）。
【０１２０】
大脳アミロイドーシス及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルを用いたモリス水迷路中での学習実験の結果を図４にまとめる。
【０１２１】
実施例６：
パーキンソン病のニューレグリン１−βＭＰＴＰマウスモデル
方法：
１０週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスをパーキンソン病のためのＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）モデルにおいて使用した。
【０１２２】
１０週齢の雄のＣ５７ＢＩ６マウス（Ｎ＝１０、１群につき）の脳組織を、ＮａＣｌ（対照）又はＭＰＴＰ（急性及び亜慢性モデル）を用いた処理後の異なる時間（０、１、３、７、２１日）に切開した（黒質、線条体、皮質）。この方法は、刊行された手順に従う（Hoglinger et al. 2007;Hoglinger et al. 2004）。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
ＭＰＴＰを粉末として０．９％のＮａＣｌ中に溶解させ、腹腔内注射した（急性適用：４×２０ｍｇ／ｋｇ、それぞれ２時間の間隔で；慢性適用：５×３０ｍｇ／ｋｇ、それぞれ２４時間の間隔で）。これらの注射は約１０秒間かかり、動物を頸部脱臼により定義された時間点（表参照）に屠殺した。この手順は、刊行されたプロトコルに従う（Hoglinger et al. 2007;Hoglinger et al. 2004;Liberatore et al. 1999;Przedborski and Vila 2003; Vila and Przedborski 2003）。
【０１２５】
最後のＭＰＴＰ投与０日後：線条体のドーパミン作動性神経の損失
最後のＭＰＴＰ投与１日後：マイクログリア活性化の開始
最後のＭＰＴＰ投与３日後：最大限のマイクログリア活性化
最後のＭＰＴＰ投与７日後：最大限のアストロサイト活性化
最後のＭＰＴＰ投与２１日後：最大限の細胞死。
【０１２６】
Alzet Mini pumpを介したＮＲＧ−１β−ＥＣＤ及び対照ペプチドの大脳注入２１日後に、ＭＰＴＰ処理（急性又は慢性）が引き続き、中間脳のドーパミン作動性ニューロンの組織学的定量化を立体解析学的原理により実施した。線条体中のドーパミン及びその代謝産物の生化学的定量化をＨＰＬＣにより実施する。手順は、刊行されたプロトコルに従う（Hoglinger er et al. 2007;Hoglinger et al. 2004）。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
結果：
図５に示されるとおり、ドーパミン及びその代謝産物のＨＰＬＣ測定の結果は、ＭＰＴＰ傷害（insult）の間にこのパーキンソン病のためのモデルにおいて、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの投与の明白な作用を明らかにする。
【０１２９】
この作用は、非典型的である：ドーパミンレベルに対する顕著な作用が、ＭＰＴＰ傷害の間もＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与の急性又は慢性対照中にも存在しない一方で、ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡの濃度に対する著しくかつ明白な作用が存在する。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの慢性的投与は、ＭＰＴＰ傷害の非存在におけるこの代謝産物の明白かつ顕著な減少を生じ、その一方でこの急性の様式においてわずかな減少のみが観察される。ＭＰＴＰ傷害の慢性状態の間に、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）の顕著な増加を生じ、ＭＰＴＰ傷害の非存在においてより一層明白な効果である。
【０１３０】
これらの結果は、慢性的ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与及び／又はＣＯＭＴ上方制御の間のＭＡＯ−Ｂの下方制御により解釈されることができる。適用された条件下でドーパミン作動性ニューロンの生存に対する巨大なかつ顕著な有利な作用が観察された。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤはこのモデルにおいて高度に神経保護性でもある。この系列の実験の間にｉｐ注射をすると、この明らかな有効性は、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤが血液脳関門を通過することにおいて高度に効率的であることも再度証明する。
【０１３１】
図６は、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与により作用されるように見える代謝スキームを示す：ドーパミンはＭＡＯ−ＢによりＤＯＰＡＣへと、そしてＣＯＭＴにより３−ＭＴへと変換される；ホモバニリン酸は引き続き両者の代謝産物からＣＯＭＴによりＤＯＰＡＣから、そしてＭＡＯ−Ｂにより３−ＭＴから産生される；ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与は、両方の酵素の活性を明らかに制御する。
【０１３２】
より一層重要であり、かつ、図７に示されるとおり、パーキンソン病のＭＰＴＰモデルにおいては、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの明白かつ顕著な神経保護性の作用が存在し、これは中間脳のドーパミン作動性ニューロンの組織学的定量化により明らかになる。この組織学的方法は、その他にも説明されている（Liberatore et al., 1999, Przedborski & Vila, 2003; Vila & Przedborski, 2003; Hoglinger et al., 2004; Hoeglinger et al., 2007）。
【０１３３】
一緒にすると、パーキンソン病のＭＰＴＰ動物モデルにおける意外にも明白かつ利益のある神経保護作用が存在する。この作用は、極めて低濃度のＮＲＧ−１β−ＥＣＤの腹腔内投与（例えば２０ｎｇ／ｋｇ）が、有効性を達成するために十分であり、したがってＮＲＧ−１β−ＥＣＤが脳血液関門を通過することを再度証明する。ドーパミン代謝産物に対する複雑な作用（ＨＰＬＣ結果；図５）も、ＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴのＮＲＧ−１β及びＮＲＧ−１β−ＥＣＤによる制御を指摘する。
【０１３４】
実施例７
有効成分（active principle）としてのＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性翻訳後アイソフォームの同定
学習及び記憶においてＮＲＧ−１β−ＥＣＤの特定の翻訳後酸性アイソフォームが活性のある形態であるという証拠を刊行した（Schillo et al. 2005a）。ここでは、同様のパターンがアルツハイマー病の動物モデル及びアルツハイマー病及びパーキンソン病患者からの死後の脳組織において観察されることを示す。我々は、この酸性アイソフォームが有効成分であることを結論づける。
【０１３５】
方法：
ウェスタンブロット染色のために以下の抗体を使用した：抗ＮＲＧ１−ＥＣＤ、ウサギポリクローナル（sc-28916 ロット：I 2905 Santa Cruz; H-210）
ニューレグリン−１（Ｈ−２１０）は、ヒト由来のニューレグリン−１アイソフォームＨＲＧ−αのＮ末端細胞外ドメイン内のアミノ酸２１−２３０マッピングに対して産生されたウサギポリクローナル抗体である。ニューレグリン−１（Ｈ−２１０）は、マウス、ラット及びヒト由来のニューレグリン−１アイソフォームＨＲＧ−α、ＨＲＧ−α１Ａ、ＨＲＧ−α２Ｂ、ＨＲＧ−α３、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−β３（ＧＧＦ）、ＧＧＦ２及びＳＭＤＦのウェスタンブロット（開始希釈１：２００、希釈範囲１：１００〜１：１０００）、免疫沈降［全タンパク質１００〜５００μｇにつき１〜２μｇ（細胞溶解物１ｍｌ）］及び免疫蛍光（開始希釈１：５００、希釈範囲１：５０〜１：５００）による検出のために推奨される。
【０１３６】
二次抗体は次のものであった：
抗ヤギ、ＨＲＰ
sc-2922ロット：C 1405 Santa Cruz
抗ウサギ、ＨＲＰ
sc-2054ロット：C 2005 Santa Cruz。
【０１３７】
免疫染色の次に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＱ−ＴＯＦ質量分析をＮＲＧ−１β−ＥＣＤを確認するために実施した。
【０１３８】
いまや、大脳アミロイド形成及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルにおいて極めて類似のパターンを図８に示すとおり見出す。この特定の酸性のアイソフォームのＮＲＧ−１β−ＥＣＤの濃度は、約ｐｌ５．０で、同時により良好な学習者である処理されたＡＰＰＰＳマウスにおいて顕著により高い。
【０１３９】
図８には、それぞれの、処理された良好な学習動物（上）及び劣った学習能力を有する非処理動物（下）の代表的な画像が示される。
【０１４０】
図９は、それぞれ９人のアルツハイマー患者及び年齢適合させた対照からの死後の皮質材料を用いたウェスタンブロット実験の結果を示す。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ断片が、アルツハイマーの場合に豊富さが顕著により少ないことを明白に示す。内部対照として、ＮＲＧ−１２の豊富さを測定し、これは疾病に関連する記憶喪失により作用を受けないように見える。
【０１４１】
この特定のアルツハイマー病及び記憶に関連したＮＲＧ−１β−ＥＣＤのアイソフォームの更なる検査を、図９について使用した同じ死後のヒトの脳材料の２次元ゲル（２Ｄ−ＰＡＧＥ）のウェスタンブロットにより行い、これは、図１０に示される代表的な例により示されるとおりに、確かに、アルツハイマー状態において減少しているＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性のアイソフォームであることを明らかにする。
【０１４２】
結論
我々はここで初めて、ｎｒｇ−１遺伝子の転写産物の翻訳後修飾、特にタンパク質加水分解的開裂により産生された切断された形態であって、ＭＷ１５〜３５、ｐｌ４〜１０を有するＮＲＧ−１βの細胞外ドメインを含有するもののｉｎ ｖｉｖｏ作用の機能的な証拠を提示する；より特異的には、我々は、精神分裂病のための動物モデルにおける抗精神病薬活性を、５〜６００ｎｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の濃度で、ことによるとＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴの制御に基づいて見出した。１００〜１０００倍より高い濃度で使用される対照神経遮断薬とは対照的に、不利な作用は観察されなかった。
【０１４３】
さらに、我々は３〜３００ｎｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の濃度でのパーキンソン病のＭＰＴＰモデルにおける神経保護作用を見出した。
【０１４４】
さらに、我々は、学習及び大脳アミロイドーシス及びアルツハイマー病のためのそれぞれの動物モデルにおける記憶及び学習（モリス水迷路）に対する有利な作用を見出した。
【０１４５】
現在使用されている多くの非典型的な抗精神病薬の副作用を考慮すると（Haddad and Sharma 2007）、我々はＳＭＤＦ、ＮＲＧ−１α、特にＮＲＧ−１のＥＧＦドメインを有する溶解性ＮＲＧ−１−ＥＣＤ断片は、精神分裂病、双極性障害及びうつ病の治療のための独立の又は共薬物療法として使用されてよいことを結論付ける。
【０１４６】
これは、ある意味で、中枢神経系の他の疾病において使用されてもよく、例えば神経変性疾患、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、卒中、外傷性の脳及び脊髄損傷である。
【０１４７】
溶解性ＮＲＧ−１−ＥＣＤタンパク質は、神経シグナルトランスダクション、特にグルタミン酸シグナリング及び興奮毒性を媒介するシグナルトランスダクションにおける中心的な役割のためにこれらの極めて広範な作用を有し、これは前述した全ての適応症において中心的な役割を果たす（Schrattenholz and Soskic 2006）。
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
本発明は、認知に関連した神経学的状態、例えば精神分裂病、アルツハイマー病及びパーキンソン病における薬物療法としての、翻訳後ニューレグリン−１修飾又はスプライス変異体を提示する、生理学的溶液中に溶解性のニューレグリン−１アイソフォームを参照する。
【０００２】
背景技術
ニューレグリン（ＮＲＧ）は、シナプス性シグナリングの鍵となる制御因子として出現した。この膜貫通型タンパク質は、４個の遺伝子（ＮＲＧ−１、−２、−３、及び−４）によりコードされ、この多様性は更に代替的ＲＮＡスプライスング及びプロモーターの使用により増加され、特にタンパク質加水分解性プロセッシングなどの翻訳後修飾により増加され、これは膜結合ホロタンパク質からの溶解性アイソフォームの放出を引き起こす。更に、リン酸化及びグリコシル化の証拠が存在する（Buonanno and Fischbach 2001）。これらは、異なる細胞外ドメインにより特徴付けられ、かつ、ＥｒｂＢレセプターチロシンキナーゼのリガンドであり、これは、神経炎症及び遺伝子転写に対する下流の暗示的意味合いを有する（Holbro and Hynes 2004）。特にＮＲＧ−１の溶解性アイソフォームは、ＮＲＧの膜貫通型形態から、電気的刺激の間のタンパク質加水分解性開裂を通じて産生され、引き続き活性依存性シナプス性調節因子として分泌される（Ozaki et al. 2004）。
【０００３】
ＮＲＧ−１の切断されたアイソフォーム、恐らくβ−１は、この全体の膜タンパク質のＮ末端の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有し、これは学習及び記憶に関連していることが見出されている（Schillo et al. 2005a; WO03/014156）。機能的研究は、ＮＲＧ−１が直接的にＮＭＤＡレセプターサブユニット成分を制御することを実証した（Ozaki et al. 1997; Eilam et al. 1998）。更に、この種のＮＲＧ−１断片が神経保護特性をｉｎ ｖｉｖｏで抗アポトーシス性作用により有することが示されている（Xu et al. 2005A; Xu et al. 2005B; Xu et al. 2004）。
【０００４】
極めて最近、ＮＲＧ−１が、ＮＭＤＡレセプターのＮＲＧ依存性制御（Schrattenholz and Soskic 2006）及び引き続く下流の現象、例えば興奮毒性、神経炎症及びアポトーシスのために中心的な役割をヒトの神経学的疾病において有することが明らかになった（要約のために図１を参照のこと）。これらは、ＮＲＧ−１が重要な役割を、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病から卒中及び精神分裂病にわたる範囲の状態において果たすことを示している（Britsch 2007）。
【０００５】
ＮＲＧ−１のこの根本的な重要性は、神経保護及び認知関連学習及び記憶におけるポジティブな役割の他に、ＮＲＧ−１が、種々の障害の後に、種々の特定の脳領域及び細胞種における、神経組織の再生における決定的な神経栄養性因子を提示することを示唆する。明らかに、これは神経関連回路の統合性の維持及び修復のための決定的な因子である：神経保護及び機能損失後の正しい再生における役割、また同様に活性に依存した神経的可塑性の形成における。
【０００６】
ニューレグリン−１βにおける興味は更に、Kastin et al., 2004が、ニューレグリン１βがこの血液脳関門を横断できることを示した時に、顕著に助長された。これにより、ニューレグリン１βの治療的使用のための展望が開かれた。
【０００７】
最近の研究は、神経保護における幅の広い適用を証明した。独立して、２つの刊行物においてニューレグリン１がＢＡＣＥ（β−セクレターゼ、β−アミロイド変換酵素）の基質でもあることを示し、これはニューレグリン−１のアルツハイマー病における関連性を示唆する（Glabe 2006; Schubert 2006）。
【０００８】
更に、シュワン細胞においてニューレグリン１が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素−Ａレダクターゼ、シュワン細胞におけるコレステロールの生合成のための速度制限酵素、の転写を増加させることが見出された（Pertusa et al. 2007）。これは、ミエリン鞘が影響を受ける全ての状態、例えば精神分裂病及び多発性硬化症、又はいわゆる「コレステロールリッチなラフト」が関与する認知関連機能のための広範囲にわたる示唆を有する（Schrattenholz and Soskic 2006）。軸索を取り囲むシュワン細胞は、ＮＲＧ−１レセプターＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３及び溶解性のＮＲＧ１α及びβを生理学的条件下で発現する。除神経に引き続き、成熟したシュワン細胞は軸索との接触を離れ、その形態を変化し、ＮＲＧ１βの発現を停止し、ＮＲＧ１α及びＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３発現を上方制御する（Geuna et al.2007; Karoutzou et al. 2007）。
【０００９】
加えて、遺伝的疫学的研究は、ニューレグリン１の精神分裂病及びアルツハイマー病、特にその精神病性形態への明らかな関与を示す（Farmer et al., 2007）。
【００１０】
いくつかの最近の遺伝学的集団分析は、特定のＮＲＧ−１−ＳＮＰ’ｓがアルツハイマー及び精神分裂病に関連することを示す（Go et al. 2005;Scolnick et al. 2006;Ross et al. 2006;Meeks et al. 2006;Farmer et al. 2007）。これらの知見の示唆するものは、図１に示した機能性ＮＲＧ含有複合体の他のタンパク質に関連する（ＥｒｂＢレセプター：（Benzel et al. 2007;Thomson et al. 2007;Hahn et al. 2006））。多発性硬化症におけるＮＲＧ１のための示唆もある（Esper et al. 2006）。
【００１１】
ＮＲＧ１リスクアレルと精神分裂病との間の関連の分子機構が、アルファ７サブタイプのニコチン性アセチルコリンレセプターの下方制御を含む可能性があることを暗示する結果がある（Mathew et al. 2007）。
【００１２】
本発明によれば、組み換え溶解性ニューレグリン１βアイソフォームが、学習及び記憶、精神分裂病、アルツハイマー病及びパーキンソン病のための動物モデルにおいて、医薬的有効性を示すことが見出された。ｉ．ｖ．投与後に、ニューレグリン１βアイソフォームは、対照医薬品の濃度に比較して顕著により低い濃度で活性があった。
【００１３】
このように、本発明の第１の観点は、神経学的状態、特に認知に関連した神経学的状態の治療のための医薬品の製造のための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用である。
【００１４】
本発明の更なる観点は、（ｉ）組み換え溶解性ニューレグリン１アイソフォーム及び（ｉｉ）特に神経学的状態、特に認知に関連した神経学的状態の治療のための更なる医薬品を含有する医薬組成物又はキットである。
【００１５】
本発明のまた更なる観点は、医薬品の製造のための記憶及び認知促進のための組み換え溶解性ニューレグリン１アイソフォームの使用である。
【００１６】
また更なる本発明の観点は、医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む神経学的状態の治療方法である。
【００１７】
また更なる本発明の観点は、医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む記憶及び認知の促進の治療方法である。
【００１８】
また更なる本発明の観点は、組み換え溶解性ニューレグリン１アイソフォームの更なる医薬品と一緒での共投与である。
【００１９】
本発明によれば、溶解性ニューレグリン１アイソフォームは、神経学的状態、特に状態、例えば精神疾患、例えば精神分裂病、双極性障害及びうつ病、神経変性性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん又は神経学的損傷、例えば卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷の治療のために有効であることが見出された。有利であるのは、精神分裂病、特に精神分裂病の認知に関連した観点、パーキンソン病及びアルツハイマー病の治療である。さらに、本発明は、記憶及び認知促進のための、特に神経学的状態、例えばアルツハイマー病及び精神分裂病に関連した記憶及び認知喪失を減少及び／又は抑制するための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用にも関する。
【００２０】
組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームは有利にはヒトのニューレグリン−１アイソフォームであり、すなわち、天然に生じるヒトのニューレグリン１−アイソフォームの１次アミノ酸配列又は少なくとも９０％、有利には少なくとも９５％、最も有利には少なくとも９８％の同一性を組み換えアイソフォームの全長に対して有する配列を含有する組み換えアイソフォームである。
【００２１】
本発明の溶解性組み換えニューレグリン−１アイソフォームは有利には、相応するニューレグリン−１の細胞外ドメインの少なくとも一部、例えばヒトのニューレグリン、例えばヒトのニューレグリン−１βの細胞外ドメインの少なくとも一部を含有する。
【００２２】
本発明の組み換え溶解性ニューレグリンアイソフォームは有利には、２５０アミノ酸までの、例えば１５０〜２５０アミノ酸の長さを有する。ニューレグリンアイソフォームの分子量は有利には、約１５〜約３５ＫＤ、有利には約２５〜約３２ＫＤであり、例えばこれはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）により測定される。組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム、特に組み換えニューレグリン−１βアイソフォームは、約４〜約９．５、有利には約４〜約６の等電点（ｐｌ）を有する。このアイソフォームは、修飾していないアミノ酸配列からなる修飾していないポリペプチド又は修飾ポリペプチドであってよく、その際この修飾は、リン酸化、グリコシル化、メチル化、ミリスチル化、酸化及びこの任意の組み合わせから選択されてよい。特に有利な一実施態様において、ニューレグリン−１アイソフォームは、少なくとも１のリン酸化したアミノ酸残基を含有する。更に、本発明は、非相同的（heterologous）残基、例えばポリ（アルキレンオキシド）残基、特にポリエチレングリコール残基に対するコンジュゲーションを包含する。
【００２３】
この組み換え溶解性アイソフォームは、標的とされる組織、例えば神経系、特に中枢神経系、例えば脳及び／又は脊髄中への有効な配送を達成する任意の経路により投与されてよい。ニューレグリンアイソフォームの医薬的に有効な濃度が、全身投与によって達成されてよいことが見出された。例えば、このアイソフォームは、注射又は注入、例えば静脈性注射により投与されてよい。このアイソフォームは有利には、０．１〜５０００ｎｇ／ｋｇの処置すべき被験体の体重の量で、特に２〜１０００ｎｇ／ｋｇの処置すべき被験体の体重の量で、より有利には３〜６００ｎｇ／ｋｇの処置すべき被験体の体重の量で、処置すべき状態の種類及び深刻度に依存して投与される。本発明の他の一実施態様においては、この溶解性アイソフォームは、局所的に投与されてもよく、例えば、中枢神経系への、例えば脊髄への及び／又は脳中への直接的な投与によって投与されてもよい。ｉ．ｐ．又はｓ．ｃ．注射又は吸入装置による５００μｇ／ｋｇのより高い用量での投与も考慮されてよい。有利には、処置すべき被験体は、哺乳類、有利にはヒトの患者である。
【００２４】
この溶解性の組み換えニューレグリン−１アイソフォームは、独立薬物療法として、すなわち、単剤療法として又は共薬物療法として、すなわち、更なる医薬品、特に神経学的状態の治療に適している更なる医薬品との組み合わせにおいて投与されてよい。 更なる医薬品の例は、カテコールアミン代謝に作用する化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ−又はＣＯＭＴ−阻害剤、メマンチン型チャネル遮断剤、ドーパミン又はセロトニンレセプターアゴニスト又はアンタゴニスト、カテコールアミン又はセロトニン再取り込み阻害剤又は任意の種類の抗精神病薬、例えばクロザピン又はオランザピン又はガバペンチン様薬剤であり、とりわけアルツハイマー病及びパーキンソン病、精神分裂病、双極性障害、うつ病又はその他の神経学的状態の治療におけるものである。更なる医薬品の付加的な例は、神経保護剤、例えばＰＡＲＰ１阻害剤、例えばWO 2006/008118及びWO 2006/008119中に開示されているものであり、これは本願明細書により参照により組み込まれる。
【００２５】
したがって、本発明の一実施態様は、本願明細書に開示されたとおりの組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームと、精神学的疾病、例えば精神分裂病、双極性障害及びうつ病の治療のための医薬品、例えばオランザピン又はクロザピンとの組み合わせを参照する。更なる一実施態様は、組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム及び神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ＭＳ又はＡＬＳの治療のための医薬品との組み合わせを参照する。また更なる実施態様は、組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム及び神経学的損傷、例えば卒中、外傷性脳損傷又は脊髄損傷の治療のための医薬品の組み合わせを参照する。
【００２６】
この組み合わせ療法は、医薬組成物又はキットの形態にある組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム及び更なる医薬品の共投与により実施されてよく、その際、この個々の医薬品は、別個に又は共通の投与により投与される。
【００２７】
ニューレグリン−１アイソフォームは、ニューレグリン−１タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、タイプＶ、又はタイプＶＩアイソフォーム、有利にはニューレグリン−１βアイソフォーム、ニューレグリン−１αアイソフォーム、又は、知覚及び運動神経由来因子（ＳＭＤＦ）アイソフォーム、特にニューレグリン−１β、より有利にはヒトのニューレグリン−１βアイソフォームであってよい。
【００２８】
ニューレグリン−１βアイソフォームは、血液脳関門を通じて能動的に輸送される。ｉ．ｖ．／ｉ．ｐ．注射後の脳中のニューレグリン−１βの傑出したバイオアベイラビリティは、実施例中に示されるとおり、ＮＲＧ１βの治療的適用に向けての道を開く。
【００２９】
抗アポトーシス性の、ミエリン安定性の抗炎症性特性の組み合わせにおいて、ＢＡＣＥとのその直接的な相互作用と一緒になって、卒中、アルツハイマー、ＭＳ及び精神分裂病及び他の神経学的状態の治療における機会を開く。
【００３０】
上で概要を示したとおり、本出願は、修飾されていない及び修飾されているニューレグリン−１アイソフォーム、特にニューレグリン−１βアイソフォームの使用を包含する。後翻訳修飾、例えばタンパク質加水分解性プロセッシング、リン酸化及びグリコシル化が、ニューレグリン−１、特にその細胞外ドメインの特定のアミノ酸残基で生じる証拠がある。特に、ニューレグリン−１の溶解性断片の放出は、報告されている（Buonanno and Fischbach 2001 ;Fischbach 2007）。可能性のある酸化も同様に報告されている（Nadri et al. 2007）。
【００３１】
本発明者らは、好ましい生理学的に活性のあるニューレグリン−１βアイソフォームが、ニューレグリン−１βの細胞外ドメイン又はその部分であって、翻訳後修飾されているものを含有することの証拠を得た。有利には、このアイソフォームは、リン酸化により修飾されていて、その際、１、２、３又はそれより多いアミノ酸側鎖残基、特にＯＨ基を有する側鎖残基、例えばＴｙｒ、Ｓｅｒ又はＴｈｒがリン酸化されている。有利なリン酸化部位は、アミノ酸位置７９〜８２、１３３〜１３６及び／又は１５８〜１６１（Falquet et al., 2002による命名法）に存在する。更に有利なリン酸化部位は、アミノ酸１２〜１４、３０〜３２及び／又は８５〜８７に存在する。更なる可能性のある修飾部位は、アミド化部位、有利には位置２２〜２５及び／又は３０〜３３にあるアミド化部位、位置１５０〜１５３、１５６〜１５９及び／又は２０４〜２０７にあるグリコシル化部位、及び、ミリスチル化部位、有利には位置９４〜９９、１４９〜１５４、１６８〜１７３、１７５〜１８０及び／又は２０２〜２０７にあるミリスチル化部位であり、これはFalquet et al. 2002による命名法による。
【００３２】
以下においては、本出願による実験データの関連性が、好ましい医薬的適応症に関して説明される。
【００３３】
精神分裂病
精神分裂病は、症状、例えば幻聴、障害された思考及び妄想、意欲消失、快感消失、鈍化された情動及び無関心を伴う深刻かつ不能化にする精神障害である。疫学的、臨床的、神経心理学的かつ神経生理学的研究は、脳の発達における異常性及び進行する神経可塑性が、前記疾患の病原論において重要な役割を果たすことについての実質的な証拠を提供している（Arnold et al. 2005）。
【００３４】
精神分裂病は、ドーパミン作動性の神経伝達の疾患を含むと考えられるが、しかしながら、グルタミン酸作動性神経伝達によるドーパミン作動性の系の調節が重要な役割を果たすように見える。この観点は、グルタミン酸作動性の系に対して機能的な作用を有するニューレグリン−及びジスビンジン遺伝子の遺伝的な知見により支持される（Muller and Schwarz 2006）。ますます明らかになったのは、精神分裂病に寄与する遺伝子（neuregulinsを含む）を含むようである幾つかの領域が、双極性情動障害にも関連することであり、知見は最近の一対のデータにより支持される（Farmer et al. 2007;Owen et al. 2007）。
【００３５】
ニューレグリン−１は、神経細胞移動、軸索誘導及びミエリン化に対する作用を有する精神病感受性遺伝子であり、これは精神分裂病及び双極性障害における異常な解剖学的及び機能的連結性の知見を有効に説明できる可能性がある（Mclntosh et al. 2007）。
【００３６】
ニューレグリン１の精神分裂病への遺伝学的連結のますます増加する一連の証拠が存在する（レビュー：Farmer et al., 2007）。ニューレグリン−１によるグルタマート、ＧＡＢＡ及びニコチン性神経伝達の促進（Fischbach 2007;Woo et al. 2007;Li et al. 2007）は、この文脈において関連し、脳炎症を有する掛かり合いも同様である（Hanninen et al. 2007）。
【００３７】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ−レダクターゼの制御、コレステロール生合成のための速度制限酵素（Pertusa et al. 2007）（ミエリン化にとって重要である）は、この状態において同様に掛かり合いを有すると推定される。
【００３８】
精神分裂病、双極性疾患及びうつ病に共通の遺伝子的危険因子の中で、ＮＲＧ１が傑出した役割を果たすという事実は、この精神病において示唆される遺伝子、例えばＮＲＧ−１が結局症状によるよりむしろ生物学に依存した分類のための基礎を提供する可能性があってよく、かつ、これらの複雑な脳疾患のための新規の治療戦略を生じることについて示唆を提起している（Blackwood et al. 2007;Bertram et al. 2007）。
【００３９】
本出願のこの実験的なデータは、精神分裂病の実験モデルにおける溶解性組み換えニューレグリン−１βアイソフォームの投与の有効性を実証する。
【００４０】
アルツハイマー病
本発明者らによる初期の研究は、ニューレグリン１βがアルツハイマー患者の脳の海馬の死後の切片において、年齢適合対照に比較して減少していること（Sommer et al., 2004）を、ニューレグリン１の溶解性の断片と放射状迷路試験における学習能力との明白な正の相関と一緒に示した（Sommer et al., 2004）。
【００４１】
シナプス性変化に依存した活性におけるＮＲＧ−１の役割（Xie et al. 2006;Kwon et al. 2005;Rimer et al. 2005;Bao et al. 2004;Yang et al. 2005）が、学習及び記憶のために重要であることを実証する数々の報告が存在する（Ozaki et al. 1997;Ozaki et al. 2004;Golub et al. 2004;Schillo et al. 2005b）。以下示すとおり、細胞外ドメインを含有するＮＲＧ１β断片は、行動的な動物モデルにおいて学習と明らかに関連していた。アルツハイマー患者の海馬領域（短期間記憶形成を担う）の死後の脳スライスにおいて、年齢適合した対照に比較してタンパク質の減少した発現を示すことは、明らかにいまだ健康な神経細胞の領域において、記憶に関連したシナプス性活性の非存在を実証できた。
【００４２】
極めて最近の発見（Hu et al. 2006;Glabe 2006;Schubert 2006）は、ＢＡＣＥ１（＝βセクレターゼ）によりＮＲＧ１がプロセッシングされることを示し、この酵素はアルツハイマー病を有する人の脳中でアミロイドβの凝集物の産生を助けるものであり、これは、アルツハイマー病への関連、ＮＲＧ１の神経栄養性特性に関するミエリン形成における同時発生する役割を説明する（Hu et al., 2006;Glabe 2006; Schubert 2006）。酵素、ＢＡＣＥ１（ベータ位置アミロイド前駆体タンパク質を開裂する酵素１）は、より大きな前駆体からアミロイドβを開裂することが要求される。（ＢＡＣＥ１媒介した開裂後に、プレセリニン含有複合体γセクレターゼは、最終的な開裂を生じ、アミロイドβを放出する。
【００４３】
セクレターゼによるＮＲＧの開裂は、神経のミエリン化にとって決定的である。アミロイド前駆体タンパク質とちょうど同じように、ニューレグリン１もまたβセクレターゼにより開裂される。βセクレターゼによるニューレグリン１のタンパク質加水分解的開裂は、シュワン細胞による末梢神経ミエリン化にとって決定的である。βセクレターゼを標的とする薬剤は、末梢神経発達及び機能に作用することができる。
【００４４】
この初期の観察は、ＢＡＣＥ１もミエリン化のために要求されるようであることを見出したHaass（Willem et al. 2006）のグループにより為された。末端神経ミエリン化は生涯の初期に生じ、したがってどのようにＢＡＣＥ１阻害がより高齢の動物に作用する可能性があるかは明らかでない。ＢＡＣＥ１もまた中心神経系のミエリン化において役割を有することについて示唆がある。ＢＡＣＥ−１を欠失しているトランスジェニック動物は、末梢神経においてミエリン欠陥を有していた。
【００４５】
神経変性及びアルツハイマー病の関連においても、ニューレグリン１によるグルタマート、ＧＡＢＡ及びニコチン性神経伝達の促進の最近の発見は関連する（Fischbach 2007;Woo et al. 2007;Li et al. 2007）。
【００４６】
本出願のこの実験データは、アルツハイマー病の実験モデルにおける溶解性組み換えニューレグリン１βアイソフォームの投与の有効性を実証する。
【００４７】
卒中、外傷性脳損傷
ＵＳにおける独立した外部研究による一連の卒中に関連したｉｎ ｖｉｖｏ実験は、自体で抗アポトーシス性であるニューレグリン１の神経保護を実証する（Xu et al., 2004, 2005 and 2006; Guo et al., 2006）。
【００４８】
ＮＲＧ−１は、中脳動脈閉塞（通常の卒中モデル）後の神経ダメージを減少し、神経学的結果を改善する（Xu et al. 2005b;Xu et al. 2004;Xu et al. 2006;Guo et al. 2006）。
【００４９】
虚血／再灌流による脳損傷を減弱させることにおける組み換えヒトＮＲＧ−１の治療的有効性及び機構についての同じ研究において、ＮＲＧが抗アポトーシス性であることが見出された。ＮＲＧ−１（３．０ｎｇ／ｋｇ）を中脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の１０分前に血管内に適用し、引き続き９０分間の局所脳虚血及び２４時間の再灌流をした。
【００５０】
本発明のデータは、組み換えの溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの低濃度での投与が、顕著な薬理学的作用を有すること、したがって卒中及び外傷性脳損傷のモデルにおいて有効であるようであることを実証する。
【００５１】
以下においては、本出願は以下に示す図面及び実施例によりより詳細に説明される。
【００５２】
図１：ニューレグリン１についての様々な総説及び数多くの研究論文は、神経変性疾患、神経学的疾病また同様に生理学的機能において中心的であると考えられる機構の上流の制御性原則としてのＮＲＧ１の鍵となる機能的位置を示す。
【００５３】
ＮＲＧは、機能性複合体の鍵となる部分であり、少なくともニューレグリン（ＮＲＧ）、レセプターチロシンキナーゼ（ＥｒｂＢレセプター）、へパランスルファートプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）及びＮＭＤＡレセプター（ＮＭＤＡＲ）からなり、これは一過的にかつ活性に依存してコレステロール（ＣＨＯ）リッチな膜マイクロドメイン中に一緒になって組み立てられる。特に、カルシウムシグナリングの形成は、翻訳後修飾によるシナプス下足場タンパク質との相互作用のために重要である（ＰＳＤ−９５、特定のリン酸化されたドメイン、例えばパートナータンパク質上のＰＤＺ又はＳＨドメインとの相互作用による）。このＰＳＤ９５複合体は、直接的に炎症促進性酵素、例えば酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ、ｉＮＯＳが誘導性であり、ｎＮＯＳは神経性である）及びＣｏｘ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）を制御し、これは関連するが、必ずしも下流でない機構との複雑な関係においてその作用を促進し、前記機構はＮＡＤ+依存性酵素、例えばＰＡＲＰ−１（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）及びＳｉｒ−２（シルツイン−２）を伴う；ＰＡＲＧは、ポリ（ＡＤＰリボース）グリコヒドロラーゼであり、ＰＡＲＰ−１に対する相補的かつアンタゴニスト性の酵素であり、ＨＤＡＣはヒストンジアセチラーゼであり、Ｓｉｒ−２を含む一般的な酵素クラスである。ＭＰＴＰは、ミトコンドリア透過性遷移孔を意味する。ＤＲＰ−２は、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質２である。また他の重要な膜タンパク質、例えば特定の二コチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲα７）、ＧＡＢＡAレセプター（ＧＡＢＡAＲ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及びプロテアーゼ（ＰＳ）は、脂質ラフトにおいて一過的に組織化され、かつ、様々な機能的特性をこの通常のリン脂質（ＰＬ）の環境の外側で必要とし、詳細は、（Schratten holz and Soskic 2006）中にある。
【００５４】
図２：モリス水迷路（Morris water maze）中の学習実験の要約：ニューレグリン１β（ＮＲＧ−１βＥＣＤ）の溶解性細胞外ドメインの一日量３ｎｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）で処置した動物は、ビヒクル処理動物に比較して学習が顕著により良好であった；ＩＡＥ：内部領域入場；ＩＡＥＦ内部領域入場頻度；ＴＳ：内部領域中で過ごした時間；ＤＴ：内部領域中で移動した距離。
【００５５】
図３：ＮＲＧ−１βＥＣＤによるアンフェタミン誘発された活動過剰の減少、精神分裂病のために広く許容されているモデル。濃度は１５〜６００ｎｇ／ｋｇ（アンフェタミン適用１５分前のｉ．ｖ．注射）にわたった。ハロペリドール０．１２５ｍｇ／ｋｇの正の対照を含めた。
【００５６】
ハロペリドールが他の非典型的及び典型的な抗精神病薬と同様に通常は活動を対照レベルより下に減少させる一方で（ここではｖｅｈ／ｖｅｈと記した点線で示した、青で横断、赤で立ち上がり（rear））、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ減少は漸近的に活動の対照レベルに近づくが、更なる減少は生じない。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの低い有効濃度及び好ましくない作用（ビヒクル対照レベル未満の活動の減少）の非存在は、このモデルにおける傑出した特性である。この作用は、ｐ＜０．０５で有意である。
【００５７】
図４：モリス水迷路中での脳のアミロイドーシス及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルを用いた学習実験の要約：ｉ．ｐ．のＮＲＧ−１β−ＥＣＤの一日量２００ｎｇ／ｋｇ処置した動物は、ビヒクル処理動物に比較して学習が顕著により良好であった；ＩＡＥ：内部領域入場；ＩＡＥＦ内部領域入場頻度；ＴＳ：内部領域中で過ごした時間；ＤＴ：内部領域中で移動した距離。
【００５８】
図５：ドーパミン及びその代謝産物のＨＰＬＣ定量化：アスタリスクで標識した縦欄は高度に有意である。
【００５９】
【表１】
【００６０】
図６：ＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴによるドーパミンの代謝
【００６１】
図７：ＭＰＴＰ暴露は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な損失を生じる（ａＭＰＴＰ、ｐ＝０．０００５；及びｃＭＰＴＰ、ｐ＝０．００７５）。２０ｎｇ／ｋｇのＮＲＧ−１β−ＥＣＤのｉｐ適用は、反転（ａＮＲ−ＭＰＴＰ；ｐ＝０．５７、すなわち、ビヒクル対照から相違しない）又は明白な又は顕著なＭＰＴＰ障害の改善を生じる（ｃＮＲ−ＭＰＴＰ；ｐ＝０．００９７）；慢性モデル（２０ｎｇ／ｋｇのＮＲＧ−１β−ＥＣＤの５日間毎日のｉｐ適用）においては、ドーパミン作動性ニューロンの数の顕著な作用もある（ｃＮＲ：ｐ＝０．０００２）。
【００６２】
【表２】
【００６３】
図８：ニューレグリン−１βについて染色したＡＰＰＰＳマウスの脳タンパク質の２Ｄウェスタンブロットの２個の代表画像は、それぞれの、処理しかつ良好な学習動物（上）及び未処理の劣った学習能力を有する動物（下）を示す。上方部分における数は、２Ｄゲルのｐｌ値である。
【００６４】
図９：ウェスタンブロット実験は、アルツハイマー患者及び対照からの死後の皮質材料における余剰のＮＲＧ−１β−ＥＣＤ断片を比較する。
【００６５】
図１０：２Ｄ−ＰＡＧＥは、約５〜５．５のｐｌ及び約２５〜３２ｋＤの分子量を有するＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性アイソフォームは、この実験においてアルツハイマー病の患者の脳において明白に減少していることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、ニューレグリン１についての、神経変性疾患、神経学的疾病また同様に生理学的機能において中心的であると考えられる機構の上流の制御性原則としてのＮＲＧ１の鍵となる機能的位置を示す図である。
【図２】図２は、モリス水迷路（Morris water maze）中の学習実験の要約を示す図である。
【図３】図３は、ＮＲＧ−１βＥＣＤによるアンフェタミン誘発された活動過剰の減少を示す図である。
【図４】図４は、モリス水迷路中での脳のアミロイドーシス及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルを用いた学習実験の要約を示す図である。
【図５】図５は、ドーパミン及びその代謝産物のＨＰＬＣ定量化を示す図である。
【図６】図６は、ＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴによるドーパミンの代謝を示す図である。
【図７】図７は、ＭＰＴＰ暴露は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な損失を生じることを示す図である。
【図８】図８は、ニューレグリン−１βについて染色したＡＰＰＰＳマウスの脳タンパク質の２Ｄウェスタンブロットの２個の代表画像を示す図である。
【図９】図９は、ウェスタンブロット実験により、アルツハイマー患者及び対照からの死後の皮質材料における余剰のＮＲＧ−１β−ＥＣＤ断片を比較する図である。
【図１０】図１０は、約５〜５．５のｐｌ及び約２５〜３２ｋＤの分子量を有するＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性アイソフォームは、この実験においてアルツハイマー病の患者の脳において明白に減少していることを示す図である。
【図１１】図１１は、実験のセットアップを示す図である。
【図１２】図１２は、動物の経路記録からコンピューター計算されるべきパラメーターの定義のための区域を示す図である。
【００６７】
実施例
一般：
以下の全実験においては、ニューレグリン−１βの断片を使用しており、これは、ヒトのｎｒｇ−１遺伝子の全転写産物の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のみを含有する。これは、リン酸化及び／又はグリコシル化状態に依存して約２５〜３２ｋＤの分子量及び約５〜９．５の等電点を有した。
【００６８】
ニューレグリン−１アイソフォームの生理学的に活性のある形態は、約５．５のｐｌを有する。この生理学的に活性のある形態は、約５．５のｐｌを有する（この実験のほとんどは、市販の、大腸菌（E.coli）中で産生されるアイソフォームを用いて実施され、これは２６ｋＤの分子量及び約９．０のｐｌを有する）。
【００６９】
このアイソフォームは、R & D Systems, Inc.から購入された（カタログ番号377-HB-CF）、ＮＲＧ−１βの最初の２４５アミノ酸からなる組み換え溶解性ヒトのＮＲＧ−１β断片である。以下においてはＮＲＧ−１β−ＥＣＤと名付けられる。この活性のあるアイソフォームは約９．０のｐｌを有する。
【００７０】
我々は、８ｋＤを有するＮＲＧ−１βの相応する断片も試験し、これはR&D Systemsから購入された（カタログ番号396-HB）ＥＧＦドメインのみを含有する。この断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもまた同様にｉｎ ｖｉｖｏでも神経保護性であるようであるが、発癌性に関する憂慮を惹起するより高度な増殖特性のために、詳細には調査しなかった。
【００７１】
実施例１
初期の毒物学的データは、ＮＲＧ１β（ＥＣＤ）が急性毒物学及びｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異性試験において不利な作用を有しないことを示す。
・ラットにおいて急性の静脈性毒性は存在しなかった：全ての動物は研究期間の終わりまで生存した。研究の経過の間に臨床徴候は観察されなかった。動物の体重は、この株及び年齢について一般的に記録される範囲内にあった。屍検では顕微鏡的知見は記録されなかった。１４日間の期間にわたり観察された、メスのラットへの単一静脈投与後のＮＲＧβ１（ＥＣＤ）の中央致死量は：ＬＤ50（メスのラット）：５０００ｎｇ／ｋｇ体重より多い。
・用量レベル５０、２００及び６００ｎｇ／ｋｇ体重／ｄでの７日間の期間にわたるニューレグリンの毎日の静脈投与は、いかなる未成熟な死も生じなかった。臨床徴候は観察されなかった。この処置は、餌消費及び体重発育に作用しなかった。この無影響レベル（ＮＯＥＬ）を６００ｎｇ／ｋｇ体重／ｄで確立した。
・細胞系Ｌ５１７８Ｙを使用した、OECD Guideline for the Testing of Chemicals, No. 476 "In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test"によるマウスリンパ腫チミジンキナーゼ遺伝子座（locus）アッセイにおいて、ＮＲＧ１Ｂ（ＥＣＤ）は非突然変異誘発性であった。
・OECD Guideline for the Testing of Chemicals, No. 473によるチャイニーズハムスターＶ７９細胞中での染色体異常試験において、ＮＲＧ１β（ＥＣＤ）は構造的な染色体異常を誘発しなかった。
【００７２】
更に、有効性に関して実施されたこの動物実験のいずれにおいても（この幾つかのものは毎日のｉｖ適用を用いて数ヶ月継続する）、ＮＲＧ１β（ＥＣＤ）の不利な作用は全く観察しなかった。
【００７３】
以下に説明する様々な動物モデルにおけるＮＲＧ１β（ＥＣＤ）の適用は、静脈（ｉｖ）又は腹腔内（ｉｐ）注射のいずれかにより行われた；濃度は３〜６００ｎｇ／ｋｇの範囲にわたった。
【００７４】
実施例２
学習及び記憶：ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ適用あり及び無しでの空間学習
方法：
モリス水迷路は、空間学習を評価する。これは、動物を水で満たしたプール中で泳がせ、かつ、この表面のすぐ下に沈められた救助足場（rescue platform）を見つけさせる。この足場が迷路の壁から離れて配置され、かつ、動物が位置の推定を可能にする水表面から可視できる参照点を有し、但し、これが連想学習を可能にするために標的に十分近すぎないことが必須である。動物は、足場を介した場合にのみ救助がくるように訓練され、これは足場を見いだせない全ての動物は足場に案内され、かつ、このセットアップから取り除かれる前に休息させることを意味する。したがって、マウスにとって最も重要な参照点の１つは、人間の操作者である。
【００７５】
実験は、ネズミの空間想起に関連した２つの鍵となるパラメーターの決定を目的とする：
・マウスがこの足場を配置し直す（relocate）ことを学習する速度、
・短期間でこの情報を保持する能力（訓練期間内又はオーバーナイト）。
【００７６】
動物
この研究をＡＰＰ／ＰＳマウス（Meyer-Luehmann et al. 2006;Radde et al. 2006）の２つの群を用いて実施し、このうちの一方をＮＲＧ−１β−ＥＣＤの毎日の用量により処置し、かつ、もう一方は対照として偽処置されている。それぞれの群は、最初の実験系列の開始時に９週齢の８匹の雄からなる。
【００７７】
この最初の実験系列は、４２週に８匹の処理したマウス及び８匹の未処理マウスの２つのサブグループで開始し、１５日間にわたり持続するものである。更なる同一の実験の系列は、６、１２等の週間後に実施されるものである。
【００７８】
第２の一対のサブグループ（８匹の処理及び８匹の未処理の９週齢の雄）については、同じ系列の実験を４８週に開始し、この結果このサブグループの実験はこの最初のサブグループの１つのちょうど６週間遅れである。
【００７９】
装置
この処理及び未処理ＡＰＰ／ＰＳマウスの学習適性を、円形のモリス水迷路を用いて評価し、これはマウスを消耗させることなく探索空間を提供するために十分大きい必要がある。最大限に注意を払うべきは、全ての実験を通じて実験のセットアップの各詳細を可能な限り変動しないように維持することである。
【００８０】
この現在の研究においては、１２０ｃｍの直径のプールを使用し、これは実験室中で常に同一の向きを有して正確に再現可能な位置に配置されている。プール中の固定された位置で、白色の半透明な円形の、１５、１０又は５ｃｍの直径の足場を配置し、これは水面のちょうど下へと延び（この結果この足場はマウスに見えない）、かつ、動物がよじ上れるように配置されている−これは水から出て休息するための唯一の手段である。よじ登りを評価するために、足場は金網グリップで被覆されている（図１１参照）。
【００８１】
以下説明するとおりに救助手順を検査試験において実施するために、足場に、直接的な操作者の介入なしに自動的に昇降可能にする機構を備える。このようにして、その高さに依存して、足場は水泳中のネズミにとってアクセス可能であるか又は「オンデマンド足場」（Buresova et al. 1985）ではない。
【００８２】
足場配置は環状に形成された、それぞれ〜４０ｃｍ及び〜８０ｃｍの内側直径及び外側直径を有するプールの同心状の領域中に常に配置されりる。４つの四分円は、足場がこのうちの１の中心領域を占めるように定義される（標的四分円）。足場サイズ及び位置についての更なる詳細については以下を参照のこと。
【００８３】
足場位置がこの実験の全系列を通じて正確に同じになることを確かにするために、ソケットをプール床に固く添え、この上に足場は最小限の空間的許容性でもって取り付けられることができる。足場の上部には、その中心に、水から突出する（隣接する）手がかりのための他の取り付けが存在し、これは、ビデオ録画で良好に可視可能であり、同様のことはプール中の水泳するマウスについても当てはまる。足場位置の確認のために、短いビデオ録画が動物なしではあるが足場中へとはめ込まれた手がかりありで行われるものであり、これは足場又はビデオカメラがいずれにせよ操作される場合にはいつでも当てはまる。
【００８４】
水は、低脂肪乳粉末を用いて不透明にしてある。水温は、出口の探索を促すために十分冷たいことが望ましいが、動物が苦しんだり又は消耗するほど冷たくはない。適正な妥協策として、水温はそれぞれの実験の開始時にモニターされ、かつ、温水又は氷片でもって１８℃に調節される。個々の試験の間に温度を必要に応じて再適合させる。
【００８５】
（異なる単純な幾何学的形状及び異なる色彩、高さ〜２０ｃｍの）４つの遠位の手がかりを、プールの側面の〜２０ｃｍ上方に取り付け、各四分円中に１つである。注意すべきであるのは、全ての実験を通じてこの正確に同じ配置中に手がかりが配置されていることである。全体のプールを白色の半透明のカーテンにより囲む。照明は薄暗くかつ散乱的である。
【００８６】
ビデオカメラをプール中心の上のちょうど垂直な位置に固く取り付け、この結果プールは完全にビデオ画像を満たす。ビデオ録画を少なくともＰＡＬ解像度でとる（７２０×５７６ピクセル、１秒間あたり２５フレーム）。ビデオを自動追跡システムにより評価し、この結果時間に伴う動物の運動の欠点のない検出が可能になる。
【００８７】
スティック上に取り付けられた特殊な装置を用いてマウスを水中に配置し、この結果これらは半透明なカーテン製の小屋に入る操作者なしにプールの縁にそって正確に定義されたスポットで水で湿潤されることができる。
【００８８】
実験的設計
各セッションにおいて、マウスを予め定義された部位でプール中に配置し、６０秒間水泳させる。動物の運動路をビデオ追跡システムにより記録し、パラメーターをコンピューター計算し、ここから動物の学習適性に関する結論が導き出される（最も明らかであるのは、マウスがこの足場に最初にぶつかるまでの時間＝「逃走潜時」；更なる詳細については以下参照のこと）。マウスが足場の発見に成功すると、短期間（〜１５ｓ）そこに休息させたままにする。さもなければ、水泳６０秒後、マウスを操作者により足場に案内し、〜１５秒間休息させる。その後、操作者により持ち上げ、優しく乾燥させ、その小屋に戻すか又は次の水泳のために準備させる。
【００８９】
実験のそれぞれの日に、マウスにつき１の試験を早朝に実施する。それぞれの試験は２つの連続的な水泳からなり、これは２つの異なる四分円から発生するが、標的四分円からでない。正確な水でぬらす部位（及び適用可能である場合には常に足場部位）は、それぞれの日のそれぞれの水泳についてランダムに割り当てられ、しかしながらこの日の間の個々のマウスの間で相違しない。
【００９０】
マウスが水泳の回数を極めて緩慢に学習することが分かった場合には１回の試験について又は１日につき複数の試験について増加してよい（逆も同じである）。さらに、多くのマウス株において若い動物は極めて迅速に学習し、このため訓練の４又は５日後に、逃走潜時は数秒間のみ一定のままであり、これは処理動物においても未処理動物においても等しく事実である。しかしながら、統計学的評価については、訓練日数にわたる逃走潜時の曲線が飽和せずむしろ単調に減少する場合に有利である。したがって、解決すべき問題が訓練の進行に伴いより困難になる実験的設計を使用する：予め定義された日に足場をより小さいものと置き換え、その一方でこの足場の中心座標は同じままである。足場が交換される場合又はその時は、実験のそれぞれの系列について独立して決定されてよく、かつ、先立つ系列の結果に依存すべきである。
【００９１】
実験のそれぞれの系列においてマウスに３つの異なる種類の課題を課す：
・合図された配置ナビゲーション。プラットフォームを手がかりでマークし、マウスを足場を見つけるまで泳がせる。この手順は連想的学習を試験し、マウスを可能な限り類似している学習適性である２つの実験群にわけるのに役立つ。更に、第２の及び更なる系列の実験において、合図された場所ナビゲーションは、先行する系列における足場の位置の薄れていく想起を支持する。
・隠された足場獲得訓練。足場はマウスに可視可能でなく、かつ、先行する水泳の間に同じ配置に位置される。この課題は、隠された足場の正確な配置を想起することについてのてマウスの進歩をモニターすることを可能にする（「空間的学習」）。
・検査試験実験。この課題において、オンデマンド足場を表面下に最大限低下させ、マウスをこれを自由に探索させながら泳がせる。検査試験実験は、動物の絶対的な想起を評価し、これは、この文脈においては、足場配置に関する信念、忍耐又は確信とも解釈されることができる。実験を解釈するための慣用的アプローチとは、足場の固く固定された場所を有する動物が、限定された場所においてより忍耐強く探索し、したがって足場の隣の区域においてより時間を費やすであろうことである。
・検査試験実験において、足場を見出すことについての不能性が足場区域へと泳ぐための刺激を減少させる可能性があるという危険が存在する。これらのいらだちを可能な限り小さく維持するために、ヒトの救助の調節は同じに維持されなくてはならず、この結果、足場の非存在にもかかわらず幾ばくかの空間的な不変性が存在する。したがって、水泳６０ｓ後足場を表面のちょうど下におろし、このマウスをここに操作者により案内し、この装置から取り出される前に〜１５ｓにわたり休息させる。
検査試験実験の全ての日に、ただ一回の水泳が実施される。
【００９２】
各試験の約６０分間前に、マウスを毎日ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ５ｎｇ／ｋｇ（黒色の６マウスの血清中に懸濁され、マウスにつき２０μｌの容量においてｉ．ｖ．で提供）又はビヒクル２０μｌでそれぞれｉ．ｖ．で処理した。
【００９３】
第１の系列の実験の１日目に、全てのマウスは研究において偽処理のみを受けた。この後でマウスをニューレグリン及び対照群に割り当て、この結果逃走潜時の分布が両者のグループで適合する。
【００９４】
それぞれの系列の実験において、以下の年代記を添付する：
１日目．１０ｃｍの大きさ及び各水泳毎に変化する位置の足場を用いた合図された足場探索。
２日目．１０ｃｍの大きさ及び各水泳毎に変化する位置の足場を用いた合図された足場探索。
３日目．１０ｃｍの大きさ及び各水泳毎に変化する位置の足場を用いた合図された足場探索。
４日目．１０ｃｍの大きさ及び３日目の最後のものと同じ位置の足場を用いた合図された足場探索。
５日目．１５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
６日目．１５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
７日目．１５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
８日目．１０ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
９日目．検査試験実験。
１０日目．１０ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１１日目．１０ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１２日目．５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１３日目．５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１４日目．５ｃｍの大きさ及び同じ位置の足場を用いた隠された足場探索。
１５日目．検査試験実験。
【００９５】
存在する足場なしにマウスを数日間自由に泳がせることにより、先行するセットの実験から足場の位置の反学習を助力することが必要であってよい。
【００９６】
学習速度を各訓練／試験セッションをモニターし、かつ、足場を見出すことにおける動物の成功また同様に、足場がある中心領域近辺において探索すべき側から移動して遠ざかるためのプールの側面を回避することからの探索戦略の進化に注意することにより評価する。
【００９７】
測定されたパラメーター
動物のビデオ記録から、それぞれのマウスの動き経路を抽出し、ｘ、ｙの系列及び時間軸として更なるプロセス処理のためエクスポートする。
【００９８】
信頼してそれぞれの経路の開始点を同定できるよう、かつ、追跡エラーを回避するように、注意しなくてはならない。同時に、パラメーターの数をコンピューター計算し、ここから動物の学習適性に関する結論が導かれることができる（以下参照のこと）。パラメーター記録は６０秒後又はマウスが足場を見出した場合に維持する（いずれかより早く起こった方）。
【００９９】
動物の経路記録からコンピューター計算されるべきパラメーターの定義のために以下の区域が定義される（図１２参照のこと）：
評価を可能な限り柔軟に維持するために、５．５〜３０ｃｍの直径の４つの同心標的区域（足場に関して中心にある）を利用する。
【０１００】
動物の経路記録からコンピューター計算されるパラメーターは次のものを含む：
・移動した全距離
・全体的な平均速度
・プール中心への入場の回数
・プール中心中での時間
・プール中心への最初の入場への潜時
・最初の入場からプール中心へと移動した距離
・内部領域への入場の回数
・内部領域中での時間
・内部領域中で移動した距離
・内部領域への最初の入場への潜時
・内部領域への最初の入口へ及び各標的区域１〜４及び標的四分円のために移動した距離
・区域への入場の回数
・区域中での時間
・区域中に移動した距離
・区域に最初に入場するための潜時
・区域に最初に入場するために移動した距離
・経路の開始から区域の最も近い点への距離
・区域の外側の場合の区域からの平均距離
・区域の外側の場合の区域からの最小距離
・区域の外側の場合の区域からの最小距離への時間
・区域に近づく時間
・区域から更に離れる時間
・区域にむかって移動する時間
・区域から離れて移動する時間
・区域へのヘッド（head）入場の回数
・区域中でのヘッドの時間
・ヘッドが区域中で移動した距離
・区域へのヘッドの最初の入場の潜時
・区域の外側の場合の区域からのヘッドの平均距離
・区域の外側の場合の区域からのヘッドの最小距離
・最初のヘッディングエラー
・平均のヘッディングエラー
・区域から出る回数。
【０１０１】
実験それぞれの日のために、処理および未処理の群中の学習進展のパラメーターの読み取りを、相互に統計学的に比較する。
【０１０２】
個々のマウスの経路記録を試験する場合に、ヒトの観察者は、足場を配置することについての動物の主張（assertiveness）の妥当に現実的な認知をすることができるようになり、これは測定されたパラメーター値において完全には反映されていない。したがって、経路記録をも手動で検査し、足場位置の動物の想起を評価した。
【０１０３】
結果：
一日量３ｎｇ／ｋｇのＮＲＧ−１β−ＥＣＤでｉ．ｖ．で訓練の３０分前に処理したこれらの動物は、ビヒクル処理群に比較して学習関連パラメーターにおいて顕著により良好であった。
【０１０４】
ニューレグリンは改善された学習のみでなく、しかしながら処理された動物は、より発達した探索戦略も有した。より多くの処理動物は、プールの内側領域に入り（１１ｖｓ．７、ｐ＝０．０１９）、内側領域への入場はより頻繁に生じ（２．１７ｖｓ．０．９２回、ｐ＝０．０２）、内側領域中を移動して費やした時間及び距離はより長かった（６．５１ｖｓ．２．１３ｓ、ｐ＝０．０９及び０．６４ｍ ｖｓ．０．２５ｍ、ｐ＝０．０３１、それぞれ）。
【０１０５】
モリス水迷路中での学習実験の結果を図２に要約する。
【０１０６】
実施例３
精神分裂病：ラット中でアンフェタミン誘発された活動過剰
方法：
抗精神病及び抗パーキンソン病活性を検出する方法は、Costall et al. 1978により説明された方法にならい、そしてBoissier and Simon 1966により説明されたものに類似する活動メーターを使用する。
【０１０７】
アンフェタミンはこの試験状況において活動過剰を誘発する。活動過剰は、辺縁系レベルでのドーパミン作動系に作用する典型的かつ非定型の（atypical）向精神病薬により拮抗され、かつ、抗パーキンソン薬により強化される。
【０１０８】
ラットにｄ−アンフェタミン（３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を注射し、すぐさま活動メーター中に配置する。
【０１０９】
この活動メーターは、１２個のカバー付きプレキシガラスケージ（４０×２５×２５ｃｍ）からなり、暗くしたキャビネット内に含まれる。それぞれのケージは、それぞれのケージの末端で、床の３ｃｍ上に２つのフォトセル組立を備え、これは、ケージの一端からもう一端へとそれぞれの動物（ケージにつき一匹）による動きの数を測定するためである。２つの更なるフォトセル組立を、立ち上がり（rearing）を記録するために床上２０ｃｍに配置する。活動及び立ち上がりのためのスコアを、１０分間の間隔でコンピューターにより記録し、３０分間の期間にわたり蓄積した。
【０１１０】
１５匹のラットを一群につき研究した。この試験を盲検的に実施した。この試験物質を、８の用量で評価し、アンフェタミンの１５分前にｉ．ｖ．投与し、ビヒクル対照群と比較する。実験は、アンフェタミンで未処理の対照群も含んだ。同じ実験状況で投与したハロペリドール（０．１２５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）を参照物質して使用した。この実験はしたがって１６群を含んだ。
【０１１１】
データを対応のないスチューデントのｔ試験を用いて処理群と適当な対照とを比較することにより分析した。
【０１１２】
結果：
図３に示されるとおり、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは用量依存的にアンフェタミンにより誘発された過剰活動を精神分裂病のための動物モデル中で抑制した。著しく、この実験はＮＲＧ−１β−ＥＣＤの傑出した特性を明らかにする：
・図３中に示される作用は、実験の第２の半分（２０〜４０分）において最強である。最初の２０分間においてはより小さな作用のみが見出されることができ、これはこのタンパク質の更なるプロセッシングへと作用点を遅延させた。
・ここで使用したＮＲＧ−１β−ＥＣＤの有効濃度は、典型的な対照神経遮断薬、例えばハロペリドール（１２５μｇ／ｋｇ）について使用したものよりも約２００〜１０００倍より低い。
・ハロペリドール、クロザピン、オランザピンその他とは対照的に、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤはビヒクル対照レベル未満に試験動物の活動を減少させないので、不利な作用は観察されない。
【０１１３】
実施例４
精神分裂病：プレパルス阻害
ＮＲＧ１ノックアウトを有する齧歯類は、顕著に損なわれたプレパルス阻害（ＰＰＩ）を示し、これはＮＲＧ１を精神分裂病につなげる。動物モデル中の精神病の広く使用される代理測定、ＰＰＩは、精神分裂病エンドフェノタイプと考えられる。精神分裂病及び健康な対照集団の両者において、広範なジェノタイピング後に、ＰＰＩに対して、ＮＲＧ１（rs3924999）上に配置されている非同義単一ヌクレオチド多形のミスセンス突然変異の神経生理学的作用があることが報告された（Hong et al. 2007）。ＰＰＩに対するＮＲＧ−１β−ＥＣＤの作用を試験した。これまでの結果は以下のように要約されてよい：
この作用は、１１５ｄＢで、統計学的有意には達せず、観察されなかったが、１０５ｄＢで、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、ＰＰＩの再確立に対して一般的な傾向を示した（＋２６％、＋２３％及び＋３６％、１５０、３００及び６００ｎｇ／ｋｇ、それぞれ）。これは１５０又は３００ｎｇ／ｋｇで刺激の非存在において自発的な動きに対する作用を有しなかったが、６００ｎｇ／ｋｇで刺激の非存在において自発的な動きを顕著に減少させた（−２０％及び−２９％、平均及びピーク強度に対して、それぞれ、ｐ＜０．０５、これはアリピラゾールに類似である）。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、プレパルス単独に対する反応に対して作用を有しなかった。
【０１１４】
これまでの結果は、１５０〜３００ｎｇ／ｋｇの用量範囲にわたるPropsy100についてのアポモルフィン誘発されたＰＰＩ欠失及び自発運動また同様にＰＰＩの再確立に対する傾向の減少に対する顕著な作用の非存在を示唆し、これはラットにおけるプレパルス抑制（ＰＰＩ）試験における６００ｎｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．でのものである（アポモルフィンにより誘発される欠失）。
【０１１５】
この実験系列において、参照物質、アリピプラゾールは、弱いが顕著な活性を３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．で有したが、同じ試験において１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．では有しなかった。
【０１１６】
一緒になってかつ使用した条件下で、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、約６００ｎｇ／ｋｇのより高い濃度でＰＰＩに作用するようである。これらの結果は、意外なことに、精神分裂病における有力な候補遺伝子の１つとして（ＮＲＧ１）を示唆する最近の神経生物学的研究の新規の理解を開く。
【０１１７】
実施例５
アルツハイマー病のための動物モデル（ＡＰＰＰＳ ｄｔマウス）における学習及び記憶
通常マウスについて上述したとおりのモリス水迷路セットアップにおけるニューレグリン１β（ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ）の溶解性細胞外ドメインの適用あり又はなしでの学習及び記憶を試験する動物実験を、大脳アミロイドーシスについてのダブルトランスジェニックマウスモデルに繰り返した（ＡＰＰＰＳマウス（Meyer-Luehmann et al. 2006;Radde et al. 2006））。
【０１１８】
ここでも、一日量のＮＲＧ−１β−ＥＣＤ（ここでは２００ｎｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．を適用）で訓練の３０分前に処理したこれら動物は、ビヒクル処理群に比較して学習関連パラメーターにおいて顕著により良好であった。
【０１１９】
ニューレグリンは改善された学習のみでなく、しかしながら処理された動物は、より進んだ探索戦略をも発達させた：より多くの処理された動物は、プールの内側領域に入り（１２ｖｓ．７、ｐ＝０．００９）、内側領域への入場はより頻繁に生じ（２．０ｖｓ．０．７回、ｐ＝０．０３）、内側領域中を移動して費やした時間及び距離はより長かった（５．３ｖｓ．２．１ｓ、ｐ＝０．０９及び０．７ｍ ｖｓ．０．３ｍ、ｐ＝０．０２５、それぞれ）。
【０１２０】
大脳アミロイドーシス及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルを用いたモリス水迷路中での学習実験の結果を図４にまとめる。
【０１２１】
実施例６：
パーキンソン病のニューレグリン１−βＭＰＴＰマウスモデル
方法：
１０週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスをパーキンソン病のためのＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）モデルにおいて使用した。
【０１２２】
１０週齢の雄のＣ５７ＢＩ６マウス（Ｎ＝１０、１群につき）の脳組織を、ＮａＣｌ（対照）又はＭＰＴＰ（急性及び亜慢性モデル）を用いた処理後の異なる時間（０、１、３、７、２１日）に切開した（黒質、線条体、皮質）。この方法は、刊行された手順に従う（Hoglinger et al. 2007;Hoglinger et al. 2004）。
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
ＭＰＴＰを粉末として０．９％のＮａＣｌ中に溶解させ、腹腔内注射した（急性適用：４×２０ｍｇ／ｋｇ、それぞれ２時間の間隔で；慢性適用：５×３０ｍｇ／ｋｇ、それぞれ２４時間の間隔で）。これらの注射は約１０秒間かかり、動物を頸部脱臼により定義された時間点（表参照）に屠殺した。この手順は、刊行されたプロトコルに従う（Hoglinger et al. 2007;Hoglinger et al. 2004;Liberatore et al. 1999;Przedborski and Vila 2003; Vila and Przedborski 2003）。
【０１２５】
最後のＭＰＴＰ投与０日後：線条体のドーパミン作動性神経の損失
最後のＭＰＴＰ投与１日後：マイクログリア活性化の開始
最後のＭＰＴＰ投与３日後：最大限のマイクログリア活性化
最後のＭＰＴＰ投与７日後：最大限のアストロサイト活性化
最後のＭＰＴＰ投与２１日後：最大限の細胞死。
【０１２６】
Alzet Mini pumpを介したＮＲＧ−１β−ＥＣＤ及び対照ペプチドの大脳注入２１日後に、ＭＰＴＰ処理（急性又は慢性）が引き続き、中間脳のドーパミン作動性ニューロンの組織学的定量化を立体解析学的原理により実施した。線条体中のドーパミン及びその代謝産物の生化学的定量化をＨＰＬＣにより実施する。手順は、刊行されたプロトコルに従う（Hoglinger er et al. 2007;Hoglinger et al. 2004）。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
結果：
図５に示されるとおり、ドーパミン及びその代謝産物のＨＰＬＣ測定の結果は、ＭＰＴＰ傷害（insult）の間にこのパーキンソン病のためのモデルにおいて、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの投与の明白な作用を明らかにする。
【０１２９】
この作用は、非典型的である：ドーパミンレベルに対する顕著な作用が、ＭＰＴＰ傷害の間もＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与の急性又は慢性対照中にも存在しない一方で、ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡの濃度に対する著しくかつ明白な作用が存在する。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの慢性的投与は、ＭＰＴＰ傷害の非存在におけるこの代謝産物の明白かつ顕著な減少を生じ、その一方でこの急性の様式においてわずかな減少のみが観察される。ＭＰＴＰ傷害の慢性状態の間に、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤは、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）の顕著な増加を生じ、ＭＰＴＰ傷害の非存在においてより一層明白な効果である。
【０１３０】
これらの結果は、慢性的ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与及び／又はＣＯＭＴ上方制御の間のＭＡＯ−Ｂの下方制御により解釈されることができる。適用された条件下でドーパミン作動性ニューロンの生存に対する巨大なかつ顕著な有利な作用が観察された。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤはこのモデルにおいて高度に神経保護性でもある。この系列の実験の間にｉｐ注射をすると、この明らかな有効性は、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤが血液脳関門を通過することにおいて高度に効率的であることも再度証明する。
【０１３１】
図６は、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与により作用されるように見える代謝スキームを示す：ドーパミンはＭＡＯ−ＢによりＤＯＰＡＣへと、そしてＣＯＭＴにより３−ＭＴへと変換される；ホモバニリン酸は引き続き両者の代謝産物からＣＯＭＴによりＤＯＰＡＣから、そしてＭＡＯ−Ｂにより３−ＭＴから産生される；ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ投与は、両方の酵素の活性を明らかに制御する。
【０１３２】
より一層重要であり、かつ、図７に示されるとおり、パーキンソン病のＭＰＴＰモデルにおいては、ＮＲＧ−１β−ＥＣＤの明白かつ顕著な神経保護性の作用が存在し、これは中間脳のドーパミン作動性ニューロンの組織学的定量化により明らかになる。この組織学的方法は、その他にも説明されている（Liberatore et al., 1999, Przedborski & Vila, 2003; Vila & Przedborski, 2003; Hoglinger et al., 2004; Hoeglinger et al., 2007）。
【０１３３】
一緒にすると、パーキンソン病のＭＰＴＰ動物モデルにおける意外にも明白かつ利益のある神経保護作用が存在する。この作用は、極めて低濃度のＮＲＧ−１β−ＥＣＤの腹腔内投与（例えば２０ｎｇ／ｋｇ）が、有効性を達成するために十分であり、したがってＮＲＧ−１β−ＥＣＤが脳血液関門を通過することを再度証明する。ドーパミン代謝産物に対する複雑な作用（ＨＰＬＣ結果；図５）も、ＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴのＮＲＧ−１β及びＮＲＧ−１β−ＥＣＤによる制御を指摘する。
【０１３４】
実施例７
有効成分（active principle）としてのＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性翻訳後アイソフォームの同定
学習及び記憶においてＮＲＧ−１β−ＥＣＤの特定の翻訳後酸性アイソフォームが活性のある形態であるという証拠を刊行した（Schillo et al. 2005a）。ここでは、同様のパターンがアルツハイマー病の動物モデル及びアルツハイマー病及びパーキンソン病患者からの死後の脳組織において観察されることを示す。我々は、この酸性アイソフォームが有効成分であることを結論づける。
【０１３５】
方法：
ウェスタンブロット染色のために以下の抗体を使用した：抗ＮＲＧ１−ＥＣＤ、ウサギポリクローナル（sc-28916 ロット：I 2905 Santa Cruz; H-210）
ニューレグリン−１（Ｈ−２１０）は、ヒト由来のニューレグリン−１アイソフォームＨＲＧ−αのＮ末端細胞外ドメイン内のアミノ酸２１−２３０マッピングに対して産生されたウサギポリクローナル抗体である。ニューレグリン−１（Ｈ−２１０）は、マウス、ラット及びヒト由来のニューレグリン−１アイソフォームＨＲＧ−α、ＨＲＧ−α１Ａ、ＨＲＧ−α２Ｂ、ＨＲＧ−α３、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−β３（ＧＧＦ）、ＧＧＦ２及びＳＭＤＦのウェスタンブロット（開始希釈１：２００、希釈範囲１：１００〜１：１０００）、免疫沈降［全タンパク質１００〜５００μｇにつき１〜２μｇ（細胞溶解物１ｍｌ）］及び免疫蛍光（開始希釈１：５００、希釈範囲１：５０〜１：５００）による検出のために推奨される。
【０１３６】
二次抗体は次のものであった：
抗ヤギ、ＨＲＰ
sc-2922ロット：C 1405 Santa Cruz
抗ウサギ、ＨＲＰ
sc-2054ロット：C 2005 Santa Cruz。
【０１３７】
免疫染色の次に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＱ−ＴＯＦ質量分析をＮＲＧ−１β−ＥＣＤを確認するために実施した。
【０１３８】
いまや、大脳アミロイド形成及びアルツハイマー病のＡＰＰＰＳマウスモデルにおいて極めて類似のパターンを図８に示すとおり見出す。この特定の酸性のアイソフォームのＮＲＧ−１β−ＥＣＤの濃度は、約ｐｌ５．０で、同時により良好な学習者である処理されたＡＰＰＰＳマウスにおいて顕著により高い。
【０１３９】
図８には、それぞれの、処理された良好な学習動物（上）及び劣った学習能力を有する非処理動物（下）の代表的な画像が示される。
【０１４０】
図９は、それぞれ９人のアルツハイマー患者及び年齢適合させた対照からの死後の皮質材料を用いたウェスタンブロット実験の結果を示す。ＮＲＧ−１β−ＥＣＤ断片が、アルツハイマーの場合に豊富さが顕著により少ないことを明白に示す。内部対照として、ＮＲＧ−１２の豊富さを測定し、これは疾病に関連する記憶喪失により作用を受けないように見える。
【０１４１】
この特定のアルツハイマー病及び記憶に関連したＮＲＧ−１β−ＥＣＤのアイソフォームの更なる検査を、図９について使用した同じ死後のヒトの脳材料の２次元ゲル（２Ｄ−ＰＡＧＥ）のウェスタンブロットにより行い、これは、図１０に示される代表的な例により示されるとおりに、確かに、アルツハイマー状態において減少しているＮＲＧ−１β−ＥＣＤの酸性のアイソフォームであることを明らかにする。
【０１４２】
結論
我々はここで初めて、ｎｒｇ−１遺伝子の転写産物の翻訳後修飾、特にタンパク質加水分解的開裂により産生された切断された形態であって、ＭＷ１５〜３５、ｐｌ４〜１０を有するＮＲＧ−１βの細胞外ドメインを含有するもののｉｎ ｖｉｖｏ作用の機能的な証拠を提示する；より特異的には、我々は、精神分裂病のための動物モデルにおける抗精神病薬活性を、５〜６００ｎｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の濃度で、ことによるとＭＡＯ−Ｂ及びＣＯＭＴの制御に基づいて見出した。１００〜１０００倍より高い濃度で使用される対照神経遮断薬とは対照的に、不利な作用は観察されなかった。
【０１４３】
さらに、我々は３〜３００ｎｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）の濃度でのパーキンソン病のＭＰＴＰモデルにおける神経保護作用を見出した。
【０１４４】
さらに、我々は、学習及び大脳アミロイドーシス及びアルツハイマー病のためのそれぞれの動物モデルにおける記憶及び学習（モリス水迷路）に対する有利な作用を見出した。
【０１４５】
現在使用されている多くの非典型的な抗精神病薬の副作用を考慮すると（Haddad and Sharma 2007）、我々はＳＭＤＦ、ＮＲＧ−１α、特にＮＲＧ−１のＥＧＦドメインを有する溶解性ＮＲＧ−１−ＥＣＤ断片は、精神分裂病、双極性障害及びうつ病の治療のための独立の又は共薬物療法として使用されてよいことを結論付ける。
【０１４６】
これは、ある意味で、中枢神経系の他の疾病において使用されてもよく、例えば神経変性疾患、例えばアルツハイマー病及びパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、卒中、外傷性の脳及び脊髄損傷である。
【０１４７】
溶解性ＮＲＧ−１−ＥＣＤタンパク質は、神経シグナルトランスダクション、特にグルタミン酸シグナリング及び興奮毒性を媒介するシグナルトランスダクションにおける中心的な役割のためにこれらの極めて広範な作用を有し、これは前述した全ての適応症において中心的な役割を果たす（Schrattenholz and Soskic 2006）。
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経学的状態の治療のための医薬品の製造のための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用。
【請求項２】
精神分裂病、特に精神分裂病の認知に関連した観点、双極性障害及びうつ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、ＭＳ、ＡＬＳ、卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷の治療のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
ニューレグリン−１アイソフォームが組み換え溶解性ヒトニューレグリン−１アイソフォームである請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
ニューレグリン−１アイソフォームが、ニューレグリン−１βアイソフォーム、ニューレグリン−１αアイソフォーム又はＳＭＤＳアイソフォームである請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
ニューレグリン−１アイソフォームがニューレグリン−１βアイソフォームである請求項４記載の使用。
【請求項６】
ニューレグリン−１アイソフォームがこの細胞外ドメインの少なくとも一部を含有する請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
ニューレグリン−１アイソフォームがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して約１５〜約３５ＫＤの分子量を有する請求項１から６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
ニューレグリン−１アイソフォームが約４〜約１０、有利には約４〜約６の等電点（ｐｌ）を有する請求項１から７までのいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
ニューレグリン−１アイソフォームが修飾したポリペプチドであり、その際この修飾がリン酸化、グリコシル化、メチル化、ミリスチル化、酸化及びこの任意の組み合わせから選択される請求項１から８までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
更なる医薬品との組み合わせにおける請求項１から９までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
更なる医薬品が神経学的状態の治療のための医薬品である請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
更なる医薬品が、カテコールアミン代謝に作用する化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ−又はＣＯＭＴ−阻害剤、メマンチン型チャネル遮断剤、ドーパミン又はセロトニンレセプターアゴニスト又はアンタゴニスト、カテコールアミン又はセロトニン再取り込み阻害剤又は任意の種類の抗精神病薬、例えばクロザピン又はオランザピン又はガバペンチン様薬剤であってアルツハイマー病及びパーキンソン病、精神分裂病、双極性障害、うつ病又はその他の神経学的状態の治療におけるものから選択される、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
更なる医薬品が、精神病性疾患、例えば精神分裂病、双極性障害及びうつ病の治療のための医薬品、例えばオランザピン又はクロザピンである請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１４】
更なる医薬品がパーキンソン病の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１５】
更なる医薬品がアルツハイマー病の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１６】
更なる医薬品が多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１７】
更なる医薬品が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１８】
更なる医薬品がてんかんの治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１９】
更なる医薬品が卒中の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項２０】
更なる医薬品が外傷性脳損傷の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項２１】
更なる医薬品が脊髄損傷の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項２２】
（ｉ）組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム、及び
（ｉｉ）更なる医薬品、特に神経学的状態の治療のための更なる医薬品
を含有する医薬組成物又はキット。
【請求項２３】
記憶及び認知促進のための医薬品の製造のための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用。
【請求項２４】
神経学的状態、例えばアルツハイマー病に関連した記憶及び認知喪失を減少化及び／又は抑制するための請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
ニューレグリン−１アイソフォームが請求項１から９までのいずれか１項に定義されているとおりである請求項２１又は２２記載の使用。
【請求項２６】
医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む神経学的状態の治療方法。
【請求項２７】
医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む記憶及び認知の促進方法。
【請求項１】
神経学的状態の治療のための医薬品の製造のための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用。
【請求項２】
精神分裂病、特に精神分裂病の認知に関連した観点、双極性障害及びうつ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、ＭＳ、ＡＬＳ、卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷の治療のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
ニューレグリン−１アイソフォームが組み換え溶解性ヒトニューレグリン−１アイソフォームである請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
ニューレグリン−１アイソフォームが、ニューレグリン−１βアイソフォーム、ニューレグリン−１αアイソフォーム又はＳＭＤＳアイソフォームである請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
ニューレグリン−１アイソフォームがニューレグリン−１βアイソフォームである請求項４記載の使用。
【請求項６】
ニューレグリン−１アイソフォームがこの細胞外ドメインの少なくとも一部を含有する請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
ニューレグリン−１アイソフォームがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して約１５〜約３５ＫＤの分子量を有する請求項１から６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
ニューレグリン−１アイソフォームが約４〜約１０、有利には約４〜約６の等電点（ｐｌ）を有する請求項１から７までのいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
ニューレグリン−１アイソフォームが修飾したポリペプチドであり、その際この修飾がリン酸化、グリコシル化、メチル化、ミリスチル化、酸化及びこの任意の組み合わせから選択される請求項１から８までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
更なる医薬品との組み合わせにおける請求項１から９までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
更なる医薬品が神経学的状態の治療のための医薬品である請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
更なる医薬品が、カテコールアミン代謝に作用する化合物、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ−又はＣＯＭＴ−阻害剤、メマンチン型チャネル遮断剤、ドーパミン又はセロトニンレセプターアゴニスト又はアンタゴニスト、カテコールアミン又はセロトニン再取り込み阻害剤又は任意の種類の抗精神病薬、例えばクロザピン又はオランザピン又はガバペンチン様薬剤であってアルツハイマー病及びパーキンソン病、精神分裂病、双極性障害、うつ病又はその他の神経学的状態の治療におけるものから選択される、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
更なる医薬品が、精神病性疾患、例えば精神分裂病、双極性障害及びうつ病の治療のための医薬品、例えばオランザピン又はクロザピンである請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１４】
更なる医薬品がパーキンソン病の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１５】
更なる医薬品がアルツハイマー病の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１６】
更なる医薬品が多発性硬化症（ＭＳ）の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１７】
更なる医薬品が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１８】
更なる医薬品がてんかんの治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１９】
更なる医薬品が卒中の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項２０】
更なる医薬品が外傷性脳損傷の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項２１】
更なる医薬品が脊髄損傷の治療のための医薬品である請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項２２】
（ｉ）組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォーム、及び
（ｉｉ）更なる医薬品、特に神経学的状態の治療のための更なる医薬品
を含有する医薬組成物又はキット。
【請求項２３】
記憶及び認知促進のための医薬品の製造のための組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームの使用。
【請求項２４】
神経学的状態、例えばアルツハイマー病に関連した記憶及び認知喪失を減少化及び／又は抑制するための請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
ニューレグリン−１アイソフォームが請求項１から９までのいずれか１項に定義されているとおりである請求項２１又は２２記載の使用。
【請求項２６】
医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む神経学的状態の治療方法。
【請求項２７】
医薬的有効量で組み換え溶解性ニューレグリン−１アイソフォームをこれを必要とする被験体に投与することを含む記憶及び認知の促進方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５０３１３４（Ｐ２０１１−５０３１３４Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３５０９（Ｐ２０１０−５３３５０９）
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７１５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６２７５０
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８３６２６０８）プロテオシス アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＰｒｏｔｅｏＳｙｓ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ−Ｓｔｒａｓｓｅ ５１， Ｄ−５５１２９ Ｍａｉｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１７日（２００８．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００９７１５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６２７５０
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０８３６２６０８）プロテオシス アクチエンゲゼルシャフト (4)
【氏名又は名称原語表記】ＰｒｏｔｅｏＳｙｓ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ−Ｓｔｒａｓｓｅ ５１， Ｄ−５５１２９ Ｍａｉｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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