生体再吸収性微粒子の製造方法、得た微粒子及びその使用
【課題】生体再吸収性微粒子の製造方法、得た微粒子及びその使用の提供。
【解決手段】本発明は、タンパク性物質が結合する非ラメラ生体再吸収性微粒子の調製方法であって、以下の段階：
（ｉ）安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから上記微粒子を調製する段階、並びに、
（ｉｉ）界面活性剤を使用せず、段階（ｉ）で得た微粒子に上記タンパク性物質を結合させる段階：を含む
ことを特徴とする方法に関する。
本発明は、更に、こうして得た微粒子、並びに、診断及び治療におけるその使用にも関する。
【解決手段】本発明は、タンパク性物質が結合する非ラメラ生体再吸収性微粒子の調製方法であって、以下の段階：
（ｉ）安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから上記微粒子を調製する段階、並びに、
（ｉｉ）界面活性剤を使用せず、段階（ｉ）で得た微粒子に上記タンパク性物質を結合させる段階：を含む
ことを特徴とする方法に関する。
本発明は、更に、こうして得た微粒子、並びに、診断及び治療におけるその使用にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に予防接種の分野で有用な、タンパク性物質が結合する新規生体再吸収性粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質及びペプチド等のタンパク性物質は抗原とも呼ばれ、ウイルス由来疾患等の多くの疾患の治療に、概してワクチンとして広く使用される。
【０００３】
抗原の活性及び強度の増強、並びに、抗原含有医薬組成物の安定性改善のため、これら組成物はアジュバントを含有する。この点で、ワクチン調製物は細胞性応答及び液性応答を増強するための免疫性アジュバントを含むことが多い。
【０００４】
従来のワクチンは、上記アジュバントを含有する場合でも標的病原体に対する非方向性保護を有するという欠点を有する場合が多い。用語「方向性保護」は、免疫系の細胞性応答及び液性応答の両方を含む保護の意味を意図する。
【０００５】
好適な免疫応答の取得には、抗原が担体に吸着又は担体中に捕獲した状態で結合する粒子状担体を使用する。この担体は免疫系への提示対象である抗原のコピーを複数有し、局所リンパ節において抗原の捕獲及び保持を促進する。この粒子は抗原提示細胞により貪食され得、免疫系への抗原提示の増強が可能である。この担体の例としては、ポリ（メタクリル酸メチル）ポリマー、並びに、ポリ（Ｄ−又は、Ｌ−乳酸）（それぞれＤ−ＰＬＡ又はＬ−ＰＬＡとして知られる）等のポリラクチドから、及び、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧとして知られる）からなる微粒子が含まれる。
【０００６】
抗原を捕獲するＰＬＧに基づく微粒子は免疫応答を付与可能である。例えば、Ｍｏｏｒｅらは、マイクロカプセル化したＨＩＶウイルスｇｐ１２０抗原がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞性応答を誘導することを示している（非特許文献１）。同様に、Ｖｏｒｄｅｍｅｉｅｒらは、ＰＬＧ捕獲結核菌抗原が、この抗原で免疫したマウスにおいて液性応答及びＴ細胞性応答の両方を誘導することを示した（非特許文献２）。
【０００７】
この種のアジュバントは他の高毒性の系よりも利点をいくつか有するが、微粒子の製造時に、抗原を変性させてその免疫原性を破壊しかねない溶媒等の腐食性化学物質を使用し、かつ、上記生産が困難であるという欠点を有する。また、カプセル化等の捕獲過程に要する激しい撹拌によって抗原が分解する可能性もある。
【０００８】
従って、抗原が表面に吸着又はグラフトした微粒子の使用が提案される（非特許文献３）。しかしＥｌｄｒｉｇｅら（非特許文献４）等による、好適なアジュバント効果の達成には微粒子による抗原捕獲が必要であると示す文献がいくつかある。
【０００９】
特許文献１は、抗原が吸着可能な生分解性ポリマーからなる粒子を記載する。この粒子は上記抗原の輸送に有用である。この粒子は、結晶性又は部分的結晶性のポリマーの使用によりラメラ特性を有するために大きさの制御が不可能であるという欠点を有する。実際、予防接種用の粒子はサブミクロンサイズでなければトランスフェクション及び免疫に有効ではない。
【００１０】
特許文献２及び３中には、抗原を吸着するポリラクチド又はＰＬＧに基づく微粒子、及び、その使用による免疫応答刺激について記載する。これら特許出願中の抗原吸着微粒子は全て、微粒子のコロイド安定性を維持する界面活性剤及びポリ（ビニルアルコール）等の安定化剤をポリマー粒子調製時に使用して得たものである。これにより得た微粒子には、微粒子中の界面活性剤及び安定化剤により毒性を有するという欠点がある。
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９７／０２８１０
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ９８／３３４８７
【特許文献３】国際特許出願ＷＯ００／０６１２３
【非特許文献１】Ｍｏｏｒｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１７４１−１７４９（１９９５）
【非特許文献２】Ｖｏｒｄｅｍｅｉｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３−１５７６−１５８２（１９９５）
【非特許文献３】Ｒｏｃｋ Ｋ．Ｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＭＨＣ Ｉ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ａｇ，ＰＮＡＳ（１９９３）
【非特許文献４】Ｅｌｄｒｉｇｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：２９７８−２９８６（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本出願人は予想外にも、免疫応答の捕獲が要求される抗原性タンパク性物質が結合し、かつ、上記欠点を克服した、すなわち、ポリマー微粒子調製時に安定化剤及び界面活性化剤を使用せず、かつ、微粒子表面への抗原結合のための界面活性化剤を使用せずにコロイド安定性を損なうことなく調製するために毒性のない、上限ミクロンサイズの球状非ラメラ生体再吸収性微粒子を取得可能であることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明の第一の主題は、
タンパク性物質が結合する生体再吸収性微粒子の調製方法であって、以下の段階：
（ｉ）安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから上記微粒子を調製する段階、並びに、
（ｉｉ）界面活性剤を使用せず、段階（ｉ）で得た微粒子に上記タンパク性物質を結合させる段階：を含む
ことを特徴とする方法である。
【００１３】
本発明の方法により得た微粒子は安定化剤及び界面活性剤を使用しない点で新規である。
【００１４】
従って本発明の別の主題は、本発明の方法により取得可能な、タンパク性物質が結合する生体再吸収性微粒子である。
【００１５】
例外なく、本発明の粒子はコロイド安定性を保持する。
【００１６】
本発明の微粒子は細胞性応答及び液性応答の両方の刺激に有用であるため、治療及び診断の両方に有用である。
【００１７】
従って本発明の別の主題は、医療品調製用の、本発明の微粒子の使用、及び、本発明の微粒子を含む医薬組成物、特にワクチンである。
【００１８】
最後に本発明の別の主題は、上記微粒子に結合するタンパク性物質に関連する病状のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用の、本発明の微粒子の使用である。
【００１９】
予防接種用の微粒子はこれを摂取する生物に対して毒性を有してはならず、また同時に、そのコロイド安定性を保持する必要がある。
【００２０】
界面活性剤又は安定化剤を使用しない本発明の方法により例外なく上記粒子を取得可能である。
【００２１】
用語「微粒子」は、抗原提示細胞中に進入可能な上限ミクロンサイズ、好ましくは上限サブミクロンサイズの粒子の意味を意図する。
【００２２】
用語「上限ミクロンサイズ」は９９９μｍ以下、用語「上限サブミクロンサイズ」は９９９ｎｍ以下の大きさの意味を意図する。
【００２３】
微粒子の粒径は３μｍ以下であることが好ましい。本発明の粒子はサブミクロンサイズであることがより好ましく、好ましくは直径１５０〜９００ｎｍ、より好ましくは直径２５０〜７００ｎｍである。
【００２４】
例えば走査型電子顕微鏡、準弾性光散乱又は透過型電子顕微鏡等の当業者に公知の技術により上記粒子の大きさを容易に測定する。
【００２５】
用語「毒性微粒子」は、上記微粒子を摂取した生物において代謝障害等の生物学的障害を誘導可能な少なくとも一種の化合物を含む微粒子の意味を意図する。
【００２６】
本発明の方法の第一段階は、安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから上記微粒子を調製することを含む。
【００２７】
用語「生体再吸収性ポリマー」は、これを導入した生物において天然の経路により排出可能な化合物に分解可能なポリマーの意味を意図する。このポリマーは非晶質、わずかに結晶性又は結晶性であってよい。
【００２８】
この生体再吸収性ポリマーの例としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル及びポリ無水物が含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、本発明の方法で使用する生体再吸収性ポリマーはポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＡと呼ばれる）、ポリ（グリコール酸）（ＰＬＧ）等のポリ（α−ヒドロキシ酸）、又は、ポリ（Ｄ−及びＬ−乳酸）の混合物、ポリ（Ｌ−乳酸）及びポリ（グリコール酸）の混合物、ポリ（Ｄ−乳酸）及びポリ（グリコール酸）の混合物若しくはポリ（Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸）及びポリ（グリコール酸）の混合物等のポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物であり、これらは本発明の一実施形態である。
【００２９】
本発明の方法で使用するポリマーがポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物である場合、各成分の割合は当業者が容易に決定可能である。従って例えばポリ（Ｄ−及びＬ−乳酸）のラセミ混合物又はＰＬＡ／ＰＬＧ混合物を当業者に公知の種々の割合で使用可能である。
【００３０】
少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーからの本発明の微粒子の調製は、安定化剤及び界面活性剤を使用しない、当業者に公知の任意の微粒子調製法でも実施可能である。実際、本発明の方法の段階（ｉ）はこれらの剤を使用しないことを特徴とする。
【００３１】
微粒子調製法で通常使用する安定化剤には、例えばポリ（ビニルアルコール）、プルロニック（ポリ（エチレンオキサイド）及びポリ（プロピレンオキサイド）のコポリマー）、及び、臭化セチルトリメチルアンモニウム又はドデシル硫酸ナトリウム等のカチオン性又はアニオン性界面活性剤が含まれる。
【００３２】
言うまでもなく、先行技術の方法において安定化剤として界面活性剤を使用する場合には更なる界面活性剤を使用しない。
【００３３】
先行技術の方法で通常使用する界面活性剤は広く当業者に公知であり、例えば国際特許出願ＷＯ９８／３３４８７中に記載される。
【００３４】
安定化剤及び界面活性剤を使用しない微粒子調製法の例としては、透析、溶媒置換、乳化−溶媒蒸発及び乳化−拡散を挙げることができ、これらの方法は広く当業者に公知である。
【００３５】
例えば、本発明の微粒子調製時の透析は、生体再吸収性ポリマーをアセトン、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ等の水混和性溶媒中に濃度０．１質量％〜１０質量％で溶解した溶液を使用し、千倍容量の水に対して１２時間かけて実施可能である。
【００３６】
本発明の方法の第二段階は、界面活性剤を使用せず、本方法の第一段階で得た微粒子にタンパク性物質を結合させることである。
【００３７】
タンパク性物質を微粒子表面に結合させるこの段階は界面活性剤を使用せずに実施することが特徴である。実際、予想外にも、界面活性剤が存在しない場合でも本発明の微粒子はコロイド安定性を示し、粒子の大きさを免疫に好適な範囲内とする。
【００３８】
微粒子表面にタンパク性物質を結合させるのに通常使用する界面活性剤の例としては、上記界面活性剤を挙げることができる。
【００３９】
本発明の方法の段階（ｉ）で得た微粒子の表面に結合するタンパク性物質は、免疫応答の捕獲が望まれる任意のタンパク性物質であってよい。
【００４０】
用語「免疫応答」は、細胞性応答、液性応答又はその両方の意味を意図する。
【００４１】
用語「細胞性応答」は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球が媒介する応答の意味を意図する。この応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球による細胞溶解活性の誘導により、及び／又は、サプレッサーＣＤ８＋Ｔリンパ球による、若しくは、ヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生により反映される。
【００４２】
用語「液性応答」は、Ｂリンパ球が分泌する抗体分子が媒介する応答の意味を意図する。
【００４３】
本発明の目的に好適なタンパク性物質は、ウイルス又は細菌等多種に由来するものであってよい。
【００４４】
このタンパク性物質の例としては例えば、抗原及びエピトープ、又は、微粒子への結合後に抗原の役割を有する任意のタンパク性物質を挙げることができる。
【００４５】
抗原は、免疫応答により合成が誘導される抗体により認識可能な分子であり、かつ、少なくとも一種のエピトープを含む。抗原は、タンパク質そのもの、又は、目的の構造が保存されたタンパク質断片であってよい。
【００４６】
エピトープはアミノ酸を３〜１５個、概して５〜１５個含むペプチドであり、上記と同様に目的の構造が保存されている。
【００４７】
本発明の特定の実施形態によれば、タンパク性物質はウイルス由来の抗原である。
【００４８】
タンパク性物質がウイルス由来である場合、好適なウイルスは、免疫応答可能な物質が知られる任意のウイルスである。
【００４９】
その例としては、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型感染ウイルス（ＨＣＶ）等の肝炎ウイルス、パピローマウイルス（ＨＰＶ）、並びに、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５０】
本発明の目的に好適なウイルスの核酸配列、及び、この配列がコードするタンパク質は当業者に公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースで入手可能である。
【００５１】
従って、例えばＨＩＶウイルスはウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を有する。ｇａｇ遺伝子は、ｐ２４抗原を含むビリオンの核を形成するタンパク質をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写（逆転写酵素）、切断（プロテアーゼ）及び組み込み（インテグラーゼ）を担う酵素をコードする。ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、ウイルス遺伝子の発現調節に関与するタンパク質（調節タンパク質）をコードする六つの他の遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ及びｖｐｕ（ＨＩＶ−１）又はｖｐｘ（ＨＩＶ−２））を含む。ＨＩＶゲノムはウイルス遺伝子の発現に関与する調節因子を含有する５’及び３’ＬＴＲ（ロングターミナルリピート）も含む。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、本発明の方法で使用するタンパク性物質はＨＩＶウイルス抗原である。ＨＩＶウイルス抗原は調節タンパク質又はｐ２４タンパク質であることが好ましく、好ましい調節タンパク質はＴａｔ、Ｒｅｖ又はＮｅｆタンパク質である。
【００５３】
ＨＣＶについて、そのゲノムの５’末端は、構造タンパク質、ヌクレオキャプシドコアタンパク質、２つのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、並びに、ｐ７と呼ばれる低分子タンパク質をコードする遺伝子に隣接する非翻訳領域に対応する。５’非翻訳領域及びコア遺伝子は種々の遺伝子型で比較的よく保存されている。Ｅ１及びＥ２エンベロープタンパク質は、各単離体により異なる領域によりコードされる。ｐ７タンパク質は非常に疎水性の高いタンパク質であり、イオンチャネルを構成すると考えられる。ＨＣＶゲノムの３’末端は、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）をコードする遺伝子、及び、よく保存されたドメインを有する３’非コード領域を含む（Ｍａｊｏｒ ＭＥ，Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ ＳＭ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ １９９７，２５（６）：１５２７−１５３８）。
【００５４】
ＨＣＶのＮＳ３非構造タンパク質は次の二つの異なる構造ドメインを含むアミノ酸６３０個のタンパク質である：ウイルスタンパク質の成熟に関与する活発なセリンプロテアーゼ活性を有するアミノ酸８１個のＮ末端ドメイン（ＮＳ３プロテアーゼと呼ばれるドメイン）、及び、ウイルスゲノムの複製時に機能するＮＴＰａｓｅ活性に関与するヘリカーゼ活性を含むアミノ酸５４９個のＣ末端ドメイン（ＮＳ３ヘリカーゼと呼ばれるドメイン）。このＮＳ３タンパク質は種々のウイルス遺伝子型で比較的よく保存され、目的の「ワクチン候補」抗原を構成する。
【００５５】
本発明の一実施形態において、目的のタンパク性物質はＨＣＶの抗原タンパク質、好ましくは非構造タンパク質、より好ましくはＮＳ３タンパク質、特に好ましくはＮＳ３ヘリカーゼタンパク質である。
【００５６】
本発明の目的に好適なタンパク性物質は以下の段階：
−目的のタンパク性物質をコードするヌクレオチド配列で形質転換した微生物又は真核生物細胞を培養する段階、並びに、
―上記微生物又は真核生物細胞が産生した上記タンパク性物質を回収する段階：を含む遺伝子工学技術により取得可能である。
【００５７】
上記技術は当業者に公知である。詳細は次のマニュアルを参照可能である：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉ，Ｅｄｉｔｏｒｓ Ａｌｅｓ Ｐｒｏｋｏｐ，Ｒａｓｋｅｓｈ Ｋ Ｂａｊｐａｉ；Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｅｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６４６，１９９１。
【００５８】
目的のタンパク性物質が小さい場合には、当業者に公知の従来のペプチド合成によっても調製可能である。
【００５９】
タンパク性物質の生体再吸収性微粒子への結合は当業者に公知の任意の方法で実施可能である。
【００６０】
上記結合の例としては、吸着、共有結合、及び、キトサン等の微粒子表面に付着した多糖ポリマーを介する結合が含まれる（この場合、タンパク性物質は吸着によりキトサンに結合する）。
【００６１】
吸着は例えば、微粒子をタンパク性物質と混合し、（例えば常温又は３７℃で）撹拌しながらインキュベートすることにより実施可能である。
【００６２】
タンパク性物質の微粒子表面への共有結合は、例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９６、及び、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９１に記載のもの等、文献中で公知の技術及び試薬の使用により実施可能である。
【００６３】
特定の一実施形態において、タンパク性物質の微粒子への結合は吸着により実施される。
【００６４】
本発明の方法で調製した、タンパク性物質が結合する生体再吸収性微粒子は、安定化剤及び界面活性剤を含まないため新規であり、本発明の別の主題を構成する。
【００６５】
本発明の微粒子は、タンパク性物質により免疫応答を誘導可能であり、かつ、毒性がないため、微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状の治療に有用な医薬組成物、特にワクチンの調製に特に好適である。
【００６６】
従って、本発明の別の主題は、医薬品を調製するための本発明の生体再吸収性微粒子の使用である。
【００６７】
特に、本発明の微粒子の使用により調製した医薬品は、例えばＨＩＶ若しくはＨＣＶウイルス又は他の任意の公知のウイルス等のウイルスにより生じる感染の阻害、予防又は治療に特に有用であり、本発明の別の実施形態を構成する。
【００６８】
また本発明は、本発明の少なくとも一種の微粒子、及び、適切な場合には医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物、特にワクチンにも関する。
【００６９】
本発明の医薬組成物は経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所的、部分的、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼内又は耳介内投与に好適であり、上記有効成分は単位投与形態で投与可能である。
【００７０】
単位投与形態は、例えば錠剤、ゼラチンカプセル、顆粒、粉末、注射用経口溶液若しくは懸濁液、経皮パッチ、舌下、頬内、気管内、眼内、鼻腔内若しくは耳介内投与形態、吸入投与形態、局所的、経皮、皮下、筋肉内若しくは静脈内投与形態、直腸投与形態、又は、インプラントであってよい。局所投与としてはクリーム、ゲル、軟膏、ローション又は眼用ローションが考えられる。
【００７１】
これらの医薬形態を当該分野における通常の方法により調製する。
【００７２】
言うまでもなく、当業者であれば、医薬組成物の成分及び単位投与形態に応じて好適な賦形剤及び微粒子の使用量を容易に決定可能である。
【００７３】
上記投与形態は、医薬形態より有効成分を一日０．００１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ投与可能な投与量を含有する。
【００７４】
高投与量又は低投与量が好適であるような特定の場合もあってよく、このような投与量は本発明の範囲を逸脱しない。通常の手法により、個々の患者にとって好適な投与量を医師は投与方法並びに患者の体重及び応答に応じて決定する。
【００７５】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物の患者への投与を特徴とする、本発明の微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状の治療方法にも関する。
【００７６】
本発明の微粒子により抗体の取得も可能であり、これは本発明の別の主題を構成する。
【００７７】
本発明による抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７８】
上記ポリクローナル抗体の取得は、少なくとも一種の本発明の微粒子で動物を免疫し、続いて、上記動物の血清を採取して、（特に、所望の抗体（特に本発明の微粒子の抗体）によって特異的に認識される抗原を付着させたカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより）他の血清成分から上記抗体を分離し、上記抗体を精製した状態で回収することによって実施可能である。
【００７９】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術により取得可能であり、その一般的な原理を以下に挙げる。
【００８０】
まず動物を、一般的にはマウス（又は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫の場合は培養細胞）を、本発明の少なくとも一種の微粒子で免疫する。これにより、Ｂリンパ球が上記微粒子のタンパク性物質に対する抗体を産生可能である。次に、この抗体産生リンパ球を「不死」骨髄腫細胞（例示におけるネズミ細胞）と融合し、ハイブリドーマを作成する。得た異種細胞混合物から、特異的抗体を産生可能、かつ、無限に増殖可能な細胞を選択する。ハイブリドーマをそれぞれクローンとして複製し、それぞれによりモノクローナル抗体を作成し、本発明の微粒子に対する認識特性を（例えば、ＥＬＩＳＡにより、一次元若しくは二次元イムノブロッティングにより、免疫蛍光法により、又は、バイオセンサーの使用により）試験可能である。その後、選択したモノクローナル抗体を、特に上述のアフィニティークロマトグラフィー法により精製する。
【００８１】
本発明の微粒子及び抗体は、上記微粒子表面に結合したタンパク性物質に関与する病状の診断にも有用である。
【００８２】
具体的には、検体の捕獲又は検出用のパートナーを使用するＥＬＩＳＡ方法等の任意の診断技術において、検体の捕獲又は検出用のパートナーとして本発明の微粒子又は抗体を使用可能である。例えば、検体として抗原の探索を意図する場合にはこの抗原が結合した微粒子から得た本発明の抗体を使用し、また、抗体の探索を意図する場合には本発明の微粒子を使用する。後者において、診断試験に固体支持体の使用を必要とする場合には、微粒子は上記のように機能してもよいししなくてもよい。
【００８３】
従って、本発明の別の主題は本発明の生体再吸収性微粒子又は抗体からなる診断用組成物である。
【００８４】
また本発明の別の主題は、生体再吸収性微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用の上記診断用組成物の使用にも関し、一実施形態において、病状はＨＩＶウイルス又はＨＣＶウイルス等により生じるウイルス感染であってよい。
【００８５】
繰り返すが、当業者であれば、使用する診断技術に応じて使用する微粒子又は抗体の量を容易に決定可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
本発明は、以下の例示及び付随の図１〜９によってより詳細に理解されるであろう。ただし、本発明はこれらの例示には制限されない。
【００８７】
図１は、コントロールとしてのＨＣＶ ＮＳ３ＮＳ４ポリタンパク質に対応するＤＮＡ配列（図１Ａ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質及びフロイントアジュバント（図１Ｂ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質（図１Ｃ）で、タンパク性物質を使用せずＰＬＡ微粒子（図１Ｄ）で、及び、ポリマーがＰＬＡかつタンパク質基質がＮＳ３ヘリカーゼペプチドである本発明の微粒子（図１Ｅ）でマウスを免疫することによるＣＴＬアッセイの結果を示す。
【００８８】
図２は、免疫前血清、及び、本発明の粒子ＰＬＡ−ｐ２４を皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）注射したウサギ６匹（Ｌ１〜Ｌ６）の免疫血清中の抗ｐ２４ ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡアッセイで調べたヒストグラムを表す。
【００８９】
図３は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより得たヒストグラム（四回の実験の平均＋／−標準偏差）を表し、これは、抗原を使用しない刺激後における（培地、ネガティブコントロール、黒色のヒストグラム）、ｐ２４による刺激後における（灰色のヒストグラム）、又は、ＰＭＡイオノマイシンカップルによる刺激後における（外枠ヒストグラム）、免疫後日数に対する細胞１００万個当たりのスポット数を示す。
【００９０】
図４は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴにより得たヒストグラムを表し、これは、ｐ２４タンパク質（黒色のヒストグラム）又はペプチド（灰色のヒストグラム）のいずれかによる刺激後の、総ＰＢＭＣ画分中の、抗ＣＤ４抗体存在下の総ＰＢＭＣ画分中の、ＣＤ４＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ４− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ４＋豊富画分（ＣＤ４＋ ＰＢＭＣ）中の、並びに、ＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ８− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ８＋豊富画分（ＣＤ８＋ ＰＢＭＣ）中のスポット数を示す。
【００９１】
図５は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したサルＭ２においてＥＬＩＳＡにより得た、連続して血清を採取した日に対する抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示すヒストグラムを表す。
【００９２】
図６は、ＳＲＤＣ細胞で免疫し、かつ、ネガティブコントロール（Ｃｔ１及びＣｔ２）で、又は、ｐ２４タンパク質（ｐ２４−１及びｐ２４−２）で、又は、ネガティブコントロール微粒子（ＮａｎｏＯｖａｌ及びＮａｎｏＯｖａ２）で、又は、本発明の微粒子（Ｎａｎｏｐ２４−１及びＮａｎｏｐ２４−２）で感作したマウスの免疫前血清中において、一回目の免疫後の血清中において、二回目の免疫後の血清中において、及び、三回目の免疫後の血清中においてＥＬＩＳＡにより得たＯＤ値を示すヒストグラムを表す。
【００９３】
図７は、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【００９４】
図８は、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を、局所細胞性応答について膝窩節細胞において（図８Ａ）及び全身細胞性応答について脾臓細胞において（図８Ｂ）示すグラフを表す。
【００９５】
図９は、マウスで使用した免疫原（すなわちＮＳ３ｈ−ＰＢＳ）の量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する細胞増殖指数（ＲＰＩ）を、刺激をしない脾臓細胞において（０）、ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後において（１）、又は、タンパク質及び抗ＣＤ４＋抗体による刺激後において（１＋ａＣＤ４）示すヒストグラムを表す。
【実施例１】
【００９６】
透析による本発明の微粒子の調製
１．ＰＬＡ粒子の調製
モル質量５２０００ＤａのＰＬＡ５０（ポリ（Ｌ−乳酸）５０％及びポリ（Ｄ−乳酸）５０％）（Ｐｈｕｓｉｓ（登録商標））を使用した。
【００９７】
このＰＬＡをＤＭＳＯ（Ｐｒｏｌａｂｏ（登録商標））中に溶解し、ＰＬＡが溶液総重量の２％となるようにした。その後、ＰＬＡの有機溶液を孔の大きさが１５０００Ｄａである透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標））中に導入し、二回蒸留した水（４Ｌ，ＭｉｌｌｉＱ（登録商標））の水浴中にこの組み合わせを６時間入れ、その間水浴を撹拌して１時間毎に規則的に取り替えた。最後の透析浴を一晩継続して、粒子を沈殿として得た。
【００９８】
翌日、ＰＬＡ粒子の溶液を回収して４℃で保存した。
【００９９】
得た粒子の大きさ、多分散指数及び電荷をＺｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ ＨＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により調べた。また、秤量後に計算「（乾燥抽出物の質量／湿潤抽出物の質量）×１００」により固形物含有量を調べた。
【０１００】
２．粒子ＰＬＡ／ｐ２４の調製
ＨＩＶ−１ ｐ２４タンパク質を大腸菌において組換え体として調製し、Ｃｈｅｙｎｅｔ Ｖ．，ら（１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，４：３６７−３７２）の方法により金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０１０１】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径５１５．７＋／−６．７ｎｍ、固形物含有量１．１％及び多分散指数０．２４２＋／−０．０１３である。
【０１０２】
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ４．７、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｍ＝１５．６０ｇ／Ｌ）１０ｍＬ及び０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９．２、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｍ＝１７．７９ｇ／Ｌ）１．１ｍＬを混合し、水で１／１０に希釈することにより、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．７）を調製した。
【０１０３】
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．７）中に０．６ｇ／Ｌに希釈したｐ２４タンパク質２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温にてホイール（ｗｈｅｅｌ）上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着ｐ２４量をアッセイし（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したｐ２４の濃度が０．２ｇ／Ｌであると推定した。
【０１０４】
３．ＰＬＡ／Ｔａｔ微粒子の調製
Ｐｅｌｏｐｏｎｅｓｅ Ｊ．Ｐ．，ら（１９９９，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（１７）：１１４７３−１１４７８）記載の方法により合成した配列番号１のＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質を使用した。
【０１０５】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径４２０．１＋／−１０．７ｎｍ、固形物含有量１．０２％、及び、多分散指数０．２４１＋／−０．０４０である。
【０１０６】
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９．２）１３．８ｍＬを使用した以外は上記項目２中と同様に調製した、脱気した１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）中に０．４ｇ／Ｌに希釈したＴａｔタンパク質２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温にてホイール上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着Ｔａｔを定量し（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したＴａｔの濃度が０．１ｇ／Ｌであると推定した。
【０１０７】
４．ＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子の調製
以下のように組換え体で得た配列番号２のＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼペプチドを使用した。
【０１０８】
ヘキサヒスチジンと融合したＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメインに対応する１１９２〜１４５８番目のアミノ酸をコードする遺伝子を原核生物発現ベクターｐＭＨ８０中にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９菌（プロメガ社）中で発現させた。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（プロメガ社））１ｍＭで３時間誘導後、３０℃で組換えタンパク質を発現させた。遠心後、バッファー溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、抗プロテアーゼ錠（ベーリンガー社）１錠、２５０Ｕベンゾナーゼ（メルク社））中での超音波処理により菌を溶解した。溶解及び遠心後、可溶性画分をＮｉアガロースカラムで精製し、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び３００ｍＭイミダゾールを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ７．２）中で溶出した。その後、純粋なタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析した。精製後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下のアクリルアミドゲル電気泳動及び質量分析によりタンパク質を調べた。ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼドメインの純度は９５％を超えると推測される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＬＡＬ及び機能アッセイによるエンドトキシン（ＬＰＳ）の定量によって、エンドトキシンが存在しないことを確認した。
【０１０９】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径約６００ｎｍ、固形物含有量１％、及び、多分散指数０．２である。
【０１１０】
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９．２）６．８ｍＬを使用した以外は上記項目２中と同様に調製した、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中に０．３２７ｇ／Ｌに希釈したＮＳ３ヘリカーゼペプチド２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温にてホイール上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着ＮＳ３ヘリカーゼを定量し（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したＮＳ３ヘリカーゼの濃度が０．２８ｇ／Ｌであると推定した。
【実施例２】
【０１１１】
溶媒置換による本発明の微粒子の調製
１．ＰＬＡ粒子の調製
モル質量５２０００ＤａのＰＬＡ５０（ポリ（Ｌ−乳酸）５０％及びポリ（Ｄ−乳酸）５０％）（Ｐｈｕｓｉｓ（登録商標））を使用した。
【０１１２】
このＰＬＡをアセトン中に溶解し、ＰＬＡが溶液総重量の２％となるようにした。その後ＰＬＡのアセトン溶液を水３５ｍＬ中に滴下し、減圧下で３５分間かけて溶媒を蒸発させた。
【０１１３】
得た粒子の大きさ、多分散指数及び電荷をＺｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ ＨＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により調べた。また、秤量後に計算「（乾燥抽出物の質量／湿潤抽出物の質量）×１００」により固形物含有量を調べた。
【０１１４】
２．ＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子の調製
上記実施例１項目４中に示すように組換え体で得た配列番号２のＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼペプチドを使用した。
【０１１５】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径約２５０ｎｍ、固形物含有量１％及び多分散指数０．３である。
【０１１６】
０．１Ｍ ＰＢＳバッファー（ｐＨ９．２）６．８ｍＬを使用した以外は上記項目１中と同様に調製した、ＰＢＳバッファー（リン酸緩衝化生理食塩水バッファー；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．１）中に０．３２７ｇ／Ｌに希釈したＮＳ３ヘリカーゼペプチド２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温においてホイール上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着ＮＳ３ヘリカーゼを定量し（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したＮＳ３ヘリカーゼの濃度を０．３４ｇ／Ｌと推定した。
【実施例３】
【０１１７】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるマウスの免疫
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１１８】
２．投与した免疫原
本実験においては、ｐ２４タンパク質単独、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４、及び、油中水型エマルションの形態で調製したｐ２４−フロイントアジュバント（シグマ社）組成物（ポジティブコントロール）（免疫能力が良好であることが知られる）を使用した。
【０１１９】
３．免疫
上記項目２に記載の免疫原を連続して三回（各４０μｇ又は１０μｇ）、０、２及び４週目にマウスに摂取させた。注射は全て皮下で実施した。
【０１２０】
三回目に注射して１０日後（Ｄ３８）、１４日後（Ｄ４２）又は４２日後（Ｄ７０）後に動物を屠殺し、血液及び脾臓を採取して免疫学的分析に供した。
【０１２１】
４．免疫学的分析
液性応答及び細胞性応答を以下のように調べた：
−液性応答：屠殺前にマウスの血液試料を採取した。ＥＬＡＳＡにより抗ｐ２４抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ）が存在することを決定した。ｐ２４タンパク質により捕獲し、抗マウスポリクローナル抗体を検出抗体として使用して血清中に特異的抗体が存在することを明らかとした（この抗体は、所望の抗体に結合し、各々、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１ヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号１０７０−０５、アメリカ合衆国アラバマ州バーミンガム）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号１０８０−０５）、及び、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５−０３５−０６２）である）。力価は希釈度の逆数であり、この値について、使用したＥＬＩＳＡプロトコルで０．３ＯＤ単位の吸光度を得る。ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１イソタイプの比率についてもＥＬＩＳＡにより間接的に決定し、免疫応答のＩＦＮ−γ−ＩＬ−４の傾向（各々Ｔｈ１−Ｔｈ２）の判断を可能とした。
−細胞性応答：マウス屠殺後に脾臓を無菌的に摘出して、細胞懸濁液を調製した。得た細胞懸濁液について、マウスそれぞれ個々について以下の分析を実施した。
【０１２２】
（ｉ）ＣＴＬアッセイ：免疫優性Ｈ−２Ｋｄ制限ＣＴＬエピトープに対応する９量体ペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ，配列番号３）、及び、ＩＬ−２を含む培地中に細胞懸濁液を入れた。５日後、ペプチドを負荷した無処理照射細胞でエフェクター群を再刺激した。７日後に細胞傷害性エフェクター群を回収し、５１Ｃｒ標識Ｐ８１５細胞を標的としてＣＴＬ活性を測定した。
【０１２３】
（ｉｉ）ＥＬＩＳＰＯＴ：ＥＬＩＳＰＯＴにより、特異的刺激に応答して所定のサイトカインを分泌する細胞数の決定が可能である。本出願人らは、サイトカインＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）に着目した。脾臓から採取した細胞懸濁液をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩで２０時間再刺激し、ＣＤ８型の応答を調べた。
【０１２４】
ＰＶＤＦ膜（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＩＰ，ミリポア社）を備えた９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗ＩＦＮ−γ抗体で被覆した。再刺激中、脾臓細胞懸濁液をこのプレート中でインキュベートして、各細胞が分泌したサイトカインを捕獲した。目的のサイトカインを分泌する各細胞に相当するスポットを、目的のサイトカインに対して特異的なビオチニル化検出抗体で可視化した。
【０１２５】
（ｉｉｉ）増殖：ｐ２４タンパク質の存在下で脾臓細胞を５日間刺激した。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、免疫原（ｐ２４）に対する細胞性応答が増大する。
【０１２６】
５．結果
マウス１５匹（ブランチ当たりマウス５匹）に免疫原１０μｇを三回投与してＤ３８においてマウスを屠殺し、液性応答、ＣＴＬアッセイ及び細胞性応答としての増殖の調査により、第一シリーズの実験を実施した。
【０１２７】
結果を下記表１中に示す。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
ａ：ｃｐｍ値の平均（特異的刺激−培地による刺激）、ｃｐｍ＝１分当たりのカウント（ステューデント検定、Ｐ＝０．００２）
ｂ：ブランチの全マウス中、特異的ＣＴＬ活性を有するマウスの数
ｃ：ブランチのマウスの抗ｐ２４ ＩｇＧ１力価の数値平均
【０１３０】
この表は以下を示す：
−ｐ２４タンパク質単独又はフロイントアジュバントと比較して、本発明のｐ２４／ＰＬＡ微粒子により増殖応答が増強されたこと、
−免疫原のいずれによってもＣＴＬ活性は検出されないこと、及び、
−本発明のｐ２４／ＰＬＡ微粒子によって、ｐ２４単独投与の場合より非常に優れた特異的抗体力価を取得可能であり、得た応答はｐ２４／フロイントアジュバントの組合せで得た抗体力価と同等であること。
【０１３１】
免疫原の割合を４０μｇとしてマウスをＤ４２（マウス３匹）又はＤ７０（マウス４匹）において屠殺した以外は上記と同様に、マウス１３匹（ブランチ当たりマウス３又は４匹）について実験を実施した。
【０１３２】
結果を下記表２中に示す。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
ａ：（２０時間に渉る特異的刺激（ペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）に応答してＩＦＮ−γを分泌する細胞数）／（全細胞１０６個）の平均
ｂ：ブランチの全マウス中、特異的ＣＴＬ活性を有するマウスの数
ｃ：ブランチのマウスの抗ｐ２４ ＩｇＧ１力価の数値平均
【０１３５】
表中の結果は以下を示す：
−表１中に示す抗体力価と表２中に示す抗体力価とを比較すると、投与量を１０μｇから４０μｇに増やすと匹敵する結果を提供可能であること、並びに、
−マウスの屠殺を後に延ばすことにより最後の注射後に長時間応答させることによって、２４／ＰＬＡ群の全マウスにおけるＣＴＬ応答、及び、ＥＬＩＳＰＯＴによる、増強された抗体力価の項目における応答を証明可能であること。
【実施例４】
【０１３６】
本発明の微粒子ＰＬＡ／Ｔａｔによるマウスの免疫
上記実施例１項目３中と同様に調製した微粒子ＰＬＡ／Ｔａｔ、Ｔａｔタンパク質単独、及び、油中水型エマルションの形態で調製したＴａｔタンパク質／フロイントアジュバント（シグマ社）の組み合わせを免疫原として使用し、各々２０μｇ注射し、液性応答についてはＴａｔタンパク質を捕獲パートナーとして使用し、上記実施例３項目４中に示すマウスポリクローナル抗体を検出パートナーとして使用し、液性応答については、ＣＤ８型応答の分析用に後述の６つのペプチドのいずれかを２０時間、又は、ＣＤ４型応答の分析用にＴａｔタンパク質を４２時間、刺激体として使用してＥＬＩＳＰＯＴアッセイのみを実施した以外は、実施例３中に示す手法と同様に実施した。
【０１３７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで使用したペプチド（Ｓｙｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）
ＣＦＨＣＱＶＣＦＴＫＫＧＬＧＩ（配列番号４）
ＶＣＦＴＫＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫ（配列番号５）
ＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲ（配列番号６）
ＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＳＰＱ（配列番号７）
ＫＲＲＱＲＲＲＳＰＱＤＳＥＴＨ（配列番号８）
ＲＲＳＰＱＤＳＥＴＨＱＶＳＬＳ（配列番号９）
【０１３８】
結果を下記表３に示す。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
ａ：（２０時間に渉る特異的刺激（ペプチドのプール）に応答してＩＦＮ−γを分泌する細胞数）／（全細胞１０６個）の平均
ｂ：（４２時間に渉る特異的刺激（Ｔａｔタンパク質）に応答してＩＦＮ−γを分泌する細胞数）／（全細胞１０６個）の平均
ｃ：ブランチのマウスの抗Ｔａｔ総ＩｇＧ力価の数値平均
ｄ：ブランチの全マウス中、特異的ＩｇＧ２ａ応答を有するマウスの数
ｅ：応答したマウスの抗Ｔａｔ ＩｇＧ２ａ力価の数値平均
【０１４１】
上記表３における結果は以下を示す：
−Ｔａｔタンパク質単独又はＴａｔ／フロイント組成物の注射に対して、本発明の微粒子の注射によりＩＦＮ−γ分泌細胞の誘導が可能であること、及び
−Ｔａｔタンパク質単独又はフロイントアジュバントの使用で得た力価約１０４と比較して、Ｔａｔタンパク質のＰＬＡへの結合は抗体力価（総ＩｇＧ）を約１ｌｏｇ増強可能であり、Ｔａｔ／ＰＬＡ微粒子の使用により、抗Ｔａｔ ＩｇＧ２ａの頻度及び力価を共に増強可能であること。
【実施例５】
【０１４２】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子によるマウスの免疫
１．動物モデル
ＨＬＡ−Ａ２分子を導入したＣ５７ＢＬ／６マウス１４匹について免疫実験を実施した（Ｐａｓｃｏｌｏ Ｓ，ら．（１９９７），Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１８５（１２），２０４３−２０５１）。
【０１４３】
２．投与した免疫原
本実験においては、ＮＳ３ＮＳ４核酸配列（配列番号１０）に対応する裸のＤＮＡをポジティブコントロールとして使用し、上記実施例１項目１及び４中と同様に調製したＮＳ３ヘリカーゼパプチド単独及びＰＬＡ粒子単独、油中水型エマルションの形態で調製したＮＳ３ヘリカーゼ／フロイントアジュバント（シグマ社）組成物、並びに、上記実施例１項目４中と同様に調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子を使用した。
【０１４４】
３．免疫
上記項目２に記載の免疫原を連続して三回、タンパク質の場合には各々５０μｇ、又は、裸のＤＮＡの場合には各々１００μｇの割合で、０、２及び４週目にマウスに摂取させた。裸のＤＮＡを筋肉内投与した以外は、注射は全て皮下で実施した。
【０１４５】
最初の注射から約７０日（Ｄ７０）後に動物を屠殺し、血液及び脾臓を採取して免疫学的に調べた。
【０１４６】
４．免疫学的分析
ＣＴＬ細胞性応答を以下のように調べた：マウス屠殺後に脾臓を滅菌的に摘出し、細胞懸濁液を調製した。ＮＳ３タンパク質に含まれるＣＴＬエピトープに対応するＫＬＶペプチド（ＫＬＶＡＬＧＶＮＡＶ、配列番号１１）及びＩＬ−２を含む培地に細胞懸濁液を入れた。５日後に、ペプチドを負荷した照射無処理細胞でエフェクター群を再刺激した。７日後に細胞傷害性エフェクター群を回収し、５１Ｃｒ標識Ｐ８１５細胞を標的としてＣＴＬ活性を測定した。
【０１４７】
５．結果
結果を図１中に示すが、この図はエフェクター／標的の比率に対する特異的溶解の割合を示すグラフを表し、図１ＡはコントロールとしてのＨＣＶ ＮＳ３ＮＳ４ポリタンパク質に対応するＤＮＡ配列の注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｂは微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼ／フロイントアジュバントの組み合わせの注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｃは微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼペプチドの注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｄはタンパク性物質を使用せずＰＬＡ微粒子の注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｅは本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子の注射後に誘導された細胞性応答を示す。
【０１４８】
上記グラフは、本発明のＰＬＡ／ＮＳ３微粒子の注射時に示された、ＮＳ３ヘリカーゼペプチドに対して特異的なＣＴＬ応答を示す。
【実施例６】
【０１４９】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるウサギの免疫
１．動物モデル
一回目の免疫時に体重約２．５ｋｇのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ株ウサギについて免疫実験を実施した。
【０１５０】
２．投与した免疫原
本実験においては、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明のＰＬＡ−ｐ２４微粒子、及び、油中水型エマルションの形態で調製し、免疫原性能力が良好であることが知られる（ポジティブコントロール）ｐ２４−フロイントアジュバント（シグマ社）組成物を使用した。
【０１５１】
３．免疫
上記項目２に記載の免疫原２００μｇを五回連続して、０、１、２、３及び４か月目にウサギに摂取させた。注射はいずれも皮下又は皮内で実施した。
【０１５２】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を追跡するために、動物の血液試料を規則的に採取した。その後、コンジュゲートの可視化をホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１１−０３５−００３）で置き換えた以外は、実施例３項目４中と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより抗ｐ２４抗体の存在を試験した。
【０１５３】
５．結果
結果を図２中に示すが、この図は、皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）いずれかで注射したウサギ６匹（Ｌ１〜Ｌ６）の免疫前血清及び免疫血清中の抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示す。力価は希釈度の逆数に対応し、この値について約０．１のＯＤを得る。免疫前血清は免疫原注射前にＤ０において採取し、免疫血清はＤ０の４か月後に採取した。
【０１５４】
得た結果は、抗原投与が皮下又は皮内のいずれであるかにかかわらず、本発明のＰＬＡ／ｐ２４粒子による免疫が全ての動物において良好な力価を示すことを示す。しかし、選択したモデルにおいては、皮内投与の方が皮下投与よりわずかに良好であるようである。着目すべきは、フロイントアジュバント／ｐ２４の免疫で得た力価は、ＰＬＡ／ｐ２４免疫で得た力価に実質的に匹敵するということである（２×１０７と５×１０６）。従って、微粒子ＰＬＡ／ｐ２４の使用により、ウサギにおいてポリクローナル血清を誘導可能である。
【実施例７】
【０１５５】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるマカク属サルの免疫
１．動物モデル
ＣＥＡに収容したカニクイザルについて免疫実験を実施した。
【０１５６】
２．投与した免疫原
本実験においては、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を使用した。
【０１５７】
３．免疫
カニクイザル２匹をＰＬＡ／ｐ２４（１匹当たり５００μｇ筋肉内投与）の注射により免疫した後、６週間後に同一の追加抗原を注射した。同一条件下で６か月後に三回目の注射を実施する。
【０１５８】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を追跡するために、０（最初に免疫した日）、２、４、６（追加抗原を注射した日）、８，１０及び１２週目にマカクザルの血液試料を採取した。その後、コンジュゲートの可視化をホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片マウス抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号２０９−０３５−０９８）で置き換えた以外は、上記実施例３項目４中と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより、抗ｐ２４抗体の存在を試験した。また、同一ＥＬＩＳＡフォーマットにより、抗ヒトＩｇＧ１（カタログ番号０５−３３２０、Ｚｙｍｅｄ）、抗ヒトＩｇＧ２（カタログ番号０５−０５２０、Ｚｙｍｅｄ）、抗ヒトＩｇＧ３（カタログ番号０５−３６２０、Ｚｙｍｅｄ）及び抗ヒトＩｇＧ４（カタログ番号０５−３８２０、Ｚｙｍｅｄ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体を使用し、存在するＩｇＧサブクラスを調べた。
【０１５９】
５．ＥＬＩＳＰＯＴによる抗ｐ２４細胞性応答の出現の観察
この手法により、最終濃度５μｇ／ｍＬでの４８時間の抗原刺激に応答してインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を分泌する細胞の数を決定可能である。新たに単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、予め低温保存したＰＢＭＣ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激したＰＢＭＣから、及び、（抗ＣＤ４抗体を使用して）ＣＤ４＋細胞又は（抗ＣＤ８抗体を使用して）ＣＤ８＋細胞を予め枯渇させたＰＢＭＣから誘導したＴリンパ球系列に対して、この手法を首尾よく使用した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社より入手のＭＡＣＳ試薬、ＣＤ４ミクロビーズ（カタログ番号１３０−０９１−１０２）及びＣＤ８ミクロビーズキット（カタログ番号１３０−０９１−１１２）を使用して、製造業者の指示に従い、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞を選別した。
【０１６０】
Ｔリンパ球の抗原活性化効果を模倣するＰＭＡ−イオノマイシンカップル（ＰＭＡは酢酸ミリスチン酸ホルボール）をポジティブコントロールとして使用した。
【０１６１】
ＰＶＤＦ膜（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ，ミリポア社）を備えた９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートを、滅菌ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬで添加した抗マカクザルＩＦＮ−γモノクローナル抗体のクローンＧＺ−４（Ｍａｂｔｅｃｈ，ｒｅｆ：３４２０Ｍ−３）で＋４℃において一晩かけて被覆した。その後プレートを洗浄して飽和させた。平行して、通常技術によりＦｉｃｏｌｌグラジエントでＰＭＢＣを血液試料から単離した。１ウェル当たり細胞１０５個を含む培地１００μＬ、及び、１ウェル当たり抗原源を含む培地１００μＬを入れた。実験によると、抗原源はｐ２４タンパク質又は後に定義するｇａｇペプチドのプールいずれかであり、それについては、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて陽性応答を取得可能であることをあらかじめ確認した。刺激に対するポジティブコントロールを産生するため、ＰＭＡ５０ｎｇ／ｍＬ及びイオノマイシン５００ｎｇ／ｍＬを入れたウェルに、１ウェル当たり細胞４×１０３個を含む培地２００μＬを入れた。その後、５％ＣＯ２の湿潤雰囲気中で３７℃において２４時間プレートをインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。その後、残存する細胞を氷冷水で１０分間処理して溶解し、プレートを再度洗浄した。その後、可視化抗体である、ヒトＩＦＮ−γに対するビオチニル化モノクローナル抗体のクローン７−Ｂ６−１（Ｍａｂｔｅｃｈ，ｒｅｆ：３４２０−６）を１ウェル当たり０．１μｇ添加した（３７℃で２時間、又は、４℃で一晩インキュベート）。エキストラビジン−アルカリホスファターゼ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質の添加によりスポットを可視化した。ｇａｇペプチドの配列は以下の通りである：
ＥＱＩＧＷＭＴＮＮＰＰＩＰＶＧ（配列番号１２）
ＷＭＴＮＮＰＰＩＰＶＧＥＩＹＫ（配列番号１３）
ＮＰＰＩＰＶＧＥＩＹＫＲＷＩＩ（配列番号１４）
ＰＶＧＥＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮ（配列番号１５）
ＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲ（配列番号１６）
ＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳＰ（配列番号１７）
ＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳＰＴＳＩＬ（配列番号１８）
ＩＶＲＭＹＳＰＴＳＩＬＤＩＲＱ（配列番号１９）
ＹＳＰＴＳＩＬＤＩＲＱＧＰＫＥ（配列番号２０）
ＳＩＬＤＩＲＱＧＰＫＥＰＦＲＤ（配列番号２１）
ＩＲＱＧＰＫＥＰＦＲＤＹＶＤＲ（配列番号２２）
ＰＫＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴ（配列番号２３）
ＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡＥ（配列番号２４）
ＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳＱ（配列番号２５）
ＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳＱＥＶＫＮ（配列番号２６）
ＲＡＥＱＡＳＱＥＶＫＮＷＭＴＥ（配列番号２７）
ＡＳＱＥＶＫＮＷＭＴＥＴＬＬＶ（配列番号２８）
ＶＫＮＷＭＴＥＴＬＬＶＱＮＡＮ（配列番号２９）
ＭＴＥＴＬＬＶＱＮＡＮＰＤＣＫ（配列番号３０）
ＬＬＶＱＮＡＮＰＤＣＫＴＩＬＫ（配列番号３１）
ＮＡＮＰＤＣＫＴＩＬＫＡＬＧＰ（配列番号３２）
【０１６２】
６．結果
６．１ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の証明
ＰＬＡ／ｐ２４調製物を摂取させ、かつ、ＰＢＭＣを刺激したマカクザル２匹（Ｍ１及びＭ２）についてのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図３中に再度示すが、この図は、抗原を使用しない刺激後（培地、ネガティブコントロール、実線のヒストグラム）、ｐ２４による刺激後（点線のヒストグラム）、又は、ＰＭＡ−イオノマイシンカップルによる刺激後の、免疫後の日数に対する細胞１００万個当たりのスポット数を示すヒストグラム（４回の実験の平均＋／−標準偏差）を表す。各グラフ下の矢印は注射した時点を表す（Ｄ０及びＤ＋６週）。
【０１６３】
この結果は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４により、試験動物２匹においてＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を誘導可能であることを示す。一匹目のサル（Ｍ１）のみが二回目の注射後に特異的な応答を生し、また、二匹目のサル（Ｍ２）は一回目の注射後に最初の試料を試験した際に既に応答を生じている。いずれの場合においても、得たＥＬＩＳＰＯＴ応答が高いことから、追加抗原注射の効果（追加抗原効果）は非常に大きい。また、得た応答は、非複製免疫原が関与すると仮定すると比較的持続する；応答は二回目の注射から約４０日後も有意な状態で持続する。
【０１６４】
６．２ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の性質
ＥＬＩＳＰＯＴ応答の性質により、エフェクター免疫細胞ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれの型が、測定したＩＦＮ−γ分泌を担っているかを実証可能である。
【０１６５】
結果を図４中に示すが、この図は、総ＰＢＭＣ画分、抗ＣＤ４抗体存在下における総ＰＢＭＣ画分、ＣＤ４＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ４−ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ４＋豊富画分（ＣＤ４＋ＰＢＭＣ）、並びに、ＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ８−ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ８＋豊富画分（ＣＤ８＋ＰＢＭＣ）において、ｐ２４タンパク質（実線のヒストグラム）又はペプチド（点線のヒストグラム）のいずれかによる刺激後にＥＬＩＳＰＯＴで得たスポット数を示すヒストグラムを表す。着目すべきは、Ｍ１サルにおいて得た細胞の量は、抗ＣＤ８抗体を使用した枯渇実験の実施には不十分であったということである。
【０１６６】
図４で得た結果は、ＩＦＮ−γサイトカインは末梢血単核球のＣＤ４−画分及びＣＤ８−画分の両方により分泌されることを示す。更に、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体（陽性選別画分）の存在下においてＥＬＩＳＰＯＴ応答はなく、このことは、これらの抗体はいずれも免疫応答を妨げることを示す。従って、この実験により、観察されたＩＦＮ−γ分泌はＣＤ４＋エフェクター細胞及びＣＤ８＋エフェクター細胞の両方によって媒介されると結論可能である。更に、この観察は、使用した抗原刺激がｐ２４タンパク質であるかｇａｇペプチドのプールであるかにかかわらずあてはまる。微粒子に基づく調製物によって霊長類において目的の抗原に特異的なＣＤ８＋応答を誘導できたのはこれが最初であると強調するのは重要である。
【０１６７】
６．３ 液性応答の分析
ＰＢＭＣに対する細胞性応答の分析と同時に、本出願人らは、サルから連続して採取した血清についての液性応答も分析する。２匹のうち、Ｍ２サルのみが抗体応答を発生し、この応答は二回目の注射後に抗ｐ２４ ＩｇＧ力価約１０５に達した。Ｍ１サルは２回のＰＬＡ／ｐ２４注射後に有意な抗体応答を示さず、力価は１０３未満のままであった。この結果はそれ程予想外のものではなく、その理由は、細胞性応答の分析中に本出願人らは、Ｍ１サルの応答は不十分であって、Ｍ２サルの場合より多数回注射しなければ免疫応答が生じないことを実証可能であったためである。
【０１６８】
Ｍ２サルにおけるＥＬＩＳＡアッセイの結果を図５中に示すが、この図は、連続して血清を採取した日におけるＭ２サルの抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示すヒストグラムを表す。これらの結果は第一に、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によりマカクザルにおいて特異的抗体応答を誘導可能であり、第二に、応答の弱い個体においても応答を確実に誘導するためには、本出願人らが使用したプロトコルより１回又は２回多く注射する必要がおそらくあることを示す。
【０１６９】
６．４ 結論
カニクイザルモデルにおいて実施した３回の実験全てから、本発明の微粒子により、ヒト以外の霊長類においてＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞性応答並びに抗体応答で良好な免疫応答を誘導可能であることが示された。
【実施例８】
【０１７０】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４で感作させた樹状細胞によるマウスの免疫
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢である雌ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ−２ｋ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１７１】
２．投与した免疫原
本実験においては、ＳＲＤＣ（Ｈ−２ｋ）ネズミ脾臓細胞系を使用し、試験する種々の免疫原を輸送した。この樹状細胞系は以下の免疫原の一種で１２時間感作させた：実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４（ｐ２４について換算してｐ２４／ＰＬＡ１０μｇ／ｍＬ）、同様に調製したＰＬＡ−ＯＶＡ微粒子（ネガティブコントロールとして）、又は、ｐ２４タンパク質。
【０１７２】
３．免疫
マウスを６匹ずつの４群に分けた。個々のマウスには感作ＳＲＤＣ細胞５×１０５個を０、２及び４週目に皮下摂取させた。４バッチのマウスに、非感作細胞（ネガティブコントロール）、又は、微粒子ＰＬＡ／ｐ２４若しくは微粒子ＰＬＡ／ＯＶＡ（微粒子ネガティブコントロール）若しくはｐ２４タンパク質で感作させた細胞のいずれかを摂取させた。
【０１７３】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を観察するために、免疫後１０日毎にマウスの血液試料を採取した。その後、先の実施例中の記載と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより抗ｐ２４抗体が存在するかどうかを試験した。
【０１７４】
５．結果
液性応答の分析を図６中に示すが、この図は、ネガティブコントロール（Ｃｔ１及びＣｔ２）で、又は、ｐ２４タンパク質（ｐ２４−１及びｐ２４−２）で、又は、微粒子ネガティブコントロール（ＮａｎｏＯｖａ１及びＮａｎｏＯｖａ２）で、又は、本発明の微粒子（Ｎａｎｏｐ２４−１及びＮａｎｏｐ２４−２）で感作させたマウスの、免疫前血清中の、一回目の免疫後の血清中の、二回目の免疫後の血清中の、及び、三回目の免疫後の血清中の、ＥＬＩＳＡで得たＯＤ値を示すヒストグラムを表す。
【０１７５】
結果は、ＳＲＤＣをＰＬＡ−ｐ２４微粒子で感作させる場合にのみＳＲＤＣ細胞の注射により抗体が誘導されることを示す。可溶性ｐ２４タンパク質による感作では免疫応答を取得不可能である。
【０１７６】
６．細胞性応答の実験
マウスから単離した脾臓及び粘膜リンパ球の両方を使用して実験した。刺激したＴリンパ球亜群の分析は、リンパ増殖及びサイトカイン分泌アッセイにより実施し、最後の免疫から２週間後に抗原に対する応答能力を調べた。
【０１７７】
リンパ増殖アッセイでは、脾臓から及び粘膜リンパ節から単離したＴリンパ球を、目的の抗原を種々の濃度で含む完全培地中に５日間入れておき、その後、３Ｈチミジンで１８時間放射標識した。チミジンの取り込み量はリンパ増殖応答の程度に対応する。
【０１７８】
サイトカイン分泌アッセイでは、脾臓から及び粘膜リンパ節から単離したＴリンパ球を、目的の抗原を種々の濃度で含む完全培地中に３日間入れておき、その後、培養上清中に分泌されたサイトカインを市販のＥＬＩＳＡキットでアッセイした。
【０１７９】
７．結果
下記表４中に得た結果をまとめる。
【０１８０】
【表４】
【０１８１】
上記のように、結果から、特異的免疫応答を表示可能な群はＳＲＤＣ−ＰＣＡ−ｐ２４群のみであることを示す。刺激指数は脾臓から単離した細胞では２．８であり、腸間膜リンパ節から単離した細胞では２．２である。他の群では、刺激指数の増加はないか、又は、有意ではない。同様に、Ｔｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌を誘導可能な群はＳＲＤＣ−ＰＬＡ−ｐ２４群のみである。抗原存在下におけるこの分泌は、脾臓細胞及び腸間膜リンパ節細胞の両方により実証可能である。
【０１８２】
８．結論
これらの実験全てから、本出願人らがＰＬＡ−ｐ２４微粒子により目的の抗原（この場合にはｐ２４）で樹状細胞を感作可能であることを実証可能であった。ＳＲＤＣ投与により（ＰＬＡ−ｐ２４を負荷した場合には）細胞性及び液性両方の特異的応答を誘導可能であるが、可溶性ｐ２４で感作させたＳＲＤＣは抗ｐ２４応答を誘導不可能である。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感作させた樹状細胞の移動に基づく免疫療法においてＰＬＡ微粒子を首尾よく使用可能である。目的の抗原を可溶性形態で樹状細胞に負荷できない場合、抗原を有するＰＬＡ微粒子により、樹状細胞による取り込みを促進可能である。本発明の微粒子により、得た特異的免疫応答を相当程度増強可能である。
【実施例９】
【０１８３】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子によるマウスの免疫：初期かつ局所的細胞性応答
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１８４】
２．投与した免疫原
本実験においては各免疫群当たりマウス５匹を使用した：ＮＳ３ヘリカーゼ遺伝子型１ｂタンパク質（ＮＳ３ｈ）単独、上記実施例１項目４中に記載の透析により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＹＳ）、上記実施例２項目２中に記載の溶媒置換により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＤＳ）、及び、エマルションの形態で調製し、かつ、市販のワクチン中でアジュバントであることが知られるＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ社）組成物（ポジティブコントロール）。
【０１８５】
３．免疫
上記項目２に記載した免疫原をマウスの足底肉趾皮下に一回（１００μｇ）投与した。
【０１８６】
最初の注射から１０日後にマウスを屠殺し、膝窩リンパ節を摘出して免疫学的分析に供した。
【０１８７】
４．免疫学的分析
初期かつ局所的なＮＳ３ｈタンパク質特異的かつ用量応答性の細胞性応答を以下のように調べた：種々の濃度のＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の膝窩リンパ節細胞の増殖−膝窩リンパ節細胞を、ＮＳ３ｈタンパク質０、０．１、０．３及び１μＭの存在下で３日間刺激した。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。
【０１８８】
パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、ＮＳ３ｈ免疫原に対する細胞性応答が増大する。
【０１８９】
５．結果
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後における膝窩リンパ節細胞の増殖の結果を図７中に示すが、この図は、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳ（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子（ＤＤＳ）及びＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物を摂取したマウスにおいて、細胞増殖アッセイ時の再刺激で使用したＮＳ３ｈ量に対する、濃度０のＮＳ３ｈタンパク質に対して各濃度（０、０．１、０．３及び１μＭ）のＮＳ３ｈについて得たｃｐｍ（１分当たりのカウント）値の比率に対応する、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【０１９０】
このグラフは、溶媒置換（ＤＤＳ）により調製したＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子、及び、透析により調製したＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＤＹＳ）を注射した場合における、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な細胞性応答を示す。本発明のＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈを注射したマウスの特異的細胞性応答は、本発明のＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ、ポジティブコントロール（Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ）及び試験した任意の濃度のＮＳ３ｈ抗原についてのＰＢＳ／ＮＳ３ｈコントロールで得たものよりも大きい（ＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ＞ＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ＞Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ＝ＰＢＳ／ＮＳ３ｈ）。
【０１９１】
この結果は、ＮＳ３ｈタンパク質単独又はＡｌｕｍとのアジュバントと比較して、本発明のＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ及びＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ微粒子により、細胞増殖応答が増強されたことを示す。
【実施例１０】
【０１９２】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子によるマウスの免疫：局所的かつ全身性の細胞性応答、及び、抗ＣＤ４＋抗体によるこの全身性細胞性応答の阻害
１．動物モデル
最初の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１９３】
２．投与した免疫原
本実験では、免疫群当たりマウス５匹を使用した：ＮＳ３ヘリカーゼ遺伝型１ｂタンパク質（ＮＳ３ｈ）単独、上記実施例１項目４中に記載の透析により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＹＳ）、上記実施例２項目２中に記載の溶媒置換により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＤＳ）、及び、エマルションの形態で調製し、かつ、市販のワクチン中でアジュバントであることが知られるＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ社）組成物（ポジティブコントロール）。
【０１９４】
３．免疫
上記項目２中に記載の免疫原をマウスに二回（１００μｇ）投与し、一回目は０日目に足底肉趾に皮下投与し、二回目は７日目に尾の付け根に皮下投与した。
【０１９５】
二回目の注射から７日後にマウスを屠殺し、膝窩リンパ節及び脾臓を摘出して免疫学的分析に供した。
【０１９６】
４．免疫学的分析
膝窩リンパ節に局所的な、及び、脾臓における全身性の、ＮＳ３ｈタンパク質特異的かつ用量応答性細胞性応答を以下のように調べた：種々の濃度のＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の膝窩リンパ節細胞の増殖−膝窩リンパ節及び脾臓の細胞をＮＳ３ｈタンパク質０、０．１、０．３及び１μＭの存在下で３日間刺激した。３日間培養後、上清５０μＬを除去した。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、ＮＳ３ｈ免疫原に対する細胞性応答が増大する。
【０１９７】
脾臓由来の細胞において抗ＣＤ４＋抗体（ＧＫ１．５；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））による細胞性応答の阻害を以下のように求めた：
（ｉ）ＮＳ３ｈタンパク質１μＭによる刺激後の脾臓細胞の増殖の、抗ＣＤ４＋抗体による阻害−脾臓細胞をＮＳ３ｈタンパク質１μＭの存在下で刺激し、抗ＣＤ４＋抗体１０μｇと共に３日間インキュベートした。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、ＮＳ３ｈ免疫原に対する細胞性応答が増大する。
（ｉｉ）インターフェロンγのアッセイ−ＢＤ（登録商標）サイトメトリービーズアレイキット、マウスＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインＣＢＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５１２８７）を使用してインターフェロンγをアッセイした。蛍光強度の異なる５群のビーズを、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αタンパク質に特異的な捕獲抗体で被覆した。５群のビーズを一緒に混合してＣＢＡを形成し、これを、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）Ｃｏｕｌｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ等のフローサイトメーターのＦＬ３チャネルで解像する。サイトカイン捕獲ビーズをフィコエリスリン結合検出抗体と混合した後、供給元の推奨に従ってインキュベートした。ＢＤ ＣＢＡ分析ソフトウェアを使用することにより、フローサイトメーターにより試料データを取得し、結果を出した。
【０１９８】
５．結果
５．１ 局所的及び全身性の細胞性応答
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の脾臓細胞の増殖の結果を図８中に示すが、この図は、局所的細胞性応答につき膝窩リンパ節の細胞において（図８Ａ）、及び、全身性の細胞性応答につき脾臓の細胞において（図８Ｂ）、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳ（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物（Ａｌｕｍ）を摂取したマウスにおいて使用したＮＳ３ｈの量（μＭで表した）に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【０１９９】
これらの結果は、溶媒分散により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＤＤＳ）及び透析により調製したＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＤＹＳ）の１μＭについて、全身性であって（脾臓細胞−図８Ｂ）、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な細胞性応答を示す。本発明のＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ及びＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈを摂取したマウスの特異的な細胞性応答は、ポジティブコントロール（Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ）及びＰＢＳ／ＮＳ３ｈコントロール（ＰＢＳ）で得たものよりも大きい（ＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ及びＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ＞＞＞Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ＝ＰＢＳ／ＮＳ３ｈ）。
【０２００】
５．２ 抗ＣＤ４抗体による全身性の細胞性応答の阻害
結果を図９中に示すが、この図は、刺激をしない脾臓細胞における（０）、ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後における（１）、又は、タンパク質及び抗ＣＤ４＋抗体による刺激後における（１＋ａＣＤ４）、マウスで使用した免疫原、すなわち、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳ（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子（ＤＤＳ）及びＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物（Ａｌｕｍ）に対する細胞増殖指数（ＲＰＩ）を示すヒストグラムを表す。
【０２０１】
結果は、全身性の細胞性応答が抗ＣＤ４＋抗体の存在下で少なくともファクター５だけ阻害されることを示し、これにより、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な応答がＴｈ２型のものであることが示唆される。
【０２０２】
５．３ 補足的結果
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の増殖の３日目に、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌が、使用した全ての条件下で観察され、この分泌は抗ＣＤ４＋抗体により減少する。
【０２０３】
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後３日目のＩＦＮ−γアッセイの結果を下記表５中に示す。
【０２０４】
【表５】
【実施例１１】
【０２０５】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３へリカーゼ微粒子によるマウスの免疫：液性応答
１．動物モデル
最初の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０２０６】
２．投与した免疫原
本実験においては、免疫群当たりマウス５匹を使用した。ＮＳ３ヘリカーゼ遺伝子型１ｂタンパク質（ＮＳ３ｈ）単独、上記実施例１項目４中に記載の透析により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＹＳ）、上記実施例２項目２中に記載の溶媒置換により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＤＳ）、及び、エマルションの形態で調製し、かつ、市販のワクチン中でアジュバントであることが知られるＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ社）組成物（ポジティブコントロール）。
【０２０７】
３．免疫
上記項目２中に記載の免疫原を三回（５０μｇ）、０、２及び４週目にマウスの尾の付け根に皮下投与した。血清を１３日目、２７日目及び４５日目に採取し、後に示すＥＬＩＳＡアッセイにより、ＮＳ３ｈタンパク質に対する特異的液性応答を調べた。
【０２０８】
最初の注射から１０日後にマウスを屠殺し、膝窩リンパ節を摘出して免疫学的分析に供した。
【０２０９】
４．免疫学的分析
初期かつ局所的なＮＳ３ｈタンパク質特異的液性応答を以下のように調べた：
ＮＳ３ｈタンパク質に対する定性的及び定量的液性応答−最初の注射前（Ｄ０）、及び、Ｄ１３、Ｄ２７及びＤ４５に血液試料を採取した。特異的抗ＮＳ３ｈ抗体の存在、抗体力価及び免疫グロブリンイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）をＥＬＩＳＡにより決定した。微量滴定プレートをＮＳ３ｈタンパク質で感作し、免疫したマウスの血清中のＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な抗体を、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ血清（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５−０３５−０６２）で可視化した。抗体力価の決定において、免疫したマウスの血清を順次希釈した。イソタイプ分類の決定において、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１ヤギ血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，カタログ番号１０７０−０５，アメリカ合衆国アラバマ州バーミンガム）、及び、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社，ＵＰＢ９０５２０）で反応を可視化した。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１イソタイプの比率も決定し、免疫応答のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の傾向（各々Ｔｈ１−Ｔｈ２）の解釈を可能とした。
【０２１０】
５．結果
３０日目及び４５日目における特異的抗ＮＳ３ｈ総ＩｇＧ抗体力価の結果を下記表６中に示す。
【０２１１】
【表６】
【０２１２】
結果は、ＮＳ３ｈタンパク質のＰＬＡへの結合により、ＮＳ３ｈタンパク質単独で得た力価に対して約１ｌｏｇだけ抗体（総ＩｇＧ）力価が増大可能であることを実証する。更に、得た力価はフロイントアジュバント／ＮＳ３ｈ調製物で得たものに匹敵する。
【０２１３】
ＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子の使用により、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な実質的にＩｇＧ１抗体反応を取得可能となり、これは、この応答がＴｈ２型のものであることを示唆する。
【実施例１２】
【０２１４】
単球の樹状細胞への分化過程におけるＰＬＡ／ＮＳ３ｈの作用
この実験により、ＰＬＡナノ粒子に吸着したＮＳ３ｈタンパク質の抗原提示細胞に対する効果を調べる。この実験は、ヒト末梢血液から単離した単球を使用して発生し、かつ、分化した樹状細胞の存在下で実施する。
【０２１５】
共刺激性分子の拡大を調べることにより、開始時に未成熟な樹状細胞（ＤＣｉ）が成熟過程に入るか否かを決定可能である。
【０２１６】
潜在的アジュバント及びＰＬＡ−ＮＳ３ｈ調製物により単球の樹状細胞への分化及び成熟を促進可能であるかどうかも試験する。この実験により、本出願人らは、先天性免疫と適応性免疫の間において必須の、細胞媒介におけるそれらの役割をより明瞭に理解可能である。分化及び成熟の表現型マーカーを連続的に調べ、かつ、生じたサイトカインの特性を調べることによってスクリーニングを実施する。サイトカイン産生の分析により、ＰＬＡ−ＮＳ３調製物がＴｈ１及び／又はＴｈ２特性を誘導するか否かを同定可能である。
【０２１７】
１．ヒト末梢血液からの単球の精製
Ｆｉｃｏｌｌ及びＰｅｒｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）勾配で遠心することにより（リヨンのＥｔａｄｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ［フランス血液バンク］で回収した）正常ヒト末梢血液から単球を単離した。Ｆｉｃｏｌｌにより、細胞を傷つけずに機能を保持したまま、密度勾配の作成が可能である。遠心後、Ｆｉｃｏｌｌよりも密度の高い赤血球細胞及び多形核細胞が試験管の底に沈殿する。リンパ球及び単球を含むＰＢＭＣ（末梢血単核球）は原形質とＦｉｃｏｌｌ間の界面に依然として存在する。その後、それらをＰｅｒｃｏｌｌ勾配で精製する。遠心後、Ｐｅｒｃｏｌｌよりも密度の高いリンパ球はペレット中に存在し、他方、単球は培地とＰｅｒｃｏｌｌ間の界面に依然として存在する。
【０２１８】
単球を後に示す抗体（Ａｂ）の混合物と共にインキュベートして、Ｔリンパ球（マウス抗ＣＤ３ Ａｂ ＯＫＴ３，ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国メリーランド州ロックヴィル）、抗Ｔリンパ球）、Ｂリンパ球（マウス抗ＣＤ１９ Ａｂハイブリドーマ４Ｇ７、抗Ｂリンパ球）、赤血球細胞（マウス抗糖タンパク質Ａ Ａｂ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）及びＮＫ細胞（マウス抗ＣＤ５６ Ａｂ ＮＫＨ１，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社、抗ナチュラルキラー細胞）の枯渇により、かつ、磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を使用して、残留汚染物を除去した。Ｄｙｎａｌ社のビーズはマウス抗体に対するヒツジ抗体で被覆した小さな磁性ビーズである。この抗体がマウスＡｂ／細胞複合体に結合した後、細胞懸濁液の磁化担体通過後に、単球のみが残留するであろう。
【０２１９】
枯渇は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）フローサイトメトリーにより確認した。
【０２２０】
細胞が液体マトリックスを通過する毎に細胞懸濁液を調べた。これらの細胞が光ビームを通過すると小角（前方散乱−ＦＳ）及び大角（側方散乱−ＳＳ）と呼ばれる２つの型の散乱が生じ、これらは考慮した二種の細胞パラメーター（細胞の大きさ（散乱）及び粒度分析（屈折））を表す。レーザーで励起可能なフルオロクロム（ＦＩＴＣ：Ｘ軸ＦＬ１及びＰＥで読み取るフルオレセインイソチオシアネート：ＦＬ２においてＹ軸で読み取るフィコエリスリン）に結合した抗体の使用により、検出可能な蛍光を発光可能である。電気的シグナルの増幅及びアナログ−デジタル変換システムにより、データをコンピューターフォーマットに適合可能である。
【０２２１】
細胞を下記種々の型の抗体で標識した。：
・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４ Ａｂ（単球特異的）
・ＰＥ標識抗ＣＤ３ Ａｂ（ＬＴ特異的）
・抗ＣＤ５６ Ａｂ ＰＥ（ＮＫ細胞）
・抗ＣＤ２０ Ａｂ ＰＥ（ＬＢ特異的）
【０２２２】
汚染物レベルは１０％未満である。
【０２２３】
単球を２４ウェルプレート中の培地（ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、４０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）＋１０％無添加胎児ウシ血清）に、ＧＭ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）及び組換えヒトＩＬ−４（２５０Ｕ／ｍＬ）の存在下で、１×１０６個／ｍＬの割合で順次入れた（０日）。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４により、単球は未成熟樹状細胞へ分化可能である。
【０２２４】
２．細胞の表現型分析
分化５日目、細胞を種々の試験に供した：
・２５０〜２０００ｐｇ／ｍＬのＬＰＳ→ＬＰＳ（リポ多糖）は細菌膜の成分であって、ＤＣｉｓにより危険シグナルとして認識され、全身におけるその成熟を可能とする。各アッセイにおいてある範囲のＬＰＳ濃度を適用し、成熟度を比較した。
【０２２５】
ＮＳ３単独、粒子単独及びＰＬ／ＮＳ３ｈ粒子で用量−応答を実施した。
・１〜５０μｇ／ｍＬのＮＳ３ｈ→タンパク質単独では成熟は全く誘導されないことを確認するためのコントロール
・０．０１〜１ｍｇ／ｍＬのＰＬＡ→ＰＬＡがアジュバント効果を有するか否かを決定するための試験
・１０〜１００μＬのＰＬＡ／ＮＳ３ｈ→ＮＳ３ｈタンパク質の存在下でＰＬＡがアジュバント効果を有するか否かを決定するための試験
【０２２６】
６日目に、上清２００μＬを−８０℃で保存し、サイトカインをアッセイした。続いて細胞を回収して洗浄した。
【０２２７】
種々のコントロール標識を実施した：
・コントロールイソタイプ標識ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ２ａ−ＰＥ：ＩｇＧは、Ｆｃ断片受容体を有する細胞に非特異的に結合可能である。従って、この標識により、反応特異性の確認、及び、種々のアッセイにおける非特異的蛍光の除去が可能である。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａは、使用する抗ＣＤ抗体もこの種類であるということに関連する；
・（単球に対して特異的な）ＣＤ１４−ＦＩＴＣ／（未成熟樹状細胞に対して特異的な）ＣＤ１ａ−ＰＥ標識により、正しく分化したかどうかを確認可能である。
【０２２８】
続いて、成熟樹状細胞の特異的標識により表現型を決定した：
・抗ＣＤ８０ ＦＩＴＣ Ａｂ／抗ＣＤ８６ ＰＥ Ａｂ
・抗ＨＬＡ−ＤＲ ＦＩＴＣ Ａｂ／抗ＣＤ８３ ＰＥ Ａｂ
・抗ＣＤ４０ ＰＥ Ａｂ
【０２２９】
３．樹状細胞成熟プロトコルの実施
調製物を未成熟樹状細胞と接触させ、成熟樹状細胞を発生させるるＰＬＡ／ＮＳ３ｈ粒子の能力（アジュバント効果）を判断した。
【０２３０】
アッセイを以下ように実施した：
・ＬＰＳ範囲：２５０−３００−４００−５００−７５０−１０００−２０００ｐｇ
・ＮＳ３ｈ：１−１０−２５−５０μｇ
・ＰＬＡ粒子：０．０５−０．１−０．５−１ｍｇ
・ＰＬＡ／ＮＳ３ｈ粒子：０．２４ｍｇ ＤＹＳ／１０μｇ ＮＳ３ｈ（１０μＬ）−０．６ｍｇ／２５μｇ（２５μＬ）−１．２ｍｇ／５０μｇ（５０μＬ）−２．４ｍｇ／１００μｇ（１００μＬ）
【０２３１】
４．結果
ＮＳ３ｈタンパク質は陽性標識を与えない。
【０２３２】
Ｄ５においてＰＬＡ ＤＹＳ粒子を単独でＤＣｉｓに添加することにより、成熟化表現型（ＤＣｍ ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＣＤ４０＋）を取得可能である。細胞成熟化に対する用量−応答効果を観察した。
【０２３３】
ＰＬＡ／ＮＳ３ｈ粒子は非常に有利な効果を有する。具体的には、着目すべきは、成熟の活性化の程度は実質的であることである。正しくは１０μＬ（０．２４ｍｇ ＰＬＡ／１０μｇヘリカーゼ）におけるアッセイから、成熟を観察可能である。ＤＣｉｓに添加したＰＬＡ／ＮＳ３ｈは全ての活性化マーカー（ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＣＤ８０＋，ＨＬＡ−ＤＲ＋，ＣＤ４０＋）の発現を誘導する。
【０２３４】
１００μＬにおけるアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する条件において１００μＬは大過剰であるとの認識により実施した。
【０２３５】
結論として、ＰＬＡ調製物はＨＣＶ ＮＳ３ｈタンパク質に対してアジュバント効果を有する、というのは、ＰＬＡ調製物により成熟樹状細胞を取得可能であるためである。
【実施例１３】
【０２３６】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるモノクローナル抗体の取得
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢である雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０２３７】
２．投与した免疫原
本実験においては、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４、及び、油中水型エマルションの形態で調製し、かつ、良好な免疫原性能力を有することが知られるｐ２４−フロイントアジュバント（シグマ社）組成物（ポジティブコントロール）を使用した。
【０２３８】
３．免疫
０、２及び４週間において、上記項目２中に記載の免疫原１０μｇを三回連続してマウスに投与した。全ての注射は皮下投与で実施した。最初の注射からＤ６８において、５０μｇのｐ２４の静脈内注射で液性応答を再刺激した。
【０２３９】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を観察するために、血液試料をマウスから規則的に採取した。その後、上記実施例２項目４中と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより、抗ｐ２４抗体の存在を試験する。しかし、コンジュゲートの可視化は、アルカリ性ホスファターゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社，カタログ番号１１５−０５５−１４６）で置き換える。
【０２４０】
５．モノクローナル抗体の取得
最後に注射して３日後に、ＰＬＡ−ｐ２４群のマウスを屠殺した；血液及び脾臓を採取した。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９）に記載のプロトコルにより、脾臓から取得した脾臓細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄細胞を含む培地に入れ、融合かつ不死化させた。１２〜１４日間インキュベート後、得たハイブリドーマの上清をスクリーニングして、本実施例項目４に記載のＥＬＩＳＡアッセイにより、抗ｐ２４抗体の存在を決定した。陽性ハイブリドーマコロニーを、限界希釈法により２回サブクローニングした。
【０２４１】
６．結果
マウス血清中の抗ｐ２４抗体力価を屠殺前に個々のマウスについて決定した。
【０２４２】
結果を下記表７に示す。
【０２４３】
【表７】
【０２４４】
二群について得た力価を比較する。モノクローナル抗体はフロイントアジュバント／ｐ２４免疫により既に得られているので、本出願人らは、匹敵する力価を誘導可能なＰＬＡ／ｐ２４免疫原によりモノクローナル抗体を取得可能であるか否かの判断を目的とした。
【０２４５】
このために、ＰＬＡ／ｐ２４群のマウス（マウス１）を屠殺し、その脾臓由来の細胞を骨髄細胞と融合させた。融合で得たハイブリドーマを９６ウェルプレート１８枚中で限界希釈によりクローン化した。抗ｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイによるハイブリドーマ培養上清のスクリーニングにより、ｐ２４特異的抗体を分泌するハイブリドーマクローン１２種を同定可能であった。従って、微粒子ＰＬＡ／ｐ２４の使用によりモノクローナル抗体の取得も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】コントロールとしてのＨＣＶ ＮＳ３ＮＳ４ポリタンパク質に対応するＤＮＡ配列（図１Ａ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質及びフロイントアジュバント（図１Ｂ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質（図１Ｃ）で、タンパク性物質を使用せずＰＬＡ微粒子（図１Ｄ）で、及び、ポリマーがＰＬＡかつタンパク質基質がＮＳ３ヘリカーゼペプチドである本発明の微粒子（図１Ｅ）でマウスを免疫することによるＣＴＬアッセイの結果を示す。
【図２】免疫前血清、及び、本発明の粒子ＰＬＡ−ｐ２４を皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）注射したウサギ６匹（Ｌ１〜Ｌ６）の免疫血清中の抗ｐ２４ ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡアッセイで調べたヒストグラムを表す。
【図３】本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより得たヒストグラム（四回の実験の平均＋／−標準偏差）を表し、これは、抗原を使用しない刺激後における（培地、ネガティブコントロール、黒色のヒストグラム）、ｐ２４による刺激後における（灰色のヒストグラム）、又は、ＰＭＡイオノマイシンカップルによる刺激後における（外枠ヒストグラム）、免疫後日数に対する細胞１００万個当たりのスポット数を示す。
【図４】本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴにより得たヒストグラムを表し、これは、ｐ２４タンパク質（黒色のヒストグラム）又はペプチド（灰色のヒストグラム）のいずれかによる刺激後の、総ＰＢＭＣ画分中の、抗ＣＤ４抗体存在下の総ＰＢＭＣ画分中の、ＣＤ４＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ４− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ４＋豊富画分（ＣＤ４＋ ＰＢＭＣ）中の、並びに、ＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ８− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ８＋豊富画分（ＣＤ８＋ ＰＢＭＣ）中のスポット数を示す。
【図５】本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したサルＭ２においてＥＬＩＳＡにより得た、連続して血清を採取した日に対する抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示すヒストグラムを表す。
【図６】ＳＲＤＣ細胞で免疫し、かつ、ネガティブコントロール（Ｃｔ１及びＣｔ２）で、又は、ｐ２４タンパク質（ｐ２４−１及びｐ２４−２）で、又は、ネガティブコントロール微粒子（ＮａｎｏＯｖａｌ及びＮａｎｏＯｖａ２）で、又は、本発明の微粒子（Ｎａｎｏｐ２４−１及びＮａｎｏｐ２４−２）で感作したマウスの免疫前血清中において、一回目の免疫後の血清中において、二回目の免疫後の血清中において、及び、三回目の免疫後の血清中においてＥＬＩＳＡにより得たＯＤ値を示すヒストグラムを表す。
【図７】ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【図８】ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を、局所細胞性応答について膝窩節細胞において（図８Ａ）及び全身細胞性応答について脾臓細胞において（図８Ｂ）示すグラフを表す。
【図９】マウスで使用した免疫原（すなわちＮＳ３ｈ−ＰＢＳ）の量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する細胞増殖指数（ＲＰＩ）を、刺激をしない脾臓細胞において（０）、ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後において（１）、又は、タンパク質及び抗ＣＤ４＋抗体による刺激後において（１＋ａＣＤ４）示すヒストグラムを表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に予防接種の分野で有用な、タンパク性物質が結合する新規生体再吸収性粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質及びペプチド等のタンパク性物質は抗原とも呼ばれ、ウイルス由来疾患等の多くの疾患の治療に、概してワクチンとして広く使用される。
【０００３】
抗原の活性及び強度の増強、並びに、抗原含有医薬組成物の安定性改善のため、これら組成物はアジュバントを含有する。この点で、ワクチン調製物は細胞性応答及び液性応答を増強するための免疫性アジュバントを含むことが多い。
【０００４】
従来のワクチンは、上記アジュバントを含有する場合でも標的病原体に対する非方向性保護を有するという欠点を有する場合が多い。用語「方向性保護」は、免疫系の細胞性応答及び液性応答の両方を含む保護の意味を意図する。
【０００５】
好適な免疫応答の取得には、抗原が担体に吸着又は担体中に捕獲した状態で結合する粒子状担体を使用する。この担体は免疫系への提示対象である抗原のコピーを複数有し、局所リンパ節において抗原の捕獲及び保持を促進する。この粒子は抗原提示細胞により貪食され得、免疫系への抗原提示の増強が可能である。この担体の例としては、ポリ（メタクリル酸メチル）ポリマー、並びに、ポリ（Ｄ−又は、Ｌ−乳酸）（それぞれＤ−ＰＬＡ又はＬ−ＰＬＡとして知られる）等のポリラクチドから、及び、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧとして知られる）からなる微粒子が含まれる。
【０００６】
抗原を捕獲するＰＬＧに基づく微粒子は免疫応答を付与可能である。例えば、Ｍｏｏｒｅらは、マイクロカプセル化したＨＩＶウイルスｇｐ１２０抗原がＨＩＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞性応答を誘導することを示している（非特許文献１）。同様に、Ｖｏｒｄｅｍｅｉｅｒらは、ＰＬＧ捕獲結核菌抗原が、この抗原で免疫したマウスにおいて液性応答及びＴ細胞性応答の両方を誘導することを示した（非特許文献２）。
【０００７】
この種のアジュバントは他の高毒性の系よりも利点をいくつか有するが、微粒子の製造時に、抗原を変性させてその免疫原性を破壊しかねない溶媒等の腐食性化学物質を使用し、かつ、上記生産が困難であるという欠点を有する。また、カプセル化等の捕獲過程に要する激しい撹拌によって抗原が分解する可能性もある。
【０００８】
従って、抗原が表面に吸着又はグラフトした微粒子の使用が提案される（非特許文献３）。しかしＥｌｄｒｉｇｅら（非特許文献４）等による、好適なアジュバント効果の達成には微粒子による抗原捕獲が必要であると示す文献がいくつかある。
【０００９】
特許文献１は、抗原が吸着可能な生分解性ポリマーからなる粒子を記載する。この粒子は上記抗原の輸送に有用である。この粒子は、結晶性又は部分的結晶性のポリマーの使用によりラメラ特性を有するために大きさの制御が不可能であるという欠点を有する。実際、予防接種用の粒子はサブミクロンサイズでなければトランスフェクション及び免疫に有効ではない。
【００１０】
特許文献２及び３中には、抗原を吸着するポリラクチド又はＰＬＧに基づく微粒子、及び、その使用による免疫応答刺激について記載する。これら特許出願中の抗原吸着微粒子は全て、微粒子のコロイド安定性を維持する界面活性剤及びポリ（ビニルアルコール）等の安定化剤をポリマー粒子調製時に使用して得たものである。これにより得た微粒子には、微粒子中の界面活性剤及び安定化剤により毒性を有するという欠点がある。
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９７／０２８１０
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ９８／３３４８７
【特許文献３】国際特許出願ＷＯ００／０６１２３
【非特許文献１】Ｍｏｏｒｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１７４１−１７４９（１９９５）
【非特許文献２】Ｖｏｒｄｅｍｅｉｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３−１５７６−１５８２（１９９５）
【非特許文献３】Ｒｏｃｋ Ｋ．Ｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＭＨＣ Ｉ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ａｇ，ＰＮＡＳ（１９９３）
【非特許文献４】Ｅｌｄｒｉｇｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：２９７８−２９８６（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本出願人は予想外にも、免疫応答の捕獲が要求される抗原性タンパク性物質が結合し、かつ、上記欠点を克服した、すなわち、ポリマー微粒子調製時に安定化剤及び界面活性化剤を使用せず、かつ、微粒子表面への抗原結合のための界面活性化剤を使用せずにコロイド安定性を損なうことなく調製するために毒性のない、上限ミクロンサイズの球状非ラメラ生体再吸収性微粒子を取得可能であることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明の第一の主題は、
タンパク性物質が結合する生体再吸収性微粒子の調製方法であって、以下の段階：
（ｉ）安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから上記微粒子を調製する段階、並びに、
（ｉｉ）界面活性剤を使用せず、段階（ｉ）で得た微粒子に上記タンパク性物質を結合させる段階：を含む
ことを特徴とする方法である。
【００１３】
本発明の方法により得た微粒子は安定化剤及び界面活性剤を使用しない点で新規である。
【００１４】
従って本発明の別の主題は、本発明の方法により取得可能な、タンパク性物質が結合する生体再吸収性微粒子である。
【００１５】
例外なく、本発明の粒子はコロイド安定性を保持する。
【００１６】
本発明の微粒子は細胞性応答及び液性応答の両方の刺激に有用であるため、治療及び診断の両方に有用である。
【００１７】
従って本発明の別の主題は、医療品調製用の、本発明の微粒子の使用、及び、本発明の微粒子を含む医薬組成物、特にワクチンである。
【００１８】
最後に本発明の別の主題は、上記微粒子に結合するタンパク性物質に関連する病状のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用の、本発明の微粒子の使用である。
【００１９】
予防接種用の微粒子はこれを摂取する生物に対して毒性を有してはならず、また同時に、そのコロイド安定性を保持する必要がある。
【００２０】
界面活性剤又は安定化剤を使用しない本発明の方法により例外なく上記粒子を取得可能である。
【００２１】
用語「微粒子」は、抗原提示細胞中に進入可能な上限ミクロンサイズ、好ましくは上限サブミクロンサイズの粒子の意味を意図する。
【００２２】
用語「上限ミクロンサイズ」は９９９μｍ以下、用語「上限サブミクロンサイズ」は９９９ｎｍ以下の大きさの意味を意図する。
【００２３】
微粒子の粒径は３μｍ以下であることが好ましい。本発明の粒子はサブミクロンサイズであることがより好ましく、好ましくは直径１５０〜９００ｎｍ、より好ましくは直径２５０〜７００ｎｍである。
【００２４】
例えば走査型電子顕微鏡、準弾性光散乱又は透過型電子顕微鏡等の当業者に公知の技術により上記粒子の大きさを容易に測定する。
【００２５】
用語「毒性微粒子」は、上記微粒子を摂取した生物において代謝障害等の生物学的障害を誘導可能な少なくとも一種の化合物を含む微粒子の意味を意図する。
【００２６】
本発明の方法の第一段階は、安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから上記微粒子を調製することを含む。
【００２７】
用語「生体再吸収性ポリマー」は、これを導入した生物において天然の経路により排出可能な化合物に分解可能なポリマーの意味を意図する。このポリマーは非晶質、わずかに結晶性又は結晶性であってよい。
【００２８】
この生体再吸収性ポリマーの例としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル及びポリ無水物が含まれるがこれらに限定されない。好ましくは、本発明の方法で使用する生体再吸収性ポリマーはポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＡと呼ばれる）、ポリ（グリコール酸）（ＰＬＧ）等のポリ（α−ヒドロキシ酸）、又は、ポリ（Ｄ−及びＬ−乳酸）の混合物、ポリ（Ｌ−乳酸）及びポリ（グリコール酸）の混合物、ポリ（Ｄ−乳酸）及びポリ（グリコール酸）の混合物若しくはポリ（Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸）及びポリ（グリコール酸）の混合物等のポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物であり、これらは本発明の一実施形態である。
【００２９】
本発明の方法で使用するポリマーがポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物である場合、各成分の割合は当業者が容易に決定可能である。従って例えばポリ（Ｄ−及びＬ−乳酸）のラセミ混合物又はＰＬＡ／ＰＬＧ混合物を当業者に公知の種々の割合で使用可能である。
【００３０】
少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーからの本発明の微粒子の調製は、安定化剤及び界面活性剤を使用しない、当業者に公知の任意の微粒子調製法でも実施可能である。実際、本発明の方法の段階（ｉ）はこれらの剤を使用しないことを特徴とする。
【００３１】
微粒子調製法で通常使用する安定化剤には、例えばポリ（ビニルアルコール）、プルロニック（ポリ（エチレンオキサイド）及びポリ（プロピレンオキサイド）のコポリマー）、及び、臭化セチルトリメチルアンモニウム又はドデシル硫酸ナトリウム等のカチオン性又はアニオン性界面活性剤が含まれる。
【００３２】
言うまでもなく、先行技術の方法において安定化剤として界面活性剤を使用する場合には更なる界面活性剤を使用しない。
【００３３】
先行技術の方法で通常使用する界面活性剤は広く当業者に公知であり、例えば国際特許出願ＷＯ９８／３３４８７中に記載される。
【００３４】
安定化剤及び界面活性剤を使用しない微粒子調製法の例としては、透析、溶媒置換、乳化−溶媒蒸発及び乳化−拡散を挙げることができ、これらの方法は広く当業者に公知である。
【００３５】
例えば、本発明の微粒子調製時の透析は、生体再吸収性ポリマーをアセトン、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ等の水混和性溶媒中に濃度０．１質量％〜１０質量％で溶解した溶液を使用し、千倍容量の水に対して１２時間かけて実施可能である。
【００３６】
本発明の方法の第二段階は、界面活性剤を使用せず、本方法の第一段階で得た微粒子にタンパク性物質を結合させることである。
【００３７】
タンパク性物質を微粒子表面に結合させるこの段階は界面活性剤を使用せずに実施することが特徴である。実際、予想外にも、界面活性剤が存在しない場合でも本発明の微粒子はコロイド安定性を示し、粒子の大きさを免疫に好適な範囲内とする。
【００３８】
微粒子表面にタンパク性物質を結合させるのに通常使用する界面活性剤の例としては、上記界面活性剤を挙げることができる。
【００３９】
本発明の方法の段階（ｉ）で得た微粒子の表面に結合するタンパク性物質は、免疫応答の捕獲が望まれる任意のタンパク性物質であってよい。
【００４０】
用語「免疫応答」は、細胞性応答、液性応答又はその両方の意味を意図する。
【００４１】
用語「細胞性応答」は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球が媒介する応答の意味を意図する。この応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球による細胞溶解活性の誘導により、及び／又は、サプレッサーＣＤ８＋Ｔリンパ球による、若しくは、ヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生により反映される。
【００４２】
用語「液性応答」は、Ｂリンパ球が分泌する抗体分子が媒介する応答の意味を意図する。
【００４３】
本発明の目的に好適なタンパク性物質は、ウイルス又は細菌等多種に由来するものであってよい。
【００４４】
このタンパク性物質の例としては例えば、抗原及びエピトープ、又は、微粒子への結合後に抗原の役割を有する任意のタンパク性物質を挙げることができる。
【００４５】
抗原は、免疫応答により合成が誘導される抗体により認識可能な分子であり、かつ、少なくとも一種のエピトープを含む。抗原は、タンパク質そのもの、又は、目的の構造が保存されたタンパク質断片であってよい。
【００４６】
エピトープはアミノ酸を３〜１５個、概して５〜１５個含むペプチドであり、上記と同様に目的の構造が保存されている。
【００４７】
本発明の特定の実施形態によれば、タンパク性物質はウイルス由来の抗原である。
【００４８】
タンパク性物質がウイルス由来である場合、好適なウイルスは、免疫応答可能な物質が知られる任意のウイルスである。
【００４９】
その例としては、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型感染ウイルス（ＨＣＶ）等の肝炎ウイルス、パピローマウイルス（ＨＰＶ）、並びに、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５０】
本発明の目的に好適なウイルスの核酸配列、及び、この配列がコードするタンパク質は当業者に公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースで入手可能である。
【００５１】
従って、例えばＨＩＶウイルスはウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を有する。ｇａｇ遺伝子は、ｐ２４抗原を含むビリオンの核を形成するタンパク質をコードする。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写（逆転写酵素）、切断（プロテアーゼ）及び組み込み（インテグラーゼ）を担う酵素をコードする。ｅｎｖ遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、ウイルス遺伝子の発現調節に関与するタンパク質（調節タンパク質）をコードする六つの他の遺伝子（ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ及びｖｐｕ（ＨＩＶ−１）又はｖｐｘ（ＨＩＶ−２））を含む。ＨＩＶゲノムはウイルス遺伝子の発現に関与する調節因子を含有する５’及び３’ＬＴＲ（ロングターミナルリピート）も含む。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、本発明の方法で使用するタンパク性物質はＨＩＶウイルス抗原である。ＨＩＶウイルス抗原は調節タンパク質又はｐ２４タンパク質であることが好ましく、好ましい調節タンパク質はＴａｔ、Ｒｅｖ又はＮｅｆタンパク質である。
【００５３】
ＨＣＶについて、そのゲノムの５’末端は、構造タンパク質、ヌクレオキャプシドコアタンパク質、２つのエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、並びに、ｐ７と呼ばれる低分子タンパク質をコードする遺伝子に隣接する非翻訳領域に対応する。５’非翻訳領域及びコア遺伝子は種々の遺伝子型で比較的よく保存されている。Ｅ１及びＥ２エンベロープタンパク質は、各単離体により異なる領域によりコードされる。ｐ７タンパク質は非常に疎水性の高いタンパク質であり、イオンチャネルを構成すると考えられる。ＨＣＶゲノムの３’末端は、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）をコードする遺伝子、及び、よく保存されたドメインを有する３’非コード領域を含む（Ｍａｊｏｒ ＭＥ，Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ ＳＭ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ １９９７，２５（６）：１５２７−１５３８）。
【００５４】
ＨＣＶのＮＳ３非構造タンパク質は次の二つの異なる構造ドメインを含むアミノ酸６３０個のタンパク質である：ウイルスタンパク質の成熟に関与する活発なセリンプロテアーゼ活性を有するアミノ酸８１個のＮ末端ドメイン（ＮＳ３プロテアーゼと呼ばれるドメイン）、及び、ウイルスゲノムの複製時に機能するＮＴＰａｓｅ活性に関与するヘリカーゼ活性を含むアミノ酸５４９個のＣ末端ドメイン（ＮＳ３ヘリカーゼと呼ばれるドメイン）。このＮＳ３タンパク質は種々のウイルス遺伝子型で比較的よく保存され、目的の「ワクチン候補」抗原を構成する。
【００５５】
本発明の一実施形態において、目的のタンパク性物質はＨＣＶの抗原タンパク質、好ましくは非構造タンパク質、より好ましくはＮＳ３タンパク質、特に好ましくはＮＳ３ヘリカーゼタンパク質である。
【００５６】
本発明の目的に好適なタンパク性物質は以下の段階：
−目的のタンパク性物質をコードするヌクレオチド配列で形質転換した微生物又は真核生物細胞を培養する段階、並びに、
―上記微生物又は真核生物細胞が産生した上記タンパク性物質を回収する段階：を含む遺伝子工学技術により取得可能である。
【００５７】
上記技術は当業者に公知である。詳細は次のマニュアルを参照可能である：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉ，Ｅｄｉｔｏｒｓ Ａｌｅｓ Ｐｒｏｋｏｐ，Ｒａｓｋｅｓｈ Ｋ Ｂａｊｐａｉ；Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｅｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６４６，１９９１。
【００５８】
目的のタンパク性物質が小さい場合には、当業者に公知の従来のペプチド合成によっても調製可能である。
【００５９】
タンパク性物質の生体再吸収性微粒子への結合は当業者に公知の任意の方法で実施可能である。
【００６０】
上記結合の例としては、吸着、共有結合、及び、キトサン等の微粒子表面に付着した多糖ポリマーを介する結合が含まれる（この場合、タンパク性物質は吸着によりキトサンに結合する）。
【００６１】
吸着は例えば、微粒子をタンパク性物質と混合し、（例えば常温又は３７℃で）撹拌しながらインキュベートすることにより実施可能である。
【００６２】
タンパク性物質の微粒子表面への共有結合は、例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９６、及び、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９１に記載のもの等、文献中で公知の技術及び試薬の使用により実施可能である。
【００６３】
特定の一実施形態において、タンパク性物質の微粒子への結合は吸着により実施される。
【００６４】
本発明の方法で調製した、タンパク性物質が結合する生体再吸収性微粒子は、安定化剤及び界面活性剤を含まないため新規であり、本発明の別の主題を構成する。
【００６５】
本発明の微粒子は、タンパク性物質により免疫応答を誘導可能であり、かつ、毒性がないため、微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状の治療に有用な医薬組成物、特にワクチンの調製に特に好適である。
【００６６】
従って、本発明の別の主題は、医薬品を調製するための本発明の生体再吸収性微粒子の使用である。
【００６７】
特に、本発明の微粒子の使用により調製した医薬品は、例えばＨＩＶ若しくはＨＣＶウイルス又は他の任意の公知のウイルス等のウイルスにより生じる感染の阻害、予防又は治療に特に有用であり、本発明の別の実施形態を構成する。
【００６８】
また本発明は、本発明の少なくとも一種の微粒子、及び、適切な場合には医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物、特にワクチンにも関する。
【００６９】
本発明の医薬組成物は経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所的、部分的、気管内、鼻腔内、経皮、直腸、眼内又は耳介内投与に好適であり、上記有効成分は単位投与形態で投与可能である。
【００７０】
単位投与形態は、例えば錠剤、ゼラチンカプセル、顆粒、粉末、注射用経口溶液若しくは懸濁液、経皮パッチ、舌下、頬内、気管内、眼内、鼻腔内若しくは耳介内投与形態、吸入投与形態、局所的、経皮、皮下、筋肉内若しくは静脈内投与形態、直腸投与形態、又は、インプラントであってよい。局所投与としてはクリーム、ゲル、軟膏、ローション又は眼用ローションが考えられる。
【００７１】
これらの医薬形態を当該分野における通常の方法により調製する。
【００７２】
言うまでもなく、当業者であれば、医薬組成物の成分及び単位投与形態に応じて好適な賦形剤及び微粒子の使用量を容易に決定可能である。
【００７３】
上記投与形態は、医薬形態より有効成分を一日０．００１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ投与可能な投与量を含有する。
【００７４】
高投与量又は低投与量が好適であるような特定の場合もあってよく、このような投与量は本発明の範囲を逸脱しない。通常の手法により、個々の患者にとって好適な投与量を医師は投与方法並びに患者の体重及び応答に応じて決定する。
【００７５】
本発明の別の実施形態によれば、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物の患者への投与を特徴とする、本発明の微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状の治療方法にも関する。
【００７６】
本発明の微粒子により抗体の取得も可能であり、これは本発明の別の主題を構成する。
【００７７】
本発明による抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体が好ましい。
【００７８】
上記ポリクローナル抗体の取得は、少なくとも一種の本発明の微粒子で動物を免疫し、続いて、上記動物の血清を採取して、（特に、所望の抗体（特に本発明の微粒子の抗体）によって特異的に認識される抗原を付着させたカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより）他の血清成分から上記抗体を分離し、上記抗体を精製した状態で回収することによって実施可能である。
【００７９】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術により取得可能であり、その一般的な原理を以下に挙げる。
【００８０】
まず動物を、一般的にはマウス（又は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫の場合は培養細胞）を、本発明の少なくとも一種の微粒子で免疫する。これにより、Ｂリンパ球が上記微粒子のタンパク性物質に対する抗体を産生可能である。次に、この抗体産生リンパ球を「不死」骨髄腫細胞（例示におけるネズミ細胞）と融合し、ハイブリドーマを作成する。得た異種細胞混合物から、特異的抗体を産生可能、かつ、無限に増殖可能な細胞を選択する。ハイブリドーマをそれぞれクローンとして複製し、それぞれによりモノクローナル抗体を作成し、本発明の微粒子に対する認識特性を（例えば、ＥＬＩＳＡにより、一次元若しくは二次元イムノブロッティングにより、免疫蛍光法により、又は、バイオセンサーの使用により）試験可能である。その後、選択したモノクローナル抗体を、特に上述のアフィニティークロマトグラフィー法により精製する。
【００８１】
本発明の微粒子及び抗体は、上記微粒子表面に結合したタンパク性物質に関与する病状の診断にも有用である。
【００８２】
具体的には、検体の捕獲又は検出用のパートナーを使用するＥＬＩＳＡ方法等の任意の診断技術において、検体の捕獲又は検出用のパートナーとして本発明の微粒子又は抗体を使用可能である。例えば、検体として抗原の探索を意図する場合にはこの抗原が結合した微粒子から得た本発明の抗体を使用し、また、抗体の探索を意図する場合には本発明の微粒子を使用する。後者において、診断試験に固体支持体の使用を必要とする場合には、微粒子は上記のように機能してもよいししなくてもよい。
【００８３】
従って、本発明の別の主題は本発明の生体再吸収性微粒子又は抗体からなる診断用組成物である。
【００８４】
また本発明の別の主題は、生体再吸収性微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用の上記診断用組成物の使用にも関し、一実施形態において、病状はＨＩＶウイルス又はＨＣＶウイルス等により生じるウイルス感染であってよい。
【００８５】
繰り返すが、当業者であれば、使用する診断技術に応じて使用する微粒子又は抗体の量を容易に決定可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
本発明は、以下の例示及び付随の図１〜９によってより詳細に理解されるであろう。ただし、本発明はこれらの例示には制限されない。
【００８７】
図１は、コントロールとしてのＨＣＶ ＮＳ３ＮＳ４ポリタンパク質に対応するＤＮＡ配列（図１Ａ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質及びフロイントアジュバント（図１Ｂ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質（図１Ｃ）で、タンパク性物質を使用せずＰＬＡ微粒子（図１Ｄ）で、及び、ポリマーがＰＬＡかつタンパク質基質がＮＳ３ヘリカーゼペプチドである本発明の微粒子（図１Ｅ）でマウスを免疫することによるＣＴＬアッセイの結果を示す。
【００８８】
図２は、免疫前血清、及び、本発明の粒子ＰＬＡ−ｐ２４を皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）注射したウサギ６匹（Ｌ１〜Ｌ６）の免疫血清中の抗ｐ２４ ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡアッセイで調べたヒストグラムを表す。
【００８９】
図３は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより得たヒストグラム（四回の実験の平均＋／−標準偏差）を表し、これは、抗原を使用しない刺激後における（培地、ネガティブコントロール、黒色のヒストグラム）、ｐ２４による刺激後における（灰色のヒストグラム）、又は、ＰＭＡイオノマイシンカップルによる刺激後における（外枠ヒストグラム）、免疫後日数に対する細胞１００万個当たりのスポット数を示す。
【００９０】
図４は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴにより得たヒストグラムを表し、これは、ｐ２４タンパク質（黒色のヒストグラム）又はペプチド（灰色のヒストグラム）のいずれかによる刺激後の、総ＰＢＭＣ画分中の、抗ＣＤ４抗体存在下の総ＰＢＭＣ画分中の、ＣＤ４＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ４− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ４＋豊富画分（ＣＤ４＋ ＰＢＭＣ）中の、並びに、ＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ８− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ８＋豊富画分（ＣＤ８＋ ＰＢＭＣ）中のスポット数を示す。
【００９１】
図５は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したサルＭ２においてＥＬＩＳＡにより得た、連続して血清を採取した日に対する抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示すヒストグラムを表す。
【００９２】
図６は、ＳＲＤＣ細胞で免疫し、かつ、ネガティブコントロール（Ｃｔ１及びＣｔ２）で、又は、ｐ２４タンパク質（ｐ２４−１及びｐ２４−２）で、又は、ネガティブコントロール微粒子（ＮａｎｏＯｖａｌ及びＮａｎｏＯｖａ２）で、又は、本発明の微粒子（Ｎａｎｏｐ２４−１及びＮａｎｏｐ２４−２）で感作したマウスの免疫前血清中において、一回目の免疫後の血清中において、二回目の免疫後の血清中において、及び、三回目の免疫後の血清中においてＥＬＩＳＡにより得たＯＤ値を示すヒストグラムを表す。
【００９３】
図７は、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【００９４】
図８は、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を、局所細胞性応答について膝窩節細胞において（図８Ａ）及び全身細胞性応答について脾臓細胞において（図８Ｂ）示すグラフを表す。
【００９５】
図９は、マウスで使用した免疫原（すなわちＮＳ３ｈ−ＰＢＳ）の量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する細胞増殖指数（ＲＰＩ）を、刺激をしない脾臓細胞において（０）、ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後において（１）、又は、タンパク質及び抗ＣＤ４＋抗体による刺激後において（１＋ａＣＤ４）示すヒストグラムを表す。
【実施例１】
【００９６】
透析による本発明の微粒子の調製
１．ＰＬＡ粒子の調製
モル質量５２０００ＤａのＰＬＡ５０（ポリ（Ｌ−乳酸）５０％及びポリ（Ｄ−乳酸）５０％）（Ｐｈｕｓｉｓ（登録商標））を使用した。
【００９７】
このＰＬＡをＤＭＳＯ（Ｐｒｏｌａｂｏ（登録商標））中に溶解し、ＰＬＡが溶液総重量の２％となるようにした。その後、ＰＬＡの有機溶液を孔の大きさが１５０００Ｄａである透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標））中に導入し、二回蒸留した水（４Ｌ，ＭｉｌｌｉＱ（登録商標））の水浴中にこの組み合わせを６時間入れ、その間水浴を撹拌して１時間毎に規則的に取り替えた。最後の透析浴を一晩継続して、粒子を沈殿として得た。
【００９８】
翌日、ＰＬＡ粒子の溶液を回収して４℃で保存した。
【００９９】
得た粒子の大きさ、多分散指数及び電荷をＺｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ ＨＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により調べた。また、秤量後に計算「（乾燥抽出物の質量／湿潤抽出物の質量）×１００」により固形物含有量を調べた。
【０１００】
２．粒子ＰＬＡ／ｐ２４の調製
ＨＩＶ−１ ｐ２４タンパク質を大腸菌において組換え体として調製し、Ｃｈｅｙｎｅｔ Ｖ．，ら（１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，４：３６７−３７２）の方法により金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０１０１】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径５１５．７＋／−６．７ｎｍ、固形物含有量１．１％及び多分散指数０．２４２＋／−０．０１３である。
【０１０２】
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ４．７、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｍ＝１５．６０ｇ／Ｌ）１０ｍＬ及び０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９．２、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｍ＝１７．７９ｇ／Ｌ）１．１ｍＬを混合し、水で１／１０に希釈することにより、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．７）を調製した。
【０１０３】
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．７）中に０．６ｇ／Ｌに希釈したｐ２４タンパク質２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温にてホイール（ｗｈｅｅｌ）上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着ｐ２４量をアッセイし（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したｐ２４の濃度が０．２ｇ／Ｌであると推定した。
【０１０４】
３．ＰＬＡ／Ｔａｔ微粒子の調製
Ｐｅｌｏｐｏｎｅｓｅ Ｊ．Ｐ．，ら（１９９９，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（１７）：１１４７３−１１４７８）記載の方法により合成した配列番号１のＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質を使用した。
【０１０５】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径４２０．１＋／−１０．７ｎｍ、固形物含有量１．０２％、及び、多分散指数０．２４１＋／−０．０４０である。
【０１０６】
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９．２）１３．８ｍＬを使用した以外は上記項目２中と同様に調製した、脱気した１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）中に０．４ｇ／Ｌに希釈したＴａｔタンパク質２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温にてホイール上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着Ｔａｔを定量し（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したＴａｔの濃度が０．１ｇ／Ｌであると推定した。
【０１０７】
４．ＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子の調製
以下のように組換え体で得た配列番号２のＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼペプチドを使用した。
【０１０８】
ヘキサヒスチジンと融合したＨＣＶ ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメインに対応する１１９２〜１４５８番目のアミノ酸をコードする遺伝子を原核生物発現ベクターｐＭＨ８０中にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９菌（プロメガ社）中で発現させた。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（プロメガ社））１ｍＭで３時間誘導後、３０℃で組換えタンパク質を発現させた。遠心後、バッファー溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、抗プロテアーゼ錠（ベーリンガー社）１錠、２５０Ｕベンゾナーゼ（メルク社））中での超音波処理により菌を溶解した。溶解及び遠心後、可溶性画分をＮｉアガロースカラムで精製し、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び３００ｍＭイミダゾールを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ７．２）中で溶出した。その後、純粋なタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析した。精製後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下のアクリルアミドゲル電気泳動及び質量分析によりタンパク質を調べた。ＮＳ３タンパク質ヘリカーゼドメインの純度は９５％を超えると推測される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＬＡＬ及び機能アッセイによるエンドトキシン（ＬＰＳ）の定量によって、エンドトキシンが存在しないことを確認した。
【０１０９】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径約６００ｎｍ、固形物含有量１％、及び、多分散指数０．２である。
【０１１０】
０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ９．２）６．８ｍＬを使用した以外は上記項目２中と同様に調製した、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中に０．３２７ｇ／Ｌに希釈したＮＳ３ヘリカーゼペプチド２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温にてホイール上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着ＮＳ３ヘリカーゼを定量し（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したＮＳ３ヘリカーゼの濃度が０．２８ｇ／Ｌであると推定した。
【実施例２】
【０１１１】
溶媒置換による本発明の微粒子の調製
１．ＰＬＡ粒子の調製
モル質量５２０００ＤａのＰＬＡ５０（ポリ（Ｌ−乳酸）５０％及びポリ（Ｄ−乳酸）５０％）（Ｐｈｕｓｉｓ（登録商標））を使用した。
【０１１２】
このＰＬＡをアセトン中に溶解し、ＰＬＡが溶液総重量の２％となるようにした。その後ＰＬＡのアセトン溶液を水３５ｍＬ中に滴下し、減圧下で３５分間かけて溶媒を蒸発させた。
【０１１３】
得た粒子の大きさ、多分散指数及び電荷をＺｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ ＨＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により調べた。また、秤量後に計算「（乾燥抽出物の質量／湿潤抽出物の質量）×１００」により固形物含有量を調べた。
【０１１４】
２．ＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子の調製
上記実施例１項目４中に示すように組換え体で得た配列番号２のＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼペプチドを使用した。
【０１１５】
上記項目１中と同様に調製したＰＬＡ微粒子は粒径約２５０ｎｍ、固形物含有量１％及び多分散指数０．３である。
【０１１６】
０．１Ｍ ＰＢＳバッファー（ｐＨ９．２）６．８ｍＬを使用した以外は上記項目１中と同様に調製した、ＰＢＳバッファー（リン酸緩衝化生理食塩水バッファー；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．１）中に０．３２７ｇ／Ｌに希釈したＮＳ３ヘリカーゼペプチド２００μＬを微粒子２００μＬと混合し、常温においてホイール上で一晩撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去し、非吸着ＮＳ３ヘリカーゼを定量し（Ｐｉｅｒｃｅ社より入手のＢＣＡタンパク質アッセイキット）、この値から、微粒子に吸着したＮＳ３ヘリカーゼの濃度を０．３４ｇ／Ｌと推定した。
【実施例３】
【０１１７】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるマウスの免疫
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１１８】
２．投与した免疫原
本実験においては、ｐ２４タンパク質単独、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４、及び、油中水型エマルションの形態で調製したｐ２４−フロイントアジュバント（シグマ社）組成物（ポジティブコントロール）（免疫能力が良好であることが知られる）を使用した。
【０１１９】
３．免疫
上記項目２に記載の免疫原を連続して三回（各４０μｇ又は１０μｇ）、０、２及び４週目にマウスに摂取させた。注射は全て皮下で実施した。
【０１２０】
三回目に注射して１０日後（Ｄ３８）、１４日後（Ｄ４２）又は４２日後（Ｄ７０）後に動物を屠殺し、血液及び脾臓を採取して免疫学的分析に供した。
【０１２１】
４．免疫学的分析
液性応答及び細胞性応答を以下のように調べた：
−液性応答：屠殺前にマウスの血液試料を採取した。ＥＬＡＳＡにより抗ｐ２４抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ）が存在することを決定した。ｐ２４タンパク質により捕獲し、抗マウスポリクローナル抗体を検出抗体として使用して血清中に特異的抗体が存在することを明らかとした（この抗体は、所望の抗体に結合し、各々、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１ヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号１０７０−０５、アメリカ合衆国アラバマ州バーミンガム）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号１０８０−０５）、及び、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５−０３５−０６２）である）。力価は希釈度の逆数であり、この値について、使用したＥＬＩＳＡプロトコルで０．３ＯＤ単位の吸光度を得る。ＩｇＧ２ａ：ＩｇＧ１イソタイプの比率についてもＥＬＩＳＡにより間接的に決定し、免疫応答のＩＦＮ−γ−ＩＬ−４の傾向（各々Ｔｈ１−Ｔｈ２）の判断を可能とした。
−細胞性応答：マウス屠殺後に脾臓を無菌的に摘出して、細胞懸濁液を調製した。得た細胞懸濁液について、マウスそれぞれ個々について以下の分析を実施した。
【０１２２】
（ｉ）ＣＴＬアッセイ：免疫優性Ｈ−２Ｋｄ制限ＣＴＬエピトープに対応する９量体ペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ，配列番号３）、及び、ＩＬ−２を含む培地中に細胞懸濁液を入れた。５日後、ペプチドを負荷した無処理照射細胞でエフェクター群を再刺激した。７日後に細胞傷害性エフェクター群を回収し、５１Ｃｒ標識Ｐ８１５細胞を標的としてＣＴＬ活性を測定した。
【０１２３】
（ｉｉ）ＥＬＩＳＰＯＴ：ＥＬＩＳＰＯＴにより、特異的刺激に応答して所定のサイトカインを分泌する細胞数の決定が可能である。本出願人らは、サイトカインＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）に着目した。脾臓から採取した細胞懸濁液をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩで２０時間再刺激し、ＣＤ８型の応答を調べた。
【０１２４】
ＰＶＤＦ膜（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＩＰ，ミリポア社）を備えた９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗ＩＦＮ−γ抗体で被覆した。再刺激中、脾臓細胞懸濁液をこのプレート中でインキュベートして、各細胞が分泌したサイトカインを捕獲した。目的のサイトカインを分泌する各細胞に相当するスポットを、目的のサイトカインに対して特異的なビオチニル化検出抗体で可視化した。
【０１２５】
（ｉｉｉ）増殖：ｐ２４タンパク質の存在下で脾臓細胞を５日間刺激した。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、免疫原（ｐ２４）に対する細胞性応答が増大する。
【０１２６】
５．結果
マウス１５匹（ブランチ当たりマウス５匹）に免疫原１０μｇを三回投与してＤ３８においてマウスを屠殺し、液性応答、ＣＴＬアッセイ及び細胞性応答としての増殖の調査により、第一シリーズの実験を実施した。
【０１２７】
結果を下記表１中に示す。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
ａ：ｃｐｍ値の平均（特異的刺激−培地による刺激）、ｃｐｍ＝１分当たりのカウント（ステューデント検定、Ｐ＝０．００２）
ｂ：ブランチの全マウス中、特異的ＣＴＬ活性を有するマウスの数
ｃ：ブランチのマウスの抗ｐ２４ ＩｇＧ１力価の数値平均
【０１３０】
この表は以下を示す：
−ｐ２４タンパク質単独又はフロイントアジュバントと比較して、本発明のｐ２４／ＰＬＡ微粒子により増殖応答が増強されたこと、
−免疫原のいずれによってもＣＴＬ活性は検出されないこと、及び、
−本発明のｐ２４／ＰＬＡ微粒子によって、ｐ２４単独投与の場合より非常に優れた特異的抗体力価を取得可能であり、得た応答はｐ２４／フロイントアジュバントの組合せで得た抗体力価と同等であること。
【０１３１】
免疫原の割合を４０μｇとしてマウスをＤ４２（マウス３匹）又はＤ７０（マウス４匹）において屠殺した以外は上記と同様に、マウス１３匹（ブランチ当たりマウス３又は４匹）について実験を実施した。
【０１３２】
結果を下記表２中に示す。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
ａ：（２０時間に渉る特異的刺激（ペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）に応答してＩＦＮ−γを分泌する細胞数）／（全細胞１０６個）の平均
ｂ：ブランチの全マウス中、特異的ＣＴＬ活性を有するマウスの数
ｃ：ブランチのマウスの抗ｐ２４ ＩｇＧ１力価の数値平均
【０１３５】
表中の結果は以下を示す：
−表１中に示す抗体力価と表２中に示す抗体力価とを比較すると、投与量を１０μｇから４０μｇに増やすと匹敵する結果を提供可能であること、並びに、
−マウスの屠殺を後に延ばすことにより最後の注射後に長時間応答させることによって、２４／ＰＬＡ群の全マウスにおけるＣＴＬ応答、及び、ＥＬＩＳＰＯＴによる、増強された抗体力価の項目における応答を証明可能であること。
【実施例４】
【０１３６】
本発明の微粒子ＰＬＡ／Ｔａｔによるマウスの免疫
上記実施例１項目３中と同様に調製した微粒子ＰＬＡ／Ｔａｔ、Ｔａｔタンパク質単独、及び、油中水型エマルションの形態で調製したＴａｔタンパク質／フロイントアジュバント（シグマ社）の組み合わせを免疫原として使用し、各々２０μｇ注射し、液性応答についてはＴａｔタンパク質を捕獲パートナーとして使用し、上記実施例３項目４中に示すマウスポリクローナル抗体を検出パートナーとして使用し、液性応答については、ＣＤ８型応答の分析用に後述の６つのペプチドのいずれかを２０時間、又は、ＣＤ４型応答の分析用にＴａｔタンパク質を４２時間、刺激体として使用してＥＬＩＳＰＯＴアッセイのみを実施した以外は、実施例３中に示す手法と同様に実施した。
【０１３７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで使用したペプチド（Ｓｙｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）
ＣＦＨＣＱＶＣＦＴＫＫＧＬＧＩ（配列番号４）
ＶＣＦＴＫＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫ（配列番号５）
ＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲ（配列番号６）
ＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＳＰＱ（配列番号７）
ＫＲＲＱＲＲＲＳＰＱＤＳＥＴＨ（配列番号８）
ＲＲＳＰＱＤＳＥＴＨＱＶＳＬＳ（配列番号９）
【０１３８】
結果を下記表３に示す。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
ａ：（２０時間に渉る特異的刺激（ペプチドのプール）に応答してＩＦＮ−γを分泌する細胞数）／（全細胞１０６個）の平均
ｂ：（４２時間に渉る特異的刺激（Ｔａｔタンパク質）に応答してＩＦＮ−γを分泌する細胞数）／（全細胞１０６個）の平均
ｃ：ブランチのマウスの抗Ｔａｔ総ＩｇＧ力価の数値平均
ｄ：ブランチの全マウス中、特異的ＩｇＧ２ａ応答を有するマウスの数
ｅ：応答したマウスの抗Ｔａｔ ＩｇＧ２ａ力価の数値平均
【０１４１】
上記表３における結果は以下を示す：
−Ｔａｔタンパク質単独又はＴａｔ／フロイント組成物の注射に対して、本発明の微粒子の注射によりＩＦＮ−γ分泌細胞の誘導が可能であること、及び
−Ｔａｔタンパク質単独又はフロイントアジュバントの使用で得た力価約１０４と比較して、Ｔａｔタンパク質のＰＬＡへの結合は抗体力価（総ＩｇＧ）を約１ｌｏｇ増強可能であり、Ｔａｔ／ＰＬＡ微粒子の使用により、抗Ｔａｔ ＩｇＧ２ａの頻度及び力価を共に増強可能であること。
【実施例５】
【０１４２】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子によるマウスの免疫
１．動物モデル
ＨＬＡ−Ａ２分子を導入したＣ５７ＢＬ／６マウス１４匹について免疫実験を実施した（Ｐａｓｃｏｌｏ Ｓ，ら．（１９９７），Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１８５（１２），２０４３−２０５１）。
【０１４３】
２．投与した免疫原
本実験においては、ＮＳ３ＮＳ４核酸配列（配列番号１０）に対応する裸のＤＮＡをポジティブコントロールとして使用し、上記実施例１項目１及び４中と同様に調製したＮＳ３ヘリカーゼパプチド単独及びＰＬＡ粒子単独、油中水型エマルションの形態で調製したＮＳ３ヘリカーゼ／フロイントアジュバント（シグマ社）組成物、並びに、上記実施例１項目４中と同様に調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子を使用した。
【０１４４】
３．免疫
上記項目２に記載の免疫原を連続して三回、タンパク質の場合には各々５０μｇ、又は、裸のＤＮＡの場合には各々１００μｇの割合で、０、２及び４週目にマウスに摂取させた。裸のＤＮＡを筋肉内投与した以外は、注射は全て皮下で実施した。
【０１４５】
最初の注射から約７０日（Ｄ７０）後に動物を屠殺し、血液及び脾臓を採取して免疫学的に調べた。
【０１４６】
４．免疫学的分析
ＣＴＬ細胞性応答を以下のように調べた：マウス屠殺後に脾臓を滅菌的に摘出し、細胞懸濁液を調製した。ＮＳ３タンパク質に含まれるＣＴＬエピトープに対応するＫＬＶペプチド（ＫＬＶＡＬＧＶＮＡＶ、配列番号１１）及びＩＬ−２を含む培地に細胞懸濁液を入れた。５日後に、ペプチドを負荷した照射無処理細胞でエフェクター群を再刺激した。７日後に細胞傷害性エフェクター群を回収し、５１Ｃｒ標識Ｐ８１５細胞を標的としてＣＴＬ活性を測定した。
【０１４７】
５．結果
結果を図１中に示すが、この図はエフェクター／標的の比率に対する特異的溶解の割合を示すグラフを表し、図１ＡはコントロールとしてのＨＣＶ ＮＳ３ＮＳ４ポリタンパク質に対応するＤＮＡ配列の注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｂは微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼ／フロイントアジュバントの組み合わせの注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｃは微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼペプチドの注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｄはタンパク性物質を使用せずＰＬＡ微粒子の注射後に誘導された細胞性応答を示し、図１Ｅは本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子の注射後に誘導された細胞性応答を示す。
【０１４８】
上記グラフは、本発明のＰＬＡ／ＮＳ３微粒子の注射時に示された、ＮＳ３ヘリカーゼペプチドに対して特異的なＣＴＬ応答を示す。
【実施例６】
【０１４９】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるウサギの免疫
１．動物モデル
一回目の免疫時に体重約２．５ｋｇのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ株ウサギについて免疫実験を実施した。
【０１５０】
２．投与した免疫原
本実験においては、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明のＰＬＡ−ｐ２４微粒子、及び、油中水型エマルションの形態で調製し、免疫原性能力が良好であることが知られる（ポジティブコントロール）ｐ２４−フロイントアジュバント（シグマ社）組成物を使用した。
【０１５１】
３．免疫
上記項目２に記載の免疫原２００μｇを五回連続して、０、１、２、３及び４か月目にウサギに摂取させた。注射はいずれも皮下又は皮内で実施した。
【０１５２】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を追跡するために、動物の血液試料を規則的に採取した。その後、コンジュゲートの可視化をホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１１−０３５−００３）で置き換えた以外は、実施例３項目４中と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより抗ｐ２４抗体の存在を試験した。
【０１５３】
５．結果
結果を図２中に示すが、この図は、皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）いずれかで注射したウサギ６匹（Ｌ１〜Ｌ６）の免疫前血清及び免疫血清中の抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示す。力価は希釈度の逆数に対応し、この値について約０．１のＯＤを得る。免疫前血清は免疫原注射前にＤ０において採取し、免疫血清はＤ０の４か月後に採取した。
【０１５４】
得た結果は、抗原投与が皮下又は皮内のいずれであるかにかかわらず、本発明のＰＬＡ／ｐ２４粒子による免疫が全ての動物において良好な力価を示すことを示す。しかし、選択したモデルにおいては、皮内投与の方が皮下投与よりわずかに良好であるようである。着目すべきは、フロイントアジュバント／ｐ２４の免疫で得た力価は、ＰＬＡ／ｐ２４免疫で得た力価に実質的に匹敵するということである（２×１０７と５×１０６）。従って、微粒子ＰＬＡ／ｐ２４の使用により、ウサギにおいてポリクローナル血清を誘導可能である。
【実施例７】
【０１５５】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるマカク属サルの免疫
１．動物モデル
ＣＥＡに収容したカニクイザルについて免疫実験を実施した。
【０１５６】
２．投与した免疫原
本実験においては、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を使用した。
【０１５７】
３．免疫
カニクイザル２匹をＰＬＡ／ｐ２４（１匹当たり５００μｇ筋肉内投与）の注射により免疫した後、６週間後に同一の追加抗原を注射した。同一条件下で６か月後に三回目の注射を実施する。
【０１５８】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を追跡するために、０（最初に免疫した日）、２、４、６（追加抗原を注射した日）、８，１０及び１２週目にマカクザルの血液試料を採取した。その後、コンジュゲートの可視化をホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片マウス抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号２０９−０３５−０９８）で置き換えた以外は、上記実施例３項目４中と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより、抗ｐ２４抗体の存在を試験した。また、同一ＥＬＩＳＡフォーマットにより、抗ヒトＩｇＧ１（カタログ番号０５−３３２０、Ｚｙｍｅｄ）、抗ヒトＩｇＧ２（カタログ番号０５−０５２０、Ｚｙｍｅｄ）、抗ヒトＩｇＧ３（カタログ番号０５−３６２０、Ｚｙｍｅｄ）及び抗ヒトＩｇＧ４（カタログ番号０５−３８２０、Ｚｙｍｅｄ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体を使用し、存在するＩｇＧサブクラスを調べた。
【０１５９】
５．ＥＬＩＳＰＯＴによる抗ｐ２４細胞性応答の出現の観察
この手法により、最終濃度５μｇ／ｍＬでの４８時間の抗原刺激に応答してインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を分泌する細胞の数を決定可能である。新たに単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、予め低温保存したＰＢＭＣ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激したＰＢＭＣから、及び、（抗ＣＤ４抗体を使用して）ＣＤ４＋細胞又は（抗ＣＤ８抗体を使用して）ＣＤ８＋細胞を予め枯渇させたＰＢＭＣから誘導したＴリンパ球系列に対して、この手法を首尾よく使用した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社より入手のＭＡＣＳ試薬、ＣＤ４ミクロビーズ（カタログ番号１３０−０９１−１０２）及びＣＤ８ミクロビーズキット（カタログ番号１３０−０９１−１１２）を使用して、製造業者の指示に従い、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞を選別した。
【０１６０】
Ｔリンパ球の抗原活性化効果を模倣するＰＭＡ−イオノマイシンカップル（ＰＭＡは酢酸ミリスチン酸ホルボール）をポジティブコントロールとして使用した。
【０１６１】
ＰＶＤＦ膜（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ，ミリポア社）を備えた９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートを、滅菌ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬで添加した抗マカクザルＩＦＮ−γモノクローナル抗体のクローンＧＺ−４（Ｍａｂｔｅｃｈ，ｒｅｆ：３４２０Ｍ−３）で＋４℃において一晩かけて被覆した。その後プレートを洗浄して飽和させた。平行して、通常技術によりＦｉｃｏｌｌグラジエントでＰＭＢＣを血液試料から単離した。１ウェル当たり細胞１０５個を含む培地１００μＬ、及び、１ウェル当たり抗原源を含む培地１００μＬを入れた。実験によると、抗原源はｐ２４タンパク質又は後に定義するｇａｇペプチドのプールいずれかであり、それについては、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて陽性応答を取得可能であることをあらかじめ確認した。刺激に対するポジティブコントロールを産生するため、ＰＭＡ５０ｎｇ／ｍＬ及びイオノマイシン５００ｎｇ／ｍＬを入れたウェルに、１ウェル当たり細胞４×１０３個を含む培地２００μＬを入れた。その後、５％ＣＯ２の湿潤雰囲気中で３７℃において２４時間プレートをインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。その後、残存する細胞を氷冷水で１０分間処理して溶解し、プレートを再度洗浄した。その後、可視化抗体である、ヒトＩＦＮ−γに対するビオチニル化モノクローナル抗体のクローン７−Ｂ６−１（Ｍａｂｔｅｃｈ，ｒｅｆ：３４２０−６）を１ウェル当たり０．１μｇ添加した（３７℃で２時間、又は、４℃で一晩インキュベート）。エキストラビジン−アルカリホスファターゼ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質の添加によりスポットを可視化した。ｇａｇペプチドの配列は以下の通りである：
ＥＱＩＧＷＭＴＮＮＰＰＩＰＶＧ（配列番号１２）
ＷＭＴＮＮＰＰＩＰＶＧＥＩＹＫ（配列番号１３）
ＮＰＰＩＰＶＧＥＩＹＫＲＷＩＩ（配列番号１４）
ＰＶＧＥＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮ（配列番号１５）
ＩＹＫＲＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲ（配列番号１６）
ＷＩＩＬＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳＰ（配列番号１７）
ＧＬＮＫＩＶＲＭＹＳＰＴＳＩＬ（配列番号１８）
ＩＶＲＭＹＳＰＴＳＩＬＤＩＲＱ（配列番号１９）
ＹＳＰＴＳＩＬＤＩＲＱＧＰＫＥ（配列番号２０）
ＳＩＬＤＩＲＱＧＰＫＥＰＦＲＤ（配列番号２１）
ＩＲＱＧＰＫＥＰＦＲＤＹＶＤＲ（配列番号２２）
ＰＫＥＰＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴ（配列番号２３）
ＦＲＤＹＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡＥ（配列番号２４）
ＶＤＲＦＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳＱ（配列番号２５）
ＹＫＴＬＲＡＥＱＡＳＱＥＶＫＮ（配列番号２６）
ＲＡＥＱＡＳＱＥＶＫＮＷＭＴＥ（配列番号２７）
ＡＳＱＥＶＫＮＷＭＴＥＴＬＬＶ（配列番号２８）
ＶＫＮＷＭＴＥＴＬＬＶＱＮＡＮ（配列番号２９）
ＭＴＥＴＬＬＶＱＮＡＮＰＤＣＫ（配列番号３０）
ＬＬＶＱＮＡＮＰＤＣＫＴＩＬＫ（配列番号３１）
ＮＡＮＰＤＣＫＴＩＬＫＡＬＧＰ（配列番号３２）
【０１６２】
６．結果
６．１ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の証明
ＰＬＡ／ｐ２４調製物を摂取させ、かつ、ＰＢＭＣを刺激したマカクザル２匹（Ｍ１及びＭ２）についてのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を図３中に再度示すが、この図は、抗原を使用しない刺激後（培地、ネガティブコントロール、実線のヒストグラム）、ｐ２４による刺激後（点線のヒストグラム）、又は、ＰＭＡ−イオノマイシンカップルによる刺激後の、免疫後の日数に対する細胞１００万個当たりのスポット数を示すヒストグラム（４回の実験の平均＋／−標準偏差）を表す。各グラフ下の矢印は注射した時点を表す（Ｄ０及びＤ＋６週）。
【０１６３】
この結果は、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４により、試験動物２匹においてＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を誘導可能であることを示す。一匹目のサル（Ｍ１）のみが二回目の注射後に特異的な応答を生し、また、二匹目のサル（Ｍ２）は一回目の注射後に最初の試料を試験した際に既に応答を生じている。いずれの場合においても、得たＥＬＩＳＰＯＴ応答が高いことから、追加抗原注射の効果（追加抗原効果）は非常に大きい。また、得た応答は、非複製免疫原が関与すると仮定すると比較的持続する；応答は二回目の注射から約４０日後も有意な状態で持続する。
【０１６４】
６．２ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の性質
ＥＬＩＳＰＯＴ応答の性質により、エフェクター免疫細胞ＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれの型が、測定したＩＦＮ−γ分泌を担っているかを実証可能である。
【０１６５】
結果を図４中に示すが、この図は、総ＰＢＭＣ画分、抗ＣＤ４抗体存在下における総ＰＢＭＣ画分、ＣＤ４＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ４−ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ４＋豊富画分（ＣＤ４＋ＰＢＭＣ）、並びに、ＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ８−ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ８＋豊富画分（ＣＤ８＋ＰＢＭＣ）において、ｐ２４タンパク質（実線のヒストグラム）又はペプチド（点線のヒストグラム）のいずれかによる刺激後にＥＬＩＳＰＯＴで得たスポット数を示すヒストグラムを表す。着目すべきは、Ｍ１サルにおいて得た細胞の量は、抗ＣＤ８抗体を使用した枯渇実験の実施には不十分であったということである。
【０１６６】
図４で得た結果は、ＩＦＮ−γサイトカインは末梢血単核球のＣＤ４−画分及びＣＤ８−画分の両方により分泌されることを示す。更に、抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体（陽性選別画分）の存在下においてＥＬＩＳＰＯＴ応答はなく、このことは、これらの抗体はいずれも免疫応答を妨げることを示す。従って、この実験により、観察されたＩＦＮ−γ分泌はＣＤ４＋エフェクター細胞及びＣＤ８＋エフェクター細胞の両方によって媒介されると結論可能である。更に、この観察は、使用した抗原刺激がｐ２４タンパク質であるかｇａｇペプチドのプールであるかにかかわらずあてはまる。微粒子に基づく調製物によって霊長類において目的の抗原に特異的なＣＤ８＋応答を誘導できたのはこれが最初であると強調するのは重要である。
【０１６７】
６．３ 液性応答の分析
ＰＢＭＣに対する細胞性応答の分析と同時に、本出願人らは、サルから連続して採取した血清についての液性応答も分析する。２匹のうち、Ｍ２サルのみが抗体応答を発生し、この応答は二回目の注射後に抗ｐ２４ ＩｇＧ力価約１０５に達した。Ｍ１サルは２回のＰＬＡ／ｐ２４注射後に有意な抗体応答を示さず、力価は１０３未満のままであった。この結果はそれ程予想外のものではなく、その理由は、細胞性応答の分析中に本出願人らは、Ｍ１サルの応答は不十分であって、Ｍ２サルの場合より多数回注射しなければ免疫応答が生じないことを実証可能であったためである。
【０１６８】
Ｍ２サルにおけるＥＬＩＳＡアッセイの結果を図５中に示すが、この図は、連続して血清を採取した日におけるＭ２サルの抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示すヒストグラムを表す。これらの結果は第一に、本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によりマカクザルにおいて特異的抗体応答を誘導可能であり、第二に、応答の弱い個体においても応答を確実に誘導するためには、本出願人らが使用したプロトコルより１回又は２回多く注射する必要がおそらくあることを示す。
【０１６９】
６．４ 結論
カニクイザルモデルにおいて実施した３回の実験全てから、本発明の微粒子により、ヒト以外の霊長類においてＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞性応答並びに抗体応答で良好な免疫応答を誘導可能であることが示された。
【実施例８】
【０１７０】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４で感作させた樹状細胞によるマウスの免疫
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢である雌ＣＢＡ／Ｊ（Ｈ−２ｋ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１７１】
２．投与した免疫原
本実験においては、ＳＲＤＣ（Ｈ−２ｋ）ネズミ脾臓細胞系を使用し、試験する種々の免疫原を輸送した。この樹状細胞系は以下の免疫原の一種で１２時間感作させた：実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４（ｐ２４について換算してｐ２４／ＰＬＡ１０μｇ／ｍＬ）、同様に調製したＰＬＡ−ＯＶＡ微粒子（ネガティブコントロールとして）、又は、ｐ２４タンパク質。
【０１７２】
３．免疫
マウスを６匹ずつの４群に分けた。個々のマウスには感作ＳＲＤＣ細胞５×１０５個を０、２及び４週目に皮下摂取させた。４バッチのマウスに、非感作細胞（ネガティブコントロール）、又は、微粒子ＰＬＡ／ｐ２４若しくは微粒子ＰＬＡ／ＯＶＡ（微粒子ネガティブコントロール）若しくはｐ２４タンパク質で感作させた細胞のいずれかを摂取させた。
【０１７３】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を観察するために、免疫後１０日毎にマウスの血液試料を採取した。その後、先の実施例中の記載と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより抗ｐ２４抗体が存在するかどうかを試験した。
【０１７４】
５．結果
液性応答の分析を図６中に示すが、この図は、ネガティブコントロール（Ｃｔ１及びＣｔ２）で、又は、ｐ２４タンパク質（ｐ２４−１及びｐ２４−２）で、又は、微粒子ネガティブコントロール（ＮａｎｏＯｖａ１及びＮａｎｏＯｖａ２）で、又は、本発明の微粒子（Ｎａｎｏｐ２４−１及びＮａｎｏｐ２４−２）で感作させたマウスの、免疫前血清中の、一回目の免疫後の血清中の、二回目の免疫後の血清中の、及び、三回目の免疫後の血清中の、ＥＬＩＳＡで得たＯＤ値を示すヒストグラムを表す。
【０１７５】
結果は、ＳＲＤＣをＰＬＡ−ｐ２４微粒子で感作させる場合にのみＳＲＤＣ細胞の注射により抗体が誘導されることを示す。可溶性ｐ２４タンパク質による感作では免疫応答を取得不可能である。
【０１７６】
６．細胞性応答の実験
マウスから単離した脾臓及び粘膜リンパ球の両方を使用して実験した。刺激したＴリンパ球亜群の分析は、リンパ増殖及びサイトカイン分泌アッセイにより実施し、最後の免疫から２週間後に抗原に対する応答能力を調べた。
【０１７７】
リンパ増殖アッセイでは、脾臓から及び粘膜リンパ節から単離したＴリンパ球を、目的の抗原を種々の濃度で含む完全培地中に５日間入れておき、その後、３Ｈチミジンで１８時間放射標識した。チミジンの取り込み量はリンパ増殖応答の程度に対応する。
【０１７８】
サイトカイン分泌アッセイでは、脾臓から及び粘膜リンパ節から単離したＴリンパ球を、目的の抗原を種々の濃度で含む完全培地中に３日間入れておき、その後、培養上清中に分泌されたサイトカインを市販のＥＬＩＳＡキットでアッセイした。
【０１７９】
７．結果
下記表４中に得た結果をまとめる。
【０１８０】
【表４】
【０１８１】
上記のように、結果から、特異的免疫応答を表示可能な群はＳＲＤＣ−ＰＣＡ−ｐ２４群のみであることを示す。刺激指数は脾臓から単離した細胞では２．８であり、腸間膜リンパ節から単離した細胞では２．２である。他の群では、刺激指数の増加はないか、又は、有意ではない。同様に、Ｔｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌を誘導可能な群はＳＲＤＣ−ＰＬＡ−ｐ２４群のみである。抗原存在下におけるこの分泌は、脾臓細胞及び腸間膜リンパ節細胞の両方により実証可能である。
【０１８２】
８．結論
これらの実験全てから、本出願人らがＰＬＡ−ｐ２４微粒子により目的の抗原（この場合にはｐ２４）で樹状細胞を感作可能であることを実証可能であった。ＳＲＤＣ投与により（ＰＬＡ−ｐ２４を負荷した場合には）細胞性及び液性両方の特異的応答を誘導可能であるが、可溶性ｐ２４で感作させたＳＲＤＣは抗ｐ２４応答を誘導不可能である。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感作させた樹状細胞の移動に基づく免疫療法においてＰＬＡ微粒子を首尾よく使用可能である。目的の抗原を可溶性形態で樹状細胞に負荷できない場合、抗原を有するＰＬＡ微粒子により、樹状細胞による取り込みを促進可能である。本発明の微粒子により、得た特異的免疫応答を相当程度増強可能である。
【実施例９】
【０１８３】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子によるマウスの免疫：初期かつ局所的細胞性応答
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１８４】
２．投与した免疫原
本実験においては各免疫群当たりマウス５匹を使用した：ＮＳ３ヘリカーゼ遺伝子型１ｂタンパク質（ＮＳ３ｈ）単独、上記実施例１項目４中に記載の透析により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＹＳ）、上記実施例２項目２中に記載の溶媒置換により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＤＳ）、及び、エマルションの形態で調製し、かつ、市販のワクチン中でアジュバントであることが知られるＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ社）組成物（ポジティブコントロール）。
【０１８５】
３．免疫
上記項目２に記載した免疫原をマウスの足底肉趾皮下に一回（１００μｇ）投与した。
【０１８６】
最初の注射から１０日後にマウスを屠殺し、膝窩リンパ節を摘出して免疫学的分析に供した。
【０１８７】
４．免疫学的分析
初期かつ局所的なＮＳ３ｈタンパク質特異的かつ用量応答性の細胞性応答を以下のように調べた：種々の濃度のＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の膝窩リンパ節細胞の増殖−膝窩リンパ節細胞を、ＮＳ３ｈタンパク質０、０．１、０．３及び１μＭの存在下で３日間刺激した。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。
【０１８８】
パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、ＮＳ３ｈ免疫原に対する細胞性応答が増大する。
【０１８９】
５．結果
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後における膝窩リンパ節細胞の増殖の結果を図７中に示すが、この図は、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳ（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子（ＤＤＳ）及びＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物を摂取したマウスにおいて、細胞増殖アッセイ時の再刺激で使用したＮＳ３ｈ量に対する、濃度０のＮＳ３ｈタンパク質に対して各濃度（０、０．１、０．３及び１μＭ）のＮＳ３ｈについて得たｃｐｍ（１分当たりのカウント）値の比率に対応する、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【０１９０】
このグラフは、溶媒置換（ＤＤＳ）により調製したＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子、及び、透析により調製したＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＤＹＳ）を注射した場合における、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な細胞性応答を示す。本発明のＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈを注射したマウスの特異的細胞性応答は、本発明のＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ、ポジティブコントロール（Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ）及び試験した任意の濃度のＮＳ３ｈ抗原についてのＰＢＳ／ＮＳ３ｈコントロールで得たものよりも大きい（ＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ＞ＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ＞Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ＝ＰＢＳ／ＮＳ３ｈ）。
【０１９１】
この結果は、ＮＳ３ｈタンパク質単独又はＡｌｕｍとのアジュバントと比較して、本発明のＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ及びＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ微粒子により、細胞増殖応答が増強されたことを示す。
【実施例１０】
【０１９２】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ヘリカーゼ微粒子によるマウスの免疫：局所的かつ全身性の細胞性応答、及び、抗ＣＤ４＋抗体によるこの全身性細胞性応答の阻害
１．動物モデル
最初の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０１９３】
２．投与した免疫原
本実験では、免疫群当たりマウス５匹を使用した：ＮＳ３ヘリカーゼ遺伝型１ｂタンパク質（ＮＳ３ｈ）単独、上記実施例１項目４中に記載の透析により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＹＳ）、上記実施例２項目２中に記載の溶媒置換により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＤＳ）、及び、エマルションの形態で調製し、かつ、市販のワクチン中でアジュバントであることが知られるＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ社）組成物（ポジティブコントロール）。
【０１９４】
３．免疫
上記項目２中に記載の免疫原をマウスに二回（１００μｇ）投与し、一回目は０日目に足底肉趾に皮下投与し、二回目は７日目に尾の付け根に皮下投与した。
【０１９５】
二回目の注射から７日後にマウスを屠殺し、膝窩リンパ節及び脾臓を摘出して免疫学的分析に供した。
【０１９６】
４．免疫学的分析
膝窩リンパ節に局所的な、及び、脾臓における全身性の、ＮＳ３ｈタンパク質特異的かつ用量応答性細胞性応答を以下のように調べた：種々の濃度のＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の膝窩リンパ節細胞の増殖−膝窩リンパ節及び脾臓の細胞をＮＳ３ｈタンパク質０、０．１、０．３及び１μＭの存在下で３日間刺激した。３日間培養後、上清５０μＬを除去した。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、ＮＳ３ｈ免疫原に対する細胞性応答が増大する。
【０１９７】
脾臓由来の細胞において抗ＣＤ４＋抗体（ＧＫ１．５；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））による細胞性応答の阻害を以下のように求めた：
（ｉ）ＮＳ３ｈタンパク質１μＭによる刺激後の脾臓細胞の増殖の、抗ＣＤ４＋抗体による阻害−脾臓細胞をＮＳ３ｈタンパク質１μＭの存在下で刺激し、抗ＣＤ４＋抗体１０μｇと共に３日間インキュベートした。細胞をトリチウム化チミジンで１８時間パルスし、これにより、増殖した細胞のＤＮＡ中に取り込まれる。パルス後、ＤＮＡを保持する膜上に細胞を回収し、これによって、取り込まれなかった標識チミジンを洗浄により除去可能である。特異的刺激に応答して細胞が増殖するにつれ、ＤＮＡの標識が増大する；言い換えると、ＮＳ３ｈ免疫原に対する細胞性応答が増大する。
（ｉｉ）インターフェロンγのアッセイ−ＢＤ（登録商標）サイトメトリービーズアレイキット、マウスＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインＣＢＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５１２８７）を使用してインターフェロンγをアッセイした。蛍光強度の異なる５群のビーズを、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αタンパク質に特異的な捕獲抗体で被覆した。５群のビーズを一緒に混合してＣＢＡを形成し、これを、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）Ｃｏｕｌｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ等のフローサイトメーターのＦＬ３チャネルで解像する。サイトカイン捕獲ビーズをフィコエリスリン結合検出抗体と混合した後、供給元の推奨に従ってインキュベートした。ＢＤ ＣＢＡ分析ソフトウェアを使用することにより、フローサイトメーターにより試料データを取得し、結果を出した。
【０１９８】
５．結果
５．１ 局所的及び全身性の細胞性応答
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の脾臓細胞の増殖の結果を図８中に示すが、この図は、局所的細胞性応答につき膝窩リンパ節の細胞において（図８Ａ）、及び、全身性の細胞性応答につき脾臓の細胞において（図８Ｂ）、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳ（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物（Ａｌｕｍ）を摂取したマウスにおいて使用したＮＳ３ｈの量（μＭで表した）に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【０１９９】
これらの結果は、溶媒分散により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＤＤＳ）及び透析により調製したＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＤＹＳ）の１μＭについて、全身性であって（脾臓細胞−図８Ｂ）、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な細胞性応答を示す。本発明のＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ及びＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈを摂取したマウスの特異的な細胞性応答は、ポジティブコントロール（Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ）及びＰＢＳ／ＮＳ３ｈコントロール（ＰＢＳ）で得たものよりも大きい（ＰＬＡＤＤＳ／ＮＳ３ｈ及びＰＬＡＤＹＳ／ＮＳ３ｈ＞＞＞Ａｌｕｍ／ＮＳ３ｈ＝ＰＢＳ／ＮＳ３ｈ）。
【０２００】
５．２ 抗ＣＤ４抗体による全身性の細胞性応答の阻害
結果を図９中に示すが、この図は、刺激をしない脾臓細胞における（０）、ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後における（１）、又は、タンパク質及び抗ＣＤ４＋抗体による刺激後における（１＋ａＣＤ４）、マウスで使用した免疫原、すなわち、ＮＳ３ｈ−ＰＢＳ（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子（ＤＤＳ）及びＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物（Ａｌｕｍ）に対する細胞増殖指数（ＲＰＩ）を示すヒストグラムを表す。
【０２０１】
結果は、全身性の細胞性応答が抗ＣＤ４＋抗体の存在下で少なくともファクター５だけ阻害されることを示し、これにより、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な応答がＴｈ２型のものであることが示唆される。
【０２０２】
５．３ 補足的結果
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後の増殖の３日目に、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌が、使用した全ての条件下で観察され、この分泌は抗ＣＤ４＋抗体により減少する。
【０２０３】
ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後３日目のＩＦＮ−γアッセイの結果を下記表５中に示す。
【０２０４】
【表５】
【実施例１１】
【０２０５】
本発明のＰＬＡ／ＮＳ３へリカーゼ微粒子によるマウスの免疫：液性応答
１．動物モデル
最初の免疫時に６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０２０６】
２．投与した免疫原
本実験においては、免疫群当たりマウス５匹を使用した。ＮＳ３ヘリカーゼ遺伝子型１ｂタンパク質（ＮＳ３ｈ）単独、上記実施例１項目４中に記載の透析により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＹＳ）、上記実施例２項目２中に記載の溶媒置換により調製した本発明のＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子（ＰＬＡＤＤＳ）、及び、エマルションの形態で調製し、かつ、市販のワクチン中でアジュバントであることが知られるＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ社）組成物（ポジティブコントロール）。
【０２０７】
３．免疫
上記項目２中に記載の免疫原を三回（５０μｇ）、０、２及び４週目にマウスの尾の付け根に皮下投与した。血清を１３日目、２７日目及び４５日目に採取し、後に示すＥＬＩＳＡアッセイにより、ＮＳ３ｈタンパク質に対する特異的液性応答を調べた。
【０２０８】
最初の注射から１０日後にマウスを屠殺し、膝窩リンパ節を摘出して免疫学的分析に供した。
【０２０９】
４．免疫学的分析
初期かつ局所的なＮＳ３ｈタンパク質特異的液性応答を以下のように調べた：
ＮＳ３ｈタンパク質に対する定性的及び定量的液性応答−最初の注射前（Ｄ０）、及び、Ｄ１３、Ｄ２７及びＤ４５に血液試料を採取した。特異的抗ＮＳ３ｈ抗体の存在、抗体力価及び免疫グロブリンイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）をＥＬＩＳＡにより決定した。微量滴定プレートをＮＳ３ｈタンパク質で感作し、免疫したマウスの血清中のＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な抗体を、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ血清（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５−０３５−０６２）で可視化した。抗体力価の決定において、免疫したマウスの血清を順次希釈した。イソタイプ分類の決定において、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１ヤギ血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，カタログ番号１０７０−０５，アメリカ合衆国アラバマ州バーミンガム）、及び、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社，ＵＰＢ９０５２０）で反応を可視化した。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１イソタイプの比率も決定し、免疫応答のＩＦＮ−γ／ＩＬ−４の傾向（各々Ｔｈ１−Ｔｈ２）の解釈を可能とした。
【０２１０】
５．結果
３０日目及び４５日目における特異的抗ＮＳ３ｈ総ＩｇＧ抗体力価の結果を下記表６中に示す。
【０２１１】
【表６】
【０２１２】
結果は、ＮＳ３ｈタンパク質のＰＬＡへの結合により、ＮＳ３ｈタンパク質単独で得た力価に対して約１ｌｏｇだけ抗体（総ＩｇＧ）力価が増大可能であることを実証する。更に、得た力価はフロイントアジュバント／ＮＳ３ｈ調製物で得たものに匹敵する。
【０２１３】
ＰＬＡ／ＮＳ３ｈ微粒子の使用により、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な実質的にＩｇＧ１抗体反応を取得可能となり、これは、この応答がＴｈ２型のものであることを示唆する。
【実施例１２】
【０２１４】
単球の樹状細胞への分化過程におけるＰＬＡ／ＮＳ３ｈの作用
この実験により、ＰＬＡナノ粒子に吸着したＮＳ３ｈタンパク質の抗原提示細胞に対する効果を調べる。この実験は、ヒト末梢血液から単離した単球を使用して発生し、かつ、分化した樹状細胞の存在下で実施する。
【０２１５】
共刺激性分子の拡大を調べることにより、開始時に未成熟な樹状細胞（ＤＣｉ）が成熟過程に入るか否かを決定可能である。
【０２１６】
潜在的アジュバント及びＰＬＡ−ＮＳ３ｈ調製物により単球の樹状細胞への分化及び成熟を促進可能であるかどうかも試験する。この実験により、本出願人らは、先天性免疫と適応性免疫の間において必須の、細胞媒介におけるそれらの役割をより明瞭に理解可能である。分化及び成熟の表現型マーカーを連続的に調べ、かつ、生じたサイトカインの特性を調べることによってスクリーニングを実施する。サイトカイン産生の分析により、ＰＬＡ−ＮＳ３調製物がＴｈ１及び／又はＴｈ２特性を誘導するか否かを同定可能である。
【０２１７】
１．ヒト末梢血液からの単球の精製
Ｆｉｃｏｌｌ及びＰｅｒｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）勾配で遠心することにより（リヨンのＥｔａｄｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ［フランス血液バンク］で回収した）正常ヒト末梢血液から単球を単離した。Ｆｉｃｏｌｌにより、細胞を傷つけずに機能を保持したまま、密度勾配の作成が可能である。遠心後、Ｆｉｃｏｌｌよりも密度の高い赤血球細胞及び多形核細胞が試験管の底に沈殿する。リンパ球及び単球を含むＰＢＭＣ（末梢血単核球）は原形質とＦｉｃｏｌｌ間の界面に依然として存在する。その後、それらをＰｅｒｃｏｌｌ勾配で精製する。遠心後、Ｐｅｒｃｏｌｌよりも密度の高いリンパ球はペレット中に存在し、他方、単球は培地とＰｅｒｃｏｌｌ間の界面に依然として存在する。
【０２１８】
単球を後に示す抗体（Ａｂ）の混合物と共にインキュベートして、Ｔリンパ球（マウス抗ＣＤ３ Ａｂ ＯＫＴ３，ＡＴＣＣ（アメリカ合衆国メリーランド州ロックヴィル）、抗Ｔリンパ球）、Ｂリンパ球（マウス抗ＣＤ１９ Ａｂハイブリドーマ４Ｇ７、抗Ｂリンパ球）、赤血球細胞（マウス抗糖タンパク質Ａ Ａｂ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）及びＮＫ細胞（マウス抗ＣＤ５６ Ａｂ ＮＫＨ１，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社、抗ナチュラルキラー細胞）の枯渇により、かつ、磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を使用して、残留汚染物を除去した。Ｄｙｎａｌ社のビーズはマウス抗体に対するヒツジ抗体で被覆した小さな磁性ビーズである。この抗体がマウスＡｂ／細胞複合体に結合した後、細胞懸濁液の磁化担体通過後に、単球のみが残留するであろう。
【０２１９】
枯渇は、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）フローサイトメトリーにより確認した。
【０２２０】
細胞が液体マトリックスを通過する毎に細胞懸濁液を調べた。これらの細胞が光ビームを通過すると小角（前方散乱−ＦＳ）及び大角（側方散乱−ＳＳ）と呼ばれる２つの型の散乱が生じ、これらは考慮した二種の細胞パラメーター（細胞の大きさ（散乱）及び粒度分析（屈折））を表す。レーザーで励起可能なフルオロクロム（ＦＩＴＣ：Ｘ軸ＦＬ１及びＰＥで読み取るフルオレセインイソチオシアネート：ＦＬ２においてＹ軸で読み取るフィコエリスリン）に結合した抗体の使用により、検出可能な蛍光を発光可能である。電気的シグナルの増幅及びアナログ−デジタル変換システムにより、データをコンピューターフォーマットに適合可能である。
【０２２１】
細胞を下記種々の型の抗体で標識した。：
・ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４ Ａｂ（単球特異的）
・ＰＥ標識抗ＣＤ３ Ａｂ（ＬＴ特異的）
・抗ＣＤ５６ Ａｂ ＰＥ（ＮＫ細胞）
・抗ＣＤ２０ Ａｂ ＰＥ（ＬＢ特異的）
【０２２２】
汚染物レベルは１０％未満である。
【０２２３】
単球を２４ウェルプレート中の培地（ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、４０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）＋１０％無添加胎児ウシ血清）に、ＧＭ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）及び組換えヒトＩＬ−４（２５０Ｕ／ｍＬ）の存在下で、１×１０６個／ｍＬの割合で順次入れた（０日）。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４により、単球は未成熟樹状細胞へ分化可能である。
【０２２４】
２．細胞の表現型分析
分化５日目、細胞を種々の試験に供した：
・２５０〜２０００ｐｇ／ｍＬのＬＰＳ→ＬＰＳ（リポ多糖）は細菌膜の成分であって、ＤＣｉｓにより危険シグナルとして認識され、全身におけるその成熟を可能とする。各アッセイにおいてある範囲のＬＰＳ濃度を適用し、成熟度を比較した。
【０２２５】
ＮＳ３単独、粒子単独及びＰＬ／ＮＳ３ｈ粒子で用量−応答を実施した。
・１〜５０μｇ／ｍＬのＮＳ３ｈ→タンパク質単独では成熟は全く誘導されないことを確認するためのコントロール
・０．０１〜１ｍｇ／ｍＬのＰＬＡ→ＰＬＡがアジュバント効果を有するか否かを決定するための試験
・１０〜１００μＬのＰＬＡ／ＮＳ３ｈ→ＮＳ３ｈタンパク質の存在下でＰＬＡがアジュバント効果を有するか否かを決定するための試験
【０２２６】
６日目に、上清２００μＬを−８０℃で保存し、サイトカインをアッセイした。続いて細胞を回収して洗浄した。
【０２２７】
種々のコントロール標識を実施した：
・コントロールイソタイプ標識ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ２ａ−ＰＥ：ＩｇＧは、Ｆｃ断片受容体を有する細胞に非特異的に結合可能である。従って、この標識により、反応特異性の確認、及び、種々のアッセイにおける非特異的蛍光の除去が可能である。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａは、使用する抗ＣＤ抗体もこの種類であるということに関連する；
・（単球に対して特異的な）ＣＤ１４−ＦＩＴＣ／（未成熟樹状細胞に対して特異的な）ＣＤ１ａ−ＰＥ標識により、正しく分化したかどうかを確認可能である。
【０２２８】
続いて、成熟樹状細胞の特異的標識により表現型を決定した：
・抗ＣＤ８０ ＦＩＴＣ Ａｂ／抗ＣＤ８６ ＰＥ Ａｂ
・抗ＨＬＡ−ＤＲ ＦＩＴＣ Ａｂ／抗ＣＤ８３ ＰＥ Ａｂ
・抗ＣＤ４０ ＰＥ Ａｂ
【０２２９】
３．樹状細胞成熟プロトコルの実施
調製物を未成熟樹状細胞と接触させ、成熟樹状細胞を発生させるるＰＬＡ／ＮＳ３ｈ粒子の能力（アジュバント効果）を判断した。
【０２３０】
アッセイを以下ように実施した：
・ＬＰＳ範囲：２５０−３００−４００−５００−７５０−１０００−２０００ｐｇ
・ＮＳ３ｈ：１−１０−２５−５０μｇ
・ＰＬＡ粒子：０．０５−０．１−０．５−１ｍｇ
・ＰＬＡ／ＮＳ３ｈ粒子：０．２４ｍｇ ＤＹＳ／１０μｇ ＮＳ３ｈ（１０μＬ）−０．６ｍｇ／２５μｇ（２５μＬ）−１．２ｍｇ／５０μｇ（５０μＬ）−２．４ｍｇ／１００μｇ（１００μＬ）
【０２３１】
４．結果
ＮＳ３ｈタンパク質は陽性標識を与えない。
【０２３２】
Ｄ５においてＰＬＡ ＤＹＳ粒子を単独でＤＣｉｓに添加することにより、成熟化表現型（ＤＣｍ ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＣＤ４０＋）を取得可能である。細胞成熟化に対する用量−応答効果を観察した。
【０２３３】
ＰＬＡ／ＮＳ３ｈ粒子は非常に有利な効果を有する。具体的には、着目すべきは、成熟の活性化の程度は実質的であることである。正しくは１０μＬ（０．２４ｍｇ ＰＬＡ／１０μｇヘリカーゼ）におけるアッセイから、成熟を観察可能である。ＤＣｉｓに添加したＰＬＡ／ＮＳ３ｈは全ての活性化マーカー（ＣＤ８３＋，ＣＤ８６＋，ＣＤ８０＋，ＨＬＡ−ＤＲ＋，ＣＤ４０＋）の発現を誘導する。
【０２３４】
１００μＬにおけるアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する条件において１００μＬは大過剰であるとの認識により実施した。
【０２３５】
結論として、ＰＬＡ調製物はＨＣＶ ＮＳ３ｈタンパク質に対してアジュバント効果を有する、というのは、ＰＬＡ調製物により成熟樹状細胞を取得可能であるためである。
【実施例１３】
【０２３６】
本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４によるモノクローナル抗体の取得
１．動物モデル
一回目の免疫時に６〜８週齢である雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスについて免疫実験を実施した。
【０２３７】
２．投与した免疫原
本実験においては、上記実施例１項目２中と同様に調製した本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４、及び、油中水型エマルションの形態で調製し、かつ、良好な免疫原性能力を有することが知られるｐ２４−フロイントアジュバント（シグマ社）組成物（ポジティブコントロール）を使用した。
【０２３８】
３．免疫
０、２及び４週間において、上記項目２中に記載の免疫原１０μｇを三回連続してマウスに投与した。全ての注射は皮下投与で実施した。最初の注射からＤ６８において、５０μｇのｐ２４の静脈内注射で液性応答を再刺激した。
【０２３９】
４．抗ｐ２４液性応答の出現の観察
抗ｐ２４抗体の出現を観察するために、血液試料をマウスから規則的に採取した。その後、上記実施例２項目４中と同様のＥＬＩＳＡアッセイにより、抗ｐ２４抗体の存在を試験する。しかし、コンジュゲートの可視化は、アルカリ性ホスファターゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社，カタログ番号１１５−０５５−１４６）で置き換える。
【０２４０】
５．モノクローナル抗体の取得
最後に注射して３日後に、ＰＬＡ−ｐ２４群のマウスを屠殺した；血液及び脾臓を採取した。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９７６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９）に記載のプロトコルにより、脾臓から取得した脾臓細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄細胞を含む培地に入れ、融合かつ不死化させた。１２〜１４日間インキュベート後、得たハイブリドーマの上清をスクリーニングして、本実施例項目４に記載のＥＬＩＳＡアッセイにより、抗ｐ２４抗体の存在を決定した。陽性ハイブリドーマコロニーを、限界希釈法により２回サブクローニングした。
【０２４１】
６．結果
マウス血清中の抗ｐ２４抗体力価を屠殺前に個々のマウスについて決定した。
【０２４２】
結果を下記表７に示す。
【０２４３】
【表７】
【０２４４】
二群について得た力価を比較する。モノクローナル抗体はフロイントアジュバント／ｐ２４免疫により既に得られているので、本出願人らは、匹敵する力価を誘導可能なＰＬＡ／ｐ２４免疫原によりモノクローナル抗体を取得可能であるか否かの判断を目的とした。
【０２４５】
このために、ＰＬＡ／ｐ２４群のマウス（マウス１）を屠殺し、その脾臓由来の細胞を骨髄細胞と融合させた。融合で得たハイブリドーマを９６ウェルプレート１８枚中で限界希釈によりクローン化した。抗ｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイによるハイブリドーマ培養上清のスクリーニングにより、ｐ２４特異的抗体を分泌するハイブリドーマクローン１２種を同定可能であった。従って、微粒子ＰＬＡ／ｐ２４の使用によりモノクローナル抗体の取得も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】コントロールとしてのＨＣＶ ＮＳ３ＮＳ４ポリタンパク質に対応するＤＮＡ配列（図１Ａ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質及びフロイントアジュバント（図１Ｂ）で、微粒子を使用せずＮＳ３ヘリカーゼタンパク性物質（図１Ｃ）で、タンパク性物質を使用せずＰＬＡ微粒子（図１Ｄ）で、及び、ポリマーがＰＬＡかつタンパク質基質がＮＳ３ヘリカーゼペプチドである本発明の微粒子（図１Ｅ）でマウスを免疫することによるＣＴＬアッセイの結果を示す。
【図２】免疫前血清、及び、本発明の粒子ＰＬＡ−ｐ２４を皮内（ＩＤ）又は皮下（ＳＣ）注射したウサギ６匹（Ｌ１〜Ｌ６）の免疫血清中の抗ｐ２４ ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡアッセイで調べたヒストグラムを表す。
【図３】本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより得たヒストグラム（四回の実験の平均＋／−標準偏差）を表し、これは、抗原を使用しない刺激後における（培地、ネガティブコントロール、黒色のヒストグラム）、ｐ２４による刺激後における（灰色のヒストグラム）、又は、ＰＭＡイオノマイシンカップルによる刺激後における（外枠ヒストグラム）、免疫後日数に対する細胞１００万個当たりのスポット数を示す。
【図４】本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したマカクザル２匹Ｍ１及びＭ２においてＥＬＩＳＰＯＴにより得たヒストグラムを表し、これは、ｐ２４タンパク質（黒色のヒストグラム）又はペプチド（灰色のヒストグラム）のいずれかによる刺激後の、総ＰＢＭＣ画分中の、抗ＣＤ４抗体存在下の総ＰＢＭＣ画分中の、ＣＤ４＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ４− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ４＋豊富画分（ＣＤ４＋ ＰＢＭＣ）中の、並びに、ＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣ画分（ＣＤ８− ＰＢＭＣ）及び対応するＣＤ８＋豊富画分（ＣＤ８＋ ＰＢＭＣ）中のスポット数を示す。
【図５】本発明の微粒子ＰＬＡ／ｐ２４を摂取したサルＭ２においてＥＬＩＳＡにより得た、連続して血清を採取した日に対する抗ｐ２４ ＩｇＧ力価を示すヒストグラムを表す。
【図６】ＳＲＤＣ細胞で免疫し、かつ、ネガティブコントロール（Ｃｔ１及びＣｔ２）で、又は、ｐ２４タンパク質（ｐ２４−１及びｐ２４−２）で、又は、ネガティブコントロール微粒子（ＮａｎｏＯｖａｌ及びＮａｎｏＯｖａ２）で、又は、本発明の微粒子（Ｎａｎｏｐ２４−１及びＮａｎｏｐ２４−２）で感作したマウスの免疫前血清中において、一回目の免疫後の血清中において、二回目の免疫後の血清中において、及び、三回目の免疫後の血清中においてＥＬＩＳＡにより得たＯＤ値を示すヒストグラムを表す。
【図７】ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を示すグラフを表す。
【図８】ＮＳ３ｈ−ＰＢＳを摂取したマウスで使用したＮＳ３ｈの量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕｍ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する、ＮＳ３ｈタンパク質に対して特異的な相対増殖指数（ＲＰＩ）を、局所細胞性応答について膝窩節細胞において（図８Ａ）及び全身細胞性応答について脾臓細胞において（図８Ｂ）示すグラフを表す。
【図９】マウスで使用した免疫原（すなわちＮＳ３ｈ−ＰＢＳ）の量（ＰＢＳ）、透析により調製した本発明の微粒子の量（ＤＹＳ）、溶媒置換により調製した本発明の微粒子の量（ＤＤＳ）、及び、ＮＳ３ｈ−Ａｌｕ組成物の量（Ａｌｕｍ）に対する細胞増殖指数（ＲＰＩ）を、刺激をしない脾臓細胞において（０）、ＮＳ３ｈタンパク質による刺激後において（１）、又は、タンパク質及び抗ＣＤ４＋抗体による刺激後において（１＋ａＣＤ４）示すヒストグラムを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク性物質が結合する非ラメラ生体再吸収性微粒子の調製方法であって、以下の段階：
（ｉ）安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから前記微粒子を調製する段階、並びに、
（ｉｉ）界面活性剤を使用せず、段階（ｉ）で得た微粒子に前記タンパク性物質を結合させる段階：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記段階（ｉ）で使用するポリマーはポリ（α−ヒドロキシ酸）又はポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク性物質の微粒子への結合は吸着により実施される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク性物質はウイルス由来の抗原である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
抗原はＨＩＶウイルス抗原、好ましくはｐ２４タンパク質又は調節タンパク質である
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＶウイルス抗原はＴａｔ、Ｒｅｖ及びＮｅｆタンパク質から選択される調節タンパク質である
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗原はＨＣＶウイルス抗原、好ましくはＨＣＶウイルスの非構造タンパク質である
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
抗原はＮＳ３タンパク質、好ましくはＮＳ３ヘリカーゼタンパク質である
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で取得した、タンパク性物質が結合した生体再吸収性微粒子。
【請求項１０】
医薬品を調製するための、請求項９に記載の生体再吸収性微粒子の使用。
【請求項１１】
医薬品は、ウイルスにより生じる感染の阻害、予防又は治療を目的とする
ことを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項９に記載の生体再吸収性微粒子の少なくとも一種、及び、適切な場合には医薬上許容される賦形剤を含む
ことを特徴とする医薬組成物、特にワクチン。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物の有効量の患者への投与を含む
ことを特徴とする、請求項９に記載の生体再吸収性微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状の治療方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の生体再吸収性微粒子に対する抗体。
【請求項１５】
請求項９に記載の生体再吸収性微粒子又は請求項１４に記載の抗体からなる診断用組成物。
【請求項１６】
生体再吸収性微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用の、請求項１５に記載の診断用組成物の使用。
【請求項１７】
病状はウイルス感染である
ことを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１】
タンパク性物質が結合する非ラメラ生体再吸収性微粒子の調製方法であって、以下の段階：
（ｉ）安定化剤及び界面活性剤を使用せず、少なくとも一種の生体再吸収性ポリマーから前記微粒子を調製する段階、並びに、
（ｉｉ）界面活性剤を使用せず、段階（ｉ）で得た微粒子に前記タンパク性物質を結合させる段階：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記段階（ｉ）で使用するポリマーはポリ（α−ヒドロキシ酸）又はポリ（α−ヒドロキシ酸）の混合物である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク性物質の微粒子への結合は吸着により実施される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク性物質はウイルス由来の抗原である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
抗原はＨＩＶウイルス抗原、好ましくはｐ２４タンパク質又は調節タンパク質である
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＩＶウイルス抗原はＴａｔ、Ｒｅｖ及びＮｅｆタンパク質から選択される調節タンパク質である
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗原はＨＣＶウイルス抗原、好ましくはＨＣＶウイルスの非構造タンパク質である
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
抗原はＮＳ３タンパク質、好ましくはＮＳ３ヘリカーゼタンパク質である
ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で取得した、タンパク性物質が結合した生体再吸収性微粒子。
【請求項１０】
医薬品を調製するための、請求項９に記載の生体再吸収性微粒子の使用。
【請求項１１】
医薬品は、ウイルスにより生じる感染の阻害、予防又は治療を目的とする
ことを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項９に記載の生体再吸収性微粒子の少なくとも一種、及び、適切な場合には医薬上許容される賦形剤を含む
ことを特徴とする医薬組成物、特にワクチン。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物の有効量の患者への投与を含む
ことを特徴とする、請求項９に記載の生体再吸収性微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状の治療方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の生体再吸収性微粒子に対する抗体。
【請求項１５】
請求項９に記載の生体再吸収性微粒子又は請求項１４に記載の抗体からなる診断用組成物。
【請求項１６】
生体再吸収性微粒子に結合したタンパク性物質に関与する病状のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用の、請求項１５に記載の診断用組成物の使用。
【請求項１７】
病状はウイルス感染である
ことを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２１３２１（Ｐ２００７−５２１３２１Ａ）
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６６７１（Ｐ２００６−５２６６７１）
【出願日】平成１６年９月２１日（２００４．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０４４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２７８７１
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２１日（２００４．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５０４４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２７８７１
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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