炎症性疾患の予防剤および／または治療剤
【課題】 ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患に有効な、医薬品、食品、または飼料を提供することをその主な課題とする。
【解決手段】 ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患である、潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患や、全身性自己免疫疾患や臓器特異性免疫疾患等の自己免疫疾患の予防剤および／または治療剤として、システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分として含有する医薬品、食品、飼料を提供する。
【解決手段】 ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患である、潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患や、全身性自己免疫疾患や臓器特異性免疫疾患等の自己免疫疾患の予防剤および／または治療剤として、システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分として含有する医薬品、食品、飼料を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン、グリシン、ヒスチジンの少なくともいずれか１つを含有する、ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢは、免疫担当細胞を含む多くの細胞において、構造的、機能的に広範囲の遺伝子の転写調節に関与するタンパク質で、炎症反応に寄与するタンパク質の転写、翻訳を活性化することにより、炎症性疾患に重要な役割をしている。そのため、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することが、前記疾患の有効な治療法となり得ると考えられている。
【０００３】
ＮＦ−κＢは、構造的には、ｐ５０とｐ６５のヘテロダイマーからなる複合タンパク質で、通常、その阻害因子ＩκＢが結合した形で細胞質に存在し、核移行が阻止されているが、ＩκＢのリン酸化や分解が起こるとＮＦ−κＢは活性化され、核内へ移行する。核内のＮＦ−κＢは、染色体上のＮＦ−κＢ結合部位に結合して、その下流にある遺伝子の転写を促進する。ＮＦ−κＢにより制御される遺伝子に起因する物質としては、例えば、ＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）、ＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）等の炎症性サイトカイン類、ＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、ＩＣＡＭ−１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）等の接着因子、ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＧＲＯ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ＩＬ−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）等のケモカイン類等、炎症反応に関与する物質である。
【０００４】
本発明者らは、ＴＮＦ−αで刺激されたヒト単球・マクロファージ、Ｔ細胞、冠動脈の肺上皮細胞（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）のような種々のヒト細胞においては、クラリスロマイシン、ホスホマイシン、テオフィリン、プランルカストや免疫グロブリン製剤等のような多くの種類の物質が、ＮＦ−κＢ活性を阻害する効果を持つことを報告した（例えば、非特許文献１参照。）。阻害効果のメカニズムはそれぞれの物質で異なり、テオフィリンと免疫グロブリン製剤は、ＩκＢα（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂα）の分解を保護することによりＮＦ−κＢ活性を阻害するが、クラリスロマイシン、ホスホマイシンやプランルカストではそのメカニズムではない。
【０００５】
炎症性疾患は、クローン病や潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、痛風、乾癬等が代表的な疾患として知られている。クローン病は、消化管全域に炎症や潰瘍が起きる疾患であり、クローン病の発生には単球／マクロファージが重要な働きをしていることが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。炎症性サイトカインのＴＮＦ−αやＩＬ−６が、クローン病の発症段階に存在することは、抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ｉｎｆｌｉｘｍａｂ）が臨床的に有効あることで明らかにされている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００６】
クローン病患者に対しては、患者の栄養状態や、臨床的症状改善のために、アミノ酸からなる成分栄養剤が用いられている。成分栄養剤はクローン病におけるＴＮＦ−αやＩＬ−６のような炎症性サイトカインの生産を減少させることが知られおり（例えば、非特許文献４参照。）、アミノ酸のいくつかの種類が炎症への阻害効果を有することが報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。特許文献では、イソロイシン、ロイシン、バリンから選択される少なくとも1種の分岐鎖アミノ酸による、潰瘍性大腸炎や炎症性大腸炎の治療方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。アレルギー性炎症疾患の処置に有用なアミノ酸としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリンを含有する医薬または栄養製剤が提案され、グリシンのヒト単核細胞からＩＬ−１０の放出も明らかにしている（例えば、特許文献２参照。）。ヒスチジンは、ＴＮＦ−αで刺激した腸管上皮細胞で、ＮＦ−κＢ活性やＩＬ−８の生産を阻害すること、あるいは、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）で刺激したマウス腹腔マクロファージで、ＮＦ−κＢ活性やサイトカイン生産を阻害することが明らかにされている（例えば、非特許文献６参照。）。また、アミノ酸のグリシンは、肺胞マクロファージやＴ細胞で阻害効果を有することが知られている（例えば、非特許文献７参照。）。さらに、これらのアミノ酸は、人工的に作製した炎症性疾患に対し効果を示したことが報告されている。ラットにおける化学的誘導大腸炎、ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ刺激関節炎、エンドトキシン誘導肺炎をグリシンは阻害し、ヒスチジンは、マウスの大腸炎を回復したという報告がある（例えば、非特許文献８参照。）。しかしながら、ヒトではアミノ酸のグリシン、ヒスチジン、あるいはシステインによるＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患への効果は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−９５９３８号公報（図３）
【特許文献２】特開平１０−２０３９７２号公報（図１）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｃｈｉｙａｍａ Ｔ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：４４−４７，２００１
【非特許文献２】Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６６：１９２−２０２，２００９
【非特許文献３】Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１７：７６１−７６９，１９９９
【非特許文献４】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．１１：５８０−５８８，２００５
【非特許文献５】Ｔｓｕｎｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２５：７７５−７８５，２００３
【非特許文献６】Ａｎｄｏｕ Ａ，ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１３６：５６４−５７４，２００９
【非特許文献７】Ｗｈｅｅｌｅｒ ＭＤ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７：Ｌ９５２−９５９，１９９９
【非特許文献８】Ｗｈｅｅｌｅｒ ＭＤ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ.２７９：Ｌ３９０−３９８，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患に有効な、医薬品、食品、または飼料を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、アミノ酸のシステイン、グリシン、ヒスチジンが、ヒト単球・マクロファージにおいて、ＩＬ−８等のサイトカインの生産や、ＩＣＡＭ−１等の接着分子の発現を抑制することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【００１２】
（１）システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分として含有する、ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【００１３】
（２）ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、炎症性腸疾患である上記（１）に記載の予防剤および／または治療剤。
【００１４】
（３）ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、自己免疫疾患である上記（１）に記載の予防剤および／または治療剤。
【００１５】
（４）上記（１）〜（３）に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する医薬品。
【００１６】
（５）上記（１）〜（３）に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する食品。
【００１７】
（６）上記（１）〜（３）に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する飼料。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、ＮＦ−κＢの活性化に起因する炎症性腸疾患に有効な医薬品、食品、または飼料組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＴＨＰ−１細胞におけるアミノ酸の生存能力への影響を示した図である。
【図２】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＮＦ−κＢ活性化、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【図３】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＩκＢαのリン酸化、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【図４】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＩＣＡＭ−１発現効果、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【図５】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＩＬ−８生産増加、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のアミノ酸であるシステイン、グリシン、およびヒスチジンは、いずれもＬ型で、天然物由来のアミノ酸でも、市販の製品であっても良く、また塩酸、硫酸・リン酸等の酸との塩の形や、あるいはナトリウム、カルシウム等のアルカリ塩の形をとったアミノ酸を使用しても良い。これらのアミノ酸は、安定で、さらに生体内投与で安全な形態のアミノ酸を使用することが望ましい。
【００２１】
本発明において、ＮＦ−κＢとは、内皮細胞において、接着分子、ケモカイン、サイトカインの発現に重要な役割をもつ転写因子を意味する。
【００２２】
本発明において、ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患とは、ストレス、紫外線、サイトカイン等の刺激でおこる炎症性疾患で、炎症性腸疾患、炎症性神経系疾患、炎症性肺疾患、慢性炎症性関節疾患、肝炎、髄膜炎、自己免疫疾患、皮膚疾患、骨疾患、心疾患、腎不全、慢性脱髄疾患、内皮細胞疾患、アレルギー症候群、敗血症、悪性腫瘍、糖尿病等が含まれる。
【００２３】
前記、炎症性腸疾患とは、消化管に炎症が起きた慢性疾患であり、潰瘍性大腸炎、クローン病等があげられる。潰瘍性大腸炎は、若年成人に発症することが多く、厚生労働省の特定疾患に指定されている。また、クローン病は、口腔から肛門までの消化管全域に非連続の炎症や潰瘍を起こす疾患であり、クローン病も厚生労働省の特定疾患に指定されている。
【００２４】
さらに、前記、自己免疫疾患とは、全身性自己免疫疾患や臓器特異性免疫疾患であり、間接リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症等の全身性自己免疫疾患、重症筋無力症、大動脈炎症候群、バセドー病等の臓器特異性免疫疾患があげられる。
【００２５】
ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤として有効な物質は、ＮＦ−κＢ活性を阻害する物質と考えられることから、ＮＦ−κＢに制御されているＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＭＣＰ−１、ＧＲＯ、ＩＬ−８の発現や生産の阻害効果を確認することにより、あるいは、ＮＦ−κＢを制御するＩκＢのリン酸化の阻害効果を確認することにより、見出すことができる。
【００２６】
ＮＦ−κＢの活性を確認するためには、免疫細胞の単球・マクロファージ、単球・樹状細胞、線維芽細胞、リンパ球・Ｔ細胞、リンパ球・Ｂ細胞等を使用することができる。
【００２７】
本発明は、システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分とするＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を用いて、効果を期待する疾病のために医薬品、食品、または飼料として使用することができる。
【００２８】
本発明のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する医薬品、食品、または飼料は、目的により投与しやすい形態とすることができ、固体、液体、または半固体として製造し、そのまま、あるいはさらに望ましい形態に変えて使用することができる。
【００２９】
本発明に係るアミノ酸の含量は、目的により異なり、医薬品として使用する場合には、０．００１〜８０重量％、好ましくは、０．０１〜１０重量％であり、食品として使用する場合には、０．１〜８０重量％、好ましくは、１〜３０重量％であり、飼料として使用する場合には、０．１〜８０重量％、好ましくは、１〜３０重量％である。
【００３０】
本発明に係る医薬品の投与経路としては、経口及び非経口のいずれを用いることもできる。経口投与する場合は、製剤の形態として、錠剤、丸剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤等の固体製剤の他に、経管経腸液、乳剤、シロップ液のような液状製剤とすることができる。また、非経口投与する場合は、製剤の形態として、注射剤や、軟膏剤、貼付剤、座剤等の外用剤とすることができる。
【００３１】
経口投与のための固体製剤は、本発明に係るアミノ酸の他、有機または無機の賦形剤、例えば、乳糖、蔗糖、ブドウ糖、尿素、デンプン、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等と混合して、さらに、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース等の結合剤、精製タルク、ステアリン酸マグネシウム、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤等を含有させて固体組成物を製造し、必要に応じて、糖や、腸溶性素材でコーティングしてコーティング剤とすることもでき、あるいは固体組成物をカプセルに充填してカプセル剤とすることもできる。
【００３２】
経口投与のための液状製剤は、成分栄養剤として用いることができるが、例えば以下の成分を用いて製造することができる。本発明に係るアミノ酸の他、カゼイン等のタンパク質、デキストリン、マルトース、オリゴ糖等の糖類、大豆油、オリーブ油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の脂質、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＣ、ビタミンＤ等のビタミン類、マグネシウム、カルシウム等のミネラル類の中から必要な成分を選択し、蒸留水、エタノール、プロパノール等の溶剤と混合して製造する。
【００３３】
注射剤は、本発明に係るアミノ酸を、蒸留水、生理食塩水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の必要とされる溶剤で溶解あるいは懸濁し、さらに緩衝剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤等を添加して製造することができる。
【００３４】
軟膏剤、貼付剤、座剤等の外用剤は、本発明に係るアミノ酸を、油脂性基剤、乳剤性基剤、水溶性基剤、懸濁性基剤等の中から選んだ必要な成分と混合して製造することができる。油脂性基剤としては、例えば、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、植物油、ロウ等があげられ、乳剤性基剤としては、ラノリン、親水性ワセリン等があげられる。水溶性基剤は、ポリエチレングリコール等であり、懸濁性基剤は、セルロース等である。貼付剤は、上記組成物と、さらに必要に応じて結合剤、粘着剤を添加し、酢酸セルロース、エチルセルロース、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリエチレン等の支持体に貼付して製造することができる。
【００３５】
投与量は、症状、投与対象の年齢・性別等を考慮して適宜決定されるが、経口投与製剤の場合は、本発明に係るアミノ酸を、1日あたり、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ、注射剤の場合は、本発明に係るアミノ酸を、１回あたり、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、外用剤の場合は、本発明に係るアミノ酸を１日あたり、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇである。これらの製剤を1日に、１〜数回に分けて投与する。
【００３６】
本発明における食品としては、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、健康志向食品があげられる。形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料、タブレット、顆粒剤等摂取しやすい形態であることが望ましい。日常的に摂取する茶類やサプリメントとして、本発明に係るアミノ酸を配合することにより、継続的な摂取を可能にする食品とすることもできる。
【００３７】
本発明の食品は、本発明に係るアミノ酸に、前記経口投与のための医薬品製剤と同様の成分を添加して製造することができる。また、上記成分に、嗜好性を高める成分を付加することもできる。摂取量は、本発明に係るアミノ酸として、1日あたり、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇとする。
【００３８】
本発明における飼料としては、畜産業における牛・豚・馬・山羊・羊・鶏等のための飼料や、水産業における養殖魚のための餌料や、犬・猫・ウサギ・ネズミの他、ペットとして飼育している哺乳動物・鳥類・観賞魚等のためのペットフードがあげられる。
【００３９】
本発明の飼料は、本発明に係るアミノ酸に、必要に応じて、穀物類、豆類、イモ類、野菜、果物、肉及び魚介、油脂、糠又は粕、糖類、色素等の動物等の生命維持物質、および嗜好性に必要な物質を配合することができる。本発明に係るアミノ酸の摂取量は、動物の種類や年齢等に応じて異なるので特に限定されないが、本発明に係るアミノ酸として、1日あたり、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇとする。
【００４０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００４１】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸の生存能力への影響＞
ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球系細胞株、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣより購入）を３７℃、５％ＣＯ２下で、１０％の仔牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。アミノ酸前処理の前にＦＣＳを含まない ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で１２時間培養し、洗浄後アミノ酸を含まない培地に置換した。その後細胞を０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのアラニン、システイン、ヒスチジン、グリシンをそれぞれ含む培地と含まない培地で２時間培養し、次いで細胞をＴＮＦ−α ２ｎｇ／ｍｌで刺激した。６時間後トリパンブルー染色を使って生存細胞を測定した。データは、平均±標準誤差として表した。統計分析は標準ｔ検定を行い、ｐ値が０．０５未満を有意とした。
【００４２】
＜結果＞
図１に細胞の生存能力へのアミノ酸の影響を示した。０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのアラニン、グリシン、ヒスチジン、システインはＴＨＰ−１細胞の生存能力へ影響はなかった。
【実施例２】
【００４３】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＮＦ−κＢ活性化抑制効果＞
実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞をＴＮＦ−α ２ｎｇ／ｍｌで３０分間刺激後、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製）を用いてマニュアルに従って核抽出物を得た。核抽出物のタンパク濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＲＣＥ社製）を用いて測定した。ＮＦ−κＢ活性はＮＦ−κＢ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製）で測定し、各種アミノ酸の前処理の有無で比較検討した。データは実施例１と同様の方法で解析した。
【００４４】
＜結果＞
図２に、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＮＦ−κＢ活性化およびアミノ酸の抑制効果を示した。アミノ酸で非処理のＴＨＰ−１細胞では、ＴＮＦ−α刺激によりＮＦ−κＢ活性は有意に誘導され（ｐ＜０．００１）、２ｍＭ、２０ｍＭのグリシン、ヒスチジンおよび０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのシステインの前処理で有意にＮＦ−κＢ活性化を抑制した。それらのアミノ酸のうちシステインによる前処理の抑制効果が最も大きかった（ｐ＜０．００１）。アラニンには抑制効果は見られなかった。
【実施例３】
【００４５】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＩκＢαリン酸化抑制効果＞
さらにアミノ酸のＮＦ−κＢ活性化の抑制効果が、ＩκＢαのリン酸化によるものかどうかを検討した。実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞を、ＴＮＦ−α刺激１０、２０、３０、６０分後に細胞全抽出物を得た。抽出物をドデシル硫酸ポリアクリル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を施行後、リン酸化したＩκＢαに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法で検出した。
【００４６】
＜結果＞
アミノ酸の前処理、特にヒスチジンとシステインの前処理では、図３に示すようにＩκＢαのリン酸化を抑制した。これによりＮＦ−κＢ活性の抑制効果は、ＩκＢαリン酸化抑制効果によることが示唆された。
【実施例４】
【００４７】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）発現抑制効果＞
実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞をＴＮＦ−α ２ｎｇ／ｍｌで６時間刺激し、アミノ酸のＩＣＡＭ−１発現への抑制効果についてフローサイトメーターを用いて検討した。フローサイトメーターによるＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の発現解析は、フィコエリトリン（ＰＥ）標識した抗ヒトＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、陰性コントロール（ｉｓｏｔｙｐｅ−ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＰＥ標識したマウスＩｇＧ１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）も使用した。細胞の免疫蛍光状態は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を搭載した細胞解析装置のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーにより解析し、１万個の細胞を分析した。データは実施例１と同様の方法で解析した。
【００４８】
＜結果＞
ＮＦ−κＢで調節されるＩＣＡＭ−１の発現について図４に示した。２ｍＭ、２０ｍＭのグリシン、ヒスチジン、および０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのシステインでの前処理で有意にＩＣＡＭ−１の発現を抑制した。そのうちシステインでの前処理が図２に示したＮＦ−κＢ活性と同じように最も顕著であった（ｐ＜０．００１）。アラニンには、ＩＣＡＭ−１の発現抑制効果は見られなかった。
【実施例５】
【００４９】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＩＬ−８産生抑制効果＞
実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞を用い、ＴＮＦ−αで６時間刺激後、培養上清中のＩＬ−８濃度を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたサンドイッチ ＥＬＩＳＡ法によりマニュアルに従って測定した。データは実施例１と同様の方法で解析した。
【００５０】
＜結果＞
図５に示すように、ＴＮＦ−α刺激後、ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−８産生においてもアミノ酸の抑制効果が認められた。２ｍＭ、２０ｍＭのグリシン、ヒスチジン、システインでの前処理はＴＮＦ−α刺激後のＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−８産生を抑制した。特に、ヒスチジンの２ｍＭ、２０ｍＭ、およびシステインの２０ｍＭでは顕著に抑制効果を表した（ｐ＜０．００１）。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は医療、食品、飼料等の分野で、ＮＦ−κＢの活性化に起因する炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患、あるいは自己免疫疾患の予防および／または治療のために利用される可能性があり、極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン、グリシン、ヒスチジンの少なくともいずれか１つを含有する、ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢは、免疫担当細胞を含む多くの細胞において、構造的、機能的に広範囲の遺伝子の転写調節に関与するタンパク質で、炎症反応に寄与するタンパク質の転写、翻訳を活性化することにより、炎症性疾患に重要な役割をしている。そのため、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することが、前記疾患の有効な治療法となり得ると考えられている。
【０００３】
ＮＦ−κＢは、構造的には、ｐ５０とｐ６５のヘテロダイマーからなる複合タンパク質で、通常、その阻害因子ＩκＢが結合した形で細胞質に存在し、核移行が阻止されているが、ＩκＢのリン酸化や分解が起こるとＮＦ−κＢは活性化され、核内へ移行する。核内のＮＦ−κＢは、染色体上のＮＦ−κＢ結合部位に結合して、その下流にある遺伝子の転写を促進する。ＮＦ−κＢにより制御される遺伝子に起因する物質としては、例えば、ＩＬ−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）、ＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）等の炎症性サイトカイン類、ＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、ＩＣＡＭ−１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）等の接着因子、ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＧＲＯ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ＩＬ−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）等のケモカイン類等、炎症反応に関与する物質である。
【０００４】
本発明者らは、ＴＮＦ−αで刺激されたヒト単球・マクロファージ、Ｔ細胞、冠動脈の肺上皮細胞（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）のような種々のヒト細胞においては、クラリスロマイシン、ホスホマイシン、テオフィリン、プランルカストや免疫グロブリン製剤等のような多くの種類の物質が、ＮＦ−κＢ活性を阻害する効果を持つことを報告した（例えば、非特許文献１参照。）。阻害効果のメカニズムはそれぞれの物質で異なり、テオフィリンと免疫グロブリン製剤は、ＩκＢα（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂα）の分解を保護することによりＮＦ−κＢ活性を阻害するが、クラリスロマイシン、ホスホマイシンやプランルカストではそのメカニズムではない。
【０００５】
炎症性疾患は、クローン病や潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、痛風、乾癬等が代表的な疾患として知られている。クローン病は、消化管全域に炎症や潰瘍が起きる疾患であり、クローン病の発生には単球／マクロファージが重要な働きをしていることが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。炎症性サイトカインのＴＮＦ−αやＩＬ−６が、クローン病の発症段階に存在することは、抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体（ｉｎｆｌｉｘｍａｂ）が臨床的に有効あることで明らかにされている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００６】
クローン病患者に対しては、患者の栄養状態や、臨床的症状改善のために、アミノ酸からなる成分栄養剤が用いられている。成分栄養剤はクローン病におけるＴＮＦ−αやＩＬ−６のような炎症性サイトカインの生産を減少させることが知られおり（例えば、非特許文献４参照。）、アミノ酸のいくつかの種類が炎症への阻害効果を有することが報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。特許文献では、イソロイシン、ロイシン、バリンから選択される少なくとも1種の分岐鎖アミノ酸による、潰瘍性大腸炎や炎症性大腸炎の治療方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。アレルギー性炎症疾患の処置に有用なアミノ酸としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリンを含有する医薬または栄養製剤が提案され、グリシンのヒト単核細胞からＩＬ−１０の放出も明らかにしている（例えば、特許文献２参照。）。ヒスチジンは、ＴＮＦ−αで刺激した腸管上皮細胞で、ＮＦ−κＢ活性やＩＬ−８の生産を阻害すること、あるいは、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）で刺激したマウス腹腔マクロファージで、ＮＦ−κＢ活性やサイトカイン生産を阻害することが明らかにされている（例えば、非特許文献６参照。）。また、アミノ酸のグリシンは、肺胞マクロファージやＴ細胞で阻害効果を有することが知られている（例えば、非特許文献７参照。）。さらに、これらのアミノ酸は、人工的に作製した炎症性疾患に対し効果を示したことが報告されている。ラットにおける化学的誘導大腸炎、ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ刺激関節炎、エンドトキシン誘導肺炎をグリシンは阻害し、ヒスチジンは、マウスの大腸炎を回復したという報告がある（例えば、非特許文献８参照。）。しかしながら、ヒトではアミノ酸のグリシン、ヒスチジン、あるいはシステインによるＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患への効果は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−９５９３８号公報（図３）
【特許文献２】特開平１０−２０３９７２号公報（図１）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｃｈｉｙａｍａ Ｔ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：４４−４７，２００１
【非特許文献２】Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６６：１９２−２０２，２００９
【非特許文献３】Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ Ｐ，ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１７：７６１−７６９，１９９９
【非特許文献４】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．１１：５８０−５８８，２００５
【非特許文献５】Ｔｓｕｎｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２５：７７５−７８５，２００３
【非特許文献６】Ａｎｄｏｕ Ａ，ｅｔ ａｌ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１３６：５６４−５７４，２００９
【非特許文献７】Ｗｈｅｅｌｅｒ ＭＤ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７：Ｌ９５２−９５９，１９９９
【非特許文献８】Ｗｈｅｅｌｅｒ ＭＤ，ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ.２７９：Ｌ３９０−３９８，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患に有効な、医薬品、食品、または飼料を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、アミノ酸のシステイン、グリシン、ヒスチジンが、ヒト単球・マクロファージにおいて、ＩＬ−８等のサイトカインの生産や、ＩＣＡＭ−１等の接着分子の発現を抑制することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
【００１２】
（１）システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分として含有する、ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【００１３】
（２）ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、炎症性腸疾患である上記（１）に記載の予防剤および／または治療剤。
【００１４】
（３）ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、自己免疫疾患である上記（１）に記載の予防剤および／または治療剤。
【００１５】
（４）上記（１）〜（３）に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する医薬品。
【００１６】
（５）上記（１）〜（３）に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する食品。
【００１７】
（６）上記（１）〜（３）に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する飼料。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、ＮＦ−κＢの活性化に起因する炎症性腸疾患に有効な医薬品、食品、または飼料組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＴＨＰ−１細胞におけるアミノ酸の生存能力への影響を示した図である。
【図２】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＮＦ−κＢ活性化、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【図３】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＩκＢαのリン酸化、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【図４】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＩＣＡＭ−１発現効果、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【図５】ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＩＬ−８生産増加、およびアミノ酸の抑制効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のアミノ酸であるシステイン、グリシン、およびヒスチジンは、いずれもＬ型で、天然物由来のアミノ酸でも、市販の製品であっても良く、また塩酸、硫酸・リン酸等の酸との塩の形や、あるいはナトリウム、カルシウム等のアルカリ塩の形をとったアミノ酸を使用しても良い。これらのアミノ酸は、安定で、さらに生体内投与で安全な形態のアミノ酸を使用することが望ましい。
【００２１】
本発明において、ＮＦ−κＢとは、内皮細胞において、接着分子、ケモカイン、サイトカインの発現に重要な役割をもつ転写因子を意味する。
【００２２】
本発明において、ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患とは、ストレス、紫外線、サイトカイン等の刺激でおこる炎症性疾患で、炎症性腸疾患、炎症性神経系疾患、炎症性肺疾患、慢性炎症性関節疾患、肝炎、髄膜炎、自己免疫疾患、皮膚疾患、骨疾患、心疾患、腎不全、慢性脱髄疾患、内皮細胞疾患、アレルギー症候群、敗血症、悪性腫瘍、糖尿病等が含まれる。
【００２３】
前記、炎症性腸疾患とは、消化管に炎症が起きた慢性疾患であり、潰瘍性大腸炎、クローン病等があげられる。潰瘍性大腸炎は、若年成人に発症することが多く、厚生労働省の特定疾患に指定されている。また、クローン病は、口腔から肛門までの消化管全域に非連続の炎症や潰瘍を起こす疾患であり、クローン病も厚生労働省の特定疾患に指定されている。
【００２４】
さらに、前記、自己免疫疾患とは、全身性自己免疫疾患や臓器特異性免疫疾患であり、間接リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症等の全身性自己免疫疾患、重症筋無力症、大動脈炎症候群、バセドー病等の臓器特異性免疫疾患があげられる。
【００２５】
ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤として有効な物質は、ＮＦ−κＢ活性を阻害する物質と考えられることから、ＮＦ−κＢに制御されているＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＭＣＰ−１、ＧＲＯ、ＩＬ−８の発現や生産の阻害効果を確認することにより、あるいは、ＮＦ−κＢを制御するＩκＢのリン酸化の阻害効果を確認することにより、見出すことができる。
【００２６】
ＮＦ−κＢの活性を確認するためには、免疫細胞の単球・マクロファージ、単球・樹状細胞、線維芽細胞、リンパ球・Ｔ細胞、リンパ球・Ｂ細胞等を使用することができる。
【００２７】
本発明は、システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分とするＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を用いて、効果を期待する疾病のために医薬品、食品、または飼料として使用することができる。
【００２８】
本発明のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する医薬品、食品、または飼料は、目的により投与しやすい形態とすることができ、固体、液体、または半固体として製造し、そのまま、あるいはさらに望ましい形態に変えて使用することができる。
【００２９】
本発明に係るアミノ酸の含量は、目的により異なり、医薬品として使用する場合には、０．００１〜８０重量％、好ましくは、０．０１〜１０重量％であり、食品として使用する場合には、０．１〜８０重量％、好ましくは、１〜３０重量％であり、飼料として使用する場合には、０．１〜８０重量％、好ましくは、１〜３０重量％である。
【００３０】
本発明に係る医薬品の投与経路としては、経口及び非経口のいずれを用いることもできる。経口投与する場合は、製剤の形態として、錠剤、丸剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤等の固体製剤の他に、経管経腸液、乳剤、シロップ液のような液状製剤とすることができる。また、非経口投与する場合は、製剤の形態として、注射剤や、軟膏剤、貼付剤、座剤等の外用剤とすることができる。
【００３１】
経口投与のための固体製剤は、本発明に係るアミノ酸の他、有機または無機の賦形剤、例えば、乳糖、蔗糖、ブドウ糖、尿素、デンプン、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等と混合して、さらに、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース等の結合剤、精製タルク、ステアリン酸マグネシウム、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤等を含有させて固体組成物を製造し、必要に応じて、糖や、腸溶性素材でコーティングしてコーティング剤とすることもでき、あるいは固体組成物をカプセルに充填してカプセル剤とすることもできる。
【００３２】
経口投与のための液状製剤は、成分栄養剤として用いることができるが、例えば以下の成分を用いて製造することができる。本発明に係るアミノ酸の他、カゼイン等のタンパク質、デキストリン、マルトース、オリゴ糖等の糖類、大豆油、オリーブ油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の脂質、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＣ、ビタミンＤ等のビタミン類、マグネシウム、カルシウム等のミネラル類の中から必要な成分を選択し、蒸留水、エタノール、プロパノール等の溶剤と混合して製造する。
【００３３】
注射剤は、本発明に係るアミノ酸を、蒸留水、生理食塩水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の必要とされる溶剤で溶解あるいは懸濁し、さらに緩衝剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤等を添加して製造することができる。
【００３４】
軟膏剤、貼付剤、座剤等の外用剤は、本発明に係るアミノ酸を、油脂性基剤、乳剤性基剤、水溶性基剤、懸濁性基剤等の中から選んだ必要な成分と混合して製造することができる。油脂性基剤としては、例えば、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、植物油、ロウ等があげられ、乳剤性基剤としては、ラノリン、親水性ワセリン等があげられる。水溶性基剤は、ポリエチレングリコール等であり、懸濁性基剤は、セルロース等である。貼付剤は、上記組成物と、さらに必要に応じて結合剤、粘着剤を添加し、酢酸セルロース、エチルセルロース、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリエチレン等の支持体に貼付して製造することができる。
【００３５】
投与量は、症状、投与対象の年齢・性別等を考慮して適宜決定されるが、経口投与製剤の場合は、本発明に係るアミノ酸を、1日あたり、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ、注射剤の場合は、本発明に係るアミノ酸を、１回あたり、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、外用剤の場合は、本発明に係るアミノ酸を１日あたり、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１０〜１００ｍｇ／ｋｇである。これらの製剤を1日に、１〜数回に分けて投与する。
【００３６】
本発明における食品としては、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、健康志向食品があげられる。形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料、タブレット、顆粒剤等摂取しやすい形態であることが望ましい。日常的に摂取する茶類やサプリメントとして、本発明に係るアミノ酸を配合することにより、継続的な摂取を可能にする食品とすることもできる。
【００３７】
本発明の食品は、本発明に係るアミノ酸に、前記経口投与のための医薬品製剤と同様の成分を添加して製造することができる。また、上記成分に、嗜好性を高める成分を付加することもできる。摂取量は、本発明に係るアミノ酸として、1日あたり、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇとする。
【００３８】
本発明における飼料としては、畜産業における牛・豚・馬・山羊・羊・鶏等のための飼料や、水産業における養殖魚のための餌料や、犬・猫・ウサギ・ネズミの他、ペットとして飼育している哺乳動物・鳥類・観賞魚等のためのペットフードがあげられる。
【００３９】
本発明の飼料は、本発明に係るアミノ酸に、必要に応じて、穀物類、豆類、イモ類、野菜、果物、肉及び魚介、油脂、糠又は粕、糖類、色素等の動物等の生命維持物質、および嗜好性に必要な物質を配合することができる。本発明に係るアミノ酸の摂取量は、動物の種類や年齢等に応じて異なるので特に限定されないが、本発明に係るアミノ酸として、1日あたり、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇとする。
【００４０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００４１】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸の生存能力への影響＞
ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球系細胞株、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣより購入）を３７℃、５％ＣＯ２下で、１０％の仔牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。アミノ酸前処理の前にＦＣＳを含まない ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で１２時間培養し、洗浄後アミノ酸を含まない培地に置換した。その後細胞を０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのアラニン、システイン、ヒスチジン、グリシンをそれぞれ含む培地と含まない培地で２時間培養し、次いで細胞をＴＮＦ−α ２ｎｇ／ｍｌで刺激した。６時間後トリパンブルー染色を使って生存細胞を測定した。データは、平均±標準誤差として表した。統計分析は標準ｔ検定を行い、ｐ値が０．０５未満を有意とした。
【００４２】
＜結果＞
図１に細胞の生存能力へのアミノ酸の影響を示した。０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのアラニン、グリシン、ヒスチジン、システインはＴＨＰ−１細胞の生存能力へ影響はなかった。
【実施例２】
【００４３】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＮＦ−κＢ活性化抑制効果＞
実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞をＴＮＦ−α ２ｎｇ／ｍｌで３０分間刺激後、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製）を用いてマニュアルに従って核抽出物を得た。核抽出物のタンパク濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＲＣＥ社製）を用いて測定した。ＮＦ−κＢ活性はＮＦ−κＢ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製）で測定し、各種アミノ酸の前処理の有無で比較検討した。データは実施例１と同様の方法で解析した。
【００４４】
＜結果＞
図２に、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−α刺激によるＮＦ−κＢ活性化およびアミノ酸の抑制効果を示した。アミノ酸で非処理のＴＨＰ−１細胞では、ＴＮＦ−α刺激によりＮＦ−κＢ活性は有意に誘導され（ｐ＜０．００１）、２ｍＭ、２０ｍＭのグリシン、ヒスチジンおよび０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのシステインの前処理で有意にＮＦ−κＢ活性化を抑制した。それらのアミノ酸のうちシステインによる前処理の抑制効果が最も大きかった（ｐ＜０．００１）。アラニンには抑制効果は見られなかった。
【実施例３】
【００４５】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＩκＢαリン酸化抑制効果＞
さらにアミノ酸のＮＦ−κＢ活性化の抑制効果が、ＩκＢαのリン酸化によるものかどうかを検討した。実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞を、ＴＮＦ−α刺激１０、２０、３０、６０分後に細胞全抽出物を得た。抽出物をドデシル硫酸ポリアクリル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を施行後、リン酸化したＩκＢαに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法で検出した。
【００４６】
＜結果＞
アミノ酸の前処理、特にヒスチジンとシステインの前処理では、図３に示すようにＩκＢαのリン酸化を抑制した。これによりＮＦ−κＢ活性の抑制効果は、ＩκＢαリン酸化抑制効果によることが示唆された。
【実施例４】
【００４７】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）発現抑制効果＞
実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞をＴＮＦ−α ２ｎｇ／ｍｌで６時間刺激し、アミノ酸のＩＣＡＭ−１発現への抑制効果についてフローサイトメーターを用いて検討した。フローサイトメーターによるＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の発現解析は、フィコエリトリン（ＰＥ）標識した抗ヒトＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用し、陰性コントロール（ｉｓｏｔｙｐｅ−ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＰＥ標識したマウスＩｇＧ１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）も使用した。細胞の免疫蛍光状態は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を搭載した細胞解析装置のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーにより解析し、１万個の細胞を分析した。データは実施例１と同様の方法で解析した。
【００４８】
＜結果＞
ＮＦ−κＢで調節されるＩＣＡＭ−１の発現について図４に示した。２ｍＭ、２０ｍＭのグリシン、ヒスチジン、および０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭのシステインでの前処理で有意にＩＣＡＭ−１の発現を抑制した。そのうちシステインでの前処理が図２に示したＮＦ−κＢ活性と同じように最も顕著であった（ｐ＜０．００１）。アラニンには、ＩＣＡＭ−１の発現抑制効果は見られなかった。
【実施例５】
【００４９】
＜ヒト単球・マクロファージにおけるアミノ酸のＩＬ−８産生抑制効果＞
実施例１と同様に、ＴＨＰ−１細胞を用い、ＴＮＦ−αで６時間刺激後、培養上清中のＩＬ−８濃度を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたサンドイッチ ＥＬＩＳＡ法によりマニュアルに従って測定した。データは実施例１と同様の方法で解析した。
【００５０】
＜結果＞
図５に示すように、ＴＮＦ−α刺激後、ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−８産生においてもアミノ酸の抑制効果が認められた。２ｍＭ、２０ｍＭのグリシン、ヒスチジン、システインでの前処理はＴＮＦ−α刺激後のＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−８産生を抑制した。特に、ヒスチジンの２ｍＭ、２０ｍＭ、およびシステインの２０ｍＭでは顕著に抑制効果を表した（ｐ＜０．００１）。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は医療、食品、飼料等の分野で、ＮＦ−κＢの活性化に起因する炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患、あるいは自己免疫疾患の予防および／または治療のために利用される可能性があり、極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分として含有する、ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項２】
ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、炎症性腸疾患である請求項１に記載の予防剤および／または治療剤。
【請求項３】
ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、自己免疫疾患である請求項１に記載の予防剤および／または治療剤。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する医薬品。
【請求項５】
請求項１〜３に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する食品。
【請求項６】
請求項１〜３に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する飼料。
【請求項１】
システイン、グリシン、およびヒスチジンの少なくとも１つを有効成分として含有する、ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項２】
ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、炎症性腸疾患である請求項１に記載の予防剤および／または治療剤。
【請求項３】
ＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患が、自己免疫疾患である請求項１に記載の予防剤および／または治療剤。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する医薬品。
【請求項５】
請求項１〜３に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する食品。
【請求項６】
請求項１〜３に記載のＮＦ−κＢの活性化に起因する疾患の予防剤および／または治療剤を含有する飼料。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１６７２８（Ｐ２０１１−１６７２８Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６０４１２（Ｐ２００９−１６０４１２）
【出願日】平成２１年７月７日（２００９．７．７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月７日（２００９．７．７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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