生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法
【課題】反応効率及び検出感度の高い生体物質検出方法を得る。
【解決手段】表面に検体中の特定の生体物質と反応するプローブが固定された複数のプローブ固定済みビーズＢを用いて生体物質の検出を行う生体物質検出方法であって、生体物質とプローブを反応させる第１の工程と、各々のプローブ固定済みビーズＢの間に、プローブと結合した生体物質を検出する発光物質を生成するための化学発光基質液と混和しないオイルを導入し、個々のプローブ固定済みビーズＢを分離する第２の工程と、オイルによって分離されたプローブ固定済みビーズＢの周囲に、化学発光基質液を供給する第３の工程と、生成された発光物質を検出する第４の工程と、を備える。
【解決手段】表面に検体中の特定の生体物質と反応するプローブが固定された複数のプローブ固定済みビーズＢを用いて生体物質の検出を行う生体物質検出方法であって、生体物質とプローブを反応させる第１の工程と、各々のプローブ固定済みビーズＢの間に、プローブと結合した生体物質を検出する発光物質を生成するための化学発光基質液と混和しないオイルを導入し、個々のプローブ固定済みビーズＢを分離する第２の工程と、オイルによって分離されたプローブ固定済みビーズＢの周囲に、化学発光基質液を供給する第３の工程と、生成された発光物質を検出する第４の工程と、を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の塩基配列を有する核酸分子などの生体物質を検出するための、生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液や組織細胞などの検体中に、疾患に由来する特定の遺伝子が存在するか否かを検査する手法の一つにＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ遺伝子と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。従来、検体中に含まれる特定の遺伝子の検出精度をあげるため、検体中の特定の遺伝子とプローブ遺伝子との反応効率を高くする工夫がなされている。例えば、反応中に検体液の攪拌を行って検体液の分布を改善させることにより、反応効率を上げる方法が提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、キャピラリー内にガラスビーズを配置する事で試料の流れに乱れを生じさせ、キャピラリー内壁もしくはガラスビーズ上に固定したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション効率を上げる提案が開示されている。
また、特許文献２には、種々のＤＮＡプローブを固定した粒子を一定の順序で整列させたプローブアレーが開示されている。
また、特許文献３には、磁気微粒子とプローブ付きガラスビーズを組合せる事でハイブリダイゼーション後にビーズの種類ごとにビーズを識別、回収する機構が提案されている。
特許文献４には、多孔板の孔の中に多孔性の吸着性領域を設けてそこにプローブを固定し、ターゲットを含む溶液がプローブと接触しながら循環するための流路を備えた生化学解析用ユニット構造体が提案されている。
【０００４】
【特許文献１】特許第３８１８２７７号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９９７号公報
【特許文献３】特許第３７１１９８８号公報
【特許文献４】特開２００４−３６１３１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プローブと反応した物質を検出する主な方法には、蛍光標識剤を用いる方法と、化学発光物質を用いる方法がある。蛍光標識剤を用いる方法では、蛍光標識剤が検出される物質に結合している。一方、化学発光物質を用いる方法は、検出される物質に結合している酵素が触媒となって、発光物質が生成される。このため、化学発光物質を用いた方法では、生成された発光物質が反応容器内で混ざり合ってしまうため、どのプローブによって検出されたものなのか区別がつかなくなってしまう。一方、蛍光標識剤を用いる方法では、標識剤同士が混ざってしまう問題がない。特許文献１，２に記載された方法では、ＤＮＡプローブを固定したビーズの分離が難しいため、ハイブリダイゼーション後の検出には蛍光標識剤を用いる事が前提になる。しかし、化学発光物質を用いる方法は、蛍光標識剤を用いる方法に比べ、より低コストで高感度な検出が可能であるため、検出方法には化学発光物質による方式を用いるのが望ましい。
【０００６】
また、特許文献３に開示された従来技術は、ビーズ上にハイブリダイゼーションした検体遺伝子を回収する事が目的であり、化学発光法による検出を前提とした機構ではない。
また、特許文献４に開示された従来技術では、プローブ遺伝子が固定化した吸着性領域をハイブリダイゼーション後に分離する事は不可能である。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、反応効率及び検出感度の高い生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る生体物質検出カートリッジは、検体と、前記検体中の特定の生体物質と反応するプローブが表面に固定された複数の粒子を導入可能な第１の流路と、前記第１の流路と接続され、前記第１の流路内の個々の前記粒子の間に、第１の液体を導入するための第２の流路と、前記第１の流路と接続され、前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給するための第３の流路と、を備え、前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないものである。
【０００９】
本発明によれば、第２の液体と混和しない第１の液体を挟んで各粒子を分離してから、検出用の物質の生成を行うことができるので、検出用の物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。よって、より検出感度の高い化学発光物質による方法を用いて検出を行うことができる。また、各々の粒子にそれぞれ異なる１種類のプローブを固定することができるので、一検体につき多項目の検出が可能である。更に、粒子による液体攪拌効果により前記検体と前記プローブの反応効率が向上する。
【００１０】
また、前記第１の流路は、前記検体と前記プローブとの反応を行うための反応用流路と、前記反応の結果を検出するための物質を生成するための検出用流路と、を備えることが望ましい。
これにより、反応用流路を検体の往復送液が可能な構造に容易にすることができ、前記検体と前記プローブの反応効率を向上させることができる。
【００１１】
また、前記第１の流路と接続され、前記第１の流路よりも速い流速に制御することが可能な第４の流路を備えることが望ましい。
これにより、流速の差を利用して粒子間の距離を大きくし、個々の粒子の分離をより容易かつ高精度に行うことができる。
【００１２】
本発明に係る生体物質検出装置は、上記の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、前記粒子を検出する粒子検出装置と、生成された前記物質を検出する検出装置とを備え、前記粒子検出装置によって前記粒子が検出された場合にのみ、前記検出装置によって前記物質の検出を行うものである。
これにより、粒子が含まれない領域の検出を行って、測定精度が低下することを防止できる。
【００１３】
本発明に係る生体物質検出装置は、上記の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、前記第４の流路の流速が前記第１の流路の流速よりも速くなるように制御する流速制御装置を備えたものである。
これにより、流速の差を利用して粒子間の距離を大きくし、個々の粒子の分離をより容易かつ高精度に行うことができる。
【００１４】
本発明に係る生体物質検出方法は、表面に検体中の特定の生体物質と反応するプローブが固定された複数の粒子を用いて、前記生体物質の検出を行う生体物質検出方法であって、前記生体物質と前記プローブを反応させる第１の工程と、各々の前記粒子の間に、第１の液体を導入し、個々の前記粒子を分離する第２の工程と、前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給する第３の工程と、前記反応の結果を検出する第４の工程と、を備え、前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないことを特徴とするものである。
【００１５】
本発明によれば、第２の液体と混和しない第１の液体を挟んで各粒子を分離してから、検出用の物質の生成を行うことができるので、検出用の物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。よって、より検出感度の高い化学発光物質による方法を用いて検出を行うことができる。また、各々の粒子にそれぞれ異なる１種類のプローブを固定することができるので、一検体につき多項目の検出が可能である。更に、粒子による液体攪拌効果により前記検体と前記プローブの反応効率が向上する。
【００１６】
また、前記反応の結果を検出するための物質は、酵素反応により生成される化学発光物質であることを特徴とすることが望ましい。
これにより、第２の液体の組成を調整することにより発光物質の産出量を増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【００１７】
また、前記第１の液体が前記第２の液体と異なる色に着色されていることが望ましい。
これにより、第１の液体の相と第２の液体の相の区別が容易になり、検出を効率よく行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本発明の実施の形態１による核酸検出装置（生体物質検出装置）１の構成を示す斜視図である。図に示すように、核酸検出装置１は、検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）１０を設置するためのステージ２、第１のポンプ３、第２のポンプ４、第３のポンプ５、カメラ（粒子検出装置）６、ＣＣＤカメラ（検出装置）７を備えている。
【００１９】
第１のポンプ３、第２のポンプ４、及び第３のポンプ５は、例えばシリンジポンプやマイクロポンプを用いることができる。
【００２０】
図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジ１０の分解斜視図、図２（Ｂ）は検出カートリッジ１０の上面図である。検出カートリッジ１０は、基板１０１，１０２を貼り合わせて構成されている。基板１０１，１０２は、例えばガラス基板、アクリル基板、ポリカーボネート基板などの透明基板で形成されている。
【００２１】
基板１０１には、第１のポンプ接続口１０３、ビーズ注入口１０４、試薬／洗浄液導入口１０５、第２のポンプ接続口１０６、第３のポンプ接続口１０７、及びビーズ排出口１０８の６個の貫通孔が形成されている。基板１０２には、ハイブリダイゼーション反応用流路（第１の流路、反応用流路）１０９、オイル導入用流路（第２の流路）１１０、発光基質液導入用流路（第３の流路）１１１、検出用流路（第１の流路）１１２、及びビーズ注入用流路１１３が形成されている。
【００２２】
図に示すように、第１のポンプ接続口１０３、ビーズ注入口１０４、試薬／洗浄液導入口１０５、第２のポンプ接続口１０６、第３のポンプ接続口１０７、ビーズ排出口１０８は、それぞれハイブリダイゼーション反応用流路１０９、ビーズ注入用流路１１３、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９、オイル導入用流路１１０、発光基質液導入用流路１１１、検出用流路１１２の端部に対応する位置に形成されている。各々の流路の送液方向に垂直な断面の幅、深さはそれぞれ１００μｍである。
【００２３】
第１のポンプ接続口１０３、第２のポンプ接続口１０６、第３のポンプ接続口１０７は、それぞれキャピラリーチューブを介して第１のポンプ３、第２のポンプ４、第３のポンプ５に繋がれている。
【００２４】
次に、本実施形態による検出カートリッジ１０を用いた、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理およびハイブリダイゼーションの検出処理について説明する。
【００２５】
まず、図３及び図４を用いてハイブリダイゼーション処理について説明する。まず、ビーズ排出口１０８と試薬／洗浄液導入口１０５を封止した状態で、ビーズ注入口１０４からビーズ注入用流路１１３にプローブ固定済みビーズ（粒子）Ｂの分散液を注入し、第１のポンプ３を駆動してプローブ固定済みビーズＢをハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に導入する。ハイブリダイゼーション反応用流路１０９の両端にはダム部Ｄが設けられており、プローブ固定済みビーズＢは塞き止められ、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９外へ排出されるのを防ぐ事ができる。
【００２６】
プローブ固定済みビーズＢは、直径８０μｍの球体であり、表面にプローブが塗布されている。
プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。
【００２７】
なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。
【００２８】
本実施形態では、個々のプローブ固定済みビーズＢには、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、一検体につき多項目の検出が可能である。
【００２９】
なお、プローブ固定済みビーズＢの表面は、親水処理が施されていることが望ましい。また、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９の表面にも親水処理が施されていることが望ましい。
【００３０】
次に、ビーズ注入口１０４とビーズ排出口１０８を封止した状態で、試薬／洗浄液導入口１０５からブロッキング液を充填し、第１のポンプ３を駆動してブロッキング液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液する。これにより、プローブが固定化されていない領域をブロッキングすることができる。ブロッキングは約１０分行う。
【００３１】
次に、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５からブロッキング液を排出した後、第１のポンプを用いてハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液することにより、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内を十分に洗浄する。
【００３２】
洗浄液を排出した後、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５から、ビオチン標識した検体試料を充填し、第１のポンプ３を駆動して検体試料をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液する。これにより、プローブ固定済みビーズＢに固定されているプローブと反応（ハイブリダイゼーション）させる。ハイブリダイゼーションは１〜３時間行うのが望ましい。
図４に示すように、第１のポンプ３を駆動することにより、検体試料は図中の矢印Ｃで示す範囲を往復する。図に示すように、検体試料が往復する範囲の両端にはダム部Ｄが設けられている。図４（Ｂ）にダム部Ｄを側面から見た図を示す。プローブ固定済みビーズＢはダム部Ｄを越えることができないため、プローブ固定済みビーズＢがハイブリダイゼーション反応用流路１０９外へ排出されてしまうのを防ぐことができる。このように、検体試料が攪拌され、プローブに短い時間でより多くのターゲット核酸が接することになるので、ハイブリダイゼーションの効率が向上する。
【００３３】
ビオチン標識した検体試料溶液の調整方法について説明する。
検体試料は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルを含む。必要に応じて、ＰＣＲ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。
具体的には、まず、試料中に第１及び第２のプライマーを加え、温度サイクルをかける。第１のプライマーはターゲットとなる核酸の一部と特異的に結合し、第２のプライマーはターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸を含む二本鎖核酸と第１及び第２のプライマーが結合すると伸長反応によってターゲット核酸を含む二本鎖核酸が増幅される。十分に標的核酸を含む二本鎖核酸が増幅された後に、試料中に第３のプライマーを加えて温度サイクルをかける。第３のプライマーは、伸長反応時にビオチンの取込みが可能であり、ターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸に相補的な核酸と、第３のプライマーが結合すると伸長反応によってビオチンで標識されたターゲット核酸が増幅される。結果として、試料中にターゲット核酸が含まれている場合は標識されたターゲット核酸が生成され、試料中にターゲット核酸が含まれない場合は標識されたターゲット核酸は生成されない。なお、ここでは、標識物質はビオチンとしたが、他の酵素や、蛍光物質等でも良い。
【００３４】
次に、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５から試料溶液を排出した後、第１のポンプ３を用いてハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液することにより、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内を十分に洗浄する。
【００３５】
次に、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５からハイブリダイゼーション反応用流路１０９内にストレプトアビジン標識した化学発光用酵素（ＨＲＰ）液を充填し、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で約５分間往復送液する。
次に、ＨＲＰ液を排出した後、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液することにより、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内を十分に洗浄する。
洗浄液を排出した後、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に緩衝液を充填する。
【００３６】
次に、検出処理について説明する。
検出処理工程では、ビーズ注入口１０４と試薬／洗浄液導入口１０５を封止する。まず、第２のポンプ接続口１０６からオイル導入用流路１１０にオイル（第１の液体）を注入し、第２のポンプ４を駆動してオイルをハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。同時に、第３のポンプ接続口１０７から発光基質液導入用流路１１１に化学発光基質液（第２の液体）を注入し、第３のポンプ５を駆動して化学発光基質液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。ここで、化学発光基質液は化学発光基質（ルミノール）と過酸化水素を含む溶液である。
また、同時に第１のポンプ３を駆動し、プローブ固定済みビーズＢをハイブリダイゼーション反応用流路１０９内から、検出用流路１１２内へ移動させる。
【００３７】
上記の操作を行うことにより、まずオイル導入用流路１１０と検出用流路１１２の合流点で、オイルの液滴（ＯＬ）に挟まれた緩衝液（水相）中に、１個のプローブ固定済みビーズＢが分配される。この時、１つの緩衝液相にプローブ固定済みビーズＢが２個以上入らないように、オイル及び緩衝液の流速を制御する。また、オイルの液滴が流路１１２の内壁面の全周に接するように、オイルの粘度と、オイル及び緩衝液の速度比等を制御する。
【００３８】
また、発光基質液導入用流路１１１と検出用流路１１２の合流点で、化学発光基質液が緩衝液相に供給される。
図５に示すように、ビーズ排出口１０８の手前には発光検出部１１４が、発光検出部１１４の手前にビーズ検出部（粒子検出部）１１５が設けられている。まず、ビーズ検出部１１５において、カメラ６により、緩衝液相中にプローブ固定済みビーズＢが含まれているかどうか確認し、プローブ固定済みビーズＢが含まれている緩衝液相のみ、発光検出部１１４において発光検出を行う。これにより、プローブ固定済みビーズＢが含まれない緩衝液相の発光検出を行って、測定精度が低下することを防止できる。
【００３９】
発光検出は、ＣＣＤカメラ７を用いて発光強度を測定し、ハイブリダイゼーション反応の有無を確認することにより行う。
緩衝液相に化学発光基質液が供給されてからビーズ検出部１１５に到達するまでの間に、プローブ固定済みビーズＢ表面の化学発光用酵素（ＨＲＰ）化学発光基質液が反応して化学発光物質が生成される。
【００４０】
図６（Ａ）は、化学発光物質を用いた検出方法の原理を説明する図である。図６（Ａ）に示すように、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合したビオチンとストレプトアビジン標識済みの化学発光用酵素（ＨＲＰ）が結合し、そこへ化学発光基質液（ルミノール、過酸化水素）を加えることにより、ＨＲＰがルミノールと過酸化水素と反応して発光物質を産出することにより発光する。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【００４１】
図６（Ｂ）は、蛍光標識剤を用いた検出方法の原理を説明する図である。蛍光標識剤を用いた方法では、ターゲット核酸に結合した蛍光標識剤が、励起光を照射することにより発光する。発光強度は、ターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するため、化学発光物質を用いた検出方法に比べると、検出感度を高めることが難しい。
【００４２】
このため、検出感度を向上させるためには、化学発光物質による方法を用いた方がよい。なお、蛍光標識剤を用いた方法では、発光体である蛍光標識剤が、ターゲット核酸に結合した状態であるため、発光体の位置が動かない。このため、プローブ固定済みビーズＢが分離できなくてもどのプローブとの反応結果なのかの区別がつきやすい。一方、化学発光物質を用いた方法では、生成された発光物質が流路内で混ざり合ってしまうため、プローブ固定済みビーズＢが分離できない場合には、どのプローブによって検出されたものなのか区別がつかなくなってしまう。しかし、本実施形態による検出カートリッジ１０では、１つの緩衝液相中に１個のプローブ固定済みビーズＢのみが含まれるようにしている。これにより、化学発光物質を用いた検出方法でも、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がなく、一検体につき多項目の検出が可能である。なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。
【００４３】
以上のように、実施の形態１によれば、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されたプローブ固定済みビーズＢを用いてハイブリダイゼーション反応用流路１０９内でハイブリダイゼーション処理を行うため、一検体につき多項目の検出が可能であり、プローブ固定済みビーズＢの攪拌効果によりターゲット核酸とプローブの反応効率が向上する。
【００４４】
また、オイルに挟まれた緩衝液相に１個のプローブ固定済みビーズＢを分配することにより、各ビーズを分離してから発光物質の生成を行うようにしたので、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。
従って、より検出感度の高い化学発光物質による方法を用いて検出を行うことができる。
【００４５】
なお、オイル導入用流路１１０と検出用流路１１２との成す角度は、図２〜５に示すものに限られない。両流路の成す角度、オイルの粘度、オイルと緩衝液の流速等の組み合わせにより、１つの緩衝液相に１つのプローブ固定済みビーズＢが分配されるように制御することができる。
また、発光基質液導入用流路１１１と検出用流路１１２との成す角度も、図２〜５に示すものに限られない。
【００４６】
なお、本実施形態では、ハイブリダイゼーション反応工程はハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で行い、検出工程は検出用流路１１２内で行うようにしている。ハイブリダイゼーション反応工程では、検体の往復送液を行った方が反応効率が向上するため、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９の両端にダム部Ｄを設け、往復送液を行なえるようにしている。一方、検出用流路１１２の端部にはダム部Ｄがないため往復送液には適さないが、ハイブリダイゼーション反応工程を、往復送液を行わずに検出用流路１１２内で行うようにすることも可能である。
【００４７】
なお、ビーズ注入口１０４、試薬／洗浄液導入口１０５、及びビーズ排出口１０８の封止は、例えば図７に示すように、加圧針５００を用いて行ってもよい。この場合、基板１０１をシリコン樹脂などの弾力性のある材料で作製し、加圧針５００で基板１０１，１０２を加圧することにより、流路を封止する。
【００４８】
また、オイル導入用流路１１０に注入するオイルに予め色素を加えておくようにしてもよい。これにより、緩衝液相とオイル相の区別が容易になり、発光検出を効率よく行うことができる。
【００４９】
実施の形態２．
図８は、本発明の実施の形態２による核酸検出装置（生体物質検出装置）８の構成を示す斜視図である。図に示すように、核酸検出装置８は、実施の形態１の核酸検出装置１の各部に対応する構成に加え、第４のポンプ（流速制御装置）９を備えている。第４のポンプ９は、例えばシリンジポンプやマイクロポンプを用いることができる。
【００５０】
図９は、実施の形態２による検出カートリッジ２０の概略構成と、ハイブリダイゼーションの検出処理方法を説明する図である。図に示すように、検出カートリッジ２０は、実施の形態１の検出カートリッジ１０の各部に対応する構成に加え、第４のポンプ接続口２０１、流速調整用流路（第４の流路）２０２を備えている。第４のポンプ接続口２０１は貫通孔であり、基板１０１に形成されている。第４のポンプ接続口２０１は、キャピラリーチューブを介して第４のポンプ９に繋がれている。流速調整用流路２０２は基板１０２に形成されており、送液方向に垂直な断面の幅、深さはそれぞれ１００μｍである。第４のポンプ接続口２０１は、流速調整用流路２０２の端部に対応する位置に形成されている。
【００５１】
実施の形態２による検出カートリッジ２０を用いた、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理は、実施の形態１と同様の手順で行う。
【００５２】
次に、検出処理について説明する。
検出処理工程では、ビーズ注入口１０４と試薬／洗浄液導入口１０５を封止する。まず、第２のポンプ接続口１０６からオイル導入用流路１１０にオイルを注入し、第２のポンプ４を駆動してオイルをハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。同時に、第３のポンプ接続口１０７から発光基質液導入用流路１１１に化学発光基質液を注入し、第３のポンプ５を駆動して化学発光基質液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。ここで、化学発光基質液は化学発光基質（ルミノール）と過酸化水素を含む溶液である。
【００５３】
また、同時に第１のポンプ３と第４のポンプ９を駆動し、プローブ固定済みビーズＢをハイブリダイゼーション反応用流路１０９内から、検出用流路１１２内へ移動させる。この時、流速調整用流路２０２内の流速がハイブリダイゼーション反応用流路１０９内の流速よりも大きくなるように、第１のポンプ３および第４のポンプ９を用いて制御する。
【００５４】
上記の操作を行うことにより、実施の形態１と同様に、オイル導入用流路１１０と検出用流路１１２の合流点で、オイルの液滴（ＯＬ）に挟まれた緩衝液（水相）中に、１個のプローブ固定済みビーズＢが分配される。実施の形態２では、流速調整用流路２０２内の流速がハイブリダイゼーション反応用流路１０９内の流速よりも速いため、プローブ固定済みビーズＢがハイブリダイゼーション反応用流路１０９から検出用流路１１２へ移動する際にビーズ間の距離が開く。このため１つの緩衝液相にプローブ固定済みビーズＢが２個以上入らないように制御しやすいという効果がある。
【００５５】
さらに、発光基質液導入用流路１１１と検出用流路１１２の合流点で、化学発光基質液が緩衝液相に供給され、ビーズ検出部１１５においてプローブ固定済みビーズＢが含まれていることが確認された緩衝液相のみ、発光検出部１１４において発光検出を行う。
【００５６】
以上のように、実施の形態２によれば、流速調整用流路２０２を設けたことにより、オイル導入用流路１１０と検出用流路１１２の合流点でプローブ固定済みビーズＢを分離する前に、ビーズ間の距離を大きくすることが可能となる。このため、個々のプローブ固定済みビーズＢの分離をより容易かつ高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態１による核酸検出装置の構成を示す斜視図である。
【図２】図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジの分解斜視図、図２（Ｂ）は検出カートリッジの上面図である。
【図３】本発明の実施の形態１による、ハイブリダイゼーション処理を説明する図である。
【図４】本発明の実施の形態１による、ハイブリダイゼーション処理を説明する図である。
【図５】本発明の実施の形態１による、ハイブリダイゼーションの検出処理を説明する図である。
【図６】検出方法の原理を説明する図である。
【図７】流路の封止方法を説明する図である。
【図８】本発明の実施の形態２による核酸検出装置の構成を示す斜視図である。
【図９】実施の形態２による検出カートリッジの概略構成と、ハイブリダイゼーションの検出処理方法を説明する図である。
【符号の説明】
【００５８】
１，８ 核酸検出装置、２ ステージ、３ 第１のポンプ、４ 第２のポンプ、５ 第３のポンプ、６ カメラ、７ ＣＣＤカメラ、８ 第４のポンプ、９ 第４のポンプ、１０，２０ 検出カートリッジ、１０１，１０２ 基板、１０３ 第１のポンプ接続口、１０４ ビーズ注入口、１０５ 試薬／洗浄液導入口、１０６ 第２のポンプ接続口、１０７ 第３のポンプ接続口、１０８ ビーズ排出口、１０９ ハイブリダイゼーション反応用流路、１１０ オイル導入用流路、１１１ 発光基質液導入用流路、１１２ 検出用流路、１１３ ビーズ注入用流路、１１４ 発光検出部、１１５ ビーズ検出部、２０１ 第４のポンプ接続口、２０２ 流速調整用流路、５００ 加圧針
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の塩基配列を有する核酸分子などの生体物質を検出するための、生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液や組織細胞などの検体中に、疾患に由来する特定の遺伝子が存在するか否かを検査する手法の一つにＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ遺伝子と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。従来、検体中に含まれる特定の遺伝子の検出精度をあげるため、検体中の特定の遺伝子とプローブ遺伝子との反応効率を高くする工夫がなされている。例えば、反応中に検体液の攪拌を行って検体液の分布を改善させることにより、反応効率を上げる方法が提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、キャピラリー内にガラスビーズを配置する事で試料の流れに乱れを生じさせ、キャピラリー内壁もしくはガラスビーズ上に固定したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション効率を上げる提案が開示されている。
また、特許文献２には、種々のＤＮＡプローブを固定した粒子を一定の順序で整列させたプローブアレーが開示されている。
また、特許文献３には、磁気微粒子とプローブ付きガラスビーズを組合せる事でハイブリダイゼーション後にビーズの種類ごとにビーズを識別、回収する機構が提案されている。
特許文献４には、多孔板の孔の中に多孔性の吸着性領域を設けてそこにプローブを固定し、ターゲットを含む溶液がプローブと接触しながら循環するための流路を備えた生化学解析用ユニット構造体が提案されている。
【０００４】
【特許文献１】特許第３８１８２７７号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９９７号公報
【特許文献３】特許第３７１１９８８号公報
【特許文献４】特開２００４−３６１３１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プローブと反応した物質を検出する主な方法には、蛍光標識剤を用いる方法と、化学発光物質を用いる方法がある。蛍光標識剤を用いる方法では、蛍光標識剤が検出される物質に結合している。一方、化学発光物質を用いる方法は、検出される物質に結合している酵素が触媒となって、発光物質が生成される。このため、化学発光物質を用いた方法では、生成された発光物質が反応容器内で混ざり合ってしまうため、どのプローブによって検出されたものなのか区別がつかなくなってしまう。一方、蛍光標識剤を用いる方法では、標識剤同士が混ざってしまう問題がない。特許文献１，２に記載された方法では、ＤＮＡプローブを固定したビーズの分離が難しいため、ハイブリダイゼーション後の検出には蛍光標識剤を用いる事が前提になる。しかし、化学発光物質を用いる方法は、蛍光標識剤を用いる方法に比べ、より低コストで高感度な検出が可能であるため、検出方法には化学発光物質による方式を用いるのが望ましい。
【０００６】
また、特許文献３に開示された従来技術は、ビーズ上にハイブリダイゼーションした検体遺伝子を回収する事が目的であり、化学発光法による検出を前提とした機構ではない。
また、特許文献４に開示された従来技術では、プローブ遺伝子が固定化した吸着性領域をハイブリダイゼーション後に分離する事は不可能である。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、反応効率及び検出感度の高い生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る生体物質検出カートリッジは、検体と、前記検体中の特定の生体物質と反応するプローブが表面に固定された複数の粒子を導入可能な第１の流路と、前記第１の流路と接続され、前記第１の流路内の個々の前記粒子の間に、第１の液体を導入するための第２の流路と、前記第１の流路と接続され、前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給するための第３の流路と、を備え、前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないものである。
【０００９】
本発明によれば、第２の液体と混和しない第１の液体を挟んで各粒子を分離してから、検出用の物質の生成を行うことができるので、検出用の物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。よって、より検出感度の高い化学発光物質による方法を用いて検出を行うことができる。また、各々の粒子にそれぞれ異なる１種類のプローブを固定することができるので、一検体につき多項目の検出が可能である。更に、粒子による液体攪拌効果により前記検体と前記プローブの反応効率が向上する。
【００１０】
また、前記第１の流路は、前記検体と前記プローブとの反応を行うための反応用流路と、前記反応の結果を検出するための物質を生成するための検出用流路と、を備えることが望ましい。
これにより、反応用流路を検体の往復送液が可能な構造に容易にすることができ、前記検体と前記プローブの反応効率を向上させることができる。
【００１１】
また、前記第１の流路と接続され、前記第１の流路よりも速い流速に制御することが可能な第４の流路を備えることが望ましい。
これにより、流速の差を利用して粒子間の距離を大きくし、個々の粒子の分離をより容易かつ高精度に行うことができる。
【００１２】
本発明に係る生体物質検出装置は、上記の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、前記粒子を検出する粒子検出装置と、生成された前記物質を検出する検出装置とを備え、前記粒子検出装置によって前記粒子が検出された場合にのみ、前記検出装置によって前記物質の検出を行うものである。
これにより、粒子が含まれない領域の検出を行って、測定精度が低下することを防止できる。
【００１３】
本発明に係る生体物質検出装置は、上記の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、前記第４の流路の流速が前記第１の流路の流速よりも速くなるように制御する流速制御装置を備えたものである。
これにより、流速の差を利用して粒子間の距離を大きくし、個々の粒子の分離をより容易かつ高精度に行うことができる。
【００１４】
本発明に係る生体物質検出方法は、表面に検体中の特定の生体物質と反応するプローブが固定された複数の粒子を用いて、前記生体物質の検出を行う生体物質検出方法であって、前記生体物質と前記プローブを反応させる第１の工程と、各々の前記粒子の間に、第１の液体を導入し、個々の前記粒子を分離する第２の工程と、前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給する第３の工程と、前記反応の結果を検出する第４の工程と、を備え、前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないことを特徴とするものである。
【００１５】
本発明によれば、第２の液体と混和しない第１の液体を挟んで各粒子を分離してから、検出用の物質の生成を行うことができるので、検出用の物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。よって、より検出感度の高い化学発光物質による方法を用いて検出を行うことができる。また、各々の粒子にそれぞれ異なる１種類のプローブを固定することができるので、一検体につき多項目の検出が可能である。更に、粒子による液体攪拌効果により前記検体と前記プローブの反応効率が向上する。
【００１６】
また、前記反応の結果を検出するための物質は、酵素反応により生成される化学発光物質であることを特徴とすることが望ましい。
これにより、第２の液体の組成を調整することにより発光物質の産出量を増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【００１７】
また、前記第１の液体が前記第２の液体と異なる色に着色されていることが望ましい。
これにより、第１の液体の相と第２の液体の相の区別が容易になり、検出を効率よく行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本発明の実施の形態１による核酸検出装置（生体物質検出装置）１の構成を示す斜視図である。図に示すように、核酸検出装置１は、検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）１０を設置するためのステージ２、第１のポンプ３、第２のポンプ４、第３のポンプ５、カメラ（粒子検出装置）６、ＣＣＤカメラ（検出装置）７を備えている。
【００１９】
第１のポンプ３、第２のポンプ４、及び第３のポンプ５は、例えばシリンジポンプやマイクロポンプを用いることができる。
【００２０】
図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジ１０の分解斜視図、図２（Ｂ）は検出カートリッジ１０の上面図である。検出カートリッジ１０は、基板１０１，１０２を貼り合わせて構成されている。基板１０１，１０２は、例えばガラス基板、アクリル基板、ポリカーボネート基板などの透明基板で形成されている。
【００２１】
基板１０１には、第１のポンプ接続口１０３、ビーズ注入口１０４、試薬／洗浄液導入口１０５、第２のポンプ接続口１０６、第３のポンプ接続口１０７、及びビーズ排出口１０８の６個の貫通孔が形成されている。基板１０２には、ハイブリダイゼーション反応用流路（第１の流路、反応用流路）１０９、オイル導入用流路（第２の流路）１１０、発光基質液導入用流路（第３の流路）１１１、検出用流路（第１の流路）１１２、及びビーズ注入用流路１１３が形成されている。
【００２２】
図に示すように、第１のポンプ接続口１０３、ビーズ注入口１０４、試薬／洗浄液導入口１０５、第２のポンプ接続口１０６、第３のポンプ接続口１０７、ビーズ排出口１０８は、それぞれハイブリダイゼーション反応用流路１０９、ビーズ注入用流路１１３、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９、オイル導入用流路１１０、発光基質液導入用流路１１１、検出用流路１１２の端部に対応する位置に形成されている。各々の流路の送液方向に垂直な断面の幅、深さはそれぞれ１００μｍである。
【００２３】
第１のポンプ接続口１０３、第２のポンプ接続口１０６、第３のポンプ接続口１０７は、それぞれキャピラリーチューブを介して第１のポンプ３、第２のポンプ４、第３のポンプ５に繋がれている。
【００２４】
次に、本実施形態による検出カートリッジ１０を用いた、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理およびハイブリダイゼーションの検出処理について説明する。
【００２５】
まず、図３及び図４を用いてハイブリダイゼーション処理について説明する。まず、ビーズ排出口１０８と試薬／洗浄液導入口１０５を封止した状態で、ビーズ注入口１０４からビーズ注入用流路１１３にプローブ固定済みビーズ（粒子）Ｂの分散液を注入し、第１のポンプ３を駆動してプローブ固定済みビーズＢをハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に導入する。ハイブリダイゼーション反応用流路１０９の両端にはダム部Ｄが設けられており、プローブ固定済みビーズＢは塞き止められ、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９外へ排出されるのを防ぐ事ができる。
【００２６】
プローブ固定済みビーズＢは、直径８０μｍの球体であり、表面にプローブが塗布されている。
プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。
【００２７】
なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。
【００２８】
本実施形態では、個々のプローブ固定済みビーズＢには、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、一検体につき多項目の検出が可能である。
【００２９】
なお、プローブ固定済みビーズＢの表面は、親水処理が施されていることが望ましい。また、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９の表面にも親水処理が施されていることが望ましい。
【００３０】
次に、ビーズ注入口１０４とビーズ排出口１０８を封止した状態で、試薬／洗浄液導入口１０５からブロッキング液を充填し、第１のポンプ３を駆動してブロッキング液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液する。これにより、プローブが固定化されていない領域をブロッキングすることができる。ブロッキングは約１０分行う。
【００３１】
次に、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５からブロッキング液を排出した後、第１のポンプを用いてハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液することにより、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内を十分に洗浄する。
【００３２】
洗浄液を排出した後、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５から、ビオチン標識した検体試料を充填し、第１のポンプ３を駆動して検体試料をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液する。これにより、プローブ固定済みビーズＢに固定されているプローブと反応（ハイブリダイゼーション）させる。ハイブリダイゼーションは１〜３時間行うのが望ましい。
図４に示すように、第１のポンプ３を駆動することにより、検体試料は図中の矢印Ｃで示す範囲を往復する。図に示すように、検体試料が往復する範囲の両端にはダム部Ｄが設けられている。図４（Ｂ）にダム部Ｄを側面から見た図を示す。プローブ固定済みビーズＢはダム部Ｄを越えることができないため、プローブ固定済みビーズＢがハイブリダイゼーション反応用流路１０９外へ排出されてしまうのを防ぐことができる。このように、検体試料が攪拌され、プローブに短い時間でより多くのターゲット核酸が接することになるので、ハイブリダイゼーションの効率が向上する。
【００３３】
ビオチン標識した検体試料溶液の調整方法について説明する。
検体試料は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルを含む。必要に応じて、ＰＣＲ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。
具体的には、まず、試料中に第１及び第２のプライマーを加え、温度サイクルをかける。第１のプライマーはターゲットとなる核酸の一部と特異的に結合し、第２のプライマーはターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸を含む二本鎖核酸と第１及び第２のプライマーが結合すると伸長反応によってターゲット核酸を含む二本鎖核酸が増幅される。十分に標的核酸を含む二本鎖核酸が増幅された後に、試料中に第３のプライマーを加えて温度サイクルをかける。第３のプライマーは、伸長反応時にビオチンの取込みが可能であり、ターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸に相補的な核酸と、第３のプライマーが結合すると伸長反応によってビオチンで標識されたターゲット核酸が増幅される。結果として、試料中にターゲット核酸が含まれている場合は標識されたターゲット核酸が生成され、試料中にターゲット核酸が含まれない場合は標識されたターゲット核酸は生成されない。なお、ここでは、標識物質はビオチンとしたが、他の酵素や、蛍光物質等でも良い。
【００３４】
次に、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５から試料溶液を排出した後、第１のポンプ３を用いてハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液することにより、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内を十分に洗浄する。
【００３５】
次に、第１のポンプ３を用いて試薬／洗浄液導入口１０５からハイブリダイゼーション反応用流路１０９内にストレプトアビジン標識した化学発光用酵素（ＨＲＰ）液を充填し、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で約５分間往復送液する。
次に、ＨＲＰ液を排出した後、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で往復送液することにより、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内を十分に洗浄する。
洗浄液を排出した後、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９内に緩衝液を充填する。
【００３６】
次に、検出処理について説明する。
検出処理工程では、ビーズ注入口１０４と試薬／洗浄液導入口１０５を封止する。まず、第２のポンプ接続口１０６からオイル導入用流路１１０にオイル（第１の液体）を注入し、第２のポンプ４を駆動してオイルをハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。同時に、第３のポンプ接続口１０７から発光基質液導入用流路１１１に化学発光基質液（第２の液体）を注入し、第３のポンプ５を駆動して化学発光基質液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。ここで、化学発光基質液は化学発光基質（ルミノール）と過酸化水素を含む溶液である。
また、同時に第１のポンプ３を駆動し、プローブ固定済みビーズＢをハイブリダイゼーション反応用流路１０９内から、検出用流路１１２内へ移動させる。
【００３７】
上記の操作を行うことにより、まずオイル導入用流路１１０と検出用流路１１２の合流点で、オイルの液滴（ＯＬ）に挟まれた緩衝液（水相）中に、１個のプローブ固定済みビーズＢが分配される。この時、１つの緩衝液相にプローブ固定済みビーズＢが２個以上入らないように、オイル及び緩衝液の流速を制御する。また、オイルの液滴が流路１１２の内壁面の全周に接するように、オイルの粘度と、オイル及び緩衝液の速度比等を制御する。
【００３８】
また、発光基質液導入用流路１１１と検出用流路１１２の合流点で、化学発光基質液が緩衝液相に供給される。
図５に示すように、ビーズ排出口１０８の手前には発光検出部１１４が、発光検出部１１４の手前にビーズ検出部（粒子検出部）１１５が設けられている。まず、ビーズ検出部１１５において、カメラ６により、緩衝液相中にプローブ固定済みビーズＢが含まれているかどうか確認し、プローブ固定済みビーズＢが含まれている緩衝液相のみ、発光検出部１１４において発光検出を行う。これにより、プローブ固定済みビーズＢが含まれない緩衝液相の発光検出を行って、測定精度が低下することを防止できる。
【００３９】
発光検出は、ＣＣＤカメラ７を用いて発光強度を測定し、ハイブリダイゼーション反応の有無を確認することにより行う。
緩衝液相に化学発光基質液が供給されてからビーズ検出部１１５に到達するまでの間に、プローブ固定済みビーズＢ表面の化学発光用酵素（ＨＲＰ）化学発光基質液が反応して化学発光物質が生成される。
【００４０】
図６（Ａ）は、化学発光物質を用いた検出方法の原理を説明する図である。図６（Ａ）に示すように、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合したビオチンとストレプトアビジン標識済みの化学発光用酵素（ＨＲＰ）が結合し、そこへ化学発光基質液（ルミノール、過酸化水素）を加えることにより、ＨＲＰがルミノールと過酸化水素と反応して発光物質を産出することにより発光する。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【００４１】
図６（Ｂ）は、蛍光標識剤を用いた検出方法の原理を説明する図である。蛍光標識剤を用いた方法では、ターゲット核酸に結合した蛍光標識剤が、励起光を照射することにより発光する。発光強度は、ターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するため、化学発光物質を用いた検出方法に比べると、検出感度を高めることが難しい。
【００４２】
このため、検出感度を向上させるためには、化学発光物質による方法を用いた方がよい。なお、蛍光標識剤を用いた方法では、発光体である蛍光標識剤が、ターゲット核酸に結合した状態であるため、発光体の位置が動かない。このため、プローブ固定済みビーズＢが分離できなくてもどのプローブとの反応結果なのかの区別がつきやすい。一方、化学発光物質を用いた方法では、生成された発光物質が流路内で混ざり合ってしまうため、プローブ固定済みビーズＢが分離できない場合には、どのプローブによって検出されたものなのか区別がつかなくなってしまう。しかし、本実施形態による検出カートリッジ１０では、１つの緩衝液相中に１個のプローブ固定済みビーズＢのみが含まれるようにしている。これにより、化学発光物質を用いた検出方法でも、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がなく、一検体につき多項目の検出が可能である。なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。
【００４３】
以上のように、実施の形態１によれば、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されたプローブ固定済みビーズＢを用いてハイブリダイゼーション反応用流路１０９内でハイブリダイゼーション処理を行うため、一検体につき多項目の検出が可能であり、プローブ固定済みビーズＢの攪拌効果によりターゲット核酸とプローブの反応効率が向上する。
【００４４】
また、オイルに挟まれた緩衝液相に１個のプローブ固定済みビーズＢを分配することにより、各ビーズを分離してから発光物質の生成を行うようにしたので、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。
従って、より検出感度の高い化学発光物質による方法を用いて検出を行うことができる。
【００４５】
なお、オイル導入用流路１１０と検出用流路１１２との成す角度は、図２〜５に示すものに限られない。両流路の成す角度、オイルの粘度、オイルと緩衝液の流速等の組み合わせにより、１つの緩衝液相に１つのプローブ固定済みビーズＢが分配されるように制御することができる。
また、発光基質液導入用流路１１１と検出用流路１１２との成す角度も、図２〜５に示すものに限られない。
【００４６】
なお、本実施形態では、ハイブリダイゼーション反応工程はハイブリダイゼーション反応用流路１０９内で行い、検出工程は検出用流路１１２内で行うようにしている。ハイブリダイゼーション反応工程では、検体の往復送液を行った方が反応効率が向上するため、ハイブリダイゼーション反応用流路１０９の両端にダム部Ｄを設け、往復送液を行なえるようにしている。一方、検出用流路１１２の端部にはダム部Ｄがないため往復送液には適さないが、ハイブリダイゼーション反応工程を、往復送液を行わずに検出用流路１１２内で行うようにすることも可能である。
【００４７】
なお、ビーズ注入口１０４、試薬／洗浄液導入口１０５、及びビーズ排出口１０８の封止は、例えば図７に示すように、加圧針５００を用いて行ってもよい。この場合、基板１０１をシリコン樹脂などの弾力性のある材料で作製し、加圧針５００で基板１０１，１０２を加圧することにより、流路を封止する。
【００４８】
また、オイル導入用流路１１０に注入するオイルに予め色素を加えておくようにしてもよい。これにより、緩衝液相とオイル相の区別が容易になり、発光検出を効率よく行うことができる。
【００４９】
実施の形態２．
図８は、本発明の実施の形態２による核酸検出装置（生体物質検出装置）８の構成を示す斜視図である。図に示すように、核酸検出装置８は、実施の形態１の核酸検出装置１の各部に対応する構成に加え、第４のポンプ（流速制御装置）９を備えている。第４のポンプ９は、例えばシリンジポンプやマイクロポンプを用いることができる。
【００５０】
図９は、実施の形態２による検出カートリッジ２０の概略構成と、ハイブリダイゼーションの検出処理方法を説明する図である。図に示すように、検出カートリッジ２０は、実施の形態１の検出カートリッジ１０の各部に対応する構成に加え、第４のポンプ接続口２０１、流速調整用流路（第４の流路）２０２を備えている。第４のポンプ接続口２０１は貫通孔であり、基板１０１に形成されている。第４のポンプ接続口２０１は、キャピラリーチューブを介して第４のポンプ９に繋がれている。流速調整用流路２０２は基板１０２に形成されており、送液方向に垂直な断面の幅、深さはそれぞれ１００μｍである。第４のポンプ接続口２０１は、流速調整用流路２０２の端部に対応する位置に形成されている。
【００５１】
実施の形態２による検出カートリッジ２０を用いた、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理は、実施の形態１と同様の手順で行う。
【００５２】
次に、検出処理について説明する。
検出処理工程では、ビーズ注入口１０４と試薬／洗浄液導入口１０５を封止する。まず、第２のポンプ接続口１０６からオイル導入用流路１１０にオイルを注入し、第２のポンプ４を駆動してオイルをハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。同時に、第３のポンプ接続口１０７から発光基質液導入用流路１１１に化学発光基質液を注入し、第３のポンプ５を駆動して化学発光基質液をハイブリダイゼーション反応用流路１０９に導入する。ここで、化学発光基質液は化学発光基質（ルミノール）と過酸化水素を含む溶液である。
【００５３】
また、同時に第１のポンプ３と第４のポンプ９を駆動し、プローブ固定済みビーズＢをハイブリダイゼーション反応用流路１０９内から、検出用流路１１２内へ移動させる。この時、流速調整用流路２０２内の流速がハイブリダイゼーション反応用流路１０９内の流速よりも大きくなるように、第１のポンプ３および第４のポンプ９を用いて制御する。
【００５４】
上記の操作を行うことにより、実施の形態１と同様に、オイル導入用流路１１０と検出用流路１１２の合流点で、オイルの液滴（ＯＬ）に挟まれた緩衝液（水相）中に、１個のプローブ固定済みビーズＢが分配される。実施の形態２では、流速調整用流路２０２内の流速がハイブリダイゼーション反応用流路１０９内の流速よりも速いため、プローブ固定済みビーズＢがハイブリダイゼーション反応用流路１０９から検出用流路１１２へ移動する際にビーズ間の距離が開く。このため１つの緩衝液相にプローブ固定済みビーズＢが２個以上入らないように制御しやすいという効果がある。
【００５５】
さらに、発光基質液導入用流路１１１と検出用流路１１２の合流点で、化学発光基質液が緩衝液相に供給され、ビーズ検出部１１５においてプローブ固定済みビーズＢが含まれていることが確認された緩衝液相のみ、発光検出部１１４において発光検出を行う。
【００５６】
以上のように、実施の形態２によれば、流速調整用流路２０２を設けたことにより、オイル導入用流路１１０と検出用流路１１２の合流点でプローブ固定済みビーズＢを分離する前に、ビーズ間の距離を大きくすることが可能となる。このため、個々のプローブ固定済みビーズＢの分離をより容易かつ高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態１による核酸検出装置の構成を示す斜視図である。
【図２】図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジの分解斜視図、図２（Ｂ）は検出カートリッジの上面図である。
【図３】本発明の実施の形態１による、ハイブリダイゼーション処理を説明する図である。
【図４】本発明の実施の形態１による、ハイブリダイゼーション処理を説明する図である。
【図５】本発明の実施の形態１による、ハイブリダイゼーションの検出処理を説明する図である。
【図６】検出方法の原理を説明する図である。
【図７】流路の封止方法を説明する図である。
【図８】本発明の実施の形態２による核酸検出装置の構成を示す斜視図である。
【図９】実施の形態２による検出カートリッジの概略構成と、ハイブリダイゼーションの検出処理方法を説明する図である。
【符号の説明】
【００５８】
１，８ 核酸検出装置、２ ステージ、３ 第１のポンプ、４ 第２のポンプ、５ 第３のポンプ、６ カメラ、７ ＣＣＤカメラ、８ 第４のポンプ、９ 第４のポンプ、１０，２０ 検出カートリッジ、１０１，１０２ 基板、１０３ 第１のポンプ接続口、１０４ ビーズ注入口、１０５ 試薬／洗浄液導入口、１０６ 第２のポンプ接続口、１０７ 第３のポンプ接続口、１０８ ビーズ排出口、１０９ ハイブリダイゼーション反応用流路、１１０ オイル導入用流路、１１１ 発光基質液導入用流路、１１２ 検出用流路、１１３ ビーズ注入用流路、１１４ 発光検出部、１１５ ビーズ検出部、２０１ 第４のポンプ接続口、２０２ 流速調整用流路、５００ 加圧針
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体と、前記検体中の特定の生体物質と反応するプローブが表面に固定された複数の粒子を導入可能な第１の流路と、
前記第１の流路と接続され、前記第１の流路内の個々の前記粒子の間に、第１の液体を導入するための第２の流路と、
前記第１の流路と接続され、前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給するための第３の流路と、を備え、
前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、
前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないことを特徴とする生体物質検出カートリッジ。
【請求項２】
前記第１の流路は、
前記検体と前記プローブとの反応を行うための反応用流路と、
前記反応の結果を検出するための物質を生成するための検出用流路と、を備えたことを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項３】
前記第１の流路と接続され、前記第１の流路よりも速い流速に制御することが可能な第４の流路を備えたことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、
前記粒子を検出する粒子検出装置と、
生成された前記物質を検出する検出装置と、を備え、
前記粒子検出装置によって前記粒子が検出された場合にのみ、前記検出装置によって前記物質の検出を行うことを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項５】
請求項３に記載の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、
前記第４の流路の流速が前記第１の流路の流速よりも速くなるように制御する流速制御装置を備えたことを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項６】
表面に検体中の特定の生体物質と反応するプローブが固定された複数の粒子を用いて、前記生体物質の検出を行う生体物質検出方法であって、
前記生体物質と前記プローブを反応させる第１の工程と、
各々の前記粒子の間に、第１の液体を導入し、個々の前記粒子を分離する第２の工程と、
前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給する第３の工程と、
前記反応の結果を検出する第４の工程と、を備え、
前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、
前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないことを特徴とする生体物質検出方法。
【請求項７】
前記反応の結果を検出するための物質は、酵素反応により生成される化学発光物質であることを特徴とする請求項６に記載の生体物質検出方法。
【請求項８】
前記第１の液体が前記第２の液体と異なる色に着色されていることを特徴とする請求項６または請求項７に記載の生体物質検出方法。
【請求項１】
検体と、前記検体中の特定の生体物質と反応するプローブが表面に固定された複数の粒子を導入可能な第１の流路と、
前記第１の流路と接続され、前記第１の流路内の個々の前記粒子の間に、第１の液体を導入するための第２の流路と、
前記第１の流路と接続され、前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給するための第３の流路と、を備え、
前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、
前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないことを特徴とする生体物質検出カートリッジ。
【請求項２】
前記第１の流路は、
前記検体と前記プローブとの反応を行うための反応用流路と、
前記反応の結果を検出するための物質を生成するための検出用流路と、を備えたことを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項３】
前記第１の流路と接続され、前記第１の流路よりも速い流速に制御することが可能な第４の流路を備えたことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、
前記粒子を検出する粒子検出装置と、
生成された前記物質を検出する検出装置と、を備え、
前記粒子検出装置によって前記粒子が検出された場合にのみ、前記検出装置によって前記物質の検出を行うことを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項５】
請求項３に記載の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、
前記第４の流路の流速が前記第１の流路の流速よりも速くなるように制御する流速制御装置を備えたことを特徴とする生体物質検出装置。
【請求項６】
表面に検体中の特定の生体物質と反応するプローブが固定された複数の粒子を用いて、前記生体物質の検出を行う生体物質検出方法であって、
前記生体物質と前記プローブを反応させる第１の工程と、
各々の前記粒子の間に、第１の液体を導入し、個々の前記粒子を分離する第２の工程と、
前記第１の液体によって分離された個々の前記粒子の周囲に、第２の液体を供給する第３の工程と、
前記反応の結果を検出する第４の工程と、を備え、
前記第２の液体は、前記反応の結果を検出するための物質を生成する溶液を含み、
前記第１の液体は、前記第２の液体と混和しないことを特徴とする生体物質検出方法。
【請求項７】
前記反応の結果を検出するための物質は、酵素反応により生成される化学発光物質であることを特徴とする請求項６に記載の生体物質検出方法。
【請求項８】
前記第１の液体が前記第２の液体と異なる色に着色されていることを特徴とする請求項６または請求項７に記載の生体物質検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２７６１３５（Ｐ２００９−２７６１３５Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２６０６７（Ｐ２００８−１２６０６７）
【出願日】平成２０年５月１３日（２００８．５．１３）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１３日（２００８．５．１３）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
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