液滴操作装置および液滴操作方法
【課題】 物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で設計自由度が高く、高精度に液滴を操作可能な液滴操作装置および液滴操作方法を提供する。
【解決手段】
磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を搬送する搬送面を有する液滴搬送装置と、
液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を印加し、液滴を搬送面上に固定させる電場手段と、磁気粒子２ａを含む親水性の液滴２を搬送する搬送面１０ａを有する液滴搬送装置１０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０ａの上方に及ぶ電場を印加し、液滴２を搬送面１０ａ上に固定させる電場手段２０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０の上方に及ぶ磁場を印加し、磁気粒子２ａに電場の印加による液滴の固定力と液滴の表面張力の和よりも大きい力を搬送面に水平方向に与える磁場手段３とを備える。
【解決手段】
磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を搬送する搬送面を有する液滴搬送装置と、
液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を印加し、液滴を搬送面上に固定させる電場手段と、磁気粒子２ａを含む親水性の液滴２を搬送する搬送面１０ａを有する液滴搬送装置１０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０ａの上方に及ぶ電場を印加し、液滴２を搬送面１０ａ上に固定させる電場手段２０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０の上方に及ぶ磁場を印加し、磁気粒子２ａに電場の印加による液滴の固定力と液滴の表面張力の和よりも大きい力を搬送面に水平方向に与える磁場手段３とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴操作装置および液滴操作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気粒子を用いた化学操作、特に生化学反応システムでの分離、抽出、精製工程においては、使用するデバイスの微小化および反応の効率的な制御を行うことにより、様々な産業分野で利用可能なマイクロ化学反応システムにおける各種操作を電気的に行うことができる。
【０００３】
磁気粒子を含む微量の水又は水性液体は、水と混ざらないオイル等の液体媒体中に置いた場合、液滴の形態をとる。例えば、表面が親水性で粒径が約０．１μｍから５００μｍの磁性シリカ粒子を用いた場合、磁性シリカ粒子は、移動磁場中に於いて磁場が移動する方向へ液滴を牽引する。この現象は、マイクロ化学反応システムにおいては液体試薬の送液等に利用されている（例えば、特許文献１、２、３参照）。
【０００４】
磁気粒子の表面が特定成分を吸着する等の機能を有しており、その機能を利用して成分の分離精製を行う場合は、目的とする成分を吸着した磁気粒子を液滴から分離させる必要がある。更に、分離した磁気粒子から不純物を除くために、洗浄液から成る別の液滴に磁気粒子を通す必要もある。
【０００５】
シキダ（Shikida）らは、機能性表面を持った磁気粒子を用い、液滴ベースでの特定成分の分離、抽出を磁力を用いて行う方法を開示している。シキダらは、オイル中の母液滴から磁気粒子を分離させるために、ガラスゲート等の物理的な液滴制御機構を用いている（例えば、非特許文献１参照）。
【特許文献１】国際公開第０５／０６９０１５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０５８８７５号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−６１０３１号公報
【非特許文献１】シキダ（M. Shikida），タカヤナギ（K. Takayanagi），イノウチ（K. Inouchi），ホンダ（H. Honda）およびカトウ（K. Sato），「マイクロ化学分析システムにおける磁気ビーズの液滴操作のための膨潤性と界面張力の利用（Using wettability and interfacial tension to handle droplets of magnetic beads in a micro-chemical-analysis system）」，Sens. Actuators, B, 2006年, 113, 563-569.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、上述のように、微量液滴ベースで化学反応を目論むデバイスにおいて、水より比重の小さいオイル等の液体媒体中に液滴を固定するためには、シキダらのように、物理的な障壁、例えばゲート等の流体制御構造を設ける必要がある。特に、磁気粒子を含まない液滴を操作する場合は、磁場による移動制御が困難なため、液滴周囲を物理的に囲うか、液滴が接する基板表面に親水性化学処理を施し、そこへ液滴を吸着させる必要がある。
【０００７】
しかしながら、流体制御構造や基板親水性化学処理を施すと装置が複雑化するため、装置設計の自由度も損なわれる。また、ガラスゲート等を用いて磁気粒子を母液滴から分離する方法では、ゲートの大きさにより、目的としない液体が分離後の磁気粒子に含まれる場合があるため、液滴の分離精度が低くなる。
【０００８】
一方、磁気粒子を含んだ液滴ベースでの化学反応デバイスでは、複数の液滴を同時に操作する場合もある。即ち、ある１つの液滴は移動させ、もう一方の液滴は定位置に固定させる場合がある。複数の磁石を用いて、それぞれの液滴を独立に制御することも可能であるが、移動制御機構が複雑になる。また、流路等の流体制御構造を設けることも可能であるが、装置の構造が複雑となるため、設計自由度が損なわれ、種々の化学反応に対応可能な装置を実現することが困難である。
【０００９】
上記問題点を鑑み、本発明は、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で、設計自由度が高く、高精度に液滴を操作可能な液滴操作装置および液滴操作方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の態様は、磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を搬送する搬送面を有する液滴搬送装置と、搬送面の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含み、第１及び第２の電極に電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより液滴を搬送面上に固定させる電場手段と、液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段とを備え、磁場手段を搬送面に沿って移動させることにより、搬送面上に固定された液滴から磁気粒子を分離する液滴操作装置であることを要旨とする。
【００１１】
本発明の他の態様は、液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む電場手段に電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、液滴を搬送面上に固定させるステップと、液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を搬送面に沿って移動させることにより、搬送面上に固定された液滴から磁気粒子を分離するステップとを有する液滴操作方法であることを要旨とする。
【００１２】
本発明の更に他の態様は、液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段にそれぞれ電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させ、液滴を搬送面上に固定させるステップと、 液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を、搬送面に沿って、複数の電場手段間で往復移動させるステップとを有し、磁場手段の移動速度を、往路の移動速度に対して復路の移動速度が１０倍〜２００倍となるように制御する液滴操作方法であることを要旨とする。
【００１３】
本願発明の更に他の態様は、液滴搬送装置が有する搬送面上に、表面に核酸が結合した磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、搬送面上に洗浄溶液を配置するステップと、液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段に電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、液滴及び洗浄溶液をそれぞれ搬送面上に固定させるステップと、液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を搬送面に沿って移動させることにより、搬送面上に固定された液滴から磁気粒子を分離するステップと、磁場手段の移動により、液滴から分離した磁気粒子を洗浄溶液と混合させ、磁気粒子を洗浄するステップとを有する液滴操作方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で、設計自由度が高く、高精度に液滴を操作可能な液滴操作装置および液滴操作方法が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下図面を参照して、本発明の形態について説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号が付してある。但し、図面は模式的なものであり、装置やシステムの構成等は現実のものとは異なる。また、図面相互間においても互いの構成等が異なる部分が含まれていることは勿論である。また、以下に示す本発明の実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想の構造、配置等を下記のものに特定するものでない。
【００１６】
（第１の実施の形態）
第１の実施の形態に係る液滴操作装置は、図１に示すように、磁気粒子２ａを含む水溶液からなる液滴２を搬送するための搬送面１０ａ（図１では底面）を有する液滴搬送装置１０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０ａの上方に及ぶ電場を印加し、液滴２を搬送面１０ａ上に固定させる電場手段２０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０ａの上方に及ぶ磁場を印加し、搬送面１０ａ上に固定された液滴２から磁気粒子２ａを分離させる磁場手段３とを備える。
【００１７】
液滴搬送装置１０の形状としては、例えば、２枚の膜の端部が貼り合わされ膜に囲まれた空間を反応場とする膜状反応容器、キャピラリー、平板状基板、平板状基板表面を囲む壁を持つ容器、平板状基板と壁で囲まれた領域を覆う蓋を有する反応容器等が利用可能である。蓋は全体又は一部が開閉可能となっていて、化学反応を行うための試薬や試料を含む液滴を内部に投入できるようになっていてもよい。
【００１８】
反応物の検出、分析等における外部からのコンタミネーションを防ぐためには、完全閉鎖系の反応場を有する容器又は基板を液滴搬送装置１０として利用することが特に好ましい。完全閉鎖系の反応場を有する容器又は基板としては、例えば、上述した膜状反応容器の他に、両端が融着され閉鎖された流路を持つ細管状反応容器や反応基板と壁と蓋とが一体成形された反応基板などを好適に用いることができる。
【００１９】
図１の例では、液滴搬送装置１０として、厚さ０．３ｍｍ、縦幅３０ｍｍ、横幅９０ｍｍのポリプロピレン製の平板に、高さ１０ｍｍの壁（側壁）を設け、平板と側壁で囲まれた領域を５ｍｍ厚のガラス製の蓋で密閉した直方体状の反応基板（反応容器）を用いている。
【００２０】
搬送面１０ａは、液滴２の移動容易性を考慮して、液滴２と接触する表面が平滑であることが好ましく、特に、表面粗さＲａ＝０．１μｍ（JIS B 0601-1994）以下であることが好ましい。搬送面１０ａの表面粗さＲａ＝０．１μｍ以下とすることにより、例えば、磁場手段３を搬送面１０ａの下方に近づけて、磁場手段３の移動により液滴２を移動させる場合に、磁場手段３の移動に伴う磁気粒子２ａの移動の追従性を向上できる。
【００２１】
液滴搬送装置１０に用いられる材質としては、使い捨て可能や量産可能の点から、安価に入手可能な材質であることが好ましい。また、液滴２移動の際の移動抵抗を下げるために、撥水性の材質を用いることが好ましい。そのような材料としては、例えば、ポリプロピレン、ポリテトラフロロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの樹脂素材を好適に用いることができる。液滴の吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率の変化などの測定において光学的な検出を行うために、液滴搬送装置１０が、光透過性を有する材質で形成されていることが好ましい。
【００２２】
液滴２中に配置される磁気粒子２ａとしては、表面に生体由来高分子と特異的に結合する化学構造、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ、錯体化した金属イオン、或いは抗体を有した、若しくは静電気力、ファンデルワールス力により高分子と特異的に結合する様態を呈した表面を持つ磁気に応答する粒子を使用することができる。
【００２３】
例えば、磁気粒子２ａは、マグネタイト、γ−酸化鉄、マンガン亜鉛フェライト等の磁性体から形成され、表面に水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などの親水性基を持つ粒子を使用することができる。具体的には、磁性体およびシリカの混合物からなる磁気粒子、シリカで表面を覆われた磁性体粒子、メルカプト基を介して親水性基を有する金で表面が覆われた磁性体粒子、磁性体を含有し表面にメルカプト基を介して親水性基を持つ金粒子などが好適に用いられる。これらの機能性表面を持った磁気粒子２ａは、特定成分を選択的に表面へ吸着できる。磁気粒子２ａの大きさとしては、０．１μｍ〜５００μｍ程度の平均粒径を持つことが好ましい。
【００２４】
磁気粒子２ａは、液滴２内に取り込まれ、液滴２と一体化することが可能である。磁気粒子２ａと一体化した液滴２は、磁場手段３の移動により、液滴状態を保ちながら磁場の移動方向へ移動することが可能である。ここで、本発明における「液滴」とは、液滴を構成する液体の分子間力によって発生する表面張力により球形、或いはそれに近い形状を持った溶液塊を指す。
【００２５】
液滴２を構成する水溶液としては、例えば、水やその他、種々の水溶液が用いられる。空気等の気相下において撥水性基板の表面上において液滴２の移動を行う場合は、エタノール等のアルコール類を含む水溶液も用いることも可能であるが、その場合は、直径が５ｍｍ程度の液滴２が形成できる程度の表面張力を有する水溶液を用いるのが好ましい。具体的には、エタノール水溶液を用いる場合は、１（ｖ／ｖ）〜５０（ｖ／ｖ）％の濃度範囲内が好ましい。
【００２６】
液滴２を構成する水溶液は、界面活性剤を含有することが好ましい。界面活性剤としては非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（トゥウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ−１００）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、液滴内で生化学反応を行う際、反応を阻害しない点で好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、N-ラウリルサルコシンが挙げられる。界面活性剤を含有することにより、磁気粒子の含有の有無に関わらず液滴の液滴搬送装置の搬送面への吸着が強くなる現象が観察され、搬送面１０ａ上の一定位置への固定が容易に実現でき、液滴２の操作精度を向上させることができる。界面活性剤の添加は、後述する磁気粒子の含有する液滴からの磁気粒子の分離操作における、母液滴の固定安定性にも寄与する。なお、界面活性剤は、０．００１（ｖ／ｖ）〜１（ｖ／ｖ）％程度、液滴２中に添加することが好ましい。
【００２７】
図１の液滴搬送装置１０内には、液滴と混じり合わず化学的に不活性な液体が封入されている。「化学的に不活性な液体」とは、液体の分取、混合、希釈、撹拌、加熱、冷却などの種々の化学反応を阻害しない物質を指し、例えば、アルカン等の炭化水素類、パーフルオロアルカン類、アルカンの水素原子の一部がフッ素である化学物質、ミネラルオイル、シリコーンオイル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸アミド、脂肪酸ケトン、脂肪酸アミン類などの疎水性の液体物質があげられる。これらの物質の中でも、比重が１より小さい物質を「化学的に不活性な液体」として用いることが好ましい。比重が１より小さい物質を用いることにより、液滴２が液滴封入媒体中に沈むため、磁場手段３による液滴２の操作性が向上する。
【００２８】
耐熱性酵素を用いた反応等の比較的高温条件下で行われる生化学反応に対しては、揮発性の低い物質、具体的には沸点が２００℃以下のミネラルオイル、シリコーンオイル、脂肪酸エステル、油脂などを用いることにより、液滴封入媒体及び液滴の揮発を防ぐことができる。
【００２９】
電場手段２０は、搬送面１０ａの下方に沿って配置され互いに異なる極性を有する第１及び第２の電極４ａ、４ｂと、第１及び第２の電極４ａ、４ｂと絶縁され第１及び第２の電極４ａ、４ｂに関し搬送面１０ａとは反対側に搬送面１０ａに沿って配置された導電性薄板５とを含む。
【００３０】
第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂとしては、図１に示すように、例えば縦３０ｍｍ、横幅３ｍｍ、厚さ４０μｍのアルミニウム製の帯状の電極を用いることができる。図１の第１の電極４ａと第２の電極４ｂは２ｍｍ間隔で平行に離間しており、それぞれ電源７に接続されている。例えば、液滴２を図１の紙面左側から右側へ移動させる場合は、第１の電極４ａを負極（グランド）に接続し、第２の電極４ｂを正極に接続する。そして、電源７から第１の電極４ａと第２の電極４ｂ間に電場（電界）を印加することにより、電極４の上方の搬送面１０ａ上に液滴２を固定させる。
【００３１】
電場（電界）の強度は、磁場を印加させた場合に、電極４上に液滴２を固定することができる程度に十分に高いことが好ましい。ただし、電場の強度は、高くしすぎると絶縁が不十分で漏電が起こり、液滴２の固定が困難になる。逆に、電場の強度を低くしすぎると、電場手段２０による液滴２の固定が困難になる。よって、第１の電極４ａと第２の電極４ｂとの間に印加する電圧の大きさとしては０．５〜１０ｋＶ、更には１．０〜８ｋＶ、更には１．５〜５ｋＶを、搬送面１０ａの上方に印加することが好ましい。
【００３２】
導電性薄板５としては、例えば縦幅３０ｍｍ、横幅２５ｍｍの平板状のアルミニウム箔を用いることができる。図２（ｃ）に示すように、導電性薄板５は、絶縁体６を介して第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂの約０．２ｍｍ下方に配置されている。絶縁体６としては、例えば、厚さ０．２ｍｍの塩化ビニル膜を用いることができる。第１の電極４ａを接地して導電性薄板５を接地しないようにすることで、導電性薄板５を接地する場合に比べて液滴２の電極４上への固定をより確実にすることができ、液滴の操作精度を向上させることができる。
【００３３】
磁場手段３としては、永久磁石又は電磁石アレイ等を用いることができる。磁場手段３の移動は手動で制御してもよいし、図１に示さない制御手段により電気的に制御しても構わない。磁場手段３が電磁石アレイの場合、磁場手段の移動は、アレイ状の電磁石に順に電圧を印加することにより達成することができる。
【００３４】
図１に示す液滴操作装置によれば、電場手段２０が発生させる電場により、搬送面１０ａの電極４ａ上方に液滴２を固定させた状態で、磁場手段３により磁場を発生させながら、搬送面１０ａ上に沿って紙面左側から紙面右側に向かって磁場手段３を移動させることにより磁気粒子２ａを牽引する。この際、液滴２の水溶液成分は、負極である第１の電極４ａに固定されたまま、磁気粒子２ａと磁気粒子２ａに付着した微量の液体のみが、磁場手段３の移動により分離されるため、物理的な流体制御機構を設けることなく、液滴２から磁気粒子２ａを分離でき、装置の簡素化が図れる。
【００３５】
また、電場と磁場の引力を利用して液滴２中の磁気粒子を分離することで、ゲート等の流体制御機構により物理的に分離する場合に比べて余分な液体を多量に抽出することがない。よって、目的とする特定成分を吸着させた磁気粒子を効率よく抽出できる。
【００３６】
更に、電場手段２０は、操作者の都合に応じて位置や数を自由に変更可能であるので、種々の化学反応に対応させることができ、装置の自由度も高い。例えば、電場手段２０を搬送面１０ａの下方に複数個配置することにより、１つの液滴搬送装置１０内で、複数の化学反応を起こすことができるため、コンビナトリアルケミストリ用ラブ・オン・チップ（lab on chip）デバイス等に応用できる。
【００３７】
更に、磁場手段３及び電場手段２０は、液滴搬送装置１０の外部に配置されるため、液滴搬送装置１０として完全閉鎖系の反応容器を用いることにより、クロスコンタミネーション対策を大きな課題とする遺伝子増幅法を利用した臨床検査利用等に応用できる。
【００３８】
次に、図２（ａ）〜図２（ｄ）を用いて、図１に示す液滴操作装置を用いた液滴操作方法を説明する。以下に述べる液滴操作方法は一例であり、これ以外の種々の液滴操作方法により実現可能であることは勿論である。
【００３９】
まず、図２（ａ）に示す液滴２の元となる磁気粒子懸濁液を用意した。磁気粒子の材料としては、東洋紡から販売されているＭＦＸ−９６００−Ｍａｇｎｉａ−自動核酸抽出装置の専用試薬キットにある磁性シリカビーズを使用した。磁性シリカビーズを１０倍量の純水で懸濁させた後、５００×ｇ、１分間の遠心操作により洗浄し、洗浄を２回繰り返した。その後、得られた液体を元の容量に戻した。液滴２中の粒子濃度は、洗浄後の懸濁液をさらに１０倍希釈となるように、液滴２の一部となる液体に予め添加し、懸濁させ、これを磁気粒子懸濁液とした。このように調整した磁気粒子懸濁液中の磁気粒子の濃度は、３０μｇ／μｌである。
【００４０】
図２（ａ）に示すように、厚さ０．８ｍｍの撥水性の底板の表面（上面）を搬送面１０ａとするポリプロピレン製の液滴搬送装置１０内にシリコーンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）を入れ、シリコーンオイル中に、磁気粒子２ａが３０μｇ／μｌの濃度で分散した純水１０μｌを封入して、搬送面１０ａ上に直径２．５ｍｍの液滴２を配置した。
【００４１】
次に、表面が平坦な搬送面１０ａの下方に磁場手段３を近づけ、搬送面１０ａに沿って水平方向に移動させる。磁場手段３としては、例えばネオジム製永久磁石を用いることができる。磁場手段３の移動により、図２（ｂ）に示すように、液滴２内の磁気粒子２ａが紙面右側に集まり、液滴２全体を右側へ動かそうとする力が働く。このとき、撥水性の搬送面１０ａでは液滴２と搬送面１０ａ間の抵抗が少ないため、磁気粒子２ａが液滴２から飛び出すことなく、結果として液滴２全体が移動する。
【００４２】
液滴２を磁場手段３によりさらに移動させていき、図２（ｃ）に示すように、例えば、８ｋＶの電圧を第１の電極４ａと第２の電極４ｂとの間に印加して、第１の電極４ａと第２の電極４ｂ上を通過させる。電圧印加により、液滴２を構成する水には負電極（第１の電極４ａ）への固定力が生じる。磁場手段３をそのまま紙面右方向に移動させると、図２（ｃ）に示すように、磁気粒子２ａが液滴２の右側に集中する。更に磁場手段３を右側へ移動させると、図２（ｄ）に示すように、液滴２から磁気粒子２ａが分離されて、その結果、液滴２が母液滴１２と小液滴１１とに分離される。磁気粒子２ａは、小液滴１１内に捕集される。
【００４３】
図２（ａ）〜図２（ｄ）に示す液滴操作方法によれば、搬送面１０ａに電場及び磁場を発生させることにより、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で高精度に液滴２を操作できる。
【００４４】
（第２の実施の形態）
第２の実施の形態に係る液滴操作装置は、図３に示すように、液滴搬送装置１０の搬送面１０ａに近接配置された平板状（円盤状）の第１の電極４ａと、第１の電極４ａと互いに異なる極性であって第１の電極４ａと対向し、第１の電極よりも外周が大きい枠状（リング状）の第２の電極４ｂと、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂと絶縁され、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂに関し、搬送面１０ａとは反対側に、搬送面に沿って配置された平板状（円盤状）の導電性薄板５とを電場手段２０として含む点が、図１に示す液滴操作装置と異なる。
【００４５】
第１の電極４ａとしては、例えば直径５ｍｍ、厚さ４０μｍのアルミニウム製電極を用いることができる。第１の電極４ａは、電源７の負極（グランド）側に接続されている。第２の電極４ｂとしては、例えば直径９ｍｍ、中空部分の直径５ｍｍ、厚さ４０μｍのアルミニウム製電極を用いることができる。第２の電極４ｂは、電源７の正極側に接続されている。
【００４６】
第１の電極４ａを取り巻くリング状の第２の電極４ｂの中空構造は、液滴２の搬送面１０ａへの吸着の安定化に寄与する。図示を省略しているが、第１の電極４ａ、第２の電極４ｂ、導電性薄板５は、それぞれ厚さ０．５ｍｍの塩化ビニル膜で絶縁してある。
【００４７】
導電性薄板５は、厚さ４０μｍ、直径９ｍｍの円盤状アルミニウム箔であり、０．５ｍｍ塩化ビニル膜を介して第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂから絶縁されている。導電性薄板５は、接地せずに、第２の電極４ｂと重なる様に配置されている。
【００４８】
なお、第１の電極４ａの平面形状は、楕円形、三角形、矩形、多角形等の種々の形状が採用できる。第２の電極４ｂの形状も、中心部に中空部分を有する枠形状であればよく、例えば、楕円形、三角形、矩形、多角形等の形状を有していてもよい。他は、図１に示す液滴操作装置と実質的に同様であるので記載を省略する。
【００４９】
図３に示す電場手段２０を用いた液滴操作装置によれば、電場を発生させて液滴２を平板状の第１の電極４ａ上方の搬送面１０ａ上に固定させながら、磁場を発生させて磁気粒子２ａを搬送面１０上に水平方向に牽引することにより、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で高精度に液滴を操作することができる。
【００５０】
また、図３に示すように、平板又は枠形状の第１の電極４ａ、第２の電極４ｂを用いることにより、図１に示すような帯状の第１の電極４ａ，４ｂを用いた場合に生じ得る、電極の延伸（帯）方向への液滴２の移動を抑制できるため、液滴２の制御効率をより向上させることもできる。
【００５１】
次に、図４（ａ）〜図４（ｄ）を用いて、図３に示す電場手段２０を用いた液滴操作方法を説明する。なお、以下に述べる液滴操作方法は一例であり、これ以外の種々の液滴操作方法により実現可能であることは勿論である。
【００５２】
まず、撥水性の底板（厚さ０．８ｍｍ）を搬送面１０ａとするポリプロピレン製の液滴搬送装置１０内にシリコーンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）を入れる。搬送面１０ａ上へは第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂを介して電場（電界）を発生させておく。
【００５３】
電場印加後、０．０１（ｖ／ｖ）％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む磁気粒子濃度３０μｇ／μｌの磁気粒子懸濁液を、マイクロピペットにより、第１の電極４ａ直上の搬送面１０ａに滴下することにより、シリコーンオイル中に、図４（ａ）に示す液滴２を形成した。液滴２から抽出される磁気粒子を洗浄するための洗浄用液滴８も搬送面１０ａ上に配置した。
【００５４】
電場を発生させた状態で、搬送面１０ａの下方から磁場手段３（図示せず）を近づけ、搬送面１０ａに沿って紙面左側から右側方向へ磁場手段３を秒速２ｍｍで移動させる。磁場手段３の移動により、図４（ｂ）に示すように、液滴２内の磁気粒子２ａが右側に集まり、液滴２全体を右側へ動かそうとする力が働く。
【００５５】
電場を発生させた状態で、磁場手段３を用いて液滴２をさらに紙面右方向へ移動させ、図４（ｃ）に示すように、液滴２を小液滴１１と母液滴１２とに分離させる。小液滴１１は、磁気粒子２ａと若干の液滴２の溶媒（水）を伴っていた。更に、磁場手段３を紙面右方向に移動させて、図４（ｄ）に示すように、小液滴１１と洗浄液滴８とを合体させることにより、磁気粒子２ａを含む混合液滴１８を形成した。
【００５６】
図４（ａ）〜図４（ｄ）に示す液滴操作方法によれば、搬送面１０ａに電場及び磁場を発生させて液滴２の移動を操作することにより、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で高精度に液滴中の磁気粒子を分離できる。なお、図４（ａ）〜図４（ｄ）に示す操作は、上述した液滴の分離の他にも、液滴の分取、希釈あるいは磁気粒子表面に吸着した特定成分の抽出等、種々の化学反応に利用できることは勿論である。
【００５７】
（第３の実施の形態）
第３の実施の形態に係る液滴操作装置は、図５（ａ）〜図５（ｅ）に示すように、液滴搬送装置１０の搬送面１０ａに沿って複数個、それぞれ離間して配置された電場手段２０を有する点が、第１及び第２の実施の形態に係る液滴操作装置と異なる。
【００５８】
搬送面１０ａの下面側には、第１の電極４ａと、第１の電極４ａと異なる極性を有し、第１の電極４ａと向き合って離間する第２の電極４ｂと、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂと絶縁され、搬送面１０ａに対向する導電性薄板５とを含む電場手段２０が配置されている。第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂの周囲には、絶縁体６が形成されている。絶縁体６を介して第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂから絶縁される導電性薄板５は、１枚のアルミニウム箔等で形成され、搬送面１０ａに沿って並んで配置された３つの電極４をそれぞれ覆うように配置されている。
【００５９】
例えば図５（ａ）に示すように、搬送面１０ａに沿って３つ並んで配置された第１の電極４ａのそれぞれは、電極の中心部からそれぞれ互いに約１３ｍｍ離間するように配置されている。他は、第１及び第２の実施の形態に係る液滴操作装置と実質的に同様であるので重複した記載を省略する。
【００６０】
図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作装置によれば、搬送面１０ａに沿って電場手段２０を複数並べて配置することにより、１つの搬送面１０ａで複数の化学反応を進行させることができるため、化学反応回路のデザインにおいて柔軟性の高いシステムを構築できる。
【００６１】
次に、図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作装置を用いた液滴操作方法を説明する。以下に述べる液滴操作方法は一例であり、これ以外の種々の液滴操作方法により実現可能であることは勿論である。
【００６２】
まず、撥水性の底板（厚さ０．８ｍｍ）を搬送面１０ａとするポリプロピレン製の液滴搬送装置１０内にシリコーンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）を入れた。次に、図５（ａ）に示すように、３つの第１の電極４ａ直上の搬送面１０ａ上に、それぞれ液滴２、洗浄液滴８、９を滴下した。図中左側の第１の電極４ａ上には、例えば、キシレンシアノール０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液及び磁気粒子２ａの濃度が３０μｇ／μｌの混合液からなる液滴２を滴下した。図５（ａ）中の中央側及び右側の第１の電極４ａ上には、それぞれ０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液からなる液滴（洗浄液滴）８、９を滴下した。液滴２、８、９の滴下量は、それぞれ１０μｌとした。液滴２、８、９を滴下する要領は、第２の実施の形態と同様とした。また、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂへの印加電圧はすべて８ｋＶとした。
【００６３】
電場手段２０によりそれぞれ搬送面１０ａへ向けて電場（電界）を印加した状態で、搬送面１０ａの下方から磁場手段３を近づけ、図５（ｂ）に示すように、搬送面１０ａに沿って紙面左方向から右方向へ秒速約２ｍｍで磁場手段３を動かすことにより、電場印加による液滴２の第１の電極４ａ上への固定力と液滴２の表面張力よりも大きな力を磁場手段３が磁気粒子２ａに搬送面水平方向に与え、磁気粒子２ａを含む液滴２を、母液滴１２と磁気粒子２ａを含む小液滴１１とに分離させた。更に、磁場手段３を紙面右方向に移動させて小液滴１１と洗浄用液滴８とを合体させ、図５（ｃ）に示すような磁気粒子２ａを含む混合液滴１８を形成した。
【００６４】
電場手段２０によりそれぞれ搬送面１０ａへ向けて電場を印加した状態で、図５（ｄ）に示すように、搬送面１０ａに沿って更に紙面右方向へ秒速約２ｍｍで磁場手段３を動かし、磁気粒子２ａを含む混合液滴１８を、母液滴１４と磁気粒子２ａを含む小液滴１３とに分離させた。更に、磁場手段３により小液滴１３を紙面右方向に移動させて洗浄液滴９と合体させ、図５（ｅ）に示すような混合液滴１９を形成して、磁気粒子２ａを洗浄する。
【００６５】
図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作方法によれば、物理的な流体制御機構を設けることなく、１つの搬送面１０ａで、液滴２中の磁気粒子２ａを高精度に分離、洗浄することができる。
【００６６】
−液滴搬送装置を利用した液体の搬送方法−
磁場手段３の移動速度を変えることによって、母液滴から磁気粒子を分離する際に、磁気粒子２ａに追従する液体の容量を調整することが可能である。この方法を利用して、複数の液滴間で液体の搬送が可能である。
【００６７】
図６（ａ）〜図６（ｄ）は、図示しない電場手段により搬送面上に固定された液滴３０に磁気粒子（鉄粉、粒径４５μｍ）を加え、搬送面の下側から磁場手段３を紙面右側から左側方向へ移動させることにより、液滴３０中の磁気粒子（磁気粒子集合体）３１を牽引し、液滴３０から小液滴を分離させる場合を示す。なお、図６（ａ）及び図６（ｂ）は、磁場手段３を毎秒１ｍｍで搬送面に沿って移動させる例を示し、図６（ｃ）及び図６（ｄ）は、磁場手段３を毎秒２００ｍｍで搬送面に沿って移動させる例を示す。
【００６８】
図６（ｂ）及び図６（ｄ）に示すように、磁気粒子３１に付着する液体の画分量は、磁場手段３の移動速度をより遅くした方が多くなる。これは、図６（ｃ）に示すように、磁性粒子３１を含んだ液滴３０を高速で移動させると液滴の形状が流線型となり、尾部の液が磁性粒子２ａに追従できなくなるため、磁気粒子３１の周囲に付着する液滴の液量が減少するものと考えられる。また、磁場手段３を高速で移動させると磁気粒子２ａの磁力線方向が垂直方向から斜め方向に傾くため、磁気粒子２ａの液体保持力が落ちるためとも考えられる。
【００６９】
図６（ａ）〜図６（ｄ）に示す現象を、複数の電場手段２００ａ、２００ｂ間における液体の送液に利用した例を図７（ａ）〜図７（ｇ）に示す。図７（ａ）〜図７（ｇ）においては、搬送面の下方に、絶縁体６６ａにより互いに絶縁された第１の電極４４ａ及び第２の電極４４ｂを含む電場手段２００ａと、絶縁体６６ｂにより互いに絶縁された第１の電極４５ａ及び第２の電極４５ｂを含む電場手段２００ｂとが配置されている。なお、図７は、操作手順の途中を図示するものであり、液滴４０は操作開始時においては存在しない。
【００７０】
図７（ａ）に示すように、第１の電極４４ａ、４５ａ及び第２の電極４４ｂ、４６ｂに電圧を印加して、液滴３０、４０を搬送面上に固定した状態において、磁場手段３を液滴３０の下方から搬送面に沿って、紙面左側から右側方向にゆっくり移動させる。なお、電場手段２００ａ、２００ｂによる液滴の固定方法に関しては、第１から第３の実施の形態において説明した通りである。
【００７１】
その結果、図７（ｂ）に示すように、磁気粒子３１の周囲に液滴３０の一部を付着させた状態で、液滴３０から磁気粒子３１が抽出される。磁場手段３をそのまま紙面左側から右方向に移動させることにより、図７（ｃ）に示すように、液滴３０の一部を伴う磁気粒子３１を液滴４０と合体させる。
【００７２】
図７（ｄ）に示すように、今度は、液滴４０を搬送面上に固定した状態において、搬送面の下側から磁場手段を図７（ａ）で移動させた速度よりも速い速度で、図７（ａ）の移動方向とは逆向き、即ち、紙面右側から左側方向へ移動させる。磁場手段を図７（ａ）での移動速度よりも速い速度で移動させることにより、図７（ｅ）に示すように、図７（ｂ）に示す液量より少量の液体を磁気粒子３１の周囲に付着させた状態で、磁気粒子３１が液滴４０から分離される。その後、磁場手段をそのまま紙面右側から左側方向へ移動させて、図７（ｆ）に示すように、磁気粒子集合体３１を液滴３０と合体させる。
【００７３】
図７（ａ）〜図７（ｆ）に示す作業を何度も繰り返すことにより、図７（ｇ）に示すように、液滴３０中の液体が徐々に液滴４０に取り込まれていき、その結果、電場手段２００ａから２００ｂへの送液を実現することができる。なお、図７（ａ）〜図７（ｆ）に示す作業を繰り返して磁気粒子３１を液滴３０、４０間で往復させる回数を多くするほど、磁気粒子３１が運搬する全送液量が増加する。
【００７４】
微小液滴を用いたマイクロフルイディクスでは、親水性表面を持った磁気粒子に周囲に水または水溶液を付着させ、磁気粒子を磁力で操作することにより、液滴の送液操作することが知られている。その際、磁気粒子の量に応じて小液滴中の磁気粒子を取り巻く液量が増加するため、任意の容量の液を送液したい場合は、磁気粒子の量を調整することにより制御している。送液量の制御範囲は、磁気粒子の種類にもよるが、およそ０．０１〜４μｌ程度である。
【００７５】
しかし、ある地点の液滴から他の地点の液滴に送液する場合、１回の小液滴の分離及び液滴同士の合体では送液量が限られるため、多数に分けた磁気粒子を何度も母液滴に付加及び分離させ、目的の液滴とを合体させる必要がある。この作業を何度も繰り返すことにより、目的とする液滴には磁気粒子が蓄積するため、磁気粒子が蓄積した液滴から磁気粒子を除去することが困難となり、以降の化学反応操作において障害となる場合がある。
【００７６】
これに対し、本発明の実施の形態に係る液滴の送液方法によれば、図７（ａ）〜図７（ｇ）に示すように、一方の電場手段から他方の電場手段へ磁気粒子を移動させる場合の磁場手段３の移動速度と、他方の電場手段から一方の電場手段へ磁気粒子を移動させる場合の磁場手段３の移動速度とをそれぞれ異なる速度に制御する。即ち、磁場手段３の移動速度は、往路（液体を排出する方の電場手段から液体を蓄える方の電場手段への移動）の移動速度に対して逆に、復路（液体を蓄える方の電場手段から液体を排出する方の電場手段への移動）の移動速度を速くすることで、磁気粒子の周囲に付着する液滴の量に偏りを生じさせる。液滴の量に偏りを生じさせた状態で、磁気粒子を複数の液滴間で往復移動させることにより、任意量の送液が可能となる。
【００７７】
本実施形態において、磁場手段の移動速度は、往路の移動速度に対して復路の移動速度が、１０倍〜２００倍とすることが好ましい。より好ましくは、往路の移動速度に対して復路の移動速度が、５０倍〜１００倍とすることが好ましい。具体的には、往路を０．１〜１０ｍｍ／ｓｅｃ、より好ましくは０．５〜５ｍｍ／ｓｅｃとし、復路を５０〜３００ｍｍ／ｓｅｃとするのが好ましい。より好ましくは、往路が１〜３ｍｍ／ｓｅｃ、復路が１５０〜２００ｍｍ／ｓｅｃである。
【００７８】
図６及び図７に示す送液方法を利用した液滴操作装置の例を図８に示す。直方体状の液滴搬送装置１０の搬送面１０ａ上には、厚さ０．０５ｍｍのフィルム２１が配置されている。フィルム２１としては、例えばテフロン（登録商標）フィルムを用いることができる。
【００７９】
搬送面１０ａの下には、円盤（平板）形状を有する２つの第１の電極４ａが、搬送面１０ａに水平方向にそれぞれ離間して配置されている。第１の電極４ａの下には、第１の電極４ａと異なる極性を有するリング（枠）形状を有する第２の電極４ｂが配置されている。第２の電極４ｂの下には、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂと絶縁された円盤（平板）状の導電性薄板５が配置されている。第１の電極４ａの電極は電源７の負極（グランド）側に接続され、第２の電極は、電源７の正極側に接続されている。
【００８０】
図８では図示を省略しているが、図９に示すように、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂの周囲は塩化ビニル等の絶縁体６で覆われている。導電性薄板５は、厚さ４５μｍの１枚のアルミニウム箔等で形成されている。なお、図９の例において、導電性薄板５の直径ｌ４は、９．５ｍｍ、第２の電極４ｂの外径ｌ２が９．０ｍｍ、第２の電極４ｂのリング幅ｌ３が１．２ｍｍ、第１の電極４ａの直径ｌ１が５．５ｍｍである。また、フィルム２１の厚さｔ１は０．０５ｍｍ、液滴操作装置１０の底面の厚さｔ２は０．３ｍｍ、液滴操作装置１０の底面の厚さ方向における第１の電極４ａと第２の電極間距離ｔ３は０．３６ｍｍ、液滴操作装置１０の底面の厚さ方向における第２の電極４ｂと導電性薄板５との距離ｔ４は０．１８ｍｍとした。図８及び図９においては図示を省略しているが、図８及び図９に示す液滴操作装置１０を用いて液体を送液する場合は、導電性薄膜５の下から搬送面１０ａに沿って磁石等の磁場手段３を移動させることにより行う。
【００８１】
図１０のグラフは、図８及び図９に示す液滴操作装置１０を用いて２つの第１の電極４ａ間で磁場手段３を制御し、磁気粒子（粒径４５μｍの鉄粉）を磁場手段３の移動速度をもって往復移動させた場合の往復移動１回当たりの送液量を示したものである。磁場手段３の移動速度は往路を毎秒１ｍｍとし、復路をそれぞれ毎秒５０ｍｍ、毎秒１００ｍｍ、毎秒２００ｍｍとして測定した。図１０のグラフ横軸は磁気粒子量、グラフ縦軸は往復移動１回当たりの磁気粒子が搬送する液体容量を示す。実験では、シリコ−ンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）中に５０μｌの純水からなる液滴を、片方の第１の電極４ａ上に配置し、２つの第１の電極４ａ各々に直流電圧（８ｋＶ）を印加することで液滴を搬送面上に固定させ、搬送面の下方から搬送面に水平方向に磁石を操作して、搬送面上で磁気粒子の移動を制御した結果を示す。磁気粒子を２つの液滴間で１０往復させ、１回当たりの平均送液量を算出し、グラフにプロットした。図１０の結果に示すように復路の速度が早く磁気粒子量が多いほど、送液量が増加することが分かる。
【００８２】
図１１のグラフは、往路の移動速度を毎秒１ｍｍ、復路の移動速度を毎秒５０ｍｍ及び毎秒２００ｍｍとし、粒径がそれぞれ異なる２種類の磁気粒子を用いて送液量を測ったグラフである。実験条件は、磁気粒子の粒径の違い以外は、図１０と同じとした。磁気粒子としては、粒径４５μｍと粒径１５０μｍの鉄粉を用いた。図１１に示すように、磁気粒子の粒子径を大きくするほど送液量が増える傾向にある。また、数十ｎＬ〜１００ｎＬの液体の送液の場合、磁気粒子量を５０μｇ／５０μＬから１００μｇ／５０μＬとすることで達成することができる。遺伝子増幅反応を代表とする生化学反応を目的とした場合、ｎＬオーダーの液体の搬送は非常に有効である。
【００８３】
本発明の実施の形態に係る液体の搬送方法によれば、図８及び図９に示す液滴操作装置１０において、磁性粒子の移動速度、移動回数、粒子径、粒子量を制御することで、一定量の液体の送液が可能になる。
【００８４】
−核酸の単離方法−
上述の第３の実施の形態に係る液滴操作方法を、シリカ粒子とカオトロピック塩を用いた核酸の単離方法（特開平２−２８９５９６）に適用し、単離した遺伝子を鋳型核酸として核酸増幅反応の代表例であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施した例を以下に説明する。なお、本発明の実施の形態に係る核酸の単離方法においては、図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作装置を用いた場合を例に説明する。核酸を含有する生体試料として、口腔スワブを用意した。
【００８５】
図５（ａ）の各液滴の構成は次の通りである。紙面左側の液滴２を、生体試料と細胞溶解液からなる液滴として、６Mグアニジンチオシアネート水溶液２μｌと口腔スワブ２μｌとの混合液とした。液滴２中の磁気粒子２ａとして、磁性シリカ粒子を１μｇ／μｌの濃度となるように添加した。紙面中央の液滴８を磁性シリカ粒子の洗浄液として、２００ｍＭ塩化カリウム及び５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０水溶液５０μｌを用意した。紙面右側の液滴９は、ＰＣＲ反応液３μｌとした。ＰＣＲ反応液の組成は後述する。磁場手段３の移動速度は２ｍｍ／秒とした。
【００８６】
まず、図５（ａ）に示すように、液滴２内で口腔スワブに含まれる口腔粘膜細胞を溶解させ、混合液滴中に遊離した核酸を磁気粒子２ａの表面に吸着させた。磁場手段３を搬送面１０ａに沿って移動させることで、図５（ｂ）に示すように、核酸を表面に吸着した磁気粒子２ａと少量のグアニジンチオシアネート水溶液を伴う小液滴１１を母液滴１２から分離させた。グアニジンチオシアネートは、後述する本工程に接続される遺伝子増幅反応を阻害するため、磁場手段３を紙面右方向へ更に移動させることにより、洗浄液から成る洗浄液滴８を通過させ、図５（ｃ）に示すように、混合液滴１８を形成した。
【００８７】
磁場手段３を紙面右方向へさらに移動させ、図５（ｄ）に示すように、混合液滴１８から小液滴１３を分離させた。磁気粒子２ａは、表面に核酸を吸着させながら少量の洗浄液を伴っていた。分離された小液滴１３は、塩化カリウムとトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を伴っているが、それら成分は酵素反応を大きく阻害することはない。磁場手段３を紙面右方向へ更に移動させることにより、分離された小液滴１３を、図５（ｅ）に示すように、ＰＣＲ反応液からなる液滴９と混合させ、混合液滴１９を形成した。
【００８８】
なお、液滴９を構成するPCR反応液としては、20mM Tris-HCl（pH9.5）, 8mM MgCl2, 各200μMのdATP, dCTP, dGTP及びdTTP, 0.2(wt/v)%BSA,各0.4μMのprimer, 2.5units/50μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Japan）を含むＰＣＲ反応液を用意した。鋳型遺伝子をβアクチン遺伝子とし、プライマーとしては、配列番号１の塩基配列からなる第１のβアクチン検出用プライマー及び配列番号２の塩基配列からなる第２のβアクチン検出用プライマーを用意した。
【００８９】
混合液滴１９を９４℃から６０℃の直線的に温度勾配がかかった搬送面に沿って磁石で往復移動させ、液滴の温度が、９４℃２秒、６０℃１秒及び７２℃５秒からなる温度サイクルを４０サイクル繰り返すように液滴の位置を制御してＰＣＲを行った。ＰＣＲ終了後、反応産物についてアガロースゲル電気泳動を行うことにより、βアクチン遺伝子からの増幅産物（１５１塩基）が確認できた（図１２参照）。ここで、図１２において、左のレーンが分子量マーカー、右のレーンが反応産物についてのアガロースゲル電気泳動像である。
【００９０】
本発明の実施の形態に係る核酸の単離方法によれば、磁気粒子２ａによる試料のサンプリングから核酸抽出精製そして遺伝子増幅反応を、同一容器内で行うことができた。
【００９１】
本発明の実施の形態に係る核酸の単離方法において、核酸を単離する生体試料としては、動植物組織、体液、排泄物等をいい、体液には全血、血漿、血清などの血液由来試料、唾液などが含まれる。細胞溶解液としては、グアニジン塩、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、及び尿素の各水溶液のいずれか又はその組み合わせを用いることができる。
【００９２】
上記のように、本発明は本発明の実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものであり、実施段階においては、その要旨を逸脱しない範囲で変形して具体化できる。
【００９３】
（配列表の説明）
本明細書の配列表に記載された配列番号１及び２は以下の配列を示す。
【００９４】
［配列番号 :１］第１のβアクチン検出用プライマーの塩基配列。
【００９５】
［配列番号 :２］第２のβアクチン検出用プライマーの塩基配列。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る液滴操作装置の一例を示す斜視図である。
【図２】図２（ａ）〜図２（ｄ）は、本発明の第１の実施の形態に係る液滴操作方法の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の第２の実施の形態に係る液滴操作装置の一例を示す斜視図である。
【図４】図４（ａ）〜図４（ｄ）は、本発明の第２の実施の形態に係る液滴操作方法の一例を示す概略図である。
【図５】図５（ａ）〜図５（ｅ）は、本発明の第３の実施の形態に係る液滴操作装置の一例を示す概略図である。
【図６】図６（ａ）〜図６（ｄ）は、本発明の実施の形態に係る液滴の搬送方法の原理を示す概略図である。
【図７】図７（ａ）〜図７（ｇ）は搬送面上に固定された２つの液滴間で磁気粒子を往復させ、所定量の液体を送液する方法の一例を表す概略図である。
【図８】本発明の実施の形態に係る液滴の搬送方法に好適な液滴操作装置の一例を示す概略図である。
【図９】図８のＡ−Ａ方向からみた断面図である。
【図１０】図８及び図９に示す液滴操作を用いて電極上に固定した２つの液滴間に磁気粒子を往復させた場合における往復移動１回当たりの送液量と磁気粒子量との関係を示すグラフである。
【図１１】図８及び図９に示す液滴操作を用いて電極上に固定した２つの液滴間で磁気粒子を往復させ、復路の速度と粒子径を変化させた場合の総液量と磁気粒子量との関係を示すグラフである。
【図１２】第３の実施の形態に係る液滴操作装置を用いた核酸の単離方法により得られた液滴について、ＰＣＲを行い、その反応産物についてのアガロースゲル電気泳動像である。
【符号の説明】
【００９７】
２…液滴
２ａ…磁気粒子
３…磁場手段
４ａ…第１の電極
４ｂ…第２の電極
５…導電性薄板
６…絶縁体
７…電源
８…液滴
９…液滴
１０…液滴搬送装置
１０ａ…搬送面
１８…混合液滴
１９…混合液滴
２０…電場手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴操作装置および液滴操作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気粒子を用いた化学操作、特に生化学反応システムでの分離、抽出、精製工程においては、使用するデバイスの微小化および反応の効率的な制御を行うことにより、様々な産業分野で利用可能なマイクロ化学反応システムにおける各種操作を電気的に行うことができる。
【０００３】
磁気粒子を含む微量の水又は水性液体は、水と混ざらないオイル等の液体媒体中に置いた場合、液滴の形態をとる。例えば、表面が親水性で粒径が約０．１μｍから５００μｍの磁性シリカ粒子を用いた場合、磁性シリカ粒子は、移動磁場中に於いて磁場が移動する方向へ液滴を牽引する。この現象は、マイクロ化学反応システムにおいては液体試薬の送液等に利用されている（例えば、特許文献１、２、３参照）。
【０００４】
磁気粒子の表面が特定成分を吸着する等の機能を有しており、その機能を利用して成分の分離精製を行う場合は、目的とする成分を吸着した磁気粒子を液滴から分離させる必要がある。更に、分離した磁気粒子から不純物を除くために、洗浄液から成る別の液滴に磁気粒子を通す必要もある。
【０００５】
シキダ（Shikida）らは、機能性表面を持った磁気粒子を用い、液滴ベースでの特定成分の分離、抽出を磁力を用いて行う方法を開示している。シキダらは、オイル中の母液滴から磁気粒子を分離させるために、ガラスゲート等の物理的な液滴制御機構を用いている（例えば、非特許文献１参照）。
【特許文献１】国際公開第０５／０６９０１５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０５８８７５号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−６１０３１号公報
【非特許文献１】シキダ（M. Shikida），タカヤナギ（K. Takayanagi），イノウチ（K. Inouchi），ホンダ（H. Honda）およびカトウ（K. Sato），「マイクロ化学分析システムにおける磁気ビーズの液滴操作のための膨潤性と界面張力の利用（Using wettability and interfacial tension to handle droplets of magnetic beads in a micro-chemical-analysis system）」，Sens. Actuators, B, 2006年, 113, 563-569.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、上述のように、微量液滴ベースで化学反応を目論むデバイスにおいて、水より比重の小さいオイル等の液体媒体中に液滴を固定するためには、シキダらのように、物理的な障壁、例えばゲート等の流体制御構造を設ける必要がある。特に、磁気粒子を含まない液滴を操作する場合は、磁場による移動制御が困難なため、液滴周囲を物理的に囲うか、液滴が接する基板表面に親水性化学処理を施し、そこへ液滴を吸着させる必要がある。
【０００７】
しかしながら、流体制御構造や基板親水性化学処理を施すと装置が複雑化するため、装置設計の自由度も損なわれる。また、ガラスゲート等を用いて磁気粒子を母液滴から分離する方法では、ゲートの大きさにより、目的としない液体が分離後の磁気粒子に含まれる場合があるため、液滴の分離精度が低くなる。
【０００８】
一方、磁気粒子を含んだ液滴ベースでの化学反応デバイスでは、複数の液滴を同時に操作する場合もある。即ち、ある１つの液滴は移動させ、もう一方の液滴は定位置に固定させる場合がある。複数の磁石を用いて、それぞれの液滴を独立に制御することも可能であるが、移動制御機構が複雑になる。また、流路等の流体制御構造を設けることも可能であるが、装置の構造が複雑となるため、設計自由度が損なわれ、種々の化学反応に対応可能な装置を実現することが困難である。
【０００９】
上記問題点を鑑み、本発明は、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で、設計自由度が高く、高精度に液滴を操作可能な液滴操作装置および液滴操作方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の態様は、磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を搬送する搬送面を有する液滴搬送装置と、搬送面の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含み、第１及び第２の電極に電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより液滴を搬送面上に固定させる電場手段と、液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段とを備え、磁場手段を搬送面に沿って移動させることにより、搬送面上に固定された液滴から磁気粒子を分離する液滴操作装置であることを要旨とする。
【００１１】
本発明の他の態様は、液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む電場手段に電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、液滴を搬送面上に固定させるステップと、液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を搬送面に沿って移動させることにより、搬送面上に固定された液滴から磁気粒子を分離するステップとを有する液滴操作方法であることを要旨とする。
【００１２】
本発明の更に他の態様は、液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段にそれぞれ電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させ、液滴を搬送面上に固定させるステップと、 液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を、搬送面に沿って、複数の電場手段間で往復移動させるステップとを有し、磁場手段の移動速度を、往路の移動速度に対して復路の移動速度が１０倍〜２００倍となるように制御する液滴操作方法であることを要旨とする。
【００１３】
本願発明の更に他の態様は、液滴搬送装置が有する搬送面上に、表面に核酸が結合した磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、搬送面上に洗浄溶液を配置するステップと、液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段に電圧を印加して、搬送面の下方から搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、液滴及び洗浄溶液をそれぞれ搬送面上に固定させるステップと、液滴搬送装置の下方から搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を搬送面に沿って移動させることにより、搬送面上に固定された液滴から磁気粒子を分離するステップと、磁場手段の移動により、液滴から分離した磁気粒子を洗浄溶液と混合させ、磁気粒子を洗浄するステップとを有する液滴操作方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で、設計自由度が高く、高精度に液滴を操作可能な液滴操作装置および液滴操作方法が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下図面を参照して、本発明の形態について説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号が付してある。但し、図面は模式的なものであり、装置やシステムの構成等は現実のものとは異なる。また、図面相互間においても互いの構成等が異なる部分が含まれていることは勿論である。また、以下に示す本発明の実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想の構造、配置等を下記のものに特定するものでない。
【００１６】
（第１の実施の形態）
第１の実施の形態に係る液滴操作装置は、図１に示すように、磁気粒子２ａを含む水溶液からなる液滴２を搬送するための搬送面１０ａ（図１では底面）を有する液滴搬送装置１０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０ａの上方に及ぶ電場を印加し、液滴２を搬送面１０ａ上に固定させる電場手段２０と、液滴搬送装置１０の下方から搬送面１０ａの上方に及ぶ磁場を印加し、搬送面１０ａ上に固定された液滴２から磁気粒子２ａを分離させる磁場手段３とを備える。
【００１７】
液滴搬送装置１０の形状としては、例えば、２枚の膜の端部が貼り合わされ膜に囲まれた空間を反応場とする膜状反応容器、キャピラリー、平板状基板、平板状基板表面を囲む壁を持つ容器、平板状基板と壁で囲まれた領域を覆う蓋を有する反応容器等が利用可能である。蓋は全体又は一部が開閉可能となっていて、化学反応を行うための試薬や試料を含む液滴を内部に投入できるようになっていてもよい。
【００１８】
反応物の検出、分析等における外部からのコンタミネーションを防ぐためには、完全閉鎖系の反応場を有する容器又は基板を液滴搬送装置１０として利用することが特に好ましい。完全閉鎖系の反応場を有する容器又は基板としては、例えば、上述した膜状反応容器の他に、両端が融着され閉鎖された流路を持つ細管状反応容器や反応基板と壁と蓋とが一体成形された反応基板などを好適に用いることができる。
【００１９】
図１の例では、液滴搬送装置１０として、厚さ０．３ｍｍ、縦幅３０ｍｍ、横幅９０ｍｍのポリプロピレン製の平板に、高さ１０ｍｍの壁（側壁）を設け、平板と側壁で囲まれた領域を５ｍｍ厚のガラス製の蓋で密閉した直方体状の反応基板（反応容器）を用いている。
【００２０】
搬送面１０ａは、液滴２の移動容易性を考慮して、液滴２と接触する表面が平滑であることが好ましく、特に、表面粗さＲａ＝０．１μｍ（JIS B 0601-1994）以下であることが好ましい。搬送面１０ａの表面粗さＲａ＝０．１μｍ以下とすることにより、例えば、磁場手段３を搬送面１０ａの下方に近づけて、磁場手段３の移動により液滴２を移動させる場合に、磁場手段３の移動に伴う磁気粒子２ａの移動の追従性を向上できる。
【００２１】
液滴搬送装置１０に用いられる材質としては、使い捨て可能や量産可能の点から、安価に入手可能な材質であることが好ましい。また、液滴２移動の際の移動抵抗を下げるために、撥水性の材質を用いることが好ましい。そのような材料としては、例えば、ポリプロピレン、ポリテトラフロロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの樹脂素材を好適に用いることができる。液滴の吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率の変化などの測定において光学的な検出を行うために、液滴搬送装置１０が、光透過性を有する材質で形成されていることが好ましい。
【００２２】
液滴２中に配置される磁気粒子２ａとしては、表面に生体由来高分子と特異的に結合する化学構造、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ、錯体化した金属イオン、或いは抗体を有した、若しくは静電気力、ファンデルワールス力により高分子と特異的に結合する様態を呈した表面を持つ磁気に応答する粒子を使用することができる。
【００２３】
例えば、磁気粒子２ａは、マグネタイト、γ−酸化鉄、マンガン亜鉛フェライト等の磁性体から形成され、表面に水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などの親水性基を持つ粒子を使用することができる。具体的には、磁性体およびシリカの混合物からなる磁気粒子、シリカで表面を覆われた磁性体粒子、メルカプト基を介して親水性基を有する金で表面が覆われた磁性体粒子、磁性体を含有し表面にメルカプト基を介して親水性基を持つ金粒子などが好適に用いられる。これらの機能性表面を持った磁気粒子２ａは、特定成分を選択的に表面へ吸着できる。磁気粒子２ａの大きさとしては、０．１μｍ〜５００μｍ程度の平均粒径を持つことが好ましい。
【００２４】
磁気粒子２ａは、液滴２内に取り込まれ、液滴２と一体化することが可能である。磁気粒子２ａと一体化した液滴２は、磁場手段３の移動により、液滴状態を保ちながら磁場の移動方向へ移動することが可能である。ここで、本発明における「液滴」とは、液滴を構成する液体の分子間力によって発生する表面張力により球形、或いはそれに近い形状を持った溶液塊を指す。
【００２５】
液滴２を構成する水溶液としては、例えば、水やその他、種々の水溶液が用いられる。空気等の気相下において撥水性基板の表面上において液滴２の移動を行う場合は、エタノール等のアルコール類を含む水溶液も用いることも可能であるが、その場合は、直径が５ｍｍ程度の液滴２が形成できる程度の表面張力を有する水溶液を用いるのが好ましい。具体的には、エタノール水溶液を用いる場合は、１（ｖ／ｖ）〜５０（ｖ／ｖ）％の濃度範囲内が好ましい。
【００２６】
液滴２を構成する水溶液は、界面活性剤を含有することが好ましい。界面活性剤としては非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（トゥウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ−１００）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、液滴内で生化学反応を行う際、反応を阻害しない点で好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、N-ラウリルサルコシンが挙げられる。界面活性剤を含有することにより、磁気粒子の含有の有無に関わらず液滴の液滴搬送装置の搬送面への吸着が強くなる現象が観察され、搬送面１０ａ上の一定位置への固定が容易に実現でき、液滴２の操作精度を向上させることができる。界面活性剤の添加は、後述する磁気粒子の含有する液滴からの磁気粒子の分離操作における、母液滴の固定安定性にも寄与する。なお、界面活性剤は、０．００１（ｖ／ｖ）〜１（ｖ／ｖ）％程度、液滴２中に添加することが好ましい。
【００２７】
図１の液滴搬送装置１０内には、液滴と混じり合わず化学的に不活性な液体が封入されている。「化学的に不活性な液体」とは、液体の分取、混合、希釈、撹拌、加熱、冷却などの種々の化学反応を阻害しない物質を指し、例えば、アルカン等の炭化水素類、パーフルオロアルカン類、アルカンの水素原子の一部がフッ素である化学物質、ミネラルオイル、シリコーンオイル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸アミド、脂肪酸ケトン、脂肪酸アミン類などの疎水性の液体物質があげられる。これらの物質の中でも、比重が１より小さい物質を「化学的に不活性な液体」として用いることが好ましい。比重が１より小さい物質を用いることにより、液滴２が液滴封入媒体中に沈むため、磁場手段３による液滴２の操作性が向上する。
【００２８】
耐熱性酵素を用いた反応等の比較的高温条件下で行われる生化学反応に対しては、揮発性の低い物質、具体的には沸点が２００℃以下のミネラルオイル、シリコーンオイル、脂肪酸エステル、油脂などを用いることにより、液滴封入媒体及び液滴の揮発を防ぐことができる。
【００２９】
電場手段２０は、搬送面１０ａの下方に沿って配置され互いに異なる極性を有する第１及び第２の電極４ａ、４ｂと、第１及び第２の電極４ａ、４ｂと絶縁され第１及び第２の電極４ａ、４ｂに関し搬送面１０ａとは反対側に搬送面１０ａに沿って配置された導電性薄板５とを含む。
【００３０】
第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂとしては、図１に示すように、例えば縦３０ｍｍ、横幅３ｍｍ、厚さ４０μｍのアルミニウム製の帯状の電極を用いることができる。図１の第１の電極４ａと第２の電極４ｂは２ｍｍ間隔で平行に離間しており、それぞれ電源７に接続されている。例えば、液滴２を図１の紙面左側から右側へ移動させる場合は、第１の電極４ａを負極（グランド）に接続し、第２の電極４ｂを正極に接続する。そして、電源７から第１の電極４ａと第２の電極４ｂ間に電場（電界）を印加することにより、電極４の上方の搬送面１０ａ上に液滴２を固定させる。
【００３１】
電場（電界）の強度は、磁場を印加させた場合に、電極４上に液滴２を固定することができる程度に十分に高いことが好ましい。ただし、電場の強度は、高くしすぎると絶縁が不十分で漏電が起こり、液滴２の固定が困難になる。逆に、電場の強度を低くしすぎると、電場手段２０による液滴２の固定が困難になる。よって、第１の電極４ａと第２の電極４ｂとの間に印加する電圧の大きさとしては０．５〜１０ｋＶ、更には１．０〜８ｋＶ、更には１．５〜５ｋＶを、搬送面１０ａの上方に印加することが好ましい。
【００３２】
導電性薄板５としては、例えば縦幅３０ｍｍ、横幅２５ｍｍの平板状のアルミニウム箔を用いることができる。図２（ｃ）に示すように、導電性薄板５は、絶縁体６を介して第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂの約０．２ｍｍ下方に配置されている。絶縁体６としては、例えば、厚さ０．２ｍｍの塩化ビニル膜を用いることができる。第１の電極４ａを接地して導電性薄板５を接地しないようにすることで、導電性薄板５を接地する場合に比べて液滴２の電極４上への固定をより確実にすることができ、液滴の操作精度を向上させることができる。
【００３３】
磁場手段３としては、永久磁石又は電磁石アレイ等を用いることができる。磁場手段３の移動は手動で制御してもよいし、図１に示さない制御手段により電気的に制御しても構わない。磁場手段３が電磁石アレイの場合、磁場手段の移動は、アレイ状の電磁石に順に電圧を印加することにより達成することができる。
【００３４】
図１に示す液滴操作装置によれば、電場手段２０が発生させる電場により、搬送面１０ａの電極４ａ上方に液滴２を固定させた状態で、磁場手段３により磁場を発生させながら、搬送面１０ａ上に沿って紙面左側から紙面右側に向かって磁場手段３を移動させることにより磁気粒子２ａを牽引する。この際、液滴２の水溶液成分は、負極である第１の電極４ａに固定されたまま、磁気粒子２ａと磁気粒子２ａに付着した微量の液体のみが、磁場手段３の移動により分離されるため、物理的な流体制御機構を設けることなく、液滴２から磁気粒子２ａを分離でき、装置の簡素化が図れる。
【００３５】
また、電場と磁場の引力を利用して液滴２中の磁気粒子を分離することで、ゲート等の流体制御機構により物理的に分離する場合に比べて余分な液体を多量に抽出することがない。よって、目的とする特定成分を吸着させた磁気粒子を効率よく抽出できる。
【００３６】
更に、電場手段２０は、操作者の都合に応じて位置や数を自由に変更可能であるので、種々の化学反応に対応させることができ、装置の自由度も高い。例えば、電場手段２０を搬送面１０ａの下方に複数個配置することにより、１つの液滴搬送装置１０内で、複数の化学反応を起こすことができるため、コンビナトリアルケミストリ用ラブ・オン・チップ（lab on chip）デバイス等に応用できる。
【００３７】
更に、磁場手段３及び電場手段２０は、液滴搬送装置１０の外部に配置されるため、液滴搬送装置１０として完全閉鎖系の反応容器を用いることにより、クロスコンタミネーション対策を大きな課題とする遺伝子増幅法を利用した臨床検査利用等に応用できる。
【００３８】
次に、図２（ａ）〜図２（ｄ）を用いて、図１に示す液滴操作装置を用いた液滴操作方法を説明する。以下に述べる液滴操作方法は一例であり、これ以外の種々の液滴操作方法により実現可能であることは勿論である。
【００３９】
まず、図２（ａ）に示す液滴２の元となる磁気粒子懸濁液を用意した。磁気粒子の材料としては、東洋紡から販売されているＭＦＸ−９６００−Ｍａｇｎｉａ−自動核酸抽出装置の専用試薬キットにある磁性シリカビーズを使用した。磁性シリカビーズを１０倍量の純水で懸濁させた後、５００×ｇ、１分間の遠心操作により洗浄し、洗浄を２回繰り返した。その後、得られた液体を元の容量に戻した。液滴２中の粒子濃度は、洗浄後の懸濁液をさらに１０倍希釈となるように、液滴２の一部となる液体に予め添加し、懸濁させ、これを磁気粒子懸濁液とした。このように調整した磁気粒子懸濁液中の磁気粒子の濃度は、３０μｇ／μｌである。
【００４０】
図２（ａ）に示すように、厚さ０．８ｍｍの撥水性の底板の表面（上面）を搬送面１０ａとするポリプロピレン製の液滴搬送装置１０内にシリコーンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）を入れ、シリコーンオイル中に、磁気粒子２ａが３０μｇ／μｌの濃度で分散した純水１０μｌを封入して、搬送面１０ａ上に直径２．５ｍｍの液滴２を配置した。
【００４１】
次に、表面が平坦な搬送面１０ａの下方に磁場手段３を近づけ、搬送面１０ａに沿って水平方向に移動させる。磁場手段３としては、例えばネオジム製永久磁石を用いることができる。磁場手段３の移動により、図２（ｂ）に示すように、液滴２内の磁気粒子２ａが紙面右側に集まり、液滴２全体を右側へ動かそうとする力が働く。このとき、撥水性の搬送面１０ａでは液滴２と搬送面１０ａ間の抵抗が少ないため、磁気粒子２ａが液滴２から飛び出すことなく、結果として液滴２全体が移動する。
【００４２】
液滴２を磁場手段３によりさらに移動させていき、図２（ｃ）に示すように、例えば、８ｋＶの電圧を第１の電極４ａと第２の電極４ｂとの間に印加して、第１の電極４ａと第２の電極４ｂ上を通過させる。電圧印加により、液滴２を構成する水には負電極（第１の電極４ａ）への固定力が生じる。磁場手段３をそのまま紙面右方向に移動させると、図２（ｃ）に示すように、磁気粒子２ａが液滴２の右側に集中する。更に磁場手段３を右側へ移動させると、図２（ｄ）に示すように、液滴２から磁気粒子２ａが分離されて、その結果、液滴２が母液滴１２と小液滴１１とに分離される。磁気粒子２ａは、小液滴１１内に捕集される。
【００４３】
図２（ａ）〜図２（ｄ）に示す液滴操作方法によれば、搬送面１０ａに電場及び磁場を発生させることにより、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で高精度に液滴２を操作できる。
【００４４】
（第２の実施の形態）
第２の実施の形態に係る液滴操作装置は、図３に示すように、液滴搬送装置１０の搬送面１０ａに近接配置された平板状（円盤状）の第１の電極４ａと、第１の電極４ａと互いに異なる極性であって第１の電極４ａと対向し、第１の電極よりも外周が大きい枠状（リング状）の第２の電極４ｂと、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂと絶縁され、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂに関し、搬送面１０ａとは反対側に、搬送面に沿って配置された平板状（円盤状）の導電性薄板５とを電場手段２０として含む点が、図１に示す液滴操作装置と異なる。
【００４５】
第１の電極４ａとしては、例えば直径５ｍｍ、厚さ４０μｍのアルミニウム製電極を用いることができる。第１の電極４ａは、電源７の負極（グランド）側に接続されている。第２の電極４ｂとしては、例えば直径９ｍｍ、中空部分の直径５ｍｍ、厚さ４０μｍのアルミニウム製電極を用いることができる。第２の電極４ｂは、電源７の正極側に接続されている。
【００４６】
第１の電極４ａを取り巻くリング状の第２の電極４ｂの中空構造は、液滴２の搬送面１０ａへの吸着の安定化に寄与する。図示を省略しているが、第１の電極４ａ、第２の電極４ｂ、導電性薄板５は、それぞれ厚さ０．５ｍｍの塩化ビニル膜で絶縁してある。
【００４７】
導電性薄板５は、厚さ４０μｍ、直径９ｍｍの円盤状アルミニウム箔であり、０．５ｍｍ塩化ビニル膜を介して第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂから絶縁されている。導電性薄板５は、接地せずに、第２の電極４ｂと重なる様に配置されている。
【００４８】
なお、第１の電極４ａの平面形状は、楕円形、三角形、矩形、多角形等の種々の形状が採用できる。第２の電極４ｂの形状も、中心部に中空部分を有する枠形状であればよく、例えば、楕円形、三角形、矩形、多角形等の形状を有していてもよい。他は、図１に示す液滴操作装置と実質的に同様であるので記載を省略する。
【００４９】
図３に示す電場手段２０を用いた液滴操作装置によれば、電場を発生させて液滴２を平板状の第１の電極４ａ上方の搬送面１０ａ上に固定させながら、磁場を発生させて磁気粒子２ａを搬送面１０上に水平方向に牽引することにより、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で高精度に液滴を操作することができる。
【００５０】
また、図３に示すように、平板又は枠形状の第１の電極４ａ、第２の電極４ｂを用いることにより、図１に示すような帯状の第１の電極４ａ，４ｂを用いた場合に生じ得る、電極の延伸（帯）方向への液滴２の移動を抑制できるため、液滴２の制御効率をより向上させることもできる。
【００５１】
次に、図４（ａ）〜図４（ｄ）を用いて、図３に示す電場手段２０を用いた液滴操作方法を説明する。なお、以下に述べる液滴操作方法は一例であり、これ以外の種々の液滴操作方法により実現可能であることは勿論である。
【００５２】
まず、撥水性の底板（厚さ０．８ｍｍ）を搬送面１０ａとするポリプロピレン製の液滴搬送装置１０内にシリコーンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）を入れる。搬送面１０ａ上へは第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂを介して電場（電界）を発生させておく。
【００５３】
電場印加後、０．０１（ｖ／ｖ）％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を含む磁気粒子濃度３０μｇ／μｌの磁気粒子懸濁液を、マイクロピペットにより、第１の電極４ａ直上の搬送面１０ａに滴下することにより、シリコーンオイル中に、図４（ａ）に示す液滴２を形成した。液滴２から抽出される磁気粒子を洗浄するための洗浄用液滴８も搬送面１０ａ上に配置した。
【００５４】
電場を発生させた状態で、搬送面１０ａの下方から磁場手段３（図示せず）を近づけ、搬送面１０ａに沿って紙面左側から右側方向へ磁場手段３を秒速２ｍｍで移動させる。磁場手段３の移動により、図４（ｂ）に示すように、液滴２内の磁気粒子２ａが右側に集まり、液滴２全体を右側へ動かそうとする力が働く。
【００５５】
電場を発生させた状態で、磁場手段３を用いて液滴２をさらに紙面右方向へ移動させ、図４（ｃ）に示すように、液滴２を小液滴１１と母液滴１２とに分離させる。小液滴１１は、磁気粒子２ａと若干の液滴２の溶媒（水）を伴っていた。更に、磁場手段３を紙面右方向に移動させて、図４（ｄ）に示すように、小液滴１１と洗浄液滴８とを合体させることにより、磁気粒子２ａを含む混合液滴１８を形成した。
【００５６】
図４（ａ）〜図４（ｄ）に示す液滴操作方法によれば、搬送面１０ａに電場及び磁場を発生させて液滴２の移動を操作することにより、物理的な流体制御機構を設けることなく、簡易な構造で高精度に液滴中の磁気粒子を分離できる。なお、図４（ａ）〜図４（ｄ）に示す操作は、上述した液滴の分離の他にも、液滴の分取、希釈あるいは磁気粒子表面に吸着した特定成分の抽出等、種々の化学反応に利用できることは勿論である。
【００５７】
（第３の実施の形態）
第３の実施の形態に係る液滴操作装置は、図５（ａ）〜図５（ｅ）に示すように、液滴搬送装置１０の搬送面１０ａに沿って複数個、それぞれ離間して配置された電場手段２０を有する点が、第１及び第２の実施の形態に係る液滴操作装置と異なる。
【００５８】
搬送面１０ａの下面側には、第１の電極４ａと、第１の電極４ａと異なる極性を有し、第１の電極４ａと向き合って離間する第２の電極４ｂと、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂと絶縁され、搬送面１０ａに対向する導電性薄板５とを含む電場手段２０が配置されている。第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂの周囲には、絶縁体６が形成されている。絶縁体６を介して第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂから絶縁される導電性薄板５は、１枚のアルミニウム箔等で形成され、搬送面１０ａに沿って並んで配置された３つの電極４をそれぞれ覆うように配置されている。
【００５９】
例えば図５（ａ）に示すように、搬送面１０ａに沿って３つ並んで配置された第１の電極４ａのそれぞれは、電極の中心部からそれぞれ互いに約１３ｍｍ離間するように配置されている。他は、第１及び第２の実施の形態に係る液滴操作装置と実質的に同様であるので重複した記載を省略する。
【００６０】
図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作装置によれば、搬送面１０ａに沿って電場手段２０を複数並べて配置することにより、１つの搬送面１０ａで複数の化学反応を進行させることができるため、化学反応回路のデザインにおいて柔軟性の高いシステムを構築できる。
【００６１】
次に、図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作装置を用いた液滴操作方法を説明する。以下に述べる液滴操作方法は一例であり、これ以外の種々の液滴操作方法により実現可能であることは勿論である。
【００６２】
まず、撥水性の底板（厚さ０．８ｍｍ）を搬送面１０ａとするポリプロピレン製の液滴搬送装置１０内にシリコーンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）を入れた。次に、図５（ａ）に示すように、３つの第１の電極４ａ直上の搬送面１０ａ上に、それぞれ液滴２、洗浄液滴８、９を滴下した。図中左側の第１の電極４ａ上には、例えば、キシレンシアノール０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液及び磁気粒子２ａの濃度が３０μｇ／μｌの混合液からなる液滴２を滴下した。図５（ａ）中の中央側及び右側の第１の電極４ａ上には、それぞれ０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液からなる液滴（洗浄液滴）８、９を滴下した。液滴２、８、９の滴下量は、それぞれ１０μｌとした。液滴２、８、９を滴下する要領は、第２の実施の形態と同様とした。また、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂへの印加電圧はすべて８ｋＶとした。
【００６３】
電場手段２０によりそれぞれ搬送面１０ａへ向けて電場（電界）を印加した状態で、搬送面１０ａの下方から磁場手段３を近づけ、図５（ｂ）に示すように、搬送面１０ａに沿って紙面左方向から右方向へ秒速約２ｍｍで磁場手段３を動かすことにより、電場印加による液滴２の第１の電極４ａ上への固定力と液滴２の表面張力よりも大きな力を磁場手段３が磁気粒子２ａに搬送面水平方向に与え、磁気粒子２ａを含む液滴２を、母液滴１２と磁気粒子２ａを含む小液滴１１とに分離させた。更に、磁場手段３を紙面右方向に移動させて小液滴１１と洗浄用液滴８とを合体させ、図５（ｃ）に示すような磁気粒子２ａを含む混合液滴１８を形成した。
【００６４】
電場手段２０によりそれぞれ搬送面１０ａへ向けて電場を印加した状態で、図５（ｄ）に示すように、搬送面１０ａに沿って更に紙面右方向へ秒速約２ｍｍで磁場手段３を動かし、磁気粒子２ａを含む混合液滴１８を、母液滴１４と磁気粒子２ａを含む小液滴１３とに分離させた。更に、磁場手段３により小液滴１３を紙面右方向に移動させて洗浄液滴９と合体させ、図５（ｅ）に示すような混合液滴１９を形成して、磁気粒子２ａを洗浄する。
【００６５】
図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作方法によれば、物理的な流体制御機構を設けることなく、１つの搬送面１０ａで、液滴２中の磁気粒子２ａを高精度に分離、洗浄することができる。
【００６６】
−液滴搬送装置を利用した液体の搬送方法−
磁場手段３の移動速度を変えることによって、母液滴から磁気粒子を分離する際に、磁気粒子２ａに追従する液体の容量を調整することが可能である。この方法を利用して、複数の液滴間で液体の搬送が可能である。
【００６７】
図６（ａ）〜図６（ｄ）は、図示しない電場手段により搬送面上に固定された液滴３０に磁気粒子（鉄粉、粒径４５μｍ）を加え、搬送面の下側から磁場手段３を紙面右側から左側方向へ移動させることにより、液滴３０中の磁気粒子（磁気粒子集合体）３１を牽引し、液滴３０から小液滴を分離させる場合を示す。なお、図６（ａ）及び図６（ｂ）は、磁場手段３を毎秒１ｍｍで搬送面に沿って移動させる例を示し、図６（ｃ）及び図６（ｄ）は、磁場手段３を毎秒２００ｍｍで搬送面に沿って移動させる例を示す。
【００６８】
図６（ｂ）及び図６（ｄ）に示すように、磁気粒子３１に付着する液体の画分量は、磁場手段３の移動速度をより遅くした方が多くなる。これは、図６（ｃ）に示すように、磁性粒子３１を含んだ液滴３０を高速で移動させると液滴の形状が流線型となり、尾部の液が磁性粒子２ａに追従できなくなるため、磁気粒子３１の周囲に付着する液滴の液量が減少するものと考えられる。また、磁場手段３を高速で移動させると磁気粒子２ａの磁力線方向が垂直方向から斜め方向に傾くため、磁気粒子２ａの液体保持力が落ちるためとも考えられる。
【００６９】
図６（ａ）〜図６（ｄ）に示す現象を、複数の電場手段２００ａ、２００ｂ間における液体の送液に利用した例を図７（ａ）〜図７（ｇ）に示す。図７（ａ）〜図７（ｇ）においては、搬送面の下方に、絶縁体６６ａにより互いに絶縁された第１の電極４４ａ及び第２の電極４４ｂを含む電場手段２００ａと、絶縁体６６ｂにより互いに絶縁された第１の電極４５ａ及び第２の電極４５ｂを含む電場手段２００ｂとが配置されている。なお、図７は、操作手順の途中を図示するものであり、液滴４０は操作開始時においては存在しない。
【００７０】
図７（ａ）に示すように、第１の電極４４ａ、４５ａ及び第２の電極４４ｂ、４６ｂに電圧を印加して、液滴３０、４０を搬送面上に固定した状態において、磁場手段３を液滴３０の下方から搬送面に沿って、紙面左側から右側方向にゆっくり移動させる。なお、電場手段２００ａ、２００ｂによる液滴の固定方法に関しては、第１から第３の実施の形態において説明した通りである。
【００７１】
その結果、図７（ｂ）に示すように、磁気粒子３１の周囲に液滴３０の一部を付着させた状態で、液滴３０から磁気粒子３１が抽出される。磁場手段３をそのまま紙面左側から右方向に移動させることにより、図７（ｃ）に示すように、液滴３０の一部を伴う磁気粒子３１を液滴４０と合体させる。
【００７２】
図７（ｄ）に示すように、今度は、液滴４０を搬送面上に固定した状態において、搬送面の下側から磁場手段を図７（ａ）で移動させた速度よりも速い速度で、図７（ａ）の移動方向とは逆向き、即ち、紙面右側から左側方向へ移動させる。磁場手段を図７（ａ）での移動速度よりも速い速度で移動させることにより、図７（ｅ）に示すように、図７（ｂ）に示す液量より少量の液体を磁気粒子３１の周囲に付着させた状態で、磁気粒子３１が液滴４０から分離される。その後、磁場手段をそのまま紙面右側から左側方向へ移動させて、図７（ｆ）に示すように、磁気粒子集合体３１を液滴３０と合体させる。
【００７３】
図７（ａ）〜図７（ｆ）に示す作業を何度も繰り返すことにより、図７（ｇ）に示すように、液滴３０中の液体が徐々に液滴４０に取り込まれていき、その結果、電場手段２００ａから２００ｂへの送液を実現することができる。なお、図７（ａ）〜図７（ｆ）に示す作業を繰り返して磁気粒子３１を液滴３０、４０間で往復させる回数を多くするほど、磁気粒子３１が運搬する全送液量が増加する。
【００７４】
微小液滴を用いたマイクロフルイディクスでは、親水性表面を持った磁気粒子に周囲に水または水溶液を付着させ、磁気粒子を磁力で操作することにより、液滴の送液操作することが知られている。その際、磁気粒子の量に応じて小液滴中の磁気粒子を取り巻く液量が増加するため、任意の容量の液を送液したい場合は、磁気粒子の量を調整することにより制御している。送液量の制御範囲は、磁気粒子の種類にもよるが、およそ０．０１〜４μｌ程度である。
【００７５】
しかし、ある地点の液滴から他の地点の液滴に送液する場合、１回の小液滴の分離及び液滴同士の合体では送液量が限られるため、多数に分けた磁気粒子を何度も母液滴に付加及び分離させ、目的の液滴とを合体させる必要がある。この作業を何度も繰り返すことにより、目的とする液滴には磁気粒子が蓄積するため、磁気粒子が蓄積した液滴から磁気粒子を除去することが困難となり、以降の化学反応操作において障害となる場合がある。
【００７６】
これに対し、本発明の実施の形態に係る液滴の送液方法によれば、図７（ａ）〜図７（ｇ）に示すように、一方の電場手段から他方の電場手段へ磁気粒子を移動させる場合の磁場手段３の移動速度と、他方の電場手段から一方の電場手段へ磁気粒子を移動させる場合の磁場手段３の移動速度とをそれぞれ異なる速度に制御する。即ち、磁場手段３の移動速度は、往路（液体を排出する方の電場手段から液体を蓄える方の電場手段への移動）の移動速度に対して逆に、復路（液体を蓄える方の電場手段から液体を排出する方の電場手段への移動）の移動速度を速くすることで、磁気粒子の周囲に付着する液滴の量に偏りを生じさせる。液滴の量に偏りを生じさせた状態で、磁気粒子を複数の液滴間で往復移動させることにより、任意量の送液が可能となる。
【００７７】
本実施形態において、磁場手段の移動速度は、往路の移動速度に対して復路の移動速度が、１０倍〜２００倍とすることが好ましい。より好ましくは、往路の移動速度に対して復路の移動速度が、５０倍〜１００倍とすることが好ましい。具体的には、往路を０．１〜１０ｍｍ／ｓｅｃ、より好ましくは０．５〜５ｍｍ／ｓｅｃとし、復路を５０〜３００ｍｍ／ｓｅｃとするのが好ましい。より好ましくは、往路が１〜３ｍｍ／ｓｅｃ、復路が１５０〜２００ｍｍ／ｓｅｃである。
【００７８】
図６及び図７に示す送液方法を利用した液滴操作装置の例を図８に示す。直方体状の液滴搬送装置１０の搬送面１０ａ上には、厚さ０．０５ｍｍのフィルム２１が配置されている。フィルム２１としては、例えばテフロン（登録商標）フィルムを用いることができる。
【００７９】
搬送面１０ａの下には、円盤（平板）形状を有する２つの第１の電極４ａが、搬送面１０ａに水平方向にそれぞれ離間して配置されている。第１の電極４ａの下には、第１の電極４ａと異なる極性を有するリング（枠）形状を有する第２の電極４ｂが配置されている。第２の電極４ｂの下には、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂと絶縁された円盤（平板）状の導電性薄板５が配置されている。第１の電極４ａの電極は電源７の負極（グランド）側に接続され、第２の電極は、電源７の正極側に接続されている。
【００８０】
図８では図示を省略しているが、図９に示すように、第１の電極４ａ及び第２の電極４ｂの周囲は塩化ビニル等の絶縁体６で覆われている。導電性薄板５は、厚さ４５μｍの１枚のアルミニウム箔等で形成されている。なお、図９の例において、導電性薄板５の直径ｌ４は、９．５ｍｍ、第２の電極４ｂの外径ｌ２が９．０ｍｍ、第２の電極４ｂのリング幅ｌ３が１．２ｍｍ、第１の電極４ａの直径ｌ１が５．５ｍｍである。また、フィルム２１の厚さｔ１は０．０５ｍｍ、液滴操作装置１０の底面の厚さｔ２は０．３ｍｍ、液滴操作装置１０の底面の厚さ方向における第１の電極４ａと第２の電極間距離ｔ３は０．３６ｍｍ、液滴操作装置１０の底面の厚さ方向における第２の電極４ｂと導電性薄板５との距離ｔ４は０．１８ｍｍとした。図８及び図９においては図示を省略しているが、図８及び図９に示す液滴操作装置１０を用いて液体を送液する場合は、導電性薄膜５の下から搬送面１０ａに沿って磁石等の磁場手段３を移動させることにより行う。
【００８１】
図１０のグラフは、図８及び図９に示す液滴操作装置１０を用いて２つの第１の電極４ａ間で磁場手段３を制御し、磁気粒子（粒径４５μｍの鉄粉）を磁場手段３の移動速度をもって往復移動させた場合の往復移動１回当たりの送液量を示したものである。磁場手段３の移動速度は往路を毎秒１ｍｍとし、復路をそれぞれ毎秒５０ｍｍ、毎秒１００ｍｍ、毎秒２００ｍｍとして測定した。図１０のグラフ横軸は磁気粒子量、グラフ縦軸は往復移動１回当たりの磁気粒子が搬送する液体容量を示す。実験では、シリコ−ンオイル（信越シリコーン ＫＦ９６−２０ＣＳ）中に５０μｌの純水からなる液滴を、片方の第１の電極４ａ上に配置し、２つの第１の電極４ａ各々に直流電圧（８ｋＶ）を印加することで液滴を搬送面上に固定させ、搬送面の下方から搬送面に水平方向に磁石を操作して、搬送面上で磁気粒子の移動を制御した結果を示す。磁気粒子を２つの液滴間で１０往復させ、１回当たりの平均送液量を算出し、グラフにプロットした。図１０の結果に示すように復路の速度が早く磁気粒子量が多いほど、送液量が増加することが分かる。
【００８２】
図１１のグラフは、往路の移動速度を毎秒１ｍｍ、復路の移動速度を毎秒５０ｍｍ及び毎秒２００ｍｍとし、粒径がそれぞれ異なる２種類の磁気粒子を用いて送液量を測ったグラフである。実験条件は、磁気粒子の粒径の違い以外は、図１０と同じとした。磁気粒子としては、粒径４５μｍと粒径１５０μｍの鉄粉を用いた。図１１に示すように、磁気粒子の粒子径を大きくするほど送液量が増える傾向にある。また、数十ｎＬ〜１００ｎＬの液体の送液の場合、磁気粒子量を５０μｇ／５０μＬから１００μｇ／５０μＬとすることで達成することができる。遺伝子増幅反応を代表とする生化学反応を目的とした場合、ｎＬオーダーの液体の搬送は非常に有効である。
【００８３】
本発明の実施の形態に係る液体の搬送方法によれば、図８及び図９に示す液滴操作装置１０において、磁性粒子の移動速度、移動回数、粒子径、粒子量を制御することで、一定量の液体の送液が可能になる。
【００８４】
−核酸の単離方法−
上述の第３の実施の形態に係る液滴操作方法を、シリカ粒子とカオトロピック塩を用いた核酸の単離方法（特開平２−２８９５９６）に適用し、単離した遺伝子を鋳型核酸として核酸増幅反応の代表例であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施した例を以下に説明する。なお、本発明の実施の形態に係る核酸の単離方法においては、図５（ａ）〜図５（ｅ）に示す液滴操作装置を用いた場合を例に説明する。核酸を含有する生体試料として、口腔スワブを用意した。
【００８５】
図５（ａ）の各液滴の構成は次の通りである。紙面左側の液滴２を、生体試料と細胞溶解液からなる液滴として、６Mグアニジンチオシアネート水溶液２μｌと口腔スワブ２μｌとの混合液とした。液滴２中の磁気粒子２ａとして、磁性シリカ粒子を１μｇ／μｌの濃度となるように添加した。紙面中央の液滴８を磁性シリカ粒子の洗浄液として、２００ｍＭ塩化カリウム及び５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０水溶液５０μｌを用意した。紙面右側の液滴９は、ＰＣＲ反応液３μｌとした。ＰＣＲ反応液の組成は後述する。磁場手段３の移動速度は２ｍｍ／秒とした。
【００８６】
まず、図５（ａ）に示すように、液滴２内で口腔スワブに含まれる口腔粘膜細胞を溶解させ、混合液滴中に遊離した核酸を磁気粒子２ａの表面に吸着させた。磁場手段３を搬送面１０ａに沿って移動させることで、図５（ｂ）に示すように、核酸を表面に吸着した磁気粒子２ａと少量のグアニジンチオシアネート水溶液を伴う小液滴１１を母液滴１２から分離させた。グアニジンチオシアネートは、後述する本工程に接続される遺伝子増幅反応を阻害するため、磁場手段３を紙面右方向へ更に移動させることにより、洗浄液から成る洗浄液滴８を通過させ、図５（ｃ）に示すように、混合液滴１８を形成した。
【００８７】
磁場手段３を紙面右方向へさらに移動させ、図５（ｄ）に示すように、混合液滴１８から小液滴１３を分離させた。磁気粒子２ａは、表面に核酸を吸着させながら少量の洗浄液を伴っていた。分離された小液滴１３は、塩化カリウムとトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を伴っているが、それら成分は酵素反応を大きく阻害することはない。磁場手段３を紙面右方向へ更に移動させることにより、分離された小液滴１３を、図５（ｅ）に示すように、ＰＣＲ反応液からなる液滴９と混合させ、混合液滴１９を形成した。
【００８８】
なお、液滴９を構成するPCR反応液としては、20mM Tris-HCl（pH9.5）, 8mM MgCl2, 各200μMのdATP, dCTP, dGTP及びdTTP, 0.2(wt/v)%BSA,各0.4μMのprimer, 2.5units/50μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Japan）を含むＰＣＲ反応液を用意した。鋳型遺伝子をβアクチン遺伝子とし、プライマーとしては、配列番号１の塩基配列からなる第１のβアクチン検出用プライマー及び配列番号２の塩基配列からなる第２のβアクチン検出用プライマーを用意した。
【００８９】
混合液滴１９を９４℃から６０℃の直線的に温度勾配がかかった搬送面に沿って磁石で往復移動させ、液滴の温度が、９４℃２秒、６０℃１秒及び７２℃５秒からなる温度サイクルを４０サイクル繰り返すように液滴の位置を制御してＰＣＲを行った。ＰＣＲ終了後、反応産物についてアガロースゲル電気泳動を行うことにより、βアクチン遺伝子からの増幅産物（１５１塩基）が確認できた（図１２参照）。ここで、図１２において、左のレーンが分子量マーカー、右のレーンが反応産物についてのアガロースゲル電気泳動像である。
【００９０】
本発明の実施の形態に係る核酸の単離方法によれば、磁気粒子２ａによる試料のサンプリングから核酸抽出精製そして遺伝子増幅反応を、同一容器内で行うことができた。
【００９１】
本発明の実施の形態に係る核酸の単離方法において、核酸を単離する生体試料としては、動植物組織、体液、排泄物等をいい、体液には全血、血漿、血清などの血液由来試料、唾液などが含まれる。細胞溶解液としては、グアニジン塩、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、及び尿素の各水溶液のいずれか又はその組み合わせを用いることができる。
【００９２】
上記のように、本発明は本発明の実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものであり、実施段階においては、その要旨を逸脱しない範囲で変形して具体化できる。
【００９３】
（配列表の説明）
本明細書の配列表に記載された配列番号１及び２は以下の配列を示す。
【００９４】
［配列番号 :１］第１のβアクチン検出用プライマーの塩基配列。
【００９５】
［配列番号 :２］第２のβアクチン検出用プライマーの塩基配列。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る液滴操作装置の一例を示す斜視図である。
【図２】図２（ａ）〜図２（ｄ）は、本発明の第１の実施の形態に係る液滴操作方法の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の第２の実施の形態に係る液滴操作装置の一例を示す斜視図である。
【図４】図４（ａ）〜図４（ｄ）は、本発明の第２の実施の形態に係る液滴操作方法の一例を示す概略図である。
【図５】図５（ａ）〜図５（ｅ）は、本発明の第３の実施の形態に係る液滴操作装置の一例を示す概略図である。
【図６】図６（ａ）〜図６（ｄ）は、本発明の実施の形態に係る液滴の搬送方法の原理を示す概略図である。
【図７】図７（ａ）〜図７（ｇ）は搬送面上に固定された２つの液滴間で磁気粒子を往復させ、所定量の液体を送液する方法の一例を表す概略図である。
【図８】本発明の実施の形態に係る液滴の搬送方法に好適な液滴操作装置の一例を示す概略図である。
【図９】図８のＡ−Ａ方向からみた断面図である。
【図１０】図８及び図９に示す液滴操作を用いて電極上に固定した２つの液滴間に磁気粒子を往復させた場合における往復移動１回当たりの送液量と磁気粒子量との関係を示すグラフである。
【図１１】図８及び図９に示す液滴操作を用いて電極上に固定した２つの液滴間で磁気粒子を往復させ、復路の速度と粒子径を変化させた場合の総液量と磁気粒子量との関係を示すグラフである。
【図１２】第３の実施の形態に係る液滴操作装置を用いた核酸の単離方法により得られた液滴について、ＰＣＲを行い、その反応産物についてのアガロースゲル電気泳動像である。
【符号の説明】
【００９７】
２…液滴
２ａ…磁気粒子
３…磁場手段
４ａ…第１の電極
４ｂ…第２の電極
５…導電性薄板
６…絶縁体
７…電源
８…液滴
９…液滴
１０…液滴搬送装置
１０ａ…搬送面
１８…混合液滴
１９…混合液滴
２０…電場手段
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を搬送する搬送面を有する液滴搬送装置と、
前記搬送面の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含み、前記第１及び第２の電極に電圧を印加して、前記搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより前記液滴を前記搬送面上に固定させる電場手段と、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段と
を備え、
前記磁場手段を前記搬送面に沿って移動させることにより、前記搬送面上に固定された前記液滴から前記磁気粒子を分離することを特徴とする液滴操作装置。
【請求項２】
前記電場手段が、前記第１の電極と前記第２の電極との間に０．５〜１０ｋＶの電圧を印加することを特徴とする請求項１に記載の液滴操作装置。
【請求項３】
前記第１及び前記第２の電極が、前記搬送面の下方で互いに平行に離間して配置された帯状の電極であることを特徴とする請求項１又は２に記載の液滴操作装置。
【請求項４】
前記第１の電極及び前記第２の電極が、平板状の電極であり、
前記第２の電極が、前記搬送面の下方において前記第１の電極の更に下方に配置されているとともに、前記第１の電極よりも表面積が大きいことを特徴とする請求項１又は２に記載の液滴操作装置。
【請求項５】
前記第１の電極が、平板状の電極であり、
前記第２の電極が、枠状の電極であり、前記搬送面の下方において前記第１の電極の更に下方に配置されているとともに、前記第１の電極よりも大きく形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の液滴操作装置。
【請求項６】
前記搬送面の下方において、前記第１及び第２の電極を挟んで前記搬送面に対向し、前記第１及び前記第２の電極と絶縁された導電性薄板を更に備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の液滴操作装置。
【請求項７】
前記第１の電極が接地されており、前記第２の電極が正極であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の液滴操作装置。
【請求項８】
前記電場手段が、前記搬送面に沿って複数個配置されており、
前記磁場手段が、前記電場手段間を、往路の移動速度に対して復路の移動速度が、１０倍〜２００倍で移動することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の液滴操作装置。
【請求項９】
液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、
前記液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む電場手段に電圧を印加して、前記搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、前記液滴を前記搬送面上に固定させるステップと、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を前記搬送面に沿って移動させることにより、前記搬送面上に固定された前記液滴から前記磁気粒子を分離するステップと
を有することを特徴とする液滴操作方法。
【請求項１０】
液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、
前記液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段にそれぞれ電圧を印加して搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させ、前記液滴を前記搬送面上に固定させるステップと、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を、前記複数の電場手段間で前記搬送面に沿って往復移動させるステップと
を有し、
前記磁場手段の移動速度を、往路の移動速度に対して復路の移動速度が１０倍〜２００倍となるように制御することを特徴とする液滴操作方法。
【請求項１１】
液滴搬送装置が有する搬送面上に、表面に核酸が結合した磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、
前記搬送面上に洗浄溶液を配置するステップと、
前記液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段に電圧を印加して、前記搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、前記液滴及び前記洗浄溶液をそれぞれ前記搬送面上に固定させるステップと、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を前記搬送面に沿って移動させることにより、前記搬送面上に固定された前記液滴から前記磁気粒子を分離するステップと、
前記磁場手段の移動により、前記液滴から分離した前記磁気粒子を前記洗浄溶液と混合させ、前記磁気粒子を洗浄するステップと
を有することを特徴とする液滴操作方法。
【請求項１２】
生体試料と細胞溶解液とからなる液滴に磁気粒子を加え、前記生体試料に含まれる核酸を前記磁気粒子の表面に結合させることにより、前記表面に核酸が結合した前記磁気粒子を用意するステップを更に有することを特徴とする請求項１１に記載の液滴操作方法。
【請求項１】
磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を搬送する搬送面を有する液滴搬送装置と、
前記搬送面の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含み、前記第１及び第２の電極に電圧を印加して、前記搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより前記液滴を前記搬送面上に固定させる電場手段と、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段と
を備え、
前記磁場手段を前記搬送面に沿って移動させることにより、前記搬送面上に固定された前記液滴から前記磁気粒子を分離することを特徴とする液滴操作装置。
【請求項２】
前記電場手段が、前記第１の電極と前記第２の電極との間に０．５〜１０ｋＶの電圧を印加することを特徴とする請求項１に記載の液滴操作装置。
【請求項３】
前記第１及び前記第２の電極が、前記搬送面の下方で互いに平行に離間して配置された帯状の電極であることを特徴とする請求項１又は２に記載の液滴操作装置。
【請求項４】
前記第１の電極及び前記第２の電極が、平板状の電極であり、
前記第２の電極が、前記搬送面の下方において前記第１の電極の更に下方に配置されているとともに、前記第１の電極よりも表面積が大きいことを特徴とする請求項１又は２に記載の液滴操作装置。
【請求項５】
前記第１の電極が、平板状の電極であり、
前記第２の電極が、枠状の電極であり、前記搬送面の下方において前記第１の電極の更に下方に配置されているとともに、前記第１の電極よりも大きく形成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の液滴操作装置。
【請求項６】
前記搬送面の下方において、前記第１及び第２の電極を挟んで前記搬送面に対向し、前記第１及び前記第２の電極と絶縁された導電性薄板を更に備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の液滴操作装置。
【請求項７】
前記第１の電極が接地されており、前記第２の電極が正極であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の液滴操作装置。
【請求項８】
前記電場手段が、前記搬送面に沿って複数個配置されており、
前記磁場手段が、前記電場手段間を、往路の移動速度に対して復路の移動速度が、１０倍〜２００倍で移動することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の液滴操作装置。
【請求項９】
液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、
前記液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む電場手段に電圧を印加して、前記搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、前記液滴を前記搬送面上に固定させるステップと、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を前記搬送面に沿って移動させることにより、前記搬送面上に固定された前記液滴から前記磁気粒子を分離するステップと
を有することを特徴とする液滴操作方法。
【請求項１０】
液滴搬送装置が有する搬送面上に磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、
前記液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段にそれぞれ電圧を印加して搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させ、前記液滴を前記搬送面上に固定させるステップと、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を、前記複数の電場手段間で前記搬送面に沿って往復移動させるステップと
を有し、
前記磁場手段の移動速度を、往路の移動速度に対して復路の移動速度が１０倍〜２００倍となるように制御することを特徴とする液滴操作方法。
【請求項１１】
液滴搬送装置が有する搬送面上に、表面に核酸が結合した磁気粒子を含む水溶液からなる液滴を配置するステップと、
前記搬送面上に洗浄溶液を配置するステップと、
前記液滴搬送装置の下方に配置された互いに極性の異なる第１及び第２の電極を含む複数の電場手段に電圧を印加して、前記搬送面の下方から前記搬送面の上方に及ぶ電場を発生させることにより、前記液滴及び前記洗浄溶液をそれぞれ前記搬送面上に固定させるステップと、
前記液滴搬送装置の下方から前記搬送面の上方に及ぶ磁場を発生させる磁場手段を前記搬送面に沿って移動させることにより、前記搬送面上に固定された前記液滴から前記磁気粒子を分離するステップと、
前記磁場手段の移動により、前記液滴から分離した前記磁気粒子を前記洗浄溶液と混合させ、前記磁気粒子を洗浄するステップと
を有することを特徴とする液滴操作方法。
【請求項１２】
生体試料と細胞溶解液とからなる液滴に磁気粒子を加え、前記生体試料に含まれる核酸を前記磁気粒子の表面に結合させることにより、前記表面に核酸が結合した前記磁気粒子を用意するステップを更に有することを特徴とする請求項１１に記載の液滴操作方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００９−１６２５８０（Ｐ２００９−１６２５８０Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３４１００８（Ｐ２００７−３４１００８）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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