粒子サンプルの拡張解析に対する装置及び方法
本発明は、溶解している粒子サンプルを解析する装置に関し、該装置は、顕微鏡システムを含み、該顕微鏡システムは、サンプルを支持するための支持手段、発光性の活性化ビーム、該発光性の活性化ビームを該サンプル上の焦点に合わせするための焦点合わせ手段、及び解析空間を焦点の周りに定義することが可能な空間選別手段、を含み、前記顕微鏡システムは、また、前記発光性の活性化ビームを拡大するための拡大手段を含み、該拡大手段は、完全に正の焦点距離及び前記サンプルの屈折率よりも高い屈折率を有し、該拡大手段の1部分は、前記発光性の活性化ビームの経路上に、前記支持手段から下流に及び前記焦点から上流に配置され、前記拡大手段の少なくとも1部分は、前記支持手段に堅く固定されている、ことを特徴とする、装置に関する。本発明は、また、溶解している粒子サンプルをそのような解析装置によって解析する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子サンプルの拡張解析に対する装置及び方法に関する。
【０００２】
本発明は、発光又は光学的に散乱する粒子を解析するための装置の分野に関する。
【０００３】
さらに具体的には、それは、溶解している粒子サンプルを解析する装置に関し、該装置は顕微鏡システムを有し、該顕微鏡システムは、そのサンプルを支持する手段、励起光ビームを放射することが可能な照明手段、該励起光ビームをサンプルの焦点に合わせる手段、及び該焦点の周りの解析容積を定義することが可能な空間選別手段を含む。
【背景技術】
【０００４】
当該装置は、発光又は散乱マーキング、すなわち励起光に反応して特定の発光又は散乱する粒子に関する光学解析応用の任意のタイプにおける使用を目的とする。解析される粒子は、分子、又は、例えば分子複合体、ナノ粒子もしくはナノビードなどの分子の集合体であり、照明手段によって放射される光の波長よりも小さい寸法を有する。それは、特に、溶解している蛍光分子を検出する分野において役立ち、さらに具体的には蛍光相関分光において役立つ。それは、生物学的テストにおいて同じく役立ち、さらに正確にはDNA又はたんぱく質チップテストにおいて役立つ。
【０００５】
この分野における従来技術は、共焦点顕微鏡システムを有する解析装置を含む。そのようなシステムは、例えば溶解している、発光又は光学的に散乱している粒子などのサンプルを解析することを目標とする。例えば、蛍光粒子を解析する場合において、そのシステムは、所定の波長のレーザービームを放射するレーザー源、二色性ミラー、非常に高い程度の倍率を持つ顕微鏡レンズ、及び幅広い開口数、光学イメージング手段、空間選別手段、及び検出器を含む。そのレーザービームは、解析することが望まれる解析容積において位置する焦点で、そのレンズによって収束される。その焦点合わせがされたレーザービームの光は、次に、後で検出器に向けられるようにそれらの粒子によって吸収され、レーザービームの波長よりも大きい波長で再放射される。光学イメージング手段は、レーザービームの焦点を検出器に組み合わせるように配置される。
【０００６】
空間選別手段は、解析容積を定義することを可能にし、それによってマイクロメータよりも低い空間分解能の程度が得られる。これを達成するために、それらは、顕微鏡対物の焦点面と共役の面において、検出器から上流に配置された開口を含む。この方法では、レーザービームの焦点の周りの容積に位置する光子だけが、検出器に対して画像の形成に加わる。
【０００７】
溶解している蛍光分子に関するかなりの量の情報を得るためには、相関器が、蛍光相関分光（FCS）検出を実行するために、解析容積によって放射される蛍光光の時間ゆらぎを解析するために検出器に接続されている。蛍光及びその時間ゆらぎが、従って、解析される。これらの揺らぎは、解析容積を通るフルオフォア（fluophore）の散乱に直接関する。短期的には、検出された高度を自動相関する機能は、エミッタの光物理的パラメータ及び検出される分子の平均数へのアクセスを可能にする。長期的には、この機能は、分子の平均滞留時間‐散乱時間‐及びその散乱のモードについての情報を、解析容積を通して供給する。
【０００８】
そのような装置は、より大きい開口を活用することを可能にし、そうすることによって最大量の光及び蛍光を集め、解析容積を減少させ、その結果として溶液において散乱するノイズを低減することも可能にする。
【０００９】
それにもかかわらず、単一分子の解析分解能が望まれる応用に対して、そのような装置は、いくつかの欠点を持つ。実際のところ、回折現象がレーザーの焦点スポットに基本的な限定を設定することから、解析容積の寸法にも基本的な限定を設定する。これらの減少は、その結果、解析容積毎に１つの分子だけを解析することを望む限り、分子毎の計数率を固定された累乗で限定し、単一分子の検出を可能にする分子の最大濃度も限定する。さらに、レイリー及びレーマン散乱の貢献によるバックグラウンドノイズの減少は、このバックグラウンドノイズが解析容積の寸法に比例することから限定される。これらの欠点は、そのような装置が高濃度溶液（約10ナノ‐モルよりも高い）における単一分子の解析には不適当であることを表わす。
【００１０】
解析容積の定義の問題を解決するための解決策が特許文献１に記載されている。該文献において、サンプルを相関分光によって測定するための装置は、視野が収集容積又は解析容積を定める光学焦点システムを含む共焦点顕微鏡、励起ビームを生成し、該ビームを顕微鏡を通してサンプル上に向けることが可能な手段、そのサンプル上で励起ビームの相互作用によって生成され、顕微鏡によって集光される光束の強度を検出する手段、及びその検出手段によって生成される信号を処理する手段、を含む。この装置は、同様に、集められた光束を増加させる光子構造を含み、それは、顕微鏡の光学焦点システムの焦点に配置され、収集容積において干渉縞を形成する。この光子構造は、例えば、耐水二色性ミラーであってもよく、非常に小さい光学的厚さを有する多数の層で構成されてよい。それは、収集容積において干渉縞を形成するために顕微鏡の光学的焦点システムの焦点で配置される。一方では、この構造の実施は、分子毎に集められる信号をかなり増加させ、他方では、収集容積の定義の問題を解決する。
【００１１】
この解決策の欠点は、ミラー上の励起ビームの反射及びそのミラーにおける寄生性ルミネッセンスよって誘導されるノイズを十分に排除することの困難性にある。さらに、解析容積において最大得られる減少は約３であり、それは、現実的な応用における実質的な利益を与えない。
【００１２】
これらの解析装置の分解能を改善する他の解決策が、期待されるかもしれない。特に、検出器によって受け取られる高度を増幅するためには、レーザービームのパワーを増加させることが期待されるが、それは、分子を光破壊する可能性がある。もう１つの選択肢は、顕微鏡レンズの開口数を増加させることであるが、それは、顕微鏡レンズに対する技術が非常に高度であり、開口数のかなりの増加がもはや見られないことから、困難である。同様に、回折現象の結果を限定するために、１つの解決策が、より短い波長を有するレーザー源を使用することにおいて存在するが、そのような増加は、レーザー励起に関して限定される。もう１つの解決策は、例えばダイヤモンドなど、より高い屈折率を有する支持手段を実施してもよいが、そのような材料は、かなりの費用の負担となり、機械加工するのが難しい。近視野走査又は刺激ルミネッセンス減少顕微鏡の使用など、他の解決策が予測できるが、これらの技術は実装が難しく、かなりの費用がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】仏国特許第2,828,959号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、これらの技術的な問題を、解析容積をかなり縮小し、それによって最大１つの分子だけに限られる量が含まれ、励起光ビーム及び放射された発光の集光の両方を拡大させる実施手段によって改善することである。これらの拡大手段は、サンプル上の励起光ビームによって定められる焦点視野をさらに集中させ、さらに濃縮させるように配置され、この視野は、回折限度よりも小さい寸法に達することが可能であり、それによってフェムトリットルよりも小さい容積において解析が可能になることから、高濃度溶液（10ナノ・モルよりも高い）における単一分子だけを含むことが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
その解決策へのアプローチは、サンプル上の励起光ビームによって定められる焦点視野を減少させ、放射光を集める効率を上げることを目的として、「光子ジェット」装置としても知られるナノ・フォトニック装置を実装することにおいて存在する。このタイプの装置に関する従来技術は、コリメートされたビームの焦点合わせをするように、そのビームの経路上に配置されたマイクロビードを含む。これは、通常のビームに比較して、そのビームに小さな発散を与え、その軸に沿って不変性も与え、それは、小さな範囲においてかなり回折する可能性がある。従って、焦点で収束性を持つこのタイプの装置は、顕微鏡解析装置の励起光などの大いに焦点が合わせられた光ビーム経路に沿った使用とは明らかに互換性がない。そのような事情で、そのようなナノ・フォトニック放射装置を部分的に通り抜ける励起光ビームの性質の調査及びその実装は、サンプルの解析容積におけるかなりの減少の実証を可能にした。
【００１６】
この目的に対し、本発明の対象は、上述の解析装置であり、それにおいて、既に述べた特徴に加えて、顕微鏡システムが励起光ビームを拡大する手段を同様に含み、その拡大手段は、完全にプラスである焦点距離及びサンプルの屈折率よりも大きい屈折率を有し、その拡大手段の少なくとも1部分は、励起光ビームの経路上に、支持手段から下流方向に及び焦点から上流方向に配置され、その拡大手段の少なくとも1部分は、支持手段と一体ではない。
【００１７】
従って、実装される拡大手段は、励起光ビームが初期の解析容積よりも小さい寸法の領域において過度に焦点が合わせられることができるようにする。実際は、入射光の拡大手段を通り抜ける部分は、その拡大手段の境界領域において収束し、この領域は、拡大手段の焦点及び屈折率によってさらに狭くされている。光ビームの拡大手段を通り抜けない部分は、相殺的干渉の減少に従って、それを取り抜ける部分と干渉する。入射光の光度の大部分は、従って、波長の半分程度の縦方向寸法を持ち、その波長程度の軸方向寸法を持つ容積において集中することから、回折限度よりも小さい寸法を持つ。
【００１８】
さらに、拡大手段の屈折率によって、サンプル上の励起光ビームの相互作用に反応して生成され、焦点手段によって集光される反応光ビームは、望ましくは、空間における1つ又はそれ以上の特定の方向に向けられている。実際には、粒子は光を再放射し、拡大手段の屈折率がより高いことから、望ましくは、拡大手段に向けて再放射する。この方法では、さらに大きい反応光束でさえ集められ検出されることから、放射された発光の集合体を同じく拡大することを可能にする。
【００１９】
本発明による解析装置は、従って、拡大手段と空間選別手段を含む従来の顕微鏡システムとの組み合わせで構成される。よって、例えば、相関分光応用などの解析に十分な分子毎の信号の集合体を利用するためにこの容積において励起光ビームを集中させる一方、同時に、単一分子を解析するためにサンプルの解析容積をかなり縮小することを可能にする。さらに、拡大手段によって定義される微細構造インターフェースは、製造が容易であり、大規模に分配され得る。
【００２０】
本発明の１つの実施形態において、拡大手段の少なくとも1部分が支持手段と一体である。この場合において、その支持手段と一体である拡大手段の部分が、支持手段上の突起部で構成されるように設定されてもよく、その突起部は完全に正曲率を持つ。
【００２１】
拡大手段のいくつかの実施形態が供給されてもよく：
‐拡大手段の、支持手段と一体でない部分は、少なくとも１つのマイクロレンズを含み、
‐拡大手段の、支持手段と一体でない部分は、少なくとも１つの微液滴を含み、及び
‐拡大手段の、支持手段と一体でない部分は、少なくとも１つのマイクロビード、
がそれらに含まれる。
【００２２】
拡大手段の、支持手段と一体でない部分がマイクロビードで構成される場合、マイクロビードは、有利に、実質的に1マイクロメートルと5マイクロメートルとの間の直径を有するように備えられる。これは、小さい寸法の解析容積において、励起光ビームの光度を最適に集中させることを可能にする。解析容積の寸法を最適化するために、マイクロビードが実質的に2マイクロメートルに等しい直径を有するように備えられる。
【００２３】
小さい寸法の解析容積における励起光ビームの光度を改善することを目的とする望ましい実施形態において：
‐拡大手段が、励起光ビームの軸上に軸方向に中心が置かれるように、及び
‐拡大手段が、励起光ビームの焦点において縦方向に中心が置かれるように、
備えられる。
【００２４】
それの小さな厚さによって、透過にごくわずかに影響を与える一方、同時に光学的放射をさらに拡大することを目的とする望ましい実施形態において、拡大手段が、少なくとも部分的に、少なくとも１つの微細金属層によって覆われているように備えられる。
【００２５】
望ましくは、顕微鏡システムは、同様に、サンプル上の励起光ビームの相互作用に反応して生成され、焦点合わせ手段によって集光される反応光ビームの光度を検出する手段を含む。これは、解析容積において含まれるサンプル粒子の励起に反応して検出手段によって受け取られる光度を測定することによって、その解析容積だけにおいて測定を実行することを可能にする。
【００２６】
望ましくは、その顕微鏡システムは、同様に、検出手段によって供給される信号を処理する手段を含む。これは、発光反応だけでなく、この反抗反応における時間ゆらぎも同様に検出することを可能にし、それによって、そのサンプルに含まれる粒子に関するさらに大量な情報へのアクセスを提供する。
【００２７】
１つの実施形態において、支持手段はガラス基板で構成される。
【００２８】
望ましくは、照明手段は、レーザー源で構成される。従って、焦点合わせ手段から上流に、単色性及び高品質の光学波面である、コリメートされた励起光ビームがある。
【００２９】
焦点合わせ手段の第１実施形態に従って、幅広い開口数レンズ（通常0.7よりも大きい）で構成されるように備えられる。その焦点合わせ手段の第２実施形態に従って、小さい開口数（通常0.7よりも小さい）を有するレンズで構成されるように備えられる。
【００３０】
顕微鏡システムは、望ましくは、焦点を共有し、空間選別手段は、可変の寸法の開口を含む。これは、解析容積の寸法を調節することを可能にし、拡大手段との組み合わせで、解析容積をかなり縮小することを可能にする。
【００３１】
励起光ビームの拡大手段は、望ましくは、平行に配置される。これは、幅広いが、薄い表面を覆う解析容積を有することを可能にする。検出が、次に、複数のピクセルを含むセンサーを用いて実行される。
【００３２】
本発明は、同様に、顕微鏡システムを含む解析装置の手段によって溶解している粒子サンプルを解析する方法に関し、その顕微鏡システムは、そのサンプルを支持する手段、励起光ビームの放射が可能な照明の手段、その励起光ビームをサンプルにおける焦点で焦点合わせをする手段、及びその焦点の周りで解析容積を定義することが可能な空間選別手段を有し：
‐その励起光ビームの少なくとも1部分は、完全に収束性の焦点及びサンプルの屈折率よりも高い屈折率の手段によって、支持手段から下流に及び焦点から上流に拡大され、その少なくとも1部分は、支持手段と一体でなく、及び
‐反応光ビームの光度が時間に関して測定され、その反応光ビームは、解析容積における励起光ビームのサンプルとの相互作用から生じる、
ことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の第1実施形態による蛍光相関分光解析装置の概略図である。
【図２Ａ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図２Ｂ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図２Ｃ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図２Ｄ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図３】本発明の第2実施形態による蛍光相関分光解析装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３４】
励起光ビームの焦点は、そのビームが拡大手段の少なくとも1部分を通り抜けない場合に、そのビームの焦点を意味することは当然である。従って、例えば、拡大手段の1部分は、励起光ビームから上流に配置され、そうすることによって、その部分の中心は、拡大手段が無い場合にはビームから上流に配置されることが理解できる。
【００３５】
図１は、本発明の第1実施形態に従って、蛍光相関分光解析装置の該略図を示す。
【００３６】
その解析装置は、サンプル2を解析することを目的とする。このサンプルは、液体又は気体の媒体であってもよく、又は解析される粒子を含む生体であってもよい。その解析される粒子は、分子又は、例えば、分子複合体、ナノ結晶又はナノビードなどの分子集合体であってもよく、照明手段によって放射される光の波長よりも小さい寸法を有する。
【００３７】
解析装置は、共焦点顕微鏡システム1を含む。このシステムは、支持3、照明4、焦点合わせ5、二色性分離6、空間選別7、検出8、処理9、及び拡大14の手段を含む配置である。
【００３８】
支持手段3は、ガラス基板で構成される。この基板は、100マイクロメートルと200マイクロメートルとの間の厚さを有する顕微鏡スライドであってよい。この基板は、側壁が、50マイクロメートルと100マイクロメートルとの間の厚さを持つ自動接着性且つ耐水性のブロックで形成された、密閉されたボックスによって有利に取り囲まれたサンプル2を支持する。
【００３９】
照明手段4は、励起光ビーム10を放射する。このビーム10は、照明手段4を出る際にコリメートされる。これらの手段は、有利に、レーザーで構成される。様々な実施形態に従って、そのレーザーは、488ナノメートルの波長で動作する固体のダイオード励起レーザー又は633ナノメートルの波長で動作するヘリウム‐ネオンレーザーであってもよい。
【００４０】
励起光ビーム10は、二色性分離手段6に向けて方向付けられる。これらの手段6は、有利に、帯域消去タイプの二色性フィルタで構成される。このフィルタは、その遮断波長及びそれの帯域が、励起光ビーム10が反射され、反応光ビーム11を透過させることを可能にするように選択される。その反応ビーム11の波長は、粒子が蛍光性であるため、励起光ビーム10の波長よりも実に大きい。例えば、Alexaの633ナノメートルで励起された647個の分子の場合において、発光反応は、670ナノメートルであると予想され、それは640ナノメートルの程度の二色性フィルタに対する遮断波長を必要とする。このフィルタは、同様に、反応ビーム11波長に対する最大透過係数が最大であるように、選択される。
【００４１】
二色性フィルタは、有利に、入射励起ビーム10から45°で配置される。二色性分離手段6で反射した後に、その二色性フィルタは、従って、励起光ビーム10を焦点合わせ手段5に向けて方向付ける。これらの手段5は、ビームを、サンプル2上の焦点12に向けて、顕微鏡システム1を通して方向付けることが可能である。その目的で、これらの手段5は、対物又はレンズで構成される。
【００４２】
有利に、図１において示されるように、焦点合わせ手段5は、顕微鏡対物で構成される。この対物は、例えば、倍率40x及び開口数1.2のアポクロマート・レンズである。この開口数は、最適な程度の光度が、光ビーム10による励起に反応して集光されることを可能にする。焦点合わせ及び集光効率は、その結果、最適として表わされる。
【００４３】
もう１つの実施形態において、焦点合わせ手段5はレンズで構成される。このタイプの焦点合わせ手段は、低い開口数を持ち、それは、拡大手段14によって得られる追加の影響を最適に使用することを可能にしない。それにもかかわらず、顕微鏡対物よりも費用が低いため、低い焦点合わせ及び集光効率は、拡大手段14によって補われる。
【００４４】
従って、焦点合わせされた励起光ビーム10は、蛍光現象に従って、サンプル2において溶解している粒子と相互作用する。この方法において、励起した粒子の各々は、蛍光発光によって、励起ビーム10の波長よりも大きい波長で発光反応を発する。この発光反応の1部分は、次に、反応光ビーム11を形成するように、焦点合わせ手段5によって集光される。
【００４５】
この反応光ビーム11は、焦点合わせ5、二色性分離6及び空間選別7手段を通して検出手段8へそれぞれ送られる。二色性フィルタの遮断波長は、実際には、反応光ビーム11を透過させるように選択され、その波長は、励起ビーム10の波長よりも大きい。反応ビーム11を検出するために、空間選別手段は、さらに、一式のレンズ7’及び7”を含み、焦点合わせ手段5の焦点面が、検出手段8の捕獲面と組み合わせられることを可能にする。
【００４６】
空間選別手段7は、同様に、調節可能な寸法の開口7”を含む。この開口は、反応光ビーム11の軸15に沿って配置される。それは、焦点合わせ手段5の焦点12と光学的に組み合わせられる。それは、検出容積又は空間選別容積を、焦点12の周りで選択することを可能にする。なぜならば、この空間選別容積から生じない光線は、開口7"を通り抜けないからである。検出領域の寸法がより短いほど、開口7"の寸法もより短い。素子7'、7”及び7”’で構成されるセット7は、従って、可変の開口7"を有するピンホールを形成し、それは、中間像面に配置され、それによって、顕微鏡システムは励起ビーム10の焦点12をピンホールの可変の開口7"に組み合わせる。
【００４７】
他の実施形態において、空間選別手段7は、如何なる開口7"も含まない。実際には、それらは、空間選別の実行を可能にする他の素子で構成されてもよい。従って、実装される顕微鏡システムは、その結果、もはや焦点を共有するタイプではない。これらの素子は、例えば：
‐金属プレートにおける穴、
‐コア径が有効開口を決定する、光ファイバー、
‐表面面積が小さく、直径が20、30マイクロメートル程度である、検出手段、又は
‐2光子励起の場合、励起ビーム自体、
であってよい。
【００４８】
2光子蛍光励起の場合、後者は、２つの励起光子（pump photon）の同時吸収が分子を励起する。それは、1光子蛍光よりも効果が低いが、励起強度に2次的に依存する限り、焦点の周りの非常に小さい容積だけが、信号に効果的に貢献する。この場合、共焦点タイプのフィルタリングを使用する必要は無い。
【００４９】
検出手段8は、サンプル2上での励起光ビーム10の相互作用によって生成され、顕微鏡システム1によって集光される反応光束11の強度の測定を可能にする。特定の１実施形態において、これらの手段8は、電子増幅光検出器を含む。これらの光検出器は、有利に、アバランシェ（Avalanche）又はカスケード・モード（「アバランシェ・フォトダイオード」に対しては、APD）で動作するフォトダイオードである。これらの光検出器は、同様に、光電子倍増管である。他の特定の実施形態に従って、これらの検出手段8は、光学増幅光検出器、及びCCD又はCMOSカメラを含み、それらは例えば、液体空気又はぺルチェ素子によって冷却される。
【００５０】
これらの検出手段8は、２つの読み込みモードに従って動作できる。本発明の実装の第1モードに従って、検出は連続的に実行され、ターゲットによって放射される光信号は、検出手段が数個のピクセルを含む場合は、その信号を検出器の各ピクセル又はピクセルのグループに対して積分することによって、検出される。ラジオメトリック測定が、次に、いくつかのピクセルとピクセルのグループとの間で同様に可能になる。本発明の実装の第2モードにしたが手、検出が、時間モードで実行され、その検出器は、信号を、解析されているプロセスに関して短い時間範囲で積分する。情報は次に、この時間的追跡の解析によって供給される。
【００５１】
これらの検出手段8から生じる信号は、信号処理手段9へ送られる。これらの手段９は有利に、カウンター及び相関器を含み、それは、受け取ったデータをデジタルで処理することを可能にする。特に、カウンターは、受け取った蛍光光度の値を記録し、相関器は、その受け取った蛍光光度における揺らぎの時間的解析を実行する。この解析は、サンプル2において溶解している粒子に関してさらに情報を得るように、短期的及び長期的に実施することができる。短期的には、検出された光度を自動相関する機能は、エミッタの光物理的パラメータ及び検出された分子の平均数へアクセスすることを可能にする。長期的には、この機能は、分子の平均滞留時間（散乱時間）及びその散乱のモードに関する情報を、空間選別容積を通して提供する。
【００５２】
拡大手段14は、光束を拡大し、それによってより小さい寸法の解析容積にそれを集中させるように、励起光ビーム10の形状の改良を可能にする。これを達成するために拡大手段14は、支持手段3から下流及び焦点12から上流に、励起光ビームの経路上に配置される。
【００５３】
これらの拡大手段14は、完全に正の焦点距離及びサンプル2の屈折率よりも高い屈折率を有する。これらの状況下において、入射光ビーム10の拡大手段14を通り抜ける部分は、その拡大手段14の境界領域において収束する。この領域は、それらの焦点距離が完全に正であり、それらの屈折率がサンプル2の屈折率よりも高いため、より狭くされる。光ビーム10の拡大手段14を通り抜けない部分は、それを通り抜ける部分と、相殺的干渉の現象に従って、干渉する。入射ビーム10の光度の大部分は、従って、波長の半分程度の縦方向の寸法を持ち、その波長程度の軸方向の寸法を持つことから、回折限度よりも小さい寸法を持つ。それによって、フェムトリットルの10分の1よりも小さい解析容積を達成することを可能にする。
【００５４】
さらに、それらの屈折率は、サンプル2の屈折率よりも高いため、反応光ビーム11は、優先的に向けられ、その光は、拡大手段14に向けて再放射される。この方法において、さらに有意な反応光束11さえも集められ検出される。拡大手段14は、従って、検出されている解析容積の寸法を縮小し、その中において光束（拡大手段が無い場合よりも大きい）を集中させるように、微細構造インターフェースを、支持手段3と励起ビーム10の焦点12との間に含む。
【００５５】
拡大手段14は、ほぼ1マイクロメートルと5マイクロメートルとの間の程度のマイクロメータ寸法を有し、ほぼ1.4から1.6までの程度の高い屈折率を有する。
【００５６】
様々な特定の実施形態に従って、拡大手段14は、支持手段3と一体でないか、少なくとも部分的にその支持手段3と一体であるか、又は全体的にその支持手段3と一体である。
【００５７】
図2Aにおいて示される実施形態に従って、拡大手段14は、支持手段3と一体である。その拡大手段は、従って、支持手段3の突起部14’で構成される。この突起部は、完全に正曲率を持っており、拡大手段の焦点は、従って、完全に正である。
【００５８】
図2Bにおいて示される実施形態に従って、拡大手段14は、支持手段3と一体でない。従って、拡大手段14で構成される微細構造インターフェースは、支持手段3のガラス基板上の手段14を分散させることによって製造される。
【００５９】
図2Bを参照すると、拡大手段14”は、発散マイクロレンズで構成される。このマイクロメータ寸法のレンズは、有利に、励起ビーム10から生じる光束を、そのレンズの領域に可能な限り近く最適に集中させるように、高い焦点距離を有する。この領域は、従って、他の粒子が励起される可能性のあるサンプル2の残りからいっそう分離されている。
【００６０】
図2Cを参照すると、拡大手段14”は、微液滴で構成される。このマイクロメトリック液滴は、有利に、励起ビーム10から生じる光束をその液滴の領域において可能な限り近く最適に集中させるように高い曲率を有する。
【００６１】
図2Dを参照すると、拡大手段14”は、マイクロビードで構成される。このマイクロビードは、高い屈折率及びマイクロメトリック寸法を持つ誘電性ビードである。このビードは、例えば、ラテックス又はポリスチレンで作られており、その率は1.6であり、それは、微細構造インターフェースの製造の間に劣化しないように、ガラスよりも柔軟であるという利点を同じく有する。そのマイクロビードは、非常に高い曲率を有し、それによって、小さい寸法の解析容積における励起光ビームの光度を最適に集中させることを可能にする。マイクロビードの直径は、1マイクロメートルと5マイクロメートとの間にあり、望ましくは2マイクロメートルである。
【００６２】
当業者は、図2Aから図2Dに示されたこれらの拡大手段に対する様々な変形を実行でき、特に、上記の模範的な実施形態を組み合わせることによって、本発明の範囲から離脱せずに実行することができる。さらに具体的には、拡大手段14は、支持手段と一体である部分14’及び一体でない部分14”を含んでもよい。上記の拡大手段14の各実施形態及びそれらの任意の可能な組み合わせに対して、拡大手段14は、有利に、励起光ビーム10の軸15上において軸方向に中心が置かれる。それらは、同様に、励起光ビーム10の焦点12上において縦方向に中心が置かれる。拡大手段14の励起光ビーム10に関するこれらの中心化は、そのビーム10を最適に拡大することを可能にする。
【００６３】
望ましくは、光学放射をさらに拡大するという目的で、その拡大手段14は少なくとも１つの微細金属層によって少なくとも部分的に覆われる。この層に使用される金属は、アルミニウム及び金、銀、銅、及びニッケルなどの貴金属から選択される。この層の厚さは、有利に、顕微鏡システムの透過を大幅に減少させ得る過度に不透明な層を持つことを防ぐように、30ナノメートルよりも小さいかそれに等しい。この微細金属層は、例えば、拡大手段を全体的又は部分的に覆う、20ナノメートルに等しい厚さを有する金の層であってもよい。
【００６４】
図3は、本発明の第2実施形態に従って、蛍光相関分光解析装置の概略図を示す。
【００６５】
蛍光相関分光解析及びレーマン分光解析を同時に実行することを目的とするこの実施形態において、共焦点顕微鏡システムは：
‐蛍光物質との相互作用から生じる発光反応が670ナノメートルであると予測される、633ナノメートルで放射するヘリウム‐ネオンレーザー源20、
‐蛍光物質との相互作用から生じる発光反応が520ナノメートルであると予測される、488ナノメートルで放射するダイオード励起固体レーザー源21、
‐顕微鏡対物23及び溶解している粒子を含むサンプル25を支持するガラス・スライド24、
‐633ナノメートル付近の第1阻止帯域二色性フィルタ26、
‐488ナノメートル付近の第2阻止帯域二色性フィルタ27、
‐調整可能な開口及び2つのレーザー源20及び21から生じるビームの焦点の周りの検出容積を空間的に選別するように配置された２つのレンズを含むピンホール28、
‐粒子のレーザー源20及び21の各々との相互作用から生じる蛍光の発光反応を分離するように、520ナノメートルと670ナノメートルとの間に位置する遮断波長を有する、第3高域二色性フィルタ29、
‐488ナノメートルで励起された粒子の蛍光を解析するためのレーマン分光装置30、
‐分離管34、
‐顕微鏡システムによって集められる、670ナノメートルの蛍光光束の強度を測定するための、フィルタ37及び38の前にそれぞれ置かれた2つのアバランシェ・フォトダイオード35及び36、及び
‐633ナノメートルで測定される蛍光光束における時間ゆらぎを可能にするカウンター39及び相関器40、
を含む。
【００６６】
分光装置30は、488ナノメートルの励起波長に対して、500ナノメートルから700ナノメートルまでの分光範囲にわたって解析される光の分光組成を可能にする。放射される光の強度は、検出器31によって測定され、それは、例えば、光電子倍増管のタイプの単一チャンネルであってもよく、又は例えばCCDタイプの多重チャンネルであってもよい。広域フィルタ32及び阻止帯域フィルタは、有利に、検出器31に送信される信号の質を改善するように、装置30に付着されている。
【００６７】
蛍光相関分光解析及びレーマン分光解析を組み合わせることによって、本発明による解析装置は、それによって、溶解している粒子の統計的及び時間的な情報のみでなく、個別に取得される粒子に関する同じような情報を取得することを可能にする。
【００６８】
上記に記載された拡大手段と従来の共焦点顕微鏡システムとの組み合わせは、上記のいずれかの実施形態に従って、解析容積を縮小し検出を拡大することを可能にする。個々の粒子が検出される、非常に効果的な検出システムもまた想定されてもよい。このシステムは、全体的な測定（反応の時間的力学及び統計的分布）によってアクセス可能でない個々の粒子の規模で取得される情報を取得することを可能にする。これは、特に過渡の又は進行している分子集合解析応用に対して、新しい研究及び治療手段を提供する。
【００６９】
上記に記載された本発明の実施形態は、説明の目的のために提供され、決して限定的ではない。当然のことながら、当業者は、特に技術の発展を用いて、それによって本発明の範囲から離脱することなく、本発明の様々な変形を実行することができる。
【００７０】
従って、拡大する手段14及び励起光ビーム10は、平行に配置することが出来る。模範的な実施形態は、ガラス基板3に対向して配置されたマイクロビード・マットである。このマイクロビードの微細構造のアセンブリは、大きい表面面積及び小さい厚さを有する解析容積の取得を可能にする。検出は、その結果、CCD又はCMOSマルチピクセル・センサーで同様に実行してもよい。
【００７１】
同じ方法で、解析されている粒子は、化学発光、生物発光、散乱（レイリー又はハイパー・レイリー）、振動分光（自発的又は誘導レーマン）、熱放射率又は反射特性（粒度分析の場合）、を有してもよい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子サンプルの拡張解析に対する装置及び方法に関する。
【０００２】
本発明は、発光又は光学的に散乱する粒子を解析するための装置の分野に関する。
【０００３】
さらに具体的には、それは、溶解している粒子サンプルを解析する装置に関し、該装置は顕微鏡システムを有し、該顕微鏡システムは、そのサンプルを支持する手段、励起光ビームを放射することが可能な照明手段、該励起光ビームをサンプルの焦点に合わせる手段、及び該焦点の周りの解析容積を定義することが可能な空間選別手段を含む。
【背景技術】
【０００４】
当該装置は、発光又は散乱マーキング、すなわち励起光に反応して特定の発光又は散乱する粒子に関する光学解析応用の任意のタイプにおける使用を目的とする。解析される粒子は、分子、又は、例えば分子複合体、ナノ粒子もしくはナノビードなどの分子の集合体であり、照明手段によって放射される光の波長よりも小さい寸法を有する。それは、特に、溶解している蛍光分子を検出する分野において役立ち、さらに具体的には蛍光相関分光において役立つ。それは、生物学的テストにおいて同じく役立ち、さらに正確にはDNA又はたんぱく質チップテストにおいて役立つ。
【０００５】
この分野における従来技術は、共焦点顕微鏡システムを有する解析装置を含む。そのようなシステムは、例えば溶解している、発光又は光学的に散乱している粒子などのサンプルを解析することを目標とする。例えば、蛍光粒子を解析する場合において、そのシステムは、所定の波長のレーザービームを放射するレーザー源、二色性ミラー、非常に高い程度の倍率を持つ顕微鏡レンズ、及び幅広い開口数、光学イメージング手段、空間選別手段、及び検出器を含む。そのレーザービームは、解析することが望まれる解析容積において位置する焦点で、そのレンズによって収束される。その焦点合わせがされたレーザービームの光は、次に、後で検出器に向けられるようにそれらの粒子によって吸収され、レーザービームの波長よりも大きい波長で再放射される。光学イメージング手段は、レーザービームの焦点を検出器に組み合わせるように配置される。
【０００６】
空間選別手段は、解析容積を定義することを可能にし、それによってマイクロメータよりも低い空間分解能の程度が得られる。これを達成するために、それらは、顕微鏡対物の焦点面と共役の面において、検出器から上流に配置された開口を含む。この方法では、レーザービームの焦点の周りの容積に位置する光子だけが、検出器に対して画像の形成に加わる。
【０００７】
溶解している蛍光分子に関するかなりの量の情報を得るためには、相関器が、蛍光相関分光（FCS）検出を実行するために、解析容積によって放射される蛍光光の時間ゆらぎを解析するために検出器に接続されている。蛍光及びその時間ゆらぎが、従って、解析される。これらの揺らぎは、解析容積を通るフルオフォア（fluophore）の散乱に直接関する。短期的には、検出された高度を自動相関する機能は、エミッタの光物理的パラメータ及び検出される分子の平均数へのアクセスを可能にする。長期的には、この機能は、分子の平均滞留時間‐散乱時間‐及びその散乱のモードについての情報を、解析容積を通して供給する。
【０００８】
そのような装置は、より大きい開口を活用することを可能にし、そうすることによって最大量の光及び蛍光を集め、解析容積を減少させ、その結果として溶液において散乱するノイズを低減することも可能にする。
【０００９】
それにもかかわらず、単一分子の解析分解能が望まれる応用に対して、そのような装置は、いくつかの欠点を持つ。実際のところ、回折現象がレーザーの焦点スポットに基本的な限定を設定することから、解析容積の寸法にも基本的な限定を設定する。これらの減少は、その結果、解析容積毎に１つの分子だけを解析することを望む限り、分子毎の計数率を固定された累乗で限定し、単一分子の検出を可能にする分子の最大濃度も限定する。さらに、レイリー及びレーマン散乱の貢献によるバックグラウンドノイズの減少は、このバックグラウンドノイズが解析容積の寸法に比例することから限定される。これらの欠点は、そのような装置が高濃度溶液（約10ナノ‐モルよりも高い）における単一分子の解析には不適当であることを表わす。
【００１０】
解析容積の定義の問題を解決するための解決策が特許文献１に記載されている。該文献において、サンプルを相関分光によって測定するための装置は、視野が収集容積又は解析容積を定める光学焦点システムを含む共焦点顕微鏡、励起ビームを生成し、該ビームを顕微鏡を通してサンプル上に向けることが可能な手段、そのサンプル上で励起ビームの相互作用によって生成され、顕微鏡によって集光される光束の強度を検出する手段、及びその検出手段によって生成される信号を処理する手段、を含む。この装置は、同様に、集められた光束を増加させる光子構造を含み、それは、顕微鏡の光学焦点システムの焦点に配置され、収集容積において干渉縞を形成する。この光子構造は、例えば、耐水二色性ミラーであってもよく、非常に小さい光学的厚さを有する多数の層で構成されてよい。それは、収集容積において干渉縞を形成するために顕微鏡の光学的焦点システムの焦点で配置される。一方では、この構造の実施は、分子毎に集められる信号をかなり増加させ、他方では、収集容積の定義の問題を解決する。
【００１１】
この解決策の欠点は、ミラー上の励起ビームの反射及びそのミラーにおける寄生性ルミネッセンスよって誘導されるノイズを十分に排除することの困難性にある。さらに、解析容積において最大得られる減少は約３であり、それは、現実的な応用における実質的な利益を与えない。
【００１２】
これらの解析装置の分解能を改善する他の解決策が、期待されるかもしれない。特に、検出器によって受け取られる高度を増幅するためには、レーザービームのパワーを増加させることが期待されるが、それは、分子を光破壊する可能性がある。もう１つの選択肢は、顕微鏡レンズの開口数を増加させることであるが、それは、顕微鏡レンズに対する技術が非常に高度であり、開口数のかなりの増加がもはや見られないことから、困難である。同様に、回折現象の結果を限定するために、１つの解決策が、より短い波長を有するレーザー源を使用することにおいて存在するが、そのような増加は、レーザー励起に関して限定される。もう１つの解決策は、例えばダイヤモンドなど、より高い屈折率を有する支持手段を実施してもよいが、そのような材料は、かなりの費用の負担となり、機械加工するのが難しい。近視野走査又は刺激ルミネッセンス減少顕微鏡の使用など、他の解決策が予測できるが、これらの技術は実装が難しく、かなりの費用がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】仏国特許第2,828,959号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、これらの技術的な問題を、解析容積をかなり縮小し、それによって最大１つの分子だけに限られる量が含まれ、励起光ビーム及び放射された発光の集光の両方を拡大させる実施手段によって改善することである。これらの拡大手段は、サンプル上の励起光ビームによって定められる焦点視野をさらに集中させ、さらに濃縮させるように配置され、この視野は、回折限度よりも小さい寸法に達することが可能であり、それによってフェムトリットルよりも小さい容積において解析が可能になることから、高濃度溶液（10ナノ・モルよりも高い）における単一分子だけを含むことが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
その解決策へのアプローチは、サンプル上の励起光ビームによって定められる焦点視野を減少させ、放射光を集める効率を上げることを目的として、「光子ジェット」装置としても知られるナノ・フォトニック装置を実装することにおいて存在する。このタイプの装置に関する従来技術は、コリメートされたビームの焦点合わせをするように、そのビームの経路上に配置されたマイクロビードを含む。これは、通常のビームに比較して、そのビームに小さな発散を与え、その軸に沿って不変性も与え、それは、小さな範囲においてかなり回折する可能性がある。従って、焦点で収束性を持つこのタイプの装置は、顕微鏡解析装置の励起光などの大いに焦点が合わせられた光ビーム経路に沿った使用とは明らかに互換性がない。そのような事情で、そのようなナノ・フォトニック放射装置を部分的に通り抜ける励起光ビームの性質の調査及びその実装は、サンプルの解析容積におけるかなりの減少の実証を可能にした。
【００１６】
この目的に対し、本発明の対象は、上述の解析装置であり、それにおいて、既に述べた特徴に加えて、顕微鏡システムが励起光ビームを拡大する手段を同様に含み、その拡大手段は、完全にプラスである焦点距離及びサンプルの屈折率よりも大きい屈折率を有し、その拡大手段の少なくとも1部分は、励起光ビームの経路上に、支持手段から下流方向に及び焦点から上流方向に配置され、その拡大手段の少なくとも1部分は、支持手段と一体ではない。
【００１７】
従って、実装される拡大手段は、励起光ビームが初期の解析容積よりも小さい寸法の領域において過度に焦点が合わせられることができるようにする。実際は、入射光の拡大手段を通り抜ける部分は、その拡大手段の境界領域において収束し、この領域は、拡大手段の焦点及び屈折率によってさらに狭くされている。光ビームの拡大手段を通り抜けない部分は、相殺的干渉の減少に従って、それを取り抜ける部分と干渉する。入射光の光度の大部分は、従って、波長の半分程度の縦方向寸法を持ち、その波長程度の軸方向寸法を持つ容積において集中することから、回折限度よりも小さい寸法を持つ。
【００１８】
さらに、拡大手段の屈折率によって、サンプル上の励起光ビームの相互作用に反応して生成され、焦点手段によって集光される反応光ビームは、望ましくは、空間における1つ又はそれ以上の特定の方向に向けられている。実際には、粒子は光を再放射し、拡大手段の屈折率がより高いことから、望ましくは、拡大手段に向けて再放射する。この方法では、さらに大きい反応光束でさえ集められ検出されることから、放射された発光の集合体を同じく拡大することを可能にする。
【００１９】
本発明による解析装置は、従って、拡大手段と空間選別手段を含む従来の顕微鏡システムとの組み合わせで構成される。よって、例えば、相関分光応用などの解析に十分な分子毎の信号の集合体を利用するためにこの容積において励起光ビームを集中させる一方、同時に、単一分子を解析するためにサンプルの解析容積をかなり縮小することを可能にする。さらに、拡大手段によって定義される微細構造インターフェースは、製造が容易であり、大規模に分配され得る。
【００２０】
本発明の１つの実施形態において、拡大手段の少なくとも1部分が支持手段と一体である。この場合において、その支持手段と一体である拡大手段の部分が、支持手段上の突起部で構成されるように設定されてもよく、その突起部は完全に正曲率を持つ。
【００２１】
拡大手段のいくつかの実施形態が供給されてもよく：
‐拡大手段の、支持手段と一体でない部分は、少なくとも１つのマイクロレンズを含み、
‐拡大手段の、支持手段と一体でない部分は、少なくとも１つの微液滴を含み、及び
‐拡大手段の、支持手段と一体でない部分は、少なくとも１つのマイクロビード、
がそれらに含まれる。
【００２２】
拡大手段の、支持手段と一体でない部分がマイクロビードで構成される場合、マイクロビードは、有利に、実質的に1マイクロメートルと5マイクロメートルとの間の直径を有するように備えられる。これは、小さい寸法の解析容積において、励起光ビームの光度を最適に集中させることを可能にする。解析容積の寸法を最適化するために、マイクロビードが実質的に2マイクロメートルに等しい直径を有するように備えられる。
【００２３】
小さい寸法の解析容積における励起光ビームの光度を改善することを目的とする望ましい実施形態において：
‐拡大手段が、励起光ビームの軸上に軸方向に中心が置かれるように、及び
‐拡大手段が、励起光ビームの焦点において縦方向に中心が置かれるように、
備えられる。
【００２４】
それの小さな厚さによって、透過にごくわずかに影響を与える一方、同時に光学的放射をさらに拡大することを目的とする望ましい実施形態において、拡大手段が、少なくとも部分的に、少なくとも１つの微細金属層によって覆われているように備えられる。
【００２５】
望ましくは、顕微鏡システムは、同様に、サンプル上の励起光ビームの相互作用に反応して生成され、焦点合わせ手段によって集光される反応光ビームの光度を検出する手段を含む。これは、解析容積において含まれるサンプル粒子の励起に反応して検出手段によって受け取られる光度を測定することによって、その解析容積だけにおいて測定を実行することを可能にする。
【００２６】
望ましくは、その顕微鏡システムは、同様に、検出手段によって供給される信号を処理する手段を含む。これは、発光反応だけでなく、この反抗反応における時間ゆらぎも同様に検出することを可能にし、それによって、そのサンプルに含まれる粒子に関するさらに大量な情報へのアクセスを提供する。
【００２７】
１つの実施形態において、支持手段はガラス基板で構成される。
【００２８】
望ましくは、照明手段は、レーザー源で構成される。従って、焦点合わせ手段から上流に、単色性及び高品質の光学波面である、コリメートされた励起光ビームがある。
【００２９】
焦点合わせ手段の第１実施形態に従って、幅広い開口数レンズ（通常0.7よりも大きい）で構成されるように備えられる。その焦点合わせ手段の第２実施形態に従って、小さい開口数（通常0.7よりも小さい）を有するレンズで構成されるように備えられる。
【００３０】
顕微鏡システムは、望ましくは、焦点を共有し、空間選別手段は、可変の寸法の開口を含む。これは、解析容積の寸法を調節することを可能にし、拡大手段との組み合わせで、解析容積をかなり縮小することを可能にする。
【００３１】
励起光ビームの拡大手段は、望ましくは、平行に配置される。これは、幅広いが、薄い表面を覆う解析容積を有することを可能にする。検出が、次に、複数のピクセルを含むセンサーを用いて実行される。
【００３２】
本発明は、同様に、顕微鏡システムを含む解析装置の手段によって溶解している粒子サンプルを解析する方法に関し、その顕微鏡システムは、そのサンプルを支持する手段、励起光ビームの放射が可能な照明の手段、その励起光ビームをサンプルにおける焦点で焦点合わせをする手段、及びその焦点の周りで解析容積を定義することが可能な空間選別手段を有し：
‐その励起光ビームの少なくとも1部分は、完全に収束性の焦点及びサンプルの屈折率よりも高い屈折率の手段によって、支持手段から下流に及び焦点から上流に拡大され、その少なくとも1部分は、支持手段と一体でなく、及び
‐反応光ビームの光度が時間に関して測定され、その反応光ビームは、解析容積における励起光ビームのサンプルとの相互作用から生じる、
ことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の第1実施形態による蛍光相関分光解析装置の概略図である。
【図２Ａ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図２Ｂ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図２Ｃ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図２Ｄ】本発明による拡大手段の様々な実施形態の図である。
【図３】本発明の第2実施形態による蛍光相関分光解析装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３４】
励起光ビームの焦点は、そのビームが拡大手段の少なくとも1部分を通り抜けない場合に、そのビームの焦点を意味することは当然である。従って、例えば、拡大手段の1部分は、励起光ビームから上流に配置され、そうすることによって、その部分の中心は、拡大手段が無い場合にはビームから上流に配置されることが理解できる。
【００３５】
図１は、本発明の第1実施形態に従って、蛍光相関分光解析装置の該略図を示す。
【００３６】
その解析装置は、サンプル2を解析することを目的とする。このサンプルは、液体又は気体の媒体であってもよく、又は解析される粒子を含む生体であってもよい。その解析される粒子は、分子又は、例えば、分子複合体、ナノ結晶又はナノビードなどの分子集合体であってもよく、照明手段によって放射される光の波長よりも小さい寸法を有する。
【００３７】
解析装置は、共焦点顕微鏡システム1を含む。このシステムは、支持3、照明4、焦点合わせ5、二色性分離6、空間選別7、検出8、処理9、及び拡大14の手段を含む配置である。
【００３８】
支持手段3は、ガラス基板で構成される。この基板は、100マイクロメートルと200マイクロメートルとの間の厚さを有する顕微鏡スライドであってよい。この基板は、側壁が、50マイクロメートルと100マイクロメートルとの間の厚さを持つ自動接着性且つ耐水性のブロックで形成された、密閉されたボックスによって有利に取り囲まれたサンプル2を支持する。
【００３９】
照明手段4は、励起光ビーム10を放射する。このビーム10は、照明手段4を出る際にコリメートされる。これらの手段は、有利に、レーザーで構成される。様々な実施形態に従って、そのレーザーは、488ナノメートルの波長で動作する固体のダイオード励起レーザー又は633ナノメートルの波長で動作するヘリウム‐ネオンレーザーであってもよい。
【００４０】
励起光ビーム10は、二色性分離手段6に向けて方向付けられる。これらの手段6は、有利に、帯域消去タイプの二色性フィルタで構成される。このフィルタは、その遮断波長及びそれの帯域が、励起光ビーム10が反射され、反応光ビーム11を透過させることを可能にするように選択される。その反応ビーム11の波長は、粒子が蛍光性であるため、励起光ビーム10の波長よりも実に大きい。例えば、Alexaの633ナノメートルで励起された647個の分子の場合において、発光反応は、670ナノメートルであると予想され、それは640ナノメートルの程度の二色性フィルタに対する遮断波長を必要とする。このフィルタは、同様に、反応ビーム11波長に対する最大透過係数が最大であるように、選択される。
【００４１】
二色性フィルタは、有利に、入射励起ビーム10から45°で配置される。二色性分離手段6で反射した後に、その二色性フィルタは、従って、励起光ビーム10を焦点合わせ手段5に向けて方向付ける。これらの手段5は、ビームを、サンプル2上の焦点12に向けて、顕微鏡システム1を通して方向付けることが可能である。その目的で、これらの手段5は、対物又はレンズで構成される。
【００４２】
有利に、図１において示されるように、焦点合わせ手段5は、顕微鏡対物で構成される。この対物は、例えば、倍率40x及び開口数1.2のアポクロマート・レンズである。この開口数は、最適な程度の光度が、光ビーム10による励起に反応して集光されることを可能にする。焦点合わせ及び集光効率は、その結果、最適として表わされる。
【００４３】
もう１つの実施形態において、焦点合わせ手段5はレンズで構成される。このタイプの焦点合わせ手段は、低い開口数を持ち、それは、拡大手段14によって得られる追加の影響を最適に使用することを可能にしない。それにもかかわらず、顕微鏡対物よりも費用が低いため、低い焦点合わせ及び集光効率は、拡大手段14によって補われる。
【００４４】
従って、焦点合わせされた励起光ビーム10は、蛍光現象に従って、サンプル2において溶解している粒子と相互作用する。この方法において、励起した粒子の各々は、蛍光発光によって、励起ビーム10の波長よりも大きい波長で発光反応を発する。この発光反応の1部分は、次に、反応光ビーム11を形成するように、焦点合わせ手段5によって集光される。
【００４５】
この反応光ビーム11は、焦点合わせ5、二色性分離6及び空間選別7手段を通して検出手段8へそれぞれ送られる。二色性フィルタの遮断波長は、実際には、反応光ビーム11を透過させるように選択され、その波長は、励起ビーム10の波長よりも大きい。反応ビーム11を検出するために、空間選別手段は、さらに、一式のレンズ7’及び7”を含み、焦点合わせ手段5の焦点面が、検出手段8の捕獲面と組み合わせられることを可能にする。
【００４６】
空間選別手段7は、同様に、調節可能な寸法の開口7”を含む。この開口は、反応光ビーム11の軸15に沿って配置される。それは、焦点合わせ手段5の焦点12と光学的に組み合わせられる。それは、検出容積又は空間選別容積を、焦点12の周りで選択することを可能にする。なぜならば、この空間選別容積から生じない光線は、開口7"を通り抜けないからである。検出領域の寸法がより短いほど、開口7"の寸法もより短い。素子7'、7”及び7”’で構成されるセット7は、従って、可変の開口7"を有するピンホールを形成し、それは、中間像面に配置され、それによって、顕微鏡システムは励起ビーム10の焦点12をピンホールの可変の開口7"に組み合わせる。
【００４７】
他の実施形態において、空間選別手段7は、如何なる開口7"も含まない。実際には、それらは、空間選別の実行を可能にする他の素子で構成されてもよい。従って、実装される顕微鏡システムは、その結果、もはや焦点を共有するタイプではない。これらの素子は、例えば：
‐金属プレートにおける穴、
‐コア径が有効開口を決定する、光ファイバー、
‐表面面積が小さく、直径が20、30マイクロメートル程度である、検出手段、又は
‐2光子励起の場合、励起ビーム自体、
であってよい。
【００４８】
2光子蛍光励起の場合、後者は、２つの励起光子（pump photon）の同時吸収が分子を励起する。それは、1光子蛍光よりも効果が低いが、励起強度に2次的に依存する限り、焦点の周りの非常に小さい容積だけが、信号に効果的に貢献する。この場合、共焦点タイプのフィルタリングを使用する必要は無い。
【００４９】
検出手段8は、サンプル2上での励起光ビーム10の相互作用によって生成され、顕微鏡システム1によって集光される反応光束11の強度の測定を可能にする。特定の１実施形態において、これらの手段8は、電子増幅光検出器を含む。これらの光検出器は、有利に、アバランシェ（Avalanche）又はカスケード・モード（「アバランシェ・フォトダイオード」に対しては、APD）で動作するフォトダイオードである。これらの光検出器は、同様に、光電子倍増管である。他の特定の実施形態に従って、これらの検出手段8は、光学増幅光検出器、及びCCD又はCMOSカメラを含み、それらは例えば、液体空気又はぺルチェ素子によって冷却される。
【００５０】
これらの検出手段8は、２つの読み込みモードに従って動作できる。本発明の実装の第1モードに従って、検出は連続的に実行され、ターゲットによって放射される光信号は、検出手段が数個のピクセルを含む場合は、その信号を検出器の各ピクセル又はピクセルのグループに対して積分することによって、検出される。ラジオメトリック測定が、次に、いくつかのピクセルとピクセルのグループとの間で同様に可能になる。本発明の実装の第2モードにしたが手、検出が、時間モードで実行され、その検出器は、信号を、解析されているプロセスに関して短い時間範囲で積分する。情報は次に、この時間的追跡の解析によって供給される。
【００５１】
これらの検出手段8から生じる信号は、信号処理手段9へ送られる。これらの手段９は有利に、カウンター及び相関器を含み、それは、受け取ったデータをデジタルで処理することを可能にする。特に、カウンターは、受け取った蛍光光度の値を記録し、相関器は、その受け取った蛍光光度における揺らぎの時間的解析を実行する。この解析は、サンプル2において溶解している粒子に関してさらに情報を得るように、短期的及び長期的に実施することができる。短期的には、検出された光度を自動相関する機能は、エミッタの光物理的パラメータ及び検出された分子の平均数へアクセスすることを可能にする。長期的には、この機能は、分子の平均滞留時間（散乱時間）及びその散乱のモードに関する情報を、空間選別容積を通して提供する。
【００５２】
拡大手段14は、光束を拡大し、それによってより小さい寸法の解析容積にそれを集中させるように、励起光ビーム10の形状の改良を可能にする。これを達成するために拡大手段14は、支持手段3から下流及び焦点12から上流に、励起光ビームの経路上に配置される。
【００５３】
これらの拡大手段14は、完全に正の焦点距離及びサンプル2の屈折率よりも高い屈折率を有する。これらの状況下において、入射光ビーム10の拡大手段14を通り抜ける部分は、その拡大手段14の境界領域において収束する。この領域は、それらの焦点距離が完全に正であり、それらの屈折率がサンプル2の屈折率よりも高いため、より狭くされる。光ビーム10の拡大手段14を通り抜けない部分は、それを通り抜ける部分と、相殺的干渉の現象に従って、干渉する。入射ビーム10の光度の大部分は、従って、波長の半分程度の縦方向の寸法を持ち、その波長程度の軸方向の寸法を持つことから、回折限度よりも小さい寸法を持つ。それによって、フェムトリットルの10分の1よりも小さい解析容積を達成することを可能にする。
【００５４】
さらに、それらの屈折率は、サンプル2の屈折率よりも高いため、反応光ビーム11は、優先的に向けられ、その光は、拡大手段14に向けて再放射される。この方法において、さらに有意な反応光束11さえも集められ検出される。拡大手段14は、従って、検出されている解析容積の寸法を縮小し、その中において光束（拡大手段が無い場合よりも大きい）を集中させるように、微細構造インターフェースを、支持手段3と励起ビーム10の焦点12との間に含む。
【００５５】
拡大手段14は、ほぼ1マイクロメートルと5マイクロメートルとの間の程度のマイクロメータ寸法を有し、ほぼ1.4から1.6までの程度の高い屈折率を有する。
【００５６】
様々な特定の実施形態に従って、拡大手段14は、支持手段3と一体でないか、少なくとも部分的にその支持手段3と一体であるか、又は全体的にその支持手段3と一体である。
【００５７】
図2Aにおいて示される実施形態に従って、拡大手段14は、支持手段3と一体である。その拡大手段は、従って、支持手段3の突起部14’で構成される。この突起部は、完全に正曲率を持っており、拡大手段の焦点は、従って、完全に正である。
【００５８】
図2Bにおいて示される実施形態に従って、拡大手段14は、支持手段3と一体でない。従って、拡大手段14で構成される微細構造インターフェースは、支持手段3のガラス基板上の手段14を分散させることによって製造される。
【００５９】
図2Bを参照すると、拡大手段14”は、発散マイクロレンズで構成される。このマイクロメータ寸法のレンズは、有利に、励起ビーム10から生じる光束を、そのレンズの領域に可能な限り近く最適に集中させるように、高い焦点距離を有する。この領域は、従って、他の粒子が励起される可能性のあるサンプル2の残りからいっそう分離されている。
【００６０】
図2Cを参照すると、拡大手段14”は、微液滴で構成される。このマイクロメトリック液滴は、有利に、励起ビーム10から生じる光束をその液滴の領域において可能な限り近く最適に集中させるように高い曲率を有する。
【００６１】
図2Dを参照すると、拡大手段14”は、マイクロビードで構成される。このマイクロビードは、高い屈折率及びマイクロメトリック寸法を持つ誘電性ビードである。このビードは、例えば、ラテックス又はポリスチレンで作られており、その率は1.6であり、それは、微細構造インターフェースの製造の間に劣化しないように、ガラスよりも柔軟であるという利点を同じく有する。そのマイクロビードは、非常に高い曲率を有し、それによって、小さい寸法の解析容積における励起光ビームの光度を最適に集中させることを可能にする。マイクロビードの直径は、1マイクロメートルと5マイクロメートとの間にあり、望ましくは2マイクロメートルである。
【００６２】
当業者は、図2Aから図2Dに示されたこれらの拡大手段に対する様々な変形を実行でき、特に、上記の模範的な実施形態を組み合わせることによって、本発明の範囲から離脱せずに実行することができる。さらに具体的には、拡大手段14は、支持手段と一体である部分14’及び一体でない部分14”を含んでもよい。上記の拡大手段14の各実施形態及びそれらの任意の可能な組み合わせに対して、拡大手段14は、有利に、励起光ビーム10の軸15上において軸方向に中心が置かれる。それらは、同様に、励起光ビーム10の焦点12上において縦方向に中心が置かれる。拡大手段14の励起光ビーム10に関するこれらの中心化は、そのビーム10を最適に拡大することを可能にする。
【００６３】
望ましくは、光学放射をさらに拡大するという目的で、その拡大手段14は少なくとも１つの微細金属層によって少なくとも部分的に覆われる。この層に使用される金属は、アルミニウム及び金、銀、銅、及びニッケルなどの貴金属から選択される。この層の厚さは、有利に、顕微鏡システムの透過を大幅に減少させ得る過度に不透明な層を持つことを防ぐように、30ナノメートルよりも小さいかそれに等しい。この微細金属層は、例えば、拡大手段を全体的又は部分的に覆う、20ナノメートルに等しい厚さを有する金の層であってもよい。
【００６４】
図3は、本発明の第2実施形態に従って、蛍光相関分光解析装置の概略図を示す。
【００６５】
蛍光相関分光解析及びレーマン分光解析を同時に実行することを目的とするこの実施形態において、共焦点顕微鏡システムは：
‐蛍光物質との相互作用から生じる発光反応が670ナノメートルであると予測される、633ナノメートルで放射するヘリウム‐ネオンレーザー源20、
‐蛍光物質との相互作用から生じる発光反応が520ナノメートルであると予測される、488ナノメートルで放射するダイオード励起固体レーザー源21、
‐顕微鏡対物23及び溶解している粒子を含むサンプル25を支持するガラス・スライド24、
‐633ナノメートル付近の第1阻止帯域二色性フィルタ26、
‐488ナノメートル付近の第2阻止帯域二色性フィルタ27、
‐調整可能な開口及び2つのレーザー源20及び21から生じるビームの焦点の周りの検出容積を空間的に選別するように配置された２つのレンズを含むピンホール28、
‐粒子のレーザー源20及び21の各々との相互作用から生じる蛍光の発光反応を分離するように、520ナノメートルと670ナノメートルとの間に位置する遮断波長を有する、第3高域二色性フィルタ29、
‐488ナノメートルで励起された粒子の蛍光を解析するためのレーマン分光装置30、
‐分離管34、
‐顕微鏡システムによって集められる、670ナノメートルの蛍光光束の強度を測定するための、フィルタ37及び38の前にそれぞれ置かれた2つのアバランシェ・フォトダイオード35及び36、及び
‐633ナノメートルで測定される蛍光光束における時間ゆらぎを可能にするカウンター39及び相関器40、
を含む。
【００６６】
分光装置30は、488ナノメートルの励起波長に対して、500ナノメートルから700ナノメートルまでの分光範囲にわたって解析される光の分光組成を可能にする。放射される光の強度は、検出器31によって測定され、それは、例えば、光電子倍増管のタイプの単一チャンネルであってもよく、又は例えばCCDタイプの多重チャンネルであってもよい。広域フィルタ32及び阻止帯域フィルタは、有利に、検出器31に送信される信号の質を改善するように、装置30に付着されている。
【００６７】
蛍光相関分光解析及びレーマン分光解析を組み合わせることによって、本発明による解析装置は、それによって、溶解している粒子の統計的及び時間的な情報のみでなく、個別に取得される粒子に関する同じような情報を取得することを可能にする。
【００６８】
上記に記載された拡大手段と従来の共焦点顕微鏡システムとの組み合わせは、上記のいずれかの実施形態に従って、解析容積を縮小し検出を拡大することを可能にする。個々の粒子が検出される、非常に効果的な検出システムもまた想定されてもよい。このシステムは、全体的な測定（反応の時間的力学及び統計的分布）によってアクセス可能でない個々の粒子の規模で取得される情報を取得することを可能にする。これは、特に過渡の又は進行している分子集合解析応用に対して、新しい研究及び治療手段を提供する。
【００６９】
上記に記載された本発明の実施形態は、説明の目的のために提供され、決して限定的ではない。当然のことながら、当業者は、特に技術の発展を用いて、それによって本発明の範囲から離脱することなく、本発明の様々な変形を実行することができる。
【００７０】
従って、拡大する手段14及び励起光ビーム10は、平行に配置することが出来る。模範的な実施形態は、ガラス基板3に対向して配置されたマイクロビード・マットである。このマイクロビードの微細構造のアセンブリは、大きい表面面積及び小さい厚さを有する解析容積の取得を可能にする。検出は、その結果、CCD又はCMOSマルチピクセル・センサーで同様に実行してもよい。
【００７１】
同じ方法で、解析されている粒子は、化学発光、生物発光、散乱（レイリー又はハイパー・レイリー）、振動分光（自発的又は誘導レーマン）、熱放射率又は反射特性（粒度分析の場合）、を有してもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶解している粒子サンプルを解析する装置であり、該装置は、顕微鏡システムを含み、該顕微鏡システムは、前記サンプルを支持する手段、励起光ビームを放射することが可能な照明手段、該励起光ビームを前記サンプルの焦点に合わせる手段、及び該焦点の周りで解析容積を定めることが可能な空間選別手段を含む、装置であり、前記顕微鏡システムは、同様に、前記励起光ビームを拡大する手段を含み、前記の拡大手段は、完全に正の焦点距離及び前記サンプルの屈折率よりも高い屈折率を有し、該拡大手段の少なくとも1部分は、前記励起光ビームの経路上に前記焦点から上流に配置され、前記拡大手段の少なくとも1部分は前記支持手段と一体でない、ことを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記拡大手段の少なくとも1部分が前記支持手段と一体である、請求項１に記載の解析装置。
【請求項３】
前記拡大手段の前記支持手段と一体である部分が、該支持手段上の突起部で構成され、該突起部は完全な正曲率を有する、請求項２に記載の解析装置。
【請求項４】
前記拡大手段の前記支持手段と一体でない部分が、少なくとも１つのマイクロレンズを含む、請求項１乃至３のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項５】
前記拡大手段の前記支持手段と一体でない部分が、少なくとも１つの微液滴を含む、請求項1乃至４のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項６】
前記拡大手段の前記支持手段と一体でない部分が、少なくとも１つのマイクロビードを含む、請求項１乃至５のいずれか1項に記載の装置。
【請求項７】
前記マイクロビードが、実質的に1マイクロメートルと5マイクロメートルとの間の直径を有する、請求項６に記載の解析装置。
【請求項８】
前記マイクロビードが、実質的に２マイクロメートルに等しい直径を有する、請求項７に記載の解析装置。
【請求項９】
前記拡大手段が、前記励起光ビームの軸上において軸方向に中心が置かれている、請求項1乃至８のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１０】
前記拡大手段が、前記励起光ビームの焦点上において縦方向に中心が置かれている、請求項1乃至９のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１１】
前記拡大手段が、少なくとも１つの微細金属層で少なくとも部分的に覆われている、請求項１乃至１０のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１２】
前記顕微鏡システムが、同様に、前記サンプル上における前記励起光ビームの相互作用に反応して生成され、前記焦点合わせ手段によって集められる、反応光ビームの強度を検出する手段を含む、請求項１乃至１１のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１３】
前記顕微鏡システムが、同様に、前記の検出手段によって供給される信号を処理する手段を含む、請求項１乃至１２のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１４】
前記支持手段がガラス基板で構成される、請求項１乃至１３のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１５】
前記照明手段が、レーザー源で構成される、請求項１乃至１４のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１６】
前記焦点合わせ手段が対物で構成される、請求項１乃至１５のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１７】
前記焦点合わせ手段がレンズで構成される、請求項１乃至１６のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１８】
前記顕微鏡システムは、焦点を共有し、前記空間選別手段は、可変の寸法の開口を含む、請求項１乃至１７のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１９】
前記励起光ビームを拡大する手段が平行に配置される、請求項１乃至１８のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項２０】
顕微鏡システムを含む解析装置によって溶解している粒子サンプルを解析する方法であり、該顕微鏡システムは、該サンプルを支持する手段、励起光ビームを放射することが可能な照明の手段、該励起光ビームを前記サンプルにおける焦点に焦点合わせする手段、及び該焦点の周りで解析容積を定めることが可能な空間選別手段、を含み：
‐前記励起光ビームの少なくとも1部分は、前記の支持手段から下流に及び前記焦点から上流に、完全に収束性のフォーカス及び前記サンプルの屈折率よりも高い屈折率によって拡大され、前記サンプルの少なくとも1部分は、前記支持手段と一体でなく、且つ
‐反応光ビームの強度が時間に関して測定され、該反応光ビームは、前記解析容積における前記励起光ビームの前記サンプルとの相互作用から生じる、
ことを特徴とする、方法。
【請求項１】
溶解している粒子サンプルを解析する装置であり、該装置は、顕微鏡システムを含み、該顕微鏡システムは、前記サンプルを支持する手段、励起光ビームを放射することが可能な照明手段、該励起光ビームを前記サンプルの焦点に合わせる手段、及び該焦点の周りで解析容積を定めることが可能な空間選別手段を含む、装置であり、前記顕微鏡システムは、同様に、前記励起光ビームを拡大する手段を含み、前記の拡大手段は、完全に正の焦点距離及び前記サンプルの屈折率よりも高い屈折率を有し、該拡大手段の少なくとも1部分は、前記励起光ビームの経路上に前記焦点から上流に配置され、前記拡大手段の少なくとも1部分は前記支持手段と一体でない、ことを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記拡大手段の少なくとも1部分が前記支持手段と一体である、請求項１に記載の解析装置。
【請求項３】
前記拡大手段の前記支持手段と一体である部分が、該支持手段上の突起部で構成され、該突起部は完全な正曲率を有する、請求項２に記載の解析装置。
【請求項４】
前記拡大手段の前記支持手段と一体でない部分が、少なくとも１つのマイクロレンズを含む、請求項１乃至３のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項５】
前記拡大手段の前記支持手段と一体でない部分が、少なくとも１つの微液滴を含む、請求項1乃至４のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項６】
前記拡大手段の前記支持手段と一体でない部分が、少なくとも１つのマイクロビードを含む、請求項１乃至５のいずれか1項に記載の装置。
【請求項７】
前記マイクロビードが、実質的に1マイクロメートルと5マイクロメートルとの間の直径を有する、請求項６に記載の解析装置。
【請求項８】
前記マイクロビードが、実質的に２マイクロメートルに等しい直径を有する、請求項７に記載の解析装置。
【請求項９】
前記拡大手段が、前記励起光ビームの軸上において軸方向に中心が置かれている、請求項1乃至８のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１０】
前記拡大手段が、前記励起光ビームの焦点上において縦方向に中心が置かれている、請求項1乃至９のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１１】
前記拡大手段が、少なくとも１つの微細金属層で少なくとも部分的に覆われている、請求項１乃至１０のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１２】
前記顕微鏡システムが、同様に、前記サンプル上における前記励起光ビームの相互作用に反応して生成され、前記焦点合わせ手段によって集められる、反応光ビームの強度を検出する手段を含む、請求項１乃至１１のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１３】
前記顕微鏡システムが、同様に、前記の検出手段によって供給される信号を処理する手段を含む、請求項１乃至１２のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１４】
前記支持手段がガラス基板で構成される、請求項１乃至１３のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１５】
前記照明手段が、レーザー源で構成される、請求項１乃至１４のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１６】
前記焦点合わせ手段が対物で構成される、請求項１乃至１５のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１７】
前記焦点合わせ手段がレンズで構成される、請求項１乃至１６のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１８】
前記顕微鏡システムは、焦点を共有し、前記空間選別手段は、可変の寸法の開口を含む、請求項１乃至１７のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項１９】
前記励起光ビームを拡大する手段が平行に配置される、請求項１乃至１８のいずれか1項に記載の解析装置。
【請求項２０】
顕微鏡システムを含む解析装置によって溶解している粒子サンプルを解析する方法であり、該顕微鏡システムは、該サンプルを支持する手段、励起光ビームを放射することが可能な照明の手段、該励起光ビームを前記サンプルにおける焦点に焦点合わせする手段、及び該焦点の周りで解析容積を定めることが可能な空間選別手段、を含み：
‐前記励起光ビームの少なくとも1部分は、前記の支持手段から下流に及び前記焦点から上流に、完全に収束性のフォーカス及び前記サンプルの屈折率よりも高い屈折率によって拡大され、前記サンプルの少なくとも1部分は、前記支持手段と一体でなく、且つ
‐反応光ビームの強度が時間に関して測定され、該反応光ビームは、前記解析容積における前記励起光ビームの前記サンプルとの相互作用から生じる、
ことを特徴とする、方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５２１２７６（Ｐ２０１１−５２１２７６Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０４４９７（Ｐ２０１１−５０４４９７）
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０００４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３３３０２
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５１０３０９０２０）セントレ ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィック（セ・エン・エル・エス） (9)
【出願人】（５１０２７２６１０）ユニヴァーシテ ポール スザンヌ マルセイユ サード (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０００４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３３３０２
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５１０３０９０２０）セントレ ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィック（セ・エン・エル・エス） (9)
【出願人】（５１０２７２６１０）ユニヴァーシテ ポール スザンヌ マルセイユ サード (1)
【Ｆターム（参考）】
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