生体組織構造を模倣したナノバイオデバイス
【課題】 本発明が解決しようとする課題は、培養した細胞をin vivoに近い状態で高度に組織化したナノバイオデバイスを提供すること、また、その生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの利用方法を提示することにある。
【解決手段】 本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスは、生体親和性物質で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置したものとした。
本発明のナノバイオデバイス作製方法は、マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板を作るステップと、該基板上に光ピンセットを用いて複数の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるようにした。
【解決手段】 本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスは、生体親和性物質で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置したものとした。
本発明のナノバイオデバイス作製方法は、マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板を作るステップと、該基板上に光ピンセットを用いて複数の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの技術と、基板デバイスの高集積化を実現するナノテクノロジーを融合させたものであって、ある生体組織構造を模倣した規則に沿って細胞集団を配列した生体ナノデバイスを作製する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジーの分野では、レーザートラッピング技術などの出現により、ひとつひとつの細胞を自由自在に操ることが可能となり、また近年のナノテクノロジーの発展により基板デバイスの高集積化や高速化が進み、使用目的に応じたサイズやデザインの形状を基板上に加工できるようになった。それは、ある生体組織構造を模倣した規則に沿って細胞集団を配列した生体ナノデバイスの作製を目指すレベルにまで達している。つまり、従来では困難であると考えられていた培養細胞をin vivoに近い状態で高度に組織化することが、これら技術の融合によりナノデバイス上に可能となりつつある。これにより再生医療に向けての素材作りとしてだけではなく、invitroでは解明が困難であった細胞間相互作用の解析においても有益なツールとして期待できるようになった。一方、医学・生物学において、ＤＮＡマイクロアレイ法を用いたトランスクリプトーム解析や二次元電気泳動と質量分析器を用いたプロテオームのような網羅的解析が様々な分野で利用され、スループットの高い解析に注目が高まっている。それは各生物が保持する全遺伝子配列がゲノムプロジェクトやｃＤＮＡプロジェクトにより明らかになるにつれ、スループットの高い解析により個々の分子レベルだけでなく細胞のネットワークの中での分子メカニズムの多様性を網羅的に理解することが求められるようになったためである。これらの新しいテクノロジーの波は生体ナノデバイスのシステムをスループットの高いアプローチと組み合わせて用いることで、遺伝子発現やタンパク質相互作用ばかりではなく生細胞レベルでそれらを解析していく時代を拓こうとしており、動物実験に代わる新しい系の確立、薬剤スクリーニング等への適用も期待できるところまできている。
【０００３】
近年、最も注目を浴びている研究分野の一つとして再生医療がある。その最大の理由は深刻な移植臓器の不足を補う新世紀の医療として期待されているためである。しかし、現時点では細胞移植治療の域に留まっており、臓器そのものを再生させるには至っていない。なぜ、臓器の再生は実現できていない理由として、臓器が複数の細胞によって構成されていることや、その内部に栄養や酸素などを供給するための血管組織が張り巡らされていることなど、規則的でありながら非常に複雑な構造を形成しているためである。そのため個々の細胞を用意することは可能でも、そこから臓器そのものを構築することは非常に困難であるとされていた。すなわち、今までの技術では細胞をコントロールして各臓器の組織を形成するように配置・構成していくことは極めて困難であった。
【０００４】
しかし、近年のレーザーマニピュレーター技術の革新やナノテクノロジー分野における微細加工技術の開発により細胞自体がナノテクノロジーの恩恵を十分に享受できるようになってきた。これにより、現時点では臓器自体を再構築するにはまだ遠いが、人工の基板上に臓器の切片のような状態で細胞を思い通りに並べることが可能になってきている。そこで、この技術を応用してまず細胞を配置する基板を構築できれば、それを幾層にも重ね合わせていくことで立体的な臓器構造も作製することが可能になる。さらにはコラーゲンやヒアルロン酸などの生体親和性物質で基板を構築できれば、細胞に対しより拒否反応を少なくすることができ、次には血管再生技術との統合を図ることで将来的には移植可能な臓器ユニットの作製も可能となる。
実際に臓器構築にあたり実際に用いるソースとして、１つは骨髄細胞などの組織性幹細胞や胚性幹細胞(ＥＳ細胞)が考えられる。組織性幹細胞は細胞融合等の問題点があげられるが成人からの採取が可能なことや自己細胞であることから、免疫拒絶反応が理論上は起きないなどの利点があり、臓器構築にとって魅力的な素材の１つである。一方、胚性幹細胞に関する問題においても、移植の障壁となっていた奇形腫の形成に関わる遺伝子が同定されたことや、拒絶反応に関しても受精卵へ患者の体細胞核を移植し、胚性幹細胞を樹立するクローン胚技術が可能となったことで医療への実用化の道が探られようとしている。このような幹細胞研究がさらに発展をし、臓器構築のソース(各細胞)として供給可能な体制を築くことがナノテクノロジーを介した臓器再生には必要である。
【非特許文献１】Oode K, Furuya T, Harada K, Kawaguchi S, Yamamoto K, Hirano T, Sasaki K. “The development of a cell array and it scombination with laser-scanning cytometry allows a high-throughput analysis of nuclear DNA content” Am J Pathol. 157(3) pp.723-728 Sep. 2000
【非特許文献２】寺谷 工，落谷 孝広 「幹細胞・ＥＳ細胞―間葉系幹細胞」 再生医療 Vol.３ No.４ 126〜133頁 2004年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臓器の再生は実現できていない理由が前述したように臓器が複数の細胞によって構成されていることや、その内部に生存のための栄養、酸素などを供給するための血管組織が張り巡らされていることなど、規則的ではあっても複雑な構造を形成して機能していること、そのため個々の細胞を用意することは可能でも、そこから臓器そのものを配列・構築することは困難であるとされている環境の中で、本発明が解決しようとする課題は、培養した細胞をin vivoに近い状態で高度に組織化させるためのナノバイオデバイスを提供すること、また、その生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの利用方法を提示することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスは、生体親和性物質で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置したものとした。
本発明のナノバイオデバイス作製方法は、マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板を作るステップと、該基板上にレーザーマニピュレータを用いて複数の種類の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるようにした。
また、本発明の他のナノバイオデバイス作製方法は、マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板の型を作るステップと、該型を版としてプリント技術によって生体親和性物質の基板を作製するステップと、該基板上にレーザーマニピュレータを用いて複数の種類の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるようにした。
マイクロマシーン技術が集束イオンビームの場合はイオンエッチングによる切削、デポジション等で構造を作製し、フェムト秒レーザーの場合には照射による穴あけや、紫外線硬化樹脂を用い２光子吸収法などの焦点走査で三次元構造を構築する。型を版としたプリントはコラーゲンやヒアルロン酸等の生体親和性物質を塗布して利用するものや、また、生体親和性物質を押し当ててインプリントとして作製利用する手法などを提示する。
また、本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの使用法は、薬剤毒性試験の試料や再生組織の素材として使用することを提示した。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスは、コラーゲンやヒアルロン酸等の生体親和性物質の基板上に生体内の高度に組織化された細胞配列を再現したものであるので、in vitra で in vivo 形態の各種試験用の試料が提供できる。
本発明のナノバイオデバイス作製方法は、半導体やマイクロマシーンの分野で培われた技術と、光ピンセットのレーザートラッピングの技術等を駆使して、１つ１つの細胞を捕捉して生体親和性物質の基板上に所望配置することを可能にしたので、生体内の高度に組織化された細胞配列を再現することができる。
また、本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの使用法は、薬剤毒性試験の試料や再生組織の素材として使用することを提示したものであり、これにより薬剤の毒性試験を人体実験ではなく、動物も使わず実施でき、in vivo に近い成果を得ることが出来る。また、細胞間相互作用の分子メカニズムの解明に有効利用できる。更にはナノバイオデバイスによって細胞培養することで機能する臓器を構築でき、将来の臓器構築による再生医療へ展開することを可能にした。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの作成とその応用例について、図１の概念図を参照しながら概要を説明する。動物やヒトから採取した種々の生細胞を従来からの方法で培養する。ナノテクノロジーの技術を駆使してナノバイオデバイス用の基板を作製する。この基板上にレーザーマニピュレータを使用して先に培養した細胞を捕捉すると共に、基板の所定位置に配置して組織ナノデバイスを作成する。その際、本発明では配置する細胞は複数種類の細胞について生体組織を模した形態で配列させることが出来、この様に生体組織構造を模倣して作成されたナノバイオデバイスは、細胞間相互の分子メカニズムの解析や、再生医療分野における臓器構築技術の基礎材料として、また、スループットの高いセルアレイへの応用へと道を開くものとなる。
【０００９】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスとしては、細胞を規則的かつ複雑な構造を構築して器官を形成し、さらに維持するためには細胞の生存に適した環境下で酸素や栄養を供給しなければならない。現在はまだ臓器ユニット培養には至っておらず、培養を目的とした細胞配置に適した基板（微細構造体）を必要とされている。本発明の基礎として、まずこの基板を作成するために本発明者等は半導体加工技術で培われた集束イオンビーム（Focused Ion Beam：ＦＩＢ）装置を用いた加工技術を応用することに想到した。
近年の半導体技術の発展によって半導体の性能の指標となる加工配線幅は電子線や極紫外光の短波長光源を用いた露光技術で数十ナノメートルの微細加工レベルに達しようとしている。半導体の分野では露光する際に転写パターンである“マスク”を必要とするが、その加工修正にこの集束イオンビーム装置が用いられている。ＦＩＢはマスク修正ツールとしての役目を担ったり、他にその加工機能を生かして、様々なデバイスを切削加工してその断面観察をする故障解析ツールとして使用されているところである。そこで我々はＦＩＢ装置に着目し、バイオ分野のデバイス作製ツールとして利用し、細胞を培養するためデバイス基板の作製を提言する。
【００１０】
基板作成技術を説明する前に集束イオンビーム装置について簡単に説明しておく、ＦＩＢは、ガリウムイオンをイオン源から電気的に引き出し、電界レンズで集束してビームとして対象物に照射する装置である。その細く集束されたビームを対象物の微小領域に走査させることで走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と同様に形状観察が可能である。この機能を走査型イオン顕微鏡（Scanning Ion Microscope：ＳＩＭ）という。ＳＩＭがＳＥＭと異なる点は、ＳＥＭは観察が主であることに対し、ＳＩＭは観察に加えて加工にも利用され、任意の箇所にイオンビームを照射してスパッタエッチングにより削ることが可能である。
さらにＦＩＢは、対象物の微小領域表面に特定のフェナントレンＣ４Ｈ１０などのガスを吹きつけながらビーム走査することで化合物中成分が照射箇所に固着し、任意の箇所に化合物ガスの成分を試料表面に局所的に固着・堆積させることができる。この膜を堆積させることをイオン誘起ＣＶＤデポジション（Chemical‐Vapor‐Deposition：ＣＶＤ）と言う。デポジションではガスの種類を変えることで異なる種類の膜を堆積することができ、フェナントレンを吹き付けてデポジションすると、ダイヤモンドライクカーボンというアモルファスの膜が堆積する。ＦＩＢは、観察機能とエッチングおよびデポジションを組み合わせて試料表面に任意の形状を作成する機能を有している。
【００１１】
デバイス作製にこのＦＩＢ加工技術を適用するメリットは、ＦＩＢは前述したエッチングによる切削機能とデポジションによる構築機能によって、任意の微細形状加工を迅速に行える点で優れており、特に微小構造をボトムアップ式に構築できる点が好条件を満たし、バイオ分野におけるニーズに一早く対応して所望構造を提供することができる点にある。
バイオデバイスは細胞の配置とイメージングを目的とした基板であり、細胞は柔らかいので重力の影響を受け基板方向に平たくつぶれてしまう。そのため形状変化を考慮したサイズで、かつ細胞同士が完全に区切られた状態ではなく、隣り合う細胞同士が接触し相互作用するようにレイアウトした。できるだけ生体内をイメージングするためのデバイスとして細胞が活性化するような形状が求められる。図２にそのような１形態を模式的に示す。
【００１２】
ＦＩＢのデポジション機能で作製したバイオデバイス試作品の形状を図３に示す。加工時間は観察も含めて２時間程度要した。作製方法としてはデポジションプロセスで半導体ウェーハに使用されるシリコンの基板上に図３のＳＩＭ像に示す壁を作製した。なお、壁は肝細胞を配置のために仕切ってあるもので、ひとつひとつの部屋に細胞が配置されたときに壁より高い細胞側面で接するようにした。実験結果から肝細胞を安置するための試料台を短時間で試作できることを確認した。
次にＦＩＢのエッチング機能で作製したバイオデバイス試作品の形状を図４に示す。蛍光塗料で着色された細胞の生体イメージング観察は、可視光が用いられるので透明基板がより適している。ところが図４のデポジションによって作製されるダイヤモンドライクカーボンやシリコン基板は光が透過しない。そこで、光学顕微鏡で容易に観察できるように透明導電性基板であるＩＴＯ基板（ガラス基板上に酸化インジウムを形成したもの）を選択し、その基板上にエッチング形状加工を行った。加工形状は加工用の画像データを元に専用のソフトウェアを用いて行い、構造物は斜めＳＩＭ像観察で作製形状を確かめ、光学顕微鏡観察では光の透過性を確認した。なお、ＩＴＯ基板は、ガラス基板に比べＳＩＭやＳＥＭの荷電ビーム照射による帯電現象（チャージアップ）を防ぐことができ、加工精度の低下をおさえることができるメリットがある。
【００１３】
ＦＩＢの作製能力を示すため、エッチングとデポジションを組み合わせて作製した構造物である回転グラスを挙げる。図５に示した回転グラスは軸ブレを極限まで抑えた高精度回転ステージ上にあらかじめデポジションプロセスでダイヤモンドライクカーボンで母材を作製しておき、200ｒｐｍで回転させながら真横からＦＩＢを照射してエッチングで作製している。なお、グラスの上部の穴も真上からＦＩＢで削って作成する。グラス上部はφ2.7μｍ、グラス開口部は２μｍφ以下で、細胞器官と比べても小さい構造物であることが分かる。我々は本機能を“ナノ旋盤”と呼び、ＦＩＢを用いた新規の微小構造物作製ツールである。
その他に三次元データを画像として取り込み、三次元構造物を作成する方法がある。この方法では原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）等で得たヒト染色体の外郭形状の情報を反映させて、デポジションで外観模型を作製する。培養液中のＡＦＭ測定データ（三次元情報）から複数の輪切りの画像データを得て、その画像をもとにしたデポジションをすることでＸＹ方向に同じスケールの三次元構造を構築するようにしている。このように画像データをもとにその形状を反映させた微小構造物を作製することが、エッチング加工とデポジション加工の両方で可能である。
【００１４】
ＦＩＢ加工技術によって作成された版を用いて、今度はインプリント技術によって基板を作製する。このインプリント技術より、将来の大量生産が可能となる。インプリント技術は、微細加工された凹凸版を任意の素材にかたどることで形成し、繰り返し複数作製することが目的とされている。また、ナノインプリント技術は半導体分野でも十ナノメートルまでの次世代加工技術として期待されている。本発明におけるインプリントの手法は図６に模式的に示すように、最初にＦＩＢでナノバイオデバイス用基板の型を作製する。その形状は基板において求められる形状（図のＢ）の凹凸を反転させた形状（図のＡ）である。図のＡの構造はＦＩＢのエッチングプロセスで加工された図のＢの構造を原版として図のＣに示すようにコラーゲン等生体親和性の薄膜に転写して形成したものである。実際に転写された基板はＡＦＭで形状精度を確認して、その高い作製能力を示すことを確認した。ＦＩＢはマイクロメートルレベルの構造物の作製性能は優れているが、ミリメートル以上の広範囲を加工するのには多くの時間を必要とする。そこで基板自体をＦＩＢで加工するのではなくこのナノインプリント技術を用いた方法が大量に製作する場合に効率がよい。
【００１５】
基板の作製が出来たところで、その上に細胞を１つ１つ配置してゆく、この技術はレーザートラッピング技術を駆使して実行する。ここで必要とされる機能は微細な細胞１つ１つを捕捉し基板の所定位置まで移送することであり、光ピンセットと呼ばれるレーザーマニピュレータシステムを使用する。このＬＭＴシステムによる光トラップの原理はレーザーを細胞のような微細な物質集光照射すると、レーザービームは媒質の違いから屈折し、光の運動量が変化する。複数のレーザー光がこの微細な物質に照射されたときはその合成された運動量がこの微細な物質に作用するが、その際運動量を保存しようと逆向きの力が生じ、その結果微細物質は焦点にトラップされる。この状態で、試料ステージを移動させることにより、捕捉した微細物質が相対移動されることになる。培養された細胞の容器と試料基板とが試料ステージ上に載置されていれば、本発明の必要とする動作を実行させることが出来る。この様子はＣＣＤカメラをセットした高倍率の光学顕微鏡で観察しつつ作業をすることが出来る。
【００１６】
本発明によって作製されたナノバイオデバイスによって可能となる細胞間相互作用の解明への応用について説明する。細胞を自在に基板上に配列することが可能になったことにより細胞間相互作用の解明への応用も期待できるようになった。現在では２種類以上の細胞との共培養の系や脳組織のスライス培養などを用いた ex vivoの系を用いることによってin vitroでin vivoの状態を再現する実験法は数多く報告されている。本発明が目指す臓器ナノデバイスの手法は、共培養の系との比較では、より生体内の高度に組織化された細胞配列を再現することができるし、またスライス培養の系とは異なり、機能を見たい細胞だけを選択して配置できるため、よりシンプルな系を組むことができ、細胞の動態や機能を見る上で適している。さらに自由自在に細胞を配列することができるため、実際の生体内には存在しないような細胞配列を組みアッセイを行うことも可能となった。肝細胞と血管内皮細胞、肝細胞と繊維芽細胞等の２種類もしくはそれ以上の細胞の相互作用を様々な配列ごと調べることができることが大きなメリットである。ただし、通常の培養と比較し、現時点ではこの手法によって大量の細胞を短時間で配列することは困難であるため小規模な細胞集団を作ることしかできない状況である。そのため、検出感度の非常に高い方法（ルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子アッセイ等）を用いて細胞個々のバイオイメージングを介した遺伝子発現や細胞機能を測定する必要がある。
【００１７】
現在ＤＮＡマイクロアレイ解析などに代表されるスループットが高い解析が注目されている。これはチップ上に数万個ものＤＮＡのプローブを設置することにより、一度に多くの遺伝子発現プロファイルを得ることを可能にしたもので、その技術は臨床医学研究分野でも、がん組織診断等に有用であることが報告（非特許文献１参照）されている。すなわち高スループット化につれ実験の規模が小さくなり、かつ誇大なデータを容易に得ることが可能になった。そこで本発明に係る臓器ナノデバイスをセルアレイのようなアプローチと組み合わせて用いることで、細胞レベルでのスループットが高い機能解析システムを開発すれば、薬剤や遺伝子導入による影響を解析する有益なツールになることが期待できる。つまり、多種の細胞(株化細胞や初代培養細胞)をin vitroにおいて、よりin vivoに近い状態でスループットが高い解析をすることができる。それにより個々の細胞を別々に解析することで、わかりにくかった細胞同士の相互作用の情報も考慮に入れた遺伝子の発現などの情報を得ることができるようになり、研究の場において非常に有効な手段として利用できる。
【００１８】
本発明の技術によって、実際に細胞ひとつひとつを操作し基板上に配置していくことが可能になった様子を図７に示す。上段は光ピンセットを用いてハニカム模様のバリアを形成した基板上に細胞一つずつを移送した顕微鏡写真であり、下段はその状態を分かり易く示した模式図である。顕微鏡画像右下のスケールバーの長さは２０μｍである。ひとつずつ直線状に配置されている。次に、細胞を操作しナノデバイス基板上に複数種の細胞が配置可能なことを示すため、模式的に２種類のQ dot(量子ドット)試薬(655赤,565緑、Quantumdot社、住商バイオサイエンス)によって標識し、識別できるようにしたHEK293細胞で細胞をナノデバイス上にレーザーマニピュレーター（光ピンセット）を駆使して配置していく実験を行った。このときの様子を図８に示す。図８のＡはシャーレの中で通常の培養をしている状態であり、図８のＢは本発明のナノバイオデバイス用基板上に配置した状態を示している。２種類のQ dotで染色しわけた細胞をシャーレの中で通常に培養するとＡに示されるように不規則にバラバラの状態である。そのような細胞をレーザーマニピュレーターで操作して捕捉移動させて２種類の細胞を基板上に一つおきにリング状に配列させた状態が図８のＢに示されている。上段は位相差画像であり、下段が蛍光写真である。スケールバーの長さは３０μｍである。カラー写真を示せないので、若干不明瞭であるがＢの蛍光画像では赤く着色された細胞と緑に着色された細胞が綺麗に順番配列されていることが確認できる。このように規則正しく整列させることができた。このことは様々な配列を自在に作製することが可能であることを示している。なお、Ａの上下段画像から分かるようにシャーレの中で通常の培養では細胞がランダムに動いてしまうのに対し、本発明の基板上では細胞がセル内に固定されることが示されている。
【００１９】
次に、図９を参照しつつ応用例として肝臓ナノデバイスについて紹介する。本発明者らはナノデバイス上に肝臓の肝小葉構造を再現し、肝臓ナノデバイスの作製を進めている。そして、薬剤の安全性試験に肝臓ナノデバイスを用い、抗がん剤などの薬剤スクリーニングをhigh-throughputに行えるシステムの確立を目指しているところである。図９において、左上部に示したマウスのＥＳ細胞とヒトの間葉系幹細胞について、未分化と肝分化した細胞の顕微鏡画像が示されている。未分化とは採取した状態での細胞であり、肝分化とは処理して肝臓細胞化させたものである。この肝分化させた細胞を本発明の技術によって基板上に肝臓組織の配列を再現して組織化する。これが右上部に組織ナノデバイスとして模式的に示してある。
【００２０】
肝実質細胞は三次元で培養することにより、肝機能が単層培養よりも向上し、そして長期間維持されることが報告されている。また、肝臓は肝実質細胞以外に血管内皮細胞や胆管上皮細胞など複数の細胞より構成されており、それらとの共培養の系において肝機能が向上することなども知られている。そこで本発明者等は肝実質細胞の機能がより向上することをねらい、ナノデバイス基板上に肝実質細胞を中心に他の細胞を in vivoに近い形で配置することに想到した。in vivo様の細胞間相互作用を起こし、肝実質細胞の機能がより向上するのではないかと考えたためである。すなわちin vitroにおいて細胞にin vivoに類似した機能を持たすことが可能となれば、ラットなどを用いた動物実験を縮小化でき、コストの削減や倫理的な観点から非常に有益である。さらに肝臓ナノデバイスを集積化し三次元化する手法として、ナノデバイス基板の素材として生分解性の高いバイオマテリアルをもちいることにより実現させることに想到した。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明によって、臓器の人工培養方法を示した。そのためにまず、ナノデバイス上に肝実質細胞と他の細胞を配列し、もっとも肝機能が向上する配列を決定することが必要である。また、実際に用いる細胞に関しても、すでに我々、国立がんセンター研究所・がん転移研究室ではＥＳ細胞やヒト骨髄性幹細胞から肝実質細胞へと分化誘導すること（非特許文献２参照）に成功しておりこれらの幹細胞から得られた肝実質細胞を肝臓ナノデバイスに利用することができれば、スループットが高い薬剤の安全性試験を動物個体の使用を最小限に留めることができことから、本発明は臨床医学とりわけ再生医学の分野、薬学、生物学にわたる広い分野で基礎材料として利用されることになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の概念図である。
【図２】ＦＩＢによってエッチング加工した基板とその上に細胞を配置した概念図である。
【図３】デポジションによって加工した基板のイオン顕微鏡像である。
【図４】画像データを基に基板を作製した試作を示す図である。
【図５】ＦＩＢ加工の精密性を示すワイングラスの試作例である。
【図６】ＦＩＢによってエッチング加工した基板用の型とその型を版としてインプリントすることを模式的に示した図である。
【図７】基板上にＨＥＫ２９３細胞を順次配置したことを示す図である。
【図８】識別できる２種類の細胞を基板上に所望配列で配置可能なことを示す顕微鏡画像である。
【図９】肝臓ナノデバイスの作製とその応用化を説明する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジーの技術と、基板デバイスの高集積化を実現するナノテクノロジーを融合させたものであって、ある生体組織構造を模倣した規則に沿って細胞集団を配列した生体ナノデバイスを作製する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジーの分野では、レーザートラッピング技術などの出現により、ひとつひとつの細胞を自由自在に操ることが可能となり、また近年のナノテクノロジーの発展により基板デバイスの高集積化や高速化が進み、使用目的に応じたサイズやデザインの形状を基板上に加工できるようになった。それは、ある生体組織構造を模倣した規則に沿って細胞集団を配列した生体ナノデバイスの作製を目指すレベルにまで達している。つまり、従来では困難であると考えられていた培養細胞をin vivoに近い状態で高度に組織化することが、これら技術の融合によりナノデバイス上に可能となりつつある。これにより再生医療に向けての素材作りとしてだけではなく、invitroでは解明が困難であった細胞間相互作用の解析においても有益なツールとして期待できるようになった。一方、医学・生物学において、ＤＮＡマイクロアレイ法を用いたトランスクリプトーム解析や二次元電気泳動と質量分析器を用いたプロテオームのような網羅的解析が様々な分野で利用され、スループットの高い解析に注目が高まっている。それは各生物が保持する全遺伝子配列がゲノムプロジェクトやｃＤＮＡプロジェクトにより明らかになるにつれ、スループットの高い解析により個々の分子レベルだけでなく細胞のネットワークの中での分子メカニズムの多様性を網羅的に理解することが求められるようになったためである。これらの新しいテクノロジーの波は生体ナノデバイスのシステムをスループットの高いアプローチと組み合わせて用いることで、遺伝子発現やタンパク質相互作用ばかりではなく生細胞レベルでそれらを解析していく時代を拓こうとしており、動物実験に代わる新しい系の確立、薬剤スクリーニング等への適用も期待できるところまできている。
【０００３】
近年、最も注目を浴びている研究分野の一つとして再生医療がある。その最大の理由は深刻な移植臓器の不足を補う新世紀の医療として期待されているためである。しかし、現時点では細胞移植治療の域に留まっており、臓器そのものを再生させるには至っていない。なぜ、臓器の再生は実現できていない理由として、臓器が複数の細胞によって構成されていることや、その内部に栄養や酸素などを供給するための血管組織が張り巡らされていることなど、規則的でありながら非常に複雑な構造を形成しているためである。そのため個々の細胞を用意することは可能でも、そこから臓器そのものを構築することは非常に困難であるとされていた。すなわち、今までの技術では細胞をコントロールして各臓器の組織を形成するように配置・構成していくことは極めて困難であった。
【０００４】
しかし、近年のレーザーマニピュレーター技術の革新やナノテクノロジー分野における微細加工技術の開発により細胞自体がナノテクノロジーの恩恵を十分に享受できるようになってきた。これにより、現時点では臓器自体を再構築するにはまだ遠いが、人工の基板上に臓器の切片のような状態で細胞を思い通りに並べることが可能になってきている。そこで、この技術を応用してまず細胞を配置する基板を構築できれば、それを幾層にも重ね合わせていくことで立体的な臓器構造も作製することが可能になる。さらにはコラーゲンやヒアルロン酸などの生体親和性物質で基板を構築できれば、細胞に対しより拒否反応を少なくすることができ、次には血管再生技術との統合を図ることで将来的には移植可能な臓器ユニットの作製も可能となる。
実際に臓器構築にあたり実際に用いるソースとして、１つは骨髄細胞などの組織性幹細胞や胚性幹細胞(ＥＳ細胞)が考えられる。組織性幹細胞は細胞融合等の問題点があげられるが成人からの採取が可能なことや自己細胞であることから、免疫拒絶反応が理論上は起きないなどの利点があり、臓器構築にとって魅力的な素材の１つである。一方、胚性幹細胞に関する問題においても、移植の障壁となっていた奇形腫の形成に関わる遺伝子が同定されたことや、拒絶反応に関しても受精卵へ患者の体細胞核を移植し、胚性幹細胞を樹立するクローン胚技術が可能となったことで医療への実用化の道が探られようとしている。このような幹細胞研究がさらに発展をし、臓器構築のソース(各細胞)として供給可能な体制を築くことがナノテクノロジーを介した臓器再生には必要である。
【非特許文献１】Oode K, Furuya T, Harada K, Kawaguchi S, Yamamoto K, Hirano T, Sasaki K. “The development of a cell array and it scombination with laser-scanning cytometry allows a high-throughput analysis of nuclear DNA content” Am J Pathol. 157(3) pp.723-728 Sep. 2000
【非特許文献２】寺谷 工，落谷 孝広 「幹細胞・ＥＳ細胞―間葉系幹細胞」 再生医療 Vol.３ No.４ 126〜133頁 2004年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臓器の再生は実現できていない理由が前述したように臓器が複数の細胞によって構成されていることや、その内部に生存のための栄養、酸素などを供給するための血管組織が張り巡らされていることなど、規則的ではあっても複雑な構造を形成して機能していること、そのため個々の細胞を用意することは可能でも、そこから臓器そのものを配列・構築することは困難であるとされている環境の中で、本発明が解決しようとする課題は、培養した細胞をin vivoに近い状態で高度に組織化させるためのナノバイオデバイスを提供すること、また、その生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの利用方法を提示することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスは、生体親和性物質で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置したものとした。
本発明のナノバイオデバイス作製方法は、マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板を作るステップと、該基板上にレーザーマニピュレータを用いて複数の種類の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるようにした。
また、本発明の他のナノバイオデバイス作製方法は、マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板の型を作るステップと、該型を版としてプリント技術によって生体親和性物質の基板を作製するステップと、該基板上にレーザーマニピュレータを用いて複数の種類の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるようにした。
マイクロマシーン技術が集束イオンビームの場合はイオンエッチングによる切削、デポジション等で構造を作製し、フェムト秒レーザーの場合には照射による穴あけや、紫外線硬化樹脂を用い２光子吸収法などの焦点走査で三次元構造を構築する。型を版としたプリントはコラーゲンやヒアルロン酸等の生体親和性物質を塗布して利用するものや、また、生体親和性物質を押し当ててインプリントとして作製利用する手法などを提示する。
また、本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの使用法は、薬剤毒性試験の試料や再生組織の素材として使用することを提示した。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスは、コラーゲンやヒアルロン酸等の生体親和性物質の基板上に生体内の高度に組織化された細胞配列を再現したものであるので、in vitra で in vivo 形態の各種試験用の試料が提供できる。
本発明のナノバイオデバイス作製方法は、半導体やマイクロマシーンの分野で培われた技術と、光ピンセットのレーザートラッピングの技術等を駆使して、１つ１つの細胞を捕捉して生体親和性物質の基板上に所望配置することを可能にしたので、生体内の高度に組織化された細胞配列を再現することができる。
また、本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの使用法は、薬剤毒性試験の試料や再生組織の素材として使用することを提示したものであり、これにより薬剤の毒性試験を人体実験ではなく、動物も使わず実施でき、in vivo に近い成果を得ることが出来る。また、細胞間相互作用の分子メカニズムの解明に有効利用できる。更にはナノバイオデバイスによって細胞培養することで機能する臓器を構築でき、将来の臓器構築による再生医療へ展開することを可能にした。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスの作成とその応用例について、図１の概念図を参照しながら概要を説明する。動物やヒトから採取した種々の生細胞を従来からの方法で培養する。ナノテクノロジーの技術を駆使してナノバイオデバイス用の基板を作製する。この基板上にレーザーマニピュレータを使用して先に培養した細胞を捕捉すると共に、基板の所定位置に配置して組織ナノデバイスを作成する。その際、本発明では配置する細胞は複数種類の細胞について生体組織を模した形態で配列させることが出来、この様に生体組織構造を模倣して作成されたナノバイオデバイスは、細胞間相互の分子メカニズムの解析や、再生医療分野における臓器構築技術の基礎材料として、また、スループットの高いセルアレイへの応用へと道を開くものとなる。
【０００９】
本発明の生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスとしては、細胞を規則的かつ複雑な構造を構築して器官を形成し、さらに維持するためには細胞の生存に適した環境下で酸素や栄養を供給しなければならない。現在はまだ臓器ユニット培養には至っておらず、培養を目的とした細胞配置に適した基板（微細構造体）を必要とされている。本発明の基礎として、まずこの基板を作成するために本発明者等は半導体加工技術で培われた集束イオンビーム（Focused Ion Beam：ＦＩＢ）装置を用いた加工技術を応用することに想到した。
近年の半導体技術の発展によって半導体の性能の指標となる加工配線幅は電子線や極紫外光の短波長光源を用いた露光技術で数十ナノメートルの微細加工レベルに達しようとしている。半導体の分野では露光する際に転写パターンである“マスク”を必要とするが、その加工修正にこの集束イオンビーム装置が用いられている。ＦＩＢはマスク修正ツールとしての役目を担ったり、他にその加工機能を生かして、様々なデバイスを切削加工してその断面観察をする故障解析ツールとして使用されているところである。そこで我々はＦＩＢ装置に着目し、バイオ分野のデバイス作製ツールとして利用し、細胞を培養するためデバイス基板の作製を提言する。
【００１０】
基板作成技術を説明する前に集束イオンビーム装置について簡単に説明しておく、ＦＩＢは、ガリウムイオンをイオン源から電気的に引き出し、電界レンズで集束してビームとして対象物に照射する装置である。その細く集束されたビームを対象物の微小領域に走査させることで走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）と同様に形状観察が可能である。この機能を走査型イオン顕微鏡（Scanning Ion Microscope：ＳＩＭ）という。ＳＩＭがＳＥＭと異なる点は、ＳＥＭは観察が主であることに対し、ＳＩＭは観察に加えて加工にも利用され、任意の箇所にイオンビームを照射してスパッタエッチングにより削ることが可能である。
さらにＦＩＢは、対象物の微小領域表面に特定のフェナントレンＣ４Ｈ１０などのガスを吹きつけながらビーム走査することで化合物中成分が照射箇所に固着し、任意の箇所に化合物ガスの成分を試料表面に局所的に固着・堆積させることができる。この膜を堆積させることをイオン誘起ＣＶＤデポジション（Chemical‐Vapor‐Deposition：ＣＶＤ）と言う。デポジションではガスの種類を変えることで異なる種類の膜を堆積することができ、フェナントレンを吹き付けてデポジションすると、ダイヤモンドライクカーボンというアモルファスの膜が堆積する。ＦＩＢは、観察機能とエッチングおよびデポジションを組み合わせて試料表面に任意の形状を作成する機能を有している。
【００１１】
デバイス作製にこのＦＩＢ加工技術を適用するメリットは、ＦＩＢは前述したエッチングによる切削機能とデポジションによる構築機能によって、任意の微細形状加工を迅速に行える点で優れており、特に微小構造をボトムアップ式に構築できる点が好条件を満たし、バイオ分野におけるニーズに一早く対応して所望構造を提供することができる点にある。
バイオデバイスは細胞の配置とイメージングを目的とした基板であり、細胞は柔らかいので重力の影響を受け基板方向に平たくつぶれてしまう。そのため形状変化を考慮したサイズで、かつ細胞同士が完全に区切られた状態ではなく、隣り合う細胞同士が接触し相互作用するようにレイアウトした。できるだけ生体内をイメージングするためのデバイスとして細胞が活性化するような形状が求められる。図２にそのような１形態を模式的に示す。
【００１２】
ＦＩＢのデポジション機能で作製したバイオデバイス試作品の形状を図３に示す。加工時間は観察も含めて２時間程度要した。作製方法としてはデポジションプロセスで半導体ウェーハに使用されるシリコンの基板上に図３のＳＩＭ像に示す壁を作製した。なお、壁は肝細胞を配置のために仕切ってあるもので、ひとつひとつの部屋に細胞が配置されたときに壁より高い細胞側面で接するようにした。実験結果から肝細胞を安置するための試料台を短時間で試作できることを確認した。
次にＦＩＢのエッチング機能で作製したバイオデバイス試作品の形状を図４に示す。蛍光塗料で着色された細胞の生体イメージング観察は、可視光が用いられるので透明基板がより適している。ところが図４のデポジションによって作製されるダイヤモンドライクカーボンやシリコン基板は光が透過しない。そこで、光学顕微鏡で容易に観察できるように透明導電性基板であるＩＴＯ基板（ガラス基板上に酸化インジウムを形成したもの）を選択し、その基板上にエッチング形状加工を行った。加工形状は加工用の画像データを元に専用のソフトウェアを用いて行い、構造物は斜めＳＩＭ像観察で作製形状を確かめ、光学顕微鏡観察では光の透過性を確認した。なお、ＩＴＯ基板は、ガラス基板に比べＳＩＭやＳＥＭの荷電ビーム照射による帯電現象（チャージアップ）を防ぐことができ、加工精度の低下をおさえることができるメリットがある。
【００１３】
ＦＩＢの作製能力を示すため、エッチングとデポジションを組み合わせて作製した構造物である回転グラスを挙げる。図５に示した回転グラスは軸ブレを極限まで抑えた高精度回転ステージ上にあらかじめデポジションプロセスでダイヤモンドライクカーボンで母材を作製しておき、200ｒｐｍで回転させながら真横からＦＩＢを照射してエッチングで作製している。なお、グラスの上部の穴も真上からＦＩＢで削って作成する。グラス上部はφ2.7μｍ、グラス開口部は２μｍφ以下で、細胞器官と比べても小さい構造物であることが分かる。我々は本機能を“ナノ旋盤”と呼び、ＦＩＢを用いた新規の微小構造物作製ツールである。
その他に三次元データを画像として取り込み、三次元構造物を作成する方法がある。この方法では原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）等で得たヒト染色体の外郭形状の情報を反映させて、デポジションで外観模型を作製する。培養液中のＡＦＭ測定データ（三次元情報）から複数の輪切りの画像データを得て、その画像をもとにしたデポジションをすることでＸＹ方向に同じスケールの三次元構造を構築するようにしている。このように画像データをもとにその形状を反映させた微小構造物を作製することが、エッチング加工とデポジション加工の両方で可能である。
【００１４】
ＦＩＢ加工技術によって作成された版を用いて、今度はインプリント技術によって基板を作製する。このインプリント技術より、将来の大量生産が可能となる。インプリント技術は、微細加工された凹凸版を任意の素材にかたどることで形成し、繰り返し複数作製することが目的とされている。また、ナノインプリント技術は半導体分野でも十ナノメートルまでの次世代加工技術として期待されている。本発明におけるインプリントの手法は図６に模式的に示すように、最初にＦＩＢでナノバイオデバイス用基板の型を作製する。その形状は基板において求められる形状（図のＢ）の凹凸を反転させた形状（図のＡ）である。図のＡの構造はＦＩＢのエッチングプロセスで加工された図のＢの構造を原版として図のＣに示すようにコラーゲン等生体親和性の薄膜に転写して形成したものである。実際に転写された基板はＡＦＭで形状精度を確認して、その高い作製能力を示すことを確認した。ＦＩＢはマイクロメートルレベルの構造物の作製性能は優れているが、ミリメートル以上の広範囲を加工するのには多くの時間を必要とする。そこで基板自体をＦＩＢで加工するのではなくこのナノインプリント技術を用いた方法が大量に製作する場合に効率がよい。
【００１５】
基板の作製が出来たところで、その上に細胞を１つ１つ配置してゆく、この技術はレーザートラッピング技術を駆使して実行する。ここで必要とされる機能は微細な細胞１つ１つを捕捉し基板の所定位置まで移送することであり、光ピンセットと呼ばれるレーザーマニピュレータシステムを使用する。このＬＭＴシステムによる光トラップの原理はレーザーを細胞のような微細な物質集光照射すると、レーザービームは媒質の違いから屈折し、光の運動量が変化する。複数のレーザー光がこの微細な物質に照射されたときはその合成された運動量がこの微細な物質に作用するが、その際運動量を保存しようと逆向きの力が生じ、その結果微細物質は焦点にトラップされる。この状態で、試料ステージを移動させることにより、捕捉した微細物質が相対移動されることになる。培養された細胞の容器と試料基板とが試料ステージ上に載置されていれば、本発明の必要とする動作を実行させることが出来る。この様子はＣＣＤカメラをセットした高倍率の光学顕微鏡で観察しつつ作業をすることが出来る。
【００１６】
本発明によって作製されたナノバイオデバイスによって可能となる細胞間相互作用の解明への応用について説明する。細胞を自在に基板上に配列することが可能になったことにより細胞間相互作用の解明への応用も期待できるようになった。現在では２種類以上の細胞との共培養の系や脳組織のスライス培養などを用いた ex vivoの系を用いることによってin vitroでin vivoの状態を再現する実験法は数多く報告されている。本発明が目指す臓器ナノデバイスの手法は、共培養の系との比較では、より生体内の高度に組織化された細胞配列を再現することができるし、またスライス培養の系とは異なり、機能を見たい細胞だけを選択して配置できるため、よりシンプルな系を組むことができ、細胞の動態や機能を見る上で適している。さらに自由自在に細胞を配列することができるため、実際の生体内には存在しないような細胞配列を組みアッセイを行うことも可能となった。肝細胞と血管内皮細胞、肝細胞と繊維芽細胞等の２種類もしくはそれ以上の細胞の相互作用を様々な配列ごと調べることができることが大きなメリットである。ただし、通常の培養と比較し、現時点ではこの手法によって大量の細胞を短時間で配列することは困難であるため小規模な細胞集団を作ることしかできない状況である。そのため、検出感度の非常に高い方法（ルシフェラーゼを用いたレポーター遺伝子アッセイ等）を用いて細胞個々のバイオイメージングを介した遺伝子発現や細胞機能を測定する必要がある。
【００１７】
現在ＤＮＡマイクロアレイ解析などに代表されるスループットが高い解析が注目されている。これはチップ上に数万個ものＤＮＡのプローブを設置することにより、一度に多くの遺伝子発現プロファイルを得ることを可能にしたもので、その技術は臨床医学研究分野でも、がん組織診断等に有用であることが報告（非特許文献１参照）されている。すなわち高スループット化につれ実験の規模が小さくなり、かつ誇大なデータを容易に得ることが可能になった。そこで本発明に係る臓器ナノデバイスをセルアレイのようなアプローチと組み合わせて用いることで、細胞レベルでのスループットが高い機能解析システムを開発すれば、薬剤や遺伝子導入による影響を解析する有益なツールになることが期待できる。つまり、多種の細胞(株化細胞や初代培養細胞)をin vitroにおいて、よりin vivoに近い状態でスループットが高い解析をすることができる。それにより個々の細胞を別々に解析することで、わかりにくかった細胞同士の相互作用の情報も考慮に入れた遺伝子の発現などの情報を得ることができるようになり、研究の場において非常に有効な手段として利用できる。
【００１８】
本発明の技術によって、実際に細胞ひとつひとつを操作し基板上に配置していくことが可能になった様子を図７に示す。上段は光ピンセットを用いてハニカム模様のバリアを形成した基板上に細胞一つずつを移送した顕微鏡写真であり、下段はその状態を分かり易く示した模式図である。顕微鏡画像右下のスケールバーの長さは２０μｍである。ひとつずつ直線状に配置されている。次に、細胞を操作しナノデバイス基板上に複数種の細胞が配置可能なことを示すため、模式的に２種類のQ dot(量子ドット)試薬(655赤,565緑、Quantumdot社、住商バイオサイエンス)によって標識し、識別できるようにしたHEK293細胞で細胞をナノデバイス上にレーザーマニピュレーター（光ピンセット）を駆使して配置していく実験を行った。このときの様子を図８に示す。図８のＡはシャーレの中で通常の培養をしている状態であり、図８のＢは本発明のナノバイオデバイス用基板上に配置した状態を示している。２種類のQ dotで染色しわけた細胞をシャーレの中で通常に培養するとＡに示されるように不規則にバラバラの状態である。そのような細胞をレーザーマニピュレーターで操作して捕捉移動させて２種類の細胞を基板上に一つおきにリング状に配列させた状態が図８のＢに示されている。上段は位相差画像であり、下段が蛍光写真である。スケールバーの長さは３０μｍである。カラー写真を示せないので、若干不明瞭であるがＢの蛍光画像では赤く着色された細胞と緑に着色された細胞が綺麗に順番配列されていることが確認できる。このように規則正しく整列させることができた。このことは様々な配列を自在に作製することが可能であることを示している。なお、Ａの上下段画像から分かるようにシャーレの中で通常の培養では細胞がランダムに動いてしまうのに対し、本発明の基板上では細胞がセル内に固定されることが示されている。
【００１９】
次に、図９を参照しつつ応用例として肝臓ナノデバイスについて紹介する。本発明者らはナノデバイス上に肝臓の肝小葉構造を再現し、肝臓ナノデバイスの作製を進めている。そして、薬剤の安全性試験に肝臓ナノデバイスを用い、抗がん剤などの薬剤スクリーニングをhigh-throughputに行えるシステムの確立を目指しているところである。図９において、左上部に示したマウスのＥＳ細胞とヒトの間葉系幹細胞について、未分化と肝分化した細胞の顕微鏡画像が示されている。未分化とは採取した状態での細胞であり、肝分化とは処理して肝臓細胞化させたものである。この肝分化させた細胞を本発明の技術によって基板上に肝臓組織の配列を再現して組織化する。これが右上部に組織ナノデバイスとして模式的に示してある。
【００２０】
肝実質細胞は三次元で培養することにより、肝機能が単層培養よりも向上し、そして長期間維持されることが報告されている。また、肝臓は肝実質細胞以外に血管内皮細胞や胆管上皮細胞など複数の細胞より構成されており、それらとの共培養の系において肝機能が向上することなども知られている。そこで本発明者等は肝実質細胞の機能がより向上することをねらい、ナノデバイス基板上に肝実質細胞を中心に他の細胞を in vivoに近い形で配置することに想到した。in vivo様の細胞間相互作用を起こし、肝実質細胞の機能がより向上するのではないかと考えたためである。すなわちin vitroにおいて細胞にin vivoに類似した機能を持たすことが可能となれば、ラットなどを用いた動物実験を縮小化でき、コストの削減や倫理的な観点から非常に有益である。さらに肝臓ナノデバイスを集積化し三次元化する手法として、ナノデバイス基板の素材として生分解性の高いバイオマテリアルをもちいることにより実現させることに想到した。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明によって、臓器の人工培養方法を示した。そのためにまず、ナノデバイス上に肝実質細胞と他の細胞を配列し、もっとも肝機能が向上する配列を決定することが必要である。また、実際に用いる細胞に関しても、すでに我々、国立がんセンター研究所・がん転移研究室ではＥＳ細胞やヒト骨髄性幹細胞から肝実質細胞へと分化誘導すること（非特許文献２参照）に成功しておりこれらの幹細胞から得られた肝実質細胞を肝臓ナノデバイスに利用することができれば、スループットが高い薬剤の安全性試験を動物個体の使用を最小限に留めることができことから、本発明は臨床医学とりわけ再生医学の分野、薬学、生物学にわたる広い分野で基礎材料として利用されることになろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の概念図である。
【図２】ＦＩＢによってエッチング加工した基板とその上に細胞を配置した概念図である。
【図３】デポジションによって加工した基板のイオン顕微鏡像である。
【図４】画像データを基に基板を作製した試作を示す図である。
【図５】ＦＩＢ加工の精密性を示すワイングラスの試作例である。
【図６】ＦＩＢによってエッチング加工した基板用の型とその型を版としてインプリントすることを模式的に示した図である。
【図７】基板上にＨＥＫ２９３細胞を順次配置したことを示す図である。
【図８】識別できる２種類の細胞を基板上に所望配列で配置可能なことを示す顕微鏡画像である。
【図９】肝臓ナノデバイスの作製とその応用化を説明する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性物質で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置したものである生体組織構造を模倣したナノバイオデバイス。
【請求項２】
マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板を作るステップと、該基板上にピンセットを用いて複数の種類の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるナノバイオデバイス作製方法。
【請求項３】
マイクロマシーン加工技術は集束イオンビーム加工により基板を作製するものである請求項２に記載のナノバイオデバイス作製方法。
【請求項４】
マイクロマシーン加工技術は、フェムト秒レーザーやHe-Cd レーザーを用いて光硬化樹脂内で焦点走査させることにより基板を作製するものである請求項２に記載のナノバイオデバイス作製方法。
【請求項５】
請求項２乃至４のいずれかに記載の加工技術でナノバイオデバイス用の基板の型を作るステップと、該型を版としてプリント技術によって生体親和性物質の基板を作製するステップと、該基板上に複数の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるナノバイオデバイス作製方法。
【請求項６】
生体親和性物質を請求項２乃至４のいずれかに記載の方法で作製した基板上に塗布し、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置した生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスを薬剤毒性試験の試料として使用する方法。
【請求項７】
生体親和性物質を用い、生体親和性物質を請求項２乃至４のいずれかに記載の方法で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置した生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスを再生組織の素材として使用する方法。
【請求項１】
生体親和性物質で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置したものである生体組織構造を模倣したナノバイオデバイス。
【請求項２】
マイクロマシーン加工技術でナノバイオデバイス用の基板を作るステップと、該基板上にピンセットを用いて複数の種類の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるナノバイオデバイス作製方法。
【請求項３】
マイクロマシーン加工技術は集束イオンビーム加工により基板を作製するものである請求項２に記載のナノバイオデバイス作製方法。
【請求項４】
マイクロマシーン加工技術は、フェムト秒レーザーやHe-Cd レーザーを用いて光硬化樹脂内で焦点走査させることにより基板を作製するものである請求項２に記載のナノバイオデバイス作製方法。
【請求項５】
請求項２乃至４のいずれかに記載の加工技術でナノバイオデバイス用の基板の型を作るステップと、該型を版としてプリント技術によって生体親和性物質の基板を作製するステップと、該基板上に複数の培養細胞を所望の配列で配置するステップとからなるナノバイオデバイス作製方法。
【請求項６】
生体親和性物質を請求項２乃至４のいずれかに記載の方法で作製した基板上に塗布し、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置した生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスを薬剤毒性試験の試料として使用する方法。
【請求項７】
生体親和性物質を用い、生体親和性物質を請求項２乃至４のいずれかに記載の方法で基板を作り、その上に複数の種類の細胞を所望の配列で配置した生体組織構造を模倣したナノバイオデバイスを再生組織の素材として使用する方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−２２３６７２（Ｐ２００６−２２３６７２Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−４２９９５（Ｐ２００５−４２９９５）
【出願日】平成１７年２月１８日（２００５．２．１８）
【出願人】（５０３４６０３２３）エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社 (330)
【出願人】（５０５０６２６３９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１８日（２００５．２．１８）
【出願人】（５０３４６０３２３）エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社 (330)
【出願人】（５０５０６２６３９）
【Ｆターム（参考）】
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