溶媒中における分子の溶液の平均分子特性を決定する方法
【課題】分留されていない巨大分子の溶液における分子特性の測定のための新しい方法を与える。
【解決手段】一連の濃度にまたがるサンプル一定分量が、溶液の流れに連続して注入され、検出器に向かって流れる。それによって、各一定分量は、その要素が希釈された一定分量の異なる濃度に対応する、有効な「ピーク」を生成する。重み平均モル質量、平均二乗半径、および溶液における巨大分子の第２のビリアル係数が、対応するピーク全体にわたる分散信号の角度および濃度依存の分析から導き出される。従前のオンライン法とは対照的に、より少量サンプルを用いつつよりよい精度が達成される。巨大分子の２つの区別できる種間のクロスビリアル係数を決定する同様の方法も示される。
【解決手段】一連の濃度にまたがるサンプル一定分量が、溶液の流れに連続して注入され、検出器に向かって流れる。それによって、各一定分量は、その要素が希釈された一定分量の異なる濃度に対応する、有効な「ピーク」を生成する。重み平均モル質量、平均二乗半径、および溶液における巨大分子の第２のビリアル係数が、対応するピーク全体にわたる分散信号の角度および濃度依存の分析から導き出される。従前のオンライン法とは対照的に、より少量サンプルを用いつつよりよい精度が達成される。巨大分子の２つの区別できる種間のクロスビリアル係数を決定する同様の方法も示される。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
溶液の分子は、その重み平均モル質量Ｍ、第２のビリアル係数Ａ2、および以下で表わされる平均二乗半径によって、一般に特徴づけられる。
【０００２】
【数１】
【０００３】
（ここでｒは分子の質量中心からの距離であり、ｄｍはその距離における少量の質量である）。ある場合には、第３のビリアル係数Ａ3にも注意される。他の場合には、２つの区別できる分子ＡとＢとの間のクロスビリアル係数Ａ2ABに注意される。Ｍおよび＜ｒg2＞は、溶液のすべての分子にわたって平均された、個別の分子の特性である。ビリアル係数は、溶媒によって媒介される間の分子間の平均相互作用の測定単位である。分留されていない溶液については、これらの特性は、化学物理学ジャーナル（Journal of Chemical Physics）第１６巻、１０９３〜１０９９頁に掲載されたブルーノ・ジム（Ｂｒｕｎｏ Ｚｉｍｍ）による１９４８年の研究論文に記載された方法を用いて、それらの光が散乱される態様を測定することにより決定され得る。少量の溶液から散乱した光は、さまざまな角度および濃度にわたって測定される。さまざまな散乱角にわたる光散乱データの集合は、より一般的には、多角度光散乱、ＭＡＬＳと呼ばれる。単一の種類の分子の光散乱測定から導き出される特性は、ジムによって開発され、「重合体（Polymer）」１０の８０４−８０９頁（１９６９年）においてＷ．Ａ．Ｊ．ブライス（W.A. J. Bryce）によって訂正された以下の公式を通して関連付けられる：
【０００４】
【数２】
【０００５】
ここで、Ｒ*（ｃ,θ）＝Ｒ（ｃ,θ）／Ｋ*であり、Ｒ（ｃ,θ）は、Ｒ（θ）＝［Ｉs（θ）−Ｉsolv（θ）］ｒ2／［ＩOＶ］として定義される単位角当りの方向θにおける測定された過剰レイリー比（excess Rayleigh ratio）であり、Ｉs（θ）は、角度の関数として単位角当りの溶液によって散乱した光の強度、Ｉsolv（θ）は、角度の関数として単位角当りの溶媒から散乱した光の強度、ＩOは入射強度、ｒは散乱した体積から検出器までの距離、Ｖは検出器で読取られる照らされた体積であって、Ｋ＝４π2ｎ02／（ＮAλ04）、かつＫ*＝Ｋ（ｄｎ／ｄｃ）2であって、ＮAはアボガドロ数であり、ｄｎ／ｄｃは屈折率増分であり、ｎ0は溶媒屈折率であり、λ0は真空における入射光の波長である。Ｐ（θ）は以下の式によって定義される分散分子の形状因子である：
【０００６】
【数３】
【０００７】
Ｐ（θ）の一般的形式は、Ｐ．デバイ（Ｐ．Ｄｅｂｙｅ）によって物理学コロイド化学ジャーナル（J. Phys. Colloid Chem.）５１の１８（１９４７年）において以下のように導き出された：
【０００８】
【数４】
【０００９】
Ｐ1は、
【００１０】
【数５】
【００１１】
によって平均二乗半径に関連し、ｋ＝２π／λであって、λは溶媒における入射光の波長である。Ｐ2は、
【００１２】
【数６】
【００１３】
によって、平均二乗半径＜ｒg2＞および平均四乗半径＜ｒg4＞に関連する。この方程式は、濃度およびｓｉｎ2（θ／２）の冪乗における級数展開に基づいた近似値である。そのため、精度は、さらなる高次項の相対的な大きさに依存する。
【００１４】
この測定を行なうための、「プラトー法」としても公知である標準的方法は、公知の値の濃度が増加するサンプル列を準備することと、サンプルを包含するガラス瓶を光ビームに挿入することによって、またはビームに位置するフローセルにサンプルを注入することによって、サンプルを連続してＭＡＬＳ検出器に導入することと、光検出器によって各角度における散乱された強度を得ることと、各濃度および各角度について過剰レイリー比を計算することと、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3を抽出するために方程式（１）にデータをフィッティングすることとを含む。
【００１５】
いくらかの以前のサンプルまたは溶液を包含しているフローセルにサンプルを注入する場合には、セルを「過剰供給する」ため、すなわち、セル内の濃度を本来の公知のサンプル濃度にするために、十分な体積が注入されなければならない。これは、散乱信号を観察し、信号対時間の値が停滞状態（plateau）に達するまでサンプルを流すことによって達成され得、それは指数関数的な依存を伴って漸近的に生じる。代替的には、フローセルを備えた濃度検出器がフロー経路に加えられてもよく、またＭＡＬＳ信号および濃度信号の両方が時間が経つと停滞状態に達するように、十分なサンプルが注入されなければならない。このように、ＭＡＬＳ検出器における濃度は濃度検出器における濃度から推論されることができ、方程式（１）におけるＲおよびｃの値を与える。フローセルを飽和させるのに必要な注入あたりの典型的な体積は１−３ｍＬである。
【００１６】
各セルの正確な濃度値への漸近的手法を認識すると、下からではなく上から漸近的に正確な濃度に接近する、減少する級数とともに増大する濃度級数に従うことにより、さらに正確な測定が得られる。２つの測定（増大する濃度および低下する濃度）の平均値は、２倍のサンプル合計および２倍の測定時間を犠牲にするが、より正確な計算をもたらす。ト
レイノフ（Ｔｒａｉｎｏｆｆ）らによる米国特許第６，６５１，００９号（以下、’００９の特許と称する）に従うと、純粋な質量項に相対して光散乱方程式のビリアル展開でのＡ2およびＡ3項の大きさを記述する、良度指数ＦＯＭを規定することができる。これらは方程式（１）から、それぞれ２Ａ2Ｍｃ−４Ａ22Ｍ2c2および３Ａ3Ｍc2として容易に導き出せる。光散乱がそのようなビリアル展開によって記述され得るという仮定は、方程式の収束を意味する。すなわち、連続的な高次項の大きさがかなり素早く低下する。換言すれば、１＞＞ＦＯＭ（Ａ2）＞＞ＦＯＭ（Ａ3）であり、良度指数が小さいほどより良い近似値となる。他方では、信頼できる測定値を得るためには良度指数が何らかの有限値でなければならないことは、信号対雑音を考慮しても明らかである。特定のサンプルおよび機器について、Ａ2およびＡ3を決定するためのＦＯＭの望ましい上限および下限は、これらの考慮によって設定される。
【００１７】
米国特許第６，４１１，３８３号では、ワイアット（Wyatt）は、ＭＡＬＳ検出器および濃度検出器を通して流れる有限体積の分留されていないサンプルの単一の注入を用いて、Ｍ、＜ｒg2＞、およびＡ2を測定するための関連する方法を記載する。このサンプル注入の前後には十分な純粋な溶媒が与えられ、ＭＡＬＳ信号および濃度信号をベースライン（Ｉsolv）に戻し、その注入は信号において「ピーク」と表示される。サンプルの有限な性質のために、サンプルがシステムを通して流れる際、サンプルは希釈され、広がって、注入の異なる部分が異なる濃度を示す。注入ごとに単一の値のＩ（θ）およびｃを備えた複数の注入に対して方程式（１）を用いる代わりに、発明者は、単一のピークにわたるＩ（θ）、ｃおよびｃ2の合計を計算し、方程式（１）および演繹的なＭについての知識によって＜ｒg2＞およびＡ2を求める。
【００１８】
単一の流れるピークを利用するこの方法は、「ワイアットピーク」法として本願明細書に表示される。フローセル飽和が必要ではないので、はるかに小さな２００−５００μｍＬの範囲の体積しか典型的には必要とされず、そこでは、最大の溶出間隔濃度は、プラトー法で得られるであろう濃度に対応する。
【００１９】
検出器から検出器へと通る際に、サンプルピークはさらに広がり、混合および希釈により高さが減じられる。したがって、濃度検出器からの時間依存する濃度信号は、光散乱検出器に存在する時間依存する濃度を正確に複製するわけではない。光散乱信号が濃度の一次関数ではないので、光散乱および濃度の連続する値に方程式（１）を適用することは、ビリアル係数の計算においていくらかの誤差をもたらす。ワイアットピーク法における誤差は、検出器間の拡大が増加するにつれ、かつ濃度への線形依存からのＭＡＬＳ信号の偏差が増加するにつれて、すなわちＦＯＭが大きくなるにつれて増加する。
【００２０】
’００９の特許は、この誤差を減じることを意図した補正率を説明し、本願明細書において「トレイノフ−ワイアットピーク法」として表わされる。この方法では、異なる濃度の一連のピークが検出器に注入される。これらの注入の典型的な体積は１００−２００μＬである。検出器間拡大がない場合、各ピークにわたってＲ（θ）、ｃおよびｃ2を合計し、方程式（１）にこの合計をフィッティングすることにより、関心のあるパラメータを計算することが可能である。ここでも、拡大効果が計算に誤差を導入する。’００９の特許は、拡大がピークの幅に小さな変化しかもたらさない場合では、簡単な乗法因子によって誤差を補正できることを示す。この因子はいくつかの方法で決定することができる。最も簡単なものは、注入方法の結果を参照標準のプラトー法の結果と比較する較正方法である。それによって決定された補正率は、続く未知のサンプルに用いることができる。ガウスピークの特別な場合では、補正率はピーク幅の比から推論することができる。この方法の限界は、大きな拡大にはうまく作用しないこと、および補正率を演繹的に決定するにはさらなる努力を必要とすることである。
【００２１】
したがって、’００９の特許におけるように最小限のサンプル量について流れるピークを利用するが、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3について、検出器間拡大効果と無関係の態様でピーク形状に関する制限なしに、ピークデータを分析する方法が有利であろう。
【００２２】
異種の分子ＡおよびＢの間の相互作用を測定するクロスビリアル係数もまた、科学および産業においてさらに根本的に重要な数量である。２つの分子種の溶液のための光散乱方程式は方程式（３）に一次的に提示される。単一種の場合に関しては、自己ビリアル係数およびクロスビリアル係数は、この場合両方の種の、異なる濃度を包含する一連の注入によって測定されることができ、光散乱値および濃度値をこの方程式にフィッティングする。これは、ＭA、ＭB、＜ｒg2＞A、＜ｒg2＞B、Ａ2A、Ａ2BおよびＡ2ABについてのプラトー法に類似しており、ここでＡ2AおよびＡ2Bは「自己ビリアル係数」、Ａ2ABはクロスビリアル係数であり得る。自己ビリアル係数についてのワイアットピーク法と類似する、最小限のサンプル量を用いてクロスビリアル係数を特徴づける方法が有利であろう。
【００２３】
【数７】
【００２４】
さまざまな型のオンライン濃度検出器が公知であり、ＵＶ可視の吸光型、蛍光型、示差屈折率（ｄＲＩ）型などの検出器を含む。ｄＲＩ検出器は光散乱測定と組合せると特に有用であり、広範囲の可溶性巨大分子を測定するのに十分に用途が広い。ｄＲＩ測定の１つの欠点は、溶媒に対してタンパク質サンプルを完全に透析する必要があることである。これは、ｄＲＩ検出器が、溶解ガスと同様に、純粋な緩衝液の中にはないがタンパク質サンプルの中にあり得る、塩類および賦形剤に敏感であることとまさに同じ理由のためである。
【００２５】
透析はまた、ビリアル係数が緩衝液条件に応じて異なるので、ビリアル係数測定においても重要であり、緩衝液条件は測定が意味あるものとなるために十分に定義されていなければならない。いくつかの例では、分子の相互作用に対する緩衝液の効果はいくつかの異なる緩衝液におけるビリアル係数の測定により決定され、各緩衝液に対して同じサンプルの一定分量（aliquot）が透析されなければならない。しかしながら、透析は単調で時間のかかるプロセスとなりかねず、インライン透析と流れるピーク測定とを組合わせる手段が、これらの測定の自動化において有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許第６，６５１，００９号
【特許文献２】米国特許第６，４１１，３８３号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】化学物理学ジャーナル（Journal of Chemical Physics）第１６巻、１０９３〜１０９９頁
【非特許文献２】「重合体（Polymer）」１０の８０４−８０９頁（１９６９年）
【非特許文献３】物理学コロイド化学ジャーナル（J. Phys. Colloid Chem.）５１の１８（１９４７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
この発明の目的は、最小限のサンプル量を用いる、精度が向上し、計算の手間が減じられた、異なる濃度のサンプルの一連の注入からＭ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3を直接に決定する、本願明細書において「オンライン・ビリアル係数法」と表わされる方法を与えることである。
【００２９】
この発明の別の目的は、オンライン・ビリアル係数法に基づいて、最小限のサンプル量を用いてクロスビリアル係数を決定することである。
【００３０】
この発明のさらに別の目的は、測定と透析プロセスとを組合わせることにより自動化を増大させ、異なる溶媒に対して注入前にサンプルを透析する必要性を回避することである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】この発明の１つの好ましい実施の形態である注入弁法の重要な要素の図である。
【図２】この発明の第２の好ましい実施の形態である複式ポンプ法の重要な要素の図である。
【図３】リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のジムプロットを構築するのに用いられる、一連の注入についての９０°光散乱信号および濃度信号を示す図である。
【図４】図３のプラトーデータおよび図３のデータに適用されるプラトー法を介した標準分析に基づく、ＰＢＳに溶解したＢＳＡの従来のジムプロットである。
【図５ａ】オンライン・ビリアル係数法でリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のジムプロットを構築するのに用いられる、一連の注入についての９０°光散乱信号および濃度信号を示す図である。
【図５ｂ】個々のピークを示す、（ａ）でプロットされたデータの部分を示す図である。
【図６】図５ａおよび図５ｂのデータに適用された、オンライン・ビリアル係数分析を用いたジムプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
’００９の特許におけるように、この方法は、連続的に配置されたＭＡＬＳ検出器および濃度検出器のフローセルを通して注入するための１組のサンプル濃縮液の準備から始まる。サンプル濃縮液を形成し、かつそれを検出器に送るために用いられ得る技術のうち２つは、注入ループ／注入弁法と下記に記載される複式ポンプ法とである。異なるサンプル濃縮液のピークを形成し注入する方法の他の実施の形態は、当業者に明らかである。
【００３３】
注入弁法：
第１の好ましい実施の形態では、溶媒の流れが、回避位置にある注入弁によって検出器を通って連続的に流れる。回避位置にある間、サンプルはサンプルループにロードされる。次いで、バルブが注入位置に回転し、サンプルループがフロー経路に挿入され、サンプルが検出器に運ばれる。自動サンプル採取装置が利用可能な場合、続いて特定された濃度に自動希釈するために、サンプルの単一の原液が与えられてもよい。自動サンプル採取装置を用いて濃縮液を準備するために２つの方法がある。まず、自動サンプル採取装置がより少量の原液を徐々にサンプルループに注入し、サンプルループを満たした状態にする。
代替的には、サンプルループを満たす前に予めサンプルを希釈し、次に典型的には各濃縮液の体積と等しい体積で、希釈されたサンプルをループに注入するように、自動サンプル採取装置をプログラムすることができる。実現がより簡単なので前者の方法が好ましい。自動サンプル採取装置が存在しない場合、異なる濃度のサンプル列が、手動または当業者に公知の他の任意の方法によって、注入のために準備されてもよい。
【００３４】
複式ポンプ方法：
第２の好ましい実施の形態では、サンプル原液を供給するポンプおよび溶媒を供給する他のポンプの２つのポンプを介して、サンプルおよび溶媒が混合され、検出器を通って流される。ポンプの流量の比は、流量の合計が目標値を達成するように所望の希釈を生成するよう調整され、２つの流れは組合わせられて、検出器に達する前にミキサを通過する。たとえば希釈されたサンプルの均質化、平衡化などのために、サンプルが検出器に達する前に、流れはいつでも停止することができる。所望の希釈でサンプルの所望の体積を形成した後に、サンプル原液を与えるポンプは停止され、溶媒を与えるポンプはサンプルを検出器へと押し出して所望の合計流量値と一致するよう調整される。
【００３５】
第３の好ましい実施の形態では、これらの２つの注入方法を組合わせることができ、そこでは複式ポンプ希釈システムは希釈されたサンプルを注入ループに与える。
【００３６】
ＭＡＬＳ検出器および濃度検出器に達する際、これらの検出器によって測定される信号はコンピュータによって取得され、分子特性を計算するために格納され、処理される。
【００３７】
この計算は、サンプルが１つの検出器から次の検出器までの経路で希釈されているが、失われるサンプルはないという事実を説明する。濃度および角度の冪乗の級数展開としての通常の過剰レイリー比の表現の代わりに（方程式（１）を参照）、ジム方程式が反転され、標準ジム方程式と同じ近似次数で、過剰レイリー比および角度の冪乗の級数展開としての濃度の表現を与える。新しい方程式は光散乱データに適用され、ＭＡＬＳ検出器を通過するピークの各点における濃度を得る。次いで、両方の検出器における濃度信号が積分されて各ピークの合計サンプル質量を得る。これらの質量が等しいと仮定されるので、２つの検出器からの積分値は等しくなり得る。異なる濃度のピークの列すべてについてこの手順が繰返され、結果が方程式にフィッティングされて、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3パラメータが得られる。
【００３８】
この計算は、検出器を通る流量が一定であるという仮定のもとに、ピークにわたって検出器信号を積分することを含む。したがって、サンプルが検出器の中にある間に一定の流量を維持することが重要である。しかしながら、サンプルが検出器に到達するに先立って、およびベースラインに戻った後、必要に応じて、流れは停止されてもよい。
【００３９】
１．０ 単一種の解析
１．１ 理論的な説明
この計算は、ｃ＝ｃ（Ｒ*,θ）を表わすために光散乱方程式を反転することに依存する。この反転は、標準ジム方程式（１）の形式から最も容易に導き出される：
【００４０】
【数８】
【００４１】
この展開は容易に反転されて以下を生じる：
【００４２】
【数９】
【００４３】
これが光散乱検出器の内部のサンプルの瞬間的濃度を記述することに注意するのが重要である。連続して取付けられた濃度検出器における濃度は、一般に、２つの検出器間の通過時間に関連付けられる遅延を訂正した後であってさえ、検出器間拡大の前述の効果により、僅かに異なるであろう。瞬間的濃度は異なるが、各検出器を通過する各ピークにおける全質量が同一であることは質量保存により保証される。
【００４４】
オンライン・ビリアル係数測定では、濃度を積分することにより、濃度検出器およびＭＡＬＳ検出器に検出される各ピークの全質量が均等化される：
【００４５】
【数１０】
【００４６】
ここでｃiは濃度検出器によって取得される第ｉ番目の濃度測定であり、溶出された体積Δｖiにわたって平均化され、かつｃjは光散乱検出器によって取得されるデータから計算された第ｊ番目の濃度であって、溶出された体積Δｖjにわたって平均化される。便宜上、以下の表記が用いられる。ここでＲ（θ）jは、角度θで光検出器によって取得される過剰レイリー比の第ｊ番目の光散乱測定であり、溶出された体積Δｖjにわたって平均化されている：
【００４７】
【数１１】
【００４８】
方程式（５）は次のように書き直されてもよい：
【００４９】
【数１２】
【００５０】
さまざまな濃度の一連のピークからのデータを方程式（６）にフィッティングすると、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3の値が決定される。同様の方法で、Ｒ（θ,ｃ）のいかなる次数へのビリアル展開も反転することができ、比較できる次数でｃ（θ,Ｒ）を得る。体積要素の大きさは、溶出時間および流量から決定される。ＭＡＬＳ検出器および濃度検出器が連続して接続されるので、両方を通る流量は同一であり、体積要素は時間要素ΔｔiおよびΔｔjと置換されてもよい。検出器間バンド拡大は瞬間的濃度（ｃmi）に影響するが、積分された濃度（ｃm）には影響しないことは重要な観察結果である。したがって方程式（６）は検出器間バンド拡大に依存せず、これは従前の方法に比べてこの方法の主要な利点となる。
【００５１】
この方法は、両方の検出器を通って溶出する全質量が等しいと仮定する。したがって、測定値と計算値とで、溶出するサンプルのすべてを本質的に含むのに十分なさまざまな溶出する体積要素をカバーしなければならない。
【００５２】
１．２ 測定装置および手順
初期の濃度ｃ1,ｃ2,…ｃnの１組のサンプルが１組の検出器に連続して注入される。これらの検出器は、図１に示されるように、複数の角度θkに光検出器を含むＭＡＬＳ検出器および濃度検出器である。ＭＡＬＳ検出器の１つの例は、カリフォルニア州サンタバーバラのワイアットテクノロジー株式会社（Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA）のＤＡＷＮ−ＨＥＬＥＯＳであり、濃度検出器の例は、やはりワイアットテクノロジー株式会社のＯｐｔｉｌａｂ ｒＥＸである。典型的な実施の形態では、濃度級数はｃm＝ｍΔｃに対応し、ここでｍは１からｎまでの整数値をとり、Δｃは固定された濃度ステップである。サンプルピークがシステムを通して流れる間に希釈されて広がるので、実際のピーク濃度は元の値とは異なる。サンプルはポンプによって検出器を通して連続的に流れるようにされる。サンプルが検出器を通過する間、検出器からデータが取得され、以前に説明したフィッティング手順を実行するコンピュータによって格納され、分析される。
【００５３】
第１の実施の形態には、図１に示される「注入弁法」が表わされ、溶媒は、脱気器３を通って溶媒貯槽２からポンプ手段１によって引き出され、次にフィルタ手段４を通して注入弁ポンプ１１ならびに検出器８および９に向かってポンプ送りされる。脱気器３は一般に溶媒から溶解したガスを取り除くために用いられる。なぜならばそのようなガスは、溶液自体からの所望の測定に干渉しかねない、小さな気泡を後に溶液に生成し得るからである。フィルタ手段４が一般に組込まれ、示されるように、所望の測定に干渉しかねない残りの微粒子材料を前記溶媒から取除く。ポンプ手段の１つの例は、カリフォルニア州サンタクララのアジレント・テクノロジー社（Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA）のＧ１３１０型のアイソクラチックポンプである。脱気器の例は、ワシントン州オークハーバーのアップチャーチ・サイエンティフィック社（Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA）から入手可能なシステックマルチチャネル真空脱気器（Systec Multi-Channel Vacuum Degasser）である。溶媒がサンプルループ１２を通って流れないように、溶媒は回避位置に設定される注入弁１１を通って流れる。注入弁の例は、やはりアップチャーチ・サイエンティフィック社の７７２５型の分析的注入器である。サンプル５の一定分量は
注入器手段６によってサンプルループ１２に転送される。その重み平均モル質量、平均二乗半径、および第２、第３のビリアル係数はこの発明の方法によって導き出される。サンプル移動が完了すると、注入弁は注入位置に切り替えられ、その結果、溶媒はサンプルループ１２を通して流れ、検出器８および９にサンプルを運ぶ。さまざまな濃縮液を前もって準備することができ、サンプルループに手動で注入することができる。代替的には、それらは前もって準備され、自動サンプル採取装置によって注入されてもよい。好ましい実施の形態では、同じくアジレント・テクノロジー社の１３２９Ａなどの商業用自動サンプル採取装置は、ガラス瓶内で異なる体積の原液および溶媒を混合することによりサンプルの原液から濃縮液を形成するようにプログラムされている。別の好ましい実施の形態では、異なる体積の原液をサンプルループに直接注入するように自動サンプル採取装置をプログラムすることにより濃縮液が形成される。そこではサンプルループが溶媒で満たされ、サンプルループ中で混合することによって希釈が生じるように、注入体積はループ体積よりも小さい。優先的に、サンプルの濃度は桁にまたがるか、それ以上となる。
【００５４】
第２の実施の形態では、図２に示される「複式ポンプ法」を表わし、コンピュータに制御される２つのポンプ２１ａおよび２１ｂ、たとえば、ネバダ州リノのハミルトン社（Hamilton Corp., Reno, NV）のＭｉｃｒｏｌａｂ５００デュアルシリンジ希釈器／ディスペンサ（Microlab 500 Dual-Syringe Diluter/Dispenser）は、２つの独立して制御可能なシリンジポンプを含み、これらが用いられてサンプル貯槽２２からサンプルを引出し、溶媒貯槽２３から溶媒を引出す。これらは脱気チャンバ２４ａおよび２４ｂを通して転送され、フィルタ２５ａおよび２５ｂを通してポンプ送りされる。２つのポンプの流量はコンピュータによって調整され、流れは、所望の濃度のサンプルの連続的な流れを生成するために、たとえばカリフォルニア州エルソブランテのアナリティカル・サイエンティフィック・インスツルメンツ社（Analytical Scientific Instruments, El Sobrante, CA）から入手可能なハイパーシアー（Hypershear）インラインスタティックミキサなどの混合チャンバを通して組み合わされ、ポンプ送りされる。混合されたサンプルは、混合チャンバ、管材料、脱塩カラムおよび必要に応じた任意の付加的な体積を含む保持体積２６に一時的に格納されてもよい。混合されたサンプルの所望の体積が保持体積に注入された後、サンプル原液の流れは停止され、溶媒は、サンプルが保持体積から検出器を通って所望の流量で流れるようにするために、ポンプ２１ａによってポンプ送りされる。希釈の好ましい範囲は前の実施の形態における範囲と同じである。
【００５５】
当業者に明らかなように、第３の実施の形態では、複式ポンプ法におけるように１対のポンプで連続するサンプル濃度を形成し、混合されたサンプルをサンプルループに注入して、注入弁法におけるように、注入弁を切り替える際に付加的なポンプ手段によってサンプルが検出器に押出される。
【００５６】
サンプルが予めの透析を必要とする場合、脱塩カラム７、たとえばスウェーデン、ウプサラのアマシャム・バイサイエンス社（Amersham BioSciences, Uppsala, Sweden）から入手可能なＨｉＴｒａｐ脱塩カラムなどがＭＡＬＳ検出器８の前に配置されてもよい。
【００５７】
各連続サンプル５はＭＡＬＳ検出器８を通過し、それによって各角度における過剰レイリー比の値、Ｒj（θk）は、連続的な溶出体積Δｖjで、示差屈折率（ｄＲＩ）検出器として示された濃度検出器９を通して測定される。それによってサンプル濃度ｃiは各体積間隔Δｖiで測定される。次いで、結果的な光散乱信号および濃度信号は、各注入された一定分量ｍ、値Ｃm、Ｒ1,mk、Ｒ2,mk、およびＲ3,mkについて計算するため、コンピュータ手段１０によって格納され処理される。コンピュータ手段１０はまた、計算された結果を方程式（６）にフィッティングすることにより、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3を含む分子特性を計算する。分子特性を抽出するためにさまざまなフィッティング手順が実現され得る。角度依存が無視できる場合、またはＡ3項が無視できる場合、線形の最小二乗法は
１つの好ましい実施の形態である。別の好ましい実施の形態ではフィッティング手順は、レーベンバーグ−マルカート・アルゴリズム（Levenberg-Marquardt algorithm）を使用する非線形の最小二乗法から構成される。当業者には公知なように、さらなる高位項をすべて維持することがデータの質またはＦＯＭのメリットにならないならば、より下位の次数のフィッティング、たとえばＡ3項を取除くことなどが実行されてもよい。
【００５８】
サンプル濃度検出器９はｄＲＩ検出器であってもよいが、紫外線検出器または可視光線吸収検出器が代用されてもよい。蒸発性光散乱検出器が用いられて各溶出するサンプルの濃度をモニタしてもよいが、このような装置は、応答が一般に非線形なので、特別な較正を必要とする場合がある。他のオンライン検出器は当業者に公知である。
【００５９】
当業者に明らかなこととして、測定されたデータの方程式（６）の形式に対するフィッティングは、線形の最小二乗法、レーベンバーグ−マルカート法、または他のアルゴリズムのいずれによって行われたとしても統計的な重みづけを含むことができ、それにより、これらのフィッティングの実行に用いられるデータは、その測定された標準偏差によって重みづけされる。
【実施例１】
【００６０】
１．３ 方法の実施例
この方法の実用性を実証するために、水性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解されたウシの血清アルブミンＢＳＡの分子パラメータの測定が示される。シグマ・オルドリッチ株式会社（Sigma-Aldrich Corporation）のサンプルは、６６，４００の単量体分子量（実際の重み平均モル質量は、二量体および三量体の低濃度の存在により、僅かに大きい）と、（静的な光散乱技術を用いて）可視光線散乱により測定可能な限界を下回る、平均二乗半径とを有する。
【００６１】
サンプルは２つの方法を用いて特徴づけられた。第１の方法はプラトー法である。サンプル原液は１０ｇ／ｌの濃度で準備された。原液および溶媒は脱気チャンバを通して引き出され、フィルタされ、固定された濃度間隔で、トリプルシリンジポンプ希釈器／ディスペンサによってスタティックミキサにおいて所望の濃度級数まで混合された。フローセルを満たし、かつ各信号をプラトーに導くように、十分に多量のサンプル（２ｍＬ）が、連続的に接続されたＭＡＬＳ検出器および濃度検出器に注入された。９０°光散乱検出器２７からの生の信号および濃度検出器２８からの未処理信号が図３に示される。プラトーは明確に目に見え、各ピークのプラトー上の小さな範囲のデータが平均化され、図４に示されるジムプロットを生成するために用いられた。測定された量は、Ｍ＝６７，７６０±０．０５ｋＤおよびＡ2＝１．３３±０．０１×１０-4ｍｏｌ・ｍＬ／ｇ2である。データは高品質であるが、比較的多量のサンプル（一定分量当たり〜２ｍＬ）が必要である。
【００６２】
第２の方法がこの発明の主題である。注入当たり僅かに２００μｌしか用いずに同じサンプル濃縮液が複式ポンプ方法を介して注入されたので、その結果フローセルが完全には満たされず、プラトーが達成されなかった。データは図５ａおよび図５ｂに示される。９０°光散乱信号２９がｄＲＩ検出器信号３０と重なって示される。双方ともベースラインが差し引かれている。各注入から、Ｃm、Ｒ1,mk、Ｒ2,mk、およびＲ3,mkが計算される。線形の最小二乗法を用いた、方程式（６）への結果的なフィッティングは図６に示される。得られた結果は、Ｍ＝６６，７００±０．０３ｋＤおよびＡ2＝１．１７±０．０１×１０-4ｍｏｌ・ｍＬ／ｇ2であった。これらの値は、プラトー法によって得られた値とうまく合う。
【００６３】
２．０ ２種の解析：
２．１ 理論的な説明：
溶媒に存在する２つの関連しない巨大分子種についての濃度において最大２次までの光散乱方程式が方程式（７）で与えられる：
【００６４】
【数１３】
【００６５】
ここで、ｄｎ／ｄｃAおよびｄｎ／ｄｃBは、種ＡおよびＢの示差屈折増分であり、ＭAおよびＭBは種ＡおよびＢの重み平均モル質量であり、ｃAおよびｃBは種ＡおよびＢの濃度であり、ＰA（θ）およびＰB（θ）は、種ＡおよびＢが＜ｒg2＞Aおよび＜ｒg2＞Bを仮定することによる角分布であり、Ａ2AおよびＡ2Bは種ＡおよびＢの自己ビリアル係数であり、Ａ2ABは種ＡおよびＢのクロスビリアル係数である。値ＭA、ＭB、＜ｒg2＞A、＜ｒg2＞B、Ａ2AおよびＡ2Bは上述の単一種の方法によって決定され得る。
【００６６】
残りのパラメータＡ2ABは、ここで２つの種を組合わせる測定で決定され得る。この測定は、異なる濃度の種Ａおよび種Ｂを備えたサンプル列から構成され、オンライン・ビリアル係数法の利点を享受するために、小さい、継続的に流れる一定分量から構成される。
【００６７】
単一の散乱する種について上述されたように方程式を反転するためには、付加的な関係が必要である。この関係については、各一定分量ｍの注入の全体にわたって、たとえ混合が両方の種に等しく影響するからこれらの濃度の大きさが異なっても、ｃBのｃAに対する比ｆmは（それが装置によって決定されるので）一定であり、かつ知られている、と安全に仮定することができる：
【００６８】
【数１４】
【００６９】
方程式（７）および（８）は、ｃA＝ｃA（Ｒ,θ）を表現するために反転され得るＲ＝Ｒ（ｃA,θ）のための式を与えるよう組合わせられ得る：
【００７０】
【数１５】
【００７１】
ここでＲまたはｓｉｎ2（θ／２）の２次よりも高次数の項が無視されており、以下の変数が規定される：
【００７２】
【数１６】
【００７３】
および
【００７４】
【数１７】
【００７５】
濃度信号から計算されるような各注入ｍにおけるＡの全質量は、質量保存によって、方程式（９）および（５）によって光散乱から得られた質量と等しくされ得る：
【００７６】
【数１８】
【００７７】
ここで、
【００７８】
【数１９】
【００７９】
【数２０】
【００８０】
さまざまな値のｃAおよびｃBにわたって測定を行ない、その結果を方程式（１０）および（１１）にフィッティングすることにより、クロスビリアル係数Ａ2ABが決定される。
【００８１】
当業者にとって明白なように、ビリアル展開の次数は、より高位のパラメータ、たとえばＡ3AまたはＡ3Bを含むために増大されてもよい。
【００８２】
２．２ 測定装置および手順
この測定は、サンプルが次のものを含む場合以外は、単一種の測定に関して進められる：１）種Ａだけの一連の濃縮液；２）種Ｂだけの一連の濃縮液；ならびに、３）ＡおよびＢの両方を異なる濃度で含むサンプル列、である。部分（１）および（２）は、Ａ2ABの一義的な測定値を得るために必要である。
【００８３】
１つの好ましい実施の形態では、ｃBに対するｃAの比はすべての２つの構成要素の一定分量の全体にわたって固定され、その結果、２つのサンプルのモル濃度の比が１：１である。
【００８４】
別の好ましい実施の形態では、ＡおよびＢの割合は、固定された濃度合計において純粋なＡから純粋なＢまでの比の全範囲にわたる２つの構成要素一定分量の全体にわたって、変動する。
【００８５】
装置は、好ましい実施の形態において複式ポンプがトリプルポンプと置換される以外は、単一種の測定の装置に類似し、各ポンプは、種Ａ、種Ｂ、そして溶媒をポンプ送りするよう、コンピュータによって制御可能である。このようなトリプルポンプはカリフォルニア州サンタバーバラのワイアット・テクノロジー株式会社から入手可能なカリプソ（Calypso）システムである。
【００８６】
光散乱技術の当業者に明らかなように、ここに発明し記述した方法には、彼らが実行できるように列挙した根本的な要素から逸脱することなく、多くの明白な変形がある。そのような変形は、本願明細書で前述したこの発明の明白な実現例にすぎず、下記に記載する請求項を参照することによって含まれるものである。
【背景技術】
【０００１】
溶液の分子は、その重み平均モル質量Ｍ、第２のビリアル係数Ａ2、および以下で表わされる平均二乗半径によって、一般に特徴づけられる。
【０００２】
【数１】
【０００３】
（ここでｒは分子の質量中心からの距離であり、ｄｍはその距離における少量の質量である）。ある場合には、第３のビリアル係数Ａ3にも注意される。他の場合には、２つの区別できる分子ＡとＢとの間のクロスビリアル係数Ａ2ABに注意される。Ｍおよび＜ｒg2＞は、溶液のすべての分子にわたって平均された、個別の分子の特性である。ビリアル係数は、溶媒によって媒介される間の分子間の平均相互作用の測定単位である。分留されていない溶液については、これらの特性は、化学物理学ジャーナル（Journal of Chemical Physics）第１６巻、１０９３〜１０９９頁に掲載されたブルーノ・ジム（Ｂｒｕｎｏ Ｚｉｍｍ）による１９４８年の研究論文に記載された方法を用いて、それらの光が散乱される態様を測定することにより決定され得る。少量の溶液から散乱した光は、さまざまな角度および濃度にわたって測定される。さまざまな散乱角にわたる光散乱データの集合は、より一般的には、多角度光散乱、ＭＡＬＳと呼ばれる。単一の種類の分子の光散乱測定から導き出される特性は、ジムによって開発され、「重合体（Polymer）」１０の８０４−８０９頁（１９６９年）においてＷ．Ａ．Ｊ．ブライス（W.A. J. Bryce）によって訂正された以下の公式を通して関連付けられる：
【０００４】
【数２】
【０００５】
ここで、Ｒ*（ｃ,θ）＝Ｒ（ｃ,θ）／Ｋ*であり、Ｒ（ｃ,θ）は、Ｒ（θ）＝［Ｉs（θ）−Ｉsolv（θ）］ｒ2／［ＩOＶ］として定義される単位角当りの方向θにおける測定された過剰レイリー比（excess Rayleigh ratio）であり、Ｉs（θ）は、角度の関数として単位角当りの溶液によって散乱した光の強度、Ｉsolv（θ）は、角度の関数として単位角当りの溶媒から散乱した光の強度、ＩOは入射強度、ｒは散乱した体積から検出器までの距離、Ｖは検出器で読取られる照らされた体積であって、Ｋ＝４π2ｎ02／（ＮAλ04）、かつＫ*＝Ｋ（ｄｎ／ｄｃ）2であって、ＮAはアボガドロ数であり、ｄｎ／ｄｃは屈折率増分であり、ｎ0は溶媒屈折率であり、λ0は真空における入射光の波長である。Ｐ（θ）は以下の式によって定義される分散分子の形状因子である：
【０００６】
【数３】
【０００７】
Ｐ（θ）の一般的形式は、Ｐ．デバイ（Ｐ．Ｄｅｂｙｅ）によって物理学コロイド化学ジャーナル（J. Phys. Colloid Chem.）５１の１８（１９４７年）において以下のように導き出された：
【０００８】
【数４】
【０００９】
Ｐ1は、
【００１０】
【数５】
【００１１】
によって平均二乗半径に関連し、ｋ＝２π／λであって、λは溶媒における入射光の波長である。Ｐ2は、
【００１２】
【数６】
【００１３】
によって、平均二乗半径＜ｒg2＞および平均四乗半径＜ｒg4＞に関連する。この方程式は、濃度およびｓｉｎ2（θ／２）の冪乗における級数展開に基づいた近似値である。そのため、精度は、さらなる高次項の相対的な大きさに依存する。
【００１４】
この測定を行なうための、「プラトー法」としても公知である標準的方法は、公知の値の濃度が増加するサンプル列を準備することと、サンプルを包含するガラス瓶を光ビームに挿入することによって、またはビームに位置するフローセルにサンプルを注入することによって、サンプルを連続してＭＡＬＳ検出器に導入することと、光検出器によって各角度における散乱された強度を得ることと、各濃度および各角度について過剰レイリー比を計算することと、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3を抽出するために方程式（１）にデータをフィッティングすることとを含む。
【００１５】
いくらかの以前のサンプルまたは溶液を包含しているフローセルにサンプルを注入する場合には、セルを「過剰供給する」ため、すなわち、セル内の濃度を本来の公知のサンプル濃度にするために、十分な体積が注入されなければならない。これは、散乱信号を観察し、信号対時間の値が停滞状態（plateau）に達するまでサンプルを流すことによって達成され得、それは指数関数的な依存を伴って漸近的に生じる。代替的には、フローセルを備えた濃度検出器がフロー経路に加えられてもよく、またＭＡＬＳ信号および濃度信号の両方が時間が経つと停滞状態に達するように、十分なサンプルが注入されなければならない。このように、ＭＡＬＳ検出器における濃度は濃度検出器における濃度から推論されることができ、方程式（１）におけるＲおよびｃの値を与える。フローセルを飽和させるのに必要な注入あたりの典型的な体積は１−３ｍＬである。
【００１６】
各セルの正確な濃度値への漸近的手法を認識すると、下からではなく上から漸近的に正確な濃度に接近する、減少する級数とともに増大する濃度級数に従うことにより、さらに正確な測定が得られる。２つの測定（増大する濃度および低下する濃度）の平均値は、２倍のサンプル合計および２倍の測定時間を犠牲にするが、より正確な計算をもたらす。ト
レイノフ（Ｔｒａｉｎｏｆｆ）らによる米国特許第６，６５１，００９号（以下、’００９の特許と称する）に従うと、純粋な質量項に相対して光散乱方程式のビリアル展開でのＡ2およびＡ3項の大きさを記述する、良度指数ＦＯＭを規定することができる。これらは方程式（１）から、それぞれ２Ａ2Ｍｃ−４Ａ22Ｍ2c2および３Ａ3Ｍc2として容易に導き出せる。光散乱がそのようなビリアル展開によって記述され得るという仮定は、方程式の収束を意味する。すなわち、連続的な高次項の大きさがかなり素早く低下する。換言すれば、１＞＞ＦＯＭ（Ａ2）＞＞ＦＯＭ（Ａ3）であり、良度指数が小さいほどより良い近似値となる。他方では、信頼できる測定値を得るためには良度指数が何らかの有限値でなければならないことは、信号対雑音を考慮しても明らかである。特定のサンプルおよび機器について、Ａ2およびＡ3を決定するためのＦＯＭの望ましい上限および下限は、これらの考慮によって設定される。
【００１７】
米国特許第６，４１１，３８３号では、ワイアット（Wyatt）は、ＭＡＬＳ検出器および濃度検出器を通して流れる有限体積の分留されていないサンプルの単一の注入を用いて、Ｍ、＜ｒg2＞、およびＡ2を測定するための関連する方法を記載する。このサンプル注入の前後には十分な純粋な溶媒が与えられ、ＭＡＬＳ信号および濃度信号をベースライン（Ｉsolv）に戻し、その注入は信号において「ピーク」と表示される。サンプルの有限な性質のために、サンプルがシステムを通して流れる際、サンプルは希釈され、広がって、注入の異なる部分が異なる濃度を示す。注入ごとに単一の値のＩ（θ）およびｃを備えた複数の注入に対して方程式（１）を用いる代わりに、発明者は、単一のピークにわたるＩ（θ）、ｃおよびｃ2の合計を計算し、方程式（１）および演繹的なＭについての知識によって＜ｒg2＞およびＡ2を求める。
【００１８】
単一の流れるピークを利用するこの方法は、「ワイアットピーク」法として本願明細書に表示される。フローセル飽和が必要ではないので、はるかに小さな２００−５００μｍＬの範囲の体積しか典型的には必要とされず、そこでは、最大の溶出間隔濃度は、プラトー法で得られるであろう濃度に対応する。
【００１９】
検出器から検出器へと通る際に、サンプルピークはさらに広がり、混合および希釈により高さが減じられる。したがって、濃度検出器からの時間依存する濃度信号は、光散乱検出器に存在する時間依存する濃度を正確に複製するわけではない。光散乱信号が濃度の一次関数ではないので、光散乱および濃度の連続する値に方程式（１）を適用することは、ビリアル係数の計算においていくらかの誤差をもたらす。ワイアットピーク法における誤差は、検出器間の拡大が増加するにつれ、かつ濃度への線形依存からのＭＡＬＳ信号の偏差が増加するにつれて、すなわちＦＯＭが大きくなるにつれて増加する。
【００２０】
’００９の特許は、この誤差を減じることを意図した補正率を説明し、本願明細書において「トレイノフ−ワイアットピーク法」として表わされる。この方法では、異なる濃度の一連のピークが検出器に注入される。これらの注入の典型的な体積は１００−２００μＬである。検出器間拡大がない場合、各ピークにわたってＲ（θ）、ｃおよびｃ2を合計し、方程式（１）にこの合計をフィッティングすることにより、関心のあるパラメータを計算することが可能である。ここでも、拡大効果が計算に誤差を導入する。’００９の特許は、拡大がピークの幅に小さな変化しかもたらさない場合では、簡単な乗法因子によって誤差を補正できることを示す。この因子はいくつかの方法で決定することができる。最も簡単なものは、注入方法の結果を参照標準のプラトー法の結果と比較する較正方法である。それによって決定された補正率は、続く未知のサンプルに用いることができる。ガウスピークの特別な場合では、補正率はピーク幅の比から推論することができる。この方法の限界は、大きな拡大にはうまく作用しないこと、および補正率を演繹的に決定するにはさらなる努力を必要とすることである。
【００２１】
したがって、’００９の特許におけるように最小限のサンプル量について流れるピークを利用するが、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3について、検出器間拡大効果と無関係の態様でピーク形状に関する制限なしに、ピークデータを分析する方法が有利であろう。
【００２２】
異種の分子ＡおよびＢの間の相互作用を測定するクロスビリアル係数もまた、科学および産業においてさらに根本的に重要な数量である。２つの分子種の溶液のための光散乱方程式は方程式（３）に一次的に提示される。単一種の場合に関しては、自己ビリアル係数およびクロスビリアル係数は、この場合両方の種の、異なる濃度を包含する一連の注入によって測定されることができ、光散乱値および濃度値をこの方程式にフィッティングする。これは、ＭA、ＭB、＜ｒg2＞A、＜ｒg2＞B、Ａ2A、Ａ2BおよびＡ2ABについてのプラトー法に類似しており、ここでＡ2AおよびＡ2Bは「自己ビリアル係数」、Ａ2ABはクロスビリアル係数であり得る。自己ビリアル係数についてのワイアットピーク法と類似する、最小限のサンプル量を用いてクロスビリアル係数を特徴づける方法が有利であろう。
【００２３】
【数７】
【００２４】
さまざまな型のオンライン濃度検出器が公知であり、ＵＶ可視の吸光型、蛍光型、示差屈折率（ｄＲＩ）型などの検出器を含む。ｄＲＩ検出器は光散乱測定と組合せると特に有用であり、広範囲の可溶性巨大分子を測定するのに十分に用途が広い。ｄＲＩ測定の１つの欠点は、溶媒に対してタンパク質サンプルを完全に透析する必要があることである。これは、ｄＲＩ検出器が、溶解ガスと同様に、純粋な緩衝液の中にはないがタンパク質サンプルの中にあり得る、塩類および賦形剤に敏感であることとまさに同じ理由のためである。
【００２５】
透析はまた、ビリアル係数が緩衝液条件に応じて異なるので、ビリアル係数測定においても重要であり、緩衝液条件は測定が意味あるものとなるために十分に定義されていなければならない。いくつかの例では、分子の相互作用に対する緩衝液の効果はいくつかの異なる緩衝液におけるビリアル係数の測定により決定され、各緩衝液に対して同じサンプルの一定分量（aliquot）が透析されなければならない。しかしながら、透析は単調で時間のかかるプロセスとなりかねず、インライン透析と流れるピーク測定とを組合わせる手段が、これらの測定の自動化において有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許第６，６５１，００９号
【特許文献２】米国特許第６，４１１，３８３号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】化学物理学ジャーナル（Journal of Chemical Physics）第１６巻、１０９３〜１０９９頁
【非特許文献２】「重合体（Polymer）」１０の８０４−８０９頁（１９６９年）
【非特許文献３】物理学コロイド化学ジャーナル（J. Phys. Colloid Chem.）５１の１８（１９４７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
この発明の目的は、最小限のサンプル量を用いる、精度が向上し、計算の手間が減じられた、異なる濃度のサンプルの一連の注入からＭ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3を直接に決定する、本願明細書において「オンライン・ビリアル係数法」と表わされる方法を与えることである。
【００２９】
この発明の別の目的は、オンライン・ビリアル係数法に基づいて、最小限のサンプル量を用いてクロスビリアル係数を決定することである。
【００３０】
この発明のさらに別の目的は、測定と透析プロセスとを組合わせることにより自動化を増大させ、異なる溶媒に対して注入前にサンプルを透析する必要性を回避することである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】この発明の１つの好ましい実施の形態である注入弁法の重要な要素の図である。
【図２】この発明の第２の好ましい実施の形態である複式ポンプ法の重要な要素の図である。
【図３】リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のジムプロットを構築するのに用いられる、一連の注入についての９０°光散乱信号および濃度信号を示す図である。
【図４】図３のプラトーデータおよび図３のデータに適用されるプラトー法を介した標準分析に基づく、ＰＢＳに溶解したＢＳＡの従来のジムプロットである。
【図５ａ】オンライン・ビリアル係数法でリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のジムプロットを構築するのに用いられる、一連の注入についての９０°光散乱信号および濃度信号を示す図である。
【図５ｂ】個々のピークを示す、（ａ）でプロットされたデータの部分を示す図である。
【図６】図５ａおよび図５ｂのデータに適用された、オンライン・ビリアル係数分析を用いたジムプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
’００９の特許におけるように、この方法は、連続的に配置されたＭＡＬＳ検出器および濃度検出器のフローセルを通して注入するための１組のサンプル濃縮液の準備から始まる。サンプル濃縮液を形成し、かつそれを検出器に送るために用いられ得る技術のうち２つは、注入ループ／注入弁法と下記に記載される複式ポンプ法とである。異なるサンプル濃縮液のピークを形成し注入する方法の他の実施の形態は、当業者に明らかである。
【００３３】
注入弁法：
第１の好ましい実施の形態では、溶媒の流れが、回避位置にある注入弁によって検出器を通って連続的に流れる。回避位置にある間、サンプルはサンプルループにロードされる。次いで、バルブが注入位置に回転し、サンプルループがフロー経路に挿入され、サンプルが検出器に運ばれる。自動サンプル採取装置が利用可能な場合、続いて特定された濃度に自動希釈するために、サンプルの単一の原液が与えられてもよい。自動サンプル採取装置を用いて濃縮液を準備するために２つの方法がある。まず、自動サンプル採取装置がより少量の原液を徐々にサンプルループに注入し、サンプルループを満たした状態にする。
代替的には、サンプルループを満たす前に予めサンプルを希釈し、次に典型的には各濃縮液の体積と等しい体積で、希釈されたサンプルをループに注入するように、自動サンプル採取装置をプログラムすることができる。実現がより簡単なので前者の方法が好ましい。自動サンプル採取装置が存在しない場合、異なる濃度のサンプル列が、手動または当業者に公知の他の任意の方法によって、注入のために準備されてもよい。
【００３４】
複式ポンプ方法：
第２の好ましい実施の形態では、サンプル原液を供給するポンプおよび溶媒を供給する他のポンプの２つのポンプを介して、サンプルおよび溶媒が混合され、検出器を通って流される。ポンプの流量の比は、流量の合計が目標値を達成するように所望の希釈を生成するよう調整され、２つの流れは組合わせられて、検出器に達する前にミキサを通過する。たとえば希釈されたサンプルの均質化、平衡化などのために、サンプルが検出器に達する前に、流れはいつでも停止することができる。所望の希釈でサンプルの所望の体積を形成した後に、サンプル原液を与えるポンプは停止され、溶媒を与えるポンプはサンプルを検出器へと押し出して所望の合計流量値と一致するよう調整される。
【００３５】
第３の好ましい実施の形態では、これらの２つの注入方法を組合わせることができ、そこでは複式ポンプ希釈システムは希釈されたサンプルを注入ループに与える。
【００３６】
ＭＡＬＳ検出器および濃度検出器に達する際、これらの検出器によって測定される信号はコンピュータによって取得され、分子特性を計算するために格納され、処理される。
【００３７】
この計算は、サンプルが１つの検出器から次の検出器までの経路で希釈されているが、失われるサンプルはないという事実を説明する。濃度および角度の冪乗の級数展開としての通常の過剰レイリー比の表現の代わりに（方程式（１）を参照）、ジム方程式が反転され、標準ジム方程式と同じ近似次数で、過剰レイリー比および角度の冪乗の級数展開としての濃度の表現を与える。新しい方程式は光散乱データに適用され、ＭＡＬＳ検出器を通過するピークの各点における濃度を得る。次いで、両方の検出器における濃度信号が積分されて各ピークの合計サンプル質量を得る。これらの質量が等しいと仮定されるので、２つの検出器からの積分値は等しくなり得る。異なる濃度のピークの列すべてについてこの手順が繰返され、結果が方程式にフィッティングされて、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3パラメータが得られる。
【００３８】
この計算は、検出器を通る流量が一定であるという仮定のもとに、ピークにわたって検出器信号を積分することを含む。したがって、サンプルが検出器の中にある間に一定の流量を維持することが重要である。しかしながら、サンプルが検出器に到達するに先立って、およびベースラインに戻った後、必要に応じて、流れは停止されてもよい。
【００３９】
１．０ 単一種の解析
１．１ 理論的な説明
この計算は、ｃ＝ｃ（Ｒ*,θ）を表わすために光散乱方程式を反転することに依存する。この反転は、標準ジム方程式（１）の形式から最も容易に導き出される：
【００４０】
【数８】
【００４１】
この展開は容易に反転されて以下を生じる：
【００４２】
【数９】
【００４３】
これが光散乱検出器の内部のサンプルの瞬間的濃度を記述することに注意するのが重要である。連続して取付けられた濃度検出器における濃度は、一般に、２つの検出器間の通過時間に関連付けられる遅延を訂正した後であってさえ、検出器間拡大の前述の効果により、僅かに異なるであろう。瞬間的濃度は異なるが、各検出器を通過する各ピークにおける全質量が同一であることは質量保存により保証される。
【００４４】
オンライン・ビリアル係数測定では、濃度を積分することにより、濃度検出器およびＭＡＬＳ検出器に検出される各ピークの全質量が均等化される：
【００４５】
【数１０】
【００４６】
ここでｃiは濃度検出器によって取得される第ｉ番目の濃度測定であり、溶出された体積Δｖiにわたって平均化され、かつｃjは光散乱検出器によって取得されるデータから計算された第ｊ番目の濃度であって、溶出された体積Δｖjにわたって平均化される。便宜上、以下の表記が用いられる。ここでＲ（θ）jは、角度θで光検出器によって取得される過剰レイリー比の第ｊ番目の光散乱測定であり、溶出された体積Δｖjにわたって平均化されている：
【００４７】
【数１１】
【００４８】
方程式（５）は次のように書き直されてもよい：
【００４９】
【数１２】
【００５０】
さまざまな濃度の一連のピークからのデータを方程式（６）にフィッティングすると、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3の値が決定される。同様の方法で、Ｒ（θ,ｃ）のいかなる次数へのビリアル展開も反転することができ、比較できる次数でｃ（θ,Ｒ）を得る。体積要素の大きさは、溶出時間および流量から決定される。ＭＡＬＳ検出器および濃度検出器が連続して接続されるので、両方を通る流量は同一であり、体積要素は時間要素ΔｔiおよびΔｔjと置換されてもよい。検出器間バンド拡大は瞬間的濃度（ｃmi）に影響するが、積分された濃度（ｃm）には影響しないことは重要な観察結果である。したがって方程式（６）は検出器間バンド拡大に依存せず、これは従前の方法に比べてこの方法の主要な利点となる。
【００５１】
この方法は、両方の検出器を通って溶出する全質量が等しいと仮定する。したがって、測定値と計算値とで、溶出するサンプルのすべてを本質的に含むのに十分なさまざまな溶出する体積要素をカバーしなければならない。
【００５２】
１．２ 測定装置および手順
初期の濃度ｃ1,ｃ2,…ｃnの１組のサンプルが１組の検出器に連続して注入される。これらの検出器は、図１に示されるように、複数の角度θkに光検出器を含むＭＡＬＳ検出器および濃度検出器である。ＭＡＬＳ検出器の１つの例は、カリフォルニア州サンタバーバラのワイアットテクノロジー株式会社（Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA）のＤＡＷＮ−ＨＥＬＥＯＳであり、濃度検出器の例は、やはりワイアットテクノロジー株式会社のＯｐｔｉｌａｂ ｒＥＸである。典型的な実施の形態では、濃度級数はｃm＝ｍΔｃに対応し、ここでｍは１からｎまでの整数値をとり、Δｃは固定された濃度ステップである。サンプルピークがシステムを通して流れる間に希釈されて広がるので、実際のピーク濃度は元の値とは異なる。サンプルはポンプによって検出器を通して連続的に流れるようにされる。サンプルが検出器を通過する間、検出器からデータが取得され、以前に説明したフィッティング手順を実行するコンピュータによって格納され、分析される。
【００５３】
第１の実施の形態には、図１に示される「注入弁法」が表わされ、溶媒は、脱気器３を通って溶媒貯槽２からポンプ手段１によって引き出され、次にフィルタ手段４を通して注入弁ポンプ１１ならびに検出器８および９に向かってポンプ送りされる。脱気器３は一般に溶媒から溶解したガスを取り除くために用いられる。なぜならばそのようなガスは、溶液自体からの所望の測定に干渉しかねない、小さな気泡を後に溶液に生成し得るからである。フィルタ手段４が一般に組込まれ、示されるように、所望の測定に干渉しかねない残りの微粒子材料を前記溶媒から取除く。ポンプ手段の１つの例は、カリフォルニア州サンタクララのアジレント・テクノロジー社（Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA）のＧ１３１０型のアイソクラチックポンプである。脱気器の例は、ワシントン州オークハーバーのアップチャーチ・サイエンティフィック社（Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA）から入手可能なシステックマルチチャネル真空脱気器（Systec Multi-Channel Vacuum Degasser）である。溶媒がサンプルループ１２を通って流れないように、溶媒は回避位置に設定される注入弁１１を通って流れる。注入弁の例は、やはりアップチャーチ・サイエンティフィック社の７７２５型の分析的注入器である。サンプル５の一定分量は
注入器手段６によってサンプルループ１２に転送される。その重み平均モル質量、平均二乗半径、および第２、第３のビリアル係数はこの発明の方法によって導き出される。サンプル移動が完了すると、注入弁は注入位置に切り替えられ、その結果、溶媒はサンプルループ１２を通して流れ、検出器８および９にサンプルを運ぶ。さまざまな濃縮液を前もって準備することができ、サンプルループに手動で注入することができる。代替的には、それらは前もって準備され、自動サンプル採取装置によって注入されてもよい。好ましい実施の形態では、同じくアジレント・テクノロジー社の１３２９Ａなどの商業用自動サンプル採取装置は、ガラス瓶内で異なる体積の原液および溶媒を混合することによりサンプルの原液から濃縮液を形成するようにプログラムされている。別の好ましい実施の形態では、異なる体積の原液をサンプルループに直接注入するように自動サンプル採取装置をプログラムすることにより濃縮液が形成される。そこではサンプルループが溶媒で満たされ、サンプルループ中で混合することによって希釈が生じるように、注入体積はループ体積よりも小さい。優先的に、サンプルの濃度は桁にまたがるか、それ以上となる。
【００５４】
第２の実施の形態では、図２に示される「複式ポンプ法」を表わし、コンピュータに制御される２つのポンプ２１ａおよび２１ｂ、たとえば、ネバダ州リノのハミルトン社（Hamilton Corp., Reno, NV）のＭｉｃｒｏｌａｂ５００デュアルシリンジ希釈器／ディスペンサ（Microlab 500 Dual-Syringe Diluter/Dispenser）は、２つの独立して制御可能なシリンジポンプを含み、これらが用いられてサンプル貯槽２２からサンプルを引出し、溶媒貯槽２３から溶媒を引出す。これらは脱気チャンバ２４ａおよび２４ｂを通して転送され、フィルタ２５ａおよび２５ｂを通してポンプ送りされる。２つのポンプの流量はコンピュータによって調整され、流れは、所望の濃度のサンプルの連続的な流れを生成するために、たとえばカリフォルニア州エルソブランテのアナリティカル・サイエンティフィック・インスツルメンツ社（Analytical Scientific Instruments, El Sobrante, CA）から入手可能なハイパーシアー（Hypershear）インラインスタティックミキサなどの混合チャンバを通して組み合わされ、ポンプ送りされる。混合されたサンプルは、混合チャンバ、管材料、脱塩カラムおよび必要に応じた任意の付加的な体積を含む保持体積２６に一時的に格納されてもよい。混合されたサンプルの所望の体積が保持体積に注入された後、サンプル原液の流れは停止され、溶媒は、サンプルが保持体積から検出器を通って所望の流量で流れるようにするために、ポンプ２１ａによってポンプ送りされる。希釈の好ましい範囲は前の実施の形態における範囲と同じである。
【００５５】
当業者に明らかなように、第３の実施の形態では、複式ポンプ法におけるように１対のポンプで連続するサンプル濃度を形成し、混合されたサンプルをサンプルループに注入して、注入弁法におけるように、注入弁を切り替える際に付加的なポンプ手段によってサンプルが検出器に押出される。
【００５６】
サンプルが予めの透析を必要とする場合、脱塩カラム７、たとえばスウェーデン、ウプサラのアマシャム・バイサイエンス社（Amersham BioSciences, Uppsala, Sweden）から入手可能なＨｉＴｒａｐ脱塩カラムなどがＭＡＬＳ検出器８の前に配置されてもよい。
【００５７】
各連続サンプル５はＭＡＬＳ検出器８を通過し、それによって各角度における過剰レイリー比の値、Ｒj（θk）は、連続的な溶出体積Δｖjで、示差屈折率（ｄＲＩ）検出器として示された濃度検出器９を通して測定される。それによってサンプル濃度ｃiは各体積間隔Δｖiで測定される。次いで、結果的な光散乱信号および濃度信号は、各注入された一定分量ｍ、値Ｃm、Ｒ1,mk、Ｒ2,mk、およびＲ3,mkについて計算するため、コンピュータ手段１０によって格納され処理される。コンピュータ手段１０はまた、計算された結果を方程式（６）にフィッティングすることにより、Ｍ、＜ｒg2＞、Ａ2およびＡ3を含む分子特性を計算する。分子特性を抽出するためにさまざまなフィッティング手順が実現され得る。角度依存が無視できる場合、またはＡ3項が無視できる場合、線形の最小二乗法は
１つの好ましい実施の形態である。別の好ましい実施の形態ではフィッティング手順は、レーベンバーグ−マルカート・アルゴリズム（Levenberg-Marquardt algorithm）を使用する非線形の最小二乗法から構成される。当業者には公知なように、さらなる高位項をすべて維持することがデータの質またはＦＯＭのメリットにならないならば、より下位の次数のフィッティング、たとえばＡ3項を取除くことなどが実行されてもよい。
【００５８】
サンプル濃度検出器９はｄＲＩ検出器であってもよいが、紫外線検出器または可視光線吸収検出器が代用されてもよい。蒸発性光散乱検出器が用いられて各溶出するサンプルの濃度をモニタしてもよいが、このような装置は、応答が一般に非線形なので、特別な較正を必要とする場合がある。他のオンライン検出器は当業者に公知である。
【００５９】
当業者に明らかなこととして、測定されたデータの方程式（６）の形式に対するフィッティングは、線形の最小二乗法、レーベンバーグ−マルカート法、または他のアルゴリズムのいずれによって行われたとしても統計的な重みづけを含むことができ、それにより、これらのフィッティングの実行に用いられるデータは、その測定された標準偏差によって重みづけされる。
【実施例１】
【００６０】
１．３ 方法の実施例
この方法の実用性を実証するために、水性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解されたウシの血清アルブミンＢＳＡの分子パラメータの測定が示される。シグマ・オルドリッチ株式会社（Sigma-Aldrich Corporation）のサンプルは、６６，４００の単量体分子量（実際の重み平均モル質量は、二量体および三量体の低濃度の存在により、僅かに大きい）と、（静的な光散乱技術を用いて）可視光線散乱により測定可能な限界を下回る、平均二乗半径とを有する。
【００６１】
サンプルは２つの方法を用いて特徴づけられた。第１の方法はプラトー法である。サンプル原液は１０ｇ／ｌの濃度で準備された。原液および溶媒は脱気チャンバを通して引き出され、フィルタされ、固定された濃度間隔で、トリプルシリンジポンプ希釈器／ディスペンサによってスタティックミキサにおいて所望の濃度級数まで混合された。フローセルを満たし、かつ各信号をプラトーに導くように、十分に多量のサンプル（２ｍＬ）が、連続的に接続されたＭＡＬＳ検出器および濃度検出器に注入された。９０°光散乱検出器２７からの生の信号および濃度検出器２８からの未処理信号が図３に示される。プラトーは明確に目に見え、各ピークのプラトー上の小さな範囲のデータが平均化され、図４に示されるジムプロットを生成するために用いられた。測定された量は、Ｍ＝６７，７６０±０．０５ｋＤおよびＡ2＝１．３３±０．０１×１０-4ｍｏｌ・ｍＬ／ｇ2である。データは高品質であるが、比較的多量のサンプル（一定分量当たり〜２ｍＬ）が必要である。
【００６２】
第２の方法がこの発明の主題である。注入当たり僅かに２００μｌしか用いずに同じサンプル濃縮液が複式ポンプ方法を介して注入されたので、その結果フローセルが完全には満たされず、プラトーが達成されなかった。データは図５ａおよび図５ｂに示される。９０°光散乱信号２９がｄＲＩ検出器信号３０と重なって示される。双方ともベースラインが差し引かれている。各注入から、Ｃm、Ｒ1,mk、Ｒ2,mk、およびＲ3,mkが計算される。線形の最小二乗法を用いた、方程式（６）への結果的なフィッティングは図６に示される。得られた結果は、Ｍ＝６６，７００±０．０３ｋＤおよびＡ2＝１．１７±０．０１×１０-4ｍｏｌ・ｍＬ／ｇ2であった。これらの値は、プラトー法によって得られた値とうまく合う。
【００６３】
２．０ ２種の解析：
２．１ 理論的な説明：
溶媒に存在する２つの関連しない巨大分子種についての濃度において最大２次までの光散乱方程式が方程式（７）で与えられる：
【００６４】
【数１３】
【００６５】
ここで、ｄｎ／ｄｃAおよびｄｎ／ｄｃBは、種ＡおよびＢの示差屈折増分であり、ＭAおよびＭBは種ＡおよびＢの重み平均モル質量であり、ｃAおよびｃBは種ＡおよびＢの濃度であり、ＰA（θ）およびＰB（θ）は、種ＡおよびＢが＜ｒg2＞Aおよび＜ｒg2＞Bを仮定することによる角分布であり、Ａ2AおよびＡ2Bは種ＡおよびＢの自己ビリアル係数であり、Ａ2ABは種ＡおよびＢのクロスビリアル係数である。値ＭA、ＭB、＜ｒg2＞A、＜ｒg2＞B、Ａ2AおよびＡ2Bは上述の単一種の方法によって決定され得る。
【００６６】
残りのパラメータＡ2ABは、ここで２つの種を組合わせる測定で決定され得る。この測定は、異なる濃度の種Ａおよび種Ｂを備えたサンプル列から構成され、オンライン・ビリアル係数法の利点を享受するために、小さい、継続的に流れる一定分量から構成される。
【００６７】
単一の散乱する種について上述されたように方程式を反転するためには、付加的な関係が必要である。この関係については、各一定分量ｍの注入の全体にわたって、たとえ混合が両方の種に等しく影響するからこれらの濃度の大きさが異なっても、ｃBのｃAに対する比ｆmは（それが装置によって決定されるので）一定であり、かつ知られている、と安全に仮定することができる：
【００６８】
【数１４】
【００６９】
方程式（７）および（８）は、ｃA＝ｃA（Ｒ,θ）を表現するために反転され得るＲ＝Ｒ（ｃA,θ）のための式を与えるよう組合わせられ得る：
【００７０】
【数１５】
【００７１】
ここでＲまたはｓｉｎ2（θ／２）の２次よりも高次数の項が無視されており、以下の変数が規定される：
【００７２】
【数１６】
【００７３】
および
【００７４】
【数１７】
【００７５】
濃度信号から計算されるような各注入ｍにおけるＡの全質量は、質量保存によって、方程式（９）および（５）によって光散乱から得られた質量と等しくされ得る：
【００７６】
【数１８】
【００７７】
ここで、
【００７８】
【数１９】
【００７９】
【数２０】
【００８０】
さまざまな値のｃAおよびｃBにわたって測定を行ない、その結果を方程式（１０）および（１１）にフィッティングすることにより、クロスビリアル係数Ａ2ABが決定される。
【００８１】
当業者にとって明白なように、ビリアル展開の次数は、より高位のパラメータ、たとえばＡ3AまたはＡ3Bを含むために増大されてもよい。
【００８２】
２．２ 測定装置および手順
この測定は、サンプルが次のものを含む場合以外は、単一種の測定に関して進められる：１）種Ａだけの一連の濃縮液；２）種Ｂだけの一連の濃縮液；ならびに、３）ＡおよびＢの両方を異なる濃度で含むサンプル列、である。部分（１）および（２）は、Ａ2ABの一義的な測定値を得るために必要である。
【００８３】
１つの好ましい実施の形態では、ｃBに対するｃAの比はすべての２つの構成要素の一定分量の全体にわたって固定され、その結果、２つのサンプルのモル濃度の比が１：１である。
【００８４】
別の好ましい実施の形態では、ＡおよびＢの割合は、固定された濃度合計において純粋なＡから純粋なＢまでの比の全範囲にわたる２つの構成要素一定分量の全体にわたって、変動する。
【００８５】
装置は、好ましい実施の形態において複式ポンプがトリプルポンプと置換される以外は、単一種の測定の装置に類似し、各ポンプは、種Ａ、種Ｂ、そして溶媒をポンプ送りするよう、コンピュータによって制御可能である。このようなトリプルポンプはカリフォルニア州サンタバーバラのワイアット・テクノロジー株式会社から入手可能なカリプソ（Calypso）システムである。
【００８６】
光散乱技術の当業者に明らかなように、ここに発明し記述した方法には、彼らが実行できるように列挙した根本的な要素から逸脱することなく、多くの明白な変形がある。そのような変形は、本願明細書で前述したこの発明の明白な実現例にすぎず、下記に記載する請求項を参照することによって含まれるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中における分子の溶液の平均分子特性を決定する方法であって、
Ａ．前記溶媒の貯槽を与えるステップと、
Ｂ．前記溶液の貯槽を与えるステップと、
Ｃ．前記溶媒による、希釈手段を用いて前記貯槽から前記溶液の一連のｎ個の希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）を準備するステップと、
Ｄ．サンプリング手段を与えるステップとを含み、この手段によって前記希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）が連続して注入され、連続的に下記を通って流れるようにされ、
ａ．前記希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）の各増分注入体積Δｖiにおける複数のｑ個の角度θk（ｋ＝１〜ｑ）において散乱した光を集める光散乱検出器；
ｂ． 前記希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）の各増分注入体積Δｖiにおける対応する分子濃度ｃmi（ｍ＝１〜ｎ）を測定する濃度検出器；さらに
Ｅ．各流れの体積増分間隔Δｖiにおける測定された散乱光強度および対応する濃度ｃmiから、関連付けられた過剰レイリー比Ｒ（θk,ｃmi）を生成するステップと、
Ｆ． 各前記希釈ｍの溶出全体にわたる前記集められた濃度データ値ｃmiから、前記希釈液Ｄmに対応する下記のｎ個の合計を計算するステップとを含み、
【数１】
ここでｍ＝１からｎであり；
Ｇ． 前記生成された過剰レイリー比Ｒ*（θk,ｃmi）から、前記ｎ個の希釈液に対応する、３×ｑ×n個の過剰レイリー比の合計；
【数２】
および
【数３】
を計算するステップとを含み、さらに
Ｈ．データを方程式にフィッティングすることにより、前記３×ｑ×ｎ個の過剰レイリー比の合計から分子の前記溶液の前記平均特性を抽出するステップとを含む、方法。
【数４】
ここで
【数５】
【数６】
ｎ0は溶媒の屈折率であり、λ0は前記光散乱検出器の入射真空波長である。
【請求項２】
分子の前記溶液の前記平均特性が、重み平均モル質量Ｍ、平均二乗半径＜ｒg2＞、第２のビリアル係数Ａ2、第３のビリアル係数Ａ3および平均四乗半径＜ｒg4＞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
溶媒中における分子の溶液の平均分子特性を決定する方法であって、
Ａ．前記溶媒の貯槽を与えるステップと、
Ｂ．前記溶液の貯槽を与えるステップと、
Ｃ．前記溶媒による、希釈手段を用いて前記貯槽から前記溶液の一連のｎ個の希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）を準備するステップと、
Ｄ．サンプリング手段を与えるステップとを含み、この手段によって前記希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）が連続して注入され、連続的に下記を通って流れるようにされ、
ａ．前記希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）の各増分注入体積Δｖiにおける複数のｑ個の角度θk（ｋ＝１〜ｑ）において散乱した光を集める光散乱検出器；
ｂ． 前記希釈液Ｄm（ｍ＝１〜ｎ）の各増分注入体積Δｖiにおける対応する分子濃度ｃmi（ｍ＝１〜ｎ）を測定する濃度検出器；さらに
Ｅ．各流れの体積増分間隔Δｖiにおける測定された散乱光強度および対応する濃度ｃmiから、関連付けられた過剰レイリー比Ｒ（θk,ｃmi）を生成するステップと、
Ｆ． 各前記希釈ｍの溶出全体にわたる前記集められた濃度データ値ｃmiから、前記希釈液Ｄmに対応する下記のｎ個の合計を計算するステップとを含み、
【数１】
ここでｍ＝１からｎであり；
Ｇ． 前記生成された過剰レイリー比Ｒ*（θk,ｃmi）から、前記ｎ個の希釈液に対応する、３×ｑ×n個の過剰レイリー比の合計；
【数２】
および
【数３】
を計算するステップとを含み、さらに
Ｈ．データを方程式にフィッティングすることにより、前記３×ｑ×ｎ個の過剰レイリー比の合計から分子の前記溶液の前記平均特性を抽出するステップとを含む、方法。
【数４】
ここで
【数５】
【数６】
ｎ0は溶媒の屈折率であり、λ0は前記光散乱検出器の入射真空波長である。
【請求項２】
分子の前記溶液の前記平均特性が、重み平均モル質量Ｍ、平均二乗半径＜ｒg2＞、第２のビリアル係数Ａ2、第３のビリアル係数Ａ3および平均四乗半径＜ｒg4＞である、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図３】
【図４】
【図６】
【図２】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図３】
【図４】
【図６】
【公開番号】特開２００９−２１０５７５（Ｐ２００９−２１０５７５Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４２４０４（Ｐ２００９−４２４０４）
【出願日】平成２１年２月２５日（２００９．２．２５）
【出願人】（５９４０３５９３２）ワイアット テクノロジー コーポレイション (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｋｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２５日（２００９．２．２５）
【出願人】（５９４０３５９３２）ワイアット テクノロジー コーポレイション (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｋｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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