生体分子標識用複素環ＦＲＥＴ色素カセット並びにＤＮＡ配列決定での使用
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）カセット及びそれらの対応ジデオキシヌクレオチドターミネーターをＤＮＡ配列決定用の効率的な試薬とするための設計及び合成における適当な官能化複素環分子の開発。様々な複素環系から誘導される本発明のＦＲＥＴカセット／ターミネーターは生体分子の汎用標識に使用することができ、高感度シグナルを発生する。これらの製造法、エネルギー移動効率、さらに特にＤＮＡシークエンシング反応における標識としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広範な分子生物学及びＤＮＡ配列決定用途に対して核酸及びタンパク質の標識に使用できる新規複素環ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）カセットに関する。
【０００２】
ハイスループット遺伝子配列決定の現在の一般的慣行は、一般則として、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構に基づいて４種類の異なる標識を有するエネルギー移動（ＥＴ）色素ターミネーターを用い、ドナーの励起波長で励起し、４種類の個々の核酸塩基にコンジュゲートした４種類のアクセプターの波長で発光を測定することによって配列を読み取る。
【０００３】
しかし、現在入手し得るＥＴターミネーターセットは輝度が低いという難点を有する。こうした低い輝度は、ドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動及びアクセプターの発光波長での再発光が非効率的であることに起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合して色素ターミネーターを形成するのに用いられている構造的連結が最適でないことによる。
【０００４】
ＦＲＥＴ効率は主に、関与する色素の相対的な双極子-誘起双極子配向に依存する。色素がコアリンカー分子に共有結合する官能基の配向によって、色素の相対的な双極子−双極子配向が決まる。蛍光色素及び生物学的に重要な分子との共有結合を形成するのに適した官能基を有する複素環式及び脂環式分子は、官能基を３次元に配向させて、結合する基を一定の位置に規定するので、カセットコアとして役立つ。効率の高いＦＲＥＴ色素カセットを誘導しそれらを高感度ＤＮＡ配列決定ターミネーターに変換するため、様々な構造及び環の大きさを有する複素環系がコアカセット分子として選択されてきた。
【０００５】
本発明では、現在入手可能なターミネーターよりも輝度の高い色素標識カセット及び対応ターミネーターの新規セットを提供する。。本発明の色素ターミネーターセットは輝度が向上し、それに応じてＳＮ比が向上しているので、さらに広範な種類のＤＮＡテンプレートの配列決定が可能となる。本発明で開示するコア分子としてピペリジン又はピペラジンアミノ酸の形態の新規蛍光団／リンカーの組合せによって、高輝度のＥＴ色素が構築できるようになる。本発明で開示する複素環ＦＲＥＴカセットは、核酸、タンパク質、炭水化物その他の生体分子の標識に使用できる。
【背景技術】
【０００６】
最近、生体試料中の成分の標識及び検出用に多数の蛍光色素が開発されている。一般に、検出限界を下げるには、これらの蛍光色素は高い吸光係数と量子収率を有していなければならない。
【０００７】
Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構に基づいてストークスシフトを拡大しかつ多様にするために開発され、混合物中の異なる標識を有する試料の同時検出に使用されている色素の１種はＥＴ（エネルギー移動）色素である。これらのＥＴ色素はドナー蛍光団とアクセプター蛍光団、さらにはそれらを目的生体分子と結合させる機能をもつ標識からなる複雑な分子構造を含む。ドナー蛍光団の励起によってドナーに吸収されたエネルギーはＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構でアクセプター蛍光団に移動し、蛍光を発する。単一のドナーに対して異なるアクセプターを用いて１セットのＥＴ色素群を形成すれば、そのセットが単一のドナー周波数で励起されたときにアクセプターの種類に応じて異なる発光が観察できる。これらの異なる発光を定量することによって、これらの色素を目的の生体分子に結合させたときの混合物の各成分を容易に解析することができる。これらのＥＴ色素セットは現在のハイスループット遺伝子配列決定法論の根幹をなす。
【０００８】
従前、様々な組合せの二元蛍光団色素が報告されている。Ｍａｔｈｉｅｓ他の「Ｐｒｏｂｅｓ Ｌａｂｅｌｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｙｅｓ」と題する米国特許第５６８８６４８号、「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｐａｃｅｒ／ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ」と題する米国特許第５７２８５２８号及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌａｂｅｌｓ ｗｉｔｈ ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅｓ ａｓ ｄｏｎｏｒ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ」と題する米国特許第６１５０１０７号（それらの図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、ドナー色素分子とアクセプター色素分子の対を有する蛍光標識のセットが開示されており、標識は配列決定用核酸骨格に結合させることができる。ドナー色素とアクセプター色素を離隔するためのスペーサーとして核酸塩基又は脱塩基糖単位が用いられている。ドナー色素からアクセプター色素への効率的エネルギー移動に最適な距離は約６〜１０塩基であることが判明している。異なる蛍光標識を用いて核酸混合物中の核酸を同定・検出する方法も開示されており、蛍光部分はシアニン色素及びキサンテン類のような群から選択される。蛍光標識は１対の蛍光団を含んでおり、その一方の蛍光団ドナーは蛍光団アクセプターの吸収と重複する発光スペクトルを有していて、励起側から他方へのエネルギーの移動が起こる。
【０００９】
Ｗａｇｇｏｎｅｒ他の「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｃｙａｎｉｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ」と題する米国特許第６００８３７３号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、第１の吸収及び発光スペクトルを有する第１の蛍光色素と第２の吸光及び発光スペクトルを有する第２の蛍光色素とを含む複合体が開示されている。蛍光色素間のリンカー基はアルキル鎖である。色素の蛍光性によって、それらを配列決定及び核酸の検出に使用することができる。
【００１０】
Ｌｅｅ他の「Ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」と題する米国特許第５８６３７２７号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、ドナー及びアクセプター色素が色素間のリンカーで離隔されたエネルギー移動色素が開示されている。色素間の好ましいリンカーは４−アミノメチル安息香酸である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２）。このリンカーに基づくエネルギー移動ターミネーターＤＮＡ配列決定キットはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスターシティ）から入手可能であり、Ｂｉｇ Ｄｙｅターミネーターキットとして市販されている。
【００１１】
Ｋｕｍａｒ他の「Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｙｅｓ」と題する国際公開第００／１３０２６号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、エネルギー移動色素、その調製及び生体系における標識としての使用が開示されている。色素は好ましくはカセットの形態であり、それらを各種生体物質に結合させることができる。ドナー色素、アクセプター色素及びジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸はすべて芳香族アミノ酸構造に基づく三官能性リンカーに結合する（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４１，８８６７−８８７１）。これらの構造に基づくエネルギー移動ターミネーターキットはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）からＤＮＡ配列決定用のＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴターミネーターキットとして市販されている。
【００１２】
Ｋｕｍａｒ他の「Ｃｈａｒｇｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｄｉｄｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ」と題する国際公開第０１／１９８４１号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、リンカーアームに正電荷又は負電荷を導入した単一のエネルギー移動色素標識ターミネーターが開示されている。これらのターミネーターは、色素標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸の分解で形成される「色素斑」を全く含まないＤＮＡシークエンシングバンドを得るのに有用である。荷電ターミネーターの使用によって、これらの分解生成物は配列情報の後方（正電荷ターミネーター）又は前方（負電荷ターミネーター）に移動させることができる（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５）。
【００１３】
現在入手可能なＥＴ色素ターミネーターセットは概して輝度が低いという難点を有する。このような低い輝度は、ドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動及びアクセプターの発光波長での再発光が非効率的であることに起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合して色素ターミネーターを形成するのに用いられている構造的連結が最適でないことによる。そこで、最大輝度が得られるようなエネルギー移動色素カセットの構築及びその生体分子との結合をさらに改善するニーズが依然として存在している。
【特許文献１】米国特許５６８８６４８号明細書
【特許文献２】米国特許５７２８５２８号明細書
【特許文献３】米国特許６１５０１０７号明細書
【特許文献４】米国特許６００８３７３号明細書
【特許文献５】米国特許５８６３７２７号明細書
【特許文献６】国際公開第００／１３０２６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０１／１９８４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４１，８８６７−８８７１
【非特許文献３】Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、輝度が高くＤＮＡポリメラーゼの基質となるエネルギー移動色素及び標識ヌクレオチドを提供する。エネルギー移動色素はピペリジン及びピペラジンのような複素環リンカー構造をコア分子として用いてドナー及びアクセプター色素を結合させる。例えばピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸の場合、ドナー色素は二級窒素原子に結合し、アクセプター色素はアミノ基に結合する。分子のカルボン酸残基を用いて、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドその他の生体分子を結合させる。ドナー及びアクセプター色素の結合位置は入れ替えることもできる。
【００１５】
本発明は、本発明の複素環リンカーから誘導される４種類のターミネーターセットも提供する。ターミネーターセットは、フルオロセイン（ＦＡＭ）又はローダミン１１０（Ｒ１１０）をドナー色素として含み、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びローダミンＸ（ＲＯＸ）又はシアニン色素をアクセプター色素として含む。このターミネーターセットはＤＮＡ配列決定用に最適化される。キット中の標識ヌクレオチドターミネーターは既存のキットよりも輝度が高く、均一なバンドを与える。これらの製造方法及びＤＮＡ配列決定における使用についても本発明で開示する。
【００１６】
本発明の複素環ＦＲＥＴ色素の組成及びその製造方法並びにヌクレオシド、ヌクレオチド（一、二又は三リン酸）又はオリゴヌクレオチドのような生体分子にそれらを結合させる方法についても開示する。
【００１７】
太字で示す符号及び文字はスキーム及び実施例に示す化合物の番号を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＦＲＥＴの効率は数多くの因子に依存する。Ｆｏｒｓｔｅｒ理論（Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ， “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｄｕｒｄｒｅｃｈｔ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｍｏｓｃｏｗ １９９９）によれば、その主な因子は以下の通りである。
１）ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なり、
２）ドナーとアクセプターの間隔、及び、
３）ドナーの双極子とアクセプターの双極子の空間的配向。
【００１９】
実際には、問題ははるかに複雑である。ドナーとアクセプター間の特異的な相互作用によって消光が起こる場合があり、ドナー発光が全く存在しないときでもアクセプターからの発光がほとんど認められないことがある。さらに、ドナーがどの程度消光されるかはアクセプターに移動するエネルギーとはほとんど関係なく、観察される発光量ともほとんど関係ない。今回、これらの色素ターミネーターに関する実際のＥＴ過程を説明するための数学的処理を開発したので、以下これらについて説明する。かかる数学的処理には、以下に挙げる３つの実験的に測定可能なパラメーターが最も重要である。
１）ＰＱＥＱ（ドナーの消光率％）、これは以下の通り定義される。
ＰＱＥＱ＝（１−発光ドナー／アクセプター対のドナー／発光アクセプター非存在下での同量のドナー）×１００％
２）ＰＡＥＥ（アクセプター発光効率％）、
ＰＡＥＥ＝（ドナーアクセプター対のアクセプターの発光効率）／（ドナー非存在下でのアクセプターの発光効率）×１００％、及び
３）ＰＥＴ（エネルギー移動率％）、
ＰＥＴ＝ドナーの量子収率×［（ドナー励起波長で励起したアクセプターの発光効率）／（アクセプター非存在下でのドナーの発光効率）］。
【００２０】
上記のＰＥＴは、実際には、ドナー励起波長で励起し、アクセプター発光波長で発光を測定したときのドナー／アクセプター対の量子収率となる。
【００２１】
上述の方法論は１個のドナーと３個以上のアクセプターからなるＥＴ構築体にも拡張できる。
【００２２】
さらに、これらの数値から、ＥＴ過程全体を通しての光子の流れを示すフローダイアグラムを構築できる。一例として、現在ＤＮＡシークエンシング反応に使用されている４種類のＥＴ色素ターミネーターのセット（Ｋｕｍａｒ他の国際公開第００／１３０２６号、Ｎａｍｐａｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０００，４１，８８６７）に関する数値を表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【化１】
【００２５】
例示として、例えば化合物（４Ｆ）を用いて光子のフローダイアグラムを構築できる。
【００２６】
【化２】
【００２７】
ダイアグラムの作成は比較的簡単である。化合物（４Ｆ）のＰＱＥＱが９９％に等しいので、ドナー（ＦＡＭ）に吸収された光子１００個のうちドナーによって再発光されるものは１個にすぎない。ＰＥＴは０．１９に等しいが、これは、ドナーに吸収された光子１００個当たり、光子１９個がアクセプター（ＲＯＸ）から発光されることを意味する。ＰＡＥＥは０．３５であるので、その遊離状態におけるＲＯＸの量子収率がＦＡＭに対して１．０であると仮定すると、ＲＯＸアクセプターから光子１９個を発光させるには１９／０．３５、つまり５４個の光子のインプットが必要となる。従って、蛍光以外の過程でアクセプター（ＲＯＸ）が失った光子の数は３５（＝５４−１９）となる。すると、光子の保存則から、ドナーＦＡＭから無放射過程で失われた光子の数は４５（＝１００−１−５４）となるはずである。
【００２８】
表１に示すものよりも輝度の向上した色素ターミネーターセットを求めて鋭意検討した結果、ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸に基づく新規なＥＴ色素を発見した。ピペリジン核の環窒素（ＮＨ）をドナー色素（フルオロセイン）との結合に用いる。ピペリジンの１位のアミノ基をアクセプター色素（ローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、ローダミン−Ｘ、Ｃｙ５等）との結合に用い、ヌクレオシド三リン酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質のような生体分子を活性化カルボン酸に結合させる。ＥＴ色素カセット及びこの構造体から誘導されるターミネーターは輝度が高く、そのジデオキシヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの良好な基質である。
【００２９】
したがって、本発明は、次式のエネルギー移動色素を提供する。
【００３０】
【化３】
【００３１】
式中、Ｄはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるドナー色素であり、
Ｌ１はＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択される官能基であって、この基を介してＤが共有結合しており、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ又はアルキルアミノ基を表し、
Ｌ２はＣ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択されるアミンであって、この基を介してＡが共有結合しており、
Ｘはアルデヒド、酸、酸クロライド、エステル、ヒドロキシメチル、ＣＨ２Ｏ−メシレート、ＣＨ２Ｏ−トリフレート、メルカプトメチレン、ホスホルアミダイトであるか、或いはアミン、チオール、ヒドロキシ又はハロアセチル含有生体分子と共有結合を形成し得る反応性基であり、又はＸ＝Ｌ３Ｂであって、Ｌ３は生体分子Ｂと共有結合を形成し得るカルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、酸クロライド、マレイミド、ヒドラジド又はスルホニルクロライドから構成される官能基であり、Ｂは、ヌクレオシド、ヌクレオシド−一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸、チオリン酸、アルケニル置換もしくはアルキニルアミノ置換ジデオキシヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三リン酸、アミノ酸、タンパク質又は修飾オリゴヌクレオチドからなる群から選択される生体分子であり、
Ａはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【００３２】
別の態様では、本発明は、エネルギー移動色素カセット及び以下の構造の対応ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸、それらの製造法及びＤＮＡ配列決定における使用法を提供する。
【００３３】
【化４】
【００３４】
式中、アクセプター色素は、キサンチン群の色素、ローダミン色素又はシアニン色素から選択され、
ＢＡＳＥはシトシン、チミン、ウラシル、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、７−デアザプリン、７−デアザ−８−アザプリンその他の修飾複素環塩基から選択され、ｎは０〜３である。
【００３５】
アクセプター色素及びドナー色素はピペリジン−１，１−アミノカルボン酸の環窒素又は一級アミノ基のいずれかに互いに交換可能に結合させることができる。
【００３６】
標識用ＥＴ色素カセットは、その他同様の複素環式アミノ酸からも製造でき、その例を以下に示す。
【００３７】
【化５】
【００３８】
上記のすべての複素環式ＦＲＥＴカセットにおいて、ドナー色素（Ｄ）には、カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、Ｃｙ３、ローダミングリーン（Ｒ１１０）の５及び６−位置異性体が包含され、アクセプター色素（Ａ）には、５−カルボキシローダミン（Ｒ１１０）、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ又はＲＥＧ）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン（Ｃｙ３）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン（Ｃｙ３．５）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５、５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン（Ｃｙ５．５）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニン（Ｃｙ７）又は関連色素の５及び６−異性体が包含され、アクセプター色素Ａはドナー色素Ｄからエネルギーを受け取ることができるものである。
【００３９】
ＦＡＭ、Ｒ１１０、ＲＥＧ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯＸはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国カリフォルニア州フォスターシティ）の商標であり、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５．Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）の商標である。
【００４０】
さらに、本発明はＦＲＥＴカセット（上記参照）を包含するが、これらは環系に窒素原子を有し、Ａ及びＢに対する連結基を１，２−位又は１，３−位に有する。なお、これらの系は１又は２個のキラル中心を有しており、これらのキラル中心がＡ、Ｂ及びＤの相対的配向に影響を及ぼしてエネルギー移動効率（輝度又は量子収率）に影響を与える。
【００４１】
色素とジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸の間に様々なリンカーを有する単一色素標識ターミネーターを多数合成し、それらの輝度（ＰＥＴ）を４８８ｎｍの励起で測定した。単一色素標識ターミネーターの輝度を、本発明のエネルギー移動色素標識ターミネーター及び従前開示されたターミネーターと比較した。ピペリジン由来ターミネーターの合成は図１に示す通り行なった。例えば、実施例１に示すように、Ｎ−ＦＭＯＣ−ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸（１）を保護フルオロセイン−５−カルボン酸クロライド（３）と反応させ、フルオロセイン標識ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸（４）を得た。アクセプター色素（ＮＨＳエステル形）をピペリジンで脱保護した後、アミノ基に結合させた。最後に、酸を対応活性エステルへと活性化した後、適切に連結したプロパルギルアミノ−ｄｄＮＴＰと反応させてピペリジンリンカー由来エネルギー移動色素ターミネーターを得た。また、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ピペリジニル−１，１−カルボン酸メチルエステルを用いて、本発明の単一及びＥＴ色素カセットを合成することもできる。
【００４２】
単一色素標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸（ターミネーター）及び本発明で合成したエネルギー移動ターミネーターすべてについてエネルギー移動効率（ＰＥＴ）を測定した。色素ターミネーターはすべて４８８ｎｍで励起し、発光は個々の発光波長で測定した。結果を以下の表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
表２に記載の色素ターミネーターの分子構造を以下に示す。
【００４５】
【化６】
【００４６】
【化７】
【００４７】
本発明の単一色素標識ターミネーター及びエネルギー移動色素標識ターミネーター（上述）を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡシークエンシング反応で試験した。個々の色素標識ターミネーターの有用性を、配列全体の質、輝度及びバンドの均一性に基づいて確認した。これらの規準に基づいて、新しい色素ターミネーターセットを構築した。この新規セットのターミネーターのＰＥＴを以下に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
本発明には、試薬並びに上述の蛍光水溶性標識複合体を担体材料と共にインキュベートすることを含む試薬の製造法も包含される。複合体、又は複合体もしくは担体の他の反応基と反応してそれらの間に共有結合を形成する官能基を有する担体材料。担体材料は、ポリマー粒子、ガラスビーズ、セル、抗体、抗原、タンパク質、酵素及びヌクレオチドからなる群から選択され、アミノ、スルヒドリル、カルボニル、カルボキシル又は水酸基のいずれかを含むように誘導体化される。また、担体材料は反応基を含んでいてもよく、本発明の蛍光標識複合体は該反応基と反応して共有結合を形成する上述の官能基のいずれかを含んでいてもよい。
【００５０】
別の態様では、本発明の蛍光複合体は、他の化合物と非共有結合で結合させるときは反応基を有する必要がない。例えば、複合体を溶解し、有機溶媒中でポリスチレンのようなポリマー粒子と混合し、乳化重合によって撹拌してもよい。溶媒を蒸発させ、蛍光色素複合体をポリスチレン粒子に吸収させる。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。これらの実施例は例示を目的としたものであり、特許請求の範囲及び本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明は、本明細書中の教示内容から明らかなあらゆる変更を包含する。以下に太字で示す符号は、合成における符号を付した各種の化合物を示す。
【００５２】
実施例１
ピペリジンリンカーから誘導したターミネーターの合成（ＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−Ｘ−ｄｄＮＴＰｓ）
【００５３】
【化８】
【００５４】
４−Ｎ−（ジピバロイルフルオロセイン−５−カルボニル）−Ｎ−ＦＭＯＣ−ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸（４）
Ｎ−ＦＭＯＣ−ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸１（０．４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１０ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。乾燥した基質を塩化メチレン（５ｍｌ）とピリジン（５ｍｌ）の混液中に溶解した。反応フラスコを氷浴中で冷却し、ジピバロイル−５−カルボキシフルオレセイン酸クロライド３（１．２５ｍｌ、ジピバロイル−５−カルボキシフルオレセイン２を塩化メチレン中ＤＭＦ存在下シュウ酸クロライドで処理して調製）の塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液を加えた。反応混合物を０〜５℃で２時間撹拌し、放置して室温まで温めた。反応を一晩継続し、水（０．５ｍｌ）の添加によって奪活した。反応混合物をクロロホルム（１００ｍｌ）で希釈し、水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させた。残渣をトルエンと共蒸発し、塩化メチレン中０〜５％メタノール勾配を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。
【００５５】
４−Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボニル）ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸（５）
ＴＨＦ（１５ｍｌ）中の化合物４（１５０ｍｇ）の溶液にピペリジン（５ｍｌ）を添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、残渣を塩化メチレン中０〜１００％メタノール勾配を溶出液として用いたカラムクロマトグラフィーで精製した。
【００５６】
４−Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボニル）−Ｎ−ＲＯＸ−ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸（６）
化合物５（２０ｍｇ）とＲＯＸ−ＮＨＳエステルの混合物を、乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。次いで無水ＤＭＳＯ（５ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍｌ）を添加し、反応混合物を室温で６．５時間撹拌した。反応混合物を、塩化メチレン中で充填したシリカゲルカラムにかけた。生成物を、塩化メチレン中０〜１００％メタノール、次いでメタノール中１％トリフルオロ酢酸を用いて溶出した。生成物を含む画分を蒸発させ、残渣をトルエンと共蒸発させた。残渣をさらに、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製した。溶出液は、４０％アセトニトリル含有０．１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウム〜４０％アセトニトリル含有１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウムであった。生成物を含む画分を回収して蒸発させ、化合物６を得た。
【００５７】
５−ＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ（１０）
化合物６（１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（８ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。次いで乾燥ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、ＤＭＦ（１ｍｌ）中のジスクシンイミジルカーボネート（１８ｍｇ）の溶液を添加した。反応フラスコを−６０℃に冷却し、ＤＭＦ（１ｍｌ）中のＤＭＡＰ（９ｍｇ）溶液を滴下した。１０分後、反応混合物の温度を−３０℃に上げ、ｐＨ９．５のＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（８ｍｌ）中１１−ｄｄＣＴＰ（０．３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物の温度を室温まで上げて、反応を３時間続けた。反応混合物を直接、５０％メタノール−クロロホルム中で充填したシリカゲルカラムにかけた。カラムをメタノールで洗浄し、生成物をイソプロパノールと水酸化アンモニウムと水（６：３：１）の混液で溶出した。生成物を含む画分を回収して蒸発させて濃縮し、０．４μフィルターで濾過し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。生成物を４０％アセトニトリル含有０．１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウム〜４０％アセトニトリル含有１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウムの勾配で溶出した。純粋な生成物を含む適当な画分を回収して蒸発させた。残渣をメタノール（５×３０ｍｌ）と共蒸発して化合物１０を得た。
【００５８】
５−ＦＡＭ−ピペリジニル−ＲＯＸ−１８−ｄＣＴＰ（１１）
ＦＡＭ−ピペリジニル−ＲＯＸのＥＴカセット６（４ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。全８ｍｇのＤＳＣ（０．０３ｍｍｏｌ、８当量）を添加した。混合物を撹拌して−６０℃に冷却し、この温度でＤＳＣ（２．４ｍｇ）の無水ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を滴下した。１５分後に、ＮＨＳエステルに完全に転化されていることがＴＬＣで確認された。反応混合物の温度を−３０℃に上げ、１８−ｄｄＣＴＰ（１当量）の緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５）を添加した。次いで、反応混合物を室温まで温め、さらに３時間撹拌した。所望生成物１１を、化合物１０について説明した通りＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製した。
【００５９】
実施例２
ＦＡＭ−ピペリジン−ＴＡＭＲＡ−Ｘ−ｄｄＮＴＰｓ−の合成
【００６０】
【化９】
【００６１】
４−Ｎ−（フルオロセイン−５−カルボニル）−Ｎ４−ＴＡＭＲＡ−ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸（９）
化合物５（２４ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解し、撹拌溶液に室温でＤＩＰＥＡ（０．１ｍＬ、０．５８ｍｍｏｌ、１２当量）を添加し、次いでＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル（３０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、所望生成物９（６０％）を、化合物６について説明した通りＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて単離した。
【００６２】
５−ＦＡＭ−ピペリジニル−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ（７）及び５−ＦＡＭ−ピペリジニル−ＴＡＭＲＡ−１８−ｄｄＡＴＰ（８）
８当量のＤＳＣ、５当量のＤＭＡＰ及び１当量の１１−又は１８−ｄｄＡＴＰを用いて３．８μｍｏｌｅスケールで化合物９から化合物７及び８を、化合物１０について説明したのと同様の反応条件を用いて合成した。
【００６３】
実施例３
ＦＡＭ−ピペリジン−Ｒ１１０−Ｘ−ｄｄＮＴＰ及びＦＡＭ−ピペリジン−Ｒ６Ｇ−Ｘ−ｄｄＮＴＰの合成
５−ＦＡＭ−ピペリジニル−Ｒ１１０−１１−ｄｄＧＴＰ（１５）
化合物７と同様の手順で化合物５から化合物１４を介してターミネーター１５を合成し精製した。
【００６４】
【化１０】
【００６５】
実施例４
ピペリジン由来単一色素（ドナー色素としてＲ１１０）カセットの合成
ピペリジニル−Ｒ１１０カセット合成（１９）
【００６６】
【化１１】
【００６７】
ＴＦＡ−５−Ｒ１１０酸１７（０．２ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。乾燥材料を無水ＴＨＦ（６ｍｌ）に溶解した。反応フラスコを氷浴中で冷却し、ＤＭＦ１滴と次いでオキサリルクロライド（０．２５ｍｌ、０．５ｍｍｏｌ）を５分かけて添加した。反応を１５分間氷浴中で継続し、室温まで温めた。２時間後室温で蒸発乾固し、乾燥塩化メチレン（１０ｍｌ）と共蒸発させ、高真空で１．５時間乾燥させ、化合物１８を得た。
【００６８】
ＦＭＯＣ−ピペリジン１誘導体（０．１４ｇ）を乾燥ピリジン（１０ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。次いでピリジン（３ｍｌ）に溶解し、塩化メチレン（５ｍｌ）と無水アセトニトリル（１ｍｌ）の混液中の酸クロライド（１８）溶液を０℃で滴下した。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、室温まで温めた。反応混合物を室温で１５時間撹拌した後、水（１ｍｌ）を添加し反応を奪活した。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、水洗した。有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させ、トルエンと共蒸発させた。最後に、生成物を０〜８％メタノール−塩化メチレンを溶出液として用いてシリカゲルクロマトグラフィで精製した。所望生成物を含む適当な画分をプールして蒸発させ、化合物１９を得た。化合物１９は、化合物２０を介して化合物２１に転化でき、Ｒ１１０−ピペリジン−ローダミンＥＴカセットとその対応ターミネーターを得た。
【００６９】
エネルギー移動率（ＰＥＴ）に関するＦＲＥＴの効率を、複素環ＦＲＥＴ−カセット及びターミネーターのフルオロセインとローダミン色素について１×ＴＢＥ、８Ｍ尿素中でフルオロメーター（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）で測定し、単一色素標識ターミネーターと比較した。プロットしたグラフから、本発明のＦＲＥＴカセット及びターミネーターが増大したＰＥＴ増加を示すことが明らかである。スペーサー長の長いターミネーター（１１）は、ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ（単一色素標識ターミネーター）よりも５５倍高いＰＥＴを示し、市販の４Ｆよりも３．２倍高いＰＥＴを示したが、短いスペーサーのターミネーター（１０）は４Ｆよりも２．１倍高いＰＥＴを示した。次のターミネーターのＦＡＭ−ピペリジン−ＴＭＲ−１８−ｄｄＡＴＰ（８）は、その吸収スペクトルとの重なりがかなり離れているのでその蛍光増強が望ましいが、単一色素標識ターミネーターに比べて４１倍高いＰＥＴを示し、市販の４Ｆに比べて２．５倍高いＰＥＴを示した。
【００７０】
ＦＡＭ−ピペリジン−Ｃｙ５−Ｘ−ｄｄＮＴＰｓ−の合成
【００７１】
【化１２】
【００７２】
Ｃｙ５をアクセプター色素とするエネルギー移動ターミネーターの合成は実施例１及び実施例２と全く同様に実施できる。ローダミン−ＮＨＳエステルに代えてＣｙ５ ＮＨＳエステルを用いる。
【００７３】
実施例５
単一及びエネルギー移動色素標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸を用いたＤＮＡ配列決定
Ｍ１３ｍｐ１８テンプレートＤＮＡの配列を、標準的な「−４０」プライマーを用いて作成した。反応混合物（２０μｌ）は、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、１０００μＭのｄＩＴＰ、１６０ｎＭのＦＡＭ−１８−ｄｄＧＴＰ、１２５ｎＭのＲ６Ｇ−１１−ｄｄＵＴＰ、９５ｎＭのＦＡＭ−ピペリジン−ＴＭＲ−１８−ｄｄＡＴＰ、６０ｎＭのＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１８−ｄｄＣＴＰ、２ｐｍｏｌの−４０プライマー、２００ｎｇのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ、２０単位のＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅその他の変異ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．０００８単位のＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ無機ピロホスファターゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、３５ｍＭのＫＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有していた。
【００７４】
反応混合物を、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間及び６０℃で１２０秒間の２５サイクル、サーモサイクラー中でインキュベートした。サイクル後反応生成物を定法を用いてエタノール沈殿させ、洗浄し、ホルムアミドローディング緩衝液に再懸濁した。試料を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７７装置又はＭｅｇａＢＡＣＥ １０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にローディングし、結果を標準ソフトウェア法を用いて分析した。
【００７５】
上述の本発明の教示に接した当業者はその教示内容に様々な変更を施すことができる。かかる変更は特許請求の範囲に記載された本発明の技術的範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ピペリジンリンカーから誘導されるＦＲＥＴカセットの合成法及びジデオキシヌクレオチシド−５‘−三リン酸の標識法の概略スキーム。
【図２】リンカー長の異なる様々な濃度のＴＡＭＲＡ標識ｄｄＡＴＰを用いたときの８００塩基でのシグナル強度のプロット。
【図３】ＦＡＭ−Ｐｈｅ−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ（３Ｆ）、ＦＡＭ−ピペリジン−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ（７）及びＦＡＭ−ピペリジン−ＴＡＭＲＡ−１８−ｄｄＡＴＰ（８）終止アンプリコンの単色電気泳動図。
【図４】リンカー長の異なる様々な濃度のＲＯＸ標識ｄｄＣＴＰを用いたときの８００塩基でのシグナル強度のプロット。
【図５】ＦＡＭ−Ｐｈｅ−ＲＯＸ−１１−ｄｄＡＴＰ（４Ｆ）、ＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１１−ｄｄＡＴＰ（１０）及びＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１８−ｄｄＡＴＰ（１１）終止アンプリコンの単色電気泳動図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広範な分子生物学及びＤＮＡ配列決定用途に対して核酸及びタンパク質の標識に使用できる新規複素環ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）カセットに関する。
【０００２】
ハイスループット遺伝子配列決定の現在の一般的慣行は、一般則として、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構に基づいて４種類の異なる標識を有するエネルギー移動（ＥＴ）色素ターミネーターを用い、ドナーの励起波長で励起し、４種類の個々の核酸塩基にコンジュゲートした４種類のアクセプターの波長で発光を測定することによって配列を読み取る。
【０００３】
しかし、現在入手し得るＥＴターミネーターセットは輝度が低いという難点を有する。こうした低い輝度は、ドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動及びアクセプターの発光波長での再発光が非効率的であることに起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合して色素ターミネーターを形成するのに用いられている構造的連結が最適でないことによる。
【０００４】
ＦＲＥＴ効率は主に、関与する色素の相対的な双極子-誘起双極子配向に依存する。色素がコアリンカー分子に共有結合する官能基の配向によって、色素の相対的な双極子−双極子配向が決まる。蛍光色素及び生物学的に重要な分子との共有結合を形成するのに適した官能基を有する複素環式及び脂環式分子は、官能基を３次元に配向させて、結合する基を一定の位置に規定するので、カセットコアとして役立つ。効率の高いＦＲＥＴ色素カセットを誘導しそれらを高感度ＤＮＡ配列決定ターミネーターに変換するため、様々な構造及び環の大きさを有する複素環系がコアカセット分子として選択されてきた。
【０００５】
本発明では、現在入手可能なターミネーターよりも輝度の高い色素標識カセット及び対応ターミネーターの新規セットを提供する。。本発明の色素ターミネーターセットは輝度が向上し、それに応じてＳＮ比が向上しているので、さらに広範な種類のＤＮＡテンプレートの配列決定が可能となる。本発明で開示するコア分子としてピペリジン又はピペラジンアミノ酸の形態の新規蛍光団／リンカーの組合せによって、高輝度のＥＴ色素が構築できるようになる。本発明で開示する複素環ＦＲＥＴカセットは、核酸、タンパク質、炭水化物その他の生体分子の標識に使用できる。
【背景技術】
【０００６】
最近、生体試料中の成分の標識及び検出用に多数の蛍光色素が開発されている。一般に、検出限界を下げるには、これらの蛍光色素は高い吸光係数と量子収率を有していなければならない。
【０００７】
Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構に基づいてストークスシフトを拡大しかつ多様にするために開発され、混合物中の異なる標識を有する試料の同時検出に使用されている色素の１種はＥＴ（エネルギー移動）色素である。これらのＥＴ色素はドナー蛍光団とアクセプター蛍光団、さらにはそれらを目的生体分子と結合させる機能をもつ標識からなる複雑な分子構造を含む。ドナー蛍光団の励起によってドナーに吸収されたエネルギーはＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構でアクセプター蛍光団に移動し、蛍光を発する。単一のドナーに対して異なるアクセプターを用いて１セットのＥＴ色素群を形成すれば、そのセットが単一のドナー周波数で励起されたときにアクセプターの種類に応じて異なる発光が観察できる。これらの異なる発光を定量することによって、これらの色素を目的の生体分子に結合させたときの混合物の各成分を容易に解析することができる。これらのＥＴ色素セットは現在のハイスループット遺伝子配列決定法論の根幹をなす。
【０００８】
従前、様々な組合せの二元蛍光団色素が報告されている。Ｍａｔｈｉｅｓ他の「Ｐｒｏｂｅｓ Ｌａｂｅｌｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｙｅｓ」と題する米国特許第５６８８６４８号、「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｐａｃｅｒ／ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ」と題する米国特許第５７２８５２８号及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌａｂｅｌｓ ｗｉｔｈ ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅｓ ａｓ ｄｏｎｏｒ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ」と題する米国特許第６１５０１０７号（それらの図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、ドナー色素分子とアクセプター色素分子の対を有する蛍光標識のセットが開示されており、標識は配列決定用核酸骨格に結合させることができる。ドナー色素とアクセプター色素を離隔するためのスペーサーとして核酸塩基又は脱塩基糖単位が用いられている。ドナー色素からアクセプター色素への効率的エネルギー移動に最適な距離は約６〜１０塩基であることが判明している。異なる蛍光標識を用いて核酸混合物中の核酸を同定・検出する方法も開示されており、蛍光部分はシアニン色素及びキサンテン類のような群から選択される。蛍光標識は１対の蛍光団を含んでおり、その一方の蛍光団ドナーは蛍光団アクセプターの吸収と重複する発光スペクトルを有していて、励起側から他方へのエネルギーの移動が起こる。
【０００９】
Ｗａｇｇｏｎｅｒ他の「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｓｔｏｋｅｓ ｓｈｉｆｔ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｃｙａｎｉｎｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ」と題する米国特許第６００８３７３号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、第１の吸収及び発光スペクトルを有する第１の蛍光色素と第２の吸光及び発光スペクトルを有する第２の蛍光色素とを含む複合体が開示されている。蛍光色素間のリンカー基はアルキル鎖である。色素の蛍光性によって、それらを配列決定及び核酸の検出に使用することができる。
【００１０】
Ｌｅｅ他の「Ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」と題する米国特許第５８６３７２７号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、ドナー及びアクセプター色素が色素間のリンカーで離隔されたエネルギー移動色素が開示されている。色素間の好ましいリンカーは４−アミノメチル安息香酸である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２）。このリンカーに基づくエネルギー移動ターミネーターＤＮＡ配列決定キットはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（米国カリフォルニア州フォスターシティ）から入手可能であり、Ｂｉｇ Ｄｙｅターミネーターキットとして市販されている。
【００１１】
Ｋｕｍａｒ他の「Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｙｅｓ」と題する国際公開第００／１３０２６号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、エネルギー移動色素、その調製及び生体系における標識としての使用が開示されている。色素は好ましくはカセットの形態であり、それらを各種生体物質に結合させることができる。ドナー色素、アクセプター色素及びジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸はすべて芳香族アミノ酸構造に基づく三官能性リンカーに結合する（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４１，８８６７−８８７１）。これらの構造に基づくエネルギー移動ターミネーターキットはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）からＤＮＡ配列決定用のＤＹＥｎａｍｉｃ ＥＴターミネーターキットとして市販されている。
【００１２】
Ｋｕｍａｒ他の「Ｃｈａｒｇｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｄｉｄｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ」と題する国際公開第０１／１９８４１号（その図面も含めた開示内容全体を援用によって本明細書の内容に組み込む。）には、リンカーアームに正電荷又は負電荷を導入した単一のエネルギー移動色素標識ターミネーターが開示されている。これらのターミネーターは、色素標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸の分解で形成される「色素斑」を全く含まないＤＮＡシークエンシングバンドを得るのに有用である。荷電ターミネーターの使用によって、これらの分解生成物は配列情報の後方（正電荷ターミネーター）又は前方（負電荷ターミネーター）に移動させることができる（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５）。
【００１３】
現在入手可能なＥＴ色素ターミネーターセットは概して輝度が低いという難点を有する。このような低い輝度は、ドナーに吸収されたエネルギーのアクセプターへの移動及びアクセプターの発光波長での再発光が非効率的であることに起因する。こうした非効率性はドナーとアクセプター及び塩基を結合して色素ターミネーターを形成するのに用いられている構造的連結が最適でないことによる。そこで、最大輝度が得られるようなエネルギー移動色素カセットの構築及びその生体分子との結合をさらに改善するニーズが依然として存在している。
【特許文献１】米国特許５６８８６４８号明細書
【特許文献２】米国特許５７２８５２８号明細書
【特許文献３】米国特許６１５０１０７号明細書
【特許文献４】米国特許６００８３７３号明細書
【特許文献５】米国特許５８６３７２７号明細書
【特許文献６】国際公開第００／１３０２６号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０１／１９８４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（１４），２８１６−２８２２
【非特許文献２】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，４１，８８６７−８８７１
【非特許文献３】Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０（１３），２８７７−２８８５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、輝度が高くＤＮＡポリメラーゼの基質となるエネルギー移動色素及び標識ヌクレオチドを提供する。エネルギー移動色素はピペリジン及びピペラジンのような複素環リンカー構造をコア分子として用いてドナー及びアクセプター色素を結合させる。例えばピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸の場合、ドナー色素は二級窒素原子に結合し、アクセプター色素はアミノ基に結合する。分子のカルボン酸残基を用いて、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドその他の生体分子を結合させる。ドナー及びアクセプター色素の結合位置は入れ替えることもできる。
【００１５】
本発明は、本発明の複素環リンカーから誘導される４種類のターミネーターセットも提供する。ターミネーターセットは、フルオロセイン（ＦＡＭ）又はローダミン１１０（Ｒ１１０）をドナー色素として含み、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びローダミンＸ（ＲＯＸ）又はシアニン色素をアクセプター色素として含む。このターミネーターセットはＤＮＡ配列決定用に最適化される。キット中の標識ヌクレオチドターミネーターは既存のキットよりも輝度が高く、均一なバンドを与える。これらの製造方法及びＤＮＡ配列決定における使用についても本発明で開示する。
【００１６】
本発明の複素環ＦＲＥＴ色素の組成及びその製造方法並びにヌクレオシド、ヌクレオチド（一、二又は三リン酸）又はオリゴヌクレオチドのような生体分子にそれらを結合させる方法についても開示する。
【００１７】
太字で示す符号及び文字はスキーム及び実施例に示す化合物の番号を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＦＲＥＴの効率は数多くの因子に依存する。Ｆｏｒｓｔｅｒ理論（Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ， “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｄｕｒｄｒｅｃｈｔ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｍｏｓｃｏｗ １９９９）によれば、その主な因子は以下の通りである。
１）ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なり、
２）ドナーとアクセプターの間隔、及び、
３）ドナーの双極子とアクセプターの双極子の空間的配向。
【００１９】
実際には、問題ははるかに複雑である。ドナーとアクセプター間の特異的な相互作用によって消光が起こる場合があり、ドナー発光が全く存在しないときでもアクセプターからの発光がほとんど認められないことがある。さらに、ドナーがどの程度消光されるかはアクセプターに移動するエネルギーとはほとんど関係なく、観察される発光量ともほとんど関係ない。今回、これらの色素ターミネーターに関する実際のＥＴ過程を説明するための数学的処理を開発したので、以下これらについて説明する。かかる数学的処理には、以下に挙げる３つの実験的に測定可能なパラメーターが最も重要である。
１）ＰＱＥＱ（ドナーの消光率％）、これは以下の通り定義される。
ＰＱＥＱ＝（１−発光ドナー／アクセプター対のドナー／発光アクセプター非存在下での同量のドナー）×１００％
２）ＰＡＥＥ（アクセプター発光効率％）、
ＰＡＥＥ＝（ドナーアクセプター対のアクセプターの発光効率）／（ドナー非存在下でのアクセプターの発光効率）×１００％、及び
３）ＰＥＴ（エネルギー移動率％）、
ＰＥＴ＝ドナーの量子収率×［（ドナー励起波長で励起したアクセプターの発光効率）／（アクセプター非存在下でのドナーの発光効率）］。
【００２０】
上記のＰＥＴは、実際には、ドナー励起波長で励起し、アクセプター発光波長で発光を測定したときのドナー／アクセプター対の量子収率となる。
【００２１】
上述の方法論は１個のドナーと３個以上のアクセプターからなるＥＴ構築体にも拡張できる。
【００２２】
さらに、これらの数値から、ＥＴ過程全体を通しての光子の流れを示すフローダイアグラムを構築できる。一例として、現在ＤＮＡシークエンシング反応に使用されている４種類のＥＴ色素ターミネーターのセット（Ｋｕｍａｒ他の国際公開第００／１３０２６号、Ｎａｍｐａｌｌｉ ｅｔ．ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０００，４１，８８６７）に関する数値を表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【化１】
【００２５】
例示として、例えば化合物（４Ｆ）を用いて光子のフローダイアグラムを構築できる。
【００２６】
【化２】
【００２７】
ダイアグラムの作成は比較的簡単である。化合物（４Ｆ）のＰＱＥＱが９９％に等しいので、ドナー（ＦＡＭ）に吸収された光子１００個のうちドナーによって再発光されるものは１個にすぎない。ＰＥＴは０．１９に等しいが、これは、ドナーに吸収された光子１００個当たり、光子１９個がアクセプター（ＲＯＸ）から発光されることを意味する。ＰＡＥＥは０．３５であるので、その遊離状態におけるＲＯＸの量子収率がＦＡＭに対して１．０であると仮定すると、ＲＯＸアクセプターから光子１９個を発光させるには１９／０．３５、つまり５４個の光子のインプットが必要となる。従って、蛍光以外の過程でアクセプター（ＲＯＸ）が失った光子の数は３５（＝５４−１９）となる。すると、光子の保存則から、ドナーＦＡＭから無放射過程で失われた光子の数は４５（＝１００−１−５４）となるはずである。
【００２８】
表１に示すものよりも輝度の向上した色素ターミネーターセットを求めて鋭意検討した結果、ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸に基づく新規なＥＴ色素を発見した。ピペリジン核の環窒素（ＮＨ）をドナー色素（フルオロセイン）との結合に用いる。ピペリジンの１位のアミノ基をアクセプター色素（ローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、ローダミン−Ｘ、Ｃｙ５等）との結合に用い、ヌクレオシド三リン酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質のような生体分子を活性化カルボン酸に結合させる。ＥＴ色素カセット及びこの構造体から誘導されるターミネーターは輝度が高く、そのジデオキシヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの良好な基質である。
【００２９】
したがって、本発明は、次式のエネルギー移動色素を提供する。
【００３０】
【化３】
【００３１】
式中、Ｄはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるドナー色素であり、
Ｌ１はＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択される官能基であって、この基を介してＤが共有結合しており、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ又はアルキルアミノ基を表し、
Ｌ２はＣ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択されるアミンであって、この基を介してＡが共有結合しており、
Ｘはアルデヒド、酸、酸クロライド、エステル、ヒドロキシメチル、ＣＨ２Ｏ−メシレート、ＣＨ２Ｏ−トリフレート、メルカプトメチレン、ホスホルアミダイトであるか、或いはアミン、チオール、ヒドロキシ又はハロアセチル含有生体分子と共有結合を形成し得る反応性基であり、又はＸ＝Ｌ３Ｂであって、Ｌ３は生体分子Ｂと共有結合を形成し得るカルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、酸クロライド、マレイミド、ヒドラジド又はスルホニルクロライドから構成される官能基であり、Ｂは、ヌクレオシド、ヌクレオシド−一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸、チオリン酸、アルケニル置換もしくはアルキニルアミノ置換ジデオキシヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三リン酸、アミノ酸、タンパク質又は修飾オリゴヌクレオチドからなる群から選択される生体分子であり、
Ａはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【００３２】
別の態様では、本発明は、エネルギー移動色素カセット及び以下の構造の対応ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸、それらの製造法及びＤＮＡ配列決定における使用法を提供する。
【００３３】
【化４】
【００３４】
式中、アクセプター色素は、キサンチン群の色素、ローダミン色素又はシアニン色素から選択され、
ＢＡＳＥはシトシン、チミン、ウラシル、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、７−デアザプリン、７−デアザ−８−アザプリンその他の修飾複素環塩基から選択され、ｎは０〜３である。
【００３５】
アクセプター色素及びドナー色素はピペリジン−１，１−アミノカルボン酸の環窒素又は一級アミノ基のいずれかに互いに交換可能に結合させることができる。
【００３６】
標識用ＥＴ色素カセットは、その他同様の複素環式アミノ酸からも製造でき、その例を以下に示す。
【００３７】
【化５】
【００３８】
上記のすべての複素環式ＦＲＥＴカセットにおいて、ドナー色素（Ｄ）には、カルボキシフルオロセイン（ＦＡＭ）、Ｃｙ３、ローダミングリーン（Ｒ１１０）の５及び６−位置異性体が包含され、アクセプター色素（Ａ）には、５−カルボキシローダミン（Ｒ１１０）、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ又はＲＥＧ）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン（Ｃｙ３）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン（Ｃｙ３．５）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５、５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン（Ｃｙ５．５）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニン（Ｃｙ７）又は関連色素の５及び６−異性体が包含され、アクセプター色素Ａはドナー色素Ｄからエネルギーを受け取ることができるものである。
【００３９】
ＦＡＭ、Ｒ１１０、ＲＥＧ、ＴＡＭＲＡ及びＲＯＸはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国カリフォルニア州フォスターシティ）の商標であり、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５．Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）の商標である。
【００４０】
さらに、本発明はＦＲＥＴカセット（上記参照）を包含するが、これらは環系に窒素原子を有し、Ａ及びＢに対する連結基を１，２−位又は１，３−位に有する。なお、これらの系は１又は２個のキラル中心を有しており、これらのキラル中心がＡ、Ｂ及びＤの相対的配向に影響を及ぼしてエネルギー移動効率（輝度又は量子収率）に影響を与える。
【００４１】
色素とジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸の間に様々なリンカーを有する単一色素標識ターミネーターを多数合成し、それらの輝度（ＰＥＴ）を４８８ｎｍの励起で測定した。単一色素標識ターミネーターの輝度を、本発明のエネルギー移動色素標識ターミネーター及び従前開示されたターミネーターと比較した。ピペリジン由来ターミネーターの合成は図１に示す通り行なった。例えば、実施例１に示すように、Ｎ−ＦＭＯＣ−ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸（１）を保護フルオロセイン−５−カルボン酸クロライド（３）と反応させ、フルオロセイン標識ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸（４）を得た。アクセプター色素（ＮＨＳエステル形）をピペリジンで脱保護した後、アミノ基に結合させた。最後に、酸を対応活性エステルへと活性化した後、適切に連結したプロパルギルアミノ−ｄｄＮＴＰと反応させてピペリジンリンカー由来エネルギー移動色素ターミネーターを得た。また、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−ピペリジニル−１，１−カルボン酸メチルエステルを用いて、本発明の単一及びＥＴ色素カセットを合成することもできる。
【００４２】
単一色素標識ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸（ターミネーター）及び本発明で合成したエネルギー移動ターミネーターすべてについてエネルギー移動効率（ＰＥＴ）を測定した。色素ターミネーターはすべて４８８ｎｍで励起し、発光は個々の発光波長で測定した。結果を以下の表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
表２に記載の色素ターミネーターの分子構造を以下に示す。
【００４５】
【化６】
【００４６】
【化７】
【００４７】
本発明の単一色素標識ターミネーター及びエネルギー移動色素標識ターミネーター（上述）を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡシークエンシング反応で試験した。個々の色素標識ターミネーターの有用性を、配列全体の質、輝度及びバンドの均一性に基づいて確認した。これらの規準に基づいて、新しい色素ターミネーターセットを構築した。この新規セットのターミネーターのＰＥＴを以下に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
本発明には、試薬並びに上述の蛍光水溶性標識複合体を担体材料と共にインキュベートすることを含む試薬の製造法も包含される。複合体、又は複合体もしくは担体の他の反応基と反応してそれらの間に共有結合を形成する官能基を有する担体材料。担体材料は、ポリマー粒子、ガラスビーズ、セル、抗体、抗原、タンパク質、酵素及びヌクレオチドからなる群から選択され、アミノ、スルヒドリル、カルボニル、カルボキシル又は水酸基のいずれかを含むように誘導体化される。また、担体材料は反応基を含んでいてもよく、本発明の蛍光標識複合体は該反応基と反応して共有結合を形成する上述の官能基のいずれかを含んでいてもよい。
【００５０】
別の態様では、本発明の蛍光複合体は、他の化合物と非共有結合で結合させるときは反応基を有する必要がない。例えば、複合体を溶解し、有機溶媒中でポリスチレンのようなポリマー粒子と混合し、乳化重合によって撹拌してもよい。溶媒を蒸発させ、蛍光色素複合体をポリスチレン粒子に吸収させる。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。これらの実施例は例示を目的としたものであり、特許請求の範囲及び本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明は、本明細書中の教示内容から明らかなあらゆる変更を包含する。以下に太字で示す符号は、合成における符号を付した各種の化合物を示す。
【００５２】
実施例１
ピペリジンリンカーから誘導したターミネーターの合成（ＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−Ｘ−ｄｄＮＴＰｓ）
【００５３】
【化８】
【００５４】
４−Ｎ−（ジピバロイルフルオロセイン−５−カルボニル）−Ｎ−ＦＭＯＣ−ピペリジニル−１，１−アミノカルボン酸（４）
Ｎ−ＦＭＯＣ−ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸１（０．４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１０ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。乾燥した基質を塩化メチレン（５ｍｌ）とピリジン（５ｍｌ）の混液中に溶解した。反応フラスコを氷浴中で冷却し、ジピバロイル−５−カルボキシフルオレセイン酸クロライド３（１．２５ｍｌ、ジピバロイル−５−カルボキシフルオレセイン２を塩化メチレン中ＤＭＦ存在下シュウ酸クロライドで処理して調製）の塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液を加えた。反応混合物を０〜５℃で２時間撹拌し、放置して室温まで温めた。反応を一晩継続し、水（０．５ｍｌ）の添加によって奪活した。反応混合物をクロロホルム（１００ｍｌ）で希釈し、水（５０ｍｌ）で洗浄した。有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させた。残渣をトルエンと共蒸発し、塩化メチレン中０〜５％メタノール勾配を溶出液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。
【００５５】
４−Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボニル）ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸（５）
ＴＨＦ（１５ｍｌ）中の化合物４（１５０ｍｇ）の溶液にピペリジン（５ｍｌ）を添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、残渣を塩化メチレン中０〜１００％メタノール勾配を溶出液として用いたカラムクロマトグラフィーで精製した。
【００５６】
４−Ｎ−（フルオレセイン−５−カルボニル）−Ｎ−ＲＯＸ−ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸（６）
化合物５（２０ｍｇ）とＲＯＸ−ＮＨＳエステルの混合物を、乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。次いで無水ＤＭＳＯ（５ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍｌ）を添加し、反応混合物を室温で６．５時間撹拌した。反応混合物を、塩化メチレン中で充填したシリカゲルカラムにかけた。生成物を、塩化メチレン中０〜１００％メタノール、次いでメタノール中１％トリフルオロ酢酸を用いて溶出した。生成物を含む画分を蒸発させ、残渣をトルエンと共蒸発させた。残渣をさらに、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製した。溶出液は、４０％アセトニトリル含有０．１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウム〜４０％アセトニトリル含有１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウムであった。生成物を含む画分を回収して蒸発させ、化合物６を得た。
【００５７】
５−ＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ（１０）
化合物６（１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（８ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。次いで乾燥ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、ＤＭＦ（１ｍｌ）中のジスクシンイミジルカーボネート（１８ｍｇ）の溶液を添加した。反応フラスコを−６０℃に冷却し、ＤＭＦ（１ｍｌ）中のＤＭＡＰ（９ｍｇ）溶液を滴下した。１０分後、反応混合物の温度を−３０℃に上げ、ｐＨ９．５のＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（８ｍｌ）中１１−ｄｄＣＴＰ（０．３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物の温度を室温まで上げて、反応を３時間続けた。反応混合物を直接、５０％メタノール−クロロホルム中で充填したシリカゲルカラムにかけた。カラムをメタノールで洗浄し、生成物をイソプロパノールと水酸化アンモニウムと水（６：３：１）の混液で溶出した。生成物を含む画分を回収して蒸発させて濃縮し、０．４μフィルターで濾過し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。生成物を４０％アセトニトリル含有０．１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウム〜４０％アセトニトリル含有１Ｎ重炭酸トリエチルアンモニウムの勾配で溶出した。純粋な生成物を含む適当な画分を回収して蒸発させた。残渣をメタノール（５×３０ｍｌ）と共蒸発して化合物１０を得た。
【００５８】
５−ＦＡＭ−ピペリジニル−ＲＯＸ−１８−ｄＣＴＰ（１１）
ＦＡＭ−ピペリジニル−ＲＯＸのＥＴカセット６（４ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した。全８ｍｇのＤＳＣ（０．０３ｍｍｏｌ、８当量）を添加した。混合物を撹拌して−６０℃に冷却し、この温度でＤＳＣ（２．４ｍｇ）の無水ＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を滴下した。１５分後に、ＮＨＳエステルに完全に転化されていることがＴＬＣで確認された。反応混合物の温度を−３０℃に上げ、１８−ｄｄＣＴＰ（１当量）の緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５）を添加した。次いで、反応混合物を室温まで温め、さらに３時間撹拌した。所望生成物１１を、化合物１０について説明した通りＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製した。
【００５９】
実施例２
ＦＡＭ−ピペリジン−ＴＡＭＲＡ−Ｘ−ｄｄＮＴＰｓ−の合成
【００６０】
【化９】
【００６１】
４−Ｎ−（フルオロセイン−５−カルボニル）−Ｎ４−ＴＡＭＲＡ−ピペリジニル−１、１−アミノカルボン酸（９）
化合物５（２４ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解し、撹拌溶液に室温でＤＩＰＥＡ（０．１ｍＬ、０．５８ｍｍｏｌ、１２当量）を添加し、次いでＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル（３０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、所望生成物９（６０％）を、化合物６について説明した通りＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて単離した。
【００６２】
５−ＦＡＭ−ピペリジニル−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ（７）及び５−ＦＡＭ−ピペリジニル−ＴＡＭＲＡ−１８−ｄｄＡＴＰ（８）
８当量のＤＳＣ、５当量のＤＭＡＰ及び１当量の１１−又は１８−ｄｄＡＴＰを用いて３．８μｍｏｌｅスケールで化合物９から化合物７及び８を、化合物１０について説明したのと同様の反応条件を用いて合成した。
【００６３】
実施例３
ＦＡＭ−ピペリジン−Ｒ１１０−Ｘ−ｄｄＮＴＰ及びＦＡＭ−ピペリジン−Ｒ６Ｇ−Ｘ−ｄｄＮＴＰの合成
５−ＦＡＭ−ピペリジニル−Ｒ１１０−１１−ｄｄＧＴＰ（１５）
化合物７と同様の手順で化合物５から化合物１４を介してターミネーター１５を合成し精製した。
【００６４】
【化１０】
【００６５】
実施例４
ピペリジン由来単一色素（ドナー色素としてＲ１１０）カセットの合成
ピペリジニル−Ｒ１１０カセット合成（１９）
【００６６】
【化１１】
【００６７】
ＴＦＡ−５−Ｒ１１０酸１７（０．２ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。乾燥材料を無水ＴＨＦ（６ｍｌ）に溶解した。反応フラスコを氷浴中で冷却し、ＤＭＦ１滴と次いでオキサリルクロライド（０．２５ｍｌ、０．５ｍｍｏｌ）を５分かけて添加した。反応を１５分間氷浴中で継続し、室温まで温めた。２時間後室温で蒸発乾固し、乾燥塩化メチレン（１０ｍｌ）と共蒸発させ、高真空で１．５時間乾燥させ、化合物１８を得た。
【００６８】
ＦＭＯＣ−ピペリジン１誘導体（０．１４ｇ）を乾燥ピリジン（１０ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた。次いでピリジン（３ｍｌ）に溶解し、塩化メチレン（５ｍｌ）と無水アセトニトリル（１ｍｌ）の混液中の酸クロライド（１８）溶液を０℃で滴下した。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、室温まで温めた。反応混合物を室温で１５時間撹拌した後、水（１ｍｌ）を添加し反応を奪活した。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、水洗した。有機層を乾燥させ（硫酸ナトリウム）、蒸発させ、トルエンと共蒸発させた。最後に、生成物を０〜８％メタノール−塩化メチレンを溶出液として用いてシリカゲルクロマトグラフィで精製した。所望生成物を含む適当な画分をプールして蒸発させ、化合物１９を得た。化合物１９は、化合物２０を介して化合物２１に転化でき、Ｒ１１０−ピペリジン−ローダミンＥＴカセットとその対応ターミネーターを得た。
【００６９】
エネルギー移動率（ＰＥＴ）に関するＦＲＥＴの効率を、複素環ＦＲＥＴ−カセット及びターミネーターのフルオロセインとローダミン色素について１×ＴＢＥ、８Ｍ尿素中でフルオロメーター（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）で測定し、単一色素標識ターミネーターと比較した。プロットしたグラフから、本発明のＦＲＥＴカセット及びターミネーターが増大したＰＥＴ増加を示すことが明らかである。スペーサー長の長いターミネーター（１１）は、ＲＯＸ−１１−ｄｄＣＴＰ（単一色素標識ターミネーター）よりも５５倍高いＰＥＴを示し、市販の４Ｆよりも３．２倍高いＰＥＴを示したが、短いスペーサーのターミネーター（１０）は４Ｆよりも２．１倍高いＰＥＴを示した。次のターミネーターのＦＡＭ−ピペリジン−ＴＭＲ−１８−ｄｄＡＴＰ（８）は、その吸収スペクトルとの重なりがかなり離れているのでその蛍光増強が望ましいが、単一色素標識ターミネーターに比べて４１倍高いＰＥＴを示し、市販の４Ｆに比べて２．５倍高いＰＥＴを示した。
【００７０】
ＦＡＭ−ピペリジン−Ｃｙ５−Ｘ−ｄｄＮＴＰｓ−の合成
【００７１】
【化１２】
【００７２】
Ｃｙ５をアクセプター色素とするエネルギー移動ターミネーターの合成は実施例１及び実施例２と全く同様に実施できる。ローダミン−ＮＨＳエステルに代えてＣｙ５ ＮＨＳエステルを用いる。
【００７３】
実施例５
単一及びエネルギー移動色素標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸を用いたＤＮＡ配列決定
Ｍ１３ｍｐ１８テンプレートＤＮＡの配列を、標準的な「−４０」プライマーを用いて作成した。反応混合物（２０μｌ）は、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、１０００μＭのｄＩＴＰ、１６０ｎＭのＦＡＭ−１８−ｄｄＧＴＰ、１２５ｎＭのＲ６Ｇ−１１−ｄｄＵＴＰ、９５ｎＭのＦＡＭ−ピペリジン−ＴＭＲ−１８−ｄｄＡＴＰ、６０ｎＭのＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１８−ｄｄＣＴＰ、２ｐｍｏｌの−４０プライマー、２００ｎｇのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ、２０単位のＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅその他の変異ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．０００８単位のＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ無機ピロホスファターゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、３５ｍＭのＫＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有していた。
【００７４】
反応混合物を、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間及び６０℃で１２０秒間の２５サイクル、サーモサイクラー中でインキュベートした。サイクル後反応生成物を定法を用いてエタノール沈殿させ、洗浄し、ホルムアミドローディング緩衝液に再懸濁した。試料を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７７装置又はＭｅｇａＢＡＣＥ １０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にローディングし、結果を標準ソフトウェア法を用いて分析した。
【００７５】
上述の本発明の教示に接した当業者はその教示内容に様々な変更を施すことができる。かかる変更は特許請求の範囲に記載された本発明の技術的範囲に属する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ピペリジンリンカーから誘導されるＦＲＥＴカセットの合成法及びジデオキシヌクレオチシド−５‘−三リン酸の標識法の概略スキーム。
【図２】リンカー長の異なる様々な濃度のＴＡＭＲＡ標識ｄｄＡＴＰを用いたときの８００塩基でのシグナル強度のプロット。
【図３】ＦＡＭ−Ｐｈｅ−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ（３Ｆ）、ＦＡＭ−ピペリジン−ＴＡＭＲＡ−１１−ｄｄＡＴＰ（７）及びＦＡＭ−ピペリジン−ＴＡＭＲＡ−１８−ｄｄＡＴＰ（８）終止アンプリコンの単色電気泳動図。
【図４】リンカー長の異なる様々な濃度のＲＯＸ標識ｄｄＣＴＰを用いたときの８００塩基でのシグナル強度のプロット。
【図５】ＦＡＭ−Ｐｈｅ−ＲＯＸ−１１−ｄｄＡＴＰ（４Ｆ）、ＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１１−ｄｄＡＴＰ（１０）及びＦＡＭ−ピペリジン−ＲＯＸ−１８−ｄｄＡＴＰ（１１）終止アンプリコンの単色電気泳動図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式のエネルギー移動色素標識カセット。
【化１】
式中、Ｄはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるドナー色素であり、
Ｌ１はＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択される官能基であって、この基を介してＤが共有結合しており、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ又はアルキルアミノ基を表し、
Ｌ２はＣ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択されるアミンであって、この基を介してＡが共有結合しており、
Ｘはアルデヒド、酸、酸クロライド、エステル、ヒドロキシメチル、ＣＨ２Ｏ−メシレート、ＣＨ２Ｏ−トリフレート、メルカプトメチレン、ホスホルアミダイトであるか、或いはアミン、チオール、ヒドロキシ又はハロアセチル含有生体分子と共有結合を形成し得る反応性基であり、
Ａはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【請求項２】
次式のエネルギー移動色素標識化合物。
【化２】
式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡは請求項１で定義した通りであり、
Ｌ３は、生体分子Ｂと共有結合を形成し得るカルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、酸クロライド、マレイミド、ヒドラジド又はスルホニルクロライドからなる群から選択される官能基であり、
Ｂはヌクレオシド、ヌクレオシド−一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸、チオリン酸、アルケニル置換又はアルキニルアミノ置換ジデオキシヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三リン酸、アミノ酸、タンパク質又は修飾オリゴヌクレオチドからなる群から選択される生体分子であり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【請求項３】
次式のエネルギー移動色素及び色素標識化合物。
【化３】
式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ａ、Ｌ３及びＢは請求項２で定義した通りであり、
ＺはＨ、アルキレン、アルキル、アリル又はそれらの組合せであり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【請求項４】
Ｂがアルケニル置換又はアルキニルアミノ置換ヌクレオシド三リン酸又はオリゴヌクレオチドである、請求項２又は請求項３記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項５】
Ｂがアルケニル置換又はアルキニルアミノ置換ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸である、請求項２又は請求項３記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項６】
Ｌ３がピリミジンのＣ５位に、又はアルキニル、アルケニルもしくは飽和側鎖を介して７−デアザプリンのＣ７位に結合している、請求項２又は請求項３記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項７】
Ｄ及びＡが、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５、５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニン又は関連色素からなる群から選択され、アクセプター色素Ａが、ドナー色素Ｄからエネルギーを受け取ることができる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項８】
ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であって、
ＤＮＡ分子に該ＤＮＡとハイブリダイズし得るプライマー分子をアニールしたものを、熱安定ＤＮＡポリメラーゼと請求項２又は請求項３記載の化合物を含む容器中でインキュベートし、
上記インキュベーション反応のＤＮＡ生成物をサイズ分離し、もってＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部を決定できるようにする
ことを含んでなる方法。
【請求項９】
請求項２又は請求項３の化合物とＤＮＡポリメラーゼとを備えるＤＮＡ分析用キット。
【請求項１０】
次式の化合物。
【化４】
式中、Ａは請求項１記載のアクセプター色素であり、
ＢＡＳＥはシトシン、チミン、ウラシル、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、７−デアザプリン、７−デアザ−８−アザプリン及びこれらの同族体からなる群から選択され、
ｎは０〜３である。
【請求項１１】
請求項１０記載の化合物を備えるＤＮＡ配列決定用キット。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに備える請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
請求項１０記載の１種以上の化合物のヌクレオシド部分を含むデオキシリボ核酸配列。
【請求項１４】
ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であって、
ａ）ＤＮＡ分子に該ＤＮＡ分子とハイブリダイズし得るプライマー分子をアニールしたものを、熱安定ＤＮＡポリメラーゼと請求項１０記載の化合物を含む容器中でインキュベートし、
ｂ）上記インキュベーション反応のＤＮＡ生成物をサイズ分離し、もってＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部を決定できるようにする
ことを含んでなる方法。
【請求項１５】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化５】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１６】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化６】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１７】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化７】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１８】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化８】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１９】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化９】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１】
次式のエネルギー移動色素標識カセット。
【化１】
式中、Ｄはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるドナー色素であり、
Ｌ１はＨ、Ｃ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択される官能基であって、この基を介してＤが共有結合しており、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は独立にＨ、アルキル、ハロ、ヒドロキシ、チオ、ニトロ、アミノ又はアルキルアミノ基を表し、
Ｌ２はＣ１−Ｃ２０アルキニルアミン、アルキノール、アルケンアミン、アルキルアミン、ケト及びチオールからなる群から選択されるアミンであって、この基を介してＡが共有結合しており、
Ｘはアルデヒド、酸、酸クロライド、エステル、ヒドロキシメチル、ＣＨ２Ｏ−メシレート、ＣＨ２Ｏ−トリフレート、メルカプトメチレン、ホスホルアミダイトであるか、或いはアミン、チオール、ヒドロキシ又はハロアセチル含有生体分子と共有結合を形成し得る反応性基であり、
Ａはキサンチン色素、ローダミン色素及びシアニン色素からなる群から選択されるアクセプター色素であり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【請求項２】
次式のエネルギー移動色素標識化合物。
【化２】
式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＡは請求項１で定義した通りであり、
Ｌ３は、生体分子Ｂと共有結合を形成し得るカルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、酸クロライド、マレイミド、ヒドラジド又はスルホニルクロライドからなる群から選択される官能基であり、
Ｂはヌクレオシド、ヌクレオシド−一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸、チオリン酸、アルケニル置換又はアルキニルアミノ置換ジデオキシヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド三リン酸、アミノ酸、タンパク質又は修飾オリゴヌクレオチドからなる群から選択される生体分子であり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【請求項３】
次式のエネルギー移動色素及び色素標識化合物。
【化３】
式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ２、Ａ、Ｌ３及びＢは請求項２で定義した通りであり、
ＺはＨ、アルキレン、アルキル、アリル又はそれらの組合せであり、
ＡとＤの位置は互いに交換可能である。
【請求項４】
Ｂがアルケニル置換又はアルキニルアミノ置換ヌクレオシド三リン酸又はオリゴヌクレオチドである、請求項２又は請求項３記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項５】
Ｂがアルケニル置換又はアルキニルアミノ置換ジデオキシヌクレオシド−５′−三リン酸である、請求項２又は請求項３記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項６】
Ｌ３がピリミジンのＣ５位に、又はアルキニル、アルケニルもしくは飽和側鎖を介して７−デアザプリンのＣ７位に結合している、請求項２又は請求項３記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項７】
Ｄ及びＡが、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−５−カルボキシローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−ジスルホナト−カルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−カルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５、５′−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−４，５，４′、５′−（１，３−ジスルホナト）ジベンゾ−ジカルボシアニン、１−（ε−カルボキシペンチル）−１′−エチル−３，３，３′，３′−テトラメチル−５，５′−（１，３−ジスルホナト）トリカルボシアニン又は関連色素からなる群から選択され、アクセプター色素Ａが、ドナー色素Ｄからエネルギーを受け取ることができる、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のエネルギー移動色素標識化合物。
【請求項８】
ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であって、
ＤＮＡ分子に該ＤＮＡとハイブリダイズし得るプライマー分子をアニールしたものを、熱安定ＤＮＡポリメラーゼと請求項２又は請求項３記載の化合物を含む容器中でインキュベートし、
上記インキュベーション反応のＤＮＡ生成物をサイズ分離し、もってＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部を決定できるようにする
ことを含んでなる方法。
【請求項９】
請求項２又は請求項３の化合物とＤＮＡポリメラーゼとを備えるＤＮＡ分析用キット。
【請求項１０】
次式の化合物。
【化４】
式中、Ａは請求項１記載のアクセプター色素であり、
ＢＡＳＥはシトシン、チミン、ウラシル、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、７−デアザプリン、７−デアザ−８−アザプリン及びこれらの同族体からなる群から選択され、
ｎは０〜３である。
【請求項１１】
請求項１０記載の化合物を備えるＤＮＡ配列決定用キット。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに備える請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
請求項１０記載の１種以上の化合物のヌクレオシド部分を含むデオキシリボ核酸配列。
【請求項１４】
ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定する方法であって、
ａ）ＤＮＡ分子に該ＤＮＡ分子とハイブリダイズし得るプライマー分子をアニールしたものを、熱安定ＤＮＡポリメラーゼと請求項１０記載の化合物を含む容器中でインキュベートし、
ｂ）上記インキュベーション反応のＤＮＡ生成物をサイズ分離し、もってＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部を決定できるようにする
ことを含んでなる方法。
【請求項１５】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化５】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１６】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化６】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１７】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化７】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１８】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化８】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【請求項１９】
次式で表される請求項１０記載の化合物。
【化９】
式中、ＢＡＳＥはアデニン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ウラシル、シトシン、ヒポキサンチン及び７−デアザ−ヒポキサンチンからなる群から選択される。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５１１５８１（Ｐ２００６−５１１５８１Ａ）
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６３８１４（Ｐ２００４−５６３８１４）
【出願日】平成１５年１２月１７日（２００３．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０５７３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５９０１１
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５９８０４１４６３）アマシャム・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月１７日（２００３．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０５７３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５９０１１
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５９８０４１４６３）アマシャム・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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