眼線維性血管新生抑制剤
【課題】 本発明は、網脈絡膜血管新生を抑制する薬剤の提供を目的とする。より具体的には、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分とする網脈絡膜血管新生抑制剤、並びに、該抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【解決手段】 本発明はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の蓄積の影響を検討する一例としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの1つであるバーシカンのcore site配列を含有するバーシカンsiRNA、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの４位硫酸基を脱硫酸化するコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素、などの網脈絡膜血管新生疾患の治療又は予防に好適な、網脈絡膜血管新生抑制剤に関する。本発明はまた、バーシカンsiRNA、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素等を被験体に投与することによるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)蓄積抑制に基づく網脈絡膜血管新生抑制方法、及びそれを利用した糖尿病性網膜症等の網脈絡膜血管新生疾患の治療又は予防方法にも関する。
【解決手段】 本発明はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の蓄積の影響を検討する一例としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの1つであるバーシカンのcore site配列を含有するバーシカンsiRNA、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの４位硫酸基を脱硫酸化するコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素、などの網脈絡膜血管新生疾患の治療又は予防に好適な、網脈絡膜血管新生抑制剤に関する。本発明はまた、バーシカンsiRNA、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素等を被験体に投与することによるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)蓄積抑制に基づく網脈絡膜血管新生抑制方法、及びそれを利用した糖尿病性網膜症等の網脈絡膜血管新生疾患の治療又は予防方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質有効成分とした、CSPGの眼組織、特に網膜ならびに脈絡膜（網脈絡膜）への沈着抑制剤、網脈絡膜の血管増生・新生の抑制剤、CSPGの沈着抑制方法、及び該方法に基づく眼血管新生疾患、とりわけ網膜症や黄斑変性症に対する治療または予防に関するものである。本発明はコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素、バーシカン・アンチセンス薬等を代表例とする、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質を有効成分として含む網脈絡膜血管新生疾患、とりわけ糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症などの治療・予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
眼疾患における網脈絡膜血管新生は視機能を低下させ、失明にまで至らしめる重篤な病態であり治療に困難を来たすことが多い。主要な疾患として、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症などが挙げられる。
【０００３】
網膜血管の微小循環障害が原因で虚血を来たし、網膜新生血管が発症するものとして糖尿病網膜症がある。糖尿病網膜症は、現在本邦における成人中途失明の原因の第一位である。高血糖の長期暴露で、血液の凝固能と抗凝固能のバランスは凝固側に傾き、血管平滑筋収縮も起き易くなり、微小血管閉塞による虚血が生じる。虚血組織は生存のために、虚血網膜上に線維血管膜を作り、新生血管を発症させる。そして増殖膜から硝子体に新生血管が生じて硝子体出血をきたし著しい視力低下を来たす。さらに網膜周辺部虚血により、隅角に新生血管が張り眼房水吸収障害を来たすと続発性緑内障が発症する。虚血の軽減、新生血管増殖抑制のため治療として、現在はレーザー光凝固術、網膜硝子体手術が施行されているが、失明に至るケースは少なくない。
【０００４】
網膜静脈閉塞症は、高血圧や高脂血症が主な原因で、動脈硬化等により動静脈交差部の静脈に狭窄が生じ、狭窄部血管内に微小塞栓物質が沈着しさらなる狭窄、閉塞が生じる病態である。眼血管系は終動脈を形成し、血液は動脈分岐で末梢血管に流れ、末梢血管からの血液還流として静脈に戻ってくる。網膜の大静脈に閉塞が生じると、比較的高い圧で抹消へ流れた血液が閉塞した静脈で血流が遮断され、静脈の形態的破綻として網膜出血や硝子体出血を来たし、著しい視力低下を来たす。静脈の支配領域の網膜組織は、血流の途絶により虚血状態となり新生血管が生じる。糖尿病網膜症と同様な機序で続発性緑内障や硝子体出血を合併する。時に網膜剥離や網膜黄斑部の血管破綻による黄斑浮腫も来たし、失明にまで至る障害を来たす。治療はレーザー光凝固術であり、繰り返す硝子体出血に対しては硝子体網膜症手術を施行する。
【０００５】
未熟な組織の急激な相対的虚血によって新生血管が発症し、合併症として硝子体出血や牽引性網膜剥離をきたす疾患に未熟児網膜症がある。未熟児として出生し、生存のため保育器の中で高濃度酸素に一時期間暴露される。未熟児の網膜血管の成長も不十分で、網膜血管は周辺網膜組織にまで十分に達していない。高濃度酸素下では、未成熟な網膜血管の成長が不必要なため、血管の成長が停止してしまい、保育器下での管理が必要なくなり相対的に低酸素濃度である大気中に戻されたとき、相対的な虚血によって新生血管が発症し、著しい視力障害を来たす。治療にレーザー光凝固や網膜硝子対手術を施行することもある。視力予後は大変不良である。
【０００６】
原因不明の網膜黄斑部の網膜下に脈絡膜から新生血管が発症し、網膜組織に障害を来たす加齢黄斑変性症も失明にいたる眼疾患である。加齢黄斑変性症は、黄斑部の脈絡膜新生血管が発生、増殖し、網膜下や網膜組織、網膜前に新生血管が増殖して黄斑部の浮腫や破壊により著しい視力低下を来たし、欧米では成人中途失明の第一位である。治療は黄斑部中心窩から離れていれば、レーザー光凝固術が施行される。中心窩内の病変に対して、最近では光線力学療法が試みられ、さらに手術療法も行われているが確固たる治療が開発されていない。
【０００７】
網脈絡膜血管新生による眼疾患の治療法としては、手術やレーザー光凝固等の外科的治療が中心に行われているが、薬物療法の開発はまだ始まったばかりである。現在、網脈絡膜血管新生を促進する因子として血管内皮増殖因子(VEGF: vascular endothelial growth factor)が注目を浴びており、VEGFの作用を阻害する薬剤の開発が最良の方法であると現時点で考えられている（非特許文献１）。そのため近年、VEGFをターゲットとした新しい治療薬の研究、開発が進められている（非特許文献２）。しかしながら、VEGFは全身の血管内皮細胞に恒常的に発現するVEGF受容体にも作用するため、病的状態により特異的に作用する治療薬の開発が急務である。
【０００８】
一方、本発明の標的物質であるプロテオグリカンは、コア蛋白質に呼ばれる蛋白質に、1本以上のグリコサミノグリカン(GAG)鎖が共有結合した構造をもつ分子の総称であり細胞表面や細胞外マトリックスの構成成分である（非特許文献３、４）。プロテオグリカンに結合しているGAG鎖の特異的な糖鎖構造がプロテオグリカンの多彩な機能を担うと考えられており、プロテオグリカンはGAGの骨格構造に基づいて、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケタラン硫酸プロテオグリカンと4つに大別される。（非特許文献５〜１１）
【０００９】
一方、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに関しては、胎生時期には必須分子で、各臓器に豊富に存在するが、出生、成長、老化に伴い減少することが知られているが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生体内機能は未だ明らかとなっていない。近年では、CSPGを遺伝的に欠損させたマウスが胎生致死や器官形成不全に陥ることが判明したことから、CSPGは生体に必須の分子であるとの認識が強まっている。
【００１０】
網脈絡膜においては、CSPGは視神経繊維層と光受容体中間層に分布しており、神経や色素上皮細胞を支持する役割りを担っていると考えられている（非特許文献１２）。しかしながら、CSPGがどのように網脈絡膜血管新生と関連してくるかを明確にした報告は過去になく、治療標的とした研究は皆無である。
【００１１】
今回、CSPGを治療標的とした方法として、４位硫酸基を脱硫酸化する、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素、ならびにCSPGの一つであるバーシカンの遺伝子サイレンシング（RNA interference :RNAi）という、異なるアプローチを行い、その生体内効果の検証を加えた。先に述べたコンドロイチナーゼABCと同様に、RNAiを用いてC6STやGalNAcの発現を抑制し、CSPGの動態を生体内で制御した報告はこれまでにはない。
【００１２】
【非特許文献１】Witmer AN, Vrensen GFJM, Van Noorden CJF and Schlingemann RO: Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye diseases. Prog Retin Eye Res. 2003 Jan; 22(1):1-29. Review.
【非特許文献２】Ferrara N, Gerber HP and LeCouter J: The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. Jun; 9（6）: 669-79. Review.
【非特許文献３】Berfield M: Annu Rev Biochem 1999 68:729-777
【非特許文献４】Iozzo RV: Annu Rev Biochem 1998 67:609-652
【非特許文献５】Lindahl, U et al. (1972) In Glycoproteins (Gottschalk, A. ed)pp. 491-517, Elsevier, New York.
【非特許文献６】Oegema, T et al. J. Biol. Chem. (1984) 259, 1720-1726
【非特許文献７】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1988) 263, 10168-10174
【非特許文献８】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6027-6035
【非特許文献９】De Waard et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6036-6043
【非特許文献１０】Moses, J, Oldberg et al. Eur. J.Biol. (1992) 248, 521-526
【非特許文献１１】Yamada, S et al. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, .(1998) 10, 95-123
【非特許文献１２】Inatani M et al. Prog Retin Eye Res. 21:429-447,2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、網脈絡膜血管新生抑制剤、および該薬剤を有効成分とする網脈絡膜血管新生疾患の治療剤、並びに、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、そのような薬剤を開発する鋭意研究を重ねるうち、従来は網脈絡膜血管新生病変の病因とは考えられていなかったCSPGの過剰な蓄積が、網脈絡膜の血管内皮細胞の増殖並びに血管新生病変に寄与しているのではないかと考えた。本発明者らは、この考えにも基づいて複数の異なるアプローチで研究を重ねた結果、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積あるいは生合成を阻害することによって、網脈絡膜血管新生を抑制することができることを実証し、本発明を完成させた。
【００１５】
本発明は、網脈絡膜血管新生抑制剤、および該薬剤を有効成分とする網脈絡膜血管新生疾患の治療剤、並びに、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法等に関し、より具体的には、
〔１〕 コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、網脈絡膜血管新生抑制剤、
〔２〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔４〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔５〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔６〕 網脈絡膜においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕 網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用の、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔８〕 前記網脈絡膜血管新生疾患が、網膜血管新生疾患である、〔７〕に記載の薬剤、
〔９〕 前記網脈絡膜血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、または加齢黄斑変性症である、〔７〕に記載の薬剤、
〔１０〕 被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法、
〔１１〕 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、〔１０〕に記載のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
〔１２〕 前記網脈絡膜血管新生抑制剤が、網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用である、〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔１３〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤の、網脈絡膜血管新生抑制剤の製造における使用、
〔１４〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤を、個体（患者等）へ投与する工程を含む、網脈絡膜血管新生疾患の治療方法、
〔１５〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、CSPG（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の網脈絡膜組織への沈着抑制を目的とし、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を機序とする、網脈絡膜血管新生疾患の治療・予防薬に関する方法を提供することを１つの目的とする。
【００１７】
本発明によって、網脈絡膜血管新生の発症にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積が関係していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積を阻害することにより網脈絡膜血管新生が抑制されることが示された。これまでにない新しいコンセプトの網脈絡膜血管新生疾患の治療薬が提供できることになる。特に網脈絡膜血管新生は現代社会で患者数が増大している、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症などと密接に関連しており、新しいコンセプトの治療薬剤は医療上また産業上も重要な意義を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
代表的な網脈絡膜血管新生疾患の一つである糖尿病性網膜症に伴う病態として、網膜血管の微小循環障害による虚血により発症する、網膜血管新生がある。本発明者らは、眼の網膜組織における血管新生状態の抑制を糖尿病性網膜症治療の有効な方法の一つとするため、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの機能に着目した。そして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑制する状態を糖尿病性網膜症モデルマウスにおいて作出し、詳細に解析したところ、野生型の網膜組織に比してコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積が改善されるとともに、血管新生などが抑制された。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害すると、糖尿病性網膜症に深く関与している網膜組織におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの異常蓄積状態の改善が促進され、網脈絡膜血管新生の抑制につながることを見出した。
【００１９】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、網脈絡膜血管新生抑制剤に関する。
【００２０】
本発明の「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、プロテオグリカンの一つであり、代表的な硫酸化ムコ多糖であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸とタンパク質（コアタンパク質）との共有結合化合物の総称である。本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質（ホモログ・オルソログ等）も本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」に含まれる。例えば、ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。また本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンには、炎症などで一時的にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合しプロテオグリカンになるもの、いわゆるパートタイムプロテオグリカンも含まれる。
【００２１】
以下の記載において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbを例示する。本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはこれらに限られず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を持つ物質であればよい。ここでコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性とは、例えば細胞接着能、または細胞増殖促進などが挙げられる。当業者は次のような方法でコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を評価することができる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのアミノ酸配列の一部の領域を含むタンパク質、または一部の領域と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有するタンパク質の存在下で腫瘍細胞（例えばCaco-2、HT-29細胞など）の分裂増殖を測定する。分裂増殖を促進する効果を持つタンパク質をコンドロイチン硫酸プロテオグリカン活性を有するタンパク質として判定できる（Int J Exp Pathol. 2005 Aug;86(4):219-29およびHistochem Cell Biol. 2005 Aug;124(2):139-49）。ここで高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。
【００２２】
本発明における「網脈絡膜血管新生」とは、網脈絡膜において血管新生が発症している状態を指し、血管新生のマーカーの発現、例えばＣＤ３１陽性細胞の増加や網膜コラーゲンの増生などがみられる状態も含む。
【００２３】
本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する」とは、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」、「合成阻害」、「脱硫酸化」、「硫酸化阻害」などが挙げられるが、これには限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量、機能または活性が比較対象よりも低下または消失させることをいう。本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する物質」とは、特に制限されないが、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進作用を有する物質」、「合成阻害作用を有する物質」、「脱硫酸化作用を有する物質」、または「硫酸化阻害作用を有する物質」である。
【００２４】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」とは、たとえばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現の阻害・存在の減少が挙げられる。ここで「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質が挙げられる。また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばβglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質が挙げられる。これらはいずれも例示であり、これらに限らず広くコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質であればよい。
【００２５】
「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質が生成されることを意味する。また、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の機能」とは、例えば、該タンパク質がコンドロイチン硫酸と結合する機能や、その他の細胞中の構成要素との結合等を挙げることができる。上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
【００２６】
さらにまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素の発現の上昇であってもよい。これらの酵素の例としては、メタロプロテイナーゼ（例えばADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5など）やコンドロイチナーゼ（コンドロイチネース）、Calpain Iなどが挙げられるが、これらには限られない。また「分解促進」は、これらの酵素または酵素の一部の投与により生ずる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量の減少であってもよい。
【００２７】
また「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現の抑制を促す物質の投与により生じるものであってもよい。これらの物質には例えばn-butylate、Diethylcarbamazepine、Tunicamycin、non-steroidal estrogen、Cyclofenil deiphenolなどが挙げられるが、これらには限られない。
【００２８】
「分解促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００２９】
また「分解促進作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する低分子化合物
【００３０】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「合成阻害」とは、たとえばグリコサミノグリカンの生合成の阻害、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成に関わる酵素の阻害などが挙げられるが、必ずしもこれらに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程のいずれかを阻害することを指す。
【００３１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害する物質として、グリコサミノグリカンの生合成を阻害する物質としては、たとえば、β-D-xyloside、2-deoxy-D-glucose (2-DG)、ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate (ETDP)、5-hexyl-2-deoxyuridine (HUdR)などが挙げられる。これらをはじめとした物質によりグリコサミノグリカンの生合成が阻害され、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００３２】
一方、コンドロイチン合成に関わる酵素としては、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどが挙げられる。これらをはじめとした酵素を阻害、発現の抑制等を行うことにより、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００３３】
「合成阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３４】
また「合成阻害作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する低分子化合物
【００３５】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「脱硫酸化」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン中の硫酸基が除かれることを指し、例えば内在性あるいは外部から投与される脱硫酸化酵素による脱硫酸化、または硫酸化を抑制する化合物による硫酸化の抑制などが挙げられるが、これらに限られず、硫酸基が除去される過程を指す。
【００３６】
脱硫酸化酵素としては、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseが挙げられる。また、硫酸化を抑制する化合物としては、たとえばChlorate、EGF receptor antagonistなどが挙げられる。
【００３７】
「脱硫酸化作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３８】
また「脱硫酸化作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質に対して、ドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化抑制タンパク質変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する低分子化合物
【００３９】
ここで「脱硫酸化抑制化合物」は、タンパク質には限られず、例えば補酵素など非タンパク質化合物を含む。
【００４０】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「硫酸化阻害作用」とは、例えば、硫酸基転移酵素の阻害が挙げられるが、これに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程に生じる硫酸化が阻害されることを指す。
【００４１】
硫酸基転移酵素としては、例えば、C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などが挙げられる。
【００４２】
「硫酸化阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００４３】
また「硫酸化阻害作用を有する物質」としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物
【００４４】
上記例示した酵素は、一遺伝子に対応する一酵素を示すのみならず、ある特徴を共有する酵素群をも含む。例えばコンドロイチナーゼは、ムコ多糖分解酵素という特徴は共有するが基質特異性などの異なるABC、AC、Bなどの酵素の総称である。例えば、コンドロイチナーゼAC Iは、コンドロイチン硫酸類 (A、CまたはE)、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸-デルマタン硫酸ハイブリッド型およびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-グルクロン酸残基を持つオリゴ糖を生成する。本酵素はデルマタン硫酸 (コンドロイチン硫酸B，ヘキスロン酸としてL-イズロン酸を持つもの)、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンには作用しない。また、コンドロイチナーゼAC II は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸CのN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、Δ4-不飽和二糖(ΔDi-0S、ΔDi-4SおよびΔDi-6S)を生成する。本酵素はヒアルロン酸にもよく作用する。デルマタン硫酸(コンドロイチン硫酸B)には作用せず、本酵素の競合的阻害剤となる。コンドロイチナーゼB(デルマタナーゼ)は、デルマタン硫酸のL-イズロン酸に結合したN-アセチルガラクトサミニド結合を脱離反応的に切断し、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つオリゴ糖(2糖および4糖)を生成する。本酵素はL-イズロン酸を含まないコンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸Cには作用しない。デルマタン硫酸の硫酸基を除去した誘導体であるデルマタンは、この酵素の基質とはならない。デルマタン硫酸のL-イズロン酸単位の第2位が硫酸化されている箇所はこの酵素によってよりよく切断される。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つ二糖を主に生成する。本酵素はケタラン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸には作用しない。コンドロイチナーゼはこのような、異なる性質を持っていながらもムコ多糖分解酵素という共通の性質を持つ酵素の総称であり、必ずしもここで例示したChondroitinase ACI、Chondroitinase AC II、Chondrotinase B、Chondroitinase ABCには限られない。
【００４５】
また、このような特徴を共有する酵素群は、必ずしもゲノムDNA上の一遺伝子に対応するものではない。例えば、chondroitin-4-sulfatase、chondroitin-6-sulfataseは、ともにゲノムデータベース上の複数のアクセッション番号で参照される配列（例えばGenbankアクセッション番号NT_039500（その一部はアクセッション番号CAAA01098429（配列番号：７３）としてあらわされる）、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_001030811、NW_001030796、NW_000349）として公共遺伝子データベースGenbank上で検索される。
【００４６】
上記に例示したもののうち個別の遺伝子に対応しているものは下記のように示される。すなわち、上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして例示した、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素として例示した、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I、コンドロイチン合成に関わる酵素として例示した、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylT、硫酸基転移酵素として例示した、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2をそれぞれヒトにおいてコードする遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号、塩基配列、アミノ酸配列は、次の通りである。
aggrican（アクセッション番号NM_007424、塩基配列の配列番号：１、アミノ酸配列の配列番号：２）
versican（バーシカン）（アクセッション番号BC096495、塩基配列の配列番号：３、アミノ酸配列の配列番号：４）
neurocan（アクセッション番号NM_010875、塩基配列の配列番号：５、アミノ酸配列の配列番号：６）
brevican（アクセッション番号NM_007529、塩基配列の配列番号：７、アミノ酸配列の配列番号：８）
βglycan（アクセッション番号AF039601、塩基配列の配列番号：９、アミノ酸配列の配列番号：１０）
Decorin（アクセッション番号NM_007833、塩基配列の配列番号：１１、アミノ酸配列の配列番号：１２）
Biglycan（アクセッション番号BC057185、塩基配列の配列番号：１３、アミノ酸配列の配列番号：１４）
Fibromodulin（アクセッション番号NM_021355、塩基配列の配列番号：１５、アミノ酸配列の配列番号：１６）
PG-Lb（アクセッション番号NM_007884、塩基配列の配列番号：１７、アミノ酸配列の配列番号：１８）
ADAMTS-1（アクセッション番号NM_009621、塩基配列の配列番号：１９、アミノ酸配列の配列番号：２０）
ADAMTS-4（アクセッション番号NM_172845、塩基配列の配列番号：２１、アミノ酸配列の配列番号：２２）
ADAMTS-5（アクセッション番号AF140673、塩基配列の配列番号：２３、アミノ酸配列の配列番号：２４）
Calpain I（アクセッション番号NM_007600、塩基配列の配列番号：２５、アミノ酸配列の配列番号：２６）
GalNAc4ST-1（アクセッション番号NM_175140、塩基配列の配列番号：２７、アミノ酸配列の配列番号：２８）
GalNAc4ST-2（アクセッション番号NM_199055、塩基配列の配列番号：２９、アミノ酸配列の配列番号：３０）
GALNAC4S-6ST（アクセッション番号NM_029935、塩基配列の配列番号：３１、アミノ酸配列の配列番号：３２）
UA2OST（アクセッション番号NM_177387、塩基配列の配列番号：３３、アミノ酸配列の配列番号：３４）
GalT-I（アクセッション番号NM_016769、塩基配列の配列番号：３５、アミノ酸配列の配列番号：３６）
GalT-II（アクセッション番号BC064767、塩基配列の配列番号：３７、アミノ酸配列の配列番号：３８）
GlcAT-I（アクセッション番号BC058082、塩基配列の配列番号：３９、アミノ酸配列の配列番号：４０、またはアクセッション番号NM_024256、塩基配列の配列番号：４１、アミノ酸配列の配列番号：４２）
XylosylT（アクセッション番号NM_145828、塩基配列の配列番号：４３、アミノ酸配列の配列番号：４４）
C4ST-1（アクセッション番号NM_021439、塩基配列の配列番号：４５、アミノ酸配列の配列番号：４６）
C4ST-2（アクセッション番号NM_021528、塩基配列の配列番号：４７、アミノ酸配列の配列番号：４８）
C4ST-3（アクセッション番号XM_355798、塩基配列の配列番号：４９、アミノ酸配列の配列番号：５０）
D4ST（アクセッション番号NM_028117、塩基配列の配列番号：５１、アミノ酸配列の配列番号：５２）
C6ST-1（アクセッション番号NM_016803、塩基配列の配列番号：５３、アミノ酸配列の配列番号：５４）
C6ST-2（アクセッション番号AB046929、塩基配列の配列番号：５５、アミノ酸配列の配列番号：５６）
【００４７】
上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば細胞内の構成成分と結合する機能等）を持つタンパク質は、本発明の上記タンパク質に含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。
【００４８】
本発明における上記遺伝子には、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトの上記遺伝子のホモログ等）が含まれる。
【００４９】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。
【００５０】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用、合成阻害作用、脱硫酸化作用または硫酸化阻害作用の活性測定方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、後出の本発明におけるスクリーニング方法の項にて記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質および遺伝子に相当する上記タンパク質および遺伝子、あるいは、上述のタンパク質および遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質および遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【００５１】
本発明の上記タンパク質は、天然のタンパク質としてのほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質としては、例えば上記タンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、上記タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、例えば、上記タンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより、調製することが可能である。本発明の上記タンパク質は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
【００５２】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。
【００５３】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。
【００５４】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素のいずれかをコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または500塩基以上であってもよい。
【００５５】
本発明のアンチセンス核酸は特に制限されないが、例えばVersican（バーシカン）遺伝子の塩基配列（GenBankのアクセッション番号BC096495、配列番号：３）、C4ST-1（GenBankのアクセッション番号NM_021439、配列番号：４５）、C4ST-2（GenBankのアクセッション番号NM_021528、配列番号：４７）、C4ST-3（GenBankのアクセッション番号XM_355798、配列番号：４９）等をもとに作成することができる。
【００５６】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。
【００５７】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。
【００５８】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００５９】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。
【００６０】
近年のゲノムプロジェクトの完了によってヒトの全塩基配列が解読され数多くの疾患関連遺伝子が盛んに同定されている現在、特定の遺伝子を標的とした治療法、創薬開発が盛んに実施されている。中でも特異的転写後抑制効果を発揮するsmall interfering RNA(siRNA)の遺伝子治療への応用が注目されている。RNAiは、2本鎖RNA(dsRNA)が直接細胞内に取り込まれると、このdsRNAと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖dsRNA(siRNA)を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。
【００６１】
RNAiは1998年にFireらによって発見された現象（Fire A, Nature (1998) 391, :806-811）で、二本鎖RNA(double strand RNA)が相同な標的遺伝子の発現を強力に抑制するというものである。従来のベクター等を用いる遺伝子導入法に比べ簡便であり、標的に対する特異性が高く、遺伝子治療への応用が可能であるということで最近注目されている。
【００６２】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００６３】
siRNAの設計にあたっては、ターゲットとしては上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、Versican（バーシカン）遺伝子の塩基配列（配列番号：３）、C4ST-1遺伝子の塩基配列（配列番号：４５）、C4ST-2遺伝子の塩基配列（配列番号：４７）、C4ST-3遺伝子の塩基配列（配列番号：４９）等をもとに作成することができる。より具体的には、その配列の一部の領域をターゲット候補とすることが可能であり、例えば、Versican（バーシカン）遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５７）、C4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５８）、C4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５９）、C4ST-3遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６０）、C6ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６１）、C6ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６２）、GalNAc4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６３）、GalNAc4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６４）、GALNAC4S-6STの塩基配列の一部領域（配列番号：６５）等をもとに作成することができる。さらに具体的には、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜７０）を標的とするsiRNAが例示できる。
【００６４】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００６５】
また上記２本のRNA分子は、ここで一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)であってもよい。shRNAとは、ショートヘアピンRNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。
【００６６】
また本発明の好ましい態様としては、Versican（バーシカン）、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）であって、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜７０）を標的とするsiRNAにおいて、例えば、１もしくは少数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAであっても、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。
【００６７】
RNAi(siRNA)のために使用されるRNAは、上記タンパク質をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。
【００６８】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。
【００６９】
例えば、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
【００７０】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００７１】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖RNAである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖RNAの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのsiRNAは、当業者においては市販の核酸合成機およびDICER酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。
【００７２】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド(RNA)でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
【００７３】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７４】
また、本発明の発現阻害物質には、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現調節領域（例えば、プロモーター領域。具体的な例としては、PG-Lbのプロモーター領域である配列番号：６６で表される塩基配列が挙げられる。）と結合することにより、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また当業者においては、所望の化合物について、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。
【００７５】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７６】
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、Versican（バーシカン）、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）を発現するベクターを挙げることができる。
【００７７】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の上述のタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素やその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００７８】
本発明の抗体は、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。
【００７９】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。
【００８０】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。
【００８１】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００８２】
本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に対する抗体は、該タンパク質と結合することにより、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ましい。
【００８３】
さらに本発明は、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素の機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。該低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。
【００８４】
さらに本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体（ドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。このようなドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸との結合を野生型Versican（バーシカン）コアタンパク質と競合阻害するようなVersican（バーシカン）コアタンパク質変異体を挙げることができる。
【００８５】
また本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する組織または細胞は特に限定はされないが、好ましくは網脈絡膜であり、より好ましくは網脈絡膜における血管内皮細胞である。
【００８６】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する化合物は、網脈絡膜血管新生疾患の治療または予防のための薬剤となることが期待される。ここで「治療または予防」は、網脈絡膜血管新生を呈する組織、または細胞に対して、必ずしも完全な治療効果または予防効果を有する必要はなく、部分的な効果を有する場合であってよい。
【００８７】
本発明において網脈絡膜血管新生疾患は、網脈絡膜血管新生を伴う疾患であれば特に限定はされないが、好ましくは網脈絡膜血管新生疾患であり、さらに好ましくは、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症等を挙げることができる。
【００８８】
本発明の網脈絡膜血管新生抑制剤は、網脈絡膜血管新生の原因であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害することにより網脈絡膜血管新生を抑制する作用を有する。従って、本発明の好ましい態様としては、例えば、本発明の網脈絡膜血管新生抑制剤を有効成分とする、網膜血管新生疾患治療剤、糖尿病性網膜症治療剤、網膜静脈閉塞症治療剤、未熟児網膜症治療剤、または加齢黄斑変性症治療剤を提供する。
【００８９】
また本発明の「網脈絡膜血管新生抑制剤」は、「網脈絡膜血管新生治療剤」、または「網脈絡膜血管新生改善剤」等と表現することも可能である。また、本発明において「抑制剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
【００９０】
なお、本発明における「治療」には、網脈絡膜血管新生の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、網脈絡膜血管新生発現細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００９１】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、点眼剤あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤、頭蓋内投与注射剤、鼻腔内投与注射剤あるいは硝子体腔内投与注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００９２】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００９３】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００９４】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００９５】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００９６】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００９７】
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。網脈絡膜血管新生組織等に局所的に投与することもできる。siRNAに関して、in vitroにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、in vivoにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまう。それゆえ、生体内にて持続時間が限られることが問題となり最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。最近の報告では（Takeshita F. PNAS.(2003) 102(34) 12177-82、Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004) 32(13) e109）、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、siRNAのキャリアーとして非常に適しているとされている。これらはいずれも例示であり、本発明におけるデリバリー方法はこれらに限られない。
【００９８】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。
【００９９】
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【０１００】
本発明の薬剤を使用する場合は、網脈絡膜血管新生を発現する疾患であれば適用部位もしくは疾患の種類は特に限定されず、例えば網膜血管新生疾患、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症を対象として適用される。上記疾患は、他の疾患と併発したものであってもよい。
【０１０１】
また本発明は、被検試料からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって、網脈絡膜血管新生抑制剤もしくは網脈絡膜血管新生抑制剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。
【０１０２】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【０１０３】
これらに共通したスクリーニングの基本的な原理として、代表的な例として、下記の工程を含むものが挙げられる。
（１） コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)そのもの／もしくはグリコサミノグリカン(GAG)鎖／もしくはCSPGやGAG鎖を合成（生成）する細胞
（２） 被検化合物（例えば、製薬企業の有する莫大な化合物ライブラリー）
（３） コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の切断断面／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)量／遊離グリコサミノグリカン(GAG)量を検出する方法
上記3種のツールを用いる。（１）と（２）を試験管内、もしくは培養皿上で混合させ、その効果を（３）により簡便に検出するという手順が望ましい。
【０１０４】
以下、本発明のスクリーニング方法の態様を例示する。なお、以下に記載の態様においては、用いられるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、脱硫酸化酵素の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来するものが挙げられるが、これらに由来するものに特に制限されない。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一部とは、グリコサミノグリカン鎖、コアタンパク質などの構成要素またはその一部であり、特に限定されない。
【０１０５】
また以下に記載の態様に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
【０１０６】
また以下に記載の態様における被検化合物への「接触」は、通常、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、その一部、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素を被検化合物と混合することによって行うが、この方法に限定されない。例えば、これらのタンパク質またはその一部を発現する細胞を被検化合物と接触させることにより、上記「接触」を行うことができる。
【０１０７】
また以下に記載の態様における「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、それぞれの態様において用いられるタンパク質を発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。例えば、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを発現する細胞」としては、内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子を発現している細胞、または外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が発現した細胞は、通常コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【０１０８】
また以下の記載において、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質、また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばDecorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質である。また「合成酵素」は、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどである。また「硫酸基転移酵素」は、例えば、C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などである。また、「分解促進酵素」とは、例えば、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Chondroitinase ABC (ChABC)、Chondroitinase AC、Chondroitinase B、Calpain Iなどである。また「脱硫酸化酵素」は、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseなどである。
【０１０９】
本発明のスクリーニング方法の態様として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用を有する化合物を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、存在量を低下させる物質を選択する工程
【０１１０】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１１１】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に結合する標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１１２】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１１３】
被検化合物が上記(a)分解促進作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１１４】
上記(a) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用に関するスクリーニング方法態様：
CS-GAGとして、コンドロイチン硫酸A（CS-A）、CS-B、CS-C（生化学工業社、ICN社、Sigma社など）、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１１５】
検出方法としては、例えばWFAレクチン（ノダフジレクチン）結合法が簡便な手法として挙げられる。WFAレクチンはCS-GAG鎖のGalNAc残基に結合するため、CS-GAGを簡便に検出できる。被検化合物の陽性コントロールとしてはコンドロイチナーゼABCを使用する。コンドロイチナーゼABC添加により、CS-GAG鎖が分解されるとWFAレクチンが結合できなくなるため、その原理を利用する。より具体的には、FITC標識WFAレクチン（EY社など）を、被検化合物混合前後でCSコーティング・ウェルに添加し、CS-GAGが分解される事により、ウェル中のFITC蛍光強度の変化を蛍光プレートリーダーあるいは蛍光顕微鏡などの検出機器により極めて簡便に定量・数値化できる。混合前後で最も蛍光数値を減少させた化合物が、本コンセプトを満たす新規の治療候補化合物として判定できる。
【０１１６】
また、他の検出方法として、CS-GAGそのものを直接的に標識する抗CS抗体（クローン：CS56、生化学工業社製）を使用する事ができる。WFAレクチンと同様に、FITC標識抗CS抗体をCSコーティング・ウェルに添加する事で、蛍光数値の変化を見れば、極めて短時間かつ簡便に大量スクリーニングができる。
【０１１７】
より詳細な検出方法として、被検化合物混合前後のプレートをそのまま使用し、sGAG Assay Kit(WIESLAB社製)、Sulphanated Glycosaminoglycans, ELISA Kit（FUNAKOSHI社製）などを適用するにより、GAG含有量を正確に定量・数値化する方法がある。
【０１１８】
さらに詳細には、被検化合物混合前後のプレートに2-AB（2-aminobenzamide）や2-AP（2-aminopyridine；いずれもLUD社製など）を添加することにより、遊離GAG鎖の還元末端を簡便に蛍光標識し、糖鎖の各タイプや、各タイプの含有率までを、HPLC、MALDI-MS、LC-MSなどで解析する事により、より詳細な解析が可能である。候補化合物の特性を詳細に調べるという、スクリーニングの次の段階の方法である。
【０１１９】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群における、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記合成量を低下させる化合物を選択する工程
【０１２０】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる。
【０１２１】
次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する。測定は当業者においては公知の手法、例えば、標識した抗体による方法、質量分析法、クロマトグラフィー法等によって適宜実施することができる。
【０１２２】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、合成量を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１２３】
被検化合物が上記(b)合成阻害作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１２４】
上記(b) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸を合成する細胞、細胞株は当該研究者には既知である。ヒトでは例えば、健常人の末梢血を採取後、単核球を分離・培養するという標準的な方法により、16時間の細胞培養でコンドロイチン硫酸を産生してくる（Uhlin-Hansen L et al., Blood 82:2880, 1993.など）。また、より簡便には、既知の細胞株、例えば、線維芽細胞株NIH3T3（Phillip HA, et al. J. Biol. Chem. 279:48640, 2004など）、腎尿細管由来癌細胞株ACHN（Kawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921, 2002）、腎遠位尿細管由来細胞株MDCK（Borges FT et al., Kidney Int. 68:1630, 2005.など）、血管内皮細胞株HUVEC（Schick BP et al., Blood 97:449, 2001など）など、多数挙げられる。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後のCS-GAG量の変化を上記（a）の方法で簡便に数値化できる。細胞培養後のCS-GAG量の増加（すなわち、CS-GAG合成量を反映する）を抑制する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１２５】
さらに、より選択的には、例えばGalNAc4ST-1やXylosylTなどのCS-GAG合成酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的にCS-GAGを合成する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１２６】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、硫酸化を受けていた量を低下させる物質を選択する工程
【０１２７】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１２８】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に残存する脱硫酸化の構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１２９】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１３０】
被検化合物が上記(c)脱硫酸化作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３１】
上記(c) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用に関するスクリーニング方法態様：
基本的に上記（a）の方法と同様、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１３２】
検出方法は、脱硫酸化する事により、プロテオグリカンのコア蛋白側に残存した脱硫酸化断片の２糖構造を、抗プロテオグリカンΔdi４S抗体（クローン；2-B-6、4位に硫酸化を受けていた部分を認識する） あるいは抗プロテオグリカンΔdi6S(クローン；3-B-3、6位に硫酸化を受けていた部分を認識する。ともに生化学工業社製)と反応させることで、脱硫酸化を受けた部分の検出が容易にできる。したがって、混合培養前後のプレートにおいて、FITC標識した2-B-6や3-B-3抗体を反応させ、その蛍光数値の変化を簡便に検出できる。反応前後の蛍光強度を増加させた化合物が、より脱硫酸化を促進する物質であると判定でき、本コンセプトを満たす新規治療候補化合物として簡便に同定できる。
【０１３３】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は、例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞もしくは細胞抽出液あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化過程を構成する酵素、基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
【０１３４】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検物質を接触させる。
【０１３５】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１３６】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１３７】
被検化合物が上記(d)硫酸化阻害の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３８】
上記(d) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸の硫酸化を促進する細胞、細胞株は上記（c）に記載の細胞、細胞株と一致する。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後の硫酸化の程度を、例えば、4位硫酸化を検出する抗体（クローン；LY111）や6位硫酸化を検出する抗体（クローン；MC21C、いずれも生化学工業社製）で簡便に確認できる。蛍光標識抗体を用いて、培養前後の蛍光数値を比較しても良いし、上記（c）同様に、培養前後で2-B-6や3-B-3抗体を使用した検出法を行っても良い。細胞培養後の硫酸化の増加（LY111やMC21Cの蛍光数値増加）を抑制する化合物、もしくは細胞培養後の脱硫酸化の進行（2-B-6や3-B-3の蛍光数値増加）を促進する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１３９】
さらに、より選択的には、例えばC4ST-1やC6ST-1などの硫酸基転移酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的に硫酸基を付加する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１４０】
本発明の他の好ましい態様は、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）該発現量を被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下している化合物、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４１】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。
【０１４２】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【０１４３】
例えば、上記いずれかのタンパク質を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT- PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、上記いずれかのタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、上記いずれかのタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【０１４４】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と該遺伝子の発現量を比較する。
【０１４５】
本方法においては、次いで、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１４６】
また、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１４７】
また、本発明のスクリーニング方法の一態様としては、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下している化合物、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素に機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４８】
本方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。
【０１４９】
ここで「機能的に結合した」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【０１５０】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【０１５１】
「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。
【０１５２】
ここで「接触」は、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【０１５３】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【０１５４】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する。
【０１５５】
本方法においては、次いで、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１５６】
また、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素にと機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１５７】
本発明のスクリーニング方法において見出される網脈絡膜血管新生抑制剤は、好ましくは、網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用のものである。
【０１５８】
また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。
【０１５９】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
【０１６０】
本発明の好ましい態様においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの検出の際に利用可能な、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識する抗体（抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体）も、本発明の網脈絡膜血管新生抑制剤スクリーニング用キットの構成要素に含めることができる。
【０１６１】
上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のVersican（バーシカン）コアタンパク質遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら, Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のVersican（バーシカン）コアタンパク質遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【０１６２】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1 ×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、 42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。
【０１６３】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、例えば配列番号：７１または７２に記載のものであるが、上記本発明中の遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【０１６４】
また本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、網脈絡膜血管新生疾患の治療もしくは予防方法を提供する。
【０１６５】
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、網脈絡膜血管新生疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【０１６６】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【０１６７】
さらに本発明は、本発明の薬剤の、網脈絡膜血管新生抑制剤の製造における使用に関する。
【０１６８】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６９】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１７０】
実施例1：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果：硫酸化CSPGの減弱：
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、出生後2日令 C57BL/6JcLマウス 雌（日本クレア社製）、各々にStreptozocin 10mg/mL（SIGMA社製） 20μL/head に皮下注射し、4週令までCE-2(日本クレア社製)の飼料、滅菌水を与え飼育し、4週令よりHigh Fat Diet食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、2週間飼育させた。2週間目にコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素（20単位/ml；生化学工業社製）を４単位/mouseで、ならびに溶媒（リン酸緩衝液）を2回/1週間、腹腔内投与(1shot/1週間)の4回（2週間）処置を行った。14日目にコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果を検討するため、両群マウスの眼球を摘出し、免疫組織学的検討を加えた。
【０１７１】
摘出眼で凍結ブロック・切片を作成した。切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）抗体（クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、10μg/mL；生化学工業社製）を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質を（ニチレイ社製）添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７２】
得られた組織像を図１に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜の硝子体側に新規にCS56陽性所見を認めてくる。これに対して酵素治療群ではCS56強度が減弱している。CS56は4位のみならず6位硫酸基も認識する抗体であり、この減弱は4位硫酸基の減弱を反映しているものと示唆される。以上より、本モデルマウスにおいて誘導される網膜組織におけるCSPGの沈着は、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の生体内投与により修飾を受け抑制されることが明らかになった。
【０１７３】
実施例２：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果：血管内皮細胞増生の抑制：
実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗血管内皮細胞抗体（CD31；１：200希釈；ファーミンジェン社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ロバ由来抗ラットIgG（1:200希釈；バイオソース社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７４】
得られた組織像を図２に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜硝子体側におけるCD31陽性細胞の数が増加しており、一部硝子体に突出している像も認めた。これは、本モデルが糖尿病性網膜症の前増殖網膜症の段階を反映していると考えられ、モデルの有効性を示すものである。これに対して酵素治療群では、同部位のCD31陽性細胞の数が明らかに減少していた。以上の結果から、２型糖尿病モデルにおいては網膜硝子体側の血管内皮細胞数が増加してくるが、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素投与により、そのような血管増生が抑制させることが示唆された。
【０１７５】
実施例３：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果：コラーゲン増加性変化の抑制：
実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてウサギ由来抗IV型コラーゲン抗体（１：250希釈；Sigma社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（1:200希釈；Jackson ImmunoResearch社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７６】
得られた組織像を図３に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜硝子体側におけるIV型コラーゲン陽性所見の増加とともに、網膜内境界膜に平行して連なる所見を認めた。これは、静脈形態の異常と共に、コラーゲンの増生、すなわち線維化変化を示唆するものである。これに対して酵素治療群では、同部位のIV型コラーゲンの増生が顕著に抑制されていた。以上の結果から、２型糖尿病モデルにおいては網膜コラーゲン増生を認めるが、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素投与により抑制させることが明らかになった。
【０１７７】
実施例４：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：バーシカン発現増強の抑制：
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、出生後2日令 C57BL/6JcLマウス 雌（日本クレア社製）、各々にStreptozocin 10mg/mL（SIGMA社製） 20μL/head に皮下注射し、4週令までCE-2(日本クレア社製)の飼料、滅菌水を与え飼育し、4週令よりHigh Fat Diet食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、2週間飼育させた。2週間目にバーシカンsiRNAカクテル（5’-ATGAAAGGCATCTTATGGATGTGCTCA-3’（配列番号：６７） ; 5’-ATTACTAACCCATGCACTACATCAA-3’（配列番号：６８） ;5’-GGCAGCCACCAGCAGGTACACTCTG-3’（配列番号：６９） ; 5’-CTGCTCAACAGGCTTGTTTGGATAT-3’（配列番号：７０）、1μg/匹、ジーンワールド社製）、またはPBSをあらかじめPBSにて10倍希釈したアテロコラーゲン（コーケン社製）に混合し200μlを腹腔内に注射した。１回/1週間、腹腔内投与(1shot/1週間)の２回（2週間）処置を行った。14日目にバーシカンSiRNA効果を、PCR法により検討した。
【０１７８】
採取した眼球を1.5mlチューブにとりわけ、液体窒素で凍結した。組織50mg当たりに対し、RNA-Bee（TEL-TEST社製）1mlを加えてホモジナイズした懸濁液にchloroform 200μl (Sigma Aldrich Japan社製) を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000rpm、4℃、15分間 遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendorf社製）を用い遠心分離を行った。遠心分離後の上澄み液500μlを別の1.5mlチューブに移し、上澄み液と同等量のisopropannol 500μl(Sigma Aldrich Japan製)を加え混合後、1μlのglycogen (Invitrogen社製)を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75% Ethanol 1000μl (Sigma Aldrich Japan社製)で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分間〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水50μl (大塚製薬社製)に溶解させ、さらに大塚蒸留水にて100倍希釈し、UVプレート（コーニングコースター社製）上でプレートリーダー(POWER Wave XS、BIO-TEK社製)により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。得られたRNAサンプルを500ng/20μlの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR (ASTEC社製)にて加温し、10分間、氷冷した。氷冷後、予め調製していたRT Pre Mix 液（組成：25mM MgCl218.64μl（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μl（Invitrogen社製）、0.1M DTT 6.6μl（Invitrogen社製）、10mM dNTP mix 10μl（Invitrogen社製）、RNase Inhibitor 2μl（Invitrogen社製）、MMLV Reverse transcriptase 1.2μl（Invitrogen社製）、Random primer 2μl （Invitrogen社製）、滅菌蒸留水19.56μl（大塚蒸留水：大塚製薬社製）を80μl加えBLOCK INCUBATORにて42℃、1時間、99℃、5分間、加熱した後、氷冷しcDNA 100μlを作製した。
【０１７９】
得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。
PCR Buffer 2μl [組成：166mM (NH4)2SO4 (Sigma Aldrich Japan社製)、670mM Tris pH8.8(Invitrogen社製)、67mM MgCl2・6H2O(Sigma Aldrich Japan社製)、100mM 2-mercaptoethanol (WAKO社製)]、25mM dNTP mix 0.8μl (Invitrogen社製)、DMSO 0.6μl (Sigma Aldrich Japan社製)、プライマー 0.2μl （forwaed 5’-GACGACTGTCTTGGTGG-3’（配列番号：７１）, reverse 5’-ATATCCAAACAAGCCTG-3’（配列番号：７２）、 GeneWorld社製）、大塚蒸留水 15.7μl、Taq polymerase 0.1μl (Perkin Elmer社製)、cDNA 1μl を混合させAuthorized Themal Cycler (eppendorf社製) により94℃ 45秒、56℃ 45秒、72℃ 60秒で35 cycle 反応させた。反応終了後、得られたPCR産物に2μl Loading Dye (Invitrogen社製)を加え、1.5% UltraPure Agarose (Invitrogen社製)ゲルを作製し、Mupid-2 plus (ADVANCE社製)により100V、20分間 電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE [組成：3mM Tris-HCl(pH7.5) (Invitrogen社製)、 0.2mM EDTA (pH7.5) (Sigma Aldrich Japan社製)]にて10000倍希釈Ethydium Bromide（Invitrogen社製）染色液中で20分間〜30分間 振とうさせた後、I-Scope WD (ADVANCE社製)に設置したEXILIM (CASIO社製)にてゲル撮影し遺伝子発現の確認を行った。
【０１８０】
cDNAの希釈率を9倍と18倍（1/9、1/18）に大別した半定量的PCRの結果を図４に示す。糖尿病未治療群ではバーシカンmRNA発現増強が見られたが、バーシカンsiRNA治療群ではバーシカンmRNAの発現増強を認めなかった。この発現抑制は希釈率１８倍で顕著に認められる。以上より、バーシカンsiRNAを投与する事により、糖尿病性網膜症に伴うバーシカンの発現増強が顕著に抑制される事が証明された。
【０１８１】
実施例５：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：CSPG蓄積の抑制：
次に実施例４においても、実施例１と同様の方法で眼球を摘出し、凍結ブロック・切片を作成した。切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）抗体（クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、10μg/mL；生化学工業社製）を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質を（ニチレイ社製）添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。結果を図５に示す（原図はカラーである）。CS56はCSPG全般を認識するため、バーシカンもその認識対象となる。２型糖尿病モデルマウス未治療群においては硝子体側網膜でCSPGの増加・蓄積を認めるのに対し、バーシカンSiRNA治療群では、このようなCSPG増加・蓄積がほぼ完全に抑制されていた。この結果は、バーシカンSiRNA遺伝子サイレンシングによって、遺伝子発現のみならず、糖蛋白質レベルでの発現増強も、ほぼ完全に抑制されたことを示す。
【０１８２】
実施例６：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：血管内皮細胞増生の抑制：
実施例５と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗血管内皮細胞抗体（CD31；１：200希釈；ファーミンジェン社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ロバ由来抗ラットIgG（1:200希釈；バイオソース社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１８３】
得られた組織像を図６に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜硝子体側におけるCD31陽性細胞の数が増加しているのに対し、SiRNA治療群では同部位のCD31陽性細胞増加がほぼ完全に抑制されていた。以上の結果から、２型糖尿病モデルおける硝子体側網膜の血管内皮増生が、バーシカン遺伝子サイレンシング治療により抑制させることが示唆された。
【０１８４】
実施例７：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：IV型コラーゲン増生の抑制：
実施例５と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてウサギ由来抗IV型コラーゲン抗体（１：250希釈；Sigma社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（1:200希釈；Jackson ImmunoResearch社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１８５】
得られた組織像を図７に示した（原図はカラーである）。未治療群では硝子体側網膜におけるIV型コラーゲン増生を認めるのに対して、SiRNA治療群では顕著に抑制されていた。以上の結果から、２型糖尿病モデルにおける網膜コラーゲン増生はバーシカン遺伝子サイレンシング治療により抑制できることが明らかになった。
【０１８６】
実施例８：高酸素誘発未熟児網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：血管増生の抑制：
未熟児網膜症モデルとして汎用されている高酸素依存性網膜症モデルマウス（Shih SC et al. J. Clin. Invest. 112:50-57, 2003）におけるバーシカンSiRNA遺伝子サイレンシングの臨床効果についても検討を加えた。生後７日目のC57BL/6Jclマウス（日本クレア社製）を、75％±2％の高濃度酸素が維持されたボックス内で5日間飼育し、生後12日目に通常の室内に戻すことにより、生後17日目から21日目に高濃度酸素による網膜新生血管を誘発した。12日目に実施例４と同一のバーシカンsiRNAカクテル（5’-ATGAAAGGCATCTTATGGATGTGCTCA-3’（配列番号：６７）; 5’-ATTACTAACCCATGCACTACATCAA-3’（配列番号：６８）; 5’-GGCAGCCACCAGCAGGTACACTCTG-3’ （配列番号：６９）; 5’-CTGCTCAACAGGCTTGTTTGGATAT-3’（配列番号：７０）、1μg/匹、ジーンワールド社製）、またはPBSをあらかじめPBSにて10倍希釈したアテロコラーゲン（コーケン社製）に混合し１00μlを腹腔内に注射した。
【０１８７】
生後17日目に、両群マウスを全身麻酔下に左心室からFluorscein-Dextran（Sigma社製）をPBSに溶解したものを注入し、眼球を摘出後4％パラフォルムアルデヒドに24時間固定した。その後網膜を取り出し、伸展標本にして、蛍光実体顕微鏡（ライカ社製）で血管造影撮影を行った。結果を図８に示す（原図はカラーである）。未治療群で新生血管や血管透過性の亢進を認めるのに対し、SiRNA治療群では、顕著に抑制されていた。以上の結果から、バーシカン遺伝子サイレンシング治療により、網膜血管新生が抑制できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明に係る、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の蓄積の影響を検討する一例としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの1つであるVersican（バーシカン）のcore site配列を含有するVersican（バーシカン） siRNAは網脈絡膜のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑え、血管新生を抑制することにより糖尿病性網膜症および未熟児網膜症の治療又は予防に効果を有する。本発明に係る網脈絡膜血管新生抑制剤は、Versican（バーシカン） siRNA投与によりVersican（バーシカン）発現が抑えられ網脈絡膜周囲へのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積抑制効果を有することから、網脈絡膜の血管新生を抑制する上で非常に有用である。本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積抑制効果を有する網脈絡膜血管新生抑制剤を投与することによる糖尿病性網膜症および未熟児網膜症の治療又は予防方法は、これまでにない作用機序、薬剤療法によって病変を有効に改善出来る事から、患者のQOLのさらなる向上、医療に役立つ優れた療法と成り得る。
【０１８９】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおける、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素のCSPGの減弱効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるCSPG（CS56）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図２】２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおける、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の血管増生抑制効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜における血管内皮細胞（CD31）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図３】２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおける、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素のコラーゲン増生抑制効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるIV型コラーゲン染色像（茶色、矢印）を示す。
【図４】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球におけるバーシカン発現増強と、バーシカンSiRNA治療による発現サイレンシング効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス眼球のバーシカン遺伝子発現を示す。内部コントロールとしてGAPDHを示す。未治療群（左）でバーシカン発現の増強を認めるのに対し、SiRNA治療群（右）ではバーシカン発現が抑制されている。
【図５】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球における、バーシカンSiRNA治療によるCSPG蓄積抑制を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるCSPG（CS56）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図６】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球における、バーシカンSiRNA治療による血管増生の抑制を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜における血管内皮細胞（CD31）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図７】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球における、バーシカンSiRNA治療によるコラーゲン増生の抑制を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるIV型コラーゲン染色像（茶色、矢印）を示す。
【図８】高酸素依存性網膜血管新生における、バーシカンSiRNA治療による血管新生の抑制を示す写真である。網膜伸展標本を示す。新生血管（緑、矢印）が治療群で抑制されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質有効成分とした、CSPGの眼組織、特に網膜ならびに脈絡膜（網脈絡膜）への沈着抑制剤、網脈絡膜の血管増生・新生の抑制剤、CSPGの沈着抑制方法、及び該方法に基づく眼血管新生疾患、とりわけ網膜症や黄斑変性症に対する治療または予防に関するものである。本発明はコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素、バーシカン・アンチセンス薬等を代表例とする、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質を有効成分として含む網脈絡膜血管新生疾患、とりわけ糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症などの治療・予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
眼疾患における網脈絡膜血管新生は視機能を低下させ、失明にまで至らしめる重篤な病態であり治療に困難を来たすことが多い。主要な疾患として、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症などが挙げられる。
【０００３】
網膜血管の微小循環障害が原因で虚血を来たし、網膜新生血管が発症するものとして糖尿病網膜症がある。糖尿病網膜症は、現在本邦における成人中途失明の原因の第一位である。高血糖の長期暴露で、血液の凝固能と抗凝固能のバランスは凝固側に傾き、血管平滑筋収縮も起き易くなり、微小血管閉塞による虚血が生じる。虚血組織は生存のために、虚血網膜上に線維血管膜を作り、新生血管を発症させる。そして増殖膜から硝子体に新生血管が生じて硝子体出血をきたし著しい視力低下を来たす。さらに網膜周辺部虚血により、隅角に新生血管が張り眼房水吸収障害を来たすと続発性緑内障が発症する。虚血の軽減、新生血管増殖抑制のため治療として、現在はレーザー光凝固術、網膜硝子体手術が施行されているが、失明に至るケースは少なくない。
【０００４】
網膜静脈閉塞症は、高血圧や高脂血症が主な原因で、動脈硬化等により動静脈交差部の静脈に狭窄が生じ、狭窄部血管内に微小塞栓物質が沈着しさらなる狭窄、閉塞が生じる病態である。眼血管系は終動脈を形成し、血液は動脈分岐で末梢血管に流れ、末梢血管からの血液還流として静脈に戻ってくる。網膜の大静脈に閉塞が生じると、比較的高い圧で抹消へ流れた血液が閉塞した静脈で血流が遮断され、静脈の形態的破綻として網膜出血や硝子体出血を来たし、著しい視力低下を来たす。静脈の支配領域の網膜組織は、血流の途絶により虚血状態となり新生血管が生じる。糖尿病網膜症と同様な機序で続発性緑内障や硝子体出血を合併する。時に網膜剥離や網膜黄斑部の血管破綻による黄斑浮腫も来たし、失明にまで至る障害を来たす。治療はレーザー光凝固術であり、繰り返す硝子体出血に対しては硝子体網膜症手術を施行する。
【０００５】
未熟な組織の急激な相対的虚血によって新生血管が発症し、合併症として硝子体出血や牽引性網膜剥離をきたす疾患に未熟児網膜症がある。未熟児として出生し、生存のため保育器の中で高濃度酸素に一時期間暴露される。未熟児の網膜血管の成長も不十分で、網膜血管は周辺網膜組織にまで十分に達していない。高濃度酸素下では、未成熟な網膜血管の成長が不必要なため、血管の成長が停止してしまい、保育器下での管理が必要なくなり相対的に低酸素濃度である大気中に戻されたとき、相対的な虚血によって新生血管が発症し、著しい視力障害を来たす。治療にレーザー光凝固や網膜硝子対手術を施行することもある。視力予後は大変不良である。
【０００６】
原因不明の網膜黄斑部の網膜下に脈絡膜から新生血管が発症し、網膜組織に障害を来たす加齢黄斑変性症も失明にいたる眼疾患である。加齢黄斑変性症は、黄斑部の脈絡膜新生血管が発生、増殖し、網膜下や網膜組織、網膜前に新生血管が増殖して黄斑部の浮腫や破壊により著しい視力低下を来たし、欧米では成人中途失明の第一位である。治療は黄斑部中心窩から離れていれば、レーザー光凝固術が施行される。中心窩内の病変に対して、最近では光線力学療法が試みられ、さらに手術療法も行われているが確固たる治療が開発されていない。
【０００７】
網脈絡膜血管新生による眼疾患の治療法としては、手術やレーザー光凝固等の外科的治療が中心に行われているが、薬物療法の開発はまだ始まったばかりである。現在、網脈絡膜血管新生を促進する因子として血管内皮増殖因子(VEGF: vascular endothelial growth factor)が注目を浴びており、VEGFの作用を阻害する薬剤の開発が最良の方法であると現時点で考えられている（非特許文献１）。そのため近年、VEGFをターゲットとした新しい治療薬の研究、開発が進められている（非特許文献２）。しかしながら、VEGFは全身の血管内皮細胞に恒常的に発現するVEGF受容体にも作用するため、病的状態により特異的に作用する治療薬の開発が急務である。
【０００８】
一方、本発明の標的物質であるプロテオグリカンは、コア蛋白質に呼ばれる蛋白質に、1本以上のグリコサミノグリカン(GAG)鎖が共有結合した構造をもつ分子の総称であり細胞表面や細胞外マトリックスの構成成分である（非特許文献３、４）。プロテオグリカンに結合しているGAG鎖の特異的な糖鎖構造がプロテオグリカンの多彩な機能を担うと考えられており、プロテオグリカンはGAGの骨格構造に基づいて、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケタラン硫酸プロテオグリカンと4つに大別される。（非特許文献５〜１１）
【０００９】
一方、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに関しては、胎生時期には必須分子で、各臓器に豊富に存在するが、出生、成長、老化に伴い減少することが知られているが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生体内機能は未だ明らかとなっていない。近年では、CSPGを遺伝的に欠損させたマウスが胎生致死や器官形成不全に陥ることが判明したことから、CSPGは生体に必須の分子であるとの認識が強まっている。
【００１０】
網脈絡膜においては、CSPGは視神経繊維層と光受容体中間層に分布しており、神経や色素上皮細胞を支持する役割りを担っていると考えられている（非特許文献１２）。しかしながら、CSPGがどのように網脈絡膜血管新生と関連してくるかを明確にした報告は過去になく、治療標的とした研究は皆無である。
【００１１】
今回、CSPGを治療標的とした方法として、４位硫酸基を脱硫酸化する、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素、ならびにCSPGの一つであるバーシカンの遺伝子サイレンシング（RNA interference :RNAi）という、異なるアプローチを行い、その生体内効果の検証を加えた。先に述べたコンドロイチナーゼABCと同様に、RNAiを用いてC6STやGalNAcの発現を抑制し、CSPGの動態を生体内で制御した報告はこれまでにはない。
【００１２】
【非特許文献１】Witmer AN, Vrensen GFJM, Van Noorden CJF and Schlingemann RO: Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye diseases. Prog Retin Eye Res. 2003 Jan; 22(1):1-29. Review.
【非特許文献２】Ferrara N, Gerber HP and LeCouter J: The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. Jun; 9（6）: 669-79. Review.
【非特許文献３】Berfield M: Annu Rev Biochem 1999 68:729-777
【非特許文献４】Iozzo RV: Annu Rev Biochem 1998 67:609-652
【非特許文献５】Lindahl, U et al. (1972) In Glycoproteins (Gottschalk, A. ed)pp. 491-517, Elsevier, New York.
【非特許文献６】Oegema, T et al. J. Biol. Chem. (1984) 259, 1720-1726
【非特許文献７】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1988) 263, 10168-10174
【非特許文献８】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6027-6035
【非特許文献９】De Waard et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6036-6043
【非特許文献１０】Moses, J, Oldberg et al. Eur. J.Biol. (1992) 248, 521-526
【非特許文献１１】Yamada, S et al. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, .(1998) 10, 95-123
【非特許文献１２】Inatani M et al. Prog Retin Eye Res. 21:429-447,2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、網脈絡膜血管新生抑制剤、および該薬剤を有効成分とする網脈絡膜血管新生疾患の治療剤、並びに、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、そのような薬剤を開発する鋭意研究を重ねるうち、従来は網脈絡膜血管新生病変の病因とは考えられていなかったCSPGの過剰な蓄積が、網脈絡膜の血管内皮細胞の増殖並びに血管新生病変に寄与しているのではないかと考えた。本発明者らは、この考えにも基づいて複数の異なるアプローチで研究を重ねた結果、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積あるいは生合成を阻害することによって、網脈絡膜血管新生を抑制することができることを実証し、本発明を完成させた。
【００１５】
本発明は、網脈絡膜血管新生抑制剤、および該薬剤を有効成分とする網脈絡膜血管新生疾患の治療剤、並びに、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法等に関し、より具体的には、
〔１〕 コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、網脈絡膜血管新生抑制剤、
〔２〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔４〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔５〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔６〕 網脈絡膜においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕 網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用の、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔８〕 前記網脈絡膜血管新生疾患が、網膜血管新生疾患である、〔７〕に記載の薬剤、
〔９〕 前記網脈絡膜血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、または加齢黄斑変性症である、〔７〕に記載の薬剤、
〔１０〕 被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法、
〔１１〕 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、〔１０〕に記載のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
〔１２〕 前記網脈絡膜血管新生抑制剤が、網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用である、〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔１３〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤の、網脈絡膜血管新生抑制剤の製造における使用、
〔１４〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤を、個体（患者等）へ投与する工程を含む、網脈絡膜血管新生疾患の治療方法、
〔１５〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、CSPG（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の網脈絡膜組織への沈着抑制を目的とし、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を機序とする、網脈絡膜血管新生疾患の治療・予防薬に関する方法を提供することを１つの目的とする。
【００１７】
本発明によって、網脈絡膜血管新生の発症にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積が関係していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積を阻害することにより網脈絡膜血管新生が抑制されることが示された。これまでにない新しいコンセプトの網脈絡膜血管新生疾患の治療薬が提供できることになる。特に網脈絡膜血管新生は現代社会で患者数が増大している、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症などと密接に関連しており、新しいコンセプトの治療薬剤は医療上また産業上も重要な意義を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
代表的な網脈絡膜血管新生疾患の一つである糖尿病性網膜症に伴う病態として、網膜血管の微小循環障害による虚血により発症する、網膜血管新生がある。本発明者らは、眼の網膜組織における血管新生状態の抑制を糖尿病性網膜症治療の有効な方法の一つとするため、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの機能に着目した。そして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑制する状態を糖尿病性網膜症モデルマウスにおいて作出し、詳細に解析したところ、野生型の網膜組織に比してコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積が改善されるとともに、血管新生などが抑制された。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害すると、糖尿病性網膜症に深く関与している網膜組織におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの異常蓄積状態の改善が促進され、網脈絡膜血管新生の抑制につながることを見出した。
【００１９】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、網脈絡膜血管新生抑制剤に関する。
【００２０】
本発明の「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、プロテオグリカンの一つであり、代表的な硫酸化ムコ多糖であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸とタンパク質（コアタンパク質）との共有結合化合物の総称である。本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質（ホモログ・オルソログ等）も本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」に含まれる。例えば、ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。また本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンには、炎症などで一時的にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合しプロテオグリカンになるもの、いわゆるパートタイムプロテオグリカンも含まれる。
【００２１】
以下の記載において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbを例示する。本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはこれらに限られず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を持つ物質であればよい。ここでコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性とは、例えば細胞接着能、または細胞増殖促進などが挙げられる。当業者は次のような方法でコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を評価することができる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのアミノ酸配列の一部の領域を含むタンパク質、または一部の領域と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有するタンパク質の存在下で腫瘍細胞（例えばCaco-2、HT-29細胞など）の分裂増殖を測定する。分裂増殖を促進する効果を持つタンパク質をコンドロイチン硫酸プロテオグリカン活性を有するタンパク質として判定できる（Int J Exp Pathol. 2005 Aug;86(4):219-29およびHistochem Cell Biol. 2005 Aug;124(2):139-49）。ここで高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。
【００２２】
本発明における「網脈絡膜血管新生」とは、網脈絡膜において血管新生が発症している状態を指し、血管新生のマーカーの発現、例えばＣＤ３１陽性細胞の増加や網膜コラーゲンの増生などがみられる状態も含む。
【００２３】
本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する」とは、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」、「合成阻害」、「脱硫酸化」、「硫酸化阻害」などが挙げられるが、これには限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量、機能または活性が比較対象よりも低下または消失させることをいう。本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する物質」とは、特に制限されないが、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進作用を有する物質」、「合成阻害作用を有する物質」、「脱硫酸化作用を有する物質」、または「硫酸化阻害作用を有する物質」である。
【００２４】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」とは、たとえばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現の阻害・存在の減少が挙げられる。ここで「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質が挙げられる。また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばβglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質が挙げられる。これらはいずれも例示であり、これらに限らず広くコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質であればよい。
【００２５】
「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質が生成されることを意味する。また、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の機能」とは、例えば、該タンパク質がコンドロイチン硫酸と結合する機能や、その他の細胞中の構成要素との結合等を挙げることができる。上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
【００２６】
さらにまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素の発現の上昇であってもよい。これらの酵素の例としては、メタロプロテイナーゼ（例えばADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5など）やコンドロイチナーゼ（コンドロイチネース）、Calpain Iなどが挙げられるが、これらには限られない。また「分解促進」は、これらの酵素または酵素の一部の投与により生ずる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量の減少であってもよい。
【００２７】
また「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現の抑制を促す物質の投与により生じるものであってもよい。これらの物質には例えばn-butylate、Diethylcarbamazepine、Tunicamycin、non-steroidal estrogen、Cyclofenil deiphenolなどが挙げられるが、これらには限られない。
【００２８】
「分解促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００２９】
また「分解促進作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する低分子化合物
【００３０】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「合成阻害」とは、たとえばグリコサミノグリカンの生合成の阻害、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成に関わる酵素の阻害などが挙げられるが、必ずしもこれらに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程のいずれかを阻害することを指す。
【００３１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害する物質として、グリコサミノグリカンの生合成を阻害する物質としては、たとえば、β-D-xyloside、2-deoxy-D-glucose (2-DG)、ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate (ETDP)、5-hexyl-2-deoxyuridine (HUdR)などが挙げられる。これらをはじめとした物質によりグリコサミノグリカンの生合成が阻害され、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００３２】
一方、コンドロイチン合成に関わる酵素としては、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどが挙げられる。これらをはじめとした酵素を阻害、発現の抑制等を行うことにより、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００３３】
「合成阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３４】
また「合成阻害作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する低分子化合物
【００３５】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「脱硫酸化」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン中の硫酸基が除かれることを指し、例えば内在性あるいは外部から投与される脱硫酸化酵素による脱硫酸化、または硫酸化を抑制する化合物による硫酸化の抑制などが挙げられるが、これらに限られず、硫酸基が除去される過程を指す。
【００３６】
脱硫酸化酵素としては、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseが挙げられる。また、硫酸化を抑制する化合物としては、たとえばChlorate、EGF receptor antagonistなどが挙げられる。
【００３７】
「脱硫酸化作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３８】
また「脱硫酸化作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質に対して、ドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化抑制タンパク質変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する低分子化合物
【００３９】
ここで「脱硫酸化抑制化合物」は、タンパク質には限られず、例えば補酵素など非タンパク質化合物を含む。
【００４０】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「硫酸化阻害作用」とは、例えば、硫酸基転移酵素の阻害が挙げられるが、これに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程に生じる硫酸化が阻害されることを指す。
【００４１】
硫酸基転移酵素としては、例えば、C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などが挙げられる。
【００４２】
「硫酸化阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００４３】
また「硫酸化阻害作用を有する物質」としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物
【００４４】
上記例示した酵素は、一遺伝子に対応する一酵素を示すのみならず、ある特徴を共有する酵素群をも含む。例えばコンドロイチナーゼは、ムコ多糖分解酵素という特徴は共有するが基質特異性などの異なるABC、AC、Bなどの酵素の総称である。例えば、コンドロイチナーゼAC Iは、コンドロイチン硫酸類 (A、CまたはE)、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸-デルマタン硫酸ハイブリッド型およびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-グルクロン酸残基を持つオリゴ糖を生成する。本酵素はデルマタン硫酸 (コンドロイチン硫酸B，ヘキスロン酸としてL-イズロン酸を持つもの)、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンには作用しない。また、コンドロイチナーゼAC II は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸CのN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、Δ4-不飽和二糖(ΔDi-0S、ΔDi-4SおよびΔDi-6S)を生成する。本酵素はヒアルロン酸にもよく作用する。デルマタン硫酸(コンドロイチン硫酸B)には作用せず、本酵素の競合的阻害剤となる。コンドロイチナーゼB(デルマタナーゼ)は、デルマタン硫酸のL-イズロン酸に結合したN-アセチルガラクトサミニド結合を脱離反応的に切断し、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つオリゴ糖(2糖および4糖)を生成する。本酵素はL-イズロン酸を含まないコンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸Cには作用しない。デルマタン硫酸の硫酸基を除去した誘導体であるデルマタンは、この酵素の基質とはならない。デルマタン硫酸のL-イズロン酸単位の第2位が硫酸化されている箇所はこの酵素によってよりよく切断される。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つ二糖を主に生成する。本酵素はケタラン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸には作用しない。コンドロイチナーゼはこのような、異なる性質を持っていながらもムコ多糖分解酵素という共通の性質を持つ酵素の総称であり、必ずしもここで例示したChondroitinase ACI、Chondroitinase AC II、Chondrotinase B、Chondroitinase ABCには限られない。
【００４５】
また、このような特徴を共有する酵素群は、必ずしもゲノムDNA上の一遺伝子に対応するものではない。例えば、chondroitin-4-sulfatase、chondroitin-6-sulfataseは、ともにゲノムデータベース上の複数のアクセッション番号で参照される配列（例えばGenbankアクセッション番号NT_039500（その一部はアクセッション番号CAAA01098429（配列番号：７３）としてあらわされる）、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_001030811、NW_001030796、NW_000349）として公共遺伝子データベースGenbank上で検索される。
【００４６】
上記に例示したもののうち個別の遺伝子に対応しているものは下記のように示される。すなわち、上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして例示した、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素として例示した、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I、コンドロイチン合成に関わる酵素として例示した、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylT、硫酸基転移酵素として例示した、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2をそれぞれヒトにおいてコードする遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号、塩基配列、アミノ酸配列は、次の通りである。
aggrican（アクセッション番号NM_007424、塩基配列の配列番号：１、アミノ酸配列の配列番号：２）
versican（バーシカン）（アクセッション番号BC096495、塩基配列の配列番号：３、アミノ酸配列の配列番号：４）
neurocan（アクセッション番号NM_010875、塩基配列の配列番号：５、アミノ酸配列の配列番号：６）
brevican（アクセッション番号NM_007529、塩基配列の配列番号：７、アミノ酸配列の配列番号：８）
βglycan（アクセッション番号AF039601、塩基配列の配列番号：９、アミノ酸配列の配列番号：１０）
Decorin（アクセッション番号NM_007833、塩基配列の配列番号：１１、アミノ酸配列の配列番号：１２）
Biglycan（アクセッション番号BC057185、塩基配列の配列番号：１３、アミノ酸配列の配列番号：１４）
Fibromodulin（アクセッション番号NM_021355、塩基配列の配列番号：１５、アミノ酸配列の配列番号：１６）
PG-Lb（アクセッション番号NM_007884、塩基配列の配列番号：１７、アミノ酸配列の配列番号：１８）
ADAMTS-1（アクセッション番号NM_009621、塩基配列の配列番号：１９、アミノ酸配列の配列番号：２０）
ADAMTS-4（アクセッション番号NM_172845、塩基配列の配列番号：２１、アミノ酸配列の配列番号：２２）
ADAMTS-5（アクセッション番号AF140673、塩基配列の配列番号：２３、アミノ酸配列の配列番号：２４）
Calpain I（アクセッション番号NM_007600、塩基配列の配列番号：２５、アミノ酸配列の配列番号：２６）
GalNAc4ST-1（アクセッション番号NM_175140、塩基配列の配列番号：２７、アミノ酸配列の配列番号：２８）
GalNAc4ST-2（アクセッション番号NM_199055、塩基配列の配列番号：２９、アミノ酸配列の配列番号：３０）
GALNAC4S-6ST（アクセッション番号NM_029935、塩基配列の配列番号：３１、アミノ酸配列の配列番号：３２）
UA2OST（アクセッション番号NM_177387、塩基配列の配列番号：３３、アミノ酸配列の配列番号：３４）
GalT-I（アクセッション番号NM_016769、塩基配列の配列番号：３５、アミノ酸配列の配列番号：３６）
GalT-II（アクセッション番号BC064767、塩基配列の配列番号：３７、アミノ酸配列の配列番号：３８）
GlcAT-I（アクセッション番号BC058082、塩基配列の配列番号：３９、アミノ酸配列の配列番号：４０、またはアクセッション番号NM_024256、塩基配列の配列番号：４１、アミノ酸配列の配列番号：４２）
XylosylT（アクセッション番号NM_145828、塩基配列の配列番号：４３、アミノ酸配列の配列番号：４４）
C4ST-1（アクセッション番号NM_021439、塩基配列の配列番号：４５、アミノ酸配列の配列番号：４６）
C4ST-2（アクセッション番号NM_021528、塩基配列の配列番号：４７、アミノ酸配列の配列番号：４８）
C4ST-3（アクセッション番号XM_355798、塩基配列の配列番号：４９、アミノ酸配列の配列番号：５０）
D4ST（アクセッション番号NM_028117、塩基配列の配列番号：５１、アミノ酸配列の配列番号：５２）
C6ST-1（アクセッション番号NM_016803、塩基配列の配列番号：５３、アミノ酸配列の配列番号：５４）
C6ST-2（アクセッション番号AB046929、塩基配列の配列番号：５５、アミノ酸配列の配列番号：５６）
【００４７】
上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば細胞内の構成成分と結合する機能等）を持つタンパク質は、本発明の上記タンパク質に含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。
【００４８】
本発明における上記遺伝子には、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトの上記遺伝子のホモログ等）が含まれる。
【００４９】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。
【００５０】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用、合成阻害作用、脱硫酸化作用または硫酸化阻害作用の活性測定方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、後出の本発明におけるスクリーニング方法の項にて記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質および遺伝子に相当する上記タンパク質および遺伝子、あるいは、上述のタンパク質および遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質および遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【００５１】
本発明の上記タンパク質は、天然のタンパク質としてのほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質としては、例えば上記タンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、上記タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、例えば、上記タンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより、調製することが可能である。本発明の上記タンパク質は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
【００５２】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。
【００５３】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。
【００５４】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素のいずれかをコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または500塩基以上であってもよい。
【００５５】
本発明のアンチセンス核酸は特に制限されないが、例えばVersican（バーシカン）遺伝子の塩基配列（GenBankのアクセッション番号BC096495、配列番号：３）、C4ST-1（GenBankのアクセッション番号NM_021439、配列番号：４５）、C4ST-2（GenBankのアクセッション番号NM_021528、配列番号：４７）、C4ST-3（GenBankのアクセッション番号XM_355798、配列番号：４９）等をもとに作成することができる。
【００５６】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。
【００５７】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。
【００５８】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００５９】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。
【００６０】
近年のゲノムプロジェクトの完了によってヒトの全塩基配列が解読され数多くの疾患関連遺伝子が盛んに同定されている現在、特定の遺伝子を標的とした治療法、創薬開発が盛んに実施されている。中でも特異的転写後抑制効果を発揮するsmall interfering RNA(siRNA)の遺伝子治療への応用が注目されている。RNAiは、2本鎖RNA(dsRNA)が直接細胞内に取り込まれると、このdsRNAと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖dsRNA(siRNA)を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。
【００６１】
RNAiは1998年にFireらによって発見された現象（Fire A, Nature (1998) 391, :806-811）で、二本鎖RNA(double strand RNA)が相同な標的遺伝子の発現を強力に抑制するというものである。従来のベクター等を用いる遺伝子導入法に比べ簡便であり、標的に対する特異性が高く、遺伝子治療への応用が可能であるということで最近注目されている。
【００６２】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００６３】
siRNAの設計にあたっては、ターゲットとしては上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、Versican（バーシカン）遺伝子の塩基配列（配列番号：３）、C4ST-1遺伝子の塩基配列（配列番号：４５）、C4ST-2遺伝子の塩基配列（配列番号：４７）、C4ST-3遺伝子の塩基配列（配列番号：４９）等をもとに作成することができる。より具体的には、その配列の一部の領域をターゲット候補とすることが可能であり、例えば、Versican（バーシカン）遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５７）、C4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５８）、C4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５９）、C4ST-3遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６０）、C6ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６１）、C6ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６２）、GalNAc4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６３）、GalNAc4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６４）、GALNAC4S-6STの塩基配列の一部領域（配列番号：６５）等をもとに作成することができる。さらに具体的には、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜７０）を標的とするsiRNAが例示できる。
【００６４】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００６５】
また上記２本のRNA分子は、ここで一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)であってもよい。shRNAとは、ショートヘアピンRNA(short hairpin RNA)と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。
【００６６】
また本発明の好ましい態様としては、Versican（バーシカン）、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）であって、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜７０）を標的とするsiRNAにおいて、例えば、１もしくは少数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAであっても、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。
【００６７】
RNAi(siRNA)のために使用されるRNAは、上記タンパク質をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。
【００６８】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。
【００６９】
例えば、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
【００７０】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００７１】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖RNAである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖RNAの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのsiRNAは、当業者においては市販の核酸合成機およびDICER酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。
【００７２】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド(RNA)でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
【００７３】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７４】
また、本発明の発現阻害物質には、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現調節領域（例えば、プロモーター領域。具体的な例としては、PG-Lbのプロモーター領域である配列番号：６６で表される塩基配列が挙げられる。）と結合することにより、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また当業者においては、所望の化合物について、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。
【００７５】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７６】
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、Versican（バーシカン）、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）を発現するベクターを挙げることができる。
【００７７】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の上述のタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素やその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００７８】
本発明の抗体は、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。
【００７９】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。
【００８０】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。
【００８１】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００８２】
本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に対する抗体は、該タンパク質と結合することにより、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ましい。
【００８３】
さらに本発明は、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素の機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。該低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。
【００８４】
さらに本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体（ドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。このようなドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸との結合を野生型Versican（バーシカン）コアタンパク質と競合阻害するようなVersican（バーシカン）コアタンパク質変異体を挙げることができる。
【００８５】
また本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する組織または細胞は特に限定はされないが、好ましくは網脈絡膜であり、より好ましくは網脈絡膜における血管内皮細胞である。
【００８６】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する化合物は、網脈絡膜血管新生疾患の治療または予防のための薬剤となることが期待される。ここで「治療または予防」は、網脈絡膜血管新生を呈する組織、または細胞に対して、必ずしも完全な治療効果または予防効果を有する必要はなく、部分的な効果を有する場合であってよい。
【００８７】
本発明において網脈絡膜血管新生疾患は、網脈絡膜血管新生を伴う疾患であれば特に限定はされないが、好ましくは網脈絡膜血管新生疾患であり、さらに好ましくは、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症等を挙げることができる。
【００８８】
本発明の網脈絡膜血管新生抑制剤は、網脈絡膜血管新生の原因であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害することにより網脈絡膜血管新生を抑制する作用を有する。従って、本発明の好ましい態様としては、例えば、本発明の網脈絡膜血管新生抑制剤を有効成分とする、網膜血管新生疾患治療剤、糖尿病性網膜症治療剤、網膜静脈閉塞症治療剤、未熟児網膜症治療剤、または加齢黄斑変性症治療剤を提供する。
【００８９】
また本発明の「網脈絡膜血管新生抑制剤」は、「網脈絡膜血管新生治療剤」、または「網脈絡膜血管新生改善剤」等と表現することも可能である。また、本発明において「抑制剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
【００９０】
なお、本発明における「治療」には、網脈絡膜血管新生の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、網脈絡膜血管新生発現細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００９１】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、点眼剤あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤、頭蓋内投与注射剤、鼻腔内投与注射剤あるいは硝子体腔内投与注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００９２】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００９３】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００９４】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００９５】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００９６】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００９７】
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。網脈絡膜血管新生組織等に局所的に投与することもできる。siRNAに関して、in vitroにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、in vivoにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまう。それゆえ、生体内にて持続時間が限られることが問題となり最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。最近の報告では（Takeshita F. PNAS.(2003) 102(34) 12177-82、Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004) 32(13) e109）、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、siRNAのキャリアーとして非常に適しているとされている。これらはいずれも例示であり、本発明におけるデリバリー方法はこれらに限られない。
【００９８】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。
【００９９】
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【０１００】
本発明の薬剤を使用する場合は、網脈絡膜血管新生を発現する疾患であれば適用部位もしくは疾患の種類は特に限定されず、例えば網膜血管新生疾患、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症を対象として適用される。上記疾患は、他の疾患と併発したものであってもよい。
【０１０１】
また本発明は、被検試料からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって、網脈絡膜血管新生抑制剤もしくは網脈絡膜血管新生抑制剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。
【０１０２】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【０１０３】
これらに共通したスクリーニングの基本的な原理として、代表的な例として、下記の工程を含むものが挙げられる。
（１） コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)そのもの／もしくはグリコサミノグリカン(GAG)鎖／もしくはCSPGやGAG鎖を合成（生成）する細胞
（２） 被検化合物（例えば、製薬企業の有する莫大な化合物ライブラリー）
（３） コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の切断断面／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)量／遊離グリコサミノグリカン(GAG)量を検出する方法
上記3種のツールを用いる。（１）と（２）を試験管内、もしくは培養皿上で混合させ、その効果を（３）により簡便に検出するという手順が望ましい。
【０１０４】
以下、本発明のスクリーニング方法の態様を例示する。なお、以下に記載の態様においては、用いられるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、脱硫酸化酵素の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来するものが挙げられるが、これらに由来するものに特に制限されない。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一部とは、グリコサミノグリカン鎖、コアタンパク質などの構成要素またはその一部であり、特に限定されない。
【０１０５】
また以下に記載の態様に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
【０１０６】
また以下に記載の態様における被検化合物への「接触」は、通常、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、その一部、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素を被検化合物と混合することによって行うが、この方法に限定されない。例えば、これらのタンパク質またはその一部を発現する細胞を被検化合物と接触させることにより、上記「接触」を行うことができる。
【０１０７】
また以下に記載の態様における「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、それぞれの態様において用いられるタンパク質を発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。例えば、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを発現する細胞」としては、内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子を発現している細胞、または外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が発現した細胞は、通常コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【０１０８】
また以下の記載において、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican（バーシカン）、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質、また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばDecorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質である。また「合成酵素」は、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどである。また「硫酸基転移酵素」は、例えば、C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などである。また、「分解促進酵素」とは、例えば、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Chondroitinase ABC (ChABC)、Chondroitinase AC、Chondroitinase B、Calpain Iなどである。また「脱硫酸化酵素」は、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseなどである。
【０１０９】
本発明のスクリーニング方法の態様として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用を有する化合物を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、存在量を低下させる物質を選択する工程
【０１１０】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１１１】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に結合する標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１１２】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１１３】
被検化合物が上記(a)分解促進作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１１４】
上記(a) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用に関するスクリーニング方法態様：
CS-GAGとして、コンドロイチン硫酸A（CS-A）、CS-B、CS-C（生化学工業社、ICN社、Sigma社など）、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１１５】
検出方法としては、例えばWFAレクチン（ノダフジレクチン）結合法が簡便な手法として挙げられる。WFAレクチンはCS-GAG鎖のGalNAc残基に結合するため、CS-GAGを簡便に検出できる。被検化合物の陽性コントロールとしてはコンドロイチナーゼABCを使用する。コンドロイチナーゼABC添加により、CS-GAG鎖が分解されるとWFAレクチンが結合できなくなるため、その原理を利用する。より具体的には、FITC標識WFAレクチン（EY社など）を、被検化合物混合前後でCSコーティング・ウェルに添加し、CS-GAGが分解される事により、ウェル中のFITC蛍光強度の変化を蛍光プレートリーダーあるいは蛍光顕微鏡などの検出機器により極めて簡便に定量・数値化できる。混合前後で最も蛍光数値を減少させた化合物が、本コンセプトを満たす新規の治療候補化合物として判定できる。
【０１１６】
また、他の検出方法として、CS-GAGそのものを直接的に標識する抗CS抗体（クローン：CS56、生化学工業社製）を使用する事ができる。WFAレクチンと同様に、FITC標識抗CS抗体をCSコーティング・ウェルに添加する事で、蛍光数値の変化を見れば、極めて短時間かつ簡便に大量スクリーニングができる。
【０１１７】
より詳細な検出方法として、被検化合物混合前後のプレートをそのまま使用し、sGAG Assay Kit(WIESLAB社製)、Sulphanated Glycosaminoglycans, ELISA Kit（FUNAKOSHI社製）などを適用するにより、GAG含有量を正確に定量・数値化する方法がある。
【０１１８】
さらに詳細には、被検化合物混合前後のプレートに2-AB（2-aminobenzamide）や2-AP（2-aminopyridine；いずれもLUD社製など）を添加することにより、遊離GAG鎖の還元末端を簡便に蛍光標識し、糖鎖の各タイプや、各タイプの含有率までを、HPLC、MALDI-MS、LC-MSなどで解析する事により、より詳細な解析が可能である。候補化合物の特性を詳細に調べるという、スクリーニングの次の段階の方法である。
【０１１９】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群における、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記合成量を低下させる化合物を選択する工程
【０１２０】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる。
【０１２１】
次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する。測定は当業者においては公知の手法、例えば、標識した抗体による方法、質量分析法、クロマトグラフィー法等によって適宜実施することができる。
【０１２２】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、合成量を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１２３】
被検化合物が上記(b)合成阻害作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１２４】
上記(b) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸を合成する細胞、細胞株は当該研究者には既知である。ヒトでは例えば、健常人の末梢血を採取後、単核球を分離・培養するという標準的な方法により、16時間の細胞培養でコンドロイチン硫酸を産生してくる（Uhlin-Hansen L et al., Blood 82:2880, 1993.など）。また、より簡便には、既知の細胞株、例えば、線維芽細胞株NIH3T3（Phillip HA, et al. J. Biol. Chem. 279:48640, 2004など）、腎尿細管由来癌細胞株ACHN（Kawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921, 2002）、腎遠位尿細管由来細胞株MDCK（Borges FT et al., Kidney Int. 68:1630, 2005.など）、血管内皮細胞株HUVEC（Schick BP et al., Blood 97:449, 2001など）など、多数挙げられる。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後のCS-GAG量の変化を上記（a）の方法で簡便に数値化できる。細胞培養後のCS-GAG量の増加（すなわち、CS-GAG合成量を反映する）を抑制する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１２５】
さらに、より選択的には、例えばGalNAc4ST-1やXylosylTなどのCS-GAG合成酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的にCS-GAGを合成する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１２６】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、硫酸化を受けていた量を低下させる物質を選択する工程
【０１２７】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１２８】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に残存する脱硫酸化の構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１２９】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１３０】
被検化合物が上記(c)脱硫酸化作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３１】
上記(c) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用に関するスクリーニング方法態様：
基本的に上記（a）の方法と同様、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１３２】
検出方法は、脱硫酸化する事により、プロテオグリカンのコア蛋白側に残存した脱硫酸化断片の２糖構造を、抗プロテオグリカンΔdi４S抗体（クローン；2-B-6、4位に硫酸化を受けていた部分を認識する） あるいは抗プロテオグリカンΔdi6S(クローン；3-B-3、6位に硫酸化を受けていた部分を認識する。ともに生化学工業社製)と反応させることで、脱硫酸化を受けた部分の検出が容易にできる。したがって、混合培養前後のプレートにおいて、FITC標識した2-B-6や3-B-3抗体を反応させ、その蛍光数値の変化を簡便に検出できる。反応前後の蛍光強度を増加させた化合物が、より脱硫酸化を促進する物質であると判定でき、本コンセプトを満たす新規治療候補化合物として簡便に同定できる。
【０１３３】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は、例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞もしくは細胞抽出液あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化過程を構成する酵素、基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
【０１３４】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検物質を接触させる。
【０１３５】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１３６】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は網脈絡膜血管新生治療のための薬剤となる。
【０１３７】
被検化合物が上記(d)硫酸化阻害の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３８】
上記(d) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸の硫酸化を促進する細胞、細胞株は上記（c）に記載の細胞、細胞株と一致する。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後の硫酸化の程度を、例えば、4位硫酸化を検出する抗体（クローン；LY111）や6位硫酸化を検出する抗体（クローン；MC21C、いずれも生化学工業社製）で簡便に確認できる。蛍光標識抗体を用いて、培養前後の蛍光数値を比較しても良いし、上記（c）同様に、培養前後で2-B-6や3-B-3抗体を使用した検出法を行っても良い。細胞培養後の硫酸化の増加（LY111やMC21Cの蛍光数値増加）を抑制する化合物、もしくは細胞培養後の脱硫酸化の進行（2-B-6や3-B-3の蛍光数値増加）を促進する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１３９】
さらに、より選択的には、例えばC4ST-1やC6ST-1などの硫酸基転移酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的に硫酸基を付加する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１４０】
本発明の他の好ましい態様は、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）該発現量を被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下している化合物、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４１】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。
【０１４２】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【０１４３】
例えば、上記いずれかのタンパク質を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT- PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、上記いずれかのタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、上記いずれかのタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【０１４４】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と該遺伝子の発現量を比較する。
【０１４５】
本方法においては、次いで、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１４６】
また、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１４７】
また、本発明のスクリーニング方法の一態様としては、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下している化合物、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素に機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４８】
本方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。
【０１４９】
ここで「機能的に結合した」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【０１５０】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【０１５１】
「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。
【０１５２】
ここで「接触」は、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【０１５３】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【０１５４】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する。
【０１５５】
本方法においては、次いで、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１５６】
また、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素にと機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、網脈絡膜血管新生抑制のための薬剤もしくは網脈絡膜血管新生治療のための候補化合物となる。
【０１５７】
本発明のスクリーニング方法において見出される網脈絡膜血管新生抑制剤は、好ましくは、網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用のものである。
【０１５８】
また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。
【０１５９】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
【０１６０】
本発明の好ましい態様においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの検出の際に利用可能な、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識する抗体（抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体）も、本発明の網脈絡膜血管新生抑制剤スクリーニング用キットの構成要素に含めることができる。
【０１６１】
上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のVersican（バーシカン）コアタンパク質遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら, Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のVersican（バーシカン）コアタンパク質遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【０１６２】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1 ×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、 42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。
【０１６３】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、例えば配列番号：７１または７２に記載のものであるが、上記本発明中の遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【０１６４】
また本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、網脈絡膜血管新生疾患の治療もしくは予防方法を提供する。
【０１６５】
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、網脈絡膜血管新生疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【０１６６】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【０１６７】
さらに本発明は、本発明の薬剤の、網脈絡膜血管新生抑制剤の製造における使用に関する。
【０１６８】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６９】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１７０】
実施例1：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果：硫酸化CSPGの減弱：
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、出生後2日令 C57BL/6JcLマウス 雌（日本クレア社製）、各々にStreptozocin 10mg/mL（SIGMA社製） 20μL/head に皮下注射し、4週令までCE-2(日本クレア社製)の飼料、滅菌水を与え飼育し、4週令よりHigh Fat Diet食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、2週間飼育させた。2週間目にコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素（20単位/ml；生化学工業社製）を４単位/mouseで、ならびに溶媒（リン酸緩衝液）を2回/1週間、腹腔内投与(1shot/1週間)の4回（2週間）処置を行った。14日目にコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果を検討するため、両群マウスの眼球を摘出し、免疫組織学的検討を加えた。
【０１７１】
摘出眼で凍結ブロック・切片を作成した。切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）抗体（クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、10μg/mL；生化学工業社製）を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質を（ニチレイ社製）添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７２】
得られた組織像を図１に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜の硝子体側に新規にCS56陽性所見を認めてくる。これに対して酵素治療群ではCS56強度が減弱している。CS56は4位のみならず6位硫酸基も認識する抗体であり、この減弱は4位硫酸基の減弱を反映しているものと示唆される。以上より、本モデルマウスにおいて誘導される網膜組織におけるCSPGの沈着は、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の生体内投与により修飾を受け抑制されることが明らかになった。
【０１７３】
実施例２：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果：血管内皮細胞増生の抑制：
実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗血管内皮細胞抗体（CD31；１：200希釈；ファーミンジェン社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ロバ由来抗ラットIgG（1:200希釈；バイオソース社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７４】
得られた組織像を図２に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜硝子体側におけるCD31陽性細胞の数が増加しており、一部硝子体に突出している像も認めた。これは、本モデルが糖尿病性網膜症の前増殖網膜症の段階を反映していると考えられ、モデルの有効性を示すものである。これに対して酵素治療群では、同部位のCD31陽性細胞の数が明らかに減少していた。以上の結果から、２型糖尿病モデルにおいては網膜硝子体側の血管内皮細胞数が増加してくるが、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素投与により、そのような血管増生が抑制させることが示唆された。
【０１７５】
実施例３：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるコンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の効果：コラーゲン増加性変化の抑制：
実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてウサギ由来抗IV型コラーゲン抗体（１：250希釈；Sigma社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（1:200希釈；Jackson ImmunoResearch社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７６】
得られた組織像を図３に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜硝子体側におけるIV型コラーゲン陽性所見の増加とともに、網膜内境界膜に平行して連なる所見を認めた。これは、静脈形態の異常と共に、コラーゲンの増生、すなわち線維化変化を示唆するものである。これに対して酵素治療群では、同部位のIV型コラーゲンの増生が顕著に抑制されていた。以上の結果から、２型糖尿病モデルにおいては網膜コラーゲン増生を認めるが、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素投与により抑制させることが明らかになった。
【０１７７】
実施例４：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：バーシカン発現増強の抑制：
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、出生後2日令 C57BL/6JcLマウス 雌（日本クレア社製）、各々にStreptozocin 10mg/mL（SIGMA社製） 20μL/head に皮下注射し、4週令までCE-2(日本クレア社製)の飼料、滅菌水を与え飼育し、4週令よりHigh Fat Diet食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、2週間飼育させた。2週間目にバーシカンsiRNAカクテル（5’-ATGAAAGGCATCTTATGGATGTGCTCA-3’（配列番号：６７） ; 5’-ATTACTAACCCATGCACTACATCAA-3’（配列番号：６８） ;5’-GGCAGCCACCAGCAGGTACACTCTG-3’（配列番号：６９） ; 5’-CTGCTCAACAGGCTTGTTTGGATAT-3’（配列番号：７０）、1μg/匹、ジーンワールド社製）、またはPBSをあらかじめPBSにて10倍希釈したアテロコラーゲン（コーケン社製）に混合し200μlを腹腔内に注射した。１回/1週間、腹腔内投与(1shot/1週間)の２回（2週間）処置を行った。14日目にバーシカンSiRNA効果を、PCR法により検討した。
【０１７８】
採取した眼球を1.5mlチューブにとりわけ、液体窒素で凍結した。組織50mg当たりに対し、RNA-Bee（TEL-TEST社製）1mlを加えてホモジナイズした懸濁液にchloroform 200μl (Sigma Aldrich Japan社製) を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000rpm、4℃、15分間 遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendorf社製）を用い遠心分離を行った。遠心分離後の上澄み液500μlを別の1.5mlチューブに移し、上澄み液と同等量のisopropannol 500μl(Sigma Aldrich Japan製)を加え混合後、1μlのglycogen (Invitrogen社製)を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75% Ethanol 1000μl (Sigma Aldrich Japan社製)で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分間〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水50μl (大塚製薬社製)に溶解させ、さらに大塚蒸留水にて100倍希釈し、UVプレート（コーニングコースター社製）上でプレートリーダー(POWER Wave XS、BIO-TEK社製)により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。得られたRNAサンプルを500ng/20μlの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR (ASTEC社製)にて加温し、10分間、氷冷した。氷冷後、予め調製していたRT Pre Mix 液（組成：25mM MgCl218.64μl（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μl（Invitrogen社製）、0.1M DTT 6.6μl（Invitrogen社製）、10mM dNTP mix 10μl（Invitrogen社製）、RNase Inhibitor 2μl（Invitrogen社製）、MMLV Reverse transcriptase 1.2μl（Invitrogen社製）、Random primer 2μl （Invitrogen社製）、滅菌蒸留水19.56μl（大塚蒸留水：大塚製薬社製）を80μl加えBLOCK INCUBATORにて42℃、1時間、99℃、5分間、加熱した後、氷冷しcDNA 100μlを作製した。
【０１７９】
得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。
PCR Buffer 2μl [組成：166mM (NH4)2SO4 (Sigma Aldrich Japan社製)、670mM Tris pH8.8(Invitrogen社製)、67mM MgCl2・6H2O(Sigma Aldrich Japan社製)、100mM 2-mercaptoethanol (WAKO社製)]、25mM dNTP mix 0.8μl (Invitrogen社製)、DMSO 0.6μl (Sigma Aldrich Japan社製)、プライマー 0.2μl （forwaed 5’-GACGACTGTCTTGGTGG-3’（配列番号：７１）, reverse 5’-ATATCCAAACAAGCCTG-3’（配列番号：７２）、 GeneWorld社製）、大塚蒸留水 15.7μl、Taq polymerase 0.1μl (Perkin Elmer社製)、cDNA 1μl を混合させAuthorized Themal Cycler (eppendorf社製) により94℃ 45秒、56℃ 45秒、72℃ 60秒で35 cycle 反応させた。反応終了後、得られたPCR産物に2μl Loading Dye (Invitrogen社製)を加え、1.5% UltraPure Agarose (Invitrogen社製)ゲルを作製し、Mupid-2 plus (ADVANCE社製)により100V、20分間 電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE [組成：3mM Tris-HCl(pH7.5) (Invitrogen社製)、 0.2mM EDTA (pH7.5) (Sigma Aldrich Japan社製)]にて10000倍希釈Ethydium Bromide（Invitrogen社製）染色液中で20分間〜30分間 振とうさせた後、I-Scope WD (ADVANCE社製)に設置したEXILIM (CASIO社製)にてゲル撮影し遺伝子発現の確認を行った。
【０１８０】
cDNAの希釈率を9倍と18倍（1/9、1/18）に大別した半定量的PCRの結果を図４に示す。糖尿病未治療群ではバーシカンmRNA発現増強が見られたが、バーシカンsiRNA治療群ではバーシカンmRNAの発現増強を認めなかった。この発現抑制は希釈率１８倍で顕著に認められる。以上より、バーシカンsiRNAを投与する事により、糖尿病性網膜症に伴うバーシカンの発現増強が顕著に抑制される事が証明された。
【０１８１】
実施例５：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：CSPG蓄積の抑制：
次に実施例４においても、実施例１と同様の方法で眼球を摘出し、凍結ブロック・切片を作成した。切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）抗体（クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、10μg/mL；生化学工業社製）を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質を（ニチレイ社製）添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。結果を図５に示す（原図はカラーである）。CS56はCSPG全般を認識するため、バーシカンもその認識対象となる。２型糖尿病モデルマウス未治療群においては硝子体側網膜でCSPGの増加・蓄積を認めるのに対し、バーシカンSiRNA治療群では、このようなCSPG増加・蓄積がほぼ完全に抑制されていた。この結果は、バーシカンSiRNA遺伝子サイレンシングによって、遺伝子発現のみならず、糖蛋白質レベルでの発現増強も、ほぼ完全に抑制されたことを示す。
【０１８２】
実施例６：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：血管内皮細胞増生の抑制：
実施例５と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗血管内皮細胞抗体（CD31；１：200希釈；ファーミンジェン社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ロバ由来抗ラットIgG（1:200希釈；バイオソース社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１８３】
得られた組織像を図６に示した（原図はカラーである）。未治療群では網膜硝子体側におけるCD31陽性細胞の数が増加しているのに対し、SiRNA治療群では同部位のCD31陽性細胞増加がほぼ完全に抑制されていた。以上の結果から、２型糖尿病モデルおける硝子体側網膜の血管内皮増生が、バーシカン遺伝子サイレンシング治療により抑制させることが示唆された。
【０１８４】
実施例７：Streptozotocin誘発性２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：IV型コラーゲン増生の抑制：
実施例５と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてウサギ由来抗IV型コラーゲン抗体（１：250希釈；Sigma社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（1:200希釈；Jackson ImmunoResearch社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１８５】
得られた組織像を図７に示した（原図はカラーである）。未治療群では硝子体側網膜におけるIV型コラーゲン増生を認めるのに対して、SiRNA治療群では顕著に抑制されていた。以上の結果から、２型糖尿病モデルにおける網膜コラーゲン増生はバーシカン遺伝子サイレンシング治療により抑制できることが明らかになった。
【０１８６】
実施例８：高酸素誘発未熟児網膜症モデルマウスにおけるバーシカン遺伝子サイレンシング効果：血管増生の抑制：
未熟児網膜症モデルとして汎用されている高酸素依存性網膜症モデルマウス（Shih SC et al. J. Clin. Invest. 112:50-57, 2003）におけるバーシカンSiRNA遺伝子サイレンシングの臨床効果についても検討を加えた。生後７日目のC57BL/6Jclマウス（日本クレア社製）を、75％±2％の高濃度酸素が維持されたボックス内で5日間飼育し、生後12日目に通常の室内に戻すことにより、生後17日目から21日目に高濃度酸素による網膜新生血管を誘発した。12日目に実施例４と同一のバーシカンsiRNAカクテル（5’-ATGAAAGGCATCTTATGGATGTGCTCA-3’（配列番号：６７）; 5’-ATTACTAACCCATGCACTACATCAA-3’（配列番号：６８）; 5’-GGCAGCCACCAGCAGGTACACTCTG-3’ （配列番号：６９）; 5’-CTGCTCAACAGGCTTGTTTGGATAT-3’（配列番号：７０）、1μg/匹、ジーンワールド社製）、またはPBSをあらかじめPBSにて10倍希釈したアテロコラーゲン（コーケン社製）に混合し１00μlを腹腔内に注射した。
【０１８７】
生後17日目に、両群マウスを全身麻酔下に左心室からFluorscein-Dextran（Sigma社製）をPBSに溶解したものを注入し、眼球を摘出後4％パラフォルムアルデヒドに24時間固定した。その後網膜を取り出し、伸展標本にして、蛍光実体顕微鏡（ライカ社製）で血管造影撮影を行った。結果を図８に示す（原図はカラーである）。未治療群で新生血管や血管透過性の亢進を認めるのに対し、SiRNA治療群では、顕著に抑制されていた。以上の結果から、バーシカン遺伝子サイレンシング治療により、網膜血管新生が抑制できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１８８】
本発明に係る、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)の蓄積の影響を検討する一例としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの1つであるVersican（バーシカン）のcore site配列を含有するVersican（バーシカン） siRNAは網脈絡膜のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑え、血管新生を抑制することにより糖尿病性網膜症および未熟児網膜症の治療又は予防に効果を有する。本発明に係る網脈絡膜血管新生抑制剤は、Versican（バーシカン） siRNA投与によりVersican（バーシカン）発現が抑えられ網脈絡膜周囲へのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積抑制効果を有することから、網脈絡膜の血管新生を抑制する上で非常に有用である。本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積抑制効果を有する網脈絡膜血管新生抑制剤を投与することによる糖尿病性網膜症および未熟児網膜症の治療又は予防方法は、これまでにない作用機序、薬剤療法によって病変を有効に改善出来る事から、患者のQOLのさらなる向上、医療に役立つ優れた療法と成り得る。
【０１８９】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおける、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素のCSPGの減弱効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるCSPG（CS56）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図２】２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおける、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素の血管増生抑制効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜における血管内皮細胞（CD31）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図３】２型糖尿病性網膜症モデルマウスにおける、コンドロイチン−４−脱硫酸化酵素のコラーゲン増生抑制効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるIV型コラーゲン染色像（茶色、矢印）を示す。
【図４】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球におけるバーシカン発現増強と、バーシカンSiRNA治療による発現サイレンシング効果を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス眼球のバーシカン遺伝子発現を示す。内部コントロールとしてGAPDHを示す。未治療群（左）でバーシカン発現の増強を認めるのに対し、SiRNA治療群（右）ではバーシカン発現が抑制されている。
【図５】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球における、バーシカンSiRNA治療によるCSPG蓄積抑制を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるCSPG（CS56）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図６】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球における、バーシカンSiRNA治療による血管増生の抑制を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜における血管内皮細胞（CD31）染色像（茶色、矢印）を示す。
【図７】２型糖尿病性網膜症モデルマウス眼球における、バーシカンSiRNA治療によるコラーゲン増生の抑制を示す写真である。2型糖尿病モデルマウス網膜におけるIV型コラーゲン染色像（茶色、矢印）を示す。
【図８】高酸素依存性網膜血管新生における、バーシカンSiRNA治療による血管新生の抑制を示す写真である。網膜伸展標本を示す。新生血管（緑、矢印）が治療群で抑制されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、網脈絡膜血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
網脈絡膜においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用の、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記網脈絡膜血管新生疾患が、網膜血管新生疾患である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記網脈絡膜血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、または加齢黄斑変性症である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１０】
被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【請求項１２】
前記網脈絡膜血管新生抑制剤が、網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用である、請求項１０または１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、網脈絡膜血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
網脈絡膜においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用の、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記網脈絡膜血管新生疾患が、網膜血管新生疾患である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記網脈絡膜血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、または加齢黄斑変性症である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１０】
被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、網脈絡膜血管新生抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【請求項１２】
前記網脈絡膜血管新生抑制剤が、網脈絡膜血管新生疾患の治療用または予防用である、請求項１０または１１に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２８６６９５（Ｐ２００９−２８６６９５Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４４５３１（Ｐ２００６−２４４５３１）
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０５１５６７０９）株式会社ステリック再生医科学研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０５１５６７０９）株式会社ステリック再生医科学研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
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