本発明は、ヒトおよび動物において、損傷、欠損および／または変性した組織の再生に有用な方法および組成物を提供する。本発明は、無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを提供し、これは、無細胞の血液から誘導した産物をマトリックスが形成するのに十分な期間にわたってインキュベートすることによって生成される。そのようなマトリックスを作製する方法およびそのようなマトリックスを損傷、欠損および／または変性した組織の再生のために使用する方法も提供する。特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、損傷、欠損および／または変性した神経組織の治療に有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／７３０，６１４号（２００５年１０月２６日出願）との同時係属出願であり、この米国出願と一人の共通の発明者を共有し、そしてこの米国出願に対する優先権を主張する。この米国出願の内容は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（背景）
本発明は、動物組織から誘導した生体吸収性のタンパク質性マトリックスの形成に関する。また、本発明は、組織の増殖および産生／再生を誘発および促進するように機能するこのマトリックスのｉｎ ｖｉｖｏにおける使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
血液を除くすべてのその他の体内の組織は、統合的な構造に配置された細胞からなり、この構造には、適切な増殖分化および機能を維持するために細胞外の支持骨格またはマトリックスが必要である。組織工学の分野では、損傷または疾患の間に失われた組織に代替組織を提供するために、細胞の接着、増殖およびパターン形成を可能にする特性を有する人工高分子または天然高分子のいずれかを使用して、複雑な構造を達成する方法を提供することを目指している。理想的な骨格材料は、非免疫原性であり、体内に見出される自然の骨格支持構造を可能な限り厳密に模倣するであろう。これらの特質のうちの１つは、再生または修復された組織がホメオスタシスおよび機能の究極的なレベルに到達できるように骨格が生分解性であることである。先行技術では、細胞の接着および増殖のための支持構造ならびに生物学的に活性な化学薬品、タンパク質およびペプチドの送達を提供することができる生体吸収性の骨格を構築することが知られている。最も広く使用されているのは、多糖類をはじめとする、種々の高分子からなるヒドロゲルである。生分解性多糖類単独からまたは生分解性多糖類をコラーゲン等の天然の細胞外マトリックスタンパク質と組み合わせて生成した生分解性ヒドロゲルが、薬物送達のためのビヒクルとして利用されており（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）、かつ再生組織の構造上の支持を提供している（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５の諸所）。最近、ヒドロゲル骨格を、神経組織の再生に用いる誘導チャネルを提供することができる橋渡し構造として、脊髄損傷（「ＳＣＩ」）の治療に使用することが報告されている（非特許文献１６）。血液またはその他の組織からの細胞外マトリックスまたは骨格の材料の生成が、特許文献１（ＶａｃａｎｔｉおよびＶａｃａｎｔｉ、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ」、２００３年１０月１７日出願）によって記載されている。この材料は、実質的に細胞、細胞片および細胞残余物からなると記載されている。しかし、この材料は、創傷修復または再生を促進する生物学的機能性を有するとは報告されておらず、生細胞または細胞に類似する特性を有するその他の構造をさらに必要とする（非特許文献１７）。これらの研究成果にもかかわらず、細胞の接着、増殖促進特性をさらに有し、創傷部位の周囲の未損傷組織の再生／修復特性を支持または刺激する非免疫原性（または低免疫原性）の骨格材料が依然として求められている。
【特許文献１】米国特許公開第２００４／０１３７６１３号明細書
【非特許文献１】Ｃａｓｃｏｎｅ，Ｍ．Ｇら、「Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」、Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．、１２版、２６７〜２８１頁、２００１年
【非特許文献２】Ｊｅｏｎｇ，Ｂ．ら、「Ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｏｆ ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、６３巻、１５５〜１６３頁、２０００年
【非特許文献３】Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．、「Ｓｍａｒｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２０巻、１〜１６頁、２００３年
【非特許文献４】Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．ら、「Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、５０巻、２７〜４６頁、２０００年
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．およびＣｈｕ，Ｃ．Ｃ．、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ」、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｐｐｌ．、１６巻、３０５〜３２５頁、２００２年
【非特許文献６】Ａｒｅｖａｌｏ−Ｓｉｌｖａ，Ｃ．Ａ．ら、「Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ」、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．、１２６巻、１４４８〜１４５２頁、２０００年
【非特許文献７】Ｄｅｓｇｒａｎｄｃｈａｍｐｓ，Ｆ．、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｕｒｏｌ．、１０巻、２０１〜２０６頁、２０００年
【非特許文献８】Ｋｉｍ，Ｔ．Ｋ．ら、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｈｅ ｚｏｎａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ」、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、１１巻、６５３〜６６４頁、２００３年
【非特許文献９】Ｋｏｊｉｍａ，Ｋ．ら、「Ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｒａｃｈｅａ ｕｓｉｎｇ ｓｈｅｅｐ ｎａｓａｌ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ」、Ｆａｓｅｂ Ｊ．、１７巻、８２３〜８２８頁、２００３年
【非特許文献１０】Ｍａｉｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」、Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．、１０５巻、２０４９〜２０５８頁、２０００年
【非特許文献１１】Ｓａｉｍ，Ａ．Ｂ．ら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈａｐｅ ｏｆ ａ ｈｅｌｉｘ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ」、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ、１１０巻、１６９４〜１６９７頁、２０００年
【非特許文献１２】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ａ．ら、「Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｖｅｎｏｕｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｎｏｎｓｕｒｇｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、４１巻、１９６４〜１９７１頁、２００３年
【非特許文献１３】Ｗａｋｅ，Ｍ．Ｃ．ら、「Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｆｏａｍｓ」、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、４巻、２７５〜２７９頁、１９９５年
【非特許文献１４】Ｗｅｎｇ，Ｙ．ら、「Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｆｏｒ ｍａｎｄｉｂｌｅ ｃｏｎｄｙｌａｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．、５９巻、１８５〜１９０頁、２００１年
【非特許文献１５】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ．ら、「Ｈｙｄｒｏｇｅｌ−ｂａｓｅｄ ｎｏｎ−ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２９巻、５６４〜５７２頁、５７４頁、５７６頁、２０００年
【非特許文献１６】Ｔｓａｉ，Ｅ．Ｃ．ら、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓｔｅｍ ｍｏｔｏｒ ａｘｏｎｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．、２１巻、７８９〜８０４頁、２００４年
【非特許文献１７】Ｖａｃａｎｔｉ，Ｍ．Ｐ．ら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｒｅ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｓ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８０巻、４５５〜４６０頁、２００１年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
特定の実施形態では、本発明は、生物学的な再生特性を有する生体吸収性の構造（以下、「再生マトリックス」と呼ぶ）を生成するための方法を提供する。そのような再生マトリックスを、これらに限定されないが、血液、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、膵臓、嗅粘膜、骨髄、脳脊髄液、リンパ液およびそれらの組合せをはじめとする、いずれかの動物組織から生成することができる。特定の実施形態では、再生マトリックスを、血餅または抗凝血薬を用いて採取した血液のいずれかを処理することによって生成する。特定の実施形態では、再生マトリックスを、細胞を最初に除去した組織試料から生成する。再生マトリックスを対象自体の組織から誘導することができ、したがって、自家移植への適用が可能となる。または、再生マトリックスの組織型を一致させることができ、同種異系間の適用が可能となる。特定の実施形態では、再生マトリックスを異種の組織から誘導する。異種間の適用は、研究の設定においては有用性を有するが、通常、ヒトまたは動物に適用する治療形態にはならない。特定の実施形態では、再生マトリックスを血液、例えば、対象自体の血液から生成する。
【０００５】
本発明の特定の方法によって生成した再生マトリックスは、組織の損傷、欠損および／または変性した部位において、組織の再生を開始し、増加させ、支持し、かつ／または導くことができるという点で治療特性を有し、それによって、周囲の組織が正常な、機能性の組織に再生する。特定の実施形態では、本発明は、再生マトリックスを対象に投与する方法を提供し、再生マトリックスが、組織の再生を開始し、かつ／または増加させる。特定の実施形態では、本発明によって再生される損傷した組織として、これらに限定されないが、神経組織、筋肉組織、肝臓組織、心臓組織、肺組織および／または皮膚組織があげられる。例えば、特定の実施形態では、血液および／または血餅の天然の再生成分を生かし、それらを再生マトリックスに操作するための方法を提供し、この再生マトリックスを創傷部位に適切な時期に送達して、非機能性の瘢痕形成が生じるのを最小化する一方で、再生応答を最大化することができる。
【０００６】
特定の実施形態では、再生マトリックスは、神経組織の損傷、欠損および／または変性に至る状態を治療するのに有用である神経再生特性を有する。特定の実施形態では、再生される神経組織は、中枢神経系（「ＣＮＳ」）からの神経組織を含む。特定の実施形態では、例えば、脊髄損傷、脊髄癌、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中および／または多発性硬化症等の疾患および／または損傷の結果として、ＣＮＳ組織が欠損する。これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、薬物、サイトカイン、細胞外マトリックス分子および／または増殖因子をはじめとする、１種以上の治療用作用物質の添加によって、再生マトリックスの再生活性を増強または補足することができる。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の治療効果が増加する。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明は、組織再生特性を有する生体吸収性の構造を含む再生マトリックスを提供する。特定の実施形態では、そのような再生マトリックスは、１種以上のタンパク質を含む。例えば、そのような再生マトリックスは、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン前駆体、補体成分３、Ａ〜Ｄ鎖ヘモグロビン、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、メダラシン阻害剤２、炭酸脱水酵素および／またはＣＡ１タンパク質のうちの１種以上を含むことができる。特定の実施形態では、再生マトリックスは、実質的な代謝活性を欠く。
【０００８】
特定の実施形態では、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、薬物、サイトカイン、細胞外マトリックス分子および増殖因子をはじめとする、１種以上の治療用作用物質を用いて、本発明の再生マトリックスを補足する。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の治療効果が増加する。特定の実施形態では、再生マトリックスを、これらに限定されないが、幹細胞、前駆細胞、神経細胞および／またはグリア細胞をはじめとする、細胞と共に播種してもよいし、細胞と混合してもよい。
【０００９】
特定の実施形態では、本発明は、対象において機能性の組織の再生を適用部位で誘発するための生体吸収性の組織再生マトリックスを提供する。特定の実施形態では、再生マトリックスは、組織の自己再生を適用部位で促進する。特定の実施形態では、再生マトリックスは、周囲の組織の生物学的活性を増加させる。特定の実施形態では、再生マトリックスは、固体または半固体の形態である。例えば、再生マトリックスは、三次元マトリックスの形態であることができる。特定の実施形態では、再生マトリックスは、懸濁液の形態であることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（特定の実施形態の詳細な説明）
定義
「無細胞試料」：本明細書で使用する場合、「無細胞試料」という用語は、単離した組織試料から細胞を除去することによって得た生体試料を指す。特定の実施形態では、無細胞試料を使用して、無細胞の生体吸収性の組織再生マトリックスを得る。無細胞試料は、多様な組織試料の型のうちのいずれかから得ることができる。例えば、無細胞試料を、４種の基本的な動物の組織型（筋肉組織、結合組織、上皮組織および神経組織）のうちのいずれか、３種の基本的な植物の組織型（基本組織、表皮組織および維管束組織）のうちのいずれか、多様なその他の特異的な組織型（例えば、血液または肝臓組織）のうちのいずれか、および／またはこれらもしくはその他の組織型のいずれかの組合せから得ることができる。特定の実施形態では、無細胞試料を、胎盤組織から、臍帯組織から、ならびに／あるいは心血管、消化器、内分泌、排泄、免疫、外被、リンパ、筋肉、神経、生殖、呼吸および／または骨格の器官系のうちの１種以上の組織から得る。当業者であれば、無細胞試料を得ることができるその他の組織型が分かるであろう。特定の実施形態では、無細胞試料を、２種以上の異なる組織型を含む組織試料から得る。特定の実施形態では、無細胞試料を、組織試料を、フィルターを通過させることによって得、そのようなフィルターを通過させて細胞を排除するのに十分に小さいろ過直径をこのフィルターは有する。特定の実施形態では、無細胞試料を、組織試料を遠心分離し、上清を使用することによって得る。当業者であれば、組織試料から細胞を除去するために有用なその他の方法が分かるであろう。無細胞試料を組織試料から得る場合、細胞の一部または全部が溶解する場合があると理解されている。特定の実施形態では、無細胞試料は、そのような溶解した細胞からの１種以上の成分を含む。特定の実施形態では、無細胞試料は、実質的な代謝活性を示さない（下記の「実質的な代謝活性」の定義を参照）。
【００１１】
「生体吸収性」：本明細書で使用する場合、「生体吸収性」という用語は、生物学的環境において、限定された期間存在するという特徴を指す。特定の実施形態では、本発明の再生マトリックス、および／または本発明の１つ以上の方法によって生成した再生マトリックスは、生体吸収性である。生体吸収性の再生マトリックスに照らして「生体吸収性」であるという場合には、再生マトリックスを生物学的環境において留置した後、所与の時点で観察した場合、再生マトリックスが初期の形態で存在するとはもはや認められないことを意味する。特定の実施形態では、生物学的環境において留置した場合、生体吸収性の再生マトリックスは、数日、数週間または数カ月の間存在することができる。例えば、生物学的環境において留置した場合、生体吸収性の再生マトリックスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０または１８０日以上の間存在することができる。生体吸収性の再生マトリックスは、多様な機構のうちのいずれかによって生体への吸収が可能である。特定の実施形態では、生体吸収性の再生マトリックスは、細胞の活性の作用を介して生体への吸収が可能である。例えば、生体吸収性の再生マトリックスは、生体吸収性の再生マトリックスを解体するマクロファージの作用を介して生体に吸収される。特定の実施形態では、生体吸収性の再生マトリックスは、機械的、化学的、代謝的および／または酵素的な分解を介して解体された後に生体に吸収される。再生マトリックスの解体産物の身体による吸収および／または身体からの排泄が可能である限り、生体吸収性の正確な機構は重要でないことが当業者には理解されるであろう。
【００１２】
「インキュベートする」：本明細書で使用する場合、再生マトリックスを生成する場面における「インキュベートする」という用語は、再生マトリックスが所与の時間をかけて形をなすことを可能にする工程を指す。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料をインキュベーションチャンバー内でインキュベートすることによって生成する（下記の「インキュベーションチャンバー」の定義を参照）。特定の実施形態では、無細胞試料を、インキュベートする間、処理媒体中に懸濁化および／または可溶化する。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を多様な温度のうちのいずれかにおいてインキュベートすることによって生成するが、ただし、無細胞試料が液体の状態に留まる場合に限られる。例えば、そのようなインキュベーションを、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または４２℃以上の温度において行うことができるが、ただし、無細胞試料がこれらの温度で液体の状態に留まる場合に限られる。特定の実施形態では、インキュベートする期間中、温度を上昇および／または低下させることができ、したがって、インキュベーションが所与の範囲の温度にわたって生じる。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を多様な気圧のうちのいずれかにおいてインキュベートすることによって生成する。例えば、無細胞試料を、標準気圧（「ＡＴＭ」）、またはＡＴＭ未満もしくはＡＴＭ超のいずれかの圧力においてインキュベートすることができる。特定の実施形態では、無細胞試料をインキュベートする間に、気圧を変化させる。例えば、インキュベートする間に、気圧を上昇および／または低下させることができる。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を多様な周囲の酸素濃度のうちのいずれかにおいてインキュベートすることによって生成する。特定の実施形態では、周囲の酸素濃度は、標準気圧での酸素濃度よりも低い。例えば、インキュベートする間の周囲の酸素濃度は、約２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％以下であることができる。特定の実施形態では、インキュベートする間の周囲の酸素濃度は、ほぼまたはまさしく０％である。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を多様な周囲湿度のうちのいずれかにおいてインキュベートすることによって生成する。特定の実施形態では、インキュベートする間、周囲湿度を低く保ち、その結果、無細胞試料中の液体の蒸発が増加する。特定の実施形態では、新たな溶質を含有する液体（これらに限定されないが、例えば、「処理媒体」または「生理的溶液」があげられる。下記の定義を参照）を、蒸発が生じている無細胞試料に連続的または定期的に添加する。そのような実施形態では、無細胞試料の浸透圧モル濃度が、蒸発および新たな溶質を含有する液体の添加の結果として、時間の経過と共に増加することが理解されるであろう。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を多様な有効重力場強度のうちのいずれかにおいてインキュベートすることによって生成する。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を（例えば、海水面および／または海水面上の１つ以上の別々の海抜での）地球の重力の重力場強度にほぼ等しい有効重力場強度においてインキュベートすることによって生成する。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を海水面での地球の重力の重力場強度より高い有効重力場強度においてインキュベートすることによって生成する。例えば、地球の重力の重力場強度より高い有効重力場強度を、海水面下または遠心機中でインキュベートすることによって得ることができるが、ただし、そのような方法が何らかの振盪を生じない場合に限られる。特定の実施形態では、再生マトリックスを、無細胞試料を海水面での地球の重力の重力場強度より低い有効重力場強度においてインキュベートすることによって生成する。例えば、地球の重力の重力場強度より低い有効重力場強度を、高い海抜または宇宙でインキュベートすることによって得ることができる。
【００１３】
「インキュベーションチャンバー」：本明細書で使用する場合、「インキュベーションチャンバー」という用語は、再生マトリックスの形成の間に、無細胞試料をインキュベートする（上記の「インキュベートする」の定義を参照）ために使用することができる多様な容器のうちのいずれかを指す。特定の実施形態では、インキュベーションチャンバーは、フラスコ、培養皿、ビーカーおよびその他等の標準的な実験用容器を含む。当業者であれば、その他の適切で有用な標準的な実験用容器が分かるであろう。特定の実施形態では、インキュベーションチャンバーは、密閉容器または半密閉容器を含む。特定の実施形態では、インキュベーションチャンバーは、１種以上の物質に対して透過性または半透過性である密閉容器または半密閉容器である。例えば、特定の実施形態では、インキュベーションチャンバーは、空気および／またはガス状の分子に対して透過性である容器を含む。特定の実施形態では、インキュベーションチャンバーは、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット（ＢｉｏＣｒｙｓｔａｌ Ｌｔｄ．製、Ｗｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅ、オハイオ州）を含む。特定の実施形態では、密閉または半密閉のインキュベーションチャンバーは、材料を、インキュベートする工程を開始してから容器に添加および／または容器から除去することができるように設計されている。例えば、空気および／またはガス状の分子に対して透過性または半透過性であるインキュベーションチャンバーを、液体および／または固体の材料を、インキュベーションの間および／または後に１つ以上の時点でチャンバーに添加および／またはチャンバーから除去することができるように設計することができる。特定の実施形態では、密閉または半密閉のインキュベーションチャンバーは、材料を、インキュベーションチャンバーを貫通することができる針またはその他の用具の使用によって添加および／または除去することができるように設計されている。特定の実施形態では、針またはその他の用具を用いて貫通した密閉または半密閉のインキュベーションチャンバーが、それ自体で「再度密閉」し（かつ／または再度密閉することができ）、その結果、インキュベーションチャンバーの密閉または半密閉の状態が維持されることが望ましい。
【００１４】
「マトリックス」：本明細書で使用する場合、「マトリックス」という用語は、これらに限定されないが、固体または半固体の構造をはじめとする、いずれかの物理的構造、および／あるいは懸濁液を指す。特定の実施形態では、本発明は、再生性の特徴を有するマトリックスを提供する（下記の「再生性の」の定義を参照）。そのような再生性のマトリックスを、本明細書では、「再生マトリックス」と呼ぶ。
【００１５】
「処理媒体」：本明細書で使用する場合、「処理媒体」という用語は、再生マトリックスを得る工程の間に、組織試料、無細胞試料またはそれらの両方に添加することができる液状の溶液を指す。特定の実施形態では、処理媒体は、生理的溶液（下記の「生理的溶液」の定義を参照）を含む。特定の実施形態では、処理媒体は、最少塩溶液を含む。例えば、処理媒体は、ＰＢＳであることができる。当業者であれば、本発明によって使用することができるその他の最少塩溶液が分かるであろう。さらに、当業者であれば、これらに限定されないが、ｐＨ、浸透圧モル濃度、緩衝能、１種以上の特定のイオンの濃度および／または多様なその他の溶液特性のうちのいずれかをはじめとする、１つ以上の望ましい溶液特性を達成するために最少塩溶液を改変するために有用な組成物および方法が分かるであろう。特定の実施形態では、処理媒体は、１種以上の治療用作用物質（下記の「治療用作用物質」の定義を参照）を含む。特定の実施形態では、処理媒体を組織試料に単離の前、間および／または後に添加する。特定の実施形態では、処理媒体を無細胞試料に細胞の除去の前、間および／または後に添加する。特定の実施形態では、処理媒体を無細胞試料にインキュベートする工程の間に添加する。特定の実施形態では、処理媒体をインキュベートする工程の間に複数の時点で添加する。特定の実施形態では、再生マトリックス生成工程の間に添加する処理媒体の１つ以上の成分が、生成した再生マトリックスの一部となる。
【００１６】
「生理的溶液」：本明細書で使用する場合、「生理的溶液」という用語は、１つ以上の生理的条件に類似するまたはそれらと同一である溶液、あるいは特定の生理的環境の生理的状態を変化させることができる溶液を指す。また、本明細書で使用する「生理的溶液」は、（これらに限定されないが、哺乳動物、脊椎動物および／またはその他の細胞をはじめとする）細胞の増殖を支持することができる溶液も指す。特定の実施形態では、生理的溶液は、規定された培地を含み、この場合、媒体成分のそれぞれの濃度が分かっている、かつ／または制御されている。典型的には、規定された培地は、これらに限定されないが、塩、アミノ酸、ビタミン、脂質、微量元素、および炭水化物等のエネルギー源をはじめとする、細胞の増殖を支持するのに必要な栄養素をすべて含有する。規定された培地の非限定的な例として、ＤＭＥＭ、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、１９９培地；Ｆ−１２（Ｈａｍ）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ；Ｆ−１０（Ｈａｍ）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ；基礎培地（ＭＥＭ）、ウイリアムスＥ培地、およびＲＰＭＩ １６４０があげられる。当業者であれば、本発明によって使用することができるその他の規定された培地が分かるであろう。特定の実施形態では、生理的溶液は、１種以上の規定された培地の混合物を含む。特定の実施形態では、生理的溶液は、複合媒体であり、この場合、媒体成分のうちの少なくとも１つが、分かっておらず、かつ制御されていない。生理的溶液は、本発明の方法によって再生マトリックスを生成するのに有用であるが、この詳細な説明の全体から明らかになるであろうが、再生マトリックスを生成するためにインキュベートする無細胞試料は、細胞を含有しない（上記の「無細胞試料」の定義を参照）。したがって、そのような場合の処理媒体は、細胞の増殖を支持することができるとしても、細胞の増殖が再生マトリックス生成の必要な構成要素ではないと理解されている。しかし、特定の実施形態では、細胞を再生マトリックス形成工程の間に１つ以上の特定の時点でインキュベーションチャンバーに添加することができる。これらの場合には、生理的溶液が、それ自体でまたは再生マトリックス溶液と組み合わさって、インキュベーションチャンバーに添加した細胞の生存能力を支持することができると理解されている。
【００１７】
「再生」、「再生する」、「再生性の」：本明細書で使用する場合、これらの用語は、弱った、損傷した、欠損した、および／または変性した組織の増殖、再増殖、修復、機能性、パターン形成、結合性、強化、活力および／または創傷治癒の自然の過程を開始し、増加させ、調節し、促進し、支持し、かつ／または導く、いずれかの過程または性質を指す。また、これらの用語は、弱った、疲労した、および／または正常な組織の増殖、強化、機能性、活力、強靭性、効力および／または健康を開始し、増加させ、促進し、支持し、かつ／または導く、いずれかの過程または性質も指す。特定の実施形態では、本発明は、損傷した、欠損した、および／または変性した組織の再生に有用な組成物および方法を提供する。例えば、本発明の方法および組成物を利用して、損傷した、欠損した、および／または変性した組織の再生を開始し、増加させ、調節し、支持し、促進し、かつ／または導くことができる。特定の実施形態では、本発明は、１つ以上の再生特性または再生活性を示す再生マトリックス（上記の「再生マトリックス」の定義を参照）を提供する。特定の実施形態では、再生は、以下の過程のうちの１つ以上の開始、増加、調節、促進、支持および／または導きを含む：自然な創傷治癒、組織の成長、組織の機能性、パターン形成、結合性、血管新生、増殖および／または前駆細胞の活性化、細胞の成長および／または増殖、細胞の特殊分化および／または伸長、細胞の脱分化および／または分化、再生に関連する細胞遺伝子の上方制御、ならびに／あるいは瘢痕形成の抑制。しかし、再生は、これらの過程、性質および活性に限定されるわけではなく、当業者であれば、当技術分野において、「再生」、「再生する」または「再生性の」と見なされるその他の過程、性質または活性が分かるであろう。
【００１８】
「実質的な代謝活性」：本明細書で使用する場合、「実質的な代謝活性」という用語は、未変化の細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて典型的に示す代謝活性を指す。特定の実施形態では、無細胞試料および／または本発明の再生マトリックスは、細胞を欠き、したがって、実質的な代謝活性を示さない。多様な手法が当業者に知られており、それによって、代謝活性を検出および／または測定することができる。例えば、未変化の細胞は、巨大分子（例えば、糖、アミノ酸、脂質およびその他）の好気的および／または嫌気的な解体によって、顕著な量のＡＴＰを産生する。したがって、典型的には、ＡＴＰの顕著なレベルの産生は、試料中に未変化の細胞が存在することを指し示す。未変化の細胞の存在を指し示す特定の現象が無細胞試料中に検出される場合があることを当業者であれば理解するであろう。しかし、細胞を指し示すそのような現象は、典型的には、細胞の存在の結果として生じるそのような現象のレベルまたは規模と比較して、より低いまたは減少したレベルまたは規模で観察される。したがって、例えば、無細胞試料および／または再生マトリックスが、低いレベルのＡＴＰの産生を示す場合があり、このレベルは、無細胞試料および／または再生マトリックス中に未変化の細胞が存在した場合に産生されるであろうレベルより十分に低い。
【００１９】
「治療用作用物質」：本明細書で使用する場合、「治療用作用物質」という用語は、本発明の方法および／または再生マトリックスと共に使用した場合に、１つ以上の有利な治療効果を示す多様な物質のうちのいずれかを指す。考案の再生マトリックスおよび方法と共に使用することができる治療用作用物質の例として、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、薬物、サイトカイン、細胞外マトリックス分子および／または増殖因子があげられる。当業者であれば、本発明によって使用することができる適切および／好都合なその他の治療用作用物質が分かるであろう。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果の大きさが増加する。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果の活性が延長される。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果が時間をかけて放出される。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果が時間の経過に伴う実質的な減少から保護される。特定の実施形態では、２種以上の治療用作用物質を再生マトリックス中に投与する。
【００２０】
「組織試料」：本明細書で使用する場合、「組織試料」という用語は、細胞および／または細胞外材料を含む生体試料を指す。例えば、組織試料は、４種の基本的な動物の組織型（筋肉組織、結合組織、上皮組織および神経組織）のうちのいずれか、３種の基本的な植物の組織型（基本組織、表皮組織および維管束組織）のうちのいずれか、多様なその他の特異的な組織型（例えば、血液または肝臓組織）のうちのいずれか、および／またはこれらもしくはその他の組織型のいずれかの組合せを含むことができる。特定の実施形態では、組織試料は、胎盤組織から、臍帯組織から、ならびに／あるいは心血管、消化器、内分泌、排泄、免疫、外被、リンパ、筋肉、神経、生殖、呼吸および／または骨格の器官系のうちの１種以上の組織からの組織を含む。当業者であれば、本発明によって使用することができるその他の組織型が分かるであろう。特定の実施形態では、組織試料は、２種以上の異なる組織型を含む。組織試料を、多様な生物体のいずれかから単離することができる。非限定的な例として、組織試料を、ヒト、ブタ、ラット、サンショウウオ、ウシ、イヌ、ネコ、マウスおよび／またはウサギから単離することができる。当業者であれば、組織試料を単離することができるその他の適切な生物体が分かるであろう。特定の実施形態では、組織試料を、再生マトリックスを生成するための出発材料として使用する。特定の実施形態では、再生マトリックスを生成するために使用する組織試料を、再生マトリックスを使用しようとする生物体の種類から単離する。例えば、ヒトにおいて使用しようとする再生マトリックスを、ヒトから単離した出発組織試料から生成することができる。特定の実施形態では、再生マトリックスを生成するために使用する組織試料を、再生マトリックスを使用しようとする個々の生物体から単離する。例えば、個人において使用しようとする再生マトリックスを、その個人から単離した出発組織試料から生成することができる。特定の実施形態では、再生マトリックスを、再生マトリックスを使用しようとする個人の血液から生成する。
【００２１】
概要
特定の実施形態では、本発明は、組織の損傷の部位において、組織の再生を開始し、増加させ、支持し、かつ／または導くことができる再生マトリックスを提供する。例えば、本発明による再生マトリックスを使用して、神経組織、筋肉組織、肝臓組織、心臓組織、肺組織および／または皮膚組織を再生することができる。
【００２２】
再生マトリックスが、損傷、および／またはこれらに限定されないが、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織をはじめとする、変性した組織を修復する能力は、創傷治癒および組織の発生の科学に基づく。創傷治癒の過程は、十分には解明されていないが、本発明は、再生マトリックスが損傷および／または変性した組織の再生を開始し、増加させ、支持し、かつ／または導くことができるという知見を包含する。
【００２３】
本発明の再生マトリックスの１つの利点は、組織の再生を増強しない特定の創傷治癒の過程を抑制することができる一方で、患者が組織を再生することを可能にするその他の過程を増強することである。身体がそれ自体を迅速に修復できるという点は、注目に値する。しかし、創傷治癒の過程の特定の面は、サンショウウオ等の下等動物種に見出される元々の再生機能性を可能にしない。創傷治癒および組織の発生の過程の望ましくない特色を抑制し、望ましい特色を増強または再現することによって、再生マトリックスは、優れた結果を達成することができる。サンショウウオ等の下等動物種とは異なり、ヒトにおける創傷治癒の自然な過程は、瘢痕組織をもたらして損傷部位をそれ以外の身体から単離することによって、損傷から最も迅速に回復するようにプログラムされており、これは、脊髄またはその他のＣＮＳの損傷の場合には、その他の、平行する創傷治癒の過程の効果が限定されていること、またはそのような効果を欠くことにより、機能の回復を欠くことになる。中枢神経系のその他の部分および身体のその他の組織の損傷および変性についても、同じことがいえる。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の方法および／または再生マトリックスは、損傷、欠損および／または変性した神経組織、例えば、中枢神経系組織の治療に有用である。歴史的に、脊髄の損傷をはじめとする、中枢神経系の損傷に関しては、顕著な進歩が見られず、利用可能な治療法がない状態である。組織、特に、中枢神経系組織を再生させる治療法を欠く主たる理由は、これらの組織が命にかかわり、高度に複雑であるという性質による。
【００２５】
本発明は、高度に複雑な生物学的および構造的本質を有する脊髄を、ＳＣＩ患者において、この複雑な生物学的および構造的本質の修復を促進し、かつ脊髄の正しいパターン形成および再結合性を促進する、関連のある活性を有する産物を用いて修復できるという知見を包含する。中枢神経系のその他の領域についても、同じことがいえる。本発明の再生マトリックスを、これらおよびその他の好都合な特徴を有するように設計する。さらに、追加の機能性を、本発明の再生マトリックスに、比較的単純で直接的な様式で加えることもできる。今日まで、ＳＣＩ患者における脊髄等、中枢神経系の複雑な機能性の修復を目指して、すべてを包括するアプローチを用いて開発された、ＣＮＳの損傷およびＳＣＩ患者を治療するために形成されたものは他には存在しない。
【００２６】
創傷治癒
創傷治癒の過程においては、いくつかの型の細胞が、創傷治癒の過程の異なる段階で関与し、それぞれが、損傷した組織を再生し、その機能性を修復するのに独自に寄与する。一般に、第一線の細胞は、血流から生じ、これには、マクロファージが含まれる。マクロファージの仕事は、損傷部位を浄化して、新たな細胞の増殖の余地を生み出すこと、および創傷治癒の過程の次の段階で必要になる細胞を活性化する増殖因子を放出することである。マクロファージ単独では、脊髄再生に及ぼす効果は比較的小さいが、その効果はまったくないよりはわずかでもあった方がよい。しかし、その他の作用機構と組み合わさると、活性化マクロファージは、再生過程に対してより顕著な効果を及ぼす。特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスによって、多数の活性化マクロファージの脊髄損傷部位に進入する速度が、移植後数日以内に増加するのを観察しており、したがって、何らかの活性化マクロファージを組織の損傷部位に注入する必要がない。しかし、考案の再生マトリックスがマクロファージの組織の損傷部位への侵入を促進しても、それでもやはり、本発明の再生マトリックスと共に、またはそれに加えて、マクロファージを損傷部位に、またはその付近に投与する場合があることを、当業者であれば理解するであろう。
【００２７】
創傷治癒の自然の過程の次のステップは、新しい血管の動員であり、外傷性の損傷の場合には、外傷性の損傷部位を囲い込む瘢痕を生み出す線維芽細胞の動員であり、それによって、損傷がゆっくりと修復される間、周囲の未損傷の組織が引き続き機能し、かつ損傷した組織の欠損した機能性を代償することができる。活性化マクロファージが放出する増殖因子が、これらの新しい血管および線維芽細胞の動員を促進する。残念なことに、中枢神経系は、血液脳関門に囲い込まれており、これによって、マクロファージの侵入および新しい血管の動員の促進が制限されている。血液脳関門の周囲の抑制因子が、特に、ＣＮＳの損傷または変性の場合には、新しい血管のＣＮＳの損傷部位への進入を制限し、その結果、線維芽細胞およびグリア細胞によって瘢痕が形成されるが、新しい血管が同時に形成されることはない。形成された瘢痕は、非常に分厚くかつ貫通できないようになり、新しい血管を欠くことは、損傷部位を復元できないことを意味する。最終的な結果として、病変（分厚い貫通できない瘢痕に囲み込まれた中が空洞の構造）が形成され、長期（慢性）のＣＮＳの損傷、脊髄損傷の場合には、慢性の麻痺に至る。特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスは、瘢痕形成のペースを落とし、それを抑制する一方で、新しい血管の形成を同時に促進する創傷治癒特性を有する。血管を欠くと病変（いずれの細胞も存在しない、体液で満たされた空洞）を生じることになるので、新しい血管がこれらの病変および／または病変がまさに形成されようとしている領域の中および周囲に形成されることは好都合である。理論に縛られる意図はないが、本発明の再生マトリックスが、独自の経路、すなわち、新しい血管を自然に形成させるフォン−ヴィレブランド因子陽性内皮様細胞に活性化マクロファージを分化形質転換（形質転換）させることによって、新しい血管を生み出すことができると仮定されている（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを参照）。したがって、この仮説によれば、そのような再生マトリックスによってＣＮＳの損傷部位に引きつけられた活性化マクロファージが、損傷部位を浄化する仕事を終え、増殖因子を放出した後に、それらのマクロファージは、新しい血管を形成する新たな、特殊分化した型の細胞に形質転換される。最終結果として、栄養素および酸素を新しい細胞および新しいＣＮＳ組織に提供する新たな血管網が広がる。ＣＮＳ損傷の動物モデルでは、移植した再生マトリックスが、移植の１週間以内にすでに新たな血管網（この血管網は、腫瘍において見られる血管の増殖の型には類似しないが、その代わり、胚の発達において存在する大規模な血管網の型に類似する）を生み出し始め、何らかの抑制的な瘢痕が存在するにしてもそれは限られていることが見出されている（例えば、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄを参照）。
【００２８】
新たな血管網の形成後、典型的には、創傷治癒の過程の次のステップでは、周囲の細胞が損傷部位へ移動することになる。新たに形成された血管が提供する栄養素および酸素を新鮮に補給するために、これらの細胞が損傷部位へ移動する。残念なことに、神経組織の損傷の場合には、神経細胞は、分化（成体細胞に形質転換）してしまうと移動および／または分裂（増殖）しない、体内では唯一の長期の細胞であり−仮に、移動するようなことがあると、これらの細胞が移動または分裂する度に、これらの細胞に固有の記憶が失われることになるであろう。要するに、特定の神経細胞が関与するそれらの記憶（体細胞系または自律神経系のいずれにしても）を「忘れる」ことになるであろう。しかし、当業者に知られているように、神経細胞は、軸索および樹状突起の形成および／または伸長を介して、新たに追加して記憶または結合を形成することができる。特定の実施形態では、再生マトリックスが、損傷部位の周囲の神経細胞におけるそのような新たな結合の形成ならびに正しいパターン形成および結合性をもたらす１つ以上の遺伝子の発現を促進して、発現が数倍増加する（例えば、図１８〜１９を参照）。特定の実施形態では、再生マトリックスが、神経細胞を損傷部位内に伸長させ、例えば、ＧＡＰ−４３およびＮｅｔｒｉｎファミリーの遺伝子が制御する結合等、有効で理にかなった新しい結合をそれらの細胞に作らせる。これらの遺伝子は、再生マトリックスによって上方制御される。そのような新しい結合を利用して、訓練および／または教育によって活用することができる新たなＣＮＳの機能性を得ることが可能であり、これは、新たなＣＮＳ組織の好都合な機能性となる。特定の実施形態では、そのような新たな機能性を、短期間、例えば、約２カ月というに時間の枠内で達成する。非限定的な１つの例として、脊髄損傷の場合には、これに続いて、動作が可能になるように筋肉を協調させて動かすように神経を訓練／教育する必要があるであろう。別の非限定的な例として、脳のブローカ領域（言語中枢）の場合には、これに続いて、理路整然として言語を生み出すように神経を訓練／教育する必要があるであろう。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスは、新たなＣＮＳ組織の形成を、三相性の神経前駆細胞の増殖を動員し、増加させることによってさらに増強する。三相性の神経前駆細胞は、独特で高度に可動性の若い細胞の型であり、これは、神経科学者によれば新たなＣＮＳ組織の自発的な増殖の原因に関係するとされている。新たなＣＮＳ組織の自発的な増殖は、特に、脳において、ヒトでのいくつかの症例で観察され、その場合、ヒトの損傷したＣＮＳ組織が、それ自体で、少なくとも部分的に修復された。三相性の神経前駆細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて（皿中で）研究することは困難である。これは、三相性の神経前駆細胞は、その性質からして、その環境が神経細胞またはグリア細胞（神経支持細胞：アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）のうちの１種を欠いていることを認識すると直ぐに、これらの細胞に分化（形質転換）してしまうからである（三相性の神経前駆細胞は、その環境が欠いている細胞の型に変化するようである）。しかし、本発明は、再生マトリックスの存在下では、三相性の神経前駆細胞が、再生マトリックスが除去または（例えば、体内で）生分解されるまで、増殖し続け、再生マトリックスが除去または生分解された時点で、三相性の神経前駆細胞は、形質転換し、広範な神経網を生み出すという知見を包含する。理論に縛られる意図はないが、１つの仮説として、新たなＣＮＳ組織を生じる過程の最後のステップとして、三相性の神経前駆細胞が、欠失した部分を部分的に満たすといわれている。この欠失した部分は、その他の周囲の神経細胞およびグリア細胞が、再生マトリックスの再生過程のそれらの相の間では満たさなかった部分であり、そこには、新たなＣＮＳ組織が生み出されることになる。正確な機構にかかわらず、最終結果として、考案の再生マトリックスによって刺激されて増殖する三相性の神経前駆細胞が、新たな神経組織を産生する。
【００３０】
創傷治癒の分野のその他のアプローチに関しては、従来の製品およびアプローチからは、いずれも、実験動物において未処置の対照動物と比較して若干からかろうじてまでの程度に有意な改善を得ている。さらに、今日までの臨床治験では、これら単独アプローチの製品によっては、プラセボを上回る何らかの有意な改善は実証されていない。その上、いくつかの症例では、ヒトへの移植における有害な免疫応答に関する技術的な問題が克服できていない。その他の困難として、製品が脳脊髄液（これは、典型的には、ヒトの場合１２０ｍｍＨ_２Ｏの圧力では約５ｍｍ／分の速度で動く）によって洗い流されること、および／または移植の間に顕著な追加の損傷を起こすことなく、製品をヒト患者に送達できないことがあげられる。本発明の再生マトリックスは、これらおよびその他の困難を克服する。特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスよって、実験動物において未処置の対照動物と比較して顕著な改善が得られ、毒物学的な効果は認められない。さらに、本発明の再生マトリックスは、長期の免疫学的問題なしに、ヒト患者に送達することができる形態で容易に入手することが可能である。
【００３１】
再生マトリックスの生成
本発明は、再生マトリックスを多様な方法のうちのいずれかによって生成することができるという知見を包含する。特定の実施形態では、異なる生成方法から、異なる物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性を示す再生マトリックスを得る。さらに、特定の実施形態では、本発明の方法によって生成した再生マトリックスの物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性を、生成工程の間に１つ以上の外因性の因子を提供することによって変化させる。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスを、無細胞試料を所与の期間インキュベートすることによって生成する。特定の実施形態では、無細胞試料を、組織試料から単離する。無細胞試料を、４種の基本的な組織型（筋肉組織、結合組織、上皮組織および神経組織）のうちのいずれかから、多様なその他の基本的でない組織型のうちのいずれかから、またはこれらもしくはその他の組織型のいずれかの組合せから得ることができる。特定の実施形態では、無細胞試料を、４種の基本的な動物の組織型（筋肉組織、結合組織、上皮組織および神経組織）のうちのいずれか、３種の基本的な植物の組織型（基本組織、表皮組織および維管束組織）のうちのいずれか、多様なその他の特異的な組織型（例えば、血液または肝臓組織）のうちのいずれか、および／またはこれらもしくはその他の組織型のいずれかの組合せから得ることができる。特定の実施形態では、無細胞試料を、胎盤組織から、臍帯組織から、ならびに／あるいは心血管、消化器、内分泌、排泄、免疫、外被、リンパ、筋肉、神経、生殖、呼吸および／または骨格の器官系のうちの１種以上の組織から得る。
【００３３】
再生マトリックスを、動物界内のいずれかの動物、および／または植物界内のいずれかの植物、特に、すべての組織および体液から形成することができる。しかし、特定の実施形態では、再生マトリックスを、血液から生成する。理論に縛られる意図はないが、再生マトリックスは、少なくとも部分的には、組織損傷、特に、広範囲な組織損傷を被っている、またはその付近に存在する細胞の成分によって形成されると仮定されている。そのような機構によって、細胞が周囲の細胞を誘発して、損傷組織を再生するようである。類似するが異なり、十分には理解されていない現象が、イモリの心臓を研究する間に、１９７４年にＢｅｃｋｅｒらによって観察された（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｒ．Ｏ．ら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｉｎ ａｍｐｈｉｂｉａｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、２４８巻、１４５〜１４７頁、１９７４年）。Ｂｅｃｋｅｒの観察では、イモリの心臓の３０％〜５０％を切除すると、周囲の赤血球が溶解し、それらが放出した核が凝集して、新たな心筋組織を形成し、イモリの心臓を約４時間後に再生することができ、したがって、多くのイモリが生存することできた。これ以降の記載から明らかになるであろうが、本発明の再生マトリックスは、Ｂｅｃｋｅｒらが観察した現象とは異なり、それとは異なる機構を介して作用する。これは、本発明の再生マトリックスは、無細胞試料から生成され、それ自体では、細胞に基づく生存組織にはならないからである。にもかかわらず、特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスを、再生マトリックスの形成の間または後に、細胞と共に播種、または細胞と混合して、再生マトリックス上に１つ以上の有利な特徴または機能を与える。しかし、理解されるであろうが、そのような細胞が、本発明の再生マトリックスの形成に要求されるわけではない。
【００３４】
機能性の再生マトリックスを、多様な組織のうちのいずれかから生成することができるが、再生マトリックスの的確な組成は、とりわけ、無細胞試料を得る組織型によって影響を受けることが理解されるであろう。非限定的な例として、再生マトリックスを、肝臓組織、全血および／または１種以上の血液画分から生成することができる。再生マトリックスを全血から生成する場合には、再生マトリックスの主たるタンパク質成分は、典型的には、アルブミンおよびヘモグロビンである。再生マトリックスを血液の血漿−血小板−バフィーコート画分から生成する場合には、再生マトリックスの主たるタンパク質成分は、典型的には、アルブミンである。にもかかわらず、全血から生成した再生マトリックスおよび血漿−血小板−バフィーコート画分から生成した再生マトリックスはいずれも、組織の損傷、欠損および／変性した部位において、機能して、組織の再生を、開始し、増加させ、支持し、かつ／または導く。特定の実施形態では、再生マトリックスを、全血から得た無細胞試料から生成する。特定の実施形態では、再生マトリックスを、これらに限定されないが、赤血球画分、バフィーコート画分、血小板画分および／または血漿画分をはじめとする、１種以上の血液画分から得た無細胞試料から生成する。そのような画分を、例えば、全血を重力により沈降および分離させることによって得ることができる。特定の実施形態では、血液画分を、遠心分離によって得る。当業者であれば、本発明の再生マトリックスを生成するために使用することができる画分に血液を分離するその他の手法が分かるであろう。特定の実施形態では、再生マトリックスを、凍結されている血液またはその他の組織から生成する。特定の実施形態では、そのような組織は、数日、数週、数カ月または数年の期間凍結されている。特定の実施形態では、血液またはその他の組織に、試料の凍結〜融解点に近い温度範囲で、複数回の凍結融解サイクルを施す場合に、再生マトリックスの収率および発育が高まる。特定の実施形態では、再生マトリックスを、死体（例えば、数週が経過した死体）から単離した血液またはその他の組織から生成する。特定の実施形態では、再生マトリックスを、胎盤または臍帯の血液から生成する。当業者であれば、血液、体液（例えば、脳脊髄液およびリンパ液）および組織のうちの再生マトリックスを生成するために使用することができるその他の源が分かるであろう。
【００３５】
さらに、全血の場合には、実施例１および２に示すように、血液試料中に抗凝血薬が存在すると、異なる接着特性を有する再生マトリックスを得る。これらに限定されないが、ヘパリン、ＥＤＴＡおよび／またはクエン酸をはじめとする、多様な抗凝血薬のうちのいずれかを使用することができる。当業者であれば、その他の既知の抗凝血薬、ならびに異なる物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性を有する再生マトリックスを生成するために使用することができる抗凝血薬が分かるであろう。
【００３６】
特定の実施形態では、無細胞試料を、細胞を組織試料から除去することによって得る。多様な手法のうちのいずれかを使用して、そのような細胞を除去することができる。例えば、組織細胞を遠心分離して、組織試料を、細胞含有画分と細胞非含有画分とに分離し、次いで、細胞非含有画分を単離することができる。特定の実施形態では、組織試料を、細胞を排除するのに十分に小さいポアサイズを有するフィルターを通過させることによって、細胞を組織試料から除去する。例えば、組織試料を５μｍ、１．２μｍおよび／または０．８μｍのポアサイズを有するフィルターを通過させることによって、細胞を組織試料から除去することができる。特定の実施形態では、フィルターのポアサイズによって、生成された再生マトリックスの物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性が変化する。熟練者であれば、的確なポアサイズを、実験および／または実験室の制約、再生マトリックスに所望する特徴、ならびに／あるいは熟練者が重要であると見なす多様なその他の因子のうちのいずれかに応じて決定することができる。特定の実施形態では、細胞の除去の前に、組織試料を懸濁化、可溶化および／または希釈する。例えば、細胞を組織試料から除去する前に、処理媒体および／または生理的溶液中に、組織試料を懸濁化、可溶化および／または希釈することができる。
【００３７】
再生マトリックスを、無細胞試料を、多様なインキュべーション期間のうちのいずれかにわたってインキュベートすることによって生成することができる。例えば、無細胞試料を、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０日以上の間インキュベートすることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、機能性の再生マトリックスが、６日、１２日、１５日、２１日および２８日後に、生成された再生マトリックス中に検出されており、６週間以上のより長いインキュベーション期間にわたり機能を維持している。生成工程で使用する環境パラメーターおよび／または処理媒体を改変することによって、機能性の再生マトリックスを、より短い期間で生成することができる。例えば、酸素濃度を約０％まで減少させること、および／または処理媒体の凝集の特性または効果を、例えば、塩濃度の増加により増加させることによって、機能性の再生マトリックスを、数分、数時間または数日以内に生成することができる。特定の実施形態では、無細胞試料をインキュベートすることによって生成した再生マトリックスの活性は、インキュベーション期間が長くなるにつれて増加する。特定の実施形態では、無細胞試料をインキュベートすることによって生成した再生マトリックスは、所与の期間インキュベートした後に最大またはほぼ最大の活性に達する。そのような実施形態では、さらにインキュベートしても、再生マトリックスの活性は、仮に増加するとしても、付加的なものに過ぎない。そのような実施形態では、さらにインキュベートすると、再生マトリックスが活性を失う可能性がある。
【００３８】
本出願人は、再生マトリックスの形成の初期の間に無細胞試料を振盪またはそうでなければ撹乱すると、不完全なおよび／または欠陥のある再生マトリックスを生じること、ならびに／あるいは再生マトリックスがまったく生成されないこと（さらに、そのような不完全なおよび／または欠陥のある再生マトリックスの生物学的活性が対応して減少すること）を発見した。特定の実施形態では、無細胞試料を、再生マトリックスが形成されている間の期間にわたり、試料が振盪またはそうでなければ撹乱されないようにインキュベートする。例えば、無細胞試料を、振盪またはその他の撹乱なしで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日以上の間インキュベートすることができる。特定の実施形態では、無細胞試料を、再生マトリックスを形成する全期間にわたり、試料が振盪またはそうでなければ撹乱されないようにインキュベートする。
【００３９】
生成工程の間の特定のインキュベーション条件および／または１つ以上の外因性の因子の追加によって、再生マトリックスが所望のレベルの活性を達成するのに必要なインキュベーション期間を変化させることができる。非限定的な１つの例として、周囲の酸素濃度を減少させると、所望のレベルの再生マトリックスの活性を達成するのに必要な時間の量も減少する。特定の実施形態では、インキュベートする間の周囲の酸素濃度は、約２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％以下である。特定の実施形態では、インキュベートする間の周囲の酸素濃度は、ほぼまたはまさしく０％である。特定の実施形態では、低酸素環境でインキュベートすると、所望のレベルの活性を有する再生マトリックスを、わずか３日後に得る。特定の実施形態では、低酸素環境でインキュベートすると、所望のレベルの活性を有する再生マトリックスを、わずか７日後に得る。特定の実施形態では、インキュベートする間の周囲の酸素濃度を、インキュベートする工程の間に変化（例えば、上昇／低下）させる。当業者であれば、再生マトリックスを形成する場合の時間的な制約、再生マトリックスを使用する組織の損傷の型、実験および／または実験室の制約、ならびに／あるいは熟練者が重要であると見なす多様なその他の因子のうちのいずれかに応じて、１つ以上の適切な周囲の酸素濃度を選ぶことができるであろう。
【００４０】
特定の実施形態では、インキュベートする間に、周囲湿度を調節または制御する。例えば、再生マトリックスを、無細胞試料を多様な周囲湿度のいずれかにおいてインキュベートすることによって生成する。特定の実施形態では、インキュベートする間、周囲湿度を低く保ち、それによって、無細胞試料中の液体の蒸発を増加させる。特定の実施形態では、新たな溶質を含有する液体（例えば、「処理媒体」および／または「生理的溶液」）を、蒸発が生じている無細胞試料に連続的または定期的に添加する。そのような実施形態では、無細胞試料の浸透圧モル濃度が、蒸発および新たな溶質を含有する液体の添加の結果として、時間の経過と共に増加することが理解されるであろう。特定の実施形態では、浸透圧モル濃度のそのような増加の結果、生成した再生マトリックスの物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性が変化する。非限定的な１つの例として、無細胞試料を含有する溶液および／または懸濁液の浸透圧モル濃度をインキュベートする工程の間に増加させると、浸透圧モル濃度を、増加させなかった工程またはより少ない量だけ増加させた工程によって生成した再生マトリックスと比較して、物理的な硬度がより高い再生マトリックスを得ることが示されている。再生マトリックスが特定の物理的形状を、長期間維持することが望まれる場合には、そのような再生マトリックスを埋込み型の組成物として使用することができる。例えば、再生マトリックスを対象に注入することが望まれる場合には、物理的な硬度がより低い再生マトリックス（例えば、浸透圧モル濃度を、一定に保った工程またはより少ない量だけ増加させた工程によって生成した再生マトリックス等）が有用である。特定の実施形態では、周囲湿度をインキュベートする工程の間に変化（例えば、上昇および／または低下）させて、浸透圧モル濃度が変化する速度を制御する。当業者であれば、再生マトリックスを形成する場合の時間的な制約、再生マトリックスを使用する組織の損傷の型、実験および／または実験室の制約、ならびに／あるいは熟練者が重要であると見なす多様なその他の因子のうちのいずれかに応じて、１つ以上の適切な周囲湿度を選ぶことができるであろう。さらに、形成した再生マトリックスの密度、多孔度および／または水和のレベルを、形成した再生マトリックスを遠心分離または凍結乾燥することによって変化させることができる。例えば、形成した再生マトリックスを５０００×ｇで遠心分離して、骨の再生を支持する目的で、骨の欠陥に埋め込むために、密度および硬度を増加させることができるであろう。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスを、インキュベーションチャンバー内で、無細胞試料を所与の期間インキュベートすることによって生成する。多様なインキュベーションチャンバーのうちのいずれかを使用することができる。特定の実施形態では、インキュベーションチャンバーは、１種以上の物質、例えば、空気および／またはガス状の分子に対して透過性または半透過性である密閉容器または半密閉容器を含む。例えば、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット（ＢｉｏＣｒｙｓｔａｌ Ｌｔｄ．製、Ｗｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅ、オハイオ州）を、インキュベーションチャンバーとして使用して、無細胞試料から再生マトリックスを生成することができる。特定の実施形態では、密閉または半密閉のインキュベーションチャンバーは、材料を、インキュベートする工程を開始してから容器に添加および／または容器から除去することができるように設計されている。例えば、空気および／またはガス状の分子に対して透過性または半透過性であるインキュベーションチャンバーを、液体および／または固体の材料を、インキュベーションの間および／または後に１つ以上の時点でチャンバーに添加および／またはチャンバーから除去することができるように設計することができる。そのようなインキュベーションチャンバーは、無細胞試料の浸透圧モル濃度をインキュベートする工程の間に増加させることが望まれる場合に有利である。例えば、無細胞試料の浸透圧モル濃度を、インキュベートする工程の間に、無細胞試料を含有する液状の溶液または懸濁液の溶媒（この溶液または溶媒を、例えば、処理媒体または生理的溶液を、無細胞試料および／または無細胞試料を得る組織試料に添加することによって得ることができる）を、時間をかけて蒸発させ、新たな溶質を含有する液体を無細胞試料に連続的または定期的に添加することによって増加させることができる。そのような溶質を含有する液体は、処理媒体および／または生理的溶液を含むことができる。無細胞試料が、処理媒体および／または生理的溶液に可溶化または懸濁化されている場合には、それと同一の処理媒体および／または生理的溶液を、インキュベートする工程の間に、無細胞試料に添加することができる。それに加えてまたはそれに代わって、異なる処理媒体および／または生理的溶液を、インキュベートする工程の間に、無細胞試料に添加することもできる。それに加えてまたはそれに代わって、無細胞試料に添加する溶質を含有する液体は、処理媒体でもなく、生理的溶液でもない。
【００４２】
特定の実施形態では、再生マトリックスは、生成工程の間に使用する処理媒体および／または生理的溶液応じて、異なる物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性を示す。例えば、実施例１１に示すように、ＴＲ−１０培地を使用して形成した再生マトリックスは、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２倍地を使用して生成した再生マトリックスと比較して増加した生物学的活性を示す。当業者であれば、過度の実験をせずとも、１種以上の所望の物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性を示す再生マトリックスを達成するために適切な処理媒体および／または生理的溶液を決定することができるであろう。
【００４３】
再生マトリックスの生成工程の間の多様な時点のうちのいずれかにおいて、処理媒体および／または生理的溶液を、組織試料および／または無細胞試料に添加することができる。特定の実施形態では、組織試料を単離する間、細胞を組織試料から除去する前、無細胞試料をインキュベートする前、および／またはインキュベートする工程の間に、処理媒体を、組織試料および／または無細胞試料に添加する。
【００４４】
特定の実施形態では、１つ以上の外因性の因子の存在下で、無細胞試料をインキュベートすることによって、再生マトリックスを生成する。例えば、１種以上の治療用作用物質、１種以上の細胞型または両方の存在下で、無細胞試料をインキュベートすることができる。特定の実施形態では、そのような外因性の因子が、再生マトリックスの物理学的特徴を変化させ、かつ／ならびに生物学的活性および／または治療活性を増強する。例えば、実施例９に示すように、再生マトリックスの生成の間におけるＩＴＳ、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの添加によって補足した再生マトリックスからは、再生マトリックスの神経突起伸長活性に対する効果の増加が得られる。
【００４５】
多様な治療用作用物質のうちのいずれかを使用して、本発明の再生マトリックスの活性を増加させることおよび／または補足することができる。考案の再生マトリックスおよび方法と共に使用することができる治療用作用物質の例として、タンパク質、ペプチド、薬物、サイトカイン、細胞外マトリックス分子および／または増殖因子があげられるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明によって使用することができる適切および／好都合なその他の治療用作用物質が分かるであろう。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果の大きさが増加する。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果の活性が延長される。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果が時間をかけて放出される。特定の実施形態では、治療用作用物質を再生マトリックス中に投与すると、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果が時間の経過に伴う実質的な減少から保護される。特定の実施形態では、２種以上の治療用作用物質を再生マトリックス中に投与する。特定の実施形態では、治療用作用物質を、再生マトリックスを生成する工程の間に添加する。例えば、治療用作用物質を、これらに限定されないが、組織試料を単離する間、細胞を組織試料から除去する前、無細胞試料をインキュベートする前、および／またはインキュベートする工程の間をはじめとする、生成工程の１つ以上のステップにおいて添加することができる。
【００４６】
特定の実施形態では、治療用作用物質を、再生マトリックスにくまなく均等に分布させる。特定の実施形態では、治療用作用物質を、再生マトリックスにくまなく不均等に分布させる。例えば、治療用作用物質を、再生マトリックスの芯またはその付近により集中させることができる。これは、例えば、再生マトリックスの形成期間の初めの数日または前半の間に治療用作用物質を導入してから、インキュベーションチャンバー中の形成されつつある再生マトリックスの周囲の溶液の大部分または全部を除去し、最初の無細胞試料または溶液をさらにインキュベーションチャンバーに所望のレベルに達するまで添加し、次いで、再生マトリックスの形成工程を続けるために無細胞試料および再生マトリックスをさらにインキュベートすることによって達成することができるであろう。また、追加の無細胞試料または溶液を、別の治療用作用物質と一緒に添加することもできるであろう。この別の治療用作用物質は、次いで、形成されつつある再生マトリックスの外側表面の付近において不均一に集中するようになり、したがって、再生マトリックスが生分解または分解する場合には、最初の治療用作用物質よりも先に周囲の環境に放出されるであろう。この方法を、治療用作用物質が特異的な部位に異なる時点で（例えば、次々に）送達されることが望まれる適用例において使用することができるであろう。特定の実施形態では、そのような不均等な分布が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける治療用作用物質の特性および／または機能に影響を与える。例えば、そのような不均等な分布によって、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果の大きさが変化し、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果の活性が延長され、治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果の持続放出の特徴が変化し、かつ／または治療用作用物質の１つ以上の有利な治療効果が時間の経過に伴う実質的な減少から保護される。
【００４７】
多様な細胞型のうちのいずれかを使用して、本発明の再生マトリックスの活性を増加させることおよび／または補足することができる。しかし、細胞を使用して、本発明の再生マトリックスの活性を増加させることおよび／または補足することが可能であるものの、そのような細胞が、再生マトリックスを形成するのに要求されるわけではないことを理解されるであろう。特定の実施形態では、細胞が除去されている無細胞試料に、細胞を添加する。特定の実施形態では、無細胞試料を得る組織試料中に存在する細胞とは異なる型の細胞を使用する。本発明によって使用することができる細胞型の例として、幹細胞、前駆細胞および／または体細胞があげられるが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明によって使用することができる適切および／または好都合なその他の細胞型が分かるであろう。特定の実施形態では、再生マトリックスを生成する工程の間に、細胞を添加する。例えば、これらに限定されないが、組織試料を単離する間、細胞を組織試料から除去する前、無細胞試料をインキュベートする前、および／またはインキュベートする工程の間をはじめとする、生成工程の１つ以上のステップにおいて、細胞を添加することができる。特定の実施形態では、細胞を、再生マトリックスにくまなく均等に分布させる。特定の実施形態では、細胞を、再生マトリックスにくまなく不均等に分布させる。例えば、細胞を、再生マトリックスの芯またはその付近により集中させることができる。特定の実施形態では、そのような不均等な分布が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞の特性および／または機能に影響を与える。
【００４８】
顕著な免疫応答を惹起せずに患者に移植するための有望な再生マトリックスを生成する最も有効な方法の１つでは、再生マトリックスを患者自身の血液および／または組織から誘導する。しかし、本発明の再生マトリックスは、そのような自家性の再生マトリックスに限定されない。特定の実施形態では、即時に移植するための既製の再生マトリックスを、同種からの血液またはその他の組織を使用して作製する。そのような実施形態では、そのような同種からの再生マトリックスを１種以上の免疫抑制剤と併用して投与するのが望ましい場合がある。そのような免疫抑制剤は、当業者に知られている。特定の実施形態では、１つの種において使用するための再生マトリックスを、異なる種からの細胞から誘導する。例えば、動物（例えば、ブタ）に由来する組織を使用して生成した再生マトリックスを、ヒトに投与する。特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスは、動物への適用例、例えば、家畜および／または愛玩動物の損傷および／変性した組織を修復する場合に有用である。
【００４９】
特定の実施形態では、再生マトリックスの物理学的特徴、生物学的特性および／または治療活性を、生成工程が実質的に完全に完了してから変化させる。例えば、多くの場合、作製後、再生マトリックスを長期間保管するのが望ましいであろう。当技術分野で知られているように、加水分解は、多様な生物学的物質および非生物学的物質の保管寿命を短くする１つの原因である。したがって、特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスの保管寿命を、そのような再生マトリックス中に存在する液体の一部または全部を除去することによって延長させることができる。多様な手法のうちのいずれかを使用して、そのような液体を除去することができる。例えば、再生マトリックスを遠心分離して、タンパク質性のおよび／またはその他の生物学的な巨大分子成分を凝縮し、その後、所望の量の液体を遠心分離した試料から除去することができる。それに加えてまたはそれに代わって、液体を通過させるには十分大きいが再生マトリックス材料を通過させることがない十分小さいポアサイズを有するフィルターを使用するろ過のステップ（例えば、重力または低速遠心分離による）を、再生マトリックスに施すことによって、液体を再生マトリックスから除去することもできる。それに加えてまたはそれに代わって、乾燥剤の存在または非存在下で、再生マトリックスを所与の期間にわたって脱水することによって、液体を再生マトリックスから除去することもできる。当業者であれば、再生マトリックスの保管寿命を改善するために、液体を再生マトリックスから除去する適切および／有用なその他の方法が分かるであろう。また、液体を再生マトリックスから除去すると、再生マトリックスの生物学的特性および／または治療活性のうちの１つ以上が変化する場合があることも理解されるであろう。特定の実施形態では、そのような生物学的特性および／または治療活性が、液体除去の工程によって増強される。
【００５０】
さらに、そのような液体の除去により、再生マトリックスが投与される物理的環境に再生マトリックスがより厳密に一致するように、再生マトリックスの物理学的特徴を変化させることによって、追加の利点を得ることができる。例えば、再生マトリックスの水和のレベルを減少させると、より大きな密度を有する再生マトリックスを得ることができる。そのような高密度の再生マトリックスを、例えば、骨および／または軟骨の再生に有利に使用することができる。当業者であれば、本記載に基づいて、そのような高密度の再生マトリックスのその他の有利な適用例が分かり、過度の実験をせずとも、そのような適用例においてそのような再生マトリックスを使用することができるであろう。
【００５１】
再生マトリックスの組成物および特徴
本発明の再生マトリックスは、タンパク質、脂質、炭水化物、塩および核酸の不均等な混合物を含む。さらに、再生マトリックスは、冷蔵温度で、機能を欠損することなく、最大３カ月間保管されている。多分、再生マトリックスを、適切な条件を使用して、無期限に保管することができるであろう。例えば、再生マトリックスの含水量を（例えば、遠心分離、脱水、凍結乾燥およびその他によって）減少させて、再生マトリックスを保管できる期間を延長させることができる。特定の実施形態では、主要な構造は、大部分、直径約１〜４μｍの球状構造の凝集体からなる。特定の実施形態では、主要な構造は、大部分、直径約１００ｎｍの球状構造の凝集体からなる。特定の実施形態では、主要な構造は、大部分、直径が少なくとも約１００ｎｍである球状構造の凝集体からなる。特定の実施形態では、再生マトリックスは、繊維がくまなく散在したそのような球状構造を含む。上記に記載したように、出発材料の形成に使用する処理条件が、球状構造の究極的なサイズに影響を与えることができる。例えば、出発材料を５μｍのフィルターでろ過すると、優勢な球状構造の直径は、典型的には、約２から４μｍである。出発材料を１．２μｍのフィルターでろ過すると、優勢な球状構造の直径は、典型的には、約１から２μｍである。
【００５２】
特定の実施形態では、ＣＤ５６に対する抗体が球の表面を認識し、これは、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）の存在を示す。理論に縛られる意図はないが、ＮＣＡＭ仲介刺激は、損傷が生じると、再生マトリックスが神経細胞を動員し、再生を刺激する１つの機構であると仮定されている。特定の実施形態では、組織の修復、組織の再生および／または組織の形成の間に、再生マトリックスが、細胞外増殖マトリックス（ＥＣＧＭ）として作用する。再生マトリックスを血液から形成すると、物理的および機能的な特性が、血液の採取方法（例えば、抗凝血薬の有無および／または抗凝血薬の種類）およびインキュベーション期間の前に溶解液をろ過するのに使用したポアサイズによって影響を受ける。抗凝血薬であるヘパリンを加えて血液を採取すると、抗凝血薬なしで採取した血液を用いて形成した構造に類似する構造が形成される。この全血から形成した再生マトリックスは、通常、生成装置（例えば、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標））の下部および上部の両方に接着し、それぞれの表面上で、構造の配置が若干異なる。しかし、抗凝血薬であるＥＤＴＡまたはクエン酸を加えて血液を採取すると、この全血から形成した再生マトリックスは、生成装置に緩く接着し、ゲル様の外観および硬さを有する。
【００５３】
特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスは、水を主要な成分として含む。特定の実施形態では、再生マトリックスの非水組成物は、主としてタンパク質を含む。特定の実施形態では、再生マトリックスのタンパク質含有量は、約５から１５質量％に及ぶ。しかし、生成工程において、組織試料および／または無細胞試料の処理媒体に対する異なる比を使用することによって、この割合を操作することができる。特定の実施形態では、そのような異なる比を利用することによって、生成された再生マトリックスのタンパク質含有量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０％以上となる。生成された再生マトリックスの水和のレベルを変化させることによって、この割合をさらに変化させることができる。特定の実施形態では、再生マトリックスの水和のレベルのそのような変化を利用することによって、再生マトリックスのタンパク質含有量が、約０．１％未満または約９０％超であることができるであろう。再生マトリックスを全血から生成する場合には、再生マトリックスの主たるタンパク質成分は、典型的には、アルブミンおよびヘモグロビンである。再生マトリックスを血液の血漿−血小板−バフィーコート画分から生成する場合には、再生マトリックスの主たるタンパク質成分は、典型的には、アルブミンである。しかし、また、血液のその他のタンパク質成分またはペプチド成分もこれらの再生マトリックス中に存在することを当業者であれば理解するであろう。さらに、再生マトリックスを、血液以外の組織から得た無細胞試料から生成する場合には、その他のタンパク質成分またはペプチド成分も存在することも当業者であれば理解するであろう。
【００５４】
再生マトリックスは、再生および組織形成の重要な特性および可能性を有する。再生マトリックスは、組織再生および組織形成に関与する細胞を補助し、かつ／またはそれに対する骨格として働くことができる。特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスは、細胞が再生マトリックスの上または周りで接着、増殖および／または分化するのを可能にする。特定の実施形態では、本発明の再生マトリックスは、神経細胞を刺激して、再生マトリックスに接着する神経突起を伸長させる。神経細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイは、再生マトリックスが、神経細胞の接着、神経細胞の生存、軸索の増殖および再生、パターン形成、ならびに結合性に関連する遺伝子を選択的に刺激することを実証している。ヒト線維芽細胞を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイは、５μｍのフィルターを用いたろ過によって生成した再生マトリックスが、これらの細胞の増殖に対して抑制効果を有することを実証している。そのような線維芽細胞抑制活性の大きさには、再生マトリックスの形成のために使用する処理条件が影響を及ぼすことができる。凝固した血液から生成した再生マトリックスは、抗凝血薬の存在下で採取した血液から生成した再生マトリックスよりも、線維芽細胞の増殖をより強く抑制する。特定の実施形態では、線維芽細胞が支持構造を提供するためにある程度まで必要であるコラーゲンを創傷組織で分泌することから、この差が好都合であるが、大部分の重度の組織の損傷では、欠失は、主として結合組織の瘢痕で満たされるようになる。広範に結合組織の瘢痕が生じると、再生過程が抑制され、損傷した組織および臓器の機能の永続的な欠損につながる。したがって、特定の実施形態では、再生マトリックスの活性の大きさを調節または制御して、創傷部位における組織の損傷の重症度に基づき、最適な創傷治癒の特徴を提供する。
【００５５】
脊髄損傷のｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用して、本発明の再生マトリックスが、これらに限定されないが、血管新生特性、軸索の増殖、病変の大きさおよび数の減少、ならびにアストロサイトのグリア性瘢痕形成に対する抑制機能をはじめとする、複数の有利な効果を示すことが実証されている。ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、再生マトリックスは、典型的には、主として、マクロファージ摂取によって、時間と共に（例えば、通常、約４〜８週間で）分解するが、本発明の再生マトリックスは、そのような分解時間にも分解機構にも限定されるものではない。本記載から明らかなように、そのような分解は、これらに限定されないが、細胞の活性による（例えば、マクロファージの作用を介する）、機械的、化学的、代謝的および／または酵素的な分解をはじめとする、多様な機構のうちのいずれかを介して起こることができる。特定の実施形態では、再生マトリックスのそのような分解が、マクロファージを刺激して、マクロファージ自体がさらなる再生特性を（例えば、フォン−ヴィレブランド因子陽性内皮様細胞に分化形質転換することによって）示すようになる。本発明の再生マトリックスを、組織または臓器の損傷、欠失または切除した部分に移植すると、本発明のマトリックスは、新たな組織の再生および形成を支持し、組織または臓器の損傷または欠失した部分の機能性を修復するのを援助する。組織の再生および組織の形成を開始し、増加させ、支持し、かつ／または導くために再生マトリックスを移植することができる組織の非限定的な例として、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、卵巣、甲状腺、脳、脊髄およびその他の神経組織の損傷、欠失または切除した部分があげられる。
【００５６】
脊髄の再生の場合には、再生マトリックスを、脊髄の損傷、変性、欠失または切除した部分に、例えば、神経幹細胞、神経前駆細胞および／または分化した神経細胞等の細胞と共に移植してもよいし、細胞なしで移植してもよい。再生マトリックスの機能性を、これらに限定されないが、増殖因子、サイトカイン、薬物および／またはその他の成分をはじめとする、１種以上の治療用作用物質を添加することによって、さらに拡大または操作することができる。特定の実施形態では、再生マトリックスを外因性の治療用作用物質を添加せずに生成すると、神経突起の伸長および神経遺伝子の上方制御に関する部分的な機能性が観察される。そのような実施形態では、これらの機能の大きさを、再生マトリックスの生成の間に外因性の治療用作用物質を組み入れることによって増強することができる。望ましい追加の治療用作用物質の非限定的な例として、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＢＤＮＦおよび／またはＮＧＦ等の増殖因子があげられる。特定の実施形態では、再生マトリックスを損傷した脊髄に移植すると、運動機能の欠損が移植後わずか４週後に機能的に回復する。
【００５７】
本発明の特定の実施形態が包含する生物学的骨格は、固有の多角的な再生特性を有し、移植可能で、分解性であり、これらの生物学的骨格の形成は、まったく前例がない。いくつかの細胞型が、単純な細胞外マトリックスを生成しているが、そのようなマトリックスは、構造的なものに過ぎないようである。新たな組織の再生および増殖を構造的および生物学的に促進、支持および補助する自己集合性のマトリックスまたは骨格材料の生成はこれまでに報告されたことがない。このようなマトリックスまたは骨格材料が、本発明の特定の実施形態によって包含されている。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
再生マトリックスの凝固した全血からの誘導
健康なドナーから、静脈血（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ製、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、マサチューセッツ州）を、１２ｍｌのｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）に調達し、ＲＴで少なくとも３０分間凝固させた後、使用まで−２０℃で凍結した。血液に、５回の凍結（−２０℃）−融解（ＲＴ）サイクルを施すことによって処理を開始した。１０ｍｌの血液を含有するｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒの内容物を、無菌の乳鉢に出した。２×ＩＴＳ補助剤（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）および４０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）で補足したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製、Ｈｅｒｎｄｏｎ、バージニア州）およびハムＦ１２培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）の１：１の混合物からなる処理媒体を添加して、血餅を、無菌の乳棒を使用して手作業で粉砕することによって破壊した。粉砕工程の間に、液化した全血血餅および処理媒体を含有する液体を、乳鉢から無菌の２５ｍｌの血清用ピペットを使用して吸引し、４０μｍメッシュのフィルターに移し、そこから、内容物を無菌の５０ｍｌのコニカル遠心チューブ内に重力によってろ過させた。新鮮な処理媒体を残りの固体の血餅に添加し、血餅が全部液化し、２００ｍｌの最終容量に達するまで工程を繰り返した。チューブを５００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を５μｍのシリンジフィルター（Ｐａｌｌ／Ｇｅｌｍａｎ製）を通してＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット内に直接ろ過した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットを、３７℃および７．５％ＣＯ_２でインキュベートした。６から８日間インキュベートした後、３ｍｌの新鮮な処理媒体を各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットに添加した。その後、１．５ｍｌの新鮮な処理媒体を、さらなる分析のために再生マトリックスを収集するまで１日置きに添加した。この方法を使用して形成した再生マトリックスは、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットの上部メンブレインを取り外し、下部メンブレインから削り取ることによって収集する必要があることから、この再生マトリックスは、接着特性を有する。
【００５９】
（実施例２）
再生マトリックスの抗凝血薬を使用して採取した全血からの誘導
健康なドナーから、静脈血（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ製、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、マサチューセッツ州）をＮａ_４−ＥＤＴＡを含有する１２ｍｌのｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）に調達し、使用まで−２０℃で凍結した。血液に連続５回の凍結（−２０℃）−融解（ＲＴ）サイクルを施すことによって処理を開始した。１０ｍｌの血液を含有するｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒの内容物を、無菌の容器に出し、２００ｍｌの最終容量まで処理媒体（実施例１を参照）を添加した後、溶液を穏やかに混合した。この出発材料を、４０μｍメッシュのろ過器を通して重力ろ過した。ろ液を採取した後、５００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を５μｍのシリンジフィルターを通してＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット内に１０ｍｌずつ直接ろ過した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットを、３７℃および空気中の７．５％ＣＯ_２でインキュベートした。６から８日間インキュベートした後、３ｍｌの新鮮な処理媒体を各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットに添加した。その後、１．５ｍｌの新鮮な処理媒体を、さらなる分析のために再生マトリックスを収集するまで１日置きに添加した。
【００６０】
別の実験では、健康なドナーから、静脈血（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ製、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、マサチューセッツ州）をＮａ_４−ＥＤＴＡを含有する１２ｍｌのｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）に調達し、氷上に保った。１０ｍｌの血液を含有するｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒの内容物を、無菌の容器に出し、２００ｍｌの最終容量まで処理媒体（実施例１を参照）を添加した後、溶液を穏やかに混合した。この出発材料を、５μｍのシリンジフィルターを通してろ過した。ろ液を採取した後、５００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を５μｍのシリンジフィルターを通してＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット内に１０ｍｌずつ直接ろ過した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットを、３７℃および７．５％ＣＯ_２でインキュベートした。６から８日間インキュベートした後、３ｍｌの新鮮な処理媒体を各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットに添加した。その後、１．５ｍｌの新鮮な処理媒体を、さらなる分析のために再生マトリックスを収集するまで１日置きに添加した。
【００６１】
これらの方法を使用して形成した再生マトリックスは、弱い接着特性を有し、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットのアクセス口のうちの１つを使用して、１８ゲージの針を通して吸引することによって収集することができる。
【００６２】
（実施例３）
再生マトリックスの連続ろ過を使用して得た全血画分からの誘導
再生マトリックスの活性を、（実施例１および２に記載した）遠心分離ステップからの上清を、５μｍおよび１．２μｍのフィルターを一緒にして結合させたセットを通すことによってさらに改良した。このステップは、出発材料から大きな粒子を除去し、その結果、機能性特性が変化する。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット内の再生マトリックス構造の例を示す（図３）。図４は、全血から生成した再生マトリックスが、未変化の細胞または核の兆しを何ら示さないことを示す。ヘマトキシリン染色は、分析したすべての切片において完全に陰性であったが、材料は、エオシンで強く染色した。高い数値の開口レンズ（高解像度）を使用すると、ビーズ様構造を明確に分解することができる。再生マトリックスの大部分をなすビーズ様構造以外に、より緻密な構造からなると思われる平坦なシートの小さな領域を観察することができる。
【００６３】
（実施例４．１）
再生マトリックスの走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）
電子顕微鏡観察のために、実施例１、２および３に記載した方法によって生成した再生マトリックスを０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）中の２．５％グルタルアルデヒドを用いて、４℃で１６時間固定した。固定化は、培地を１０ｍｌの固定液で置換することによって、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）内で直接行った。翌日、固定剤を除去し、ＰＢＳ（１０ｍｌ）をＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）に添加した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）をメスで開き、再生マトリックスが接着しているＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）のメンブレインを０．５×１ｃｍの小片に切断した。小片を１．５ｍｌの微量遠心チューブに移し、水中の１％四酸化オスミウムで２時間、後固定した。次いで、直ちに、試料を５０％エタノール溶液中に２分間保った後、７０、８０、９０、９５および１００％のエタノール溶液中で連続的に脱水した。最後のエタノールのステップの後、試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｅｓｅｔｔｓ ＡｍｈｅｒｓｔのＣｅｎｔｒａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに発送するまで−２０℃に保った。試料を臨界点まで乾燥し、スパッタコートした。試料をＪＥＯＬ ＪＳＭ−５４００走査型電子顕微鏡を用いて、１００倍から７５００倍の倍率で撮影した。画像を、デジタルインターフェースを介してコンピュータに取り入れ、ＴＩＦＦフォーマットとして６４０×４８０ピクセルの解像度でエクスポートした。
【００６４】
調製方法のそれぞれから、異なる微細構造を有する再生マトリックスを得た（図５、６および７）。より低い多孔度のろ過からは、類似の全体的な形態を得たが、１．２μｍ処置の場合の球のサイズ（直径１〜２μｍ、図６）は、５．０μｍ処置の場合の球のサイズ（直径２〜３μｍ、図５）よりも小さかった。凝固血を使用して生成した再生マトリックスは、約２から３週間のインキュベーション後、成熟相を経験し、この相では、マトリックスの上部の表面上に波様の構造が認められた。非凝固血を使用して生成した再生マトリックスは、このような外観を呈しないが、球状構造が一緒になって凝集して、約１００ｎｍの繊維がくまなく散在した連続的な構造を形成する（図７）。
【００６５】
組織学的検査のために、再生マトリックスを０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）中の２．５％グルタルアルデヒドを用いて、４℃で１６時間固定した。固定化は、培地を１０ｍｌの固定液で置換することによって、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）内で直接行った。翌日、固定剤を除去し、ＰＢＳ（１０ｍｌ）をＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）に添加した。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）をメスで開き、再生マトリックスが接着しているＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）のメンブレインを２×２ｃｍの小片に切断し、組織学的検査用組織カセット中のスポンジの間にマウントした。試料を７０％エタノールに移し、Ｍａｓｓ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、マサチューセッツ州）による標準的な組織学的検査に送った。試料をエタノール中で連続的に脱水し、パラフィンに埋包した後、位置を定め、切断した。切片を、通常の固定化条件を使用してヘマトキシリン−エオシン染色した。コントラストの増強およびノイズの減少のため、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより最適化された、改変したＬｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して暗視野光学で画像を得た。ビデオカメラの６４０×４８０ピクセルの解像度を用いて、画像を２０、４０および１００倍で収集した。１００倍の倍率で収集した試料の画像を示す（図８）。再生マトリックスは、エオシンで染まるが、ヘマトキシリンでは染まらない。
【００６６】
（実施例４．２）
再生マトリックスの透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）
組織試料から調製し、５μｍのフィルターを通した２１日が経過した再生マトリックスを切断し、ＴＥＭによって走査した（図９〜１１）。ＴＥＭ下では球様の粒子がそれらの間に境界を示さないことから、球様の粒子が連続的な材料の一部であることがＴＥＭ分析から明らかである。球は、硬く、中が空洞ではなく、それらの周囲には、膜およびいずれかのその他の型の構造を有しない。この材料の内部は、均質である。図９中の非常に暗いスポットは、染色のバックグランドである。
【００６７】
（実施例５）
再生マトリックスの生化学的特徴付け
全血から作製した再生マトリックスを、タンパク質、脂質、核酸および炭水化物の含有量、ならびに生細胞の存在を示す鋭敏な指標としての代謝活性について分析した。生化学的データを、分析した湿潤状態のマトリックスのグラムでの質量に関して規準化した。タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび脂質の定量化のための標準的な方法を使用し、再生マトリックスのいくつかの異なるロットの組成を、再生マトリックスの製造工程の複数の時点において決定した（詳細な方法は、個々の項で示す）。
【００６８】
５．１．再生マトリックスの全タンパク質含有量
再生マトリックスの最も豊富な生物学的成分は、タンパク質であり、８．８±１．２質量％を示し、残りの質量は、再生マトリックスに結合している液体である。再生マトリックス中の規準化したタンパク質含有量を、あらかじめ秤量した一定量の再生マトリックスをＳＤＳ溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）およびＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ミニプロテアーゼインヒビターカクテル（カタログ番号１１−８３６−１５３、Ｒｏｃｈｅ製）に可溶化することによって決定した。溶解液中のタンパク質濃度を、ローリー法に基づくタンパク質アッセイキット（カタログ番号５００−０１１２、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用して、メーカーの指示に従って決定した。標準曲線を、ＢＳＡ標準物質（カタログ番号５００−０００７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用して作成した。光学密度（７５０ｎｍ）を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ分光光度計（Ｍｏｄｅｌ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）を使用して測定し、試料のタンパク質濃度を、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）を使用する標準曲線の直線範囲の内挿によって決定した。
【００６９】
（再生マトリックスあたりの）全タンパク質含有量を、再生マトリックス出発材料（０）に関して、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）カセットの最初の播種後、第０日、第１５日および第２１日において収集した試料について決定した。
【００７０】
表１．Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット中の再生マトリックスの全タンパク質含有量
再生マトリックス生成用液体を除去し、再生マトリックスをＳＤＳ緩衝液に可溶化した後、全タンパク質含有量を決定した。各時点で、４つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットから試料採取し、分析した。再生マトリックス生成の４つの独立したバッチからの結果を、平均±標準偏差として報告する。
【００７１】
【化１】

５．２．再生マトリックスのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析
再生マトリックス中に存在するタンパク質の主な種を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り取ったすべての目に見えるクーマシーバンドに対する質量分析法によって決定した。上記に準じて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、試料を調製し、定量化した後、あらかじめ成型したポリアクリルアミド勾配ゲル（ＰＡＧＥ ４〜２０％勾配、カタログ番号３４５−００３３、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に、ウェルあたり１０μｇで積んだ。主なタンパク質のバンドを、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ（登録商標）ゲル染色液（カタログ番号ＬＣ６０６０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて染色することによって可視化した。
【００７２】
切り取ったタンパク質のバンドを、同定のために、Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ、カンザス州（ｗｗｗ．ｍｉｄｗｅｓｔｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ））に送った。手短にいうと、還元、アルキル化およびゲル内トリプシン処理後、微小毛細管逆相カラム上でのペプチド抽出および分離。ペプチドを溶出し、ＬＣＱ Ｄｅｃａ ＸＰ Ｐｌｕｓイオントラップ質量計に直接エレクトロスプレーした。全ＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルを得、データを、ＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴソフトウェアによって分析した。この種の分析では、ペプチドの質量を使用して、既知のタンパク質のペプチド断片の既知の分子量を逆参照するので、ゲルのバンド中の部分的に分解したタンパク質の存在もまた検出されるであろう。再生マトリックス中の同定された主なタンパク質の種を以下に列挙する：トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン前駆体、補体成分３、Ａ〜Ｄ鎖ヘモグロビン、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、メダラシン阻害剤２、炭酸脱水酵素およびＣＡ１タンパク質。
【００７３】
一貫した、タンパク質のバンド形成パターンが、第１５日および第２１日の両方において、すべてのバッチ（５１〜５６）からの試料で観察された。大部分のタンパク質が、低分子量（約６７％が＜１０ＫＤａ）、約１５％が３３ＫＤａ、ならびに残りの約１９％が３４と１０３ＫＤａの間の分子量に分解した。ＳＤＳゲルの写真を、図１２に示す。
【００７４】
５．３．再生マトリックスの核酸含有量
タンパク質の場合に準じて、再生マトリックス（Ｍ）からＤＮＡを精製し、定量化した後、０、１５、２１の時点で、出発材料（Ｏ）と比較した。秤量した試料を、２×ＳＤＳ／Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶解緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２％ＳＤＳおよび６μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋストック（２０ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号２５５３０−０４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用して溶解させ、５０℃で一晩インキュベートした。溶解液を、等容量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（ＰＣＩ、２５：２４：１、ｐＨ８．０）、１滴のＰｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ（ＰＬＧ、カタログ番号９５５ １５ ４０３−７、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製）で抽出した。試料を、１４，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、相を分離させた。水相を、ＰＬＧを加えた、新しい２．０ｍｌの微量遠心チューブに移し、抽出および遠心分離を繰り返した。水相を、ＰＬＧを加えた、新しい２．０ｍｌの微量遠心チューブに移し、等容量のクロロホルムで抽出し、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。水相を、新鮮な１．５ｍｌの微量遠心チューブに移し、ＤＮＡを、０．７容量のイソプロパノール（カタログ番号３０３２−０６、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ製）および１０μｇのグリコーゲン（カタログ番号１０９０１３９３００１、Ｒｏｃｈｅ製）を添加することによって沈殿させ、ＲＴで１５分間放置した。試料を、１４，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。ペレットを、０．５ｍｌの７０％エタノール（カタログ番号ＥＸ０２８９−１、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ製）で２回洗浄し、風乾した後、３０μｌのＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０中に再懸濁した。ＤＮＡの濃度を、光学分光度的測定（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ、Ｍｏｄｅｌ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）により、２６０ｎｍの光学密度（ＯＤ）で決定した。また、２６０／２８０のＯＤ比も決定して、ＤＮＡの単離におけるタンパク質混入のレベルを示した。第１５日および第１２日における再生マトリックスの全ＤＮＡ含有量（μｇ）を、０時の出発材料中の全ＤＮＡ含有量と比較した。
【００７５】
表２．Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット中の再生マトリックスの全ＤＮＡ含有量
再生マトリックス生成用液体を除去し、Ｒ再生マトリックスをＳＤＳ緩衝液に可溶化した後、全ＤＮＡ含有量を決定した。各時点で、４つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットから試料採取し、分析した。再生マトリックス生成の４つの独立したバッチからの結果を、平均±標準偏差として報告する。
【００７６】
【化２】

再生マトリックス（Ｍ）からＲＮＡを単離し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（カタログ番号１５５９６−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用して、０、１５および２１の時点で、出発材料（Ｏ）のＲＮＡと比較した。１．０ｍｌのＴｒｉｚｏｌを、あらかじめ決定した量の質量に添加し、可溶化するまでＲＴで放置した（１０〜２０分）。試料を、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、水相を、新しい１．５ｍｌの微量遠心チューブに移した。溶液を、２００μｌのクロロホルム（カタログ番号４４４０−０４、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ製）で抽出し、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。水相を、新しい１．５ｍｌの微量遠心チューブに移し、ＲＮＡを、５００μｌのイソプロピルアルコール（カタログ番号３０３２−０６、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ製）を添加することによって沈殿させ、１２，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。ＲＮＡペレットを、７５％エタノール中で洗浄し、７，５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、風乾した後、試料を６５℃で１５分間加熱することによって、ＲＮａｓｅを含まない２５μｌの水中に再懸濁した。ＲＮＡを、分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ、Ｍｏｄｅｌ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）を使用して、２６０ｎｍのＯＤによって定量化した。第１５日および第１２日における再生マトリックスの全ＲＮＡ含有量（μｇ）を、０時の再生マトリックス出発材料中の全ＲＮＡ含有量と比較した。
【００７７】
表３．Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット中の再生マトリックスの全ＲＮＡ含有量
再生マトリックス生成用液体を除去し、再生マトリックスをＳＤＳ緩衝液に可溶化した後、全ＲＮＡ含有量を決定した。各時点で、４つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットから試料採取し、分析した。再生マトリックス生成の４つの独立したバッチからの結果を、平均±標準偏差として報告する。
【００７８】
【化３】

【００７９】
【化４】

５．４．再生マトリックスの脂質含有量。
【００８０】
再生マトリックス（Ｍ）中の全脂質含有量を、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．、「Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７巻、９１１〜９１７頁、１９５９年）を使用して、０、１５および２１の時点で、出発材料（Ｏ）の全脂質含有量と比較した。分析まで、試料を−８５℃で凍結保管し、分析時にＲＴで融解した。再生マトリックスについて、３７５μｌのメタノール：クロロホルム（２：１ｖ／ｖ）を、あらかじめ秤量した試料に添加して、ボルテックスミキサー（Ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｎｉ ｖｏｒｔｅｘｅｒ、カタログ番号、１４００５−８２４、ＶＷＲ製）中、中間スピード、ＲＴで１５分間インキュベートした。次いで、４７５μｌのメタノール：クロロホルム：水の混合物（カタログ番号ＩＢ０５１７４、ＩＢＩ Ｓｈｅｌｔｏｎ製）を添加して、上記と同様、ボルテックスミキサー中、ＲＴで１５分間インキュベートした。試料を、２５０×ｇ、ＲＴで１０分間遠心分離した。液相（クロロホルム相と水相の両方）を、新鮮な１．５ｍｌの微量遠心チューブに移し、チューブ内には、再生マトリックスのペレットのみを残した。再生マトリックスのペレットを、４７５μｌのメタノール：クロロホルム：水の２：１：０．８混合物中に再懸濁し、再び中間スピードで１５分間ボルテックスすることによって抽出した。１２５μｍｌのクロロホルムを添加し、試料を２分間ボルテックスし、１２５μｍｌの水を添加し、試料をさらに２分間ボルテックスし、次いで、２５０×ｇ、ＲＴで１０分間遠心分離した。液相を、初めの抽出からの試料にプールし、１，０００×ｇ、ＲＴで１０分間遠心分離した。クロロホルム相を、新鮮な１．５ｍｌの微量遠心チューブに移し、真空乾燥器中で４５分間またはクロロホルムが完全に蒸発するまで乾燥した。５０μｌのクロロホルムを、乾燥した脂質ペレットに添加し、試料を、１５分間ボルテックスして、脂質を完全に可溶化した。試料を、最終分析まで、−８５℃で保管した。標準脂質（Ｌ４６４６、Ｓｉｇｍａ製）の希釈系列を作製し、１０μｌの抽出した脂質試料を５００μｌの濃硫酸（カタログ番号ＳＸ１２４４−６、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）に添加し、チューブを１０分間沸騰させることによって、試料を加水分解した。試料を、水浴中、ＲＴで２分間冷却し、４０μｌの試料を、６００μｌのリン酸−バニリン試薬（０．６ｇのバニリン（カタログ番号ＶＸ００４５−１、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ製）、１０ｍｌの１００％エタノール（カタログ番号ＥＸ０２８９−１、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ製）、９０ｍｌのｄＨ_２Ｏおよび４００ｍｌのリン酸（カタログ番号ＰＸ０９９５−６、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製））に添加し、混合した後、遮光して、ＲＴで４５分間インキュベートした。脂質の濃度を、５２５ｎｍのＯＤで測定し（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ３８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）、分光光度計に提供されているＳｏｆｔＭａｘを使用して標準曲線を用いて内挿することによって決定した。第１５日および第１２日における再生マトリックスの全脂質含有量（μｇ）を、０時の出発材料中の全脂質含有量と比較した。
【００８１】
表４．Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセット中の再生マトリックスの全脂質含有量
再生マトリックス生成用液体を除去し、再生マトリックス全脂質含有量を、上記のように決定した。各時点で、４つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットから試料採取し、分析した。再生マトリックス生成の４つの独立したバッチからの結果を、平均±標準偏差として報告する。
【００８２】
【化５】

核酸および脂質の分析結果は、これらの材料が出発材料中に存在し、時間の経過と共に分解することを示唆している。ゼロ時における出発材料中に検出されたＤＮＡおよびＲＮＡの量の変動の程度が大きく、それに伴って、初期の分解速度も変動するようである。異なる試料間でのこの変動は、第１５日および第２１日までには、時間と共に減少した。これらの成分のうちのいずれかもが増加する場合はなく、これは、細胞の活性が存在しないことのさらなる証拠となる。
【００８３】
（実施例５．５）
放射標識基質を用いた、再生マトリックスの形成の間のタンパク質および核酸の合成
再生マトリックスの形成が、細胞の基本的な過程（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質合成）に積極的にかかわるか否かを確立するために、再生マトリックス出発材料にＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の合成のためのトリチウム標識基質を加えてインキュベートした。出発材料を含有する５つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）を、放射性同位体標識基質を加えてインキュベートした。各基質に、１つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）を用いた。使用した基質は、^３Ｈ−Ｌ−アミノ酸混合物（１ｍＣｉ／ｍｌ、カタログ番号２００６３、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）、^３Ｈ−ｄＴＴＰ（１０〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号２４０４４、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）、^３Ｈ−チミジン（６０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号２４０６０、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）、^３Ｈ−ｄＵＴＰ（３５〜５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号２４０６１、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）および^３Ｈ−ウリジン（３５〜５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、カタログ番号２４０４６、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）であった。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットに導入するために、２５μｌの同位体を、０．５ｍｌのＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地中に希釈し、次いで、各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）に注入し、回転させて混合を促進した。注入および混合の直後、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）（全量１０ｍｌ）から各１．０ｍｌを取り出し、ゼロ時の対照として処理した（下記を参照）。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）を３７℃、空気中の５．０％ＣＯ_２の雰囲気でインキュベートした。第１日、第３日および第７日の時点において、各１．０ｍｌを分析のために取り出した。試料を、１．５ｍｌの微量遠心チューブ中で氷上に保ち、１００μｌ（０．１ｖｏｌ）の１００％トリクロロ酢酸を添加し、チューブを反転させて、内容物を混合した。試料を、氷上で２０分間インキュベートし、核酸およびタンパク質を沈殿させた。沈殿物を、０．１％ＴＣＡ（氷冷）中のＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ製）に、パスツールピペットを使用して添加した。微量遠心チューブの内容物をフィルターに添加し、氷冷０．１％ＴＣＡを使用して５回すすいだ。フィルターを、箔上に移し、１時間風乾した。フィルターを、４ｍｌのＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｃｔａｉｌ（ＳｃｉｎｔｉＳａｆｅ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）中に移し、５ｍｌのプラスチック製シンチレーションバイアルに添加した。バイアルを、Ｂｅｃｋｍａｎ液体シンチレーションカウンターを使用して、トリチウムのエネルギーチャネル上で１分間カウントした。ＴＣＡ沈殿性材料の結果（１分あたりのカウント数）を下記の表に報告する。培養ヒト線維芽細胞を、アッセイの陽性対照として使用した。
【００８４】
表５．再生マトリックス形成材料を最初に播種した後、ゼロ時点、第１日、第３日および第１週における、各放射標識基質の１分あたりの全カウント数
【００８５】
【化６】

これらの結果は、再生マトリックス形成工程の間には検出可能な細胞の活性がないことを示している。
【００８６】
（実施例５．６）
代謝阻害研究
第１セットの実験（図１３および１４を参照）では、アフィディコリン（ＤＭＳＯに溶解、１０μｇ／ｍｌの最終濃度）、α−アマニチン（水に溶解、１０μｇ／ｍｌの最終濃度）およびシクロヘキシミド（エタノールに溶解、１０μｇ／ｍｌの最終濃度）を使用して、全血から生成する再生マトリックス中で、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡＩＩポリメラーゼおよびタンパク質合成の活性をそれぞれ阻害した。阻害剤剤を、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）に、第０日、すなわち、最初の供給日（第５日または第６日）に添加した。その後、培養物には、通常の培地を供給した。それぞれの処置および対照からの試料を、第２１日に採取し、分析した。
【００８７】
これらの阻害研究の結果を、図１３〜１６に示す。０、１０、３０および１００ｎＭのα−アマニチンを含有する対照の線維芽細胞培養物を、１週間培養した。α−アマニチンが添加されていない線維芽細胞は、第７日までにコンフルエントになった。１０、３０および１００ｎＭのα−アマニチンを含有する培養物はそれぞれ、第７日までに、約６０〜７０％、８０〜９０％および１００％の死亡率を示した。
【００８８】
別のセットの実験では、ＡＴＰａｓｅ／ＡＤＰａｓｅであるアピラーゼ（水に溶解、１０μｇ／ｍｌの最終濃度）を添加すると、５μｍろ過試料において、マトリックスの形成を部分的に抑制することができることが示された。アピラーゼは、２つの機能を有する。すなわち、アピラーゼは、一方では、ＡＴＰａｓｅ／ＡＤＰａｓｅを有し、他方では、抗凝血活性を有する。５μｍでろ過した試料中には存在する成分が、アピラーゼの抗凝血活性に感受性であり、その結果、それらの培養物に観察された「沈降」を生じた可能性がある。１μｍでろ過した試料では「沈降」が存在しなかったのは、多分、フィルターのポアサイズが小さいと残留する、これらの成分が除去されたからであろう。
【００８９】
（実施例５．７）
脂肪酸分析
質量分析法による分析を行って、全血から作製し、５μｍまたは１μｍのフィルターを通してろ過されて、３週が経過した再生マトリックス培養物中の脂肪酸含有量を決定した。表６に示すように、検出した多くの脂肪酸の種が、上清には存在せず、もっぱらマトリックス中に存在した。脂質１ｍｇあたりの脂肪酸の比率は、マトリックスの場合、５μｍでろ過した試料中よりも、１μｍでろ過した試料中の方が高かった。この比率は、上清の場合には、逆転した。提示するデータは、わずか１つの試料および１回の分析に基づくことから、この段階では、結論を出すことはできないであろう。
【００９０】
（表６．３週が経過した再生マトリックス（全血から作製）、上清についてのＦｏｌｃｈ分配による脂肪酸分析の結果。μｇ／脂質ｍｇとして示す）
【００９１】
【化７】

（実施例５．８）
浸透圧モル濃度
２つの異なる培養物の上清からの凍結試料の浸透圧モル濃度を、異なる期間にわたって分析した。培養が進むにつれて、浸透圧モル濃度が劇的に増加することが、下記の表７から明らかである。
【００９２】
（表７．再生マトリックス培養物の浸透圧モル濃度の測定値）
【００９３】
【化８】

（実施例５．９）
ＡＴＰ促進性代謝活性に関する再生マトリックスの分析
再生マトリックスおよびそれに使用した生成用液体を、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルについて、２、３、４、６および８週が経過した時点でアッセイし、これらのレベルを、出発材料中のＡＴＰのレベルと比較した。ＥＮＬＩＴＥＮ ＡＴＰ Ａｓｓａｙシステムを使用して、ＡＴＰを、発光によって迅速かつ定量的に検出した。メーカーの指示に従って、材料を、ＳＤＳで抽出した後、ＴＣＡを用いてあらかじめ沈殿させた。その上、いくつかの代謝酵素の存在を、同一の試料中で、ウェスタンブロット法を使用して試験した。ＡＴＰレベルについては、検出反応を、三つ組で行い、３つの異なる日にアッセイを行った。３バッチの再生マトリックスの出発材料は、ピコモル量（１×１０^{−１２ｍｏｌ}）のＡＴＰを含有したが、ＡＴＰは、培養第６日で検出不可能となり、その後の培養時点のすべてで検出不可能な状態を維持した。
【００９４】
代謝酵素である、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アルドラーゼ、ピルビン酸脱水素酵素およびチトクロム還元酵素の存在を、ウェスタンブロット法を使用して評価した。アルドラーゼは、解糖を介するグルコースの分解を触媒する酵素であり、出発材料中に存在し、これは、インキュベーションの第２１日と第２８日の間では、低下したレベルで検出し、第６０日では検出不可能であった。グルコース−６−リン酸脱水素酵素（ペントースリン酸経路）は、出発材料中に検出し、時間が経過すると、再生マトリックスに使用した生成用液体中に優勢に検出した。再生マトリックス中のそのレベルは、第２８日までに低下し、培養の残りの期間中、低い状態を維持した。しかし、この酵素のゲル上のバンドは、より低い分子量であり、これは、分解された形態のみが検出されたことを示唆している。ピルビン酸脱水素酵素（クレブス回路）は、出発材料中に検出し、そのレベルは、第２８日まで変化するようには見えなかった。ここでも、バンドは、予想したよりも低い分子量であり、これは、分解産物が検出されたことを示唆している。この酵素は、その後のいずれの時点でも検出できなかった。チトクロム還元酵素（酸化的リン酸化）は、出発材料中に検出し、より速い移動性のタンパク質（出発材料には存在しなかった）を、その後の時点のすべてで認め、これは、分解産物が再生マトリックス中に検出されたことを示唆している。
【００９５】
最初の播種後わずか第６日で、再生マトリックス中に検出可能なレベルのＡＴＰが存在しないことは、これらの酵素が機能性でないという結論を支持している。ピルビン酸脱水素酵素およびチトクロム還元酵素の両方は、大量のＡＴＰ（反応あたり３６ＡＴＰ）を産生する反応を触媒する。
【００９６】
（実施例５．１０）
その他の分析
マトリックスの組成分析は、再生マトリックス中には、細胞代謝活性の証拠がないことを示している。培地のｐＨは、培養中ずっと一定を維持し、したがって、これは、代謝活性が非常に低いまたはまったくないことを示している。さらに培地の浸透圧モル濃度は、培養期間に、劇的に増加するので、細胞増殖には非許容状態となる。
【００９７】
クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの比較から、５μｍでろ過した試料と１μｍでろ過した試料との間で、バンドパターンの軽度の差が明らかになった。ゲルの画像を、図１７に示す。青でのバンドの命名は、以前に質量分析によって同定したバンドを示す。赤の丸によって示す新しいバンド（Ｍ７およびＭ８）は、１μｍでろ過したマトリックスのみで観察されたバンドである。これらのバンドの出現は、その他のタンパク質が除去された結果、特定のバンドが濃縮されたことによると思われる。再生マトリックスの異なるプロテアーゼおよびヌクレアーゼに対する感受性を試験した。
【００９８】
ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ等のヌクレアーゼは、再生マトリックスに対して効果を示さなかった。ペプシン、トリプシン、パパイン、プロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素は、マトリックスを消化することができた。
【００９９】
（実施例６）
再生マトリックスを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏにおける神経栄養性遺伝子の活性化
ヒト神経芽腫細胞（細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、カタログ番号ＣＲＬ−２２６６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ製、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）を使用して、再生マトリックスの神経栄養性活性を特徴付けた。以下の基本培地（ＢＭ）を使用して、細胞を培養した：１０％ＦＣＳ（カタログ番号２６１４０−０７９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）および５μｇ／ｍｌ抗生物質ゲンタマイシン（カタログ番号１５７１００６４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて補足したＤＭＥＭ：Ｆ１２（カタログ番号３０−２００６、ＡＴＣＣ）。これを、増幅し、Ｔ１２５組織培養フラスコを使用して、コンフルエンスで継代することによって定期的に維持した。
【０１００】
遺伝子誘導の分析のために、細胞をトリプシン処理し、Ｔ７５フラスコ中に、１０^５細胞／ｍｌで播種し、３日後に出発材料を添加した。試験した材料は、基本培地（ＢＭ）、マトリックス媒体（Ｒ）、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）出発材料（Ｏ）および再生マトリックス（Ｍ）であった。液体の試験材料を不活性化するために、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）出発材料（Ｏ）を、１５ｍｌのポリスチレン製のコニカル培養チューブに入れ、６０℃で３０分間加熱した。再生マトリックスを不活性化するために、再生マトリックスに使用した液体を、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）から除去し、再生マトリックスを、ＰＢＳ（カタログ番号２１−０３０−ＣＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）（各１０ｍｌ）で３回洗浄した。１０ｍｌのホルマリン（ＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒド、カタログ番号２１０６−０１、ＪＴ Ｂａｋｅｒ製）を、再生マトリックスを含有するＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）に添加し、３０分間インキュベートした。再生マトリックスをＰＢＳで３回洗浄し、実験のために収集するまでＰＢＳ中に保管した。
【０１０１】
再生マトリックス処理（活性または固定）のために、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）の全内容物を、７０％コンフルエントなＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を含有するＴ７５培養フラスコに添加した。３時間後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、細胞を削り取って、２．０ｍｌの微量遠心チューブ中にピペットで移すことによって収集した。細胞を、１２，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を捨てた。Ａｔｌａｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（カタログ番号Ｋ１０３６−１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、元はＣｌｏｎｔｅｃｈ製）を使用して、メーカーの指示に従って、全細胞ＲＮＡを単離した。ＲＮＡペレットを、ＲＮａｓｅを含まないＨ_２Ｏに溶解し、ＯＤ_２６０によって定量化した。ＲＴ−ＰＣＲを、２μｇのＲＮＡ鋳型を使用して、Ａｍｂｉｏｎ Ｒｅｔｒｏｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（カタログ番号１７１０、Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）を使用して、メーカーの指示に従って行った。ＲＴ−ＰＣＲのために、ヒトのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ−４３）、Ｎｅｔｒｉｎ−１、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ−１）、ニュートロフィン−３（ＮＴ−３）、ニュートロフィン−６（ＮＴ−６）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および線維芽細胞増殖因子−９（ＦＧＦ−９）に特異的なプライマーを使用した。ＧＡＰＤＨの転写は、このアッセイで使用する刺激の型によって影響されないはずであることから、ＧＡＰＤＨを対照として使用した。使用したプライマーを、以下に示す。
【０１０２】
【化９】

ＰＣＲのために、５μｌのＲＴ反応産物を、４５μｌのＰＣＲ反応カクテル（５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、３２．１μｌのｄＨ_２Ｏ（ヌクレアーゼを含まない）、各２．５μｌのセンスおよびアンチセンス１０μＭプライマーストック、０．４μｌの５Ｕ／μｌ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ番号２０５２、Ａｍｂｉｏｎ製））に添加した。ＰＣＲパラメーターは、９４℃、２分（最初の変性）、次いで、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、および７２℃、４０秒の３０サイクル、さらに、７２℃、５分の仕上げの最終ステップであった。ＰＣＲ産物を、ウェルあたり１０μｌのＰＣＲ産物を使用して、２．５％アガロースゲルを５８Ｖで２時間流して分解し、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで染色した。ゲルのデジタル画像を、上方制御の倍増について、Ｓｃｉｏｎ画像分析ソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ製、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、メリーランド州）を使用して分析した。添加する媒体単独から産生したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物を含有するレーンのバンド強度を使用して、その他の処置からのシグナルを規準化した（データを示さず）。
【０１０３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＦＧＦ−９、Ｎｅｔｒｉｎ−１、ＮＴ−３、ＮＣＡＭ−１およびＧＡＰ−４３の遺伝子が再生マトリックスとのインキュベーションに応答して活性化することを示した。再生マトリックスによる遺伝子の活性化は選択的であるようである。これは、ＧＡＰＤＨ、ＮＴ−６およびＧＤＮＦの遺伝子の転写は、これらの実験では刺激されなかったからである。これらのデータは、ヒト神経芽腫細胞系ＳＨ−ＳＹ５Ｙは、再生マトリックスに選択的に応答して、機能および分化に関係する遺伝子を活性化させることを示している。増殖因子のみで補足した生成媒体は、ＦＧＦ−９およびＮｅｔｒｉｎのみに関して、媒体単独と比較して、遺伝子の上方制御活性のわずかな増加を示した。これらの結果は、再生マトリックスの遺伝子の上方制御活性は、再生マトリックスに固有の特性によるものであって、単に増殖因子の存在によるものではないことを示唆している。
【０１０４】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における再生マトリックスによるＮＴ−３、ＮＣＡＭ−１、Ｎｅｔｒｉｎ−１、ＧＡＰ−４３およびＦＧＦ−９の遺伝子の発現の活性化を、マトリックスを６０℃で３０分間処置することによって、不活性化することができる（図１９）。最後に、ホルマリンまたは高エネルギーガンマ照射（３０ｋＧｙ、３０分）を用いて再生マトリックスを処置してもまた再生マトリックスを不活性化する（データを示さず）。
【０１０５】
定期的な分析のために、再生マトリックスがＧＡＰＤＨ（対照）、ＧＡＰ−４３、ＮＣＡＭ−１およびＮＴ−３の上方制御に及ぼす効果を、４つの連続した生成バッチについて決定した。各バッチからの再生マトリックスを、第１５日および第２１日で試料採取し、出発材料の遺伝子誘導活性と比較した（表８）。上方制御の倍増を、４つの生成運転（各時点で２つのＯｐｔｉＣｅｌｌ（登録商標）カセット）から、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。結果を、平均±標準偏差として報告した。
【０１０６】
（表８．生成第０日（出発材料）、第１５日および第２１日における、再生マトリックスとのインキュベーション後のＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞中のＧＡＰＤＨ、ＮＴ−３、ＮＣＡＭ−１およびＧＡＰ−４３の上方制御の倍増の平均）
【０１０７】
【化１０】

（実施例６．１）
ヒト神経芽腫細胞における、増殖因子が補足されていない再生マトリックスが遺伝子の誘導に及ぼす効果
再生マトリックスを、いずれの増殖因子も補足せず、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地単独を使用して生成した。ＧＡＰＤＨ、ＮＴ−３、ＮＣＡＭ−１およびＧＡＰ−４３について、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞における遺伝子の上方制御応答を、ＩＴＳ（２×）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）を補足して生成した再生マトリックスと比較した。増殖因子なしで生成した再生マトリックスは、再生マトリックスを増殖因子を補足した生成媒体中で生成する場合と変わらない遺伝子の上方制御活性を有する（データを示さず）。
【０１０８】
（実施例６．２）
再生マトリックスの神経細胞遺伝子上方制御活性
１２日間形成した再生マトリックスは、神経細胞上方制御活性を有し、その周囲の溶液（ＣＭ）および再生マトリックスを形成することになる最初（第０日）の溶液（Ｒｅｐ）は、限られた神経細胞上方制御活性を有する。図１８Ａ〜１８Ｃは、再生マトリックスを用いて３時間処置したヒトＳＨＳＹ神経芽腫細胞上のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。標準対照と比較した上方制御の倍増の値を示す。再生マトリックスを、同一のヒトのドナーからの非凝固（ＥＤＴＡ処置）全血から同時に生成した。Ａ＝補助剤（標準的な再生マトリックス生成媒体）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。ＩＴＳ＝インスリン＋トランスフェリン＋セレン補助剤を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。ＥＧＦ＝上皮増殖因子補助剤を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。ＦＧＦ＝線維芽細胞増殖因子２補助剤を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。全＝ＩＴＳ＋ＥＧＦ＋ＦＧＦ補助剤を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。なし＝補助剤を添加しないＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地。供給なし＝再生マトリックス形成期間を開始（第０日）後、培地を追加して添加しなかった。
【０１０９】
図１８Ａ〜１８Ｃ中のＡ〜Ｓの行は、以下の再生マトリックスを指す。
【０１１０】
Ａ＝再生マトリックス生成用の完全な媒体；
Ｂ＝第１２日、全、ＲＭ−１；
Ｃ＝第１２日、全、ＣＭ−１；
Ｄ＝第１２日、ＩＴＳ、ＲＭ−１；
Ｅ＝第１２日、ＩＴＳ、ＣＭ−１；
Ｆ＝第１２日、ＥＧＦ−ＩＴＳ、ＲＭ−１；
Ｇ＝第１２日、ＥＧＦ−ＩＴＳ、ＣＭ−１；
Ｈ＝第１２日、ＦＧＦ−ＩＴＳ、ＲＭ−１；
Ｉ＝第１２日、ＦＧＦ−ＩＴＳ、ＣＭ−１；
Ｊ＝第１２日、なし、ＲＭ−１；
Ｋ＝第１２日、なし、ＣＭ−１；
Ｌ＝第１２日、供給なし、ＲＭ−１；
Ｍ＝第１２日、供給なし、ＣＭ−１；
Ｎ＝第０日、ＥＧＦ−ＩＴＳ、Ｒｅｐ−１；
Ｏ＝第０日、ＥＧＦ−ＩＴＳ、Ｒｅｐ−２；
Ｐ＝第０日、ＦＧＦ−ＩＴＳ、Ｒｅｐ−１；
Ｑ＝第０日、ＦＧＦ−ＩＴＳ、Ｒｅｐ−２；
Ｒ＝第０日、なし、Ｒｅｐ−１；
Ｓ＝第０日、なし、Ｒｅｐ−２。
【０１１１】
図１８Ａ〜１８Ｃに見ることができるように、いずれの場合も、再生マトリックスは、第２１日において、その出発溶液（第０日）と比較して、増加した神経細胞遺伝子上方制御活性を示した。第２１日における周囲の溶液は、引き続き、出発溶液（第０日）に観察された限られた活性を示した。したがって、形成されたマトリックスのみが、増加した活性を示し、再生マトリックスが形成されても、その周囲の溶液の活性が減少することはなかった。したがって、培養物全体的の神経細胞遺伝子上方制御活性は、再生マトリックスが形成されるにつれて、時間と共に劇的に増加した。
【０１１２】
（実施例７）
再生マトリックスのラットＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１（登録商標）細胞に及ぼす効果（神経突起の伸長の誘導）
ラットＰＣ−１２褐色細胞腫細胞からの増強されたサブクローンであるＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞（Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．ら、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ＰＣ １２ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｙｌ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒａｓ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、３２７７９〜３２７８５頁、２００１年；Ｗｕ，Ｙ．Ｙ．およびＢｒａｄｓｈａｗ，Ｒ．Ａ．、「Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｏｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ＰＣ １２ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７１巻、１３０３３〜１３０３９頁、１９９６年）を、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（カタログ番号Ｒ０４−０００１−Ｃ１）から得、再生マトリックスと共にインキュベートした。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞は、神経突起を伸長することによって応答した。その上、再生マトリックスの存在下では、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞の形態が変化し、平板化し、より細長くなる（図２０）。
【０１１３】
Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞−再生マトリックス相互作用研究のために、細胞および再生マトリックス試料材料を、以下の方法を使用して調製した。相互作用アッセイに先立って、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞を、コラーゲンでコートしたプラスチック上での定期的な培養によって維持し、ＲＰＭＩ（カタログ番号１０−０４０−ＣＶ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）、４．０ｍＭグルタミン（カタログ番号２５−００５−ＣＩ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）からなり、２０％ウマ血清（カタログ番号３５−０３０−ＣＶ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）、１０％ウシ胎仔血清（カタログ番号３５−０１０、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）を補足した基本培地を使用してコンフルエンスで継代した。再生マトリックス相互作用を確立する前日に、細胞をトリプシン処理した後、カウントし、９６ウェル細胞培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号４７７４３−９５３、Ａｘｙｇｅｎ製）中にウェルあたり２，０００細胞で蒔いた。再生マトリックスを含有するＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カセットを開き、再生マトリックスを１００μｍのナイロン製の細胞ストレーナー（カタログ番号３５２３６０、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ製）に移し、ふるいにかけた後、１ｍｌのＰＢＳ（カタログ番号ＭＴ２１−０３０−ＣＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）中に分散させた。再生マトリックスを分散させた１０μｌの懸濁液を、前日に播種したＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞を含有する各ウェルに添加した。
【０１１４】
各生成バッチについて、上記の分析のために、開始後第０日、第１５日および第２１日において試料を採取した。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞を、神経突起の伸長について、以下のβ−チューブリンの免疫染色を使用してアッセイした。培養４日後に、１０％ｖ／ｖの３７％ホルムアルデヒド（カタログ番号２１０６−０１、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ製）をウェル中の培地に直接添加することによって、細胞を固定した。プレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、透過処理し、ブロッキング緩衝液（１０％Ｎｏｒｍａｌヤギ血清：カタログ番号Ｓ２６−１００Ｍ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製、５％ＢＳＡ：カタログ番号２９１０、Ｏｍｎｉｐｕｒｅ製、０．１％Ｓａｐｏｎｉｎ：カタログ番号１０２８５５、ＭＰ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で２．５時間ブロックし、ブロッキング緩衝液中に１：１００で希釈した抗β−チューブリン抗体（マウスモノクロナール、細胞培養上清、カタログ番号Ｅ７、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ製）を使用して、４℃で１６時間染色した。細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液中に１：２００で希釈したａｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウス二次抗体（カタログ番号Ａ１１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて標識した。細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（カタログ番号Ｈ１３９９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌで３０分間対比染色し、次いで、ＰＢＳで１回洗浄した。プレートを、ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ顕微鏡（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ製、Ｖ２．２．０．０ Ｂｕｉｌｄ １９）を用いて、神経突起Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ Ｂｉｏ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｖ２．０を使用して走査した。
【０１１５】
選択したアウトプットパラメーターは、全細胞、１０μｍ超の神経突起全長を有するウェル中の細胞のパーセントである神経突起伸長指数（ＮＯＩ）、および各細胞における平均神経突起長（ＡＮＬ）μｍを含んだ。
【０１１６】
このアッセイの陽性対照として、神経増殖因子（ＮＧＦ、カタログ番号１３２５７−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を１００ｎｇ／ｍｌで添加した。要約すると、使用した処置を、以下に示す。それぞれについて、ＮＧＦを添加または未添加：再生マトリックス、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−基本培地、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−基本培地＋１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ、増殖因子なしで作製した再生マトリックス。
【０１１７】
細胞カウントが視野あたり１００個超であるウェルのみを分析した。ウェルあたりのＮＯＩの平均を、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）基本培地および１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦを含有する陽性対照ウェルからのＮＯＩ値の平均で割った。この値を、ＮＧＦ応答パーセントして報告する。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞からの神経突起伸長刺激を試験した４つの独立した実験からのデータを、図２１に示す。増殖因子補助剤の存在下で作製した再生マトリックスによる神経突起伸長刺激と比較した、増殖因子補助剤の非存在下で作製した再生マトリックスによる神経突起伸長刺激を、図２２に示す。
【０１１８】
これらの結果は、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞を用いて試験すると、再生マトリックスは、有意な神経突起誘導活性を有することを示している。しかし、神経芽腫細胞を用いた遺伝子上方制御の研究からの結果とは異なり、再生マトリックス生成の間にＩＴＳ、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの補助剤を添加することによって、再生マトリックスの神経突起伸長活性を有意に増加させることができる。
【０１１９】
（実施例８）
再生マトリックスによる増殖因子活性の保護および増強
ヒト末梢血を、Ｋ２ＥＤＴＡを含有する８ｍｌのＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）チューブ１０本に採取し、氷上でオーバーナイトで発送し、次いで、血液を重力で分離させるために、＋４℃の冷蔵庫内に６時間垂直に置いた。次いで、保管のために、重力で分離した血液を含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）チューブを、−２０℃の冷凍庫内に慎重に垂直に置いた。２日後、４本のチューブを冷凍庫から取り出し、チューブスタンド内に垂直に置き、２０℃で融解させた。融解した時点で、２本のチューブの血漿−血小板−バフィーコート画分を取り出し、５０ｍｌのコニカルチューブに入れ、残りの２本のチューブの全内容物を、別の５０ｍｌのコニカルチューブに入れた。各コニカルチューブの内容物を完全に混合した後、各コニカルチューブの５ｍｌを、別の５０ｍｌのコニカルチューブに、１００ｎｇ／ｍｌの神経増殖因子（ＮＧＦ）を含有する１０ｍｌのＴＲ−１０培地と共に入れた。ＴＲ−１０培地の組成を、表９に示す。各コニカルチューブの内容物を完全に混合した後、溶液を、５μｍのシリンジフィルター、次に、１．２μｍのシリンジフィルターを通してろ過し、次いで、新しい５０ｍｌのコニカルチューブに入れた。１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含有する十分なＴＲ−１０培地を添加して、各コニカルチューブの内容物を等しく５０ｍｌとした。各コニカルチューブの内容物を完全に混合した後、１０ｍｌの量の溶液を、５つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）の別々のセットに注入し、次いで、３７℃、２０％ＣＯ２、２％Ｏ２の無加湿のインキュベーター内に水平に置いた。したがって、各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）には、１μｇのＮＧＦを含んだ。試料を、６日間そのまま放置し、その後、３ｍｌのＴＲ−１０培地を各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）に添加した。第８日、第１０日および第１２日に、追加の１ｍｌのＴＲ−１０培地を各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）に添加した。第１３日に、各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）の内容物を別の１５ｍｌのコニカルチューブに入れ、５００×ｇで回転させた。上清を取り出し、その後の分析のために保存した。次いで、各１５ｍｌのコニカルチューブの内容物をＰＢＳで洗浄し、５００×ｇで回転させ、上清を取り出し、捨てた。これを、（再生マトリックスがＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）中に存在した時に）再生マトリックスのそれぞれが囲まれていたすべての元々の溶液を除去するために、さらに２回繰り返した。次いで、各再生マトリックス（質量約１ｇおよび体積約１ｍｌ）を、その後の分析ために保存した。各再生マトリックスは、約５ｍｇのタンパク質を含有した。再生マトリックスを、５，０００×ｇで３０分間遠心分離し（得られた液体の上清を除去すると）、再生マトリックスの水和のレベルは、約半分となることができた。
【０１２０】
（表９．ＴＲ−１０組成）
【０１２１】
【化１１】

【０１２２】
【化１２】

２週間後、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを、実施例９に従って準備した。神経増殖因子（ＮＧＦ）の応答曲線を作成した（図２３を参照）。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイの９６ウェルプレートの各ウェルは、２００μｌの溶液を含むので、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦを有するウェルは、総計２０ｎｇのＮＧＦを含んだ。
【０１２３】
早期の研究は、１０ｍｇの再生マトリックスの添加によって、１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦに曝露したＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞は、（長さ１０μｍ超の神経突起の）平均神経突起長が倍増する（表１０参照）ことを示していたので、このアッセイ上では、ｎＧＦを出発材料溶液に添加する効果を決定するために、実験を行った。
【０１２４】
（表１０．ＲＭｘおよび１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦに曝露したＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（商標）細胞の平均神経突起長。値は、陽性対照（１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ）のパーセントとして表す）
【０１２５】
【化１３】

各群から、５つの再生マトリックスのうちの３つおよびそれらの対応する溶液（保存した上清）を使用して、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにおける応答曲線を決定した（下記を参照）。Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞を、ＮＧＦ含有再生マトリックスに曝露すると、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞は、（長さ１０μｍ超の神経突起の）平均神経突起長が倍増するという非常に類似した結果を得た（下記を参照）。しかし、この倍増効果は、全血から作製した０．２ｍｇの再生マトリックス、および血漿−血小板−バフィーコート画分（赤血球画分を有しない、図２４を参照）から作製した０．０３ｍｇの再生マトリックスの場合のみで得られた。仮に出発材料溶液に添加したＮＧＦが、形成されつつある再生マトリックスと周囲の溶液との間で等しく分散しているとすると、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）アッセイのウェルに添加した再生マトリックスの全量は、全血および血漿−血小板−バフィーコート画分から作製した再生マトリックスに関して、それぞれ、わずか０．０２ｎｇおよび０．００３ｎｇのＮＧＦを含有するはずである。仮にすべてのＮＧＦが再生マトリックスに集まるとすると、その場合には、ウェルあたりのＮＧＦの全量は、それぞれ、０．２ｎｇおよび０．０３ｎｇとなるであろう。しかし、（これらの実験と平行して、同時に同一の（新鮮な）ＮＧＦを用いて行った）ＮＧＦ応答の標準曲線の点は、ウェルあたり１０ｎｇ未満の量では、新鮮なＮＧＦがＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞に及ぼす効果には制限があるか、効果がなく、最大の応答がウェルあたり１００ｎｇのＮＧＦで生ずることを示している。血漿−血小板−バフィーコート画分から作製した再生マトリックスは、この最大の応答の倍増を、そのようなＮＧＦの量（または濃度）の１／３０００から１／３００００（またはそれ未満）で示すことから、再生マトリックスには、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞に対して増殖因子感作（またはそれに類似する）効果が存在するに違いない。さらに、平均神経突起長が、ＮＧＦ単独で達成することができる最大閾値を上回って倍増したことから、再生マトリックスは、その他の神経突起増殖経路も刺激するに違いない。再生マトリックス単独（いずれのＮＧＦもなし）では、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞の平均神経突起長は、陽性対照（１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ）の約６０％となることが決定されている。
【０１２６】
驚くべきことに、上清（または１３日の再生マトリックス形成期間の終わりにおける各Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）中の再生マトリックスの周囲の溶液）もまた、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞のＮＧＦに対する最大の応答を倍増させた。仮に出発材料溶液に添加したＮＧＦが、形成されつつある再生マトリックスと周囲の溶液（上清）との間で等しく分散しているとすると、倍増効果（または最大の応答）は、わずか、ウェルあたり５ｎｇのＮＧＦ、または標準的な最大の応答（これは、上清で得られた応答のわずか１／２に過ぎない）に必要であるＮＧＦの量の１／２０で生じる。したがって、効力ははるかに低いが、再生マトリックスでの効果と同様な効果が、上清でも見られる。これは、再生マトリックスおよび再生マトリックス複合体に凝集する前の再生マトリックスの小さな粒子を形成することにもなる工程の間に存在し、形成される特性によると思われる。
【０１２７】
さらに、ＮＧＦ活性が、３７℃では、時間と共に減少することから、再生マトリックスは、増殖因子保護効果もまた有するようである。１３日が経過し、４℃で２週間さらに保管した再生マトリックスのＮＧＦ活性アッセイは、同一のロットからの新鮮なＮＧＦよりもはるかに高いＮＧＦ活性を示す。早期の実験では、同一の効果が、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＢＤＮＦで観察された。
【０１２８】
（実施例９）
ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地およびＴＲ−１０基本培地を用いて調製した再生マトリックスの用量応答
表１１は、ＤＭＥＭ／ｆ１２基本培地またはＴＲ−１０基本培地のいずれかを用いて調製した再生マトリックスの神経突起伸長性の用量応答の比較を示す（アッセイを、実施例７に従って準備した）。値を、陽性対照（ＮＧＦ）のパーセントとして表す。
【０１２９】
（表１１）
【０１３０】
【化１４】

（実施例１０）
再生マトリックスのラット胎仔脊髄からの初代細胞培養に及ぼす効果
健常なラットの胎仔（Ｅ１８）および成体から脊髄を得た。使用した神経細胞培養プロトコールは、Ｂｒｅｗｅｒら（「Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｂ２７／ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｔｒｉａｔｕｍ，ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ，ｓｅｐｔｕｍ，ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ，ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ，ａｎｄ ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、４２巻、６７４〜６８３頁、１９９５年）を改作した。脊髄を、ラットから、４℃の３５ｍｍペトリ皿中のＢ２７（カタログ番号１７５０４−０４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）および０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（カタログ番号２５−００５−ＣＩ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）で補足した２ｍｌのＨｉｂｅｒｎａｔｅ−Ａ（Ｂｒａｉｎｂｉｔｓ製、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、イリノイ州）中に解体した。髄膜および過剰の白質を同一の培地中で、４℃の第２の皿に取り出した。脊髄を、同一の培地であらかじめ湿らせた無菌の紙に移し、脊髄の長軸に垂直な約０．５ｍｍ厚さの切片を作製し、同一の培地の４℃のチューブに移した。３０℃で８分間振とう後、切片を、広い口径のピペットを用いて、パパインを含有する３０℃の別のチューブに移した。パパイン（１５〜２３単位／タンパク質ｍｇ、システインで活性化されていない）は、１２ｍｇを３７℃で５分間加温した６ｍｌのＨｉｂｅｒｎａｔｅ Ａに溶解させることによって調製した。溶液を、ろ過滅菌し、４℃で保存した。切片を、３０℃の水浴中で３０分間インキュベートし、この際、切片を懸濁させるのに十分なスピード（１７０ｒｐｍ）でプラットフォームを回転させた。切片を、２ｍｌのＨｉｂｅｒｎａｔｅ−Ａ／Ｂ２７を含有する３０℃の１５ｍｌのコニカルチューブに移し、ＲＴで５分間放置した。切片を、シリコン処理パスツールピペット（火炎研磨した先端）を用いて（約３０秒かけて）１０回粉砕した。２分間放置して小片を沈降させ、上清を別のチューブに移した。第１のチューブからの沈降物を、２ｍｌのＨｉｂｅｒｎａｔｅ Ａ／Ｂ２７中に再懸濁させ、粉砕および沈降の工程をさらに２回繰り返した。各粉砕からの上清を組み合わせて、６ｍｌの懸濁液を得た。
【０１３１】
細胞を、６０〜１５０μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ／Ｂ２７中の９０〜３２０／ｍｍ^２で、５０μｇ／ｍｌのリジン−アルギニン共重合体（ＬＡＳ、ＢｒａｉｎＢｉｔｓ製）であらかじめコートし、オートクレーブしたガラス上に蒔き、１００ｍｍの皿中に分布させた。蒔いてインキュベートして（５．０％Ｏ_２、５．０％ＣＯ_２、残りはＮ_２）から１時間後、カバーガラスを素早く取り出し、流し、３７℃の２４ウェルプレート中の０．４ｍｌのＮｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ／Ｂ２７中に移した。培地を吸引し、カバーガラスを暖かいＨｉｂｅｒｎａｔｅ−Ａで１回すすぎ、細胞に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ／Ｂ２７、０．５ｍＭグルタミン、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦで再度栄養供給した。第４日に、培地の半分を除去し、それを５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを含有する等容量の新鮮な培地で置換することによって、細胞に栄養供給した。神経細胞を、６日間、接着および増殖させてから、相互作用実験のために使用した。これらの細胞は、健常な外観を示し、着実に増殖し、相互作用の開始時には、４０〜６０％の間でコンフルエントであった。
【０１３２】
３つの異なるバッチのマトリックスを、第１６日、第９日および第７日のそれぞれにおいて評価した。３つのバッチのすべては、ＥＤＴＡを抗凝血薬として使用して採取した非凝固血から誘導した。２つのバッチは、グルコース、グルタミンおよびピルビン酸を含有し、１つのバッチは、それらを含有しなかった。ラット胎仔（Ｅ１８）全脊髄の単一細胞懸濁液を上記のプロトコールに従って調製した。細胞の単層を、ガラス製のスライドガラス上に増殖させ、マトリックスまたは対照培地のいずれかと共にインキュベートした。相互作用培養の開始後第７日において、カバーガラスをＩＣＣのために処理した。マトリックスなしの脊髄初代細胞である対照を、培養系の機能性の陽性対照として使用した。
【０１３３】
免疫細胞化学分析の結果を示す顕微鏡写真を、図２５および２６に示す。対照は、成熟神経細胞については陽性に染色し、これらのすべてが、グリア細胞については陰性に染色した（図２５）。対照の培養物中、Ｔｕｊ１陽性細胞の数が４．２％であり、ＧＦＡＰ陽性細胞が０．４％である。Ｔｕｊ１およびＧＦＡＰの両方に陽性に染色した細胞は、検出されなかった。
【０１３４】
マトリックスと共にインキュベートした神経細胞は、顕著な、長い軸索をより低い割合で示した。しかし、培養物内のＴｕｊ１陽性細胞の割合は、再生マトリックスありでは５５％まで増加した（大部分の染色が細胞体および短い突起に限定されていた）のに対して、再生マトリックスなしでは４．２％であった。培養物内のＧＦＡＰ陽性細胞の割合は、再生マトリックスありでは９２％まで増加したのに対して、対照では０．４％であった。再生マトリックスで処理した培養物中、約５０％の細胞が、Ｔｕｊ１およびＧＦＡＰの両方に陽性であり、これは、これらの細胞が、三相性の神経前駆細胞であることを示し、対照中には、そのような細胞は観察されなかった。
【０１３５】
この観察は、再生マトリックスが、若く、新しい神経細胞の増殖を促進することを示している。同一の期間中のアストロサイトの存在の増加から、組織の神経新生の現象および／または「損傷」の初期の応答を説明することができ、これは、治癒カスケードに要求され、それに先行するステップである。
【０１３６】
図２６に示すように、再生マトリックスで処置した細胞は、Ｔｕｊ１およびＧＦＡＰの両方に陽性である細胞を含有し、これは、これらの細胞が、三相性の神経前駆細胞であることを示し、対照中には、そのような細胞は観察されなかった。
【０１３７】
（実施例１１）
再生マトリックスのヒト線維芽細胞に及ぼすｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効果
相互作用アッセイに先立って、ヒト新生児包皮線維芽細胞（細胞系番号ＣＣＤ １０７９ Ｓｋ、カタログ番号ＣＲＬ ２０９７、ＡＴＣＣ）を、基本線維芽細胞培地（１０％ＦＢＳおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭ）を使用する定期的な培養およびコンフルエンスでの継代によって維持した。細胞をトリプシン処理し、空のＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）メンブレイン（Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標））、または凝固血を使用して形成した再生マトリックスが接着したＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）メンブレイン（再生マトリックス）のにいずれかの上に蒔いた。メンブレインを１ｃｍ^２に切断した。メンブレインを、６ウェルプレートの底に、無菌のＶａｓｅｌｉｎｅの小片を使用してあらかじめ付着させた。培地を添加する前にＶａｓｅｌｉｎｅ点をウェルの底部に置き、それから、培地を添加し、最後に、メンブレインをその中心を上部から押すことによって置いた。各ウェルは、２つのＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）処置および２つの再生マトリックス処置を含有した。コンフルエントなプレートからトリプシン処理した細胞を、カウントし、３ｍｌの培地中に、ウェルあたり２０，０００細胞の密度で蒔いた。プレートを、インキュベーター中に置き、２時間後に、いくつかの代表的な試料を固定した後、核を染色し、細胞数を推定した。残りのメンブレインを、静かにさらに２日間保った。ＢｒｄＵ（カタログ番号２０３８０６、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を、増殖培地中に２０μＭまで、１０ｍＭストックを希釈することによって添加した。インキュベーション期間後、メンブレインを、２４ウェルプレート中で、１ｍｌの氷冷７０％エタノール（カタログ番号ＵＮＩ１７０、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ製）中の１５ｍＭグリシン（カタログ番号Ｇ−８７９０、Ｓｉｇｍａ製）中に浸漬した。固定した細胞を、−２０℃で、少なくとも２４時間保管した。ＢｒｄＵの検出のために、細胞を、ＰＢＳ（カタログ番号ＭＴ２１−０３０−ＣＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）中で１回洗浄し、ＫｉｔＩＩ用モノクロナール抗ＢｒｄＵ抗体−ヌクレアーゼ試薬（カタログ番号１２９９９６４、Ｒｏｃｈｅ製）の１：１０希釈で処置し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１０％正常ヤギ血清：カタログ番号Ｓ２６−１００Ｍ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製、５％ＢＳＡ：カタログ番号２９１０、Ｏｍｎｉｐｕｒｅ製、０．１％サポニン：カタログ番号１０２８５５、ＭＰ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製、最終溶液を、０．２μｍのフィルターを通して無菌ろ過し、４℃で保管した）中のＡｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ１１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）の１：２００希釈を加えて、室温で１時間インキュベートした。試料を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（カタログ番号Ｈ１３９９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、−２０℃に保った１０ｍｇ／ｍｌストック）を用いて３０分間対比染色し、ＰＢＳ中で１回洗浄した。次いで、メンブレインを反転させ、再び２４ウェルプレート上の５０μｌのグリセロール中にマウントした。プレートを４℃で保管し、１週間以内に走査した。
【０１３８】
ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ製，Ｖ２．２．０．０ Ｂｕｉｌｄ １９）を用い、Ｂｉｏ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアＴａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ２．０を使用して、画像を分析した。画像を、ハードドライブにＣｅｌｌｏｍｉｃｓ専売特許のフォーマットで保存し、プレートを走査しながら分析した。陽性細胞の閾値に関する設定を、各染色のセッションについて、陰性細胞および陽性細胞のヒストグラムをプロットすることによって得た。固定の間にすべてのウェルから細胞が外れたプレートおよび信号が観察されなかったプレートは、最終的な分析には含めなかった。
【０１３９】
Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）メンブレイン上で増殖させた細胞は、ＢｒｄＵに対して、総計２１．８±２．６％陽性であり、再生マトリックス上で増殖させた場合には、わずか１３．４±２．０％陽性に過ぎなかった。初期の接着の差を、接着の直後に細胞をカウントすることによって除外した（すなわち、接着した細胞の総数は、これら２つの試料で同一であった）。
【０１４０】
２時間で再生マトリックスに接着した線維芽細胞は、対照のＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）の場合と同数であったが、核のサイズは低下し（多分、アポトーシスの第１段階を示す）、２４時間の期間にわたり再生マトリックス上で増殖させた線維芽細胞の場合、ＢｒｄＵ陽性細胞の数は減少している（図２８Ａ〜Ｃを参照）。これらの再生マトリックス上でより長期に増殖させた線維芽細胞培養物では、対照の培養物と比較して、線維芽細胞の密度が劇的に減少する（これらの線維芽細胞の一部は、アポトーシスを経ている）。図２７は、５μｍろ過全血から作製した再生マトリックス上で５日間増殖させた線維芽細胞の増殖密度のこの差を示す。
【０１４１】
（実施例１２）
再生マトリックスのヒトアストロサイトに及ぼすｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効果
形態変化アッセイを、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）についての染色を使用して行う以外は、線維芽細胞に用いたと同一の処置および培養条件を、アストロサイトに対して使用した。ヒト初代アストロサイト（カタログ番号１８００、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ製、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を、ポリ−Ｄ−リジンでコートしたプレート上の基本培地（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号１８０１、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ製）中で培養し、コンフルエンスで継代した。相互作用実験の前日に、細胞をトリプシン処理した後、カウントし、ポリ−Ｄ−リジンでコートした９６ウェルプレート（カタログ番号３５４４６１、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ製）中にウェルあたり２０００細胞で、ＢｒｄＵのために蒔いた。
【０１４２】
各バッチについて、上記の分析のために、開始後第０日、第６日、第１２日、第１５日、第１８日および第２１日において、試料を採取した。各処置を、各測定について、４回反復した（例えば、試料あたり４つのウェル）。増殖のために、再生マトリックスの存在下の２日後に、ＢｒｄＵ（カタログ番号２０３８０６、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を、増殖培地中に、４００μＭストックを１：２０で２００μｌの培地に希釈することによって、２０μＭまで添加した。細胞を、３７℃、５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、残りはＮ_２で、さらに１．５時間インキュベートした。培地をデカンテーションによって除去し、細胞を、氷冷７０％エタノール（カタログ番号ＵＮＩ１７０、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を用いて、１５ｍＭグリシン（カタログ番号Ｇ−８７９０、Ｓｉｇｍａ製）中に固定した。固定した細胞を、−２０℃で少なくとも２４時間保管した。ＢｒｄＵの検出のために、細胞を、２００μｌのＰＢＳ（カタログ番号ＭＴ２１−０３０−ＣＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ製）中で１回洗浄し、ＫｉｔＩＩ用モノクロナール抗ＢｒｄＵ抗体−ヌクレアーゼ試薬（カタログ番号１２９９９６４、Ｒｏｃｈｅ製）の１：８０希釈で処置し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１０％正常ヤギ血清：カタログ番号Ｓ２６−１００Ｍ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製、５％ＢＳＡ：カタログ番号２９１０、Ｏｍｎｉｐｕｒｅ製、０．１％サポニン：カタログ番号１０２８５５、ＭＰ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製、最終溶液を、０．２μｍを通して無菌ろ過し、４℃で保管した）中のＡｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ１１０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）の１：２００希釈を加えて、室温で１時間インキュベートした。試料を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（カタログ番号Ｈ１３９９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、−２０℃に保った１０ｍｇ／ｍｌストック）を用いて３０分間対比染色し、ＰＢＳ中で１回洗浄し４℃で保管し、通常１週間以内に走査した。エタノール固定および保管の後、細胞を、２Ｎ ＨＣｌ（カタログ番号２６１２−１４、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を用いて３０分間処理し、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ ｐＨ８．５（カタログ番号９２３０、ＯｍｎｉＰｕｒｅ製）で中和した後、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ブロッキング緩衝液中のＡｌｅｘａ−４８８標識モノクロナール抗ＢｒｄＵ抗体（カタログ番号ＭＤ５４２０、Ｃａｌｔａｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）の１：２００希釈の５０μｌ中で、４℃で１６時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液中のＡｌｅｘａ５４６標識ヤギ抗マウス（カタログ番号Ａ１１０３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を加えて３時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔの２００μｌ中で対比染色し、ＰＢＳ中に保管した。ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ製，Ｖ２．２．０．０ Ｂｕｉｌｄ １９）を用い、Ｂｉｏ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎソフトウェアＴａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｖ２．０を使用して、画像を分析した。画像を、ハードドライブにＣｅｌｌｏｍｉｃｓ専売特許のフォーマットで保存し、プレートを走査しながら分析した。陽性細胞の閾値に関する設定を、各染色のセッションについて、陰性細胞および陽性細胞のヒストグラムをプロットすることによって得た。固定の間にすべてのウェルから細胞が外れたプレートおよび信号が観察されなかったプレートは、最終的な分析には含めなかった。概して、再生マトリックスの存在下で培養したアストロサイト（１３．９±２．３％）は、再生マトリックスなしで培養したアストロサイト（１８．５±２．４％）よりも少ないＢｒｄＵ陽性の核を有し、これは、多分、再生マトリックスで処置した脊髄損傷では、対照と比較して、より少ないグリアの瘢痕化が観察されたことの説明となるであろう。
【０１４３】
（実施例１３）
再生マトリックスの損傷したラット脊髄に及ぼすｉｎ ｖｉｖｏにおける効果
再生マトリックスのｉｎ ｖｉｖｏ活性を評価するために、脊髄損傷モデルの３つのラットモデルを使用した。
【０１４４】
− 完全横切（５ｍｍ欠陥）
− 片側切断（５ｍｍ欠陥、右側）
− 挫傷（５０ｍｍ重量落下）
すべての動物実験を、手術および手術後の標準的な動物の世話の手順を含むＩＡＣＵＣ承認プロトコールを使用して行った。これらの実験には、ヌードラット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｉｎｃ．製、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、マサチューセッツ州）を使用して、ヒト再生マトリックスに対する免疫学的な反応を最小化した。脊髄にアクセスするために、Ｔ８からＴ１１までの脊椎上、正中線で切開し、皮膚および背外側腰椎帯膜を後退させた。脊椎の両側を、鈍的切開によって曝露させた。背側椎弓切除を、Ｔ８〜Ｔ９レベルで行った。硬膜を切断した後、後退させ、脊髄を曝露させた。横切研究では、Ｔ８とＴ９との間で切断した、脊髄の完全な厚さの区域を、長さ５ｍｍに切断し、慎重に取り出した。片側切断ＳＣＩモデルでは、上記で記載したように脊髄を曝露させ、右側に、５ｍｍの欠陥を、脊髄中に外科的に生み出した。再生マトリックスのインプラントを使用して、欠陥を満たした。硬膜、上部の靱帯、筋肉および皮膚を、縫合によって閉じた。挫傷モデルでは、脊髄の曝露させた硬膜を、ＮＹＵ ＩＭＰＡＣＴＯＲを使用した５０ｍｍ重量落下によって激突を生じさせた後、ラットを、損傷後２週間回復させた。２週間回復させた後、ラットに、再生マトリックスを、損傷領域に隣接する脊髄中に外科的に移植した。すべてのラットを、それらが属するケージで回復させ、感染を予防するために、抗生物質の皮下注射を３日間投与した。すべてのラットの感覚機能および運動機能を、ＢＢＢ神経学的スケールの改変版（Ｂａｓｓｏ，Ｄ．Ｍ．ら、「Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｒａｔｉｎｇ ｓｃａｌｅ ｆｏｒ ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｒａｔｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ 、１２巻、１〜２１頁、１９９５年）に従って定期的に評価した。ＢＢＢスコアを、表１２および１３に列挙した判断基準を使用して、約２週間に１回記録した。
表１２．Ｂａｓｓｏ、ＢｅａｔｔｉｅおよびＢｒｅｓｎａｈａｎの歩行運動評価スケール
【０１４５】
【化１５】

【０１４６】
【化１６】

（表１３．ＢＢＢの定義）
【０１４７】
【化１７】

【０１４８】
【化１８】

１５ａ．完全横切脊髄損傷ラットモデル
図２９は、ラットにおける完全横切研究からの結果を示し、ここでは、横切損傷を再生マトリックスで満たし、対照としては、すき間を血液で満たした。一般的に、脊髄損傷の重症度のために、この種の研究に関連する死亡率のレベルが高く、ここでの結果は、少なくとも第６週で生存したラットにおける神経機能の状態を描写する。ＢＢＢスコアを、２週間隔で、移植後１２から１４週間までモニターした。再生マトリックスを移植し、損傷／移植後少なくとも第６週で生存した７匹の全ラットは、改善されたＢＢＢスコアを示した（図２９）。最大の増加が、移植後第６〜８週で見られた。少なくとも第６週で生存した３匹の対照ラットは、１２週間の評価期間にわたり、実質的な改善を示さなかった。
【０１４９】
さらに、再生マトリックスを移植したラットにおいては、病変（嚢腫）の数および脊髄損傷（手術）部位の上下の各病変の平均体積が、対照ラットと比較して、顕著に減少した（図３０）。これは、再生マトリックスが、これらの動物モデルにおいて神経保護効果を示し、その結果、損傷部位の上下おける神経組織の保護が高まることを意味する。
【０１５０】
１５ｂ．片側切断脊髄損傷ラットモデル
図３１は、再生マトリックスを、片側切断によって損傷させた脊髄中に移植した結果の概要を示す。片側切断ＳＣＩモデルでは、上記に記載したように脊髄を曝露させた後、脊髄中に５ｍｍの欠損を右側に外科的に生み出した。このモデルは、横切モデルほどには過酷ではなく、ラットは、正常にある程度まで機能することができる。例えば、外科的に誘導した欠損があっても、膀胱の制御は可能であるが、右後肢の運動機能は損なわれる。再生マトリックスを移植する（ｎ＝４）と、非移植対照（ｎ＝２）と比較して、生存率が上昇し、機能が回復した（ｎ＝３）。非移植対照ラットは、第１週における最初のＢＢＢ評価の期間の前に死亡した。
【０１５１】
１５ｃ．挫傷脊髄損傷ラットモデル
挫傷モデルでは、硬膜を下部の脊髄と共に曝露させ、ＳＣＩを、ＭＡＳＣＩＳ ＩＭＰＡＣＴＯＲ（以前は、ＮＹＵ ＩＭＰＡＣＴＯＲ、Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｕｔｇｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージ州）を使用した５０ｍｍ重量落下によって誘発した。ラットを２週間回復させ、次いで、第２の手術を行い、脊髄を曝露させ、再生マトリックスを、損傷領域に隣接させて留置した。図３２は、再生マトリックスの移植は、挫傷によって損傷した脊髄を有するラットにおいてもまたＢＢＢスコアを改善することを示す。この研究では、２５匹のラットが、脊髄上に与えた挫傷による損傷を有し、１９匹のラットは、挫傷後第２週で生存していた。生存したラットのうち、１１匹のラットに再生マトリックスを移植し、８匹は対照となり、これらは、生物学的に不活性化した移植を行うか、第２の手術を行わない（したがって、移植なし）のいずれかとした。損傷後第６週で、９匹のマトリックス移植ラット、４匹の不活性化マトリックス移植ラット、および３匹の非移植対照ラットが生存していた。これらの生存ラットについてのＢＢＢスコアを、２週間隔で評価した（図３２）。再生マトリックス移植ラットは、完全横切モデルおよび片側切断モデルの場合と同様に回復した。生物学的不活性化マトリックス移植ラットは、部分的に回復し、これは、再生マトリックスの構造上の特性単独でも、マトリックスを投与されなかった対照を上回る顕著な再生の可能性を有することを示している。対照ラットのうちの１匹は、相当な自発的な回復を明らかに示し、これは、不完全な損傷によるものと思われた。しかし、第２の手術の軽度ではあるが、測定可能な衰弱性の効果を、移植マトリックスが克服し、その結果、ラットの顕著な改善を得た。
【０１５２】
（実施例１６）
ヒト再生マトリックスは、実験的脊髄損傷を有するブタにおいて安全で、耐容性がよく、機能の回復を支持する
実験的なパイロット研究において、ブタ、雄、体重２０から４５ｋｇに、異なる種類の脊髄損傷（衝撃、貫通、裂傷、外科的片側切断）を与え、ヒト再生マトリックスまたはブタフィブリン製のプラグを損傷部位に留置した。各種の損傷がブタの歩行運動および感覚の機能性に及ぼす結果についての見解を発生させるため、ならびにどの損傷モデルにおいて再生マトリックスが最もよく働くと思われるかの見解を得るために、異なるモデルを試験した。ヒト再生マトリックスには、ＳＣＩを有するブタにおいて機能回復を促進する明確な傾向があり、最も顕著な効果が、裂傷および脊髄組織の欠損を生じる重度の衝撃による損傷で見られた。また、これらの実験は、再生マトリックスインプラントの耐容性および想定される安全性を評価する機会も提供した。ブタの脊髄は、Ｔ２からＬ２までの微小環境の点でヒト脊髄と９８％超同一であり、したがって、再生マトリックスがヒト脊髄において示す恐れのある、何らかの想定される安全性の懸案事項を決定するための良好なモデルとなる。１〜３カ月の間隔をおいた２回に分けた手術で、再生マトリックスを脊髄に２回注入した３匹のブタを含む、ヒト再生マトリックスを移植したいずれのブタにおいても、安全性の懸案事項は検出されなかった。対照ブタと再生マトリックスを移植したブタとの間には、体重ならびに挙動の点で有意な差は見出されなかった。挙動としては、摂食、飲水、社会的相互作用、ならびに排尿および排便の挙動について動物の管理の間に行った一般的な観察があげられる。これは、再生マトリックスが、ブタに移植する場合、耐容性がよく、比較的無毒性であることを示している。
【０１５３】
いくつかのブタにおいて移植１カ月後に採取した組織試料に、Ｔｈｊ−１染色を行ったところ、移植した再生マトリックスが、脊髄損傷の部位において新たな神経細胞の形成を誘導していたことを示した。図３７は、移植した再生マトリックスが、移植１カ月以内に新たなＴｕｊ−１陽性神経細胞の形成を誘導するのを示す（２００倍の倍率で示す）。
【０１５４】
これらの予備的なパイロット研究は、ヒト再生マトリックスが、ＳＣＩを有するブタにおいて歩行運動の回復を促進することを示唆した。図３３は、これらの予備研究の結果を示し、そこでは、改変したＡＳＩＡスコア化システムを使用して、これらのブタにおける神経学的な回復を評価した。いくつかのブタは、外科的損傷の重症度のために非常に低いＡＳＩＡスコアで出発したが、その他のブタ（対照ブタのすべてを含む）は、外科的損傷がそれほど重度ではなく、したがって、より高いＡＳＩＡスコアで出発した。
【０１５５】
これらのパイロット研究の完了後、７週間の完全二重盲検安全性研究は、ヒト再生マトリックスが、実験的脊髄損傷を与えたブタにおいて、安全で、耐容性がよいことを実証した。これらの二重盲検研究では、ブタに、Ｔ８〜Ｔ９の脊髄の右側に局在する外科的に誘発したＳＣＩ−５ｍｍ離なれた二重片側切断後、脊髄の５ｍｍ長の小片を除去−を与え、ヒト再生マトリックスまたは同等の量のホモゲナイズしたヒト血餅のいずれかを移植した。左側の脊髄は、実験的手術および移植に関係する非特異的毒性の対照とした。すべてのブタを、全体的な健康状態、体重および歩行運動応答の変化について、ＳＣＩおよび移植の後、７週間定期的に観察した。
【０１５６】
最初に、１６匹の、年齢および体重が一致するブタを、各２匹の８群にランダムに割付け、これらにヒト再生マトリックスまたはヒト血餅のいずれかを移植した。４匹のブタ−再生マトリックス処置群で２匹、および血餅処置群で２匹−が、重度の脊髄損傷を与えてからほどなくして死亡した。これは、ヒト再生マトリックスは、血餅移植群と比較して、死亡率の増加と関係がないことを示している。
【０１５７】
ブタにおける再生マトリックスの移植は、血餅を移植した対照ブタと比較して、耐容性がよく、通常は安全であると思われた。図３４は、２つの群における週毎のブタの体重増加の概要を示し、それらを比較する。最初の５週間では、ブタの総体重増加の平均について差は検出されなかったが、研究期間の最後の２週間では、再生マトリックス移植ブタの体重増加が対象ブタを上回った。これらのデータは、再生マトリックスが、ブタにおいて耐容性がよく、全身毒性がないことを示唆している。さらに、データは、研究期間の最後の２週間では、再生マトリックス移植ブタは、対照ブタよりも多くの筋肉量がつき始めたことを示唆している。
【０１５８】
すべてのブタにおいて、歩行運動機能を、動物の後脚のための改変したＡＳＩＡ Ｓｅｎｓｏｒｙ ａｎｄ Ｍｏｔｏｒ Ｓｋｉｌｌスコア化システムを使用して、ＳＣＩ後、最初は第７２時で、次いで、１週間毎に測定した。図３５は、再生マトリックス移植ブタまたはホモゲナイズした血餅移植ブタの歩行運動スコアを示す。
【０１５９】
これらの研究では、Ｓｅｎｓｏｒｙ ａｎｄ Ｍｏｔｏｒ Ｓｋｉｌｌベースラインスコアを、外科的ＳＣＩおよび移植の７２時間後に測定し、初期値として使用し、次いで、１週間毎に７週間スコアを決定した。両方の研究群のブタは、外科的ＳＣＩの第１週以内に、歩行運動機能および感覚機能を（脊髄ショックから）回復し始め、これらの値は、移植後第２〜４週で、一定のレベルに達した。この第２〜４週の時期の間では、再生マトリックス移植群と血餅移植群とで、歩行運動機能および感覚機能について、有意な差を観察せず、これは、再生マトリックスは、ＳＣＩブタにおける機能の回復を妨害することもなく、脊髄の機能をさらに障害することもないことを示している。
【０１６０】
感覚機能および歩行運動機能の回復のさらなる増加を、ＳＣＩ後、およそ第４〜６週で、ほとんどのブタで観察した。これらの後期の時点では、血餅移植ブタにおいて観察した回復のレベルよりも、再生マトリックス移植ブタにおいて観察した回復のレベルの方が高かった。第７週の時点でのこれら２群の差を詳細に分析すると、再生マトリックスを受けたブタの右側（損傷を与えた側）の機能に有意な改善（ｐ＝０．０３）があることが示されている（図３６）。この第７週の時点で、再生マトリックス移植群内に、対照群よりもはるかに大きいばらつきがあることは、再生マトリックスの生物学的活性が、そのエンドポイント（最終的な運動のスコア）値にまだ達していないことを示している。エンドポイントは、約１６週であろう推定された。
【０１６１】
総合すると、これらの研究は、ブタにおいては、再生マトリックスが、安全で耐容性がよく、外科的に誘導したＳＣＩ後の感覚および歩行運動の回復を促進することを示している。
【０１６２】
（実施例１７）
ラットＧＬＰ毒物学研究
再生マトリックスの移植に関連する全身毒性の可能性を評価するために、ＧＬＰ、ＩＳＯ １０９９３−１１に準拠した前臨床研究を策定し、ＮＡＭＳＡ（Ｎｏｒｔｈｗｏｏｄ、オハイオ州）で行った。この研究では、再生マトリックスを、１４匹のラット（７匹の雄および７匹の雌）の皮下組織に移植した。対照物質（無菌０．９％食塩水）を、１４匹のラット（７匹の雄および７匹の雌）からなる別の群に同様に移植した。ラットを、死亡率および毒性の顕性の兆候について毎日観察した。疾患および異常の臨床的な兆候についての詳細な検査は、毎週行った。移植前および研究を通して１週間毎にラットの体重を求めた。
【０１６３】
第４週において、ラットを安楽死させ、血液学分析および臨床化学分析のために血液検体を採取した（すべての分析は、ＮＡＭＳＡによって行われた）。死体解剖を行い、選択した臓器を切除、秤量および組織学的に処理した。各ラットから、各移植部位の周囲の皮下組織もまた切除し、顕微鏡的に検査した。移植部位および選択した臓器の顕微鏡的評価は、正規の病理学者が行った。体重、臓器重量、臓器重量／体重の比、血液学の値および臨床化学の値を、統計学的に分析した。
【０１６４】
データからは、ラットにおいて、皮下移植後の試験物質（再生マトリックス）からの全身毒性の証拠を得なかった。毎日の臨床的観察、体重、死体解剖知見、ラット臓器重量および臓器重量／体重の比は、許容限界内であり、試験処置群と対照処置群との間でも、それぞれの群の中でも類似した。雄のラットまたは雌のラットのいずれにおいても、生物学的に有意であるまたは試験物質を用いた処置に関連すると考えられる血液学の値および臨床化学の値の変化はなかった。選択した組織の顕微鏡的評価からは、再生マトリックスを用いて処置した群において、全身毒性の証拠を得なかった。組織学的判断基準に基づくと、雄のラットおよび雌のラット中の再生マトリックスは、食塩水である参照の対照材料と比較すると、中等度の刺激物質であると考えられた。この後者の知見は、生体吸収性材料の評価のためのこの試験施設の経験の範囲内であり、異種間の移植（この場合、ヒト全血から誘導した再生マトリックスをラットに移植した）としては低い範囲に属している。結論として、種を越えた再生マトリックスの局所注入は、何らかの顕著な毒性を生じることはなく、再生マトリックスをヒトＳＣＩ患者に移植しても、再生マトリックスが局所的な病態を起こすことはないであろうということが示唆される。
【０１６５】
（実施例１８）
脊髄再生研究からの切片の顕微鏡的評価
１０ｍｍ長の脊髄が外科的に除去されている実験ラットに、再生マトリックスを移植した。１０日後に、脊髄を、組織学的に検査した。顕微鏡的には、脊髄欠陥の中心は、中心の軸索の重度のウォーラー変性および好中球の壊死からなり、これは、１ｃｍ長の脊髄の外科的除去によって生じた中心から約４．５ｍｍの半径（１ｃｍの全幅）で伸長していた。再生マトリックスインプラントの周囲には、反応性のグリア細胞および格子細胞のシートが存在し、これらの中には、ヘモシデリンを有するものもあり、さらに、明らかに原始的な間葉系／網様型の細胞のシートも存在し（図３８Ａおよび３８Ｂを参照）、これは、脊髄欠陥内に広がりつつある（脊髄欠陥を満たしつつある）ように見えた。これらの細胞は、新たな神経組織の発生および脊髄の再生に関与すると思われた。欠陥の周辺には、反応性の線維増殖を伴う軟膜の肥厚が存在した。線維増殖は、これらの明らかに原始的な間葉系／網様型の細胞を支持する枠組みとして、軟膜に沿って広がっているように見え、損傷した脊髄の再生を支持しているよう思われた。
【０１６６】
前述の説明は、本来、説明のためのものであって、本発明、または本発明の応用もしくは使用に関する詳説を制限するためのものではない。当業者であれば、本明細書に記載する本発明の１つ以上の実施形態に、特定の改変をなすことができることが理解されるであろう。しかしながら、そのような改変は、本発明の範囲内である。発明を実行するための別の方法および材料、ならびに追加の応用例が、当業者には明らかであろう。それらは、随伴する請求の範囲内に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
随伴する図面を参照すると共に、以下の詳細な説明を参照することによって、本発明の前述の特長がより容易に理解されるであろう。図中、「ＲＭｘ」は、再生マトリックスを指す。
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、マクロファージのフォン−ヴィレブランド因子陽性内皮様細胞への分化形質転換を示す。２Ａ：ブタにおける移植２週後の脊髄損傷および再生マトリックス移植の部位のマクロファージ（明るい染色）およびフォン−ヴィレブランド因子（＋）（暗い染色）細胞。二重染色が黒色に写っている。２００倍の倍率で示す。２Ｂ：黒い染色＝フォン−ヴィレブランド因子を発現するマクロファージ（明るい染色）。４００倍の倍率で示す。２Ｃ：フォン−ヴィレブランド因子を発現するマクロファージが、血管を形成しつつある。４００倍の倍率で示す。
【図２】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、ラットの脊髄組織に対する再生マトリックスの治療効果を示す。Ａは、再生マトリックス非存在下の健常な血管を有する健康なラットの脊髄を示す。Ｂは、ＣＮＳ組織がほとんど見えず、健常な血管が存在しない損傷したラットの脊髄を示す。Ｃは、再生マトリックスを用いて治療した、損傷したラットの脊髄の光景を示し、ここでは、再生した健常なＣＮＳ組織および血管の横断面が見えている。Ｄは、Ｃの損傷した脊髄組織の別の光景であり、再生したＣＮＳ組織および健常な血管の縦方向切片を示す。
【図３】図３は、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）生成用カセットに含有されている、非凝固血および１．２μｍの最終ろ過を使用して生成した再生マトリックスの写真である。
【図４】図４は、ヒト全血から作製した３週が経過した再生マトリックスのパラフィン切片を示す。再生マトリックスは、未変化の細胞または核の兆しを何ら示さない。ヘマトキシリン染色は、分析したすべての切片において完全に陰性であったが、材料は、エオシンで強く染色した。高い数値の開口レンズ（高解像度）を使用すると、ビーズ様構造を明確に分解することができる。ＲＭｘの大部分をなすビーズ様構造以外に、より緻密な構造からなると思われる平坦なシートの小さな領域を観察することができる。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、凝固血および５μｍの最終ろ過を使用して生成した再生マトリックスの走査型電子顕微鏡写真を示す。Ａ−２００倍、Ｂ−１０００倍、Ｃ−７５００倍、Ｄ−７５００倍。
【図６】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄは、凝固血および１．２μｍの最終ろ過を使用して生成した再生マトリックス（第２１日）の走査型電子顕微鏡写真を示す。Ａ−２００倍、Ｂ−１０００倍、Ｃ−７５００倍、Ｄ−７５００倍。
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄは、非凝固血（ＥＤＴＡを使用）および１．２μｍの最終ろ過を使用して生成した再生マトリックス（第２１日）の走査型電子顕微鏡写真を示す。Ａ−２００倍、Ｂ−１５００倍、Ｃ−５０００倍、Ｄ−１００００倍。
【図８】図８は、非凝固血および１．２μｍの最終ろ過を使用して形成した再生マトリックスの光学顕微鏡写真（１００倍の倍率）を示す。
【図９】図９は、組織試料から調製し、５μｍのフィルターを通した２１日が経過した再生マトリックスの透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を示す。このＴＭＥでは、走査型電子顕微鏡写真（図５〜７）に見られた丸みのある球が、これらの球からなるはるかに大きく、比較的均質な構造または凝集体の一部となっていることが明らかである。核の証拠はない。
【図１０】図１０は、ヒト全血から作製した８週が経過した再生マトリックスの透過型電子顕微鏡観察を示す。再生マトリックスは均質に染色し、各凝集体の外側表面は、３週が経過した再生マトリックス（図９を参照）よりも、突き出ている球がより大きく、幾分か蜂巣状の形状（粒子の最も有効な配置方法）であった。再生マトリックスの多くの新しい凝集体が、再生マトリックス材料の長い糸に沿って形成された。
【図１１】図１１は、ヒト全血から作製した８週が経過した再生マトリックスの透過型電子顕微鏡観察を示す。再生マトリックスは均質に染色し、各凝集体の外側表面は、３週が経過した再生マトリックス（図９を参照）よりも、突き出ている球がより大きく、幾分か蜂巣状の形状（粒子の最も有効な配置方法）であった。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、５つの異なるバッチからの再生マトリックスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。第１５日（Ａ）および第２１日（Ｂ）の再生マトリックス中の全タンパク質を、クーマシーブルーで染色した。主なタンパク質の種は、１〜６の番号を付けで示し、それぞれのデンシトメトリーのグラフに示す。分子量の標準（ＫＤａ）をゲルの左側に示す。
【図１３】図１３は、対照と比較した、α−アマニチン（ＲＮＡＩＩポリメラーゼ阻害剤）、アフィディコリン（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）またはシクロヘキシミド（タンパク質合成阻害剤）の存在下で形成した再生マトリックスおよび第２１日の培養物の上清（５μｍでろ過）中の全ＲＮＡ含有量（μｇ）を示す。
【図１４】図１４は、対照と比較した、α−アマニチン（ＲＮＡＩＩポリメラーゼ阻害剤）、アフィディコリン（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）またはシクロヘキサミド（タンパク質合成阻害剤）の存在下で形成した再生マトリックスおよび第２１日の培養物の上清（５μｍでろ過）中の全タンパク質含有量を示す。
【図１５】図１５は、対照と比較した、α−アマニチン（ＲＮＡＩＩポリメラーゼ阻害剤））の存在下で形成した再生マトリックスおよび第２１日の培養物の上清（１μｍでろ過）中の全タンパク質含有量を示す。
【図１６】図１６は、対照と比較した、α−アマニチン（ＲＮＡＩＩポリメラーゼ阻害剤））の存在下で形成した再生マトリックスおよび第２１日の培養物の上清（１μｍでろ過）中の全脂質含有量を示す。
【図１７】図１７は、ＰＡＧＥ上で、１μｍでろ過したマトリックスから５μｍでろ過したマトリックスまで、マトリックスおよび媒体について、クーマシー染色タンパク質バンドを比較したものを示す。
【図１８】図１８は、神経細胞遺伝子の上方制御について、異なる補助剤を有する処理媒体中で生成した再生マトリックス（およびそれらに使用した上清、それぞれ）の効果を示す。Ａ：ＮＴ−３、Ｂ：ＮＣＡＭ−１、Ｃ：ＧＡＰ−４３。
【図１９】図１９は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞上における再生マトリックスによって生じた遺伝子の上方制御の倍増および熱不活性化再生マトリックスを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、再生マトリックスと共に３時間インキュベートし、次いで、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＧＡＰＤＨ、ＮＴ−３、ＮＴ−６、ＮＣＡＭ−１、ＦＧＦ−９、ＧＤＮＦ、Ｎｅｔｒｉｎ−１およびＧＡＰ−４３の遺伝子発現について分析した。ＰＢＳ中で３回洗浄した再生マトリックスは、未洗浄の再生マトリックスに類似する活性を有した。６０℃で３０分間インキュベートした再生マトリックスは、遺伝子上方制御活性を有さなかった。
【図２０】図２０は、再生マトリックスを用いて処置したＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞による神経突起の伸長を示す。左の図は、基本培地中で増殖したＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞の代表的な領域を示す。右の図は、再生マトリックスを用いて処置した細胞の代表的な領域を示す。細胞の核を青で染色し、チューブリンを緑で染色した。
【図２１】図２１は、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞の神経突起の伸長を、再生マトリックスの存在下と非存在下とで培養して比較した場合を示す。結果を、ＮＧＦ処置細胞の神経突起伸長指数のパーセントとして表す。結果は、四つ組で行った４つの独立した実験の平均である。エラーバーは、平均の標準偏差を示す。再生マトリックス処理細胞の値および再生マトリックス未処理細胞の値は、０．０１未満の差のＰ値を有して異なる（ｔ検定）。
【図２２】図２２は、再生マトリックスをＥＧＦおよびｂＦＧＦの増殖因子補助剤の存在下と非存在下とで生成し、これらの再生マトリックスの存在下で培養したＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞の神経突起の伸長を比較した場合を示す。結果を、ＮＧＦ処置細胞の神経突起伸長指数のパーセントとして表す。結果は、少なくとも六つ組の試料の平均である。エラーバーは、平均の標準偏差を示す。すべての値は、０．０１未満の差のＰ値を有して相互に異なる（ｔ検定）。
【図２３】図２３は、異なる濃度のＮＧＦのＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞の神経突起の伸長に対するＮＧＦ用量応答曲線を示す。
【図２４】図２４は、ＴＲ−１０処理媒体中で生成した再生マトリックスを適用する場合の、ＮＧＦの陽性対照（図２３；１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ）と比較した、神経突起伸長の全長の平均に関する倍増（減弱）を示す。再生マトリックスは、全血または血漿−血小板−バフィーコート画分のいずれかから生成した。
【図２５】図２５は、対照であるラット胎仔脊髄の初代細胞を示し、単一細胞懸濁培養６日後の神経細胞のチューブリン（Ｔｕｊ１）およびグリア（ＧＦＡＰ）を標識している（２コマは、すべての染色された成分を示している）。平均して、４．２％の細胞が、Ｔｕｊ１陽性であり、０．４％の細胞がＧＦＡＰ陽性であった。１００倍の倍率。
【図２６】図２６は、再生マトリックスのラット胎仔脊髄の初代細胞に及ぼす効果を示し、単一細胞懸濁培養６日後の神経細胞のチューブリン（Ｔｕｊ１）およびグリア（ＧＦＡＰ）を標識している（２コマは、すべての染色された成分を示している）。平均して、５５％の細胞が、Ｔｕｊ１陽性であり、９２％の細胞がＧＦＡＰ陽性であった。二重陽性（Ｔｕｊ−１およびＧＦＡＰに陽性）細胞は、三相性の神経前駆細胞を示している。１００倍の倍率。
【図２７】図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄは、５日間培養したヒト線維芽細胞のβ−チューブリン（Ａ）およびＦ−アクチン（Ｂ）についての免疫細胞化学染色に関して、再生マトリックス（ＣおよびＤ）上と対照（ＡおよびＢ）上との比較を示す。対照の培養物で使用した培地は、再生マトリックスを生成するために使用する処理媒体であった。再生マトリックスと接触させて培養したヒト線維芽細胞は、対照の培養物と比較して、コンフルエントなレベルが顕著に低かった（アポトーシスを経ているようでもあった）。
【図２８】図２８は、再生マトリックスの線維芽細胞の接着、線維芽細胞の核領域、およびＢｒｄＵ陽性線維芽細胞パーセントに関して、２日間培養と対照との比較を示す。
【図２９】図２９は、ＳＣＩの完全横切ラットモデル（５ｍｍ）への再生マトリックスの移植が、運動機能の回復を誘導することを示す。ＢＢＢスコアによって測定した歩行運動機能の回復を、損傷および再生マトリックス移植後２週間に１回記録した。個々の動物（再生マトリックス−Ｍおよび対照−Ｃ）についてのＢＢＢスコア。
【図３０】図３０は、再生マトリックス移植を受けた、脊髄損傷の横切ラットモデルにおける嚢腫形成の発生率の減少を示す。再生マトリックス移植ラット（ｎ＝１９）では、ＳＣＩ部位およびその周囲での嚢腫形成の発生率が１５．８％であり、対照ラット（ｎ＝５）では、ＳＣＩ部位の周囲での嚢腫形成の発生率が６０％であった。
【図３１】図３１は、ＳＣＩの片側切断ラットモデル（５ｍｍ）への再生マトリックスの移植が、運動機能の回復を誘導することを示す。ＢＢＢスコアによって測定した歩行運動機能の回復を、損傷および再生マトリックス移植後２週間に１回記録した。再生マトリックスの移植を受けた個々の動物についてのＢＢＢスコア。非移植対照は、最初の評価時点まで生存しなかった。
【図３２Ａ】図３２Ａ：５ｍｍ完全横切を有するラット脊髄への再生マトリックス移植後の機能の回復。図３２Ｂ：挫傷（５０ｍｍ）による損傷２週後のラット脊髄への再生マトリックス移植後の機能の回復。図３２Ｃ：脊髄損傷の治療における再生マトリックスの効力を示す、組合せ（完全横切および挫傷）モデル。対照ラットは、両方の損傷モデルからの空の対照および生物学的不活性化再生マトリックス対照を含む。図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃのそれぞれについて、上の線は、再生マトリックス移植ラットからのデータを示し。下の線は、対照ラットからのデータを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ａ：５ｍｍ完全横切を有するラット脊髄への再生マトリックス移植後の機能の回復。図３２Ｂ：挫傷（５０ｍｍ）による損傷２週後のラット脊髄への再生マトリックス移植後の機能の回復。図３２Ｃ：脊髄損傷の治療における再生マトリックスの効力を示す、組合せ（完全横切および挫傷）モデル。対照ラットは、両方の損傷モデルからの空の対照および生物学的不活性化再生マトリックス対照を含む。図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃのそれぞれについて、上の線は、再生マトリックス移植ラットからのデータを示し。下の線は、対照ラットからのデータを示す。
【図３２Ｃ】図３２Ａ：５ｍｍ完全横切を有するラット脊髄への再生マトリックス移植後の機能の回復。図３２Ｂ：挫傷（５０ｍｍ）による損傷２週後のラット脊髄への再生マトリックス移植後の機能の回復。図３２Ｃ：脊髄損傷の治療における再生マトリックスの効力を示す、組合せ（完全横切および挫傷）モデル。対照ラットは、両方の損傷モデルからの空の対照および生物学的不活性化再生マトリックス対照を含む。図３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃのそれぞれについて、上の線は、再生マトリックス移植ラットからのデータを示し。下の線は、対照ラットからのデータを示す。
【図３３】図３３は、再生マトリックス移植が、衝撃および／または外科的片側切断（５ｍｍの脊髄の除去を含む）によって生じたブタ脊髄損傷において、運動機能の回復を誘導することを示す。ブタ００−６−５および１１３−１は、裂傷および脊髄組織の欠損を生じる重度の衝撃による損傷を受けた。ブタ８０−１は、１４ゲージ針による貫通による損傷を受けた。ブタ５５−１、５３−２、５４−５および５４−２、ならびに全部の対照ブタは、右側の外科的片側切断（５ｍｍ長の右側の脊髄を除去した）を受けた。改変した数値的なＡＳＩＡスコアによって測定した歩行運動機能の回復の結果を、損傷および再生マトリックス移植の後、毎週記録した。
【図３４】図３４は、再生マトリックス移植ブタとホモゲナイズした血餅移植ブタとの７週間にわたる平均体重および平均体重増加の比較を示す。
【図３５】図３５は、右側の片側切断（５ｍｍ長の右側の脊髄を除去した）による脊髄損傷後の再生マトリックス移植ブタとヒト血餅移植ブタとの７週間にわたる右側運動技能の回復の比較を示す。
【図３６】図３６は、ＳＣＩ後の第７週におけるヒト再生マトリックス処置ブタと血餅処置ブタとの歩行運動機能の回復の比較を示す。（内部対照として用いた）未損傷の左側は、両群で同一であったが、損傷した右側は、再生マトリックスを用いた場合の方が、血餅を用いた場合より、より顕著に回復した（ｐ＝０．０３）。
【図３７】図３７は、再生マトリックス移植後第１月のブタにおいて脊髄損傷（および脊髄除去）の部位で新たに形成されつつある神経細胞（褐色）を示す。明るい色＝細胞の核。暗い色＝Ｔｕｊ−１陽性細胞。黒色＝二重染色。倍率は、２００倍である。
【図３８】図３８は、ラット脊髄再生研究からの縦方向切片の顕微鏡的評価を示す。３８Ａ：再生マトリックスに関連する原始的な細胞が、脊髄の欠陥を満たしつつある。１０倍の倍率で撮影。３８Ｂ：再生マトリックスを１０ｍｍの脊髄欠陥中に移植した１０日後における、新たな神経組織の形成部位の原始的な細胞。４０倍の倍率で撮影。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを生成する方法であって、
ａ）単離した組織試料を提供するステップと；
ｂ）組織試料から細胞を除去して無細胞試料を得るステップと；
ｃ）該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを形成するのに十分な第１の期間、該無細胞試料をインキュベーションチャンバー中でインキュベートするステップであって、該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスの少なくとも１つの再生活性が、該第１の期間にわたって変化し、再生活性の該変化が、再生活性の外観、再生活性の発生、再生活性の増加、およびそれらの組合せからなる群から選択されるステップと；
ｄ）該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを単離するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記単離した組織試料が、筋肉組織、結合組織、上皮組織、神経組織、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離した組織試料が、基本組織、表皮組織および維管束組織、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単離した組織試料が、
心血管、消化器、内分泌、排泄、免疫、外被、リンパ、筋肉、神経、生殖、呼吸、骨格、およびそれらの組合せの系からなる群から選択された器官系の組織；
胎盤組織；
臍帯組織；
ならびにそれらの組合せ
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記組織試料が血液を含む、請求項１、２または４に記載の方法。
【請求項６】
前記組織試料が血液画分を含む、請求項１、２、４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記血液画分がバフィーコート層を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記血液画分がバフィーコート／血小板／血漿層を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記組織試料が抗凝血薬を含む、請求項１から２または請求項４から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記血液が１種以上の血餅を含み、かつ該血餅を可溶化するステップをさらに含む、請求項１から２または請求項４から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記除去するステップが、前記組織試料をサイズ選択フィルターに通すことを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記サイズ選択フィルターが約５μＭより大きい粒子を排除する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サイズ選択フィルターが約１．２μＭより大きい粒子を排除する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サイズ選択フィルターが約０．８μＭより大きい粒子を排除する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記インキュベーションチャンバーが、固体または液体に対して透過性である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記インキュベーションチャンバーが、該インキュベーションチャンバー内部の液体の蒸発によって発生した気体に対して透過性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記インキュベーションチャンバーを低湿度環境でインキュベートし、それによって、該インキュベーションチャンバー内部の液体の蒸発速度を増加させる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
処理媒体を前記無細胞試料に添加するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記処理媒体を添加するステップが、前記組織試料の単離の間、前記除去するステップの前、前記インキュベートするステップの前、該インキュベートするステップの間、およびそれらの組合せからなる群から選択された１つ以上の時に添加することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
無細胞試料が、液状の溶液または懸濁液の形態であり、かつ溶質の少なくとも一部が、前記第１の期間にわたって前記インキュベーションチャンバーから蒸発する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記処理媒体を添加するステップの結果、液状の溶液または懸濁液の浸透圧モル濃度が前記第１の期間にわたって増加する、請求項１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記処理媒体が生理的溶液を含む、請求項１８から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の期間が少なくとも５日間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の期間が少なくとも１２日間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記インキュベートするステップが、前記無細胞試料を低酸素環境でインキュベートすることを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記低酸素環境が、約５％未満の酸素を有する環境を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記低酸素環境が、実質的に酸素を欠く環境を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の期間が少なくとも３日間である、請求項２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の期間が少なくとも７日間である、請求項２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
治療用作用物質を提供するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記治療用作用物質が、タンパク質、ペプチド、薬物、サイトカイン、細胞外マトリックス分子、増殖因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療用作用物質を提供するステップが、前記組織試料の単離の間、前記除去するステップの前、前記インキュベートするステップの前、該インキュベートするステップの間、およびそれらの組合せからなる群から選択された１つ以上の時に提供することを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の期間に形成される前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが、三次元のマトリックスの形態となるように、前記無細胞試料の浸透圧モル濃度を制御する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の期間に形成される前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが、懸濁液の形態となるように、前記無細胞試料の浸透圧モル濃度を制御する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを、それが生成された後に、細胞と共に播種するまたは混合するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、幹細胞、前駆細胞、体細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択された細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、胚性幹細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、グリア細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択された細胞である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを、それが生成されている間に、細胞と共に播種するまたは混合するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、幹細胞、前駆細胞、体細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択された細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、胚性幹細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、グリア細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択された細胞である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが、前記第１の期間に活性を示し、該活性が、組織の成長、細胞の成長、遺伝子の上方制御、細胞の阻害、細胞の増殖、細胞の脱分化、細胞の分化、細胞の分化形質転換、神経突起の伸長、遺伝子の上方制御、または１種以上の自然な創傷治癒過程、およびこれらの組合せからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記生成された無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスの１種以上の細胞型に対する効果を測定することによって、該活性を決定する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記生成された無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスの１種以上の細胞型に対する効果を測定することによって、該活性を決定する、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法に従って得た無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項４５】
対象の組織を再生する方法であって、
ａ）組織の損傷、欠損または変性を受けた対象を提供するステップと；
ｂ）組織の損傷、欠損または変性した部位またはその付近において、無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを対象に投与するステップと
を含み、
該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが、組織の損傷、欠損または変性した部位において、組織の再生を開始し、増加させ、支持し、かつ／または導く方法。
【請求項４６】
前記対象がヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が動物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが治療用作用物質を含む、請求項４５、４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記治療用作用物質が、前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス内に不均等に分布する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記治療用作用物質が、前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス内に均等に分布する、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが２種以上の治療用作用物質を含む、請求項４５から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記治療用作用物質が、タンパク質、ペプチド、薬物、サイトカイン、細胞外マトリックス分子、増殖因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４５から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが、前記治療用作用物質の１つ以上の有利な効果の大きさを増加させる、請求項４５から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが、前記治療用作用物質を前記対象中で時間をかけてゆっくり放出することによって、該治療用作用物質の１つ以上の有利な効果を延長させる、請求項４５から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが、前記治療用作用物質の１つ以上の有利な効果を時間の経過に伴う実質的な減少から保護する、請求項４５から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記損傷または変性した組織が、筋肉組織、結合組織、上皮組織、神経組織、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４５から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記神経組織が中枢神経系の組織である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記損傷または変性した組織が、
心血管、消化器、内分泌、排泄、免疫、外被、リンパ、筋肉、神経、生殖、呼吸、骨格、およびそれらの組合せの系からなる群から選択された器官系の組織；
胎盤組織；
臍帯組織；
ならびにそれらの組合せ
からなる群から選択される、請求項４５から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記生体吸収性の組織再生マトリックスが、組織の損傷、欠損または変性した前記部位への神経前駆細胞の動員を刺激する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記生体吸収性の組織再生マトリックスが、神経前駆細胞の増殖を刺激する、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記生体吸収性の組織再生マトリックスが、組織の損傷、欠損または変性した前記部位へのフォン−ヴィレブランド因子陽性細胞の動員を刺激する、請求項５８、５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスの前記損傷または変性した組織の部位またはその付近への投与に応答して、損傷または変性した中枢神経系組織の神経栄養性の活性が増加する、請求項５８から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記増加した神経栄養性の活性が、ＦＧＦ−９、Ｎｅｔｒｉｎ−１、ＮＴ−３、ＮＣＡＭ−１、ＧＡＰ−４３、ニューレグリン、およびそれらの組合せからなる群から選択された神経栄養性遺伝子の発現の増加によって特徴付けられる、請求項５８から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記損傷または変性した組織の部位またはその付近へ細胞を投与することをさらに含む、請求項４５から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞と、前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスとを順次に投与する、請求項４５から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞と、前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスとを同時に投与する、請求項４５から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを、細胞と共に播種するまたは混合する、請求項４５から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを、該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが形成されつつある間に、細胞と共に播種するまたは混合する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスを、該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスが形成された後に、細胞と共に播種するまたは混合する、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞が、幹細胞、前駆細胞、体細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択された細胞である、請求項６４から６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞が、胚性幹細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、グリア細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択された細胞である、請求項６４から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記投与するステップが、注入、外科的移植、カテーテルを介しての送達、およびそれらの組合せからなる群から選択された投与経路を含む、請求項４５から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記生体吸収性の組織再生マトリックスが、細胞を、１つ以上の異なる細胞型を生じることができる細胞に脱分化させる、請求項４５から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記脱分化した細胞がマクロファージである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記脱分化したマクロファージが内皮様の特徴を示す、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記内皮様の特徴が、フォン−ヴィレブランド因子を発現することを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記脱分化したマクロファージが新しい血管を生じる、請求項７４から７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記新しい血管が新たな組織の増殖を支持する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
少なくとも１％のタンパク質含有量を有するタンパク質性の芯を含む、単離した無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスであって；
該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスの構造の特徴は、少なくとも約１００ｎｍの直径を有する球体であり；
さらに、該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスは、実質的な代謝活性を欠き；
さらに、該無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックスは、損傷した組織を有する対象においてより多くの組織の再生を開始すること、損傷した組織を有する対象において組織の再生を増加すること、またはそれらの両方が可能である組織再生マトリックス。
【請求項８０】
トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン前駆体、補体成分３、Ａ〜Ｄ鎖ヘモグロビン、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、メダラシン阻害剤２、炭酸脱水酵素、ＣＡ１タンパク質、またはそれらの組合せからなる群から選択された１種以上のタンパク質をさらに含む、請求項７９に記載の単離した無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８１】
前記球体がＣＤ５６抗体によって認識される、請求項７９または８０に記載の単離した無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８２】
前記球体が約１から２μｍの直径を有する、請求項７９、８０または８１に記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８３】
前記球体が約２から４μｍの直径を有する、請求項７９、８０または８１に記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８４】
治療用作用物質をさらに含む、請求項７９から８３のいずれかに記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８５】
前記治療用作用物質が、前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス内に不均等に分布する、請求項８４に記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８６】
前記治療用作用物質が、前記無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス内に均等に分布する、請求項８４に記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８７】
２種以上の治療用作用物質を含む、請求項８４から８６のいずれかに記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８８】
前記治療用作用物質が、タンパク質、ペプチド、薬物、サイトカイン、細胞外マトリックス分子、増殖因子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８４から８７のいずれかに記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項８９】
前記治療用作用物質の１つ以上の有利な効果の大きさを増加させる、請求項８４から８８のいずれかに記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項９０】
前記治療用作用物質を前記対象中で時間をかけてゆっくり放出することによって、治療用作用物質の１つ以上の有利な効果を延長させる、請求項８４から８９のいずれかに記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項９１】
治療用作用物質の１つ以上の有利な効果を時間の経過に伴う実質的な減少から保護する、請求項８４から９０のいずれかに記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項９２】
細胞をさらに含む、請求項７９から９１のいずれかに記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項９３】
前記細胞が、幹細胞、前駆細胞、体細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９２に記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。
【請求項９４】
前記細胞が、胚性幹細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、グリア細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択された細胞である、請求項９２または９３に記載の無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３２Ｃ】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【公表番号】特表２００９−５１３２６９（Ｐ２００９−５１３２６９Ａ）
【公表日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３７９９８（Ｐ２００８−５３７９９８）
【出願日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２０１６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５０９０２
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０６３０５０１２）
【Ｆターム（参考）】