疾患治療のためのマンノース結合レクチンの融合タンパク質
一定の細胞型および／または病原体に結合する炭水化物、脂質、および／またはタンパク質などの特異的部分を標的にする配列を有する融合タンパク質；およびエフェクター機能を誘導する配列を提供する。本開示はまた、融合タンパク質をコードする核酸、ならびに本明細書に記載された融合タンパク質を含む、感染性疾患、癌、免疫関連障害および他の病気などの病態または疾患を治療する医薬組成物、使用方法、および治療方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６０／９９６，２８８号明細書の利益を主張する。これは参照として本明細書に援用されている。
【０００２】
本発明は、種々の疾患および感染の治療に関する。より具体的には、本発明は、マンノース結合レクチンポリペプチド配列などの融合タンパク質に関する。これらの融合タンパク質は、感染性疾患、癌、免疫関連疾患および他の疾患を治療するための医薬組成物において使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）とも称されるマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）は、広範囲の病原体（ウイルス、細菌、真菌、原生動物）の表面上の炭水化物に結合することにより先天性免疫応答において役割を果たすカルシウム依存血清タンパク質であり、これはそこでの補体系を活性化することができる。ＭＢＬはまた、直接オプソニンとして働き、病原体の表面をタグ化することにより、病原体の結合と取り込みを媒介して、食細胞による認識および消化を促進する。
【０００４】
マンノース結合レクチンは、肝臓で作られるタンパク質のコレクチンファミリーのメンバーである。コレクチンは、コラーゲン様領域とレクチン領域を有するため名称を持っている。レクチンは通常、細菌の表面上の炭水化物に結合するタンパク質である。コラーゲンドメインは、先天性免疫系のエフェクター部分と相互作用する。ヒト染色体１０上のＭＢＬ２遺伝子は、Ｎ末端のシステインに富んだ領域、コラーゲン様領域、ネック領域、および炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含む３つの同一のポリペプチド鎖から構成される２４８のアミノ酸のタンパク質サブユニットのオリゴマーであるＭＢＬを生じさせる。３つのＭＢＬポリペプチド鎖は、インビボで見られる生物活性三量体へと組み立てられる。
【０００５】
血清のＭＢＬが微生物の表面上の炭水化物と相互作用すると、補体活性化のレクチン経路の病原体認識要素を形成する。ＭＢＬは、反復マンノースまたはＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する表面配列に結合する。それは、複合体が適切な表面に結合した時に自動活性化する１つまたは複数のＭＢＰ結合セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）との複合体として循環する。
【０００６】
ＭＢＰの表面認識機能は、αラセン体の多重コイルにより保持された３つのＣ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の集団によって媒介される。Ｎ末端部のコラーゲン様ドメインは、そのドメインの湾曲部を形成する単一の割り込み部分を有するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ三重体からなる。短いＮ末端ドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成するいくつかのシステイン残基を含有する。血清ＭＢＬｓは、齧歯類では２〜４個の三量体サブユニット、ヒトでは６個と多いサブユニットを含有するより大型の形態へと組み立てられる。ＭＢＰ−Ａと称されるラットの血清ＭＢＰの３つのオリゴマー形態は全て補体を固定することができるが、オリゴマーが大型になるほど、より高い特異性を有する。多くの種は、ＭＢＰの第二の形態を発現する。ラットでは、第二の形態、ＭＢＰ−Ｃは肝臓に見られる。ＭＢＰ−Ｃは、３つのポリペプチドを含有する単純なサブユニットを越えたより高いオリゴマーを形成することはない。ラットのＭＢＰ−ＡとＭＢＰ−Ｃの間のキメラの分析により、コラーゲン様ドメインが、ＭＡＳＰ結合ドメインを含有することが示唆される。
【０００７】
ＭＢＬは数年間、治療薬として研究されている。例えばＭＢＰは、食細胞の機能障害をもたらす腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤により処置された個体の感染の治療として考慮されている（国際公開第０２／０５８３３号パンフレットを参照）。ＭＢＬは、感染性薬剤に対するＭＢＬ ＣＲＤ領域の結合、および引き続くクリアランスを介して感染のクリアランスを可能にすることにより、ＴＮＦ阻害剤によって処置された患者のサブセットにおける食細胞機能の不足を補償するためにその天然形態において用いられる。ＭＢＬはまた、ワクチンアジュバントとして使用するために、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドとの融合タンパク質においても考慮されている（米国特許第７，３００，７４４号明細書を参照）。ＭＢＬなどの集合の先に記載された使用により、樹状細胞およびＴ細胞が免疫応答を開始するのを活性化するＣＤ４０Ｌなどの分子の三量体ＴＮＦベースファミリーを産生することが可能になる。上記の適用において記載されたより高い多量体化が、アジュバントの特性にとって望ましい。したがってこれらの方法により、先天性および適応性の免疫機能を活性化し、抗体応答を提供できる分子が提供される。しかしながら、これらの方法は、補体活性化を開始するために設計されてはいない。実際、補体活性化は、ＭＢＬ融合タンパク質が結合した所望の免疫細胞の死滅をもたらすため、ワクチンの効果にとって有害と考えられる。この適用において、ＭＢＰは補体活性化を媒介するのに使用されるが、細胞免疫応答を誘導し抗体産生はきわめて望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明者は、当業界において、補体を活性化する感染、癌、および他の障害を治療する方法を提供することが求められていることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、エフェクター機能を有するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含む第一のポリペプチドと、細胞表面またはウイルスに結合する標的配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供し、この第一のポリペプチドは活性ＭＢＬ Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含まない。第二のポリペプチドの標的配列は、腫瘍細胞、免疫細胞、細菌細胞、原生動物、真菌およびウイルスに感染した細胞からなる群から選択的される細胞の表面上の標的部分に結合することができる。標的部分は、特定の細胞に結合している炭水化物、脂質、またはアミノ酸配列のいずれか１つまたはそれらの組合せを含むことができる。標的配列は、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）などのレクチンを含むことができる。第一のポリペプチド結合は、哺乳類の補体系などのエフェクター機能を可能にする配列を含む。
【００１０】
一態様において、本発明は、エフェクター機能を有するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドと、細胞表面またはウイルスに結合する標的配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質を哺乳類に投与することを含む哺乳類の補体系を活性化する方法を提供し、この第一のポリペプチドは、活性ＭＢＬ Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含まない。
【００１１】
一態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質および薬学的に許容された賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、化学療法剤などの少なくとも１つの追加治療薬および／または抗体、キナーゼ阻害剤、または癌ワクチンなどの標的化治療薬をさらに含むことができる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、病原体性疾患に罹っている患者に、本発明の融合タンパク質またはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、病原体性疾患を治療する方法を提供し、標的配列が病原体の細胞表面マーカーまたはウイルスに感染している細胞上のマーカーに結合する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、腫瘍細胞と関連する増殖性疾患の治療を必要としている患者に、本発明の融合タンパク質またはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、腫瘍細胞と関連する増殖性疾患を治療する方法を提供し、標的配列が、癌細胞の表面上など、腫瘍細胞の表面上のマーカーに結合する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする配列を含む単離核酸、この核酸を含む発現ベクター、この発現ベクターを含む宿主細胞、ならびにこれらの核酸、ベクター、および宿主細胞を含む本発明の融合タンパク質を調製する方法に関する。
【００１５】
本発明の他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から当業者に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】完全長ヒトＭＢＰ（配列番号３８）のポリペプチド配列および一般的な構造領域（シグナルペプチド領域、多量体化領域、コラーゲン様領域、多重コイル領域、およびＣ型レクチンドメイン）を示す図である。イタリック体および下線を引いたアミノ酸は、ＭＢＰ結合セリンプロテアーゼ類（ＭＡＳＰ）に対する結合領域を含むと考えられる。
【図２】ヒト（配列番号３９）、ラット（ＭＢＰ−Ａは配列番号４０、ＭＢＰ−Ｃは配列番号４１）、マウス（ＭＢＰ−Ａは配列番号４２、ＭＢＰ−Ｃは配列番号４３）、およびサル（配列番号４３）からの種々のＭＢＰ配列のアラインメントを示す図である。残基「Ｏ」はヒドロキシプロリン；星印（＊）はＭＢＰおよびフィコリン類にわたって保存されているアミノ酸残基を表す。太活字および下線を引いたアミノ酸残基は、ＭＢＰ結合セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）とのＭＢＰ相互作用において重要であることが確認されている［Ｗａｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１４）：１４０６５−０７３（２００４）参照］。ヒトＭＢＰのＭＡＳＰ結合領域の機能的変異体の一実施形態は配列番号４５に規定される。
【図３Ａ】固定化されたＬｅｙＨＳＡに結合しているタグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮＣＴＬＤ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ結合分析を示す図である。トランスフェクション４日後における種々のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ構築体の結合活性。ＡＣｓＣは、最も強い結合活性を示す。
【図３Ｂ】固定化されたＬｅｙＨＳＡに結合しているタグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮＣＴＬＤ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ結合分析を示す図である。各々が種々の競合物質の存在下または非存在下でのＤＣ−ＳＩＧＮ／ＦｃおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＣｓＣ）の結合比較。
【図３Ｃ】固定化されたＬｅｙＨＳＡに結合しているタグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮＣＴＬＤ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ結合分析を示す図である。トランスフェクション４日後における種々のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮのさらなる結合活性アッセイ。
【図４Ａ】懸濁相ＥＬＩＳＡを用いたＳＫＢＲ−３細胞に結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質の結合を示す図である。構築体ＡｂｓおよびＡＢｓＣは、陽性対照ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｆｃよりも高い結合活性を示す。
【図４Ｂ】懸濁相ＥＬＩＳＡを用いたＳＫＢＲ−３細胞に結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質の結合を示す図である。種々の競合物質およびカルシウムの存在下、Ｌｅｙに対するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＡＢｓ構築体の結合特異性。
【図４Ｃ】懸濁相ＥＬＩＳＡを用いたＳＫＢＲ−３細胞に結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質の結合を示す図である。陽性対照および陰性対照に比較して、ＭＣＦ−７に対するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ構築体であるＡｂｓおよびＡＢｓＣのＥＬＩＳＡ。
【図５】２５ｍＬのマンナン−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ）上のＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣの溶出プロファイルを示す図である。
【図６】単離されたＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢＳ誘導体（Ａ）およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡｂｓＣ誘導体（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図７】マンナン−セファロースアフィニティー精製により単離されたＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓのオリゴマー化プロファイルのウェスタンブロット分析（非還元）を示す図である。ブロットは、大多数の精製ＡＢｓ構築体が高次のオリゴマーとして存在していることを示す。
【図８】固定化ルイスＹ−ＨＳＡに結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ（■）およびＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ（◆）に関するＥＬＩＳＡ結合結果を示す図である。ＭＢＰの多量体化ドメインは、ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ分子に比して、親和性の増大達成を提供する。
【図９】Ｃ４のＭＡＳＰ依存性開裂を有するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ−によるＣ４補体活性化の誘導を示す図である。
【図１０】ＳＫＢＲ−３細胞上のＣ４のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ（−◆−）−ＭＡＳＰ依存性変換を示す図である。
【図１１】ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体ＡＢｓＣおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体ＡＢｓＣ０、またはハーセプチンによるＳＫＢＲ−３（Ａ）およびＭＣＦ−７（Ｂ）の細胞増殖阻害の分析を示す図である。グラフ記号：菱形（−◆−）ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ；四角形（−■−）ＭＢＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓＣ０＋５μｇ／ｍＬのハーセプチン；三角形（−▲−）ハーセプチン；「Ｘ」（−ｘ−）ＴＢＳＣ緩衝液；＊（−＊−）媒体のみ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、補体固定を誘導することのできるマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含む第一のポリペプチドと、特定の細胞型および病原体に結合している部分を標的にする配列を含む第二のポリペプチドとを含む一連の融合タンパク質を構築することによるＭＢＰの補体固定活性を利用する。一態様において、本発明は、マンノース結合レクチンポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチドと；標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＭＢＬのエフェクター官能基および対象となっている細胞または他の病原体に融合タンパク質を方向づける標的化配列を含む融合タンパク質を、必要としている被検体に提供することによる疾患の治療に関する。ＭＢＬのエフェクター官能基は細胞または病原体に結合すると、宿主の補体系を活性化し、それによって細胞または病原体のオプソニン化、最終的には食作用を開始させる。本発明の融合タンパク質は、ＭＢＬ融合タンパク質が、エフェクター機能を保持しながら、本来なら細胞表面上のマンノースまたは他のオリゴ糖に結合すると考えられるＭＢＬ配列を有することのないように、ＭＢＬ炭水化物認識ドメインまたは活性ＭＢＰ Ｃ型レクチン様ドメインを欠いている。
【００１９】
定義
本発明をより詳細に明らかにする前に、多数の用語を定義する。用語に関して、本明細書に特に定義が示されない限り、本開示を通して用いられる用語および語句は、当業界で一般に理解されている意味を有すると解釈するべきである。また、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる際、文脈によって明らかに別様に表されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含む。
【００２０】
本明細書に用いられる用語「エフェクター機能」とは、抗体に結合していない哺乳動物における免疫応答またはＴ細胞応答を誘導する能力を意味する。例えば、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）のエフェクター機能は、細胞外病原体を攻撃するために共に働く一組の血漿タンパク質である補体系を活性化する。補体系の最も重要な役割は、オプソニン化（食細胞によって認識される受容体によって外来生物を被覆すること）であるが、補体系はまた、炎症細胞を動員し、膜攻撃複合体によって直接病原体を殺す。哺乳動物において、補体の活性化または「固定」とは一般に、ＭＢＰが集合的に「補体」と称される血清タンパク質、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９に結合し、そのことによって、タンパク質に対するマクロファージの結合を刺激し、これらのマクロファージによる引き続く消化を促進することを意味する。
【００２１】
「テトラネクチン三量体形成ドメイン」とは、参照としてその全体が援用されている米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号（‘９０１出願）明細書に記載されているテトラネクチン由来の三量体形成ドメインのことである。成熟ヒトテトラネクチン一本鎖ポリペプチド配列は、本明細書において、配列番号４６として示されている。テトラネクチン三量体形成ドメインの例としては、ヒトテトラネクチン遺伝子のエキソン２によってコードされたアミノ酸を表す、配列番号４６のアミノ酸１７から４９、１７から５０、１７から５１および１７から５２、ならびに任意に、この遺伝子のエキソン３によってコードされた初めの１つ、２つまたは３つのアミノ酸が挙げられる。他の例としては、アミノ酸１から４９、１から５０、１から５１およびエキソン１およびエキソン２の全てを表す１から５２、ならびに任意に、この遺伝子のエキソン３によってコードされた初めの１つ、２つまたは３つのアミノ酸が挙げられる。あるいは、エキソン１によってコードされたアミノ酸配列の一部のみが三量体形成ドメインに含まれる。特に、三量体化ドメインのＮ末端は、配列番号４６の残基、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７のいずれかにおいて始まり得る。特定の実施形態において、Ｎ末端はＩ１０またはＶ１７であり、Ｃ末端は、Ｑ４７、Ｔ４８、Ｖ４９、Ｃ（Ｓ）５０、Ｌ５１またはＫ５２である（配列番号４６によるナンバリング）。
【００２２】
本発明の一態様において、三量体形成ドメインは、より詳細に米国特許出願公開第２００７／００１５４９０１号明細書に記載されているテトラネクチンファミリー三量体形成構造要素の共通塩基配列である配列番号４７のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体形成構造要素（「ＴＴＳＥ」）である。ＴＴＳＥは、タンパク質のテトラネクチンファミリーの天然メンバーの変異体、特にアルファらせん多重コイル三量体を形成するＴＴＳＥの能力に大きな悪影響を与えることなくアミノ酸配列に修飾を受けた変異体を包含する。本発明の種々の態様において、本発明による三量体ポリペプチドは、配列番号４７のコンセンサス配列に少なくとも６６％のアミノ酸配列同一性；例えば配列番号４７のコンセンサス配列に少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８６％または少なくとも９２％の配列同一性（規定された（Ｘではない）残基のみをカウントして）を有する三量体形成ドメインとして、ＴＴＳＥを含む。言い換えると、配列番号４７の規定されたアミノ酸のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つを置換できる。
【００２３】
特定の一実施形態において、配列番号４６の５０位におけるシステイン（Ｃ５０）を、望ましくない多量体化に至り得る望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を避けるために、セリン、スレオニン、メチオニンまたは任意の他のアミノ酸残基に有利に変異させることができる。他の公知の変異体は、アミノ酸残基６、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３５、３９、４１、および４２（配列番号４６によるナンバリング）から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、これらは任意の非らせん破壊アミノ酸残基によって置換できる。これらの残基は、天然のテトラネクチンモノマーの３つのＴＴＳＥ間のトリマー複合体を安定化する分子間相互作用に直接関与しないことが示されている。一態様において、ＴＴＳＥは式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（ＮからＣ）を有する反復ヘプタッドを有し、式中、残基ａおよびｄ（すなわち２６位、３３位、３７位、４０位、４４位、４７位、および５１位）は任意の疎水性アミノ酸であり得る（配列番号４６によるナンバリング）。
【００２４】
さらなる実施形態において、ＴＴＳＥ三量体形成ドメインは、ポリヒスチジン配列および／またはプロテアーゼ開裂部位、例えば、血液凝集因子ＸａまたはグランザイムＢ（本明細書に参照として援用されている米国特許出願公開第２００５／０１９９２５１号明細書を参照）を組み込むこと、およびＣ末端ＫＧまたはＫＧＳ配列を含めることによって修飾できる。また、精製を助けるために、２位のプロリンをグリシンによって置換することができる。
【００２５】
用語「Ｃ型レクチン様タンパク質」および「Ｃ型レクチン」は、したがって、任意の真核生物種のゲノムに存在するか、またはゲノムにコード化されている任意のタンパク質を指すために用いられ、このタンパク質は、１つまたは複数のＣＴＬＤまたはＣＴＬＤの亜群に属する１つまたは複数のドメイン、炭水化物リガンドに結合する炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含有する。この定義は具体的に、膜結合Ｃ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチン、「可溶性」Ｃ型レクチン様タンパク質および機能的膜貫通ドメインを欠くＣ型レクチンおよび変異Ｃ型レクチン様タンパク質および１つまたは複数のアミノ酸残基がインビボでグリコシル化によって変化したＣ型レクチンまたは他の任意の合成後修飾、ならびにＣ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチンの化学的修飾によって得られる任意の生成物を含む。
【００２６】
ＣＴＬＤは、およそ１２０のアミノ酸残基からなり、特徴として２つまたは３つの鎖内ジスルフィド架橋を含有する。ＣＴＬＤと種々のタンパク質との間のアミノ酸配列レベルにおける類似性は相対的に低いが、多数のＣＴＬＤの３Ｄ構造は、５つまでのループによってしばしば規定されるいわゆるループ領域に本質的に限定された構造可変性を有して保存性が高いことが分かっている。いくつかのＣＴＬＤは、カルシウムに対する１つまたは２つの結合部位を含有し、カルシウムと相互作用する側鎖の多くはループ領域に位置している。
【００２７】
３Ｄ構造情報が入手できるＣＴＬＤに基づき、カノニカルＣＴＬＤの構造的特徴は、β１、α１、α２、β２、β３、β４、およびβ５の順で連続的に現れる７つの主要な二次構造要素（すなわち、５つのβ鎖と２つのαらせん体）であると推定されている。図２は、１０のＣ型レクチンの公知の３次元構造のＣＴＬＤのアラインメントを示している。３Ｄ構造が決定した全てのＣＴＬＤにおいて、β鎖は、１つはβ１とβ５からなり他方はβ２、β３およびβ４からなる２つの逆平行のβシートで配置している。さらなるβ鎖であるβ０は、配列の中でしばしばβ１に先行しており、存在する場合は、β１シート、β５シートと合体して追加の鎖を形成する。さらに、１つはα１とβ５をつないでおり（ＣＩ−ＣＩＶ）、１つはβ３と、β４とβ５をつないでいるポリペプチドセグメントとをつないでいる（ＣＩＩ−ＣＩＩＩ）２つのジスルフィド架橋が、現在までに特性化された全てのＣＴＬＤに常に見られる。
【００２８】
ＣＴＬＤの３Ｄ構造において、これらの保存された二次構造要素は、この文脈では集合的に、コアから突き出している「ループ領域」と称される多数のループにとってのコンパクトなスカフォードを形成する。ＣＴＬＤの一次構造において、これらのループは、２つのセグメント、すなわちループセグメントＡ、ＬＳＡとループセグメントＢ、ＬＳＢに構成される。ＬＳＡは、定型的な二次構造をしばしば欠き、４つまでのループを含有する、β２とβ３とをつないでいる長いポリペプチドセグメントを表す。ＬＳＢは、β鎖のβ３とβ４とをつないでいるポリペプチドセグメントを表す。ＬＳＡの残基は、β４の単一残基と共に、テトラネクチンのＣＴＬＤなどのいくつかのＣＴＬＤのＣａ２＋とリガンドとの結合部位を規定することが示された。例えば、１つまたは少数の残基の置換を含む変異の研究で、結合特異性、Ｃａ２＋感受性および／または親和性における変化は、ＣＴＬＤドメインによって調整できることが示された。以下の非限定的な例を含む多数のＣＴＬＤが知られている：テトラネクチン、リトスタチン、マウスマクロファージガラクトースレクチン、クッパー細胞受容体、ニワトリノイロカン、ペルルシン、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカンコアタンパク質、ＩｇＥ Ｆｃ受容体、膵炎関連タンパク質、マウスマクロファージ受容体、ナチュラルキラー群、幹細胞成長因子、因子ＩＸ／Ｘ結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、ウシコングルチニン、ウシＣＬ４３、コレクチンリバー１、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｄ、ｅ−セレクチン、被嚢類ｃ型レクチン、ＣＤ９４ＮＫ受容体ドメイン、ＬＹ４９ＡＮＫ受容体ドメイン、ニワトリ肝レクチン、マスｃ型レクチン、ＨＩＶｇｐ１２０−結合ｃ型レクチン、および樹状細胞免疫受容体参照として本明細書にその全体が援用されている米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号明細書を参照されたい。
【００２９】
語句「有効量」とは、同時投与でも連続的投与でも、問題の疾患または病態を予防、寛解または治療するために有効な本発明の融合タンパク質および治療薬の一方または双方の量のことである。特定の実施形態において、有効量は、細胞がアポトーシスを受ける、腫瘍容積を減少させる、または癌または他の疾患を有する哺乳動物の生存を延長させる傾向を増強させるか、または増加させる上で十分な融合タンパク質および併用する治療薬の量である。
【００３０】
用語「癌」、「癌性」および「悪性」とは、典型的に非制御細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態のことを言うか、または述べる。癌の例としては、限定はしないが、腺癌、リンパ腫、芽腫、黒色腫、肉芽腫、および白血病などの癌が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵癌、グリア芽腫、膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝性癌および肝腫などの肝癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍などの腎癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、および種々のタイプの頭頚部癌が挙げられる。
【００３１】
本文脈において、用語「抗体」とは、天然のものであっても、また部分的に、もしくは全体的に合成で作製されたものであっても免疫グロブリンのことを言う。抗体は多くの方法で修飾できるため、用語「抗体」は、結合ドメイン特異性を有する任意の特異的結合メンバーまたは特異的結合物質を含むものと解釈すべきである。したがって、この用語は、天然であろうと、全体的にもしくは部分的に合成されたものであろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めて、抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価物および相同体を含む。したがって、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、または別のポリペプチドに融合した等価物が含まれる。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、または抗体結合ドメインに相同性の結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質、例えば抗体模倣物を含む。これらは、天然源由来であってもよいし、部分的または全体的に作製されたものであってもよい。抗体の例としては、免疫グロブリンイソ型およびそれらのイソ型サブクラスのもの；Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；およびダイアボディー（diabodies）がある。
【００３２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミンなどのエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン類（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類縁体トポテカンなど）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（その合成類縁体アドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシンなど）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルミシン（合成類縁体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１など）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミンオキシド、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソ尿素類；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩおよびカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照））；ダイネマイシンＡなどのダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスネート類；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンなど）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類縁体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナール；フロリン酸などの葉酸補充液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウム硝酸塩；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’、２２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、TAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton、N.J.）、ABRAXANE（商標）Cremophor-free、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、および TAXOTERE（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer、Antony、仏国）；クロランブシル；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類縁体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；および薬学的に許容できる塩類、酸または上記の任意の誘導体が挙げられる。またこの定義には、ボルテズミブ（Velcade）などのプロテアソーム阻害剤、ＢＣＬ−２阻害剤、ＩＡＰアンタゴニスト（Smac合成物）、ＨＤＡＣ阻害剤（HDACI）およびキナーゼ阻害剤（Sorafenib）が含まれる。
【００３３】
またこの定義には、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標）タモキシフェンなど）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびFARESTON-トレミフェンなどの抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節剤；例えば、４（５）―イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE（登録商標）メゲストロールアセテート、AROMASIN（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、RIVISOR（登録商標）ボロゾール、FEMARA（登録商標）レトロゾール、およびARIMIDEX（登録商標）アナストロゾールなどの副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素、アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；およびフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、おびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ―アルファ、ＲａｌｆおよびＨ―Ｒａｓなどの異常な細胞増殖に関係しているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ANGIOZYME（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えば、ALLOVECTIN（登録商標）ワクチン、LEUVECTIN（登録商標）ワクチン、およびVAXID（登録商標）ワクチン；PROLEUKIN（登録商標）ｒＩＬ−２；LURTOTECAN（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ABARELIX（登録商標）ｒｍＲＨ；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤が含まれる。
【００３４】
本発明の特定の態様
ここで本発明をより詳細にのべると、完全長ヒトマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）が、配列番号３８に開示されている（図１）。ＭＢＰの種々の機能的領域もまた図１に記載されている。本明細書に用いられる「マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチド」は、配列番号３８のアミノ酸２１〜１３３（配列番号４８としても表される）、ならびに表面に記載された機能的変異体およびそれらの断片を意味することとする。融合タンパク質のＭＢＬポリペプチドは、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合したセリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）に結合することができ、補体固定を介した免疫応答などのエフェクター機能を開始することができる。
【００３５】
一定の実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは配列番号４８を含む。他の実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸４２〜１３３を含む。いくつかの実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸４８〜９９を含む。さらに他の実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸６５〜８０（配列番号４９としても表される）を含む。さらなる実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、以下の一般的配列：
ＧＸＹＧＸＹＧＸＯＧＫＹＧＰＹＧ（配列番号４５）
（式中、ＸおよびＹは任意のアミノ酸であり得、Ｏはヒドロキシプロリン（ＨｙＰ）である）
を有する配列番号３の変異体を含む。一定の実施形態において、Ｘは、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、およびＧｌｕから選択される。一定の実施形態において、Ｙは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｙｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、グリコシル化Ｌｙｓ（ｇ−Ｌｙｓ）、およびヒドロキシル化Ｌｙｓ（ｈ−Ｌｙｓ）から選択される。
【００３６】
さらなる実施形態において、ＭＢＬポリペプチド変異体は、配列番号４５における上記のもの以外に、配列番号４８の領域にアミノ酸置換を含むことができる。本発明のＭＢＬポリペプチド変異体は、ＭＡＳＰに対する結合部位に必要な構造を保持し；したがって、本発明の変異体は、ＭＢＬポリペプチドのコラーゲン様ドメインの構造を破壊しない。例えば、参照として本明細書に援用されているWallisら、J.Biol.Chem.、279(14)：14065-14073頁（2004年）を参照されたい。したがってＭＢＬ変異体は、多くの種にわたる種々のコラーゲン様領域、多量体化領域、および多重コイル領域のコンセンサス配列から誘導することができる。さらに、保存的アミノ酸置換は、種々のＭＢＬポリペプチドの二次構造および三次構造に基づいて行うことができ、ヒドロパシー、電荷、および水素結合の相互作用は全て考慮に入れることができ、ＭＡＳＰ結合活性を保持する適切な置換を行うことができる。ＭＢＬポリペプチドのＭＡＳＰ結合領域の外側の領域における欠失変異体、挿入変異体、または置換変異体などの変異体を含む実施形態において、５０％と低い同一性パーセントであり得る。ＭＡＳＰ結合領域内にこのような変異を含む他の実施形態において、変異体は、配列番号３８または配列番号４８に対して、少なくとも８０％同一性であり得る。一定の実施形態において、このような変異体は、配列番号３８または配列番号４８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性である。本発明の融合タンパク質の種々の例において、標的配列を、ＭＢＬのＫ１２３、Ｋ１２４、Ｗ１２５、およびＴ１２７（配列番号３８に対するナンバリング）において、ＭＢＬにＣ末端融合させる。
【００３７】
本発明の上記の態様の一定の実施形態において、第二のポリペプチドの配列は、特定の細胞型および／または病原体に結合した炭水化物、脂質、および／またはアミノ酸配列などの部分を標的にするように選択することができる。例えば、標的化配列は、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／または腫瘍細胞、またはそれらの組合せなどの細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質（例えば、細胞表面受容体または膜貫通輸送タンパク質）を標的にするように選択することができる。同様に、標的化配列は、例えば、ウイルス、真菌、細菌、原生動物、または他の寄生生物、またはそれらの組合せなどの病原体に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質（例えば、細胞表面受容体または膜貫通輸送タンパク質）を標的にするように選択することができる。
【００３８】
一実施形態において、標的化配列は、腫瘍細胞と結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択することができる。特定の一実施形態において、標的化配列は、非限定的な例であるＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、Ｄ９７、ｇｐ１００、ルイスＹ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦ受容体、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＭＳＡ、ＣＤＣＰ１、ＣＤ２６、Ｈｅｐｓｉｎ、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、Ｍｅｔ、ＣＡＩＸ（Ｇ２５０）、ＥｐｈｈＢ４（エフリンタイプ−Ｂ受容体４）、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＤＰＰ６、ｓｙｎｄｅｃａｎ１、ＩＧＦＢＰ２（ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質２）、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬ４、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ受容体、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ、ＢＡＧＥ、ＴＲＰ−１、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＭＵＣ１、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＳＳＣ（扁平上皮細胞癌抗原）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、コロン抗原−１（ＣＯＡ−１）、前立腺１の６つの膜内外上皮抗原（ＳＴＥＡＰ１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ポドプラニン、黒色腫過剰発現抗原（ｍｅｌｏｅ），ＣＤ２００およびｈＣＧなどの腫瘍細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００３９】
一実施形態において、標的化配列は、樹状細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。本明細書に用いられる「樹状細胞」には、例えば、骨髄またはプラズマ細胞の樹状細胞などの任意の公知の樹状細胞サブタイプが含まれる。特定の一実施形態において、標的化細胞は、非限定的な例であるＣＤ８３、ＣＤ２０５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７およびＣＤ２０９／ＤＣ−ＳＩＧＮなどの樹状細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００４０】
一実施形態において、標的化配列は、Ｂ細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。一実施形態において、標的化細胞は、非限定的な例であるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３２、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８３、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１７９α、ＣＤ１７９β、およびＣＤ１８０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、およびＢＲ−３などの樹状細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００４１】
一実施形態において、標的化配列は、Ｔ細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。本明細書に用いられる「Ｔ細胞」には、例えば、活性化Ｔ細胞；調節Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）；細胞障害性Ｔ細胞（ＴＣ、ＣＴＬ）；ヘルパーＴ細胞（エフェクターＴ細胞またはＴＨ；例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨＦ）；メモリーＴ細胞；（ＴＣＭ、ＴＥＭ）：ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）；ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）などの任意のタイプのＴ細胞サブタイプが含まれる。特定の一実施形態において、標的化配列は、非限定的な例であるＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１２９、ＣＤ２００、ＣＤＷ２１７、α−ＴＣＲ、およびβ−ＴＣＲなどのＴ細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００４２】
一実施形態において、標的化配列は、少なくとも１つの病原体（細菌、原生動物、寄生生物、ウイルスなど）に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。特定の一実施形態において、標的化配列は、非限定的な例である呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質（例えば、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質、ＲＳＶ Ｇ 糖タンパク質など）；ヒトパラインフルエンザウイルス１〜４；ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ならびにニッパウイルス、およびインフルエンザ群Ａ、ＢまたはＣウイルスタンパク質などのオルソミクソウイルス科、例えば、インフルエンザウイルスニューラミミダーゼおよびインフルエンザウイルスヘマッグルチニン；単純ヘルペスウイルスタンパク質などのヘルペスウイルス科、例えば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、またはｇＥタンパク質、またはｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、およびｇＥの相同体を含む単純ヘルペスウイルス１または２の糖タンパク質、またはサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびヒトヘルペスウイルス６、７または８、またはサルＢウイルス（オナガザルヘルペスウイルス１）からの他のタンパク質のなどの病原体に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化されている。またタンパク質には、限定はしないが、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型（ＨＩＶ１およびＨＩＶ２）などのレトロウイルスからのタンパク質およびヒトＴリンパ球増殖性ウイルス１〜４（ＨＴＬＶ−１〜４）外膜および他のタンパク質、ならびにベータレトロウイルスおよびスプマウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質はまた、風疹からのカプシドタンパク質などのタンパク質またはアルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、および西部ウマ脳脊髄炎ウイルスおよびセムリキ森林ウイルス複合体などのトガウイルスからのものであり得る。タンパク質にはまた、限定はしないが、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、および他の多肢にわたるヒトアデノウイルス）、ポックスウイルス、例えば天然痘（痘瘡）、ワクシニア、牛痘、サル痘、伝染性軟属腫、タナ痘、ヤバ痘、ヤバサル腫瘍ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、およびウシ丘疹口内炎ウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質にはまた、限定はしないが、Ｂ１９ウイルス、アデノ関連ウイルス、およびヒトボカウイルスなどのパルボウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質にはまた、限定はしないが、多数の種々のヒトパピロマウイルスからのタンパク質などのパピロマウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質にはまた、限定はしないが、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルスおよびメルケル細胞ポリオーマウイルスなどのポリオーマウイルスからのタンパク質が含まれる。このようなタンパク質にはまた、限定はしないが、ロタウイルス、オルトレオウイルス、およびコルチウイルスなどのレオウイルス科；ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；エンテロウイルス、エコウイルス、パレコウイルス、コクサッキーＡ群およびＢ群ウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、カルジオウイルス、およびリノウイルスなどのピコルナウイルス科、Ｃ型肝炎ウイルスおよびテング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介脳炎ウイルスなどのフラビウイルス科、ヒトコロナウイルス、ヒトトロウイルス、およびＳＡＲＳコロナウイルスタンパク質などのコロナウイルス科、ならびに限定はしないが、コロナウイルス科からのＳおよびＭタンパク質、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクロスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、および多数のヒト伝染性ハンタウイルスなどのバンヤウイルス科、ボルナ病ウイルスなどのボルナウイルス科、狂犬病ウイルスなどのラブドーウイルス科、エボラウイルスおよびマルブルグウイルスなどのフィロウイルス科、ノロウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、サポウイルス（例えば、サッポロウイルス）、および他のカリチウイルスなどのカリチウイルス科、ヒトアストロウイルスなどのアストロウイルス科、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサ熱ウイルス、アルボウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、フレキサルウイルス、および白水アロヨウイルスなどのアレナウイルス科、Ｅ型肝炎ウイルスなどのヘペウイルス科、およびデルタ型肝炎ウイルスなどのデルタ型ウイルスのゲノム由来の表面タンパク質からのタンパク質が含まれる。
【００４３】
細菌の表面タンパク質としてはまた、限定はしないが、アナプラスマ(Anaplasma)属(アナプラスマ・ファゴサイトフィラム(Anaplasma phagocytophilum)など)、エーリキア(Ehrlichia) 属 (イー・チャッフィンシス(E. chaffeensis)およびイー・エルウィンギ(E. erwingii)など)、リケッチア(Rickettsia)属 (アール・プロワゼキ(R. prowazekii)、アール・チフィ(R. typhi)、およびアール・リケッチ (R. rickettsii)など)、 バルトネラ(Bartonella)属 (ビー・ヘンセラ(B. henselae)など)、およびブルセラ属(Brucella)のものなど、種々の種のアルファプロテオバクテリア、バークホールデリア(Burkholderia)属 (ビー・セパシア(B. cepacia)およびビー・プソイドマレイ(B. pseudomallei)など)、ボーデテラ(Bordetella)属 (ビー・ペルツシス(B. pertussis)など)、およびネイセリア(Neisseria)属(エヌ・ゴノローエア(N. gonorrhoeae)およびエヌ・メニンギチデス(N. meningitides)など)のものなどのベータプロテオバクテリア、フランシセラ(Francisella)属(エフ・ツラレンシス(F. tularensis)など)、レギオネラ(Legionella)属(エル・ニューモフィラ(L. pneumophila)など)、コクシェラ(Coxiella)属(シー・ブルネチ(C. burnetii)など)、アシネトバクター(Acinetobacter)属(エイ・バウマンニ(A. baumannii)など)、モラキセラ(Moraxella)属(エム・ラクナタ(M. lacunata)など)、シュードモナス(Pseudomonas)属(ピー・アエルギノーサ(P. aeruginosa)およびピー・オリジハビタンス(P. oryzihabitans)など)、プロビデンシア(Providencia)属(ピー・スツアルチ(P. stuartii)など)、ビブリオ(Vibrio)属(ヴィー・コレラエ(V. cholerae)、ヴィー・バルニフィカス(V. vulnificus)、およびヴィー・パラハエモリチカス(V. parahaemolyticus)など)、シトロバクター(Citrobacter)属、エンテロバクター(Enterobacter)属(イー・クロアカエ(E. cloacae)およびイー・アエロゲネス(E. aerogenes)など)、エシェリキア(Escherichia)属(大腸菌(E. coli) O157:H7など)、クレブシエラ(Klebsiella)属(ケイ・ニューモニア(K. pneumoniae)など)、プロテウス(Proteus)属(ピー・バルガリス(P. vulgaris)、ピー・ミラビリス(P. mirabilis)、およびピー・ペンネリ(P. penneri)など)、サルモネラ(Salmonella)属(エス・エンテリカセロバリス・チフィムリウム(S. enterica serovars Typhimurium)、エンテリチチジス(Enterititidis)、およびチフィ(Typhi)など)、セラチア(Serratia)属(エス・マルセセンス(S. marcescens)など)、シゲラ(Shigella)属(エス・フレクスネリ(S. flexneri)、エス・ジセンテリア(S. dysenteriae)、およびエス・ソンネイ(S. sonnei)など)、エルシニア(Yersinia)属(ワイ・ペスチス(Y. pestis)など)、ヘモフィリス(Haemophilus)属(エイチ・インフルエンザ(H. influenzae)およびエイチ・デュクレイ(H. ducreyi)など)、およびパステウレラ(Pasteurella)属(ピー・マルトシダ(P. multocida)など)のものなどのガンマプロテオバクテリア、カンピロバクター(Campylobacter) 属 (シー・ジェジュニ(C. jejuni)、シー・コリ(C. coli)、およびシー・フェタス(C. fetus)など) およびヘリコバクター(Helicobacter)属 (エイチ・ピロリ(H. pylori) など)のものなどのイプシロンプロテオバクテリア、クロストリジウム(Clostridium)属(シー・ジフィシル(C. difficile)、シー・ペルフリンゲンス(C. perfringens)、シー・ボツリナム(C. botulinum)、シー・ソルデリ(C. sordellii)、およびシー・テタニ(C. tetani)など)、マイコプラズマ(Mycoplasma)属(エム・ニューモニア(M. pneumoniae)など)、バシラス(Bacillus)属(ビー・アントラシス(B. anthracis)およびビー・セレウス(B. cereus)など)、リステリア(Listeria)属(エル・モノサイトゲネス(L. monocytogenes)など)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属(エス・オウレウス(S. aureus)、エス・サプロフィチカス(S. saprophyticus)、およびエス・エピデルミス(S. epidermis)など)、エンテロコッカス(Enterococcus)属(イー・フェイカリス(E. faecalis)およびイー・フェイシウム(E. faecium)など)、およびストレプトコッカス(Streptococcus)属(エス・ピオゲネス(S. pyogenes)、エス・ニューモニア(S. pneumoniae)、エス・アガラクチアエ(S. agalactiae)、エス・ミュータンス(S. mutans)、エス・ビリダンス(S. viridans)、およびエス・ジスガラクチアエ(S. dysgalactiae)など) のものなどのフィルミクテス、アクチノミセス(Actinomyces)属(エイ・イスラエリ(A. israelii)など)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属(シー・ジフテリア(C. diphtheriae)、シー・アミコラタム(C. amycolatum)、およびシー・パルバム(C. parvum)など)、ガルドネレラ(Gardnerella)属(ジー・バギナリス(G. vaginalis)など)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属(エム・ツベルクローシス(M. tuberculosis)、エム・レプラエ(M. leprae)、エム・アブセサス(M. abscessus)、およびエム・アビウム(M. avium)複合体など)、およびノカルジア(Nocardia)属(エヌ・アステロイデス(N. asteroides)など) のものなどのアクチノバクテリア、 クラミジア(Chlamydia)属(シー・トラコマチス(C. trachomatis)など) およびクラミドフィラ(Chlamydophila)属(シー・プシッタシ(C. psittaci)およびシー・ニューモニア(C. pneumoniae)など) のものなどのクラミジア、ボレリア(Borrelia)属(ビー・ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)など)、レプトスピラ(Leptospira)属 (エル・インテロガンス(L. interrogans)など)、およびトレポネマ(Treponema)属(ティー・パリダム(T. pallidum)など) のものなどのスピロカエテス、バクテリロイデス(Bacteroides)属およびプレボテラ(Prevotella)属のものなどのバクテロイデス、およびフソバクテリウム(Fusobacterium)属のものなどのフソバクテリア、 に見られるものが挙げられる。
【００４４】
寄生虫の表面タンパク質としては、限定はしないが、アスペルギルスフミガーツス (Aspergillus fumigatus)、エイ・フラブス(A. flavus)、エイ・テレウス(A. terreus)、エイ・ニヅランス(A. nidulans)、エイ・ニガー(A. niger)、ブラストミセス・デルマチジス(Blastomyces dermatidis)、カンジダ(Candida spp.)、コッキジオイデス(Coccidioides spp.)、 クリプトコッカスネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、シー・ガッチ(C. gatti)、ブラキオラアルゲラエ(Brachiola algerae)、ビー・コンノリ(B. connori)、ビー・ベシクラルム(B. vesicularum)、エンセファリトズーン・クニクリ(Encephalitozoon cuniculi)、イー・ヘレム(E. hellem)、イー・インテスチナリス(E. intestinalis)、エンテロシトズーン・ビエネウシ(Enterocytozoon bieneusi)、ミクロスポリジウム・セイロネンシス(Microsporidium ceylonensis)、エム・アフリカナム(M. africanum)、ノセマ・オクラルム(Nosema ocularum)、プレイストフォーラ(Pleistophora spp.)、トラキプレイストフォーラ・ホミニス(Trachipleistophora hominis)、ティー・アントロポフテラ(T. anthropophthera)、ビッタフォルマ・コルネア(Vittaforma corneae)、およびミューモシスチス・ジロベシ(Pneumocystis jirovecii) (ピー・カリニ(P. carinii)として公式に分類された) などの真菌種の種々のライフステージ（スポア、菌糸、発芽、酵母）、およびバベシア・ミクロチ (Babesia microti)、ビー・ジベルゲンス(B. divergens)、クリプトスポリヂウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)、シー・ホミニス(C. hominis)、シー・フェリス(C. felis)、シー・カニス(C. canis)、シー・ムリス(C. muris)、シー・メレアグリジス(C. meleagridis)、シクロスポーラ・ケイエタネンシス(Cyclospora cayetanensis)、イソスポーラ・ベリ(Isospora belli)、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)、ピー・マラリア(P. malariae)、ピー・オバレ(P. ovale)、ピー・ビバックス(P. vivax)、およびトキソプラズマ・ゴンジ(Toxoplasma gondii)、ならびにバランチジウム・コリ (Balantidium coli)などのシリオフォラン原生動物種などのアピコンプレキサン原生動物種の種々のライフステージ、
およびレイシュマニア・チャガシ (Leishmania chagasi)、エル・ドノバニ(L. donovani)、エル・インファンツム(L. infantum)、エル・メキシカーナ(L. mexicana)、エル・アマゾネンシス(L. amazonensis)、エル・ヴェネズエレンシス(L. venezuelensis)、エル・トロピカ(L. tropica)、エル・メジャー(L. major)、エル・アエチピカ(L. aethiopica)、エル・スブゲヌス・ビアンニア・ブラジリエンシス(L. (subgenus Viannia) braziliensis)、エル・(ヴィ)グヤネンシス(L. (V.) guyanensis)、エル・(ヴィ) パナメンシス(L. (V.) panamensis)およびエル・(ヴィ) ペルビアーナ(L. (V.) peruviana)、トリパノソーマ・クルジ(Trypanosoma cruzi)、ティー・ブルセリローデシエンス(T. brucei rhodesiense)およびティー・ブルセイガンビエンス(T. brucei gambiense)などのオイグレノゾーンス、ならびにアカントメーバ(Acanthamoeba spp.)、バラムチア・マンドリラリス(Balamuthia mandrillaris)、およびエンタモエバ・ヒストリチカ(Entamoeba histolytica) などのアモエボゾーンス種、およびランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)などのディプロモナド(diplomonads)の種、二核アメーバ(Dientamoeba fragilis)および膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)などのトリコモナドの種、ネグレリア・フォウレリ(Naegleria fowleri)などの原生生物、ブラストシスティス・ホモニス(Blastocystis hominis)などのストラメノピレス(stramenopiles)の種、広東住血線虫(Angiostrongylus cantonensis)、エイ・コスタリセンシス(A. costaricensis )、アニサキス・シンプレックス(Anisakis simplex)、プソイドテラノバ・デシピエンス(Pseudoterranova decipiens)、アスカリス・ルンブリコイデス( Ascaris lumbricoides )、アスカリス・エスピーピー(Ascaris spp.)、バイリスアスカリス・プロコニス(Baylisascaris proconyis)、フィリピン毛頭虫(Capillaria phillipinensis)、肝毛頭虫(C. hepatica )、シー・エーロフィラ(C. aerophila)、メジナ虫(Dracunculus medicinensis)、マレー糸状虫(Brugia malayi)、ビー・チモリ(B. timori)、イヌ糸状虫・エスピーピー(Dirofilaria spp)、ロア糸状虫(Loa loa)、マンソネラ・オザルディ(Mansonella ozzardi)、エム・ペルスタンス(M. perstans)、エム・ストレプトセルカ(M. streptocerca)、ブケリア・バンクロフティ(Wucheria bancrofti)、エンテロビウス・ウェルミキュラリス(Enterobius vermicularis)、イー・グレゴリー(E. gregorii)、有棘顎口虫(Gnathostoma spinigerum)、ジー・ヒピデュム(G. hipidum)、アンシクロストーマ・デュオデナレ(Ancylostoma duodenale)、セイロン鉤虫(A. ceylanicum)、ブラジル鉤虫(A braziliense)、イヌ鉤虫(A. caninum)、ウンシナリア・ステノセファラ(Uncinaria stenocephala)、アメリカ鉤虫(Necator americanus)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、糞線虫(Strongyloides stercoralis)、エス・フエレボルニ(S. fuelleborni)、トキソカラ・カニス(Toxocara canis)、ティー・カティ(T. cati)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、ティー・プソイドスピラリス(T. pseudospiralis)、ティー・ナティバ(T. nativa)、ティー・ネルソニ(T. nelsoni)、ティー・ブリトヴィ(T. britovi)、およびトリクリス・トリキウラ(Trichuris trichiura)などの線虫種の種々のライフステージ、肝ジストマ(Clonorchis sinensis)、広節裂頭条虫(Diphyllobothrium latum)、ディー・パシフィクム(D. pacificum)、ディー・クロダトュム(D. crodatum)、ディー・ウルシ(D. ursi)、ディー・デンドリティクム(D. dendriticum)、ディー・ランセオラトゥム(D. lanceolatum)、ディー・ダリエ(D. dalliae)、ヨナゴエンシス(D. yonagoensis)、ウリザネ条虫(Dipylidium caninum)、多包条虫(Echinococcus multilocularis)、肝蛭(Fasciola hepatica)、エフ・ギガントゥス(F. gigantus)、ファシオロプシス・ブスキ(Faciolopsis buski)、異形吸虫(Heterophyes heterophyes)、ヒメノレプシス・ナナ(Hymenolepis nana)、横川吸虫(Metagonimus yokogawai)、ネコ肝吸虫(Opisthorchis viverrini)、ネコ肝吸虫(O. felineus)、ヴェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani)、エスピーピー・肺吸虫(Paragonimus spp)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、 エジプト住血吸虫(S. haematobium)、日本住血吸虫(S. japonicum)、エス・メコンギ(S. mekongi)、ビルハルツ住血吸虫(S. intercalatum)、ならびに有鉤条虫(Taenia solium)およびエスピーピー・テニア(Taenia spp)などの扁形動物の種の種々のライフステージに見られるものが挙げられる。
【００４５】
標的化配列は、標的部分の上記の非限定的例のいずれかに対して結合親和性を有する任意の配列を含むことができる。標的化配列のいくつかの非限定的例としては、レクチンドメイン（例えば、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ））、抗体配列およびそれらの抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’など）、または特定の炭水化物、脂質、および／またはタンパク質に対して結合親和性を示す他の代替スカフォード構造が挙げられる。
【００４６】
一定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）の結合特性およびＭＢＬの補体固定特性を利用する。カルシウム依存性レクチン（Ｃ型レクチン）は、マクロファージ、Ｂリンパ球ならびにＴリンパ球、肥満細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの多数の細胞型に発現する。マクロファージレクチンタンパク質は、外来細胞および病原体の認識および破壊に種々の機能を果たす。グラム陽性菌およびグラム陰性菌は、Ｃ型レクチンと相互作用することが示されている［Athamnaら、Infect Immun.59：1673（1991）；Shimaokaら、J.Immunol.166(8):5108頁（2001年）］。ヒトマクロファージＣ型レクチンは、よく知られたヒト癌関連エピトープであるＴｎ Ａｇを認識することが分かっている［Suzkiら、J.Immunol 156：128頁（1996年）］。さらに、マウスマクロファージＣ型レクチンの組換え細胞基質炭水化物結合ドメインもまた、細胞障害活性の阻害剤として働き、レクチンはマクロファージ殺腫瘍性応答の直接的な伝達物質であることを示している［Imaiら、J Immunol Methods 171：23頁（1994年）］。ユニークなマクロファージレクチンは、一定の異常細胞または疾患細胞によって発現された表面抗原と特異的に相互作用し得る。レクチンはマクロファージを異常細胞または疾患細胞に対して方向付けることができる。Ｃ型レクチンはそれらの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）におけるアミノ酸配列類似性を示し、カルシウム依存性様式で選択された炭水化物に結合する糖タンパク質である。Ｃ型レクチンは４つの一般的なカテゴリーに分類できる［Vastaら、Ann N Y Acad Sci.、712：55-73頁（1994年）；Spiess、Biochemistry、29：10009-10018頁（1990年）］。第１のカテゴリーは、アシアロ糖タンパク質受容体、マクロファージガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）特異的レクチン、およびＣＤ２３（Ｆｃ−εＲＩＩ）などのＩＩ型膜組込みタンパク質を含む。この群の多くのメンバーがガラクトース／フコース残基、ガラクトサミン／ＧａｌＮａｃ残基またはＧｌｃＮａｃ残基に対して特異性を示す。第２のカテゴリーは、軟骨および線維芽プロテオグリカンコアタンパク質を含む。第３のカテゴリーは、ＭＢＰなどのコレクチン類、肺表面活性タンパク質ＳＰ−Ａ、およびコングルチニンを含む。第４の群は、ＬＥＣ−ＣＡＭｓ（例えば、Ｍｅｌ−１４、ＧＭＰ−１４０、およびＥＬＡＭ−１）として知られている一定の接着分子を含む。
【００４７】
Ｃ型レクチンは、アグルチニン、オプソニン、補体アクチベーター、および細胞結合認識分子として機能することが知られている［Vastaら、Ann N Y Acad Sci.、712：55-73頁、1994年；Spiess、Biochemistry、29：10009-10018頁、1990年；Kery、Int J Biochem.、23（7-8）：631-40頁、1991年］。例えば、マクロファージマンノース受容体は、スカベンジャー機能を果たす（Shepherdら、Am J Respir Cell Mol Biol.、2（4）：335-40頁、1990年）と共に、ニューモシスティスカリニ（Pneumocystis carinii）［Ezekowitzら、Nature、351（6322）：155-8頁、1991年］およびカンジダアルビカンス（Candida albicans）（Ezekowitzら、J Exp Med.、172（6）：1785-94頁、（1990年）などの病原体生物の取込みを媒介する。したがって、Ｃ型レクチンは、生物学的に重要な多様な機能を示し、特定の細胞型および病原体などの特定の標的部分に対して望ましい結合特性を有する。
【００４８】
任意のタイプの機能的ＣＴＬＤを本発明の融合タンパク質における第２のポリペプチドとして使用することができる。一実施形態において、標的化配列は、例えばルイス抗原などの腫瘍細胞の表面上の部分を標的にする配列を含む。さらなる実施形態において、標的化配列は、ルイス抗原に結合するＤＣ−Ｓｉｇｎ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン）、またはその機能的断片または変異体を含む。
【００４９】
一態様において、本発明は、ＭＢＬの融合タンパク質、標的化配列およびテトラネクチン三量体化ドメインに関する。本発明により、標的化配列は、テトラネクチン三量体化ドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基に結合することができる。種々の実施形態において、標的化配列がＮ末端またはＣ末端に結合し、エフェクター機能を有するＭＢＬポリペプチドが他方の末端に結合する。
【００５０】
ペプチド結合を介して末端に結合する他に、非相同的標的化配列は、他の技法によりＭＢＬ複合体に結合する。例えば、側鎖に対するペプチド結合を介して、またはシステイン残基に対する結合を介してである。しかしながら、ポリペプチド鎖に対する非相同的材料を共有結合させる任意の方法が有用である。当業者は、例えば、これに関して、参照として本明細書に援用してある国際公開第９５／３１５４０号パンフレットの教示を参考にすることにより、このような可能性を知るであろう。
【００５１】
別の態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質を、哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の補体系を活性化する方法を提供する。
【００５２】
一態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
一態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに病原体の細胞表面受容体である標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質またはその医薬組成物を、病原性疾患に罹っている患者に投与することを含む、病原性疾患を治療する方法を提供する。
【００５４】
一態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに腫瘍細胞の表面上の受容体である標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質またはその医薬組成物を、腫瘍細胞を含む増殖性疾患の治療を必要とする患者に投与することを含む、腫瘍細胞を含む増殖性疾患を治療する方法を提供する。一実施形態において、腫瘍細胞の表面上の受容体はルイス抗原を含む。さらなる実施形態において、第二のポリペプチドは、ルイス抗原に結合するＤＣ−Ｓｉｇｎ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン）、またはその機能的断片または変異体を含む。
【００５５】
コンセプトの実証として、本発明の非限定的な実施形態を実施例において詳細に記載してあるが、ここで標的化配列は、Ｃ型レクチンファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であるＤＣ−Ｓｉｇｎを含む。このタンパク質は、末梢の樹状細胞（ＤＣ）の表面上に発現し、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３を介して、抗原提示細胞とリンパ系における静止Ｔ細胞との間の一次的接触に関与する。ＤＣ−Ｓｉｇｎはまた、リンパ組織へのＤＣの移動の間、上皮細胞上のＩＣＡＭ−２と相互作用する。ＤＣ−Ｓｉｇｎはまた、ＨＩＶのエンベロープタンパク質ｇｐ１２０に強く結合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のトランスでのウイルス感染を促進する。ＤＣ−Ｓｉｇｎタンパク質は、短いアミノ末端細胞質尾部、膜貫通ドメイン、７１／２反復までの幹状部、引き続きＣ末端Ｃ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）からなる。幹状部は四量体（多重コイル）の形成を促進する。
【００５６】
血液型関連ルイス腫瘍抗原（例えば、ＬｅｘおよびＬｅｙ）は、上皮起源のヒト癌の大多数に発現する。ルイス抗原は、複合オリゴ糖であり、双方とも細胞膜に埋め込まれ、細胞表面タンパク質（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＣＥＡ）に結合した糖脂質として見られ、正常な組織上での発現は限られている。ルイス抗原は、樹状細胞接着および腫瘍細胞浸潤を媒介することが示されている。ルイスＹは、樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体と相互作用し、免疫抑制の促進により免疫監視を免れる。したがって、ルイス抗原は、本発明の融合タンパク質を含む第二のポリペプチドに関する標的部分の非限定的例を提供する。ペプチドならびにヒトＭＢＬのペプチドをコードする対応するＣ−ＤＮＡ配列はそれぞれ、図１および配列リストに示されている。
【００５７】
一定の実施形態において、本発明は、一定のルイス抗原に結合するＤＣ−ＳＩＧＮの能力と補体系を活性化するＭＢＰの能力とをユニークに組み合わせる融合タンパク質として、ＭＢＬポリペプチドとＤＣ−ＳＩＧＮとの組合せを提供する。さらに、ＭＢＰネック領域とＤＣ−ＳＩＧＮ四量体化ドメイン（双方ともらせん状コイル−コイル構造）との慎重な比較により、同様な構造を有する領域であることが確認された。らせん周期を保存することにより、多数の異なる非限定的ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質が設計され、下記の実施例に記載されている。
【００５８】
本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質は、結合活性獲得を劇的に高める高次の多量体化（すなわち、多数の受容体を発現している細胞に対する結合強度を高める）を有し、これによって、癌細胞を特異的に標的にしている治療的分子の効果が高まり、副作用の危険性が減少する。一実施形態において、この融合タンパク質はまた、癌細胞と樹状細胞との間の相互作用（この相互作用により免疫監視から免れることになる）をブロックでき、ルイス抗原媒介接着および腫瘍細胞浸潤をブロックできる。さらなる一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、補体活性化および／または単球と好中球による取込みにより標的細胞の死滅を媒介する利点を有し得る。
【００５９】
本発明はまた、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号２）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号４）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号６）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号８）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号１０）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ（配列番号１２）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１４）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１６）およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１８）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号２０）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２２）、およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２６）およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２８）から選択される融合タンパク質など、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質を提供する。
【００６０】
一定の実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、第三のポリペプチド、すなわち、第三の融合パートナーに結合させることができる。このような第三の融合パートナーを、本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質に加えることによって、高収率のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質を得ることができると考えられる。本発明による第三の融合パートナーは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドおよびヘキサペプチドなど、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であるという条件で任意の好適な種類であり得る。一定の実施形態において、第三の融合パートナーは、単一のアミノ酸であり得る。また、この融合タンパク質を、タンパク質分解による劣化に対してより抵抗性にし、融合タンパク質の発現および分泌の増強を促進し、溶解性を改善し、および／または引き続く融合タンパク質のアフィニティー精製を可能にするように第三の融合パートナーを選択することができる。
【００６１】
一定の実施形態において、本発明の融合タンパク質とユビキチンなどの第三の融合パートナーとの間の接合領域は、ヒトグランザイムＢ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．７９）などのグランザイムＢプロテアーゼ開裂を含む。融合タンパク質の開裂剤としてのグランザイムＢの使用に関するより詳細な情報は、各々が参照として本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００６／０１９９２５１号明細書または国際公開第２００４／０９４４７８号パンフレットに見ることができる。
【００６２】
さらなる実施形態において、第三の融合パートナーを、アフィニティータグに結合させることができるか、またはそれ自体がアフィニティータグとなり得る。このようなアフィニティータグは、アフィニティー樹脂上で融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティードメインを含むことができる。アフィニティータグは、ヘキサヒス−タグを含むポリヒスチジン−タグ、ポリアルギニン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、もしくはマルトース結合タンパク質、または当業者に知られている任意の他のアフィニティータグであり得る。
【００６３】
さらなる実施形態において、第三の融合パートナーは、融合タンパク質の半減期を増加させる（延長させる）ことによって融合タンパク質を安定にする分子を含むことができる。タンパク質などの生体分子の半減期を延長し得る分子は、当業者により知られており、例えば、ＢＳＡ結合ペプチド、種々のポリオール類（例えばＰＥＧ類）、ＩｇＧ結合ペプチドまたはＦｃＲｎもしくはＦｃ抗体断片に結合するペプチドが挙げられる。
【００６４】
一定の実施形態において、本発明の方法は、例えば、上記のアフィニティータグシステムの使用により固定化された融合タンパク質の酵素的開裂によって形成される本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質を単離するための単離ステップを含むことができる。この単離ステップは、イオン交換およびサイズによる分画の使用など、タンパク質単離のため当業界に知られている任意の好適な手段により実施することができ、その選択は融合タンパク質の性質に依る。一実施形態において、第三の融合パートナーと、ＭＢＬポリペプチドならびにＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチドを含む領域との間の領域を、ヒトセリンプロテアーゼグランザイムＢと接触させてグランザイムＢプロテアーゼ開裂部位において融合タンパク質を開裂し、本発明の融合タンパク質を得る。
【００６５】
さらに本発明は、本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質をコードする単離核酸を提供する。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。より具体的には、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列など、本発明によるＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質をコードする単離核酸が提供される。
【００６６】
本発明はまた、プラスミド、ベクター、上記の少なくとも１種の核酸を含む転写カセットまたは発現カセットの形態で核酸構築体を提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の適切な配列など、適切な制御配列を含有する好適なベクターを選択できるか、または構築することができる。ベクターは、適宜プラスミド、ウイルス例えばファージ、またはファージミドであり得る。さらなる詳細に関しては、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第二版、Sambrookら、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【００６７】
本発明はまた、上記の１つまたは複数の構築体を含む組換え宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、細菌系、哺乳動物細胞系、酵母系およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現に関して当業界に利用できる哺乳動物の細胞系としては、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスターの腎細胞、ＮＳＯマウスの黒色腫細胞、および他の多くのものが挙げられる。一実施形態において、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
【００６８】
本発明のポリペプチド類の治療適用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨髄癌および上皮癌などの癌疾患の治療のためのＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質の使用を含む。
【００６９】
ＨＥＲ２（Ｅｒｂ Ｂ２）に選択的に結合するHERCEPTIN（登録商標）（トラスツズマブ）は、癌細胞上のルイス抗原によりグリコシル化されたＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍のうち、乳癌の治療に承認されている。ＨＥＲ２上のルイス抗原の標的化は、HERCEPTIN（登録商標）の結合を妨害しないため、本発明の融合タンパク質とＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）との組合せは、相乗的治療効果を有することが期待される。他の治療剤としては、リツキシマブなどのモノクローナル抗体、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲ標的化剤、キナーゼ阻害剤、免疫刺激薬、および癌ワクチンが挙げられる。
【００７０】
化学療法薬は通常、５−フルオロウラシル、マイトマイシン−Ｃ、オキサリプラチンおよびラルチトレキセドなど、大腸癌の治療に用いられる。このような化合物は、ルイスＹ発現を増強すると報告されていることは、本発明の融合タンパク質によるルイス抗原の標的化が、一連の化学療法剤と相乗的に作用し得ることを示している。
【００７１】
したがって、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質の投与は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ならびにラルチトレキセド、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル、イリノテカンならびにシスプラチン、マイトマイシン−Ｃおよびオキサリプラチンのなどの化学療法剤など、少なくとも１つのさらなる治療剤の投与を含むことができる。
【００７２】
治療方法
本発明の別の態様は、免疫細胞、病原細胞、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に関連した疾患を治療する方法に関する。この方法は、細胞と本発明の融合タンパク質とを接触させることを含む。
【００７３】
本発明の別の態様は、併用療法に関する。融合タンパク質と治療剤とを含む製剤もまた、本発明によって提供される。このような製剤は、貯蔵ならびに治療的投与に関して特に好適であると考えられる。これらの製剤は、既知の技法により調製することができる。例えば、これらの製剤は、ゲルろ過カラム上で緩衝液の交換により調製することができる。
【００７４】
融合タンパク質および治療剤は、ボーラスとしての静脈内投与、またはある期間に亘る連続注入、筋内、腹腔内、脳脊髄内、動脈内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によるなど、既知の方法に従って投与することができる。場合によっては、種々の市販の装置を用いてミニポンプを介して投与を実施することができる。
【００７５】
融合タンパク質を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定は当業界の技術の範囲内である。単回投与または複数回投与を使用することができる。現在、単独で使用される融合タンパク質の有効投与または有効量は、１日当り約１μｇ／ｋｇ体重から約１００μｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲であり得ると考えられている。種間の投与基準化は、例えば、Mordentiら、Pharmaceut. Res.、8:1351（1991）に開示されているように、当業界に知られた様式で実施することができる。
【００７６】
融合タンパク質のインビボ投与を使用する場合、通常の投与量は、投与経路に依って１日当り約１０μｇ／ｋｇ体重から約１００μｇ／ｋｇ体重またはそれ以上、好ましくは、約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日と変わり得る。具体的な投与量および送達方法に関するガイダンスは、文献［例えば、米国特許第４，６５７，７６０号明細書；米国特許第５，２０６，３４４号明細書；または米国特許第５，２２５，２１２号明細書を参照］に提供されている。種々の製剤が、種々の治療用化合物および種々の障害にとって有効であること、１つの臓器または組織を標的とする投与は、例えば、別の臓器または組織とは異なる様式での送達が必要であり得ることを当業者は認識されるであろう。投与の必要がある融合タンパク質の投与量が、例えば、融合タンパク質のアゴニストを受ける哺乳動物、投与経路、および哺乳動物に投与される他の薬物または療法に依って変わり得ることを当業者は理解するであろう。
【００７７】
これらの方法の中で、さらに追加の療法を使用し得ることが考えられる。１つまたは複数の他の療法としては、限定はしないが、放射線療法、サイトカイン、増殖阻害剤、化学療法剤、細胞毒性剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、およびシクリン依存キナーゼ阻害剤または融合タンパク質による治療に対する癌細胞の感受性を増強する任意の他の薬剤の投与を挙げることができる。
【００７８】
化学療法剤に関する調製および投与スケジュールは、製造元の取扱説明書に従って、または当業者によって経験的に判定されて使用することができる。このような化学療法に関する調製および投与スケジュールは、Chemotherapy Service Ed.、M. C. Perry、Williams & Wilkins、Baltimore、Md.（1992）にも記載されている。化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与前、もしくは投与後、またはそれと同時に投与することができる。
【００７９】
融合タンパク質と治療剤（および１つまたは複数の他の療法）とは、並行して（同時に）または連続的に投与することができる。具体的実施形態において、融合タンパク質と治療剤とを並行して投与する。別の実施形態において、融合タンパク質またはトリマー複合体を、治療剤の投与前に投与する。別の実施形態において、治療剤を、融合タンパク質またはトリマー複合体の投与前に投与する。投与後、インビトロ処置細胞を分析することができる。インビボ処置された場合、処置哺乳動物を、当業者によく知られた種々の方法でモニターすることができる。例えば、腫瘍組織を病理学的に調べて細胞死を評価することができるか、または免疫系応答に関して血清を分析することができる。
【００８０】
医薬組成物
医薬組成物を調製するために、当業界によく知られた任意の好適な方法により本発明による融合タンパク質を使用することができる。それ故、この組成物は、融合タンパク質と共に、１つまたは複数の許容できる担体、場合によっては他の治療剤および／または化学療法剤の成分を含むことができる。したがって、本発明は、薬学的に許容できる担体または賦形剤と共に本発明の融合タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物に関する。本明細書に用いられる「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」としては、生理学的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤ならびに抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容できる担体または賦形剤としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１種または複数種、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に等張剤、糖類、例えば、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。湿潤剤などの薬学的に許容できる物質、または有効期間または抗体もしくは抗体部分の有効性を増強させる湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液などの少量の補助物質もまた含むことができる。場合によっては、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩としてアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を含むことができる。賦形剤に加えて、医薬組成物は、血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝液、結合剤、甘味剤および他の香味剤；着色剤およびポリエチレングリコールのうちの１種または複数種を含むことができる。
【００８１】
これらの組成物は、例えば、液体溶液（例えば、注射液および輸液）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび座剤などの液体、半固体および固体の投与形態など、種々の形態であり得る。好ましい形態は、意図された投与経路および療法適用に依存する。一実施形態において、この組成物は、抗体によりヒトの受動免疫化に用いられたものと同様の組成物など、注射液または輸液の形態である。一実施形態において、投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。一実施形態において、融合タンパク質（またはトリマー複合体）を、静脈内注入または静脈内注射により投与する。別の実施形態において、融合タンパク質またはトリマー複合体を、筋内注射または皮下注射により投与する。
【００８２】
この医薬組成物用の他の好適な投与経路としては、限定はしないが、直腸投与、経皮投与、膣投与、経粘膜投与または腸管投与が挙げられる。
【００８３】
治療組成物は、一般に無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定である。この組成物は、液剤、ミクロ乳剤、分散剤、リポソーム、または薬物高濃度に好適な他の秩序構造として製剤化できる。無菌注射液は、必要ならば上記に挙げた成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中、必要な量の活性化合物（すなわち、融合タンパク質またはトリマー複合体）を組み込み、次いでろ過滅菌により調製する。一般に、分散剤は、ベースの分散媒体および上記に掲げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に活性化合物を組み込むことにより調製する。滅菌注射液調製用の滅菌散剤の場合、好ましい調製法は、活性成分プラス予め滅菌ろ過した溶液から所望の任意の追加成分の粉末を生じる減圧乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散剤の場合は、求められる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。注射用組成物の吸収持続性は、組成物中に吸収を遅延させる試剤、例えば、モノステアリン酸塩類およびゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【００８４】
本明細書に記載された障害の治療に有用な融合タンパク質および治療剤を含有するキットなどの製造品は、少なくとも容器およびラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど種々の材料から形成することができる。容器上のまたは容器と合体したラベルは、その製剤が選択された病態を治療するために使用されることを示している。製造品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース液などの薬学的に許容できる緩衝液を含む容器を含むことができる。製造品はさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を添えた添付文書など、商品および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができる。製造品はまた、上記の別の活性剤を有する容器を含むことができる。
【００８５】
一般に、製剤中に薬学的に許容できる適量の塩を用いて製剤を等張にする。薬学的に許容できる担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース液が挙げられる。製剤のｐＨは、約６から約９が好ましく、約７から約７．５であることがより好ましい。一定の担体が、例えば、投与経路および融合タンパク質および治療剤の濃度に依ってより好ましくなり得ることが当業者にとって明らかとなろう。
【００８６】
治療組成物は、凍結乾燥製剤、水溶液または水性懸濁液の形態で、任意の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤［Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.編集（1980）］と適切な純度を有する所望の分子とを混合することにより調製することができる。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であることが好ましく、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；および／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００８７】
このような担体のさらなる例としては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩類などの緩衝液物質、またはプロタミン硫酸流塩、燐酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイド状シリカ、トリ珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、およびセルロースベース物質などの電解質が挙げられる。局所形態またはゲルベース形態用の担体としては、カルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート類、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー類、ポリエチレングリコール、および木材ワックスアルコール類が挙げられる。全ての投与で、従来のデポー形態が好適に使用される。このような形態としては、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻用スプレー、舌下錠、および徐放性製剤が挙げられる。
【００８８】
インビボ投与のために用いられる製剤は、無菌である必要がある。これは、凍結乾燥および再構成の前か、後に無菌ろ過膜を通すろ過により容易に達成される。この製剤は、全身に投与される場合、凍結乾燥形態または溶液で貯蔵することができる。凍結乾燥形態である場合、一般に、使用時に適切な希釈剤による再構成のために他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の例は、皮下注射のために単回投与用バイアルに充填される滅菌の無色透明の生鮮溶液である。
【００８９】
治療用製剤は一般に、無菌アクセスポート、例えば、皮下注射用針により貫通可能なストッパーを有する静脈液用バッグまたはバイアルを有する容器内に入れる。反復静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋内（ｉ．ｍ．）の注射もしくは注入として、または鼻腔内もしくは肺内送達（肺内送達に関して、例えば、欧州特許第２５７，９５６号明細書を参照）に好適なエーロゾル製剤として製剤を投与することが好ましい。
【００９０】
本明細書に開示された分子は、徐放性製剤の形態でも投与できる。徐放性製剤の好適な例としては、マトリックスが造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマー類の半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、Langerら、J. Biomed. Mater. Res.、15: 167-277 (1981)およびLanger、Chem. Tech., 12: 98-105（1982）により記載されたポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー類（Sidmanら、Biopolymers、22: 547-556（1983））、 非分解性エチレン−ビニルアセテート（Langerら、上記）、Lupron Depot（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）が挙げられる。
【００９１】
融合タンパク質の製造
融合タンパク質を発現するような条件下、融合タンパク質をコードするベクターによって形質転換した宿主を培養することにより、任意の好適な標準タンパク質発現系において本発明の融合タンパク質を発現させることができる。この発現系は、所望のタンパク質が容易に単離でき、インビトロでリフォールディングできる系であることが好ましい。一般的には、原核生物の発現系が高収率のタンパク質を得ることができ、効率的な精製およびリフォールディングの方式を利用できることから好ましい。したがって、適切な発現系（ベクターや細胞型など）の選択は、当業者の知識の範囲内にある。同様に、本発明の融合タンパク質に関する一次アミノ酸配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ開裂部位の導入などの因子を考慮して、所望のアミノ酸配列をコードする適切な組換えＤＮＡ構築体を容易に設計することができる。
【００９２】
本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質の発現は、適切な条件下、核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することにより簡便に達成できる。したがって、適切または最適の発現系を選択することは、過度の実験をすることなく十分に当業者の能力および裁量の範囲内にある。同様に、本発明のポリペプチドに関する一次アミノ酸配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ開裂部位の導入などの因子を考慮して、所望のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ構築体などの適切なポリヌクレオチドを容易に設計することができる。これらの組換えＤＮＡ構築体を、選択された宿主に適切な多数の発現ベクターのうちのいずれかにフレーム内挿入をすることができる。適切または最適の発現ベクターの選択もまた、十分に当業者の能力および裁量の範囲内にある事項である。一定の実施形態において、発現ベクターは、組換え構築体の発現を駆動する強力なプロモーターを含む。
【００９３】
一実施形態において、本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質は、当業界によく知られた好適な標準的手法を用いて単離することができ、場合によっては、例えば、凍結乾燥などのさらなる処理に供することができる。
【００９４】
一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、融合タンパク質を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、エフェクター機能を有するＭＢＬポリペプチドおよび標的化配列を含む第二のポリペプチドをコードする。一定の実施形態において、ポリペプチドは単一の隣接ポリヌクレオチド配列（遺伝子融合）にコードされる。他の実施形態において、ポリペプチドは、非隣接ポリヌクレオチド配列によりコードされる。したがって、幾つかの実施形態において、ポリペプチドを発現させ、単離し、別個のポリペプチドとして精製し、共に融合させて本発明の融合タンパク質を形成する。
【００９５】
これらの組換えＤＮＡ構築体を、選択された宿主に適切な多数の発現ベクターのうちのいずれかにフレーム内挿入をすることができる。一定の実施形態において、発現ベクターは、組換え融合タンパク質構築体の発現を調節する強力なプロモーターを含む。組換え発現方式を用いて本発明の融合タンパク質を生成する場合、得られた融合タンパク質を、当業界によく知られた好適な標準的手法を用いて単離および精製することができ、場合によっては、例えば、凍結乾燥などのさらなる処理に供することができる。
【００９６】
組換えＤＮＡ分子、タンパク質、および融合タンパク質の製造、ならびに組織培養および細胞の形質変換には標準的技法を使用することができる。例えば、Sambrookら、（下記）またはCurrent Protocols in Molecular Biology［Ausubelら、編集者、Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994年］を参照されたい。精製技法は一般に、製造元の仕様書に従うか、または、Sambrookら［Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY（1989）］に記載されたものなどの従来の手法を用いて当業界で一般に達成されたとおりに、または本明細書に記載されたとおりに実施する。特定の定義が与えられない限り、本明細書に記載された実験室の手法と関連して利用される命名法、分子生物学、生化学、分析化学、および医薬化学／製剤化学に関連する技法は、当業界によく知られ、一般に使用されるものである。生化学的合成、生化学的分析、医薬製剤、製剤、および送達、ならびに患者の治療には標準的技法を使用することができる。
【００９７】
融合タンパク質の第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間に、可撓性分子リンカーを任意に挿入し、共有結合できることは認識されるであろう。一定の実施形態において、このリンカーは、約１〜２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列を含む。このリンカーは、１０未満のアミノ酸であり得、最も好ましくは、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つであり得る。一定の場合において、９つ、８つ、７つまたは６つのアミノ酸が好適であると考えられる。幾つかの実施形態において、このリンカーは、本質的に非免疫原性であり、タンパク質分解開裂の傾向がなく、他の残基（例えば、システイン残基）と相互作用することが知られているアミノ酸残基を含まない。
【００９８】
下記の説明はまた、１つまたは複数の化学基に共有結合（以後「共役」）している融合タンパク質およびトリマー複合体を作製する方法に関する。このような共役体における使用に好適な化学基は、有意に毒性でないか、または免疫原性でないことが好ましい。貯蔵に好適な条件下で貯蔵し、使用できる共役体を作製するために、化学基は任意に選択される。ポリペプチドに共役することができる種々の代表的な化学基は当業界に知られており、例えば、炭水化物、糖タンパク質、ポリグルタメート、ポリオール類などの非タンパク質ポリマー上で天然に生じる炭水化物などが含まれる（例えば、米国特許第６，２４５，９０１号明細書を参照）。
【００９９】
例えば、国際公開第９３／００１０９号パンフレットに開示されているように、ポリオールを、リシン残基など１つまたは複数のアミノ酸残基において本発明の融合タンパク質に共役させることができる。使用されるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖または分枝鎖を有することができる。好適なポリオール類としては、１つまたは複数のヒドロキシル位置で、１個と４個の間の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換されたものが挙げられる。一般に、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であり、したがって、説明を簡便にするため、残りの検討部分は、その中で使用されるポリオールはＰＥＧ（ペグ）であり、ポリペプチドにポリオールを結合させる工程は「ペグ化（pegylation）」と称される代表的な実施形態に関するものである。しかしながら、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレンポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリオール類が、ＰＥＧに関して本明細書に記載された結合技法を用いて使用できることを当業者は認識している。
【０１００】
ペグ化に使用されるＰＥＧの平均分子量を変えることができ、一般に約５００ダルトン（Ｄ）から約３０，０００ダルトンの範囲である。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約１，０００Ｄから約２５，０００Ｄであり、より好ましくは、約１，０００Ｄから約５，０００Ｄである。場合によっては、ＰＥＧホモポリマーは非置換であるが、一端をアルキル基によって置換してもよい。アルキル基は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、最も好ましくは、メチル基である。ＰＥＧ製剤は、商品として入手でき、一般に、本発明の使用に好適なこれらのＰＥＧ製剤は、平均分子量によって販売される非均質性製剤である。例えば、一般に商品として入手できるＰＥＧ（５０００）製剤は、通常分子量が±５００Ｄと僅かに分子量に変化がある分子を含有する。本発明の融合タンパク質は、小型分子化合物（例えば、化学療法剤）に対する共役；シグナル分子（例えば、蛍光体）に対する共役；特異的結合対の分子（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／抗原）に対する共役；またはグリコシル化、ＰＥＧ化、または安定性ドメインに対するさらなる融合（例えば、Ｆｃドメイン）による安定化など、当業界に知られている技法を用いてさらに修飾することができる。
【０１０１】
タンパク質をペグ化する種々の方法が、当業界に知られている。ＰＥＧに共役したタンパク質を製造する具体的方法としては、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，９３５，４６５号明細書および米国特許第５，８４９，５３５号明細書に記載された方法が挙げられる。一般にタンパク質は、主として反応条件、ポリマーの分子量などに依って、本発明の１つまたは複数のアミノ酸残基を介してポリマー上の末端反応性基に共有結合する。反応性基を有するポリマーは、本明細書において活性化ポリマーと称される。この反応性基は、タンパク質上の遊離アミノ基または他の反応性基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは、無作為または部位特異的様式でタンパク質上のアミノ基または他の反応性基に結合することができる。しかしながら、当然のことながら、最適な結果を得るために選択される反応性基のタイプと量、ならびに使用されるポリマータイプは、反応性基がタンパク質上の特に多過ぎる活性基と反応することを回避するために使用される具体的なタンパク質またはタンパク質変異体に依存する。このことは、完全に回避することは不可能と考えられるので、タンパク質の濃度に依って一般にタンパク質１分子当り約０．１モルから１０００モル、好ましくは、２モルから２００モルの活性化ポリマーを用いることが推奨される。タンパク質１モル当りの活性化ポリマーの最終量は、可能であるならば、最適活性を維持すると同時にタンパク質の循環半減期を最適にするための釣合いである。
【０１０２】
さらに、他の半減期延長分子を、血清アルブミン結合ペプチド、ＩｇＧ結合ペプチドまたはＦｃＲｎに結合するペプチドなど、ＭＢＬポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に結合することができる。
【０１０３】
本明細書における節の見出しは、構成のみを目的として使用されており、決して記述された主題を限定するものとして解釈すべきでないことに注意する必要がある。本明細書に引用された全ての参考文献は、全ての目的のために参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。
【０１０４】
以下の実施例は、本発明の一定の実施形態を単に例示するものであり、添付された請求項により規定される本発明を限定するものとしてとらえてはならない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：タグ化および非タグ化ＭＢＰ−ＣＤ２０９ＣＴＬＤ融合タンパク質の発現プラスミドクローンのＨＥＫ２９３細胞における構築と発現
ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン）は、Ｃ型レクチンファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。このタンパク質は、末梢における樹状細胞（ＤＣ）の表面上に発現し、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３を介してリンパ系における抗原提示細胞と静止Ｔ細胞との間の一次接触に関与する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、リンパ系組織へのＤＣの移動時に上皮細胞上のＩＣＡＭ−２とも相互作用する。ＤＣ−ＳＩＧＮはまた、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０と強力に結合し、トランスのＣＤ４＋Ｔ細胞においてウイルス感染を促進する。ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、短いアミノ末端細胞質尾部、膜貫通ドメイン、７ １／２反復までの幹状部、次いでＣ末端のＣ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）からなる。この幹状部は、四量体（多重コイル）の形成を促進する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ルイス抗原ＬｅｘおよびＬｅｙなどのマンノース含有およびフコース含有複合体の糖共役体に結合する。大部分の他のレシチン類とは対照的に、ＤＣ−ＳＩＧＮは、炭水化物構造の内部に結合し、このスカフォードの可能性を増加させてより多様で特異的な炭水化物結合が得られると思われる。
【０１０６】
一連の融合構築体は、ＭＢＰシグナル配列、次いでシステニルに富むオリゴマー化ドメイン、コラーゲン反復領域を表し、種々の誘導体はＭＢＰネック領域とＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインの融合を表す。種々のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質（ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号１）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号３）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号５）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号７）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号９）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ （配列番号１１）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１３）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１５）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１７）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号１９）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２１）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２３）ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２５）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２７））をコードする挿入体のヌクレオチド配列は、それぞれ表１に示された一連のプラスミドおよび挿入特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローン化した。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓは、Ｃ−末端切断ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインを含有し；ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣは、完全長ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインを含有し；ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥは、Ｎ−およびＣ−末端ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインを含有し；ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳは、ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインのＮ−末端においてセリン−グリシン挿入体を含有する。次にこの構築体は、ＧＥＮＥＴＩＣ３７００アナライザーおよび配列決定BIG DYE（登録商標）バージョン３．０の配列決定法（Applied Biosystems）を用いて検証した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
アミノ末端にｍｙｃタグおよびＨｉｓタグで全てタグ化された融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号６）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号１０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ（配列番号１２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１６）およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号２０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２２）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２４）の全て、および２つの非タグ化融合タンパク質誘導体ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２６）ならびにＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２８）を発現できるクローンを、連続オリゴヌクレオチドアセンブリおよび市販品として入手できる発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）へのサブクローニング方式を用いて構築し、その結果、プラスミド：ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０を得た。プラスミドは、プラスミド増殖および挿入体のヌクレオチド配列検証のために大腸菌（E. coli）XL-1ブルー細胞（Stratagene）に形質転換された。
【０１０９】
ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）へのトランスヘクション用プラスミドＤＮＡを、QiagenのMAXI PREP（登録商標）マキシ調製法を用いて単離した。最初に、タグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質誘導体だけをトランスフェクトし、発現に関して分析した。リポフェクタミンプロトコル（Invitrogen）を用いて細胞をトランスフェクトした。全ての構築体を首尾よく一過性にトランスフェクトし、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合した固定化ルイス腫瘍抗原ｙ（Ｌｅｙ）またはヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３を発現するＬｅｙを結合する能力に関して４日後に培養物の上澄液を分析した。
【０１１０】
実施例２：ヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３の固定化ＨＳＡ−ＬｅｙまたはＬｅｙ発現細胞に結合する種々のタグ化ＭＢＰ−ＣＤ２０９ ＣＴＬＤ融合タンパク質の分析
タグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ発現プラスミド（ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ、およびｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞培養物からの上澄液を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合した固定化Ｌｅｙまたはヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３を発現するＬｅｙを結合する能力に関して一過性発現の４日後に分析した。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣ融合タンパク質は、ＭＣＦ−７のヒト乳癌細胞、ＬＮＣａｐの前立腺癌細胞、およびＡ４３１の皮膚扁平上皮癌細胞に結合する能力に関しても試験した。
【０１１１】
最初のアッセイにおいて、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ）中、１ウェル当り０．５μｇのＬｅｙ−ＨＳＡ（IsoSep、Uppsala、スウェーデン国）を一晩インキュベートし、９６ウェルのＥＬＩＳＡトレイ内に固定化した。未結合のＬｅｙ−ＨＳＡを洗浄し、ブロッキング後、１００μｌの各培養物の上澄液を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合に関して分析した（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）。商品として入手できるＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ Ｆｃ融合タンパク質（R&D systems）を陽性対照として用い、抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を検出用に用い、次いで、ＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【０１１２】
融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＣｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＣｓＣ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＤｓは、最強の結合を示し、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＤｓＣは、中間の結合を示し、残りの融合タンパク質は、結合を示さなかった（図３Ａ、３Ｃ）。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＣｓＣ融合タンパク質の結合を、商品として入手できるＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ Ｆｃ化合物の結合と比較した（図３Ｂ）。結合は、特異的であり、カルシウム依存性であることが判明した。
【０１１３】
さらなるアッセイにおいて、それぞれ１０％のウシ胎児血清および１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補足されたＭｃＣｏｙまたはＤＭＥＭ培地中、３７ｏＣで５％のＣＯ２で増殖させたＬｅｙ発現ＳＫＢＲ−３またはＭＣＦ−７細胞の半集密性培養物を、プラスチック表面からかき取り、洗浄し、１％のＢＳＡでブロックし、ＭＢＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質または精製融合タンパク質の各々を発現する培養物上澄液と共に１時間インキュベートした。慎重に洗浄後、結合した融合タンパク質の量を、懸濁相ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した（図４Ａ〜Ｃ）。商品として入手できる融合タンパク質ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｆｃ（R&D systems）を、陽性対照として含めた。抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を検出用に用い、次いで、ＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【０１１４】
ＬＮＣａｐおよびＡ４３１癌細胞系に関して、細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩおよびＤＭＥＭそれぞれの培地中、Nunclonの９６トレー中で７０％の集密性まで増殖させた。細胞の洗浄およびブロッキング後、細胞を精製ＭＢＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質と共に１時間インキュベートした。慎重に洗浄後、結合した融合タンパク質の量を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した（図４Ａ〜Ｃ）。商品として入手できるＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｆｃ（R&D Systems）を、陽性対照として含めた。 抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を検出用に用い、次いで、ＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【０１１５】
融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣは、ＳＫＢＲ−３細胞（図４Ａ）に対し最強の結合を示し、結合は、Ｌｅｙに対して特異性であり、かつカルシウム依存性であることが立証された（図４Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞に結合する融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣの評価は、図４Ｃに示している。
【０１１６】
実施例３：マンノース−アガロースのアフィニティークロマトグラフィーを用いるＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体の精製
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣ、またはＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣ０融合誘導体を発現する安定なクローナル細胞系およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ０融合誘導体を発現する安定な細胞系集団は、スーパーコロイドまたは線形化されたプラスミドＤＮＡ、および種々の濃度のプラスミドＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより確立された。種々の濃度での細胞の接種、およびゼオシンを用いた選択圧の増加により、安定な細胞系が得られた。幾つかのクローンを増殖させ、培養物の上澄液を、実施例２に記載された固定化Ｌｅｙ ＨＳＡ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて融合タンパク質の生成に関して分析した。安定にトランスフェクトされたクローンの上澄液からのＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体を、以下の段落で説明されるマンナン−セファロースを用いてアフィニティー精製を行った。
【０１１７】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ発現上澄液（約２．５Ｌ）をろ過し、２５０ｍＬの１０×ＴＢＳＣ−緩衝液（１×ＴＢＳＣ：１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａ２＋）を供給し、２５ｍＬのマンノース−アガロースカラム（Sigma）に４℃、０．５ｍＬ／分で適用した。適用後、カラムを、２カラム容量の１×ＴＢＳＣで洗浄し、１×ＴＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡで溶出させた。塩化カルシウムの５ｍＭを溶出タンパク質フラクションに添加し、５００容量の１×ＴＢＳＣ−緩衝液に対して透析した。タンパク質濃度を、分光分析法により測定し（Ａ２８０）、純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検証した。
【０１１８】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣの溶出プロファイルは類似していなかった（図５）。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓは、１本の鋭いピークとして溶出するが、一方、ＡＢｓＣは、２本のピーク、すなわち第一のピークが最終ピークよりも小さなピークとして溶出する。双方の溶出プロファイルは、鋭いフロントと、より長いテールを有する。
【０１１９】
２．５Ｌの培養物の上澄液から、２ｍｇの各誘導体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図６Ａ〜Ｂ）により判定された＞９０％の純度で単離された。各々の場合、融合タンパク質の濃度は、ピークフラクション中３００〜６６０μｇ／ｍＬであった。単離された誘導体のオリゴマー化プロフィールは、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的マウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を用いて３〜８％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された非還元サンプルのウェスタンブロット上で分析した（図７）。
【０１２０】
実施例４：商品として入手できる（ＤＣ−ＳＩＧＮ）２−Ｆｃ誘導体の結合と比較して、固定化Ｌｅｙ−ＨＳＡに結合するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体の分析
R&D systemsからの二価のＤＣ−ＳＩＧＮ Ｆｃ誘導体と比較して、マイクロタイタープレート（Nunc）内のウェルに固定化されたＬｅｙ−結合ＨＳＡを用いるＥＬＩＳＡアッセイを開発して、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体の結合強度を分析した。
【０１２１】
９６ウェルのＥＬＩＳＡトレーの各ウェルに、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ）中０．５ｍｇのＬｅｙ−ＨＳＡ（IsoSep）を加え、一晩インキュベートし、固定化した。未結合Ｌｅｙ−ＨＳＡを洗浄して除き、ブロッキング後、１００マイクロリットルの１×ＴＢＳＣ中ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ、−ＡＢｃＣ、または（ＤＣ−ＳＩＧＮ）２−Ｆｃの連続希釈液を、各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡアッセイでの結合を分析した。抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を、検出用に用い、次いでＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。Ｆｃ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合（ダイヤモンド）に比してＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合（スクエア）の結合増加を示している比較分析からの典型的な結果を図８に示してある。
【０１２２】
実施例５：Ｄ−マンノース−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いるＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体の精製
Ｄ−マンノース−セファロースマトリックス上のアフィニティー精製、次いでソース１５Ｑカラム上のイオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製（「ポリッシングステップ」）を介して安定にトランスフェクトされたクローンの上澄液から、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＣＴＬＤ誘導体を単離した。
【０１２３】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤを発現する上澄液に、１０×ＴＢＳＣ−緩衝液から最終１×ＴＢＳＣ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａ２＋）を供給し、４℃でＤ−マンノース−セファロースカラム上で操作した。標準的なプロトコルに従って、Ｄ−マンノースを、ジビニルスルホンにより活性化されたセファロース６−ＢＣｌに結合させることによりＤ−マンノース−セファロースマトリックスを調製した。適用後、カラムを２カラム容量の１×ＴＢＳＣで洗浄し、１×ＴＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡで溶出した。溶出したタンパク質フラクションに、５ｍＭのＣａＣｌ２を加えて、５〜１０容量の１ｘＴＢＳＣ−緩衝液に対して透析した。溶出後、存在する可能性のあるウイルスの不活化は、１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０および０．３％ｗ／ｖのトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートを添加し、室温で６時間溶出された物質を放置することにより達成した。遠心分離による清澄化後、１×ＴＢＳＣ中、物質をＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム上に装填した。装填したら、カラムに５カラム容量の１５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌを流した。カラムを、１５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌによる勾配で溶出した。溶出したタンパク質を、１０ｍＭのＮａＰＯ４ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ中にダイアフィルトレーションした。次にタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、濃度は分光分析法により測定した（Ａ２８０）。
【０１２４】
実施例６：Ｃ４開裂によりモニターされた固定化Ｌｅｙ−ＨＳＡ上の補体溶解開始分析
実施例３および５で作製された精製ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体を、補体活性化アッセイにおいてアッセイした。このアッセイは、ＨＳＡ−ＬｅＹに結合した際に、Ｃ４開裂を開始させるＭＢＬ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ／ＭＡＳＰ複合体能力の定量的測定である。次に沈殿したＣ４−断片を、抗Ｃ４抗体により定量した。
【０１２５】
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬのＨＳＡ−ＬｅＹにより一晩コーティングした。過剰の抗原を洗浄後、プレートを、ＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；１４０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７，４）中０．１％のＢＳＡでブロックした。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤを、ＭＢＬ結合用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭのＣａＣｌ２；１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００；０．１％のＢＳＡ；ｐＨ７，４）中、２％のＭＢＬ欠損ヒト血清（State Serum Institute、Copenhagen、デンマーク国）と複合化し、４℃で一晩結合させた。これらのプレートを温めて洗浄した。５μｇ／ｍＬのヒトＣ４タンパク質（Quidel）を、１．５時間インキュベートしたウェルに加える。ウェルを洗浄し、開裂Ｃ４断片をポリクローナル抗Ｃ４抗体（DAKO）で検出し、次いでＥＬＩＳＡアッセイにおいてＨＲＰ−共役抗ウサギＩｇ抗体（DAKO）で検出した（図９）。
【０１２６】
実施例７：Ｃ４開裂によりモニターされた上皮癌細胞の補体溶解開始分析
実施例３または５に記載され、作製された精製ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体を、標準的補体活性化アッセイにおいてアッセイした。このアッセイは、上皮癌細胞上のＬｅＹ腫瘍抗原に結合した際に、Ｃ４開裂を開始させるＭＢＬ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ／ＭＡＳＰ複合体能力の定量的測定である。次に沈殿したＣ４−断片を、抗Ｃ４抗体により定量した。
【０１２７】
細胞（例えば、ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびその他）を、７０％の集密性まで増殖させ、プラスチックからかき取った。洗浄し、０．５％のＢＳＡ／ＴＢＳＣ−緩衝液中で予めブロッキング後、０．５％のＢＳＡ／１ｘＴＢＳＣ緩衝液中で２％のＭＢＬ欠損ヒト血清（State Serum Institute、Copenhagen、デンマーク国）と複合化させたＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤを含有する緩衝液中に細胞を再懸濁し、室温で２時間結合させた。細胞を０．５％ＢＳＡ／ＴＢＳＣ−緩衝液で洗浄し、ヒトＣ４（０．５％ＢＳＡ／ＴＢＳＣ中５μｇ／ｍＬ）中に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、開裂Ｃ４断片をポリクローナル抗Ｃ４抗体（DAKO）で検出し、次いで懸濁液ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＨＲＰ−共役抗ウサギＩｇ抗体（DAKO）により検出した（図１０）。
【０１２８】
実施例８：ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体またはモノクローナル抗体による上皮癌細胞増殖の阻害分析
乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３およびＭＣＦ−７は、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するそれぞれＭｃＣｏｙおよびＤＭＥＭ培地中、Nunclon９６−トレーに５０００個の細胞／ウェルで、３７℃かつ５％ＣＯ２で一晩接種した。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓＣ０、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓＣ０（＋５μｇ／ｍＬのHerceptin）の希釈液、Herceptinおよび対照緩衝液を、細胞に加え、細胞を、３７℃かつ５％のＣＯ２で２日または５日間増殖させた。実施例５に記載されたプロトコルを用いてＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ誘導体を単離した。以後、製造元の取扱説明書（Promega）に従って比色アッセイ（細胞タイター９６水性非放射性細胞増殖アッセイ（CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay））を用いて測生存細胞数を定した。５日後のアッセイ結果を図１１に示してある。
【０１２９】
上記に示された実施例は、単に例示であり、本発明の全ての可能な実施形態、適用または修飾の徹底したリストであることを意味していない。したがって、本発明の範囲と意図から逸脱することなく、本発明の記載された方法およびシステムの種々の修飾および変型は、当業者にとって明らかとなろう。本発明を、具体的な実施形態と関連させて記載したが、当然のことながら、請求された本発明は、このような具体的な実施形態に過度に限定されてはならない。実際、分子生物学、免疫学、化学、生化学または関連分野で当業者にとって明らかである本発明を実施するために、記載された様式の種々の改変は、添付された請求項の範囲内にあることが意図されている。
【０１３０】
当然のことながら、本発明は、本明細書に記載された具体的な方法論、プロトコル、および試薬などに限定されるものではなく、これらは、当業者が認識されるであろうが変わり得る。また、当然のことながら、本発明に用いられる用語は、具体的な実施形態の説明目的のみに使用され、本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１３１】
本発明の実施形態ならびに種々の特徴およびそれらの有利な詳細は、非限定的実施形態を参照してより十分に説明され、および／または添付の図面で例示され、以下の説明で詳述される。図面で例示された特徴は、必ずしも一定の縮尺で描かれていないが、たとえ本明細書において明白に述べられていなくても、当業者が認識し得るように、一実施形態の特徴は、他の実施形態でも使用できることに注意する必要がある。
【０１３２】
本明細書に挙げられたいずれの数値も、任意の低値と任意の高値との間で少なくとも２つの単位で分離されているという条件で、１単位の増分で低値から高値への全ての値を含んでいる。一例として、例えば、成分濃度、または例えば、サイズ、角度の大きさ、圧力、時間などの処理変数の値が、例えば、１から９０、具体的には、２０から８０、より具体的には、３０から７０であることが述べられている場合、本明細書においては１５から８５、２２から６８、４３から５１、３０から３２などの値が明確に挙げられることが意図されている。１未満の値に関して、１単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であることが考慮されている。これらは具体的に意図されたものの例にすぎず、挙げられた低値から高値の間の数値の可能な全ての組合せは、同様な様式で本明細書において明確に述べられると考えるべきである。
【０１３３】
具体的な方法、装置、および材料を記載しているが、本明細書に記載されたものと類似した、または等しい任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書に引用された全ての参照文献および刊行物の開示は、各々個々に参照として援用されるのと同程度に、参照としてそれらの全体が本明細書に明確に援用されている。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６０／９９６，２８８号明細書の利益を主張する。これは参照として本明細書に援用されている。
【０００２】
本発明は、種々の疾患および感染の治療に関する。より具体的には、本発明は、マンノース結合レクチンポリペプチド配列などの融合タンパク質に関する。これらの融合タンパク質は、感染性疾患、癌、免疫関連疾患および他の疾患を治療するための医薬組成物において使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）とも称されるマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）は、広範囲の病原体（ウイルス、細菌、真菌、原生動物）の表面上の炭水化物に結合することにより先天性免疫応答において役割を果たすカルシウム依存血清タンパク質であり、これはそこでの補体系を活性化することができる。ＭＢＬはまた、直接オプソニンとして働き、病原体の表面をタグ化することにより、病原体の結合と取り込みを媒介して、食細胞による認識および消化を促進する。
【０００４】
マンノース結合レクチンは、肝臓で作られるタンパク質のコレクチンファミリーのメンバーである。コレクチンは、コラーゲン様領域とレクチン領域を有するため名称を持っている。レクチンは通常、細菌の表面上の炭水化物に結合するタンパク質である。コラーゲンドメインは、先天性免疫系のエフェクター部分と相互作用する。ヒト染色体１０上のＭＢＬ２遺伝子は、Ｎ末端のシステインに富んだ領域、コラーゲン様領域、ネック領域、および炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含む３つの同一のポリペプチド鎖から構成される２４８のアミノ酸のタンパク質サブユニットのオリゴマーであるＭＢＬを生じさせる。３つのＭＢＬポリペプチド鎖は、インビボで見られる生物活性三量体へと組み立てられる。
【０００５】
血清のＭＢＬが微生物の表面上の炭水化物と相互作用すると、補体活性化のレクチン経路の病原体認識要素を形成する。ＭＢＬは、反復マンノースまたはＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する表面配列に結合する。それは、複合体が適切な表面に結合した時に自動活性化する１つまたは複数のＭＢＰ結合セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）との複合体として循環する。
【０００６】
ＭＢＰの表面認識機能は、αラセン体の多重コイルにより保持された３つのＣ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）の集団によって媒介される。Ｎ末端部のコラーゲン様ドメインは、そのドメインの湾曲部を形成する単一の割り込み部分を有するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ三重体からなる。短いＮ末端ドメインは、鎖間ジスルフィド結合を形成するいくつかのシステイン残基を含有する。血清ＭＢＬｓは、齧歯類では２〜４個の三量体サブユニット、ヒトでは６個と多いサブユニットを含有するより大型の形態へと組み立てられる。ＭＢＰ−Ａと称されるラットの血清ＭＢＰの３つのオリゴマー形態は全て補体を固定することができるが、オリゴマーが大型になるほど、より高い特異性を有する。多くの種は、ＭＢＰの第二の形態を発現する。ラットでは、第二の形態、ＭＢＰ−Ｃは肝臓に見られる。ＭＢＰ−Ｃは、３つのポリペプチドを含有する単純なサブユニットを越えたより高いオリゴマーを形成することはない。ラットのＭＢＰ−ＡとＭＢＰ−Ｃの間のキメラの分析により、コラーゲン様ドメインが、ＭＡＳＰ結合ドメインを含有することが示唆される。
【０００７】
ＭＢＬは数年間、治療薬として研究されている。例えばＭＢＰは、食細胞の機能障害をもたらす腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤により処置された個体の感染の治療として考慮されている（国際公開第０２／０５８３３号パンフレットを参照）。ＭＢＬは、感染性薬剤に対するＭＢＬ ＣＲＤ領域の結合、および引き続くクリアランスを介して感染のクリアランスを可能にすることにより、ＴＮＦ阻害剤によって処置された患者のサブセットにおける食細胞機能の不足を補償するためにその天然形態において用いられる。ＭＢＬはまた、ワクチンアジュバントとして使用するために、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドとの融合タンパク質においても考慮されている（米国特許第７，３００，７４４号明細書を参照）。ＭＢＬなどの集合の先に記載された使用により、樹状細胞およびＴ細胞が免疫応答を開始するのを活性化するＣＤ４０Ｌなどの分子の三量体ＴＮＦベースファミリーを産生することが可能になる。上記の適用において記載されたより高い多量体化が、アジュバントの特性にとって望ましい。したがってこれらの方法により、先天性および適応性の免疫機能を活性化し、抗体応答を提供できる分子が提供される。しかしながら、これらの方法は、補体活性化を開始するために設計されてはいない。実際、補体活性化は、ＭＢＬ融合タンパク質が結合した所望の免疫細胞の死滅をもたらすため、ワクチンの効果にとって有害と考えられる。この適用において、ＭＢＰは補体活性化を媒介するのに使用されるが、細胞免疫応答を誘導し抗体産生はきわめて望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明者は、当業界において、補体を活性化する感染、癌、および他の障害を治療する方法を提供することが求められていることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、エフェクター機能を有するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含む第一のポリペプチドと、細胞表面またはウイルスに結合する標的配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供し、この第一のポリペプチドは活性ＭＢＬ Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含まない。第二のポリペプチドの標的配列は、腫瘍細胞、免疫細胞、細菌細胞、原生動物、真菌およびウイルスに感染した細胞からなる群から選択的される細胞の表面上の標的部分に結合することができる。標的部分は、特定の細胞に結合している炭水化物、脂質、またはアミノ酸配列のいずれか１つまたはそれらの組合せを含むことができる。標的配列は、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）などのレクチンを含むことができる。第一のポリペプチド結合は、哺乳類の補体系などのエフェクター機能を可能にする配列を含む。
【００１０】
一態様において、本発明は、エフェクター機能を有するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドと、細胞表面またはウイルスに結合する標的配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質を哺乳類に投与することを含む哺乳類の補体系を活性化する方法を提供し、この第一のポリペプチドは、活性ＭＢＬ Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含まない。
【００１１】
一態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質および薬学的に許容された賦形剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、化学療法剤などの少なくとも１つの追加治療薬および／または抗体、キナーゼ阻害剤、または癌ワクチンなどの標的化治療薬をさらに含むことができる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、病原体性疾患に罹っている患者に、本発明の融合タンパク質またはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、病原体性疾患を治療する方法を提供し、標的配列が病原体の細胞表面マーカーまたはウイルスに感染している細胞上のマーカーに結合する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、腫瘍細胞と関連する増殖性疾患の治療を必要としている患者に、本発明の融合タンパク質またはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、腫瘍細胞と関連する増殖性疾患を治療する方法を提供し、標的配列が、癌細胞の表面上など、腫瘍細胞の表面上のマーカーに結合する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする配列を含む単離核酸、この核酸を含む発現ベクター、この発現ベクターを含む宿主細胞、ならびにこれらの核酸、ベクター、および宿主細胞を含む本発明の融合タンパク質を調製する方法に関する。
【００１５】
本発明の他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から当業者に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】完全長ヒトＭＢＰ（配列番号３８）のポリペプチド配列および一般的な構造領域（シグナルペプチド領域、多量体化領域、コラーゲン様領域、多重コイル領域、およびＣ型レクチンドメイン）を示す図である。イタリック体および下線を引いたアミノ酸は、ＭＢＰ結合セリンプロテアーゼ類（ＭＡＳＰ）に対する結合領域を含むと考えられる。
【図２】ヒト（配列番号３９）、ラット（ＭＢＰ−Ａは配列番号４０、ＭＢＰ−Ｃは配列番号４１）、マウス（ＭＢＰ−Ａは配列番号４２、ＭＢＰ−Ｃは配列番号４３）、およびサル（配列番号４３）からの種々のＭＢＰ配列のアラインメントを示す図である。残基「Ｏ」はヒドロキシプロリン；星印（＊）はＭＢＰおよびフィコリン類にわたって保存されているアミノ酸残基を表す。太活字および下線を引いたアミノ酸残基は、ＭＢＰ結合セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）とのＭＢＰ相互作用において重要であることが確認されている［Ｗａｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１４）：１４０６５−０７３（２００４）参照］。ヒトＭＢＰのＭＡＳＰ結合領域の機能的変異体の一実施形態は配列番号４５に規定される。
【図３Ａ】固定化されたＬｅｙＨＳＡに結合しているタグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮＣＴＬＤ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ結合分析を示す図である。トランスフェクション４日後における種々のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ構築体の結合活性。ＡＣｓＣは、最も強い結合活性を示す。
【図３Ｂ】固定化されたＬｅｙＨＳＡに結合しているタグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮＣＴＬＤ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ結合分析を示す図である。各々が種々の競合物質の存在下または非存在下でのＤＣ−ＳＩＧＮ／ＦｃおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＡＣｓＣ）の結合比較。
【図３Ｃ】固定化されたＬｅｙＨＳＡに結合しているタグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮＣＴＬＤ融合タンパク質のＥＬＩＳＡ結合分析を示す図である。トランスフェクション４日後における種々のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮのさらなる結合活性アッセイ。
【図４Ａ】懸濁相ＥＬＩＳＡを用いたＳＫＢＲ−３細胞に結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質の結合を示す図である。構築体ＡｂｓおよびＡＢｓＣは、陽性対照ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｆｃよりも高い結合活性を示す。
【図４Ｂ】懸濁相ＥＬＩＳＡを用いたＳＫＢＲ−３細胞に結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質の結合を示す図である。種々の競合物質およびカルシウムの存在下、Ｌｅｙに対するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＡＢｓ構築体の結合特異性。
【図４Ｃ】懸濁相ＥＬＩＳＡを用いたＳＫＢＲ−３細胞に結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質の結合を示す図である。陽性対照および陰性対照に比較して、ＭＣＦ−７に対するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ構築体であるＡｂｓおよびＡＢｓＣのＥＬＩＳＡ。
【図５】２５ｍＬのマンナン−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ）上のＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣの溶出プロファイルを示す図である。
【図６】単離されたＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢＳ誘導体（Ａ）およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡｂｓＣ誘導体（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図７】マンナン−セファロースアフィニティー精製により単離されたＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓのオリゴマー化プロファイルのウェスタンブロット分析（非還元）を示す図である。ブロットは、大多数の精製ＡＢｓ構築体が高次のオリゴマーとして存在していることを示す。
【図８】固定化ルイスＹ−ＨＳＡに結合しているＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ（■）およびＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ（◆）に関するＥＬＩＳＡ結合結果を示す図である。ＭＢＰの多量体化ドメインは、ＤＣ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ分子に比して、親和性の増大達成を提供する。
【図９】Ｃ４のＭＡＳＰ依存性開裂を有するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ−によるＣ４補体活性化の誘導を示す図である。
【図１０】ＳＫＢＲ−３細胞上のＣ４のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ（−◆−）−ＭＡＳＰ依存性変換を示す図である。
【図１１】ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体ＡＢｓＣおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体ＡＢｓＣ０、またはハーセプチンによるＳＫＢＲ−３（Ａ）およびＭＣＦ−７（Ｂ）の細胞増殖阻害の分析を示す図である。グラフ記号：菱形（−◆−）ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ；四角形（−■−）ＭＢＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓＣ０＋５μｇ／ｍＬのハーセプチン；三角形（−▲−）ハーセプチン；「Ｘ」（−ｘ−）ＴＢＳＣ緩衝液；＊（−＊−）媒体のみ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、補体固定を誘導することのできるマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含む第一のポリペプチドと、特定の細胞型および病原体に結合している部分を標的にする配列を含む第二のポリペプチドとを含む一連の融合タンパク質を構築することによるＭＢＰの補体固定活性を利用する。一態様において、本発明は、マンノース結合レクチンポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチドと；標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＭＢＬのエフェクター官能基および対象となっている細胞または他の病原体に融合タンパク質を方向づける標的化配列を含む融合タンパク質を、必要としている被検体に提供することによる疾患の治療に関する。ＭＢＬのエフェクター官能基は細胞または病原体に結合すると、宿主の補体系を活性化し、それによって細胞または病原体のオプソニン化、最終的には食作用を開始させる。本発明の融合タンパク質は、ＭＢＬ融合タンパク質が、エフェクター機能を保持しながら、本来なら細胞表面上のマンノースまたは他のオリゴ糖に結合すると考えられるＭＢＬ配列を有することのないように、ＭＢＬ炭水化物認識ドメインまたは活性ＭＢＰ Ｃ型レクチン様ドメインを欠いている。
【００１９】
定義
本発明をより詳細に明らかにする前に、多数の用語を定義する。用語に関して、本明細書に特に定義が示されない限り、本開示を通して用いられる用語および語句は、当業界で一般に理解されている意味を有すると解釈するべきである。また、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる際、文脈によって明らかに別様に表されない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含む。
【００２０】
本明細書に用いられる用語「エフェクター機能」とは、抗体に結合していない哺乳動物における免疫応答またはＴ細胞応答を誘導する能力を意味する。例えば、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）のエフェクター機能は、細胞外病原体を攻撃するために共に働く一組の血漿タンパク質である補体系を活性化する。補体系の最も重要な役割は、オプソニン化（食細胞によって認識される受容体によって外来生物を被覆すること）であるが、補体系はまた、炎症細胞を動員し、膜攻撃複合体によって直接病原体を殺す。哺乳動物において、補体の活性化または「固定」とは一般に、ＭＢＰが集合的に「補体」と称される血清タンパク質、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９に結合し、そのことによって、タンパク質に対するマクロファージの結合を刺激し、これらのマクロファージによる引き続く消化を促進することを意味する。
【００２１】
「テトラネクチン三量体形成ドメイン」とは、参照としてその全体が援用されている米国特許出願公開第２００７／０１５４９０１号（‘９０１出願）明細書に記載されているテトラネクチン由来の三量体形成ドメインのことである。成熟ヒトテトラネクチン一本鎖ポリペプチド配列は、本明細書において、配列番号４６として示されている。テトラネクチン三量体形成ドメインの例としては、ヒトテトラネクチン遺伝子のエキソン２によってコードされたアミノ酸を表す、配列番号４６のアミノ酸１７から４９、１７から５０、１７から５１および１７から５２、ならびに任意に、この遺伝子のエキソン３によってコードされた初めの１つ、２つまたは３つのアミノ酸が挙げられる。他の例としては、アミノ酸１から４９、１から５０、１から５１およびエキソン１およびエキソン２の全てを表す１から５２、ならびに任意に、この遺伝子のエキソン３によってコードされた初めの１つ、２つまたは３つのアミノ酸が挙げられる。あるいは、エキソン１によってコードされたアミノ酸配列の一部のみが三量体形成ドメインに含まれる。特に、三量体化ドメインのＮ末端は、配列番号４６の残基、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７のいずれかにおいて始まり得る。特定の実施形態において、Ｎ末端はＩ１０またはＶ１７であり、Ｃ末端は、Ｑ４７、Ｔ４８、Ｖ４９、Ｃ（Ｓ）５０、Ｌ５１またはＫ５２である（配列番号４６によるナンバリング）。
【００２２】
本発明の一態様において、三量体形成ドメインは、より詳細に米国特許出願公開第２００７／００１５４９０１号明細書に記載されているテトラネクチンファミリー三量体形成構造要素の共通塩基配列である配列番号４７のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体形成構造要素（「ＴＴＳＥ」）である。ＴＴＳＥは、タンパク質のテトラネクチンファミリーの天然メンバーの変異体、特にアルファらせん多重コイル三量体を形成するＴＴＳＥの能力に大きな悪影響を与えることなくアミノ酸配列に修飾を受けた変異体を包含する。本発明の種々の態様において、本発明による三量体ポリペプチドは、配列番号４７のコンセンサス配列に少なくとも６６％のアミノ酸配列同一性；例えば配列番号４７のコンセンサス配列に少なくとも７３％、少なくとも８０％、少なくとも８６％または少なくとも９２％の配列同一性（規定された（Ｘではない）残基のみをカウントして）を有する三量体形成ドメインとして、ＴＴＳＥを含む。言い換えると、配列番号４７の規定されたアミノ酸のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つを置換できる。
【００２３】
特定の一実施形態において、配列番号４６の５０位におけるシステイン（Ｃ５０）を、望ましくない多量体化に至り得る望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を避けるために、セリン、スレオニン、メチオニンまたは任意の他のアミノ酸残基に有利に変異させることができる。他の公知の変異体は、アミノ酸残基６、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３５、３９、４１、および４２（配列番号４６によるナンバリング）から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、これらは任意の非らせん破壊アミノ酸残基によって置換できる。これらの残基は、天然のテトラネクチンモノマーの３つのＴＴＳＥ間のトリマー複合体を安定化する分子間相互作用に直接関与しないことが示されている。一態様において、ＴＴＳＥは式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇ（ＮからＣ）を有する反復ヘプタッドを有し、式中、残基ａおよびｄ（すなわち２６位、３３位、３７位、４０位、４４位、４７位、および５１位）は任意の疎水性アミノ酸であり得る（配列番号４６によるナンバリング）。
【００２４】
さらなる実施形態において、ＴＴＳＥ三量体形成ドメインは、ポリヒスチジン配列および／またはプロテアーゼ開裂部位、例えば、血液凝集因子ＸａまたはグランザイムＢ（本明細書に参照として援用されている米国特許出願公開第２００５／０１９９２５１号明細書を参照）を組み込むこと、およびＣ末端ＫＧまたはＫＧＳ配列を含めることによって修飾できる。また、精製を助けるために、２位のプロリンをグリシンによって置換することができる。
【００２５】
用語「Ｃ型レクチン様タンパク質」および「Ｃ型レクチン」は、したがって、任意の真核生物種のゲノムに存在するか、またはゲノムにコード化されている任意のタンパク質を指すために用いられ、このタンパク質は、１つまたは複数のＣＴＬＤまたはＣＴＬＤの亜群に属する１つまたは複数のドメイン、炭水化物リガンドに結合する炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含有する。この定義は具体的に、膜結合Ｃ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチン、「可溶性」Ｃ型レクチン様タンパク質および機能的膜貫通ドメインを欠くＣ型レクチンおよび変異Ｃ型レクチン様タンパク質および１つまたは複数のアミノ酸残基がインビボでグリコシル化によって変化したＣ型レクチンまたは他の任意の合成後修飾、ならびにＣ型レクチン様タンパク質およびＣ型レクチンの化学的修飾によって得られる任意の生成物を含む。
【００２６】
ＣＴＬＤは、およそ１２０のアミノ酸残基からなり、特徴として２つまたは３つの鎖内ジスルフィド架橋を含有する。ＣＴＬＤと種々のタンパク質との間のアミノ酸配列レベルにおける類似性は相対的に低いが、多数のＣＴＬＤの３Ｄ構造は、５つまでのループによってしばしば規定されるいわゆるループ領域に本質的に限定された構造可変性を有して保存性が高いことが分かっている。いくつかのＣＴＬＤは、カルシウムに対する１つまたは２つの結合部位を含有し、カルシウムと相互作用する側鎖の多くはループ領域に位置している。
【００２７】
３Ｄ構造情報が入手できるＣＴＬＤに基づき、カノニカルＣＴＬＤの構造的特徴は、β１、α１、α２、β２、β３、β４、およびβ５の順で連続的に現れる７つの主要な二次構造要素（すなわち、５つのβ鎖と２つのαらせん体）であると推定されている。図２は、１０のＣ型レクチンの公知の３次元構造のＣＴＬＤのアラインメントを示している。３Ｄ構造が決定した全てのＣＴＬＤにおいて、β鎖は、１つはβ１とβ５からなり他方はβ２、β３およびβ４からなる２つの逆平行のβシートで配置している。さらなるβ鎖であるβ０は、配列の中でしばしばβ１に先行しており、存在する場合は、β１シート、β５シートと合体して追加の鎖を形成する。さらに、１つはα１とβ５をつないでおり（ＣＩ−ＣＩＶ）、１つはβ３と、β４とβ５をつないでいるポリペプチドセグメントとをつないでいる（ＣＩＩ−ＣＩＩＩ）２つのジスルフィド架橋が、現在までに特性化された全てのＣＴＬＤに常に見られる。
【００２８】
ＣＴＬＤの３Ｄ構造において、これらの保存された二次構造要素は、この文脈では集合的に、コアから突き出している「ループ領域」と称される多数のループにとってのコンパクトなスカフォードを形成する。ＣＴＬＤの一次構造において、これらのループは、２つのセグメント、すなわちループセグメントＡ、ＬＳＡとループセグメントＢ、ＬＳＢに構成される。ＬＳＡは、定型的な二次構造をしばしば欠き、４つまでのループを含有する、β２とβ３とをつないでいる長いポリペプチドセグメントを表す。ＬＳＢは、β鎖のβ３とβ４とをつないでいるポリペプチドセグメントを表す。ＬＳＡの残基は、β４の単一残基と共に、テトラネクチンのＣＴＬＤなどのいくつかのＣＴＬＤのＣａ２＋とリガンドとの結合部位を規定することが示された。例えば、１つまたは少数の残基の置換を含む変異の研究で、結合特異性、Ｃａ２＋感受性および／または親和性における変化は、ＣＴＬＤドメインによって調整できることが示された。以下の非限定的な例を含む多数のＣＴＬＤが知られている：テトラネクチン、リトスタチン、マウスマクロファージガラクトースレクチン、クッパー細胞受容体、ニワトリノイロカン、ペルルシン、アシアロ糖タンパク質受容体、軟骨プロテオグリカンコアタンパク質、ＩｇＥ Ｆｃ受容体、膵炎関連タンパク質、マウスマクロファージ受容体、ナチュラルキラー群、幹細胞成長因子、因子ＩＸ／Ｘ結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、ウシコングルチニン、ウシＣＬ４３、コレクチンリバー１、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｄ、ｅ−セレクチン、被嚢類ｃ型レクチン、ＣＤ９４ＮＫ受容体ドメイン、ＬＹ４９ＡＮＫ受容体ドメイン、ニワトリ肝レクチン、マスｃ型レクチン、ＨＩＶｇｐ１２０−結合ｃ型レクチン、および樹状細胞免疫受容体参照として本明細書にその全体が援用されている米国特許出願公開第２００７／０２７５３９３号明細書を参照されたい。
【００２９】
語句「有効量」とは、同時投与でも連続的投与でも、問題の疾患または病態を予防、寛解または治療するために有効な本発明の融合タンパク質および治療薬の一方または双方の量のことである。特定の実施形態において、有効量は、細胞がアポトーシスを受ける、腫瘍容積を減少させる、または癌または他の疾患を有する哺乳動物の生存を延長させる傾向を増強させるか、または増加させる上で十分な融合タンパク質および併用する治療薬の量である。
【００３０】
用語「癌」、「癌性」および「悪性」とは、典型的に非制御細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態のことを言うか、または述べる。癌の例としては、限定はしないが、腺癌、リンパ腫、芽腫、黒色腫、肉芽腫、および白血病などの癌が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵癌、グリア芽腫、膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝性癌および肝腫などの肝癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍などの腎癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、および種々のタイプの頭頚部癌が挙げられる。
【００３１】
本文脈において、用語「抗体」とは、天然のものであっても、また部分的に、もしくは全体的に合成で作製されたものであっても免疫グロブリンのことを言う。抗体は多くの方法で修飾できるため、用語「抗体」は、結合ドメイン特異性を有する任意の特異的結合メンバーまたは特異的結合物質を含むものと解釈すべきである。したがって、この用語は、天然であろうと、全体的にもしくは部分的に合成されたものであろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めて、抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価物および相同体を含む。したがって、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、または別のポリペプチドに融合した等価物が含まれる。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、または抗体結合ドメインに相同性の結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質、例えば抗体模倣物を含む。これらは、天然源由来であってもよいし、部分的または全体的に作製されたものであってもよい。抗体の例としては、免疫グロブリンイソ型およびそれらのイソ型サブクラスのもの；Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；およびダイアボディー（diabodies）がある。
【００３２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミンなどのエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン類（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類縁体トポテカンなど）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（その合成類縁体アドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシンなど）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルミシン（合成類縁体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１など）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミンオキシド、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソ尿素類；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩＩおよびカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照））；ダイネマイシンＡなどのダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスネート類；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンなど）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類縁体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナール；フロリン酸などの葉酸補充液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；ガリウム硝酸塩；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’、２２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、TAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton、N.J.）、ABRAXANE（商標）Cremophor-free、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、および TAXOTERE（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer、Antony、仏国）；クロランブシル；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類縁体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン；および薬学的に許容できる塩類、酸または上記の任意の誘導体が挙げられる。またこの定義には、ボルテズミブ（Velcade）などのプロテアソーム阻害剤、ＢＣＬ−２阻害剤、ＩＡＰアンタゴニスト（Smac合成物）、ＨＤＡＣ阻害剤（HDACI）およびキナーゼ阻害剤（Sorafenib）が含まれる。
【００３３】
またこの定義には、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標）タモキシフェンなど）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびFARESTON-トレミフェンなどの抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体調節剤；例えば、４（５）―イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE（登録商標）メゲストロールアセテート、AROMASIN（登録商標）エキセメスタン、フォルメスタニー、ファドロゾール、RIVISOR（登録商標）ボロゾール、FEMARA（登録商標）レトロゾール、およびARIMIDEX（登録商標）アナストロゾールなどの副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素、アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；およびフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、おびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、例えば、ＰＫＣ―アルファ、ＲａｌｆおよびＨ―Ｒａｓなどの異常な細胞増殖に関係しているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ANGIOZYME（登録商標）リボザイム）およびＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えば、ALLOVECTIN（登録商標）ワクチン、LEUVECTIN（登録商標）ワクチン、およびVAXID（登録商標）ワクチン；PROLEUKIN（登録商標）ｒＩＬ−２；LURTOTECAN（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ABARELIX（登録商標）ｒｍＲＨ；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤が含まれる。
【００３４】
本発明の特定の態様
ここで本発明をより詳細にのべると、完全長ヒトマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）が、配列番号３８に開示されている（図１）。ＭＢＰの種々の機能的領域もまた図１に記載されている。本明細書に用いられる「マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチド」は、配列番号３８のアミノ酸２１〜１３３（配列番号４８としても表される）、ならびに表面に記載された機能的変異体およびそれらの断片を意味することとする。融合タンパク質のＭＢＬポリペプチドは、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合したセリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）に結合することができ、補体固定を介した免疫応答などのエフェクター機能を開始することができる。
【００３５】
一定の実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは配列番号４８を含む。他の実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸４２〜１３３を含む。いくつかの実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸４８〜９９を含む。さらに他の実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸６５〜８０（配列番号４９としても表される）を含む。さらなる実施形態において、ＭＢＬポリペプチドは、以下の一般的配列：
ＧＸＹＧＸＹＧＸＯＧＫＹＧＰＹＧ（配列番号４５）
（式中、ＸおよびＹは任意のアミノ酸であり得、Ｏはヒドロキシプロリン（ＨｙＰ）である）
を有する配列番号３の変異体を含む。一定の実施形態において、Ｘは、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、およびＧｌｕから選択される。一定の実施形態において、Ｙは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｙｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、グリコシル化Ｌｙｓ（ｇ−Ｌｙｓ）、およびヒドロキシル化Ｌｙｓ（ｈ−Ｌｙｓ）から選択される。
【００３６】
さらなる実施形態において、ＭＢＬポリペプチド変異体は、配列番号４５における上記のもの以外に、配列番号４８の領域にアミノ酸置換を含むことができる。本発明のＭＢＬポリペプチド変異体は、ＭＡＳＰに対する結合部位に必要な構造を保持し；したがって、本発明の変異体は、ＭＢＬポリペプチドのコラーゲン様ドメインの構造を破壊しない。例えば、参照として本明細書に援用されているWallisら、J.Biol.Chem.、279(14)：14065-14073頁（2004年）を参照されたい。したがってＭＢＬ変異体は、多くの種にわたる種々のコラーゲン様領域、多量体化領域、および多重コイル領域のコンセンサス配列から誘導することができる。さらに、保存的アミノ酸置換は、種々のＭＢＬポリペプチドの二次構造および三次構造に基づいて行うことができ、ヒドロパシー、電荷、および水素結合の相互作用は全て考慮に入れることができ、ＭＡＳＰ結合活性を保持する適切な置換を行うことができる。ＭＢＬポリペプチドのＭＡＳＰ結合領域の外側の領域における欠失変異体、挿入変異体、または置換変異体などの変異体を含む実施形態において、５０％と低い同一性パーセントであり得る。ＭＡＳＰ結合領域内にこのような変異を含む他の実施形態において、変異体は、配列番号３８または配列番号４８に対して、少なくとも８０％同一性であり得る。一定の実施形態において、このような変異体は、配列番号３８または配列番号４８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性である。本発明の融合タンパク質の種々の例において、標的配列を、ＭＢＬのＫ１２３、Ｋ１２４、Ｗ１２５、およびＴ１２７（配列番号３８に対するナンバリング）において、ＭＢＬにＣ末端融合させる。
【００３７】
本発明の上記の態様の一定の実施形態において、第二のポリペプチドの配列は、特定の細胞型および／または病原体に結合した炭水化物、脂質、および／またはアミノ酸配列などの部分を標的にするように選択することができる。例えば、標的化配列は、例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／または腫瘍細胞、またはそれらの組合せなどの細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質（例えば、細胞表面受容体または膜貫通輸送タンパク質）を標的にするように選択することができる。同様に、標的化配列は、例えば、ウイルス、真菌、細菌、原生動物、または他の寄生生物、またはそれらの組合せなどの病原体に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質（例えば、細胞表面受容体または膜貫通輸送タンパク質）を標的にするように選択することができる。
【００３８】
一実施形態において、標的化配列は、腫瘍細胞と結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択することができる。特定の一実施形態において、標的化配列は、非限定的な例であるＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、Ｄ９７、ｇｐ１００、ルイスＹ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦ受容体、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＭＳＡ、ＣＤＣＰ１、ＣＤ２６、Ｈｅｐｓｉｎ、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、Ｍｅｔ、ＣＡＩＸ（Ｇ２５０）、ＥｐｈｈＢ４（エフリンタイプ−Ｂ受容体４）、ＥＧＦＲ１、ＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＤＰＰ６、ｓｙｎｄｅｃａｎ１、ＩＧＦＢＰ２（ヒトインスリン様成長因子結合タンパク質２）、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＴＬ４、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ受容体、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ、ＢＡＧＥ、ＴＲＰ−１、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＭＵＣ１、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＳＳＣ（扁平上皮細胞癌抗原）、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、コロン抗原−１（ＣＯＡ−１）、前立腺１の６つの膜内外上皮抗原（ＳＴＥＡＰ１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ポドプラニン、黒色腫過剰発現抗原（ｍｅｌｏｅ），ＣＤ２００およびｈＣＧなどの腫瘍細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００３９】
一実施形態において、標的化配列は、樹状細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。本明細書に用いられる「樹状細胞」には、例えば、骨髄またはプラズマ細胞の樹状細胞などの任意の公知の樹状細胞サブタイプが含まれる。特定の一実施形態において、標的化細胞は、非限定的な例であるＣＤ８３、ＣＤ２０５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７およびＣＤ２０９／ＤＣ−ＳＩＧＮなどの樹状細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００４０】
一実施形態において、標的化配列は、Ｂ細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。一実施形態において、標的化細胞は、非限定的な例であるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３２、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８３、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１７９α、ＣＤ１７９β、およびＣＤ１８０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、およびＢＲ−３などの樹状細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００４１】
一実施形態において、標的化配列は、Ｔ細胞に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。本明細書に用いられる「Ｔ細胞」には、例えば、活性化Ｔ細胞；調節Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）；細胞障害性Ｔ細胞（ＴＣ、ＣＴＬ）；ヘルパーＴ細胞（エフェクターＴ細胞またはＴＨ；例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨＦ）；メモリーＴ細胞；（ＴＣＭ、ＴＥＭ）：ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）；ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）などの任意のタイプのＴ細胞サブタイプが含まれる。特定の一実施形態において、標的化配列は、非限定的な例であるＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ１２９、ＣＤ２００、ＣＤＷ２１７、α−ＴＣＲ、およびβ−ＴＣＲなどのＴ細胞に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化される。
【００４２】
一実施形態において、標的化配列は、少なくとも１つの病原体（細菌、原生動物、寄生生物、ウイルスなど）に結合した炭水化物、脂質、および／またはタンパク質を標的にするように選択される。特定の一実施形態において、標的化配列は、非限定的な例である呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）タンパク質（例えば、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質、ＲＳＶ Ｇ 糖タンパク質など）；ヒトパラインフルエンザウイルス１〜４；ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス、ならびにニッパウイルス、およびインフルエンザ群Ａ、ＢまたはＣウイルスタンパク質などのオルソミクソウイルス科、例えば、インフルエンザウイルスニューラミミダーゼおよびインフルエンザウイルスヘマッグルチニン；単純ヘルペスウイルスタンパク質などのヘルペスウイルス科、例えば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、またはｇＥタンパク質、またはｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、およびｇＥの相同体を含む単純ヘルペスウイルス１または２の糖タンパク質、またはサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびヒトヘルペスウイルス６、７または８、またはサルＢウイルス（オナガザルヘルペスウイルス１）からの他のタンパク質のなどの病原体に結合した少なくとも１つのタンパク質に標的化されている。またタンパク質には、限定はしないが、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型（ＨＩＶ１およびＨＩＶ２）などのレトロウイルスからのタンパク質およびヒトＴリンパ球増殖性ウイルス１〜４（ＨＴＬＶ−１〜４）外膜および他のタンパク質、ならびにベータレトロウイルスおよびスプマウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質はまた、風疹からのカプシドタンパク質などのタンパク質またはアルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、および西部ウマ脳脊髄炎ウイルスおよびセムリキ森林ウイルス複合体などのトガウイルスからのものであり得る。タンパク質にはまた、限定はしないが、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルスＡ〜Ｆ、および他の多肢にわたるヒトアデノウイルス）、ポックスウイルス、例えば天然痘（痘瘡）、ワクシニア、牛痘、サル痘、伝染性軟属腫、タナ痘、ヤバ痘、ヤバサル腫瘍ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、およびウシ丘疹口内炎ウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質にはまた、限定はしないが、Ｂ１９ウイルス、アデノ関連ウイルス、およびヒトボカウイルスなどのパルボウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質にはまた、限定はしないが、多数の種々のヒトパピロマウイルスからのタンパク質などのパピロマウイルスからのタンパク質が含まれる。タンパク質にはまた、限定はしないが、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＫＩウイルス、ＷＵウイルスおよびメルケル細胞ポリオーマウイルスなどのポリオーマウイルスからのタンパク質が含まれる。このようなタンパク質にはまた、限定はしないが、ロタウイルス、オルトレオウイルス、およびコルチウイルスなどのレオウイルス科；ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；エンテロウイルス、エコウイルス、パレコウイルス、コクサッキーＡ群およびＢ群ウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、カルジオウイルス、およびリノウイルスなどのピコルナウイルス科、Ｃ型肝炎ウイルスおよびテング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介脳炎ウイルスなどのフラビウイルス科、ヒトコロナウイルス、ヒトトロウイルス、およびＳＡＲＳコロナウイルスタンパク質などのコロナウイルス科、ならびに限定はしないが、コロナウイルス科からのＳおよびＭタンパク質、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクロスウイルス、リフトバレー熱ウイルス、および多数のヒト伝染性ハンタウイルスなどのバンヤウイルス科、ボルナ病ウイルスなどのボルナウイルス科、狂犬病ウイルスなどのラブドーウイルス科、エボラウイルスおよびマルブルグウイルスなどのフィロウイルス科、ノロウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、サポウイルス（例えば、サッポロウイルス）、および他のカリチウイルスなどのカリチウイルス科、ヒトアストロウイルスなどのアストロウイルス科、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサ熱ウイルス、アルボウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、フレキサルウイルス、および白水アロヨウイルスなどのアレナウイルス科、Ｅ型肝炎ウイルスなどのヘペウイルス科、およびデルタ型肝炎ウイルスなどのデルタ型ウイルスのゲノム由来の表面タンパク質からのタンパク質が含まれる。
【００４３】
細菌の表面タンパク質としてはまた、限定はしないが、アナプラスマ(Anaplasma)属(アナプラスマ・ファゴサイトフィラム(Anaplasma phagocytophilum)など)、エーリキア(Ehrlichia) 属 (イー・チャッフィンシス(E. chaffeensis)およびイー・エルウィンギ(E. erwingii)など)、リケッチア(Rickettsia)属 (アール・プロワゼキ(R. prowazekii)、アール・チフィ(R. typhi)、およびアール・リケッチ (R. rickettsii)など)、 バルトネラ(Bartonella)属 (ビー・ヘンセラ(B. henselae)など)、およびブルセラ属(Brucella)のものなど、種々の種のアルファプロテオバクテリア、バークホールデリア(Burkholderia)属 (ビー・セパシア(B. cepacia)およびビー・プソイドマレイ(B. pseudomallei)など)、ボーデテラ(Bordetella)属 (ビー・ペルツシス(B. pertussis)など)、およびネイセリア(Neisseria)属(エヌ・ゴノローエア(N. gonorrhoeae)およびエヌ・メニンギチデス(N. meningitides)など)のものなどのベータプロテオバクテリア、フランシセラ(Francisella)属(エフ・ツラレンシス(F. tularensis)など)、レギオネラ(Legionella)属(エル・ニューモフィラ(L. pneumophila)など)、コクシェラ(Coxiella)属(シー・ブルネチ(C. burnetii)など)、アシネトバクター(Acinetobacter)属(エイ・バウマンニ(A. baumannii)など)、モラキセラ(Moraxella)属(エム・ラクナタ(M. lacunata)など)、シュードモナス(Pseudomonas)属(ピー・アエルギノーサ(P. aeruginosa)およびピー・オリジハビタンス(P. oryzihabitans)など)、プロビデンシア(Providencia)属(ピー・スツアルチ(P. stuartii)など)、ビブリオ(Vibrio)属(ヴィー・コレラエ(V. cholerae)、ヴィー・バルニフィカス(V. vulnificus)、およびヴィー・パラハエモリチカス(V. parahaemolyticus)など)、シトロバクター(Citrobacter)属、エンテロバクター(Enterobacter)属(イー・クロアカエ(E. cloacae)およびイー・アエロゲネス(E. aerogenes)など)、エシェリキア(Escherichia)属(大腸菌(E. coli) O157:H7など)、クレブシエラ(Klebsiella)属(ケイ・ニューモニア(K. pneumoniae)など)、プロテウス(Proteus)属(ピー・バルガリス(P. vulgaris)、ピー・ミラビリス(P. mirabilis)、およびピー・ペンネリ(P. penneri)など)、サルモネラ(Salmonella)属(エス・エンテリカセロバリス・チフィムリウム(S. enterica serovars Typhimurium)、エンテリチチジス(Enterititidis)、およびチフィ(Typhi)など)、セラチア(Serratia)属(エス・マルセセンス(S. marcescens)など)、シゲラ(Shigella)属(エス・フレクスネリ(S. flexneri)、エス・ジセンテリア(S. dysenteriae)、およびエス・ソンネイ(S. sonnei)など)、エルシニア(Yersinia)属(ワイ・ペスチス(Y. pestis)など)、ヘモフィリス(Haemophilus)属(エイチ・インフルエンザ(H. influenzae)およびエイチ・デュクレイ(H. ducreyi)など)、およびパステウレラ(Pasteurella)属(ピー・マルトシダ(P. multocida)など)のものなどのガンマプロテオバクテリア、カンピロバクター(Campylobacter) 属 (シー・ジェジュニ(C. jejuni)、シー・コリ(C. coli)、およびシー・フェタス(C. fetus)など) およびヘリコバクター(Helicobacter)属 (エイチ・ピロリ(H. pylori) など)のものなどのイプシロンプロテオバクテリア、クロストリジウム(Clostridium)属(シー・ジフィシル(C. difficile)、シー・ペルフリンゲンス(C. perfringens)、シー・ボツリナム(C. botulinum)、シー・ソルデリ(C. sordellii)、およびシー・テタニ(C. tetani)など)、マイコプラズマ(Mycoplasma)属(エム・ニューモニア(M. pneumoniae)など)、バシラス(Bacillus)属(ビー・アントラシス(B. anthracis)およびビー・セレウス(B. cereus)など)、リステリア(Listeria)属(エル・モノサイトゲネス(L. monocytogenes)など)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属(エス・オウレウス(S. aureus)、エス・サプロフィチカス(S. saprophyticus)、およびエス・エピデルミス(S. epidermis)など)、エンテロコッカス(Enterococcus)属(イー・フェイカリス(E. faecalis)およびイー・フェイシウム(E. faecium)など)、およびストレプトコッカス(Streptococcus)属(エス・ピオゲネス(S. pyogenes)、エス・ニューモニア(S. pneumoniae)、エス・アガラクチアエ(S. agalactiae)、エス・ミュータンス(S. mutans)、エス・ビリダンス(S. viridans)、およびエス・ジスガラクチアエ(S. dysgalactiae)など) のものなどのフィルミクテス、アクチノミセス(Actinomyces)属(エイ・イスラエリ(A. israelii)など)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属(シー・ジフテリア(C. diphtheriae)、シー・アミコラタム(C. amycolatum)、およびシー・パルバム(C. parvum)など)、ガルドネレラ(Gardnerella)属(ジー・バギナリス(G. vaginalis)など)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属(エム・ツベルクローシス(M. tuberculosis)、エム・レプラエ(M. leprae)、エム・アブセサス(M. abscessus)、およびエム・アビウム(M. avium)複合体など)、およびノカルジア(Nocardia)属(エヌ・アステロイデス(N. asteroides)など) のものなどのアクチノバクテリア、 クラミジア(Chlamydia)属(シー・トラコマチス(C. trachomatis)など) およびクラミドフィラ(Chlamydophila)属(シー・プシッタシ(C. psittaci)およびシー・ニューモニア(C. pneumoniae)など) のものなどのクラミジア、ボレリア(Borrelia)属(ビー・ブルグドルフェリ(B. burgdorferi)など)、レプトスピラ(Leptospira)属 (エル・インテロガンス(L. interrogans)など)、およびトレポネマ(Treponema)属(ティー・パリダム(T. pallidum)など) のものなどのスピロカエテス、バクテリロイデス(Bacteroides)属およびプレボテラ(Prevotella)属のものなどのバクテロイデス、およびフソバクテリウム(Fusobacterium)属のものなどのフソバクテリア、 に見られるものが挙げられる。
【００４４】
寄生虫の表面タンパク質としては、限定はしないが、アスペルギルスフミガーツス (Aspergillus fumigatus)、エイ・フラブス(A. flavus)、エイ・テレウス(A. terreus)、エイ・ニヅランス(A. nidulans)、エイ・ニガー(A. niger)、ブラストミセス・デルマチジス(Blastomyces dermatidis)、カンジダ(Candida spp.)、コッキジオイデス(Coccidioides spp.)、 クリプトコッカスネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、シー・ガッチ(C. gatti)、ブラキオラアルゲラエ(Brachiola algerae)、ビー・コンノリ(B. connori)、ビー・ベシクラルム(B. vesicularum)、エンセファリトズーン・クニクリ(Encephalitozoon cuniculi)、イー・ヘレム(E. hellem)、イー・インテスチナリス(E. intestinalis)、エンテロシトズーン・ビエネウシ(Enterocytozoon bieneusi)、ミクロスポリジウム・セイロネンシス(Microsporidium ceylonensis)、エム・アフリカナム(M. africanum)、ノセマ・オクラルム(Nosema ocularum)、プレイストフォーラ(Pleistophora spp.)、トラキプレイストフォーラ・ホミニス(Trachipleistophora hominis)、ティー・アントロポフテラ(T. anthropophthera)、ビッタフォルマ・コルネア(Vittaforma corneae)、およびミューモシスチス・ジロベシ(Pneumocystis jirovecii) (ピー・カリニ(P. carinii)として公式に分類された) などの真菌種の種々のライフステージ（スポア、菌糸、発芽、酵母）、およびバベシア・ミクロチ (Babesia microti)、ビー・ジベルゲンス(B. divergens)、クリプトスポリヂウム・パルブム(Cryptosporidium parvum)、シー・ホミニス(C. hominis)、シー・フェリス(C. felis)、シー・カニス(C. canis)、シー・ムリス(C. muris)、シー・メレアグリジス(C. meleagridis)、シクロスポーラ・ケイエタネンシス(Cyclospora cayetanensis)、イソスポーラ・ベリ(Isospora belli)、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)、ピー・マラリア(P. malariae)、ピー・オバレ(P. ovale)、ピー・ビバックス(P. vivax)、およびトキソプラズマ・ゴンジ(Toxoplasma gondii)、ならびにバランチジウム・コリ (Balantidium coli)などのシリオフォラン原生動物種などのアピコンプレキサン原生動物種の種々のライフステージ、
およびレイシュマニア・チャガシ (Leishmania chagasi)、エル・ドノバニ(L. donovani)、エル・インファンツム(L. infantum)、エル・メキシカーナ(L. mexicana)、エル・アマゾネンシス(L. amazonensis)、エル・ヴェネズエレンシス(L. venezuelensis)、エル・トロピカ(L. tropica)、エル・メジャー(L. major)、エル・アエチピカ(L. aethiopica)、エル・スブゲヌス・ビアンニア・ブラジリエンシス(L. (subgenus Viannia) braziliensis)、エル・(ヴィ)グヤネンシス(L. (V.) guyanensis)、エル・(ヴィ) パナメンシス(L. (V.) panamensis)およびエル・(ヴィ) ペルビアーナ(L. (V.) peruviana)、トリパノソーマ・クルジ(Trypanosoma cruzi)、ティー・ブルセリローデシエンス(T. brucei rhodesiense)およびティー・ブルセイガンビエンス(T. brucei gambiense)などのオイグレノゾーンス、ならびにアカントメーバ(Acanthamoeba spp.)、バラムチア・マンドリラリス(Balamuthia mandrillaris)、およびエンタモエバ・ヒストリチカ(Entamoeba histolytica) などのアモエボゾーンス種、およびランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)などのディプロモナド(diplomonads)の種、二核アメーバ(Dientamoeba fragilis)および膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)などのトリコモナドの種、ネグレリア・フォウレリ(Naegleria fowleri)などの原生生物、ブラストシスティス・ホモニス(Blastocystis hominis)などのストラメノピレス(stramenopiles)の種、広東住血線虫(Angiostrongylus cantonensis)、エイ・コスタリセンシス(A. costaricensis )、アニサキス・シンプレックス(Anisakis simplex)、プソイドテラノバ・デシピエンス(Pseudoterranova decipiens)、アスカリス・ルンブリコイデス( Ascaris lumbricoides )、アスカリス・エスピーピー(Ascaris spp.)、バイリスアスカリス・プロコニス(Baylisascaris proconyis)、フィリピン毛頭虫(Capillaria phillipinensis)、肝毛頭虫(C. hepatica )、シー・エーロフィラ(C. aerophila)、メジナ虫(Dracunculus medicinensis)、マレー糸状虫(Brugia malayi)、ビー・チモリ(B. timori)、イヌ糸状虫・エスピーピー(Dirofilaria spp)、ロア糸状虫(Loa loa)、マンソネラ・オザルディ(Mansonella ozzardi)、エム・ペルスタンス(M. perstans)、エム・ストレプトセルカ(M. streptocerca)、ブケリア・バンクロフティ(Wucheria bancrofti)、エンテロビウス・ウェルミキュラリス(Enterobius vermicularis)、イー・グレゴリー(E. gregorii)、有棘顎口虫(Gnathostoma spinigerum)、ジー・ヒピデュム(G. hipidum)、アンシクロストーマ・デュオデナレ(Ancylostoma duodenale)、セイロン鉤虫(A. ceylanicum)、ブラジル鉤虫(A braziliense)、イヌ鉤虫(A. caninum)、ウンシナリア・ステノセファラ(Uncinaria stenocephala)、アメリカ鉤虫(Necator americanus)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、糞線虫(Strongyloides stercoralis)、エス・フエレボルニ(S. fuelleborni)、トキソカラ・カニス(Toxocara canis)、ティー・カティ(T. cati)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、ティー・プソイドスピラリス(T. pseudospiralis)、ティー・ナティバ(T. nativa)、ティー・ネルソニ(T. nelsoni)、ティー・ブリトヴィ(T. britovi)、およびトリクリス・トリキウラ(Trichuris trichiura)などの線虫種の種々のライフステージ、肝ジストマ(Clonorchis sinensis)、広節裂頭条虫(Diphyllobothrium latum)、ディー・パシフィクム(D. pacificum)、ディー・クロダトュム(D. crodatum)、ディー・ウルシ(D. ursi)、ディー・デンドリティクム(D. dendriticum)、ディー・ランセオラトゥム(D. lanceolatum)、ディー・ダリエ(D. dalliae)、ヨナゴエンシス(D. yonagoensis)、ウリザネ条虫(Dipylidium caninum)、多包条虫(Echinococcus multilocularis)、肝蛭(Fasciola hepatica)、エフ・ギガントゥス(F. gigantus)、ファシオロプシス・ブスキ(Faciolopsis buski)、異形吸虫(Heterophyes heterophyes)、ヒメノレプシス・ナナ(Hymenolepis nana)、横川吸虫(Metagonimus yokogawai)、ネコ肝吸虫(Opisthorchis viverrini)、ネコ肝吸虫(O. felineus)、ヴェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani)、エスピーピー・肺吸虫(Paragonimus spp)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、 エジプト住血吸虫(S. haematobium)、日本住血吸虫(S. japonicum)、エス・メコンギ(S. mekongi)、ビルハルツ住血吸虫(S. intercalatum)、ならびに有鉤条虫(Taenia solium)およびエスピーピー・テニア(Taenia spp)などの扁形動物の種の種々のライフステージに見られるものが挙げられる。
【００４５】
標的化配列は、標的部分の上記の非限定的例のいずれかに対して結合親和性を有する任意の配列を含むことができる。標的化配列のいくつかの非限定的例としては、レクチンドメイン（例えば、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ））、抗体配列およびそれらの抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’など）、または特定の炭水化物、脂質、および／またはタンパク質に対して結合親和性を示す他の代替スカフォード構造が挙げられる。
【００４６】
一定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）の結合特性およびＭＢＬの補体固定特性を利用する。カルシウム依存性レクチン（Ｃ型レクチン）は、マクロファージ、Ｂリンパ球ならびにＴリンパ球、肥満細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの多数の細胞型に発現する。マクロファージレクチンタンパク質は、外来細胞および病原体の認識および破壊に種々の機能を果たす。グラム陽性菌およびグラム陰性菌は、Ｃ型レクチンと相互作用することが示されている［Athamnaら、Infect Immun.59：1673（1991）；Shimaokaら、J.Immunol.166(8):5108頁（2001年）］。ヒトマクロファージＣ型レクチンは、よく知られたヒト癌関連エピトープであるＴｎ Ａｇを認識することが分かっている［Suzkiら、J.Immunol 156：128頁（1996年）］。さらに、マウスマクロファージＣ型レクチンの組換え細胞基質炭水化物結合ドメインもまた、細胞障害活性の阻害剤として働き、レクチンはマクロファージ殺腫瘍性応答の直接的な伝達物質であることを示している［Imaiら、J Immunol Methods 171：23頁（1994年）］。ユニークなマクロファージレクチンは、一定の異常細胞または疾患細胞によって発現された表面抗原と特異的に相互作用し得る。レクチンはマクロファージを異常細胞または疾患細胞に対して方向付けることができる。Ｃ型レクチンはそれらの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）におけるアミノ酸配列類似性を示し、カルシウム依存性様式で選択された炭水化物に結合する糖タンパク質である。Ｃ型レクチンは４つの一般的なカテゴリーに分類できる［Vastaら、Ann N Y Acad Sci.、712：55-73頁（1994年）；Spiess、Biochemistry、29：10009-10018頁（1990年）］。第１のカテゴリーは、アシアロ糖タンパク質受容体、マクロファージガラクトースおよびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）特異的レクチン、およびＣＤ２３（Ｆｃ−εＲＩＩ）などのＩＩ型膜組込みタンパク質を含む。この群の多くのメンバーがガラクトース／フコース残基、ガラクトサミン／ＧａｌＮａｃ残基またはＧｌｃＮａｃ残基に対して特異性を示す。第２のカテゴリーは、軟骨および線維芽プロテオグリカンコアタンパク質を含む。第３のカテゴリーは、ＭＢＰなどのコレクチン類、肺表面活性タンパク質ＳＰ−Ａ、およびコングルチニンを含む。第４の群は、ＬＥＣ−ＣＡＭｓ（例えば、Ｍｅｌ−１４、ＧＭＰ−１４０、およびＥＬＡＭ−１）として知られている一定の接着分子を含む。
【００４７】
Ｃ型レクチンは、アグルチニン、オプソニン、補体アクチベーター、および細胞結合認識分子として機能することが知られている［Vastaら、Ann N Y Acad Sci.、712：55-73頁、1994年；Spiess、Biochemistry、29：10009-10018頁、1990年；Kery、Int J Biochem.、23（7-8）：631-40頁、1991年］。例えば、マクロファージマンノース受容体は、スカベンジャー機能を果たす（Shepherdら、Am J Respir Cell Mol Biol.、2（4）：335-40頁、1990年）と共に、ニューモシスティスカリニ（Pneumocystis carinii）［Ezekowitzら、Nature、351（6322）：155-8頁、1991年］およびカンジダアルビカンス（Candida albicans）（Ezekowitzら、J Exp Med.、172（6）：1785-94頁、（1990年）などの病原体生物の取込みを媒介する。したがって、Ｃ型レクチンは、生物学的に重要な多様な機能を示し、特定の細胞型および病原体などの特定の標的部分に対して望ましい結合特性を有する。
【００４８】
任意のタイプの機能的ＣＴＬＤを本発明の融合タンパク質における第２のポリペプチドとして使用することができる。一実施形態において、標的化配列は、例えばルイス抗原などの腫瘍細胞の表面上の部分を標的にする配列を含む。さらなる実施形態において、標的化配列は、ルイス抗原に結合するＤＣ−Ｓｉｇｎ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン）、またはその機能的断片または変異体を含む。
【００４９】
一態様において、本発明は、ＭＢＬの融合タンパク質、標的化配列およびテトラネクチン三量体化ドメインに関する。本発明により、標的化配列は、テトラネクチン三量体化ドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基に結合することができる。種々の実施形態において、標的化配列がＮ末端またはＣ末端に結合し、エフェクター機能を有するＭＢＬポリペプチドが他方の末端に結合する。
【００５０】
ペプチド結合を介して末端に結合する他に、非相同的標的化配列は、他の技法によりＭＢＬ複合体に結合する。例えば、側鎖に対するペプチド結合を介して、またはシステイン残基に対する結合を介してである。しかしながら、ポリペプチド鎖に対する非相同的材料を共有結合させる任意の方法が有用である。当業者は、例えば、これに関して、参照として本明細書に援用してある国際公開第９５／３１５４０号パンフレットの教示を参考にすることにより、このような可能性を知るであろう。
【００５１】
別の態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質を、哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の補体系を活性化する方法を提供する。
【００５２】
一態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
一態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに病原体の細胞表面受容体である標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質またはその医薬組成物を、病原性疾患に罹っている患者に投与することを含む、病原性疾患を治療する方法を提供する。
【００５４】
一態様において、本発明は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含み、エフェクター機能を有する第一のポリペプチド、ならびに腫瘍細胞の表面上の受容体である標的部分に結合する配列を含む第二のポリペプチドを含む融合タンパク質またはその医薬組成物を、腫瘍細胞を含む増殖性疾患の治療を必要とする患者に投与することを含む、腫瘍細胞を含む増殖性疾患を治療する方法を提供する。一実施形態において、腫瘍細胞の表面上の受容体はルイス抗原を含む。さらなる実施形態において、第二のポリペプチドは、ルイス抗原に結合するＤＣ−Ｓｉｇｎ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン）、またはその機能的断片または変異体を含む。
【００５５】
コンセプトの実証として、本発明の非限定的な実施形態を実施例において詳細に記載してあるが、ここで標的化配列は、Ｃ型レクチンファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質であるＤＣ−Ｓｉｇｎを含む。このタンパク質は、末梢の樹状細胞（ＤＣ）の表面上に発現し、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３を介して、抗原提示細胞とリンパ系における静止Ｔ細胞との間の一次的接触に関与する。ＤＣ−Ｓｉｇｎはまた、リンパ組織へのＤＣの移動の間、上皮細胞上のＩＣＡＭ−２と相互作用する。ＤＣ−Ｓｉｇｎはまた、ＨＩＶのエンベロープタンパク質ｇｐ１２０に強く結合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のトランスでのウイルス感染を促進する。ＤＣ−Ｓｉｇｎタンパク質は、短いアミノ末端細胞質尾部、膜貫通ドメイン、７１／２反復までの幹状部、引き続きＣ末端Ｃ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）からなる。幹状部は四量体（多重コイル）の形成を促進する。
【００５６】
血液型関連ルイス腫瘍抗原（例えば、ＬｅｘおよびＬｅｙ）は、上皮起源のヒト癌の大多数に発現する。ルイス抗原は、複合オリゴ糖であり、双方とも細胞膜に埋め込まれ、細胞表面タンパク質（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２およびＣＥＡ）に結合した糖脂質として見られ、正常な組織上での発現は限られている。ルイス抗原は、樹状細胞接着および腫瘍細胞浸潤を媒介することが示されている。ルイスＹは、樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体と相互作用し、免疫抑制の促進により免疫監視を免れる。したがって、ルイス抗原は、本発明の融合タンパク質を含む第二のポリペプチドに関する標的部分の非限定的例を提供する。ペプチドならびにヒトＭＢＬのペプチドをコードする対応するＣ−ＤＮＡ配列はそれぞれ、図１および配列リストに示されている。
【００５７】
一定の実施形態において、本発明は、一定のルイス抗原に結合するＤＣ−ＳＩＧＮの能力と補体系を活性化するＭＢＰの能力とをユニークに組み合わせる融合タンパク質として、ＭＢＬポリペプチドとＤＣ−ＳＩＧＮとの組合せを提供する。さらに、ＭＢＰネック領域とＤＣ−ＳＩＧＮ四量体化ドメイン（双方ともらせん状コイル−コイル構造）との慎重な比較により、同様な構造を有する領域であることが確認された。らせん周期を保存することにより、多数の異なる非限定的ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質が設計され、下記の実施例に記載されている。
【００５８】
本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質は、結合活性獲得を劇的に高める高次の多量体化（すなわち、多数の受容体を発現している細胞に対する結合強度を高める）を有し、これによって、癌細胞を特異的に標的にしている治療的分子の効果が高まり、副作用の危険性が減少する。一実施形態において、この融合タンパク質はまた、癌細胞と樹状細胞との間の相互作用（この相互作用により免疫監視から免れることになる）をブロックでき、ルイス抗原媒介接着および腫瘍細胞浸潤をブロックできる。さらなる一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、補体活性化および／または単球と好中球による取込みにより標的細胞の死滅を媒介する利点を有し得る。
【００５９】
本発明はまた、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号２）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号４）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号６）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号８）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号１０）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ（配列番号１２）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１４）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１６）およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１８）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号２０）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２２）、およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２６）およびＭＢＰ／ＤＣ−Ｓｉｇｎ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２８）から選択される融合タンパク質など、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質を提供する。
【００６０】
一定の実施形態において、本発明の融合タンパク質はさらに、第三のポリペプチド、すなわち、第三の融合パートナーに結合させることができる。このような第三の融合パートナーを、本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質に加えることによって、高収率のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質を得ることができると考えられる。本発明による第三の融合パートナーは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドおよびヘキサペプチドなど、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であるという条件で任意の好適な種類であり得る。一定の実施形態において、第三の融合パートナーは、単一のアミノ酸であり得る。また、この融合タンパク質を、タンパク質分解による劣化に対してより抵抗性にし、融合タンパク質の発現および分泌の増強を促進し、溶解性を改善し、および／または引き続く融合タンパク質のアフィニティー精製を可能にするように第三の融合パートナーを選択することができる。
【００６１】
一定の実施形態において、本発明の融合タンパク質とユビキチンなどの第三の融合パートナーとの間の接合領域は、ヒトグランザイムＢ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．７９）などのグランザイムＢプロテアーゼ開裂を含む。融合タンパク質の開裂剤としてのグランザイムＢの使用に関するより詳細な情報は、各々が参照として本明細書に援用されている米国特許出願公開第２００６／０１９９２５１号明細書または国際公開第２００４／０９４４７８号パンフレットに見ることができる。
【００６２】
さらなる実施形態において、第三の融合パートナーを、アフィニティータグに結合させることができるか、またはそれ自体がアフィニティータグとなり得る。このようなアフィニティータグは、アフィニティー樹脂上で融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティードメインを含むことができる。アフィニティータグは、ヘキサヒス−タグを含むポリヒスチジン−タグ、ポリアルギニン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、もしくはマルトース結合タンパク質、または当業者に知られている任意の他のアフィニティータグであり得る。
【００６３】
さらなる実施形態において、第三の融合パートナーは、融合タンパク質の半減期を増加させる（延長させる）ことによって融合タンパク質を安定にする分子を含むことができる。タンパク質などの生体分子の半減期を延長し得る分子は、当業者により知られており、例えば、ＢＳＡ結合ペプチド、種々のポリオール類（例えばＰＥＧ類）、ＩｇＧ結合ペプチドまたはＦｃＲｎもしくはＦｃ抗体断片に結合するペプチドが挙げられる。
【００６４】
一定の実施形態において、本発明の方法は、例えば、上記のアフィニティータグシステムの使用により固定化された融合タンパク質の酵素的開裂によって形成される本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質を単離するための単離ステップを含むことができる。この単離ステップは、イオン交換およびサイズによる分画の使用など、タンパク質単離のため当業界に知られている任意の好適な手段により実施することができ、その選択は融合タンパク質の性質に依る。一実施形態において、第三の融合パートナーと、ＭＢＬポリペプチドならびにＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチドを含む領域との間の領域を、ヒトセリンプロテアーゼグランザイムＢと接触させてグランザイムＢプロテアーゼ開裂部位において融合タンパク質を開裂し、本発明の融合タンパク質を得る。
【００６５】
さらに本発明は、本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質をコードする単離核酸を提供する。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。より具体的には、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列など、本発明によるＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質をコードする単離核酸が提供される。
【００６６】
本発明はまた、プラスミド、ベクター、上記の少なくとも１種の核酸を含む転写カセットまたは発現カセットの形態で核酸構築体を提供する。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の適切な配列など、適切な制御配列を含有する好適なベクターを選択できるか、または構築することができる。ベクターは、適宜プラスミド、ウイルス例えばファージ、またはファージミドであり得る。さらなる詳細に関しては、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 第二版、Sambrookら、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【００６７】
本発明はまた、上記の１つまたは複数の構築体を含む組換え宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞としては、細菌系、哺乳動物細胞系、酵母系およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現に関して当業界に利用できる哺乳動物の細胞系としては、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスターの腎細胞、ＮＳＯマウスの黒色腫細胞、および他の多くのものが挙げられる。一実施形態において、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。
【００６８】
本発明のポリペプチド類の治療適用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨髄癌および上皮癌などの癌疾患の治療のためのＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質の使用を含む。
【００６９】
ＨＥＲ２（Ｅｒｂ Ｂ２）に選択的に結合するHERCEPTIN（登録商標）（トラスツズマブ）は、癌細胞上のルイス抗原によりグリコシル化されたＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍のうち、乳癌の治療に承認されている。ＨＥＲ２上のルイス抗原の標的化は、HERCEPTIN（登録商標）の結合を妨害しないため、本発明の融合タンパク質とＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）との組合せは、相乗的治療効果を有することが期待される。他の治療剤としては、リツキシマブなどのモノクローナル抗体、ＶＥＧＦまたはＥＧＦＲ標的化剤、キナーゼ阻害剤、免疫刺激薬、および癌ワクチンが挙げられる。
【００７０】
化学療法薬は通常、５−フルオロウラシル、マイトマイシン−Ｃ、オキサリプラチンおよびラルチトレキセドなど、大腸癌の治療に用いられる。このような化合物は、ルイスＹ発現を増強すると報告されていることは、本発明の融合タンパク質によるルイス抗原の標的化が、一連の化学療法剤と相乗的に作用し得ることを示している。
【００７１】
したがって、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質の投与は、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ならびにラルチトレキセド、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル、イリノテカンならびにシスプラチン、マイトマイシン−Ｃおよびオキサリプラチンのなどの化学療法剤など、少なくとも１つのさらなる治療剤の投与を含むことができる。
【００７２】
治療方法
本発明の別の態様は、免疫細胞、病原細胞、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に関連した疾患を治療する方法に関する。この方法は、細胞と本発明の融合タンパク質とを接触させることを含む。
【００７３】
本発明の別の態様は、併用療法に関する。融合タンパク質と治療剤とを含む製剤もまた、本発明によって提供される。このような製剤は、貯蔵ならびに治療的投与に関して特に好適であると考えられる。これらの製剤は、既知の技法により調製することができる。例えば、これらの製剤は、ゲルろ過カラム上で緩衝液の交換により調製することができる。
【００７４】
融合タンパク質および治療剤は、ボーラスとしての静脈内投与、またはある期間に亘る連続注入、筋内、腹腔内、脳脊髄内、動脈内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によるなど、既知の方法に従って投与することができる。場合によっては、種々の市販の装置を用いてミニポンプを介して投与を実施することができる。
【００７５】
融合タンパク質を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定は当業界の技術の範囲内である。単回投与または複数回投与を使用することができる。現在、単独で使用される融合タンパク質の有効投与または有効量は、１日当り約１μｇ／ｋｇ体重から約１００μｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲であり得ると考えられている。種間の投与基準化は、例えば、Mordentiら、Pharmaceut. Res.、8:1351（1991）に開示されているように、当業界に知られた様式で実施することができる。
【００７６】
融合タンパク質のインビボ投与を使用する場合、通常の投与量は、投与経路に依って１日当り約１０μｇ／ｋｇ体重から約１００μｇ／ｋｇ体重またはそれ以上、好ましくは、約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日と変わり得る。具体的な投与量および送達方法に関するガイダンスは、文献［例えば、米国特許第４，６５７，７６０号明細書；米国特許第５，２０６，３４４号明細書；または米国特許第５，２２５，２１２号明細書を参照］に提供されている。種々の製剤が、種々の治療用化合物および種々の障害にとって有効であること、１つの臓器または組織を標的とする投与は、例えば、別の臓器または組織とは異なる様式での送達が必要であり得ることを当業者は認識されるであろう。投与の必要がある融合タンパク質の投与量が、例えば、融合タンパク質のアゴニストを受ける哺乳動物、投与経路、および哺乳動物に投与される他の薬物または療法に依って変わり得ることを当業者は理解するであろう。
【００７７】
これらの方法の中で、さらに追加の療法を使用し得ることが考えられる。１つまたは複数の他の療法としては、限定はしないが、放射線療法、サイトカイン、増殖阻害剤、化学療法剤、細胞毒性剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、およびシクリン依存キナーゼ阻害剤または融合タンパク質による治療に対する癌細胞の感受性を増強する任意の他の薬剤の投与を挙げることができる。
【００７８】
化学療法剤に関する調製および投与スケジュールは、製造元の取扱説明書に従って、または当業者によって経験的に判定されて使用することができる。このような化学療法に関する調製および投与スケジュールは、Chemotherapy Service Ed.、M. C. Perry、Williams & Wilkins、Baltimore、Md.（1992）にも記載されている。化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与前、もしくは投与後、またはそれと同時に投与することができる。
【００７９】
融合タンパク質と治療剤（および１つまたは複数の他の療法）とは、並行して（同時に）または連続的に投与することができる。具体的実施形態において、融合タンパク質と治療剤とを並行して投与する。別の実施形態において、融合タンパク質またはトリマー複合体を、治療剤の投与前に投与する。別の実施形態において、治療剤を、融合タンパク質またはトリマー複合体の投与前に投与する。投与後、インビトロ処置細胞を分析することができる。インビボ処置された場合、処置哺乳動物を、当業者によく知られた種々の方法でモニターすることができる。例えば、腫瘍組織を病理学的に調べて細胞死を評価することができるか、または免疫系応答に関して血清を分析することができる。
【００８０】
医薬組成物
医薬組成物を調製するために、当業界によく知られた任意の好適な方法により本発明による融合タンパク質を使用することができる。それ故、この組成物は、融合タンパク質と共に、１つまたは複数の許容できる担体、場合によっては他の治療剤および／または化学療法剤の成分を含むことができる。したがって、本発明は、薬学的に許容できる担体または賦形剤と共に本発明の融合タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物に関する。本明細書に用いられる「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」としては、生理学的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤ならびに抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容できる担体または賦形剤としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１種または複数種、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に等張剤、糖類、例えば、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。湿潤剤などの薬学的に許容できる物質、または有効期間または抗体もしくは抗体部分の有効性を増強させる湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝液などの少量の補助物質もまた含むことができる。場合によっては、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩としてアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を含むことができる。賦形剤に加えて、医薬組成物は、血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝液、結合剤、甘味剤および他の香味剤；着色剤およびポリエチレングリコールのうちの１種または複数種を含むことができる。
【００８１】
これらの組成物は、例えば、液体溶液（例えば、注射液および輸液）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび座剤などの液体、半固体および固体の投与形態など、種々の形態であり得る。好ましい形態は、意図された投与経路および療法適用に依存する。一実施形態において、この組成物は、抗体によりヒトの受動免疫化に用いられたものと同様の組成物など、注射液または輸液の形態である。一実施形態において、投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。一実施形態において、融合タンパク質（またはトリマー複合体）を、静脈内注入または静脈内注射により投与する。別の実施形態において、融合タンパク質またはトリマー複合体を、筋内注射または皮下注射により投与する。
【００８２】
この医薬組成物用の他の好適な投与経路としては、限定はしないが、直腸投与、経皮投与、膣投与、経粘膜投与または腸管投与が挙げられる。
【００８３】
治療組成物は、一般に無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定である。この組成物は、液剤、ミクロ乳剤、分散剤、リポソーム、または薬物高濃度に好適な他の秩序構造として製剤化できる。無菌注射液は、必要ならば上記に挙げた成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中、必要な量の活性化合物（すなわち、融合タンパク質またはトリマー複合体）を組み込み、次いでろ過滅菌により調製する。一般に、分散剤は、ベースの分散媒体および上記に掲げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体中に活性化合物を組み込むことにより調製する。滅菌注射液調製用の滅菌散剤の場合、好ましい調製法は、活性成分プラス予め滅菌ろ過した溶液から所望の任意の追加成分の粉末を生じる減圧乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散剤の場合は、求められる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。注射用組成物の吸収持続性は、組成物中に吸収を遅延させる試剤、例えば、モノステアリン酸塩類およびゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【００８４】
本明細書に記載された障害の治療に有用な融合タンパク質および治療剤を含有するキットなどの製造品は、少なくとも容器およびラベルを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど種々の材料から形成することができる。容器上のまたは容器と合体したラベルは、その製剤が選択された病態を治療するために使用されることを示している。製造品はさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース液などの薬学的に許容できる緩衝液を含む容器を含むことができる。製造品はさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を添えた添付文書など、商品および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができる。製造品はまた、上記の別の活性剤を有する容器を含むことができる。
【００８５】
一般に、製剤中に薬学的に許容できる適量の塩を用いて製剤を等張にする。薬学的に許容できる担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース液が挙げられる。製剤のｐＨは、約６から約９が好ましく、約７から約７．５であることがより好ましい。一定の担体が、例えば、投与経路および融合タンパク質および治療剤の濃度に依ってより好ましくなり得ることが当業者にとって明らかとなろう。
【００８６】
治療組成物は、凍結乾燥製剤、水溶液または水性懸濁液の形態で、任意の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤［Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.編集（1980）］と適切な純度を有する所望の分子とを混合することにより調製することができる。許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であることが好ましく、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；および／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００８７】
このような担体のさらなる例としては、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩類などの緩衝液物質、またはプロタミン硫酸流塩、燐酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイド状シリカ、トリ珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、およびセルロースベース物質などの電解質が挙げられる。局所形態またはゲルベース形態用の担体としては、カルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート類、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー類、ポリエチレングリコール、および木材ワックスアルコール類が挙げられる。全ての投与で、従来のデポー形態が好適に使用される。このような形態としては、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入形態、鼻用スプレー、舌下錠、および徐放性製剤が挙げられる。
【００８８】
インビボ投与のために用いられる製剤は、無菌である必要がある。これは、凍結乾燥および再構成の前か、後に無菌ろ過膜を通すろ過により容易に達成される。この製剤は、全身に投与される場合、凍結乾燥形態または溶液で貯蔵することができる。凍結乾燥形態である場合、一般に、使用時に適切な希釈剤による再構成のために他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の例は、皮下注射のために単回投与用バイアルに充填される滅菌の無色透明の生鮮溶液である。
【００８９】
治療用製剤は一般に、無菌アクセスポート、例えば、皮下注射用針により貫通可能なストッパーを有する静脈液用バッグまたはバイアルを有する容器内に入れる。反復静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋内（ｉ．ｍ．）の注射もしくは注入として、または鼻腔内もしくは肺内送達（肺内送達に関して、例えば、欧州特許第２５７，９５６号明細書を参照）に好適なエーロゾル製剤として製剤を投与することが好ましい。
【００９０】
本明細書に開示された分子は、徐放性製剤の形態でも投与できる。徐放性製剤の好適な例としては、マトリックスが造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマー類の半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、Langerら、J. Biomed. Mater. Res.、15: 167-277 (1981)およびLanger、Chem. Tech., 12: 98-105（1982）により記載されたポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー類（Sidmanら、Biopolymers、22: 547-556（1983））、 非分解性エチレン−ビニルアセテート（Langerら、上記）、Lupron Depot（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）が挙げられる。
【００９１】
融合タンパク質の製造
融合タンパク質を発現するような条件下、融合タンパク質をコードするベクターによって形質転換した宿主を培養することにより、任意の好適な標準タンパク質発現系において本発明の融合タンパク質を発現させることができる。この発現系は、所望のタンパク質が容易に単離でき、インビトロでリフォールディングできる系であることが好ましい。一般的には、原核生物の発現系が高収率のタンパク質を得ることができ、効率的な精製およびリフォールディングの方式を利用できることから好ましい。したがって、適切な発現系（ベクターや細胞型など）の選択は、当業者の知識の範囲内にある。同様に、本発明の融合タンパク質に関する一次アミノ酸配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ開裂部位の導入などの因子を考慮して、所望のアミノ酸配列をコードする適切な組換えＤＮＡ構築体を容易に設計することができる。
【００９２】
本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質の発現は、適切な条件下、核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することにより簡便に達成できる。したがって、適切または最適の発現系を選択することは、過度の実験をすることなく十分に当業者の能力および裁量の範囲内にある。同様に、本発明のポリペプチドに関する一次アミノ酸配列が選択されたら、当業者は、選択された宿主におけるコドンバイアス、宿主における分泌シグナル配列の必要性、シグナル配列内のプロテイナーゼ開裂部位の導入などの因子を考慮して、所望のタンパク質をコードする組換えＤＮＡ構築体などの適切なポリヌクレオチドを容易に設計することができる。これらの組換えＤＮＡ構築体を、選択された宿主に適切な多数の発現ベクターのうちのいずれかにフレーム内挿入をすることができる。適切または最適の発現ベクターの選択もまた、十分に当業者の能力および裁量の範囲内にある事項である。一定の実施形態において、発現ベクターは、組換え構築体の発現を駆動する強力なプロモーターを含む。
【００９３】
一実施形態において、本発明のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合タンパク質は、当業界によく知られた好適な標準的手法を用いて単離することができ、場合によっては、例えば、凍結乾燥などのさらなる処理に供することができる。
【００９４】
一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、融合タンパク質を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、エフェクター機能を有するＭＢＬポリペプチドおよび標的化配列を含む第二のポリペプチドをコードする。一定の実施形態において、ポリペプチドは単一の隣接ポリヌクレオチド配列（遺伝子融合）にコードされる。他の実施形態において、ポリペプチドは、非隣接ポリヌクレオチド配列によりコードされる。したがって、幾つかの実施形態において、ポリペプチドを発現させ、単離し、別個のポリペプチドとして精製し、共に融合させて本発明の融合タンパク質を形成する。
【００９５】
これらの組換えＤＮＡ構築体を、選択された宿主に適切な多数の発現ベクターのうちのいずれかにフレーム内挿入をすることができる。一定の実施形態において、発現ベクターは、組換え融合タンパク質構築体の発現を調節する強力なプロモーターを含む。組換え発現方式を用いて本発明の融合タンパク質を生成する場合、得られた融合タンパク質を、当業界によく知られた好適な標準的手法を用いて単離および精製することができ、場合によっては、例えば、凍結乾燥などのさらなる処理に供することができる。
【００９６】
組換えＤＮＡ分子、タンパク質、および融合タンパク質の製造、ならびに組織培養および細胞の形質変換には標準的技法を使用することができる。例えば、Sambrookら、（下記）またはCurrent Protocols in Molecular Biology［Ausubelら、編集者、Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994年］を参照されたい。精製技法は一般に、製造元の仕様書に従うか、または、Sambrookら［Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY（1989）］に記載されたものなどの従来の手法を用いて当業界で一般に達成されたとおりに、または本明細書に記載されたとおりに実施する。特定の定義が与えられない限り、本明細書に記載された実験室の手法と関連して利用される命名法、分子生物学、生化学、分析化学、および医薬化学／製剤化学に関連する技法は、当業界によく知られ、一般に使用されるものである。生化学的合成、生化学的分析、医薬製剤、製剤、および送達、ならびに患者の治療には標準的技法を使用することができる。
【００９７】
融合タンパク質の第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間に、可撓性分子リンカーを任意に挿入し、共有結合できることは認識されるであろう。一定の実施形態において、このリンカーは、約１〜２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列を含む。このリンカーは、１０未満のアミノ酸であり得、最も好ましくは、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つであり得る。一定の場合において、９つ、８つ、７つまたは６つのアミノ酸が好適であると考えられる。幾つかの実施形態において、このリンカーは、本質的に非免疫原性であり、タンパク質分解開裂の傾向がなく、他の残基（例えば、システイン残基）と相互作用することが知られているアミノ酸残基を含まない。
【００９８】
下記の説明はまた、１つまたは複数の化学基に共有結合（以後「共役」）している融合タンパク質およびトリマー複合体を作製する方法に関する。このような共役体における使用に好適な化学基は、有意に毒性でないか、または免疫原性でないことが好ましい。貯蔵に好適な条件下で貯蔵し、使用できる共役体を作製するために、化学基は任意に選択される。ポリペプチドに共役することができる種々の代表的な化学基は当業界に知られており、例えば、炭水化物、糖タンパク質、ポリグルタメート、ポリオール類などの非タンパク質ポリマー上で天然に生じる炭水化物などが含まれる（例えば、米国特許第６，２４５，９０１号明細書を参照）。
【００９９】
例えば、国際公開第９３／００１０９号パンフレットに開示されているように、ポリオールを、リシン残基など１つまたは複数のアミノ酸残基において本発明の融合タンパク質に共役させることができる。使用されるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖または分枝鎖を有することができる。好適なポリオール類としては、１つまたは複数のヒドロキシル位置で、１個と４個の間の炭素を有するアルキル基などの化学基により置換されたものが挙げられる。一般に、ポリオールは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であり、したがって、説明を簡便にするため、残りの検討部分は、その中で使用されるポリオールはＰＥＧ（ペグ）であり、ポリペプチドにポリオールを結合させる工程は「ペグ化（pegylation）」と称される代表的な実施形態に関するものである。しかしながら、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレンポリプロピレングリコールコポリマーなどの他のポリオール類が、ＰＥＧに関して本明細書に記載された結合技法を用いて使用できることを当業者は認識している。
【０１００】
ペグ化に使用されるＰＥＧの平均分子量を変えることができ、一般に約５００ダルトン（Ｄ）から約３０，０００ダルトンの範囲である。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約１，０００Ｄから約２５，０００Ｄであり、より好ましくは、約１，０００Ｄから約５，０００Ｄである。場合によっては、ＰＥＧホモポリマーは非置換であるが、一端をアルキル基によって置換してもよい。アルキル基は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基であり、最も好ましくは、メチル基である。ＰＥＧ製剤は、商品として入手でき、一般に、本発明の使用に好適なこれらのＰＥＧ製剤は、平均分子量によって販売される非均質性製剤である。例えば、一般に商品として入手できるＰＥＧ（５０００）製剤は、通常分子量が±５００Ｄと僅かに分子量に変化がある分子を含有する。本発明の融合タンパク質は、小型分子化合物（例えば、化学療法剤）に対する共役；シグナル分子（例えば、蛍光体）に対する共役；特異的結合対の分子（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／抗原）に対する共役；またはグリコシル化、ＰＥＧ化、または安定性ドメインに対するさらなる融合（例えば、Ｆｃドメイン）による安定化など、当業界に知られている技法を用いてさらに修飾することができる。
【０１０１】
タンパク質をペグ化する種々の方法が、当業界に知られている。ＰＥＧに共役したタンパク質を製造する具体的方法としては、米国特許第４，１７９，３３７号明細書、米国特許第４，９３５，４６５号明細書および米国特許第５，８４９，５３５号明細書に記載された方法が挙げられる。一般にタンパク質は、主として反応条件、ポリマーの分子量などに依って、本発明の１つまたは複数のアミノ酸残基を介してポリマー上の末端反応性基に共有結合する。反応性基を有するポリマーは、本明細書において活性化ポリマーと称される。この反応性基は、タンパク質上の遊離アミノ基または他の反応性基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは、無作為または部位特異的様式でタンパク質上のアミノ基または他の反応性基に結合することができる。しかしながら、当然のことながら、最適な結果を得るために選択される反応性基のタイプと量、ならびに使用されるポリマータイプは、反応性基がタンパク質上の特に多過ぎる活性基と反応することを回避するために使用される具体的なタンパク質またはタンパク質変異体に依存する。このことは、完全に回避することは不可能と考えられるので、タンパク質の濃度に依って一般にタンパク質１分子当り約０．１モルから１０００モル、好ましくは、２モルから２００モルの活性化ポリマーを用いることが推奨される。タンパク質１モル当りの活性化ポリマーの最終量は、可能であるならば、最適活性を維持すると同時にタンパク質の循環半減期を最適にするための釣合いである。
【０１０２】
さらに、他の半減期延長分子を、血清アルブミン結合ペプチド、ＩｇＧ結合ペプチドまたはＦｃＲｎに結合するペプチドなど、ＭＢＬポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に結合することができる。
【０１０３】
本明細書における節の見出しは、構成のみを目的として使用されており、決して記述された主題を限定するものとして解釈すべきでないことに注意する必要がある。本明細書に引用された全ての参考文献は、全ての目的のために参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。
【０１０４】
以下の実施例は、本発明の一定の実施形態を単に例示するものであり、添付された請求項により規定される本発明を限定するものとしてとらえてはならない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：タグ化および非タグ化ＭＢＰ−ＣＤ２０９ＣＴＬＤ融合タンパク質の発現プラスミドクローンのＨＥＫ２９３細胞における構築と発現
ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン）は、Ｃ型レクチンファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。このタンパク質は、末梢における樹状細胞（ＤＣ）の表面上に発現し、Ｔ細胞上のＩＣＡＭ−３を介してリンパ系における抗原提示細胞と静止Ｔ細胞との間の一次接触に関与する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、リンパ系組織へのＤＣの移動時に上皮細胞上のＩＣＡＭ−２とも相互作用する。ＤＣ−ＳＩＧＮはまた、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０と強力に結合し、トランスのＣＤ４＋Ｔ細胞においてウイルス感染を促進する。ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、短いアミノ末端細胞質尾部、膜貫通ドメイン、７ １／２反復までの幹状部、次いでＣ末端のＣ型炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）からなる。この幹状部は、四量体（多重コイル）の形成を促進する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ルイス抗原ＬｅｘおよびＬｅｙなどのマンノース含有およびフコース含有複合体の糖共役体に結合する。大部分の他のレシチン類とは対照的に、ＤＣ−ＳＩＧＮは、炭水化物構造の内部に結合し、このスカフォードの可能性を増加させてより多様で特異的な炭水化物結合が得られると思われる。
【０１０６】
一連の融合構築体は、ＭＢＰシグナル配列、次いでシステニルに富むオリゴマー化ドメイン、コラーゲン反復領域を表し、種々の誘導体はＭＢＰネック領域とＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインの融合を表す。種々のＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質（ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号１）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号３）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号５）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号７）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号９）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ （配列番号１１）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１３）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１５）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１７）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号１９）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２１）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２３）ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２５）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２７））をコードする挿入体のヌクレオチド配列は、それぞれ表１に示された一連のプラスミドおよび挿入特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローン化した。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓは、Ｃ−末端切断ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインを含有し；ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣは、完全長ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインを含有し；ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥは、Ｎ−およびＣ−末端ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインを含有し；ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳは、ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤドメインのＮ−末端においてセリン−グリシン挿入体を含有する。次にこの構築体は、ＧＥＮＥＴＩＣ３７００アナライザーおよび配列決定BIG DYE（登録商標）バージョン３．０の配列決定法（Applied Biosystems）を用いて検証した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
アミノ末端にｍｙｃタグおよびＨｉｓタグで全てタグ化された融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号６）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号１０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ（配列番号１２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１６）およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号２０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２２）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２４）の全て、および２つの非タグ化融合タンパク質誘導体ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２６）ならびにＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２８）を発現できるクローンを、連続オリゴヌクレオチドアセンブリおよび市販品として入手できる発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）へのサブクローニング方式を用いて構築し、その結果、プラスミド：ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０を得た。プラスミドは、プラスミド増殖および挿入体のヌクレオチド配列検証のために大腸菌（E. coli）XL-1ブルー細胞（Stratagene）に形質転換された。
【０１０９】
ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）へのトランスヘクション用プラスミドＤＮＡを、QiagenのMAXI PREP（登録商標）マキシ調製法を用いて単離した。最初に、タグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質誘導体だけをトランスフェクトし、発現に関して分析した。リポフェクタミンプロトコル（Invitrogen）を用いて細胞をトランスフェクトした。全ての構築体を首尾よく一過性にトランスフェクトし、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合した固定化ルイス腫瘍抗原ｙ（Ｌｅｙ）またはヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３を発現するＬｅｙを結合する能力に関して４日後に培養物の上澄液を分析した。
【０１１０】
実施例２：ヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３の固定化ＨＳＡ−ＬｅｙまたはＬｅｙ発現細胞に結合する種々のタグ化ＭＢＰ−ＣＤ２０９ ＣＴＬＤ融合タンパク質の分析
タグ化ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ発現プラスミド（ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ、ｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ、およびｐＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞培養物からの上澄液を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合した固定化Ｌｅｙまたはヒト乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３を発現するＬｅｙを結合する能力に関して一過性発現の４日後に分析した。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣ融合タンパク質は、ＭＣＦ−７のヒト乳癌細胞、ＬＮＣａｐの前立腺癌細胞、およびＡ４３１の皮膚扁平上皮癌細胞に結合する能力に関しても試験した。
【０１１１】
最初のアッセイにおいて、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ）中、１ウェル当り０．５μｇのＬｅｙ−ＨＳＡ（IsoSep、Uppsala、スウェーデン国）を一晩インキュベートし、９６ウェルのＥＬＩＳＡトレイ内に固定化した。未結合のＬｅｙ−ＨＳＡを洗浄し、ブロッキング後、１００μｌの各培養物の上澄液を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合に関して分析した（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）。商品として入手できるＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ Ｆｃ融合タンパク質（R&D systems）を陽性対照として用い、抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を検出用に用い、次いで、ＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【０１１２】
融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＣｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＣｓＣ、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＤｓは、最強の結合を示し、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＤｓＣは、中間の結合を示し、残りの融合タンパク質は、結合を示さなかった（図３Ａ、３Ｃ）。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＣｓＣ融合タンパク質の結合を、商品として入手できるＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ Ｆｃ化合物の結合と比較した（図３Ｂ）。結合は、特異的であり、カルシウム依存性であることが判明した。
【０１１３】
さらなるアッセイにおいて、それぞれ１０％のウシ胎児血清および１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補足されたＭｃＣｏｙまたはＤＭＥＭ培地中、３７ｏＣで５％のＣＯ２で増殖させたＬｅｙ発現ＳＫＢＲ−３またはＭＣＦ−７細胞の半集密性培養物を、プラスチック表面からかき取り、洗浄し、１％のＢＳＡでブロックし、ＭＢＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質または精製融合タンパク質の各々を発現する培養物上澄液と共に１時間インキュベートした。慎重に洗浄後、結合した融合タンパク質の量を、懸濁相ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した（図４Ａ〜Ｃ）。商品として入手できる融合タンパク質ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｆｃ（R&D systems）を、陽性対照として含めた。抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を検出用に用い、次いで、ＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【０１１４】
ＬＮＣａｐおよびＡ４３１癌細胞系に関して、細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩおよびＤＭＥＭそれぞれの培地中、Nunclonの９６トレー中で７０％の集密性まで増殖させた。細胞の洗浄およびブロッキング後、細胞を精製ＭＢＰ−ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合タンパク質と共に１時間インキュベートした。慎重に洗浄後、結合した融合タンパク質の量を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した（図４Ａ〜Ｃ）。商品として入手できるＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｆｃ（R&D Systems）を、陽性対照として含めた。 抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を検出用に用い、次いで、ＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【０１１５】
融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣは、ＳＫＢＲ−３細胞（図４Ａ）に対し最強の結合を示し、結合は、Ｌｅｙに対して特異性であり、かつカルシウム依存性であることが立証された（図４Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞に結合する融合タンパク質ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣの評価は、図４Ｃに示している。
【０１１６】
実施例３：マンノース−アガロースのアフィニティークロマトグラフィーを用いるＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体の精製
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣ、またはＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓＣ０融合誘導体を発現する安定なクローナル細胞系およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ０融合誘導体を発現する安定な細胞系集団は、スーパーコロイドまたは線形化されたプラスミドＤＮＡ、および種々の濃度のプラスミドＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより確立された。種々の濃度での細胞の接種、およびゼオシンを用いた選択圧の増加により、安定な細胞系が得られた。幾つかのクローンを増殖させ、培養物の上澄液を、実施例２に記載された固定化Ｌｅｙ ＨＳＡ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて融合タンパク質の生成に関して分析した。安定にトランスフェクトされたクローンの上澄液からのＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体を、以下の段落で説明されるマンナン−セファロースを用いてアフィニティー精製を行った。
【０１１７】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ発現上澄液（約２．５Ｌ）をろ過し、２５０ｍＬの１０×ＴＢＳＣ−緩衝液（１×ＴＢＳＣ：１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａ２＋）を供給し、２５ｍＬのマンノース−アガロースカラム（Sigma）に４℃、０．５ｍＬ／分で適用した。適用後、カラムを、２カラム容量の１×ＴＢＳＣで洗浄し、１×ＴＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡで溶出させた。塩化カルシウムの５ｍＭを溶出タンパク質フラクションに添加し、５００容量の１×ＴＢＳＣ−緩衝液に対して透析した。タンパク質濃度を、分光分析法により測定し（Ａ２８０）、純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検証した。
【０１１８】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣの溶出プロファイルは類似していなかった（図５）。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓは、１本の鋭いピークとして溶出するが、一方、ＡＢｓＣは、２本のピーク、すなわち第一のピークが最終ピークよりも小さなピークとして溶出する。双方の溶出プロファイルは、鋭いフロントと、より長いテールを有する。
【０１１９】
２．５Ｌの培養物の上澄液から、２ｍｇの各誘導体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図６Ａ〜Ｂ）により判定された＞９０％の純度で単離された。各々の場合、融合タンパク質の濃度は、ピークフラクション中３００〜６６０μｇ／ｍＬであった。単離された誘導体のオリゴマー化プロフィールは、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的マウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を用いて３〜８％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された非還元サンプルのウェスタンブロット上で分析した（図７）。
【０１２０】
実施例４：商品として入手できる（ＤＣ−ＳＩＧＮ）２−Ｆｃ誘導体の結合と比較して、固定化Ｌｅｙ−ＨＳＡに結合するＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体の分析
R&D systemsからの二価のＤＣ−ＳＩＧＮ Ｆｃ誘導体と比較して、マイクロタイタープレート（Nunc）内のウェルに固定化されたＬｅｙ−結合ＨＳＡを用いるＥＬＩＳＡアッセイを開発して、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体の結合強度を分析した。
【０１２１】
９６ウェルのＥＬＩＳＡトレーの各ウェルに、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ）中０．５ｍｇのＬｅｙ−ＨＳＡ（IsoSep）を加え、一晩インキュベートし、固定化した。未結合Ｌｅｙ−ＨＳＡを洗浄して除き、ブロッキング後、１００マイクロリットルの１×ＴＢＳＣ中ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓ、−ＡＢｃＣ、または（ＤＣ−ＳＩＧＮ）２−Ｆｃの連続希釈液を、各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡアッセイでの結合を分析した。抗ＤＣ−ＳＩＧＮマウスモノクローナル抗体のクローンＭＲ−１（Abcam）を、検出用に用い、次いでＨＲＰ−共役抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。Ｆｃ／ＤＣ−ＳＩＧＮ融合（ダイヤモンド）に比してＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ融合（スクエア）の結合増加を示している比較分析からの典型的な結果を図８に示してある。
【０１２２】
実施例５：Ｄ−マンノース−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いるＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体の精製
Ｄ−マンノース−セファロースマトリックス上のアフィニティー精製、次いでソース１５Ｑカラム上のイオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製（「ポリッシングステップ」）を介して安定にトランスフェクトされたクローンの上澄液から、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＣＴＬＤ誘導体を単離した。
【０１２３】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤを発現する上澄液に、１０×ＴＢＳＣ−緩衝液から最終１×ＴＢＳＣ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａ２＋）を供給し、４℃でＤ−マンノース−セファロースカラム上で操作した。標準的なプロトコルに従って、Ｄ−マンノースを、ジビニルスルホンにより活性化されたセファロース６−ＢＣｌに結合させることによりＤ−マンノース−セファロースマトリックスを調製した。適用後、カラムを２カラム容量の１×ＴＢＳＣで洗浄し、１×ＴＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡで溶出した。溶出したタンパク質フラクションに、５ｍＭのＣａＣｌ２を加えて、５〜１０容量の１ｘＴＢＳＣ−緩衝液に対して透析した。溶出後、存在する可能性のあるウイルスの不活化は、１％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０および０．３％ｗ／ｖのトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートを添加し、室温で６時間溶出された物質を放置することにより達成した。遠心分離による清澄化後、１×ＴＢＳＣ中、物質をＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム上に装填した。装填したら、カラムに５カラム容量の１５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌを流した。カラムを、１５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４ ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌによる勾配で溶出した。溶出したタンパク質を、１０ｍＭのＮａＰＯ４ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ中にダイアフィルトレーションした。次にタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、濃度は分光分析法により測定した（Ａ２８０）。
【０１２４】
実施例６：Ｃ４開裂によりモニターされた固定化Ｌｅｙ−ＨＳＡ上の補体溶解開始分析
実施例３および５で作製された精製ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体を、補体活性化アッセイにおいてアッセイした。このアッセイは、ＨＳＡ−ＬｅＹに結合した際に、Ｃ４開裂を開始させるＭＢＬ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ／ＭＡＳＰ複合体能力の定量的測定である。次に沈殿したＣ４−断片を、抗Ｃ４抗体により定量した。
【０１２５】
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬのＨＳＡ−ＬｅＹにより一晩コーティングした。過剰の抗原を洗浄後、プレートを、ＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；１４０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７，４）中０．１％のＢＳＡでブロックした。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤを、ＭＢＬ結合用緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭのＣａＣｌ２；１ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００；０．１％のＢＳＡ；ｐＨ７，４）中、２％のＭＢＬ欠損ヒト血清（State Serum Institute、Copenhagen、デンマーク国）と複合化し、４℃で一晩結合させた。これらのプレートを温めて洗浄した。５μｇ／ｍＬのヒトＣ４タンパク質（Quidel）を、１．５時間インキュベートしたウェルに加える。ウェルを洗浄し、開裂Ｃ４断片をポリクローナル抗Ｃ４抗体（DAKO）で検出し、次いでＥＬＩＳＡアッセイにおいてＨＲＰ−共役抗ウサギＩｇ抗体（DAKO）で検出した（図９）。
【０１２６】
実施例７：Ｃ４開裂によりモニターされた上皮癌細胞の補体溶解開始分析
実施例３または５に記載され、作製された精製ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ ＡＢｓおよび-ＡＢｓＣ誘導体を、標準的補体活性化アッセイにおいてアッセイした。このアッセイは、上皮癌細胞上のＬｅＹ腫瘍抗原に結合した際に、Ｃ４開裂を開始させるＭＢＬ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ／ＭＡＳＰ複合体能力の定量的測定である。次に沈殿したＣ４−断片を、抗Ｃ４抗体により定量した。
【０１２７】
細胞（例えば、ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７およびその他）を、７０％の集密性まで増殖させ、プラスチックからかき取った。洗浄し、０．５％のＢＳＡ／ＴＢＳＣ−緩衝液中で予めブロッキング後、０．５％のＢＳＡ／１ｘＴＢＳＣ緩衝液中で２％のＭＢＬ欠損ヒト血清（State Serum Institute、Copenhagen、デンマーク国）と複合化させたＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤを含有する緩衝液中に細胞を再懸濁し、室温で２時間結合させた。細胞を０．５％ＢＳＡ／ＴＢＳＣ−緩衝液で洗浄し、ヒトＣ４（０．５％ＢＳＡ／ＴＢＳＣ中５μｇ／ｍＬ）中に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、開裂Ｃ４断片をポリクローナル抗Ｃ４抗体（DAKO）で検出し、次いで懸濁液ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＨＲＰ−共役抗ウサギＩｇ抗体（DAKO）により検出した（図１０）。
【０１２８】
実施例８：ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ誘導体またはモノクローナル抗体による上皮癌細胞増殖の阻害分析
乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３およびＭＣＦ−７は、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するそれぞれＭｃＣｏｙおよびＤＭＥＭ培地中、Nunclon９６−トレーに５０００個の細胞／ウェルで、３７℃かつ５％ＣＯ２で一晩接種した。ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓ、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓＣ０、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ−ＡＢｓＣ０（＋５μｇ／ｍＬのHerceptin）の希釈液、Herceptinおよび対照緩衝液を、細胞に加え、細胞を、３７℃かつ５％のＣＯ２で２日または５日間増殖させた。実施例５に記載されたプロトコルを用いてＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ誘導体を単離した。以後、製造元の取扱説明書（Promega）に従って比色アッセイ（細胞タイター９６水性非放射性細胞増殖アッセイ（CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay））を用いて測生存細胞数を定した。５日後のアッセイ結果を図１１に示してある。
【０１２９】
上記に示された実施例は、単に例示であり、本発明の全ての可能な実施形態、適用または修飾の徹底したリストであることを意味していない。したがって、本発明の範囲と意図から逸脱することなく、本発明の記載された方法およびシステムの種々の修飾および変型は、当業者にとって明らかとなろう。本発明を、具体的な実施形態と関連させて記載したが、当然のことながら、請求された本発明は、このような具体的な実施形態に過度に限定されてはならない。実際、分子生物学、免疫学、化学、生化学または関連分野で当業者にとって明らかである本発明を実施するために、記載された様式の種々の改変は、添付された請求項の範囲内にあることが意図されている。
【０１３０】
当然のことながら、本発明は、本明細書に記載された具体的な方法論、プロトコル、および試薬などに限定されるものではなく、これらは、当業者が認識されるであろうが変わり得る。また、当然のことながら、本発明に用いられる用語は、具体的な実施形態の説明目的のみに使用され、本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１３１】
本発明の実施形態ならびに種々の特徴およびそれらの有利な詳細は、非限定的実施形態を参照してより十分に説明され、および／または添付の図面で例示され、以下の説明で詳述される。図面で例示された特徴は、必ずしも一定の縮尺で描かれていないが、たとえ本明細書において明白に述べられていなくても、当業者が認識し得るように、一実施形態の特徴は、他の実施形態でも使用できることに注意する必要がある。
【０１３２】
本明細書に挙げられたいずれの数値も、任意の低値と任意の高値との間で少なくとも２つの単位で分離されているという条件で、１単位の増分で低値から高値への全ての値を含んでいる。一例として、例えば、成分濃度、または例えば、サイズ、角度の大きさ、圧力、時間などの処理変数の値が、例えば、１から９０、具体的には、２０から８０、より具体的には、３０から７０であることが述べられている場合、本明細書においては１５から８５、２２から６８、４３から５１、３０から３２などの値が明確に挙げられることが意図されている。１未満の値に関して、１単位は、適宜０．０００１、０．００１、０．０１または０．１であることが考慮されている。これらは具体的に意図されたものの例にすぎず、挙げられた低値から高値の間の数値の可能な全ての組合せは、同様な様式で本明細書において明確に述べられると考えるべきである。
【０１３３】
具体的な方法、装置、および材料を記載しているが、本明細書に記載されたものと類似した、または等しい任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書に引用された全ての参照文献および刊行物の開示は、各々個々に参照として援用されるのと同程度に、参照としてそれらの全体が本明細書に明確に援用されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクター機能を有するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含む第一のポリペプチドと、細胞表面またはウイルスに結合する標的化配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質であって、前記第一のポリペプチドが、活性なＭＢＬのＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含まない融合タンパク質。
【請求項２】
前記標的化配列が、腫瘍細胞、免疫細胞、細菌細胞、原生動物、真菌およびウイルスに感染した細胞からなる群から選択される細胞表面上の受容体に結合する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記免疫細胞が、炎症性免疫細胞および抑制性免疫細胞から選択される請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記標的化分子がレクチンである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記レクチンが、樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第一のポリペプチドが、配列番号４９を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第一のポリペプチドが、ＭＢＰ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）に結合する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が哺乳動物の補体系を活性化する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第二のポリペプチドが、前記標的化配列を含むループ領域を有するＣＴＬＤを含み、前記ＣＴＬＤが、ＭＢＰ ＣＴＬＤではない請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号６）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号１０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ（配列番号１２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１６）およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号２０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２２）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２６）およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２８）からなる群から選択される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１に記載の融合タンパク質を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の補体系を活性化する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の融合タンパク質および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
化学療法剤および治療剤のうちの少なくとも１つをさらに含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの治療剤が、抗体、キナーゼ阻害剤、または癌ワクチンのうちの少なくとも１つを含む請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記化学療法剤が、ラルチトレキセド、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル、イリノテカンおよびシスプラチン、マイトマイシン−Ｃ、およびオキサリプラチンから選択され、前記治療剤が、トラスツズマブである請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載の医薬組成物の有効量を、病原性疾患を患っている患者に投与することを含む前記疾患を治療する方法であって、前記標的化配列が、病原体の細胞表面マーカーまたはウイルスに感染した細胞上のマーカーに結合する方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍細胞を含む増殖性疾患の治療を必要とする患者に投与することを含む、腫瘍細胞を含む増殖性疾患を治療する方法であって、前記標的配列が腫瘍細胞の表面上のマーカーに結合する方法。
【請求項１８】
前記患者に癌ワクチンを投与することをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記受容体が、ルイス抗原を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的化配列が、ルイス抗原に結合するＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチド配列を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
被検体の癌を治療する方法であって、請求項１１に記載の医薬組成物の有効量を前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨髄性癌および上皮癌から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
テトラネクチン三量体形成ドメインをさらに含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする配列を含む単離核酸。
【請求項２５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群から選択される請求項２２に記載の単離核酸。
【請求項２６】
請求項２２に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１に記載の融合タンパク質の調製のための方法であって、（ｉ）前記融合タンパク質が発現するような条件下で請求項２２に記載の単離核酸を発現するステップと、（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収するステップと、を含む方法。
【請求項１】
エフェクター機能を有するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）ポリペプチドを含む第一のポリペプチドと、細胞表面またはウイルスに結合する標的化配列を含む第二のポリペプチドとを含む融合タンパク質であって、前記第一のポリペプチドが、活性なＭＢＬのＣ型レクチン様ドメイン（ＣＬＴＤ）を含まない融合タンパク質。
【請求項２】
前記標的化配列が、腫瘍細胞、免疫細胞、細菌細胞、原生動物、真菌およびウイルスに感染した細胞からなる群から選択される細胞表面上の受容体に結合する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記免疫細胞が、炎症性免疫細胞および抑制性免疫細胞から選択される請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記標的化分子がレクチンである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記レクチンが、樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３グラビング非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第一のポリペプチドが、配列番号４９を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第一のポリペプチドが、ＭＢＰ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）に結合する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が哺乳動物の補体系を活性化する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第二のポリペプチドが、前記標的化配列を含むループ領域を有するＣＴＬＤを含み、前記ＣＴＬＤが、ＭＢＰ ＣＴＬＤではない請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ（配列番号２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓ（配列番号４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓ（配列番号６）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ（配列番号８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣ（配列番号１０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＤｓＣ（配列番号１２）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＦＥ（配列番号１４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＧＥ（配列番号１６）およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＨＥ（配列番号１８）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧ（配列番号２０）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＳ（配列番号２２）、およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＣｓＣＳＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓ０（配列番号２６）およびＭＢＰ／ＤＣ−ＳＩＧＮ ＣＴＬＤ−ＡＢｓＣ０（配列番号２８）からなる群から選択される請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１に記載の融合タンパク質を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の補体系を活性化する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の融合タンパク質および薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
化学療法剤および治療剤のうちの少なくとも１つをさらに含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの治療剤が、抗体、キナーゼ阻害剤、または癌ワクチンのうちの少なくとも１つを含む請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記化学療法剤が、ラルチトレキセド、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル、イリノテカンおよびシスプラチン、マイトマイシン−Ｃ、およびオキサリプラチンから選択され、前記治療剤が、トラスツズマブである請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載の医薬組成物の有効量を、病原性疾患を患っている患者に投与することを含む前記疾患を治療する方法であって、前記標的化配列が、病原体の細胞表面マーカーまたはウイルスに感染した細胞上のマーカーに結合する方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の医薬組成物の有効量を、腫瘍細胞を含む増殖性疾患の治療を必要とする患者に投与することを含む、腫瘍細胞を含む増殖性疾患を治療する方法であって、前記標的配列が腫瘍細胞の表面上のマーカーに結合する方法。
【請求項１８】
前記患者に癌ワクチンを投与することをさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記受容体が、ルイス抗原を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的化配列が、ルイス抗原に結合するＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチド配列を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
被検体の癌を治療する方法であって、請求項１１に記載の医薬組成物の有効量を前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、骨髄性癌および上皮癌から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
テトラネクチン三量体形成ドメインをさらに含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする配列を含む単離核酸。
【請求項２５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群から選択される請求項２２に記載の単離核酸。
【請求項２６】
請求項２２に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
請求項１に記載の融合タンパク質の調製のための方法であって、（ｉ）前記融合タンパク質が発現するような条件下で請求項２２に記載の単離核酸を発現するステップと、（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収するステップと、を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０２５２０（Ｐ２０１１−５０２５２０Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３３３０（Ｐ２０１０−５３３３３０）
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６２１９５
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０８２５３６２７）アナフォア インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ａｎａｐｈｏｒｅ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６２１９５
【国際公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【出願人】（５０８２５３６２７）アナフォア インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】Ａｎａｐｈｏｒｅ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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