糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法
【課題】 糖たん白質糖鎖の分析方法であって、操作が簡便で迅速な分析を可能にするとともに、糖鎖混合物の分離に優れかつ感度及び定量性の面で優れ、かつ装置上の問題もない分析方法、及び、構造が既知の非標識糖鎖を、実用上の問題もなく安定的に製造、供給することができる製造技術を提供する。
【解決手段】 ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行う工程、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析する工程を有することを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析方法、及びＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析するとともに分取し、分取された所定フラクション中のグリコシルアミン型糖鎖の蛍光性官能基を脱離することを特徴とする非標識糖鎖の製造方法。
【解決手段】 ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行う工程、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析する工程を有することを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析方法、及びＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析するとともに分取し、分取された所定フラクション中のグリコシルアミン型糖鎖の蛍光性官能基を脱離することを特徴とする非標識糖鎖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子である糖たん白質糖鎖の分析技術、及び非標識糖鎖の製造技術に関する。より具体的には、糖たん白質を構成する糖鎖を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、簡便かつ迅速にプロファイル分析することを可能とする糖たん白質糖鎖の分析方法、及び高純度の非標識糖鎖の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内糖たん白質を構成する糖鎖、特にＮ−結合型糖鎖は、該糖たん白質の生物学的活性等に大きな影響を与える成分である。又糖たん白質のバイオ医薬品への適用においても糖鎖が重要な役割を持つ場合が多い。
【０００３】
一方、糖鎖を構成する単糖の種類や糖鎖の分枝構造等は、糖鎖が由来する糖たん白質の種類により異なり、極めて多様な構造の糖鎖が報告されている。さら特定の糖たん白質においても、分子集団内及び分子内で微小不均一性と呼ばれる多様性を示す。又組み換え体糖たん白質においては、培養条件の微妙な変化により糖鎖の構造が変化することも知られている。そこで、糖たん白質の生化学的研究、並びに糖たん白質が適用される医薬品の特性解析及び品質評価においては、このような多様性及び不均一性を有する糖たん白質の糖鎖を分析する技術が不可欠である。
【０００４】
糖たん白質の糖鎖の分析法としては、これまで、種々の分析法が開発されている。中でも、糖鎖を化学的あるいは酵素的に糖たん白質より遊離した後、（１）遊離した糖鎖を、電気化学検出器を用いた高ｐＨ陰イオン交換ＨＰＬＣ分析法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により分離検出する方法や、（２）遊離した糖鎖を還元剤の存在下、還元末端のアルデヒド基を蛍光試薬にて蛍光標識（還元アミノ化反応）した後、蛍光検出器付きＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）又はレーザー励起蛍光検出器付きキャピラリー電気泳動法（ＣＥ−ＬＩＦ）等により分析する方法が広く用いられている。
【０００５】
この中で、（１）遊離した糖鎖を、非標識のまま、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分離検出する方法は、簡便な操作により糖鎖プロファイルが得られるという利点を有する。しかし、高価で特殊なＨＰＬＣ装置及び検出器を必要とする、検出原理上ノイズが大きく感度が蛍光検出法に比較して低い、再現性を得るためのメンテナンスが装置の構造上難しい、さらに、検出感度が糖鎖の構造に依存するので、定量性が低い等の問題点を有する。これらの問題点は、糖たん白質を適用した医薬品の品質評価を糖鎖に基づき行う場合、大きな障害となる。
【０００６】
一方、（２）遊離した糖鎖を、還元アミノ化反応を利用して各種の蛍光試薬にて蛍光標識した後、ＨＰＬＣ−ＦＬＤ又はＣＥ−ＬＩＦにより分析する方法（蛍光検出法）は、糖鎖混合物の分離に優れ、かつ感度及び定量性の面で優れており、従って、糖鎖に基づいて行う、糖たん白質を適用した医薬品の品質評価に適用可能である。しかし、還元アミノ化反応は、原理上複数のステップを要し煩雑で糖鎖を得るために数日を要する。又、毒物であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を必要とし、安全衛生面の問題もある。
【０００７】
このように、従来は、糖たん白質糖鎖の分析方法であって、操作が簡便で迅速な分析を可能にするとともに、糖鎖混合物の分離に優れかつ感度及び定量性の面で優れ、かつ装置上の問題もない分析方法は得られておらず、これらの問題を解決できる分析方法の開発が望まれていた。
【０００８】
さらに、糖たん白質の生化学的研究並びに糖たん白質が適用される医薬品の開発のためには、構造が既知の標準糖鎖、特に非標識標準糖鎖、すなわち蛍光性官能基で標識されていないフリーの標準糖鎖が求められている。すなわち、生体内での糖結合性たん白質と糖鎖との相互作用の解析等の糖鎖バイオロジーの研究や、糖鎖が関与する新規医薬品開発のための実用化研究等に、構造既知の非標識標準糖鎖の利用価値は極めて高いので、その安定した製造、供給が望まれている。
【０００９】
例えば、糖鎖は、生体内で糖結合性たん白質との相互作用を介して細胞間の情報伝達等の重要な機能を果たしているため、多くの複合糖質糖鎖を用いる相互作用解析が必要となり、この相互作用解析を行うために、標準糖鎖を固定化した糖鎖アレーの実用化が競って進められており、糖鎖アレーへの固定化等が可能な非標識標準糖鎖が求められている。又、各種の糖鎖とＨＰＬＣにおける保持時間の関係をデータベース化する研究においても、構造が既知の標準糖鎖が求められている。しかし、従来は、構造が既知の標準糖鎖であって安定供給されるものは少なく、特に、非標識標準糖鎖はほとんど供給されていない。
【００１０】
非標識糖鎖の製造技術としては、化学的に合成する方法や、糖転移酵素遺伝子を導入した細胞により生物学的に合成する方法が挙げられる。しかし、化学的あるいは生物学的に合成する方法は、高度で特殊な技術を要する一方、構造の任意性及び網羅性、回収量の面で実用性及び将来性に乏しい。
【００１１】
又、前記の蛍光標識された糖鎖から非標識糖鎖を回収する方法も報告されている。すなわち糖たん白質から糖鎖を遊離し、遊離した糖鎖を、還元アミノ化反応により蛍光標識した後、ＨＰＬＣで分離することにより、構造が既知の標準糖鎖を得ることができる。しかし、還元アミノ化反応により蛍光標識された糖鎖から、蛍光性官能基を脱離することは極めて困難であり、わずかに酸性条件下で過酸化水素等を用いて非標識糖鎖に戻す方法が検討されているが、収率が悪くかつ糖鎖の分解も避けられない方法であった。従って、この方法により非標識糖鎖へ変換することは極めて困難である。他の方法により蛍光標識された糖鎖についても、同様に、非標識糖鎖に戻すことは極めて困難である。
【００１２】
さらに、前記のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる方法も挙げられ、しばしば用いられている。この方法によれば、非標識の標準糖鎖を分離、採取することができる。しかし、この方法は、前記のような装置の性能上の問題がある他、高濃度の水酸化ナトリウムを含む移動相を必要とするので、その取り扱いに注意を要し操作上の危険性がある。さらに分離し回収した糖鎖を標準糖鎖として用いる場合には、脱塩等の操作が必要となり後処理の煩雑さ等の実用上の大きな問題がある。
【００１３】
このように、従来は、構造が既知の非標識糖鎖を、実用上の問題もなく安定的に製造、供給する製造技術は開発されておらず、その開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、糖たん白質糖鎖の分析方法であって、操作が簡便で迅速な分析を可能にするとともに、糖鎖混合物の分離に優れかつ感度及び定量性の面で優れ、さらに装置上の問題もない分析方法を提供することをその課題とする。本発明は、又、構造が既知の非標識糖鎖を、実用上の問題もなく安定的に製造、供給することができる製造技術を提供することもその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、糖たん白質のＮ−結合型糖鎖を遊離して得られるグリコシルアミンのアミノ基に対しては、アミノ酸のアミノ基への蛍光標識で用いられる様々な試薬を用いて蛍光標識を行なえる可能性があるとの発想を元に、鋭意検討した。
【００１６】
その結果、糖たん白質から糖鎖をグリコシルアミンとして遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖の蛍光標識を所定の条件下で行えば、安定な標識グリコシルアミンが得られ、ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析に供することができること、さらに、糖たん白質を遊離して得られるグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行い、この標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析すれば、従来の還元アミノ化反応により蛍光標識を行う場合の煩雑さや分析に時間を要する問題や、安全衛生面での問題等が解決され、操作が簡便で迅速な分析が可能になるとともに、糖鎖混合物の分離に優れかつ感度及び定量性の面で優れるとのＨＰＬＣ−ＦＬＤの利点も維持されることを見出した。
【００１７】
又、本発明者は、アミノ基が蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖からは、蛍光性官能基の脱離を容易かつ定量的に行うことができること、従って、前記の蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤによる高感度での分析後、ＨＰＬＣにより分取されたグリコシルアミン型糖鎖から蛍光標識体の脱離をすることにより、構造が既知の非標識糖鎖が容易にかつ定量的に得られることを見出した。本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
【００１８】
すなわち本発明は、ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行う工程、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析する工程を有することを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析方法を提供するものである（請求項１）。
【００１９】
本発明は、又、ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行い、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析するとともに分取し、分取された所定フラクション中のグリコシルアミン型糖鎖の蛍光性官能基を脱離することを特徴とする非標識糖鎖の製造方法を提供するものである（請求項５）。
【００２０】
前記の糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法において、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離する方法としては、ヒドラジンを利用してグリコシルヒドラジドとして糖鎖を得る方法も採用できるが、通常は、水中で、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を用いて酵素的に行われる。請求項２は、前記の糖たん白質糖鎖の分析方法であって、糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離が、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦを用いて行われることを特徴とする態様に該当する。このペプチドＮ−グリコシダーゼＦを用いて行われる糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離の反応は、通常、シアル酸の脱離が抑制される３７℃程度で、２時間程度で実施することが望ましい。
【００２１】
糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離は、下記式１の（ａ）に示すように行われ、還元末端にアミノ基が存在するグリコシルアミン型糖鎖が得られる。遊離されたグリコシルアミン型糖鎖は、通常は、下記式１の（ｂ）に示すように、変旋光に伴い速やかに加水分解されて、還元末端がヘミアセタール構造を持つフリーの糖鎖に変換される。
【００２２】
【化１】
【００２３】
発明者らは糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離する反応条件を詳細に検討した結果、中性〜弱アルカリ性の水中であれば、グリコシルアミンの加水分解を防ぐことができ、この条件の下グリコシルアミンの蛍光標識が可能であり、このようにして蛍光標識されたグリコシルアミンのＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析が可能であることを見出したのである。従って、本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法においては、糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離、蛍光標識は、ｐＨ６．０−９．０、好ましくはｐＨ８．０−９．０の条件の下で行われる。
【００２４】
遊離されたグリコシルアミンの蛍光標識は、通常のアミノ酸等の蛍光標識に用いられるアミノ基標識試薬やアミノ基保護試薬を使用して行われる。用いられる蛍光標識試薬としてより具体的には、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）、９−フルオレニルメチルクロロフォルメート（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、ダンシルクロライド、クマリン等が挙げられるが、フリーの非標識糖鎖を回収するためには、脱離が容易なＦｍｏｃ−Ｃｌが望ましい。このようなアミノ基保護試薬の有機溶媒溶液を、酵素により消化された後の試料溶液に混和することで、容易に蛍光標識を行うことができる。
【００２５】
請求項３は、この好ましい態様、すなわち前記の糖たん白質糖鎖の分析方法であって、グリコシルアミンの蛍光標識にＦｍｏｃ−Ｃｌを用いることを特徴とする態様に該当する。次式２に、Ｆｍｏｃ−Ｃｌによる標識（式２の（ｃ））及びその脱離の反応（式２の（ｄ））を示す。
【００２６】
【化２】
【００２７】
従来の還元アミノ化反応を利用する方法の場合、還元末端のヘミアセタール基に対して蛍光標識を行うが、前記のように、標識反応ならびに標識された糖鎖の精製は煩雑な操作を伴い長時間（数日）を必要とする。より具体的には、（１）標識の反応は、多量の水が含まれていると反応が効率よく進行しないため、糖鎖を高濃度にして行う必要がある。従って、反応前に試料の濃縮あるいは乾固が必要であり、濃縮あるいは乾固に数時間を要する、（２）標識反応は、通常酸性条件で５０〜８０℃に加熱して行われるために、糖鎖中のシアル酸の脱離の懸念があり、一方（３）シアル酸の脱離を抑制するために、標識反応を３７℃程度で行うことも考えられるが、この場合はほぼ一晩程度以上の長時間を要する等の問題がある。
【００２８】
一方、本発明に基づくアミノ基への標識は、有機溶媒に溶解した蛍光試薬を酵素消化後の溶液に混和する等の簡単な操作で直ちに標識することができ、酵素反応液の濃縮や乾固の操作は不要であり、又、Ｆｍｏｃ−Ｃｌを用いた場合の標識反応は、非酸性条件で、３７℃にて１時間以下で充分であり、非酸性条件で比較的低温で行うためにシアル酸の脱離の懸念は全くない。
【００２９】
なお、図２は、Ｆｍｏｃ−Ｃｌを用いた場合の標識反応の反応時間とＨＰＬＣ−ＦＬＤのピーク高さ（及び反応温度）との関係を示したものである。反応温度３７℃では、反応時間が１時間程度でピーク高さは、飽和に達しており、反応が１時間以内で完結していることが示されている。
【００３０】
又、従来の還元アミノ化反応を利用する場合は、還元剤として毒物であるシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いるため安全衛生上の問題があったが、本発明の方法では、このような毒物を用いる必要はないので、安全衛生上も優れている。
【００３１】
ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析においては、蛍光標識後ＨＰＬＣで分析する前に、過剰蛍光試薬や還元剤の除去が必須である。従来は、過剰蛍光試薬や還元剤の除去は、ゲルろ過等を伴う方法により行われており、そのため煩雑で長時間を要していた。
【００３２】
しかし、本発明の方法においては、蛍光標識後の過剰試薬（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ等）の除去は、蛍光標識が行われる水溶液に、水に不溶な有機溶媒を添加して混合、撹拌後、水層とこの有機溶媒層を分離し、分離された有機溶媒層を除去することにより容易に行うことができる。すなわち、過剰試薬は有機溶媒層に分配され、糖鎖は水層にとどまるため、水層を回収することにより蛍光標識糖鎖を容易に精製することができる。ここで用いられる水に不溶な有機溶媒としては、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル等が挙げられ、これらから選ばれる有機溶媒の１種又は２種以上の混合溶媒が好ましく用いられる。
【００３３】
通常は、前記の操作を３回繰り返すことにより、クロマトグラム上、過剰試薬を完全に除去できる。この操作では、特殊な前処理カラムや煩雑な操作は一切必要なく、要する時間は１５分以内である。請求項４は、この好ましい態様、すなわち前記の糖たん白質糖鎖の分析方法であって、蛍光標識が行われる水溶液に、水に不溶な有機溶媒を添加して混合、撹拌後、水層と有機溶媒層を分離し、分離された有機溶媒層を除去する工程をさらに有することを特徴とする態様に該当する。
【００３４】
以上述べたように、糖鎖分析用の試料調製に要する時間は、Ｎ−結合型糖鎖の遊離に２時間程度、標識反応に１時間程度、有機溶媒による精製に１５分程度、計約３時間半程度で充分であり、従来の還元アミノ化反応を用いた方法が通常１週間（最短で２日程度）を必要とするのに対し、極めて迅速かつ簡便である。
【００３５】
以上のようにして、調製された試料は、ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる測定に供せられる。ＨＰＬＣ−ＦＬＤの条件は、従来から行われている糖鎖プロファイル分析に適用される条件と同様な条件が適用される。例えばアミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣと蛍光検出器を用いた分離検出法を用いることができ、高分解能で分析することができる。
【００３６】
本発明の、非標識糖鎖の製造方法は、前記のようにしてＨＰＬＣ−ＦＬＤの測定に供せられ、ＨＰＬＣにより分取され標識されたグリコシルアミンをＨＰＬＣにより分画、分離された所定フラクションより、蛍光性官能基を脱離して、非標識糖鎖を得ることを特徴とする。標識された糖鎖から蛍光性官能基を除去する方法は、アミノ基が保護されたアミノ酸の脱保護法と同様に行えばよい。例えばＦｍｏｃ−Ｃｌにより標識された糖鎖からのＦｍｏｃ基の脱離は、標識された糖鎖の水溶液に、モルホリン及びジメチルホルムアミドを添加し、４℃から５０℃の範囲で５分間〜１８０分程度保てばよい。好ましくは２０℃から４０℃、より好ましくは３７℃で２０分間保温することで容易に実施できる。なお、温度が５０℃を越えるとシアル酸の脱離が起こりやすくなり、一方４℃未満では、反応時間が長時間を要する。
【００３７】
本発明は、前記の、糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法に加えて、アミノ基を蛍光標識する試薬、及び標識の脱離のための試薬を含むことを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析用キットを提供する（請求項６）。このキットにより、前記の本発明の方法による、糖たん白質糖鎖の分析及び非標識糖鎖の製造を、迅速にかつ簡便に行うことができる。アミノ基を蛍光標識する試薬としては、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）、９−フルオレニルメチルクロロフォルメート（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、ダンシルクロライド、クマリンが例示される。標識基の脱離のための試薬としては、モルホリン及びジメチルホルムアミドが挙げられる。
【００３８】
本発明は、さらに前記の糖たん白質糖鎖の分析用キットであって、さらに標準糖たん白質を含むことを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析用キットを提供する（請求項７）。このキットにより、標準糖たん白質の成分である構造が既知の非標識の標準糖鎖を、前記の本発明の方法により、容易に製造することができる。標準糖たん白質としては、フェツイン、α１−酸性糖たん白質、フィブリノーゲン、トランスフェリン、チログロブリン、組み換え体イムノグロブリンＧ、卵白アルブミン、リボヌクレアーゼＢ等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法によれば、従来のＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析方法では数日を要した糖たん白質糖鎖の分析を、数時間以内の簡便な操作で行うことができる。又、従来のＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析と同等以上の定量性、感度（２−アミノ安息香酸による標識法と比較し数倍の高感度）が達成され、優れた分離能を有する糖鎖プロファイルを得ることができる。さらに糖鎖に導入された蛍光性の官能基は、簡便な操作で脱離でき、非標識体への変換率はほぼ１００％である。従って、本発明の非標識糖鎖の製造方法により、ＨＰＬＣで分離、回収されたフラクション中の糖鎖を非標識体に変換することで、構造が既知の高純度の非標識糖鎖を簡便に製造することができる。
【００４０】
本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法は、このような優れた特徴を有するので、糖たん白質医薬品の特性解析や品質管理における糖鎖プロファイル分析及び各種構造を有する高純度の非標識糖鎖の製造等に、好ましく適用できる。又、再生医療における幹細胞の新しいレギュレーション法としても期待でき、さらに、迅速化を利用することにより、臨床分析等への応用も期待できる。本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法で得られた標識糖鎖は、容易に非標識糖鎖に変換することができるので、本発明の製造方法は、糖鎖標準品の製造法として極めて価値が高い独創的な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
次に、本発明の最良の形態を、Ｆｍｏｃ試薬を蛍光試薬として用いた場合を例として説明するが、本発明はこの例に限定されるものではない。
【００４２】
［糖たん白質糖鎖のプロファイル分析］（実施形態１）
（１）グリコシルアミンの遊離
先ず、糖たん白質を、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いる酵素的遊離法によりグリコシルアミン型の糖鎖を得る。より具体的な条件の例を示すと、試料となる糖たん白質を、２０ｍＭリン酸バッファーに１〜１０ｍｇ／ｍＬ程度になるように溶解し、この溶液１００μＬに対し、１ｕｎｉｔ／μＬのＰＮＧａｓｅＦを、１０μＬ（１０ ｕｎｉｔ）加え、３７℃で保温することにより、酵素的にＮ−結合型糖鎖をグリコシルアミン型糖鎖として遊離させる。緩衝液のｐＨは、最終的に得られる標識糖鎖の回収量に極めて重要であるので、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の、好ましくはｐＨ８．０からｐＨ９．０の適当なｐＨの緩衝液を使用して酵素反応を実施する。酵素反応時間は、１時間〜２４時間（より好ましくは２〜５時間程度）で良好な結果が得られる。
【００４３】
（２）グリコシルアミンの標識及び精製
このようにして得られた遊離のグリコシルアミンを含む酵素反応溶液に、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．５）又は精製水を加え全量を４００μＬとした後、５ｍｇ／ｍＬのＦｍｏｃ−Ｃｌアセトン溶液の２００μＬを加えて、３７℃で１時間放置後、クロロホルムを３００μＬ加え激しく攪拌し、層分離後、過剰のＦｍｏｃを含むクロロホルム層を捨てる。このクロロホルムによる抽出操作をさらに２回繰り返し、標識されたグリコシルアミン（Ｎ−結合型糖鎖）を含む水層を直接ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析に供するか、又は減圧乾固し適量の水に溶解して一部をＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析に供する。
【００４４】
（３）ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析
ＨＰＬＣ−ＦＬＤによるＦｍｏｃ標識糖鎖のプロファイル分析法としては、以下のような条件が例示される。
【００４５】
装置：島津ＬＣ−１０ＡＤポンプ、島津ＤＧＵ−１２Ａデガッサ、日立６５５−Ａ５２カラムオーブン、Ｊａｓｃｏ ＦＰ−９２０蛍光検出器
分析カラム：昭和電工Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ ４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ
移動相Ａ：２％酢酸アセトニトリル溶液
移動相Ｂ：５％酢酸３％トリエチルアミン水溶液
溶出条件：グラジエント、０分（２０％Ｂ）→１０分（２０％Ｂ）→９０分（９０％Ｂ）→９０．１分（９５％Ｂ）→１０５分（３０％Ｂ）→１０５．１分（２０％Ｂ）→１２０分（２０％Ｂ）
カラム温度：５０℃
検出：励起波長２６６ ｎｍ、蛍光波長３１０ ｎｍ
【００４６】
［非標識糖鎖の製造］（実施形態２）
前記実施形態１の方法により、糖たん白質から遊離されＨＰＬＣにより分取された蛍光標識糖鎖（グリコシルアミン）を用い、以下の方法により非標識糖鎖標準品を製造する。すなわち、ＨＰＬＣにより分取された１フラクションである、蛍光標識糖鎖を含む水溶液（２０μＬ）にジメチルホルムアミド３０μＬ及びモルホリン２０μＬを加え３７℃で１０分以上静置する。その後ジエチルエーテル５００μＬを加え激しく攪拌し、遠心後水層を回収して乾固すると、非標識糖鎖が定量的に回収される。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
実施例１ フェツインの糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に３本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるフェツイン（ウシ由来）を糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図１（ｂ）に示す。なお同じフェツインより還元アミノ化法により得られた２−アミノ安息香酸標識糖鎖を注入量として５倍量用いて分析した結果を図１（ａ）に示した。本発明の方法（実施形態１）は、還元アミノ化法の場合より、数倍の感度であり、かつ同様な分離パターン、同様な定量性が得られた。
【００４９】
実施例２ フェツインの糖鎖の脱Ｆｍｏｃ化
実施形態２に述べた方法に従い、実施例１により得られたＦｍｏｃ化糖鎖（ＨＰＬＣの溶出液）の脱Ｆｍｏｃ化を実施した。結果を図１（ｃ）に示す。Ｆｍｏｃ化糖鎖を検出する波長において、Ｆｍｏｃ糖鎖溶出範囲に全くピークが認められなかったことから、脱Ｆｍｏｃ化反応は完全に行われ、非標識糖鎖が得られたことが示された。さらにこの非標識糖鎖を２−アミノ安息香酸で標識し、２−アミノ安息香酸標識糖鎖を検出する波長においてＨＰＬＣ分析を実施した。結果を図１（ｄ）に示す。２−アミノ安息香酸標識糖鎖の糖鎖プロファイルが得られたことから、図１（ｃ）の試料中に非標識糖鎖が存在したことが示された。
【００５０】
実施例３ 目的の糖鎖構造を有する非標識糖鎖の製造
実施例１と同様の操作で得られたクロマトグラムにおいて、最大ピークの相当するフラクションを回収した（図１（ｂ）のピークＡ）。このピークは、シアル酸を３残基有する３本分枝型糖鎖であることが知られており、単一の構造である。このＦｍｏｃ化糖鎖を実施の形態２の方法により、脱Ｆｍｏｃ化操作を行った。これにより、シアル酸を３残基有する３本分枝型糖鎖の非標識体が得られた。これを確認するためにさらにこの糖鎖を２−アミノ安息香酸で標識し、２−アミノ安息香酸標識糖鎖を検出する波長においてＨＰＬＣ分析した。この結果、フェツイン由来２−アミノ安息香酸標識糖鎖のクロマトグラム（図１（ｄ））における当該ピークと同様の保持時間に単一のピークを得た（図１（ｅ））。このことより、フェツイン中に含まれるシアル酸を３残基有する３本分枝型糖鎖の非標識体が高純度で調製されていたことが示された。
【００５１】
実施例４ a１−酸性糖たん白質の糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に４本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるa１−酸性糖たん白質（ヒト由来）を試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ａ）に示す。a１−酸性糖たん白質に特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５２】
実施例５ トランスフェリンの糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に２本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるトランスフェリン（ヒト由来）を糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ｂ）に示す。トランスフェリンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５３】
実施例６ フィブリノーゲンの糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に２本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるフィブリノーゲンを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ｃ）に示す。フィブリノーゲンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５４】
実施例７ チログロブリンの糖鎖プロファイル分析
マンノース５〜９残基を含む高マンノース型糖鎖及び還元末端に複数のシアル酸を有する主に３本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるチログロブリンを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ｄ）に示す。チログロブリンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５５】
実施例８ 組み換え体イムノグロブリンＧの糖鎖プロファイル分析
還元末端にほとんどシアル酸を有しない主に２本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られる市販抗体医薬品であるイムノグロブリンＧを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図４（ａ）に示す。組み換え体イムノグロブリンＧに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５６】
実施例９ 卵白アルブミンの糖鎖プロファイル分析
還元末端にシアル酸を有しない主に高マンノース型及び混合型糖鎖をもつことが知られる卵白アルブミンを鶏卵白から精製したものを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図４（ｂ）に示す。卵白アルブミンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５７】
実施例１０ リボヌクレアーゼＢの糖鎖プロファイル分析
マンノース５〜９残基を含む高マンノース型糖鎖を有することが知られるリボヌクレアーゼＢを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図４（ｃ）に示す。リボヌクレアーゼＢに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】フェツイン由来の糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤのクロマトグラムを示す図である。
【図２】標識反応の反応時間とＨＰＬＣ−ＦＬＤのピーク高さとの関係を示すグラフ図である。
【図３】各種糖たん白質由来の糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤのクロマトグラムを示す図である。
【図４】各種糖たん白質由来の糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤのクロマトグラムを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子である糖たん白質糖鎖の分析技術、及び非標識糖鎖の製造技術に関する。より具体的には、糖たん白質を構成する糖鎖を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、簡便かつ迅速にプロファイル分析することを可能とする糖たん白質糖鎖の分析方法、及び高純度の非標識糖鎖の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内糖たん白質を構成する糖鎖、特にＮ−結合型糖鎖は、該糖たん白質の生物学的活性等に大きな影響を与える成分である。又糖たん白質のバイオ医薬品への適用においても糖鎖が重要な役割を持つ場合が多い。
【０００３】
一方、糖鎖を構成する単糖の種類や糖鎖の分枝構造等は、糖鎖が由来する糖たん白質の種類により異なり、極めて多様な構造の糖鎖が報告されている。さら特定の糖たん白質においても、分子集団内及び分子内で微小不均一性と呼ばれる多様性を示す。又組み換え体糖たん白質においては、培養条件の微妙な変化により糖鎖の構造が変化することも知られている。そこで、糖たん白質の生化学的研究、並びに糖たん白質が適用される医薬品の特性解析及び品質評価においては、このような多様性及び不均一性を有する糖たん白質の糖鎖を分析する技術が不可欠である。
【０００４】
糖たん白質の糖鎖の分析法としては、これまで、種々の分析法が開発されている。中でも、糖鎖を化学的あるいは酵素的に糖たん白質より遊離した後、（１）遊離した糖鎖を、電気化学検出器を用いた高ｐＨ陰イオン交換ＨＰＬＣ分析法（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により分離検出する方法や、（２）遊離した糖鎖を還元剤の存在下、還元末端のアルデヒド基を蛍光試薬にて蛍光標識（還元アミノ化反応）した後、蛍光検出器付きＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）又はレーザー励起蛍光検出器付きキャピラリー電気泳動法（ＣＥ−ＬＩＦ）等により分析する方法が広く用いられている。
【０００５】
この中で、（１）遊離した糖鎖を、非標識のまま、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分離検出する方法は、簡便な操作により糖鎖プロファイルが得られるという利点を有する。しかし、高価で特殊なＨＰＬＣ装置及び検出器を必要とする、検出原理上ノイズが大きく感度が蛍光検出法に比較して低い、再現性を得るためのメンテナンスが装置の構造上難しい、さらに、検出感度が糖鎖の構造に依存するので、定量性が低い等の問題点を有する。これらの問題点は、糖たん白質を適用した医薬品の品質評価を糖鎖に基づき行う場合、大きな障害となる。
【０００６】
一方、（２）遊離した糖鎖を、還元アミノ化反応を利用して各種の蛍光試薬にて蛍光標識した後、ＨＰＬＣ−ＦＬＤ又はＣＥ−ＬＩＦにより分析する方法（蛍光検出法）は、糖鎖混合物の分離に優れ、かつ感度及び定量性の面で優れており、従って、糖鎖に基づいて行う、糖たん白質を適用した医薬品の品質評価に適用可能である。しかし、還元アミノ化反応は、原理上複数のステップを要し煩雑で糖鎖を得るために数日を要する。又、毒物であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を必要とし、安全衛生面の問題もある。
【０００７】
このように、従来は、糖たん白質糖鎖の分析方法であって、操作が簡便で迅速な分析を可能にするとともに、糖鎖混合物の分離に優れかつ感度及び定量性の面で優れ、かつ装置上の問題もない分析方法は得られておらず、これらの問題を解決できる分析方法の開発が望まれていた。
【０００８】
さらに、糖たん白質の生化学的研究並びに糖たん白質が適用される医薬品の開発のためには、構造が既知の標準糖鎖、特に非標識標準糖鎖、すなわち蛍光性官能基で標識されていないフリーの標準糖鎖が求められている。すなわち、生体内での糖結合性たん白質と糖鎖との相互作用の解析等の糖鎖バイオロジーの研究や、糖鎖が関与する新規医薬品開発のための実用化研究等に、構造既知の非標識標準糖鎖の利用価値は極めて高いので、その安定した製造、供給が望まれている。
【０００９】
例えば、糖鎖は、生体内で糖結合性たん白質との相互作用を介して細胞間の情報伝達等の重要な機能を果たしているため、多くの複合糖質糖鎖を用いる相互作用解析が必要となり、この相互作用解析を行うために、標準糖鎖を固定化した糖鎖アレーの実用化が競って進められており、糖鎖アレーへの固定化等が可能な非標識標準糖鎖が求められている。又、各種の糖鎖とＨＰＬＣにおける保持時間の関係をデータベース化する研究においても、構造が既知の標準糖鎖が求められている。しかし、従来は、構造が既知の標準糖鎖であって安定供給されるものは少なく、特に、非標識標準糖鎖はほとんど供給されていない。
【００１０】
非標識糖鎖の製造技術としては、化学的に合成する方法や、糖転移酵素遺伝子を導入した細胞により生物学的に合成する方法が挙げられる。しかし、化学的あるいは生物学的に合成する方法は、高度で特殊な技術を要する一方、構造の任意性及び網羅性、回収量の面で実用性及び将来性に乏しい。
【００１１】
又、前記の蛍光標識された糖鎖から非標識糖鎖を回収する方法も報告されている。すなわち糖たん白質から糖鎖を遊離し、遊離した糖鎖を、還元アミノ化反応により蛍光標識した後、ＨＰＬＣで分離することにより、構造が既知の標準糖鎖を得ることができる。しかし、還元アミノ化反応により蛍光標識された糖鎖から、蛍光性官能基を脱離することは極めて困難であり、わずかに酸性条件下で過酸化水素等を用いて非標識糖鎖に戻す方法が検討されているが、収率が悪くかつ糖鎖の分解も避けられない方法であった。従って、この方法により非標識糖鎖へ変換することは極めて困難である。他の方法により蛍光標識された糖鎖についても、同様に、非標識糖鎖に戻すことは極めて困難である。
【００１２】
さらに、前記のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる方法も挙げられ、しばしば用いられている。この方法によれば、非標識の標準糖鎖を分離、採取することができる。しかし、この方法は、前記のような装置の性能上の問題がある他、高濃度の水酸化ナトリウムを含む移動相を必要とするので、その取り扱いに注意を要し操作上の危険性がある。さらに分離し回収した糖鎖を標準糖鎖として用いる場合には、脱塩等の操作が必要となり後処理の煩雑さ等の実用上の大きな問題がある。
【００１３】
このように、従来は、構造が既知の非標識糖鎖を、実用上の問題もなく安定的に製造、供給する製造技術は開発されておらず、その開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、糖たん白質糖鎖の分析方法であって、操作が簡便で迅速な分析を可能にするとともに、糖鎖混合物の分離に優れかつ感度及び定量性の面で優れ、さらに装置上の問題もない分析方法を提供することをその課題とする。本発明は、又、構造が既知の非標識糖鎖を、実用上の問題もなく安定的に製造、供給することができる製造技術を提供することもその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、糖たん白質のＮ−結合型糖鎖を遊離して得られるグリコシルアミンのアミノ基に対しては、アミノ酸のアミノ基への蛍光標識で用いられる様々な試薬を用いて蛍光標識を行なえる可能性があるとの発想を元に、鋭意検討した。
【００１６】
その結果、糖たん白質から糖鎖をグリコシルアミンとして遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖の蛍光標識を所定の条件下で行えば、安定な標識グリコシルアミンが得られ、ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析に供することができること、さらに、糖たん白質を遊離して得られるグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行い、この標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析すれば、従来の還元アミノ化反応により蛍光標識を行う場合の煩雑さや分析に時間を要する問題や、安全衛生面での問題等が解決され、操作が簡便で迅速な分析が可能になるとともに、糖鎖混合物の分離に優れかつ感度及び定量性の面で優れるとのＨＰＬＣ−ＦＬＤの利点も維持されることを見出した。
【００１７】
又、本発明者は、アミノ基が蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖からは、蛍光性官能基の脱離を容易かつ定量的に行うことができること、従って、前記の蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤによる高感度での分析後、ＨＰＬＣにより分取されたグリコシルアミン型糖鎖から蛍光標識体の脱離をすることにより、構造が既知の非標識糖鎖が容易にかつ定量的に得られることを見出した。本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
【００１８】
すなわち本発明は、ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行う工程、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析する工程を有することを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析方法を提供するものである（請求項１）。
【００１９】
本発明は、又、ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行い、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析するとともに分取し、分取された所定フラクション中のグリコシルアミン型糖鎖の蛍光性官能基を脱離することを特徴とする非標識糖鎖の製造方法を提供するものである（請求項５）。
【００２０】
前記の糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法において、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離する方法としては、ヒドラジンを利用してグリコシルヒドラジドとして糖鎖を得る方法も採用できるが、通常は、水中で、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を用いて酵素的に行われる。請求項２は、前記の糖たん白質糖鎖の分析方法であって、糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離が、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦを用いて行われることを特徴とする態様に該当する。このペプチドＮ−グリコシダーゼＦを用いて行われる糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離の反応は、通常、シアル酸の脱離が抑制される３７℃程度で、２時間程度で実施することが望ましい。
【００２１】
糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離は、下記式１の（ａ）に示すように行われ、還元末端にアミノ基が存在するグリコシルアミン型糖鎖が得られる。遊離されたグリコシルアミン型糖鎖は、通常は、下記式１の（ｂ）に示すように、変旋光に伴い速やかに加水分解されて、還元末端がヘミアセタール構造を持つフリーの糖鎖に変換される。
【００２２】
【化１】
【００２３】
発明者らは糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離する反応条件を詳細に検討した結果、中性〜弱アルカリ性の水中であれば、グリコシルアミンの加水分解を防ぐことができ、この条件の下グリコシルアミンの蛍光標識が可能であり、このようにして蛍光標識されたグリコシルアミンのＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析が可能であることを見出したのである。従って、本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法においては、糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離、蛍光標識は、ｐＨ６．０−９．０、好ましくはｐＨ８．０−９．０の条件の下で行われる。
【００２４】
遊離されたグリコシルアミンの蛍光標識は、通常のアミノ酸等の蛍光標識に用いられるアミノ基標識試薬やアミノ基保護試薬を使用して行われる。用いられる蛍光標識試薬としてより具体的には、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）、９−フルオレニルメチルクロロフォルメート（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、ダンシルクロライド、クマリン等が挙げられるが、フリーの非標識糖鎖を回収するためには、脱離が容易なＦｍｏｃ−Ｃｌが望ましい。このようなアミノ基保護試薬の有機溶媒溶液を、酵素により消化された後の試料溶液に混和することで、容易に蛍光標識を行うことができる。
【００２５】
請求項３は、この好ましい態様、すなわち前記の糖たん白質糖鎖の分析方法であって、グリコシルアミンの蛍光標識にＦｍｏｃ−Ｃｌを用いることを特徴とする態様に該当する。次式２に、Ｆｍｏｃ−Ｃｌによる標識（式２の（ｃ））及びその脱離の反応（式２の（ｄ））を示す。
【００２６】
【化２】
【００２７】
従来の還元アミノ化反応を利用する方法の場合、還元末端のヘミアセタール基に対して蛍光標識を行うが、前記のように、標識反応ならびに標識された糖鎖の精製は煩雑な操作を伴い長時間（数日）を必要とする。より具体的には、（１）標識の反応は、多量の水が含まれていると反応が効率よく進行しないため、糖鎖を高濃度にして行う必要がある。従って、反応前に試料の濃縮あるいは乾固が必要であり、濃縮あるいは乾固に数時間を要する、（２）標識反応は、通常酸性条件で５０〜８０℃に加熱して行われるために、糖鎖中のシアル酸の脱離の懸念があり、一方（３）シアル酸の脱離を抑制するために、標識反応を３７℃程度で行うことも考えられるが、この場合はほぼ一晩程度以上の長時間を要する等の問題がある。
【００２８】
一方、本発明に基づくアミノ基への標識は、有機溶媒に溶解した蛍光試薬を酵素消化後の溶液に混和する等の簡単な操作で直ちに標識することができ、酵素反応液の濃縮や乾固の操作は不要であり、又、Ｆｍｏｃ−Ｃｌを用いた場合の標識反応は、非酸性条件で、３７℃にて１時間以下で充分であり、非酸性条件で比較的低温で行うためにシアル酸の脱離の懸念は全くない。
【００２９】
なお、図２は、Ｆｍｏｃ−Ｃｌを用いた場合の標識反応の反応時間とＨＰＬＣ−ＦＬＤのピーク高さ（及び反応温度）との関係を示したものである。反応温度３７℃では、反応時間が１時間程度でピーク高さは、飽和に達しており、反応が１時間以内で完結していることが示されている。
【００３０】
又、従来の還元アミノ化反応を利用する場合は、還元剤として毒物であるシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いるため安全衛生上の問題があったが、本発明の方法では、このような毒物を用いる必要はないので、安全衛生上も優れている。
【００３１】
ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析においては、蛍光標識後ＨＰＬＣで分析する前に、過剰蛍光試薬や還元剤の除去が必須である。従来は、過剰蛍光試薬や還元剤の除去は、ゲルろ過等を伴う方法により行われており、そのため煩雑で長時間を要していた。
【００３２】
しかし、本発明の方法においては、蛍光標識後の過剰試薬（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ等）の除去は、蛍光標識が行われる水溶液に、水に不溶な有機溶媒を添加して混合、撹拌後、水層とこの有機溶媒層を分離し、分離された有機溶媒層を除去することにより容易に行うことができる。すなわち、過剰試薬は有機溶媒層に分配され、糖鎖は水層にとどまるため、水層を回収することにより蛍光標識糖鎖を容易に精製することができる。ここで用いられる水に不溶な有機溶媒としては、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル等が挙げられ、これらから選ばれる有機溶媒の１種又は２種以上の混合溶媒が好ましく用いられる。
【００３３】
通常は、前記の操作を３回繰り返すことにより、クロマトグラム上、過剰試薬を完全に除去できる。この操作では、特殊な前処理カラムや煩雑な操作は一切必要なく、要する時間は１５分以内である。請求項４は、この好ましい態様、すなわち前記の糖たん白質糖鎖の分析方法であって、蛍光標識が行われる水溶液に、水に不溶な有機溶媒を添加して混合、撹拌後、水層と有機溶媒層を分離し、分離された有機溶媒層を除去する工程をさらに有することを特徴とする態様に該当する。
【００３４】
以上述べたように、糖鎖分析用の試料調製に要する時間は、Ｎ−結合型糖鎖の遊離に２時間程度、標識反応に１時間程度、有機溶媒による精製に１５分程度、計約３時間半程度で充分であり、従来の還元アミノ化反応を用いた方法が通常１週間（最短で２日程度）を必要とするのに対し、極めて迅速かつ簡便である。
【００３５】
以上のようにして、調製された試料は、ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる測定に供せられる。ＨＰＬＣ−ＦＬＤの条件は、従来から行われている糖鎖プロファイル分析に適用される条件と同様な条件が適用される。例えばアミノカラムを用いた順相ＨＰＬＣと蛍光検出器を用いた分離検出法を用いることができ、高分解能で分析することができる。
【００３６】
本発明の、非標識糖鎖の製造方法は、前記のようにしてＨＰＬＣ−ＦＬＤの測定に供せられ、ＨＰＬＣにより分取され標識されたグリコシルアミンをＨＰＬＣにより分画、分離された所定フラクションより、蛍光性官能基を脱離して、非標識糖鎖を得ることを特徴とする。標識された糖鎖から蛍光性官能基を除去する方法は、アミノ基が保護されたアミノ酸の脱保護法と同様に行えばよい。例えばＦｍｏｃ−Ｃｌにより標識された糖鎖からのＦｍｏｃ基の脱離は、標識された糖鎖の水溶液に、モルホリン及びジメチルホルムアミドを添加し、４℃から５０℃の範囲で５分間〜１８０分程度保てばよい。好ましくは２０℃から４０℃、より好ましくは３７℃で２０分間保温することで容易に実施できる。なお、温度が５０℃を越えるとシアル酸の脱離が起こりやすくなり、一方４℃未満では、反応時間が長時間を要する。
【００３７】
本発明は、前記の、糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法に加えて、アミノ基を蛍光標識する試薬、及び標識の脱離のための試薬を含むことを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析用キットを提供する（請求項６）。このキットにより、前記の本発明の方法による、糖たん白質糖鎖の分析及び非標識糖鎖の製造を、迅速にかつ簡便に行うことができる。アミノ基を蛍光標識する試薬としては、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）、９−フルオレニルメチルクロロフォルメート（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、ダンシルクロライド、クマリンが例示される。標識基の脱離のための試薬としては、モルホリン及びジメチルホルムアミドが挙げられる。
【００３８】
本発明は、さらに前記の糖たん白質糖鎖の分析用キットであって、さらに標準糖たん白質を含むことを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析用キットを提供する（請求項７）。このキットにより、標準糖たん白質の成分である構造が既知の非標識の標準糖鎖を、前記の本発明の方法により、容易に製造することができる。標準糖たん白質としては、フェツイン、α１−酸性糖たん白質、フィブリノーゲン、トランスフェリン、チログロブリン、組み換え体イムノグロブリンＧ、卵白アルブミン、リボヌクレアーゼＢ等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法によれば、従来のＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析方法では数日を要した糖たん白質糖鎖の分析を、数時間以内の簡便な操作で行うことができる。又、従来のＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析と同等以上の定量性、感度（２−アミノ安息香酸による標識法と比較し数倍の高感度）が達成され、優れた分離能を有する糖鎖プロファイルを得ることができる。さらに糖鎖に導入された蛍光性の官能基は、簡便な操作で脱離でき、非標識体への変換率はほぼ１００％である。従って、本発明の非標識糖鎖の製造方法により、ＨＰＬＣで分離、回収されたフラクション中の糖鎖を非標識体に変換することで、構造が既知の高純度の非標識糖鎖を簡便に製造することができる。
【００４０】
本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法は、このような優れた特徴を有するので、糖たん白質医薬品の特性解析や品質管理における糖鎖プロファイル分析及び各種構造を有する高純度の非標識糖鎖の製造等に、好ましく適用できる。又、再生医療における幹細胞の新しいレギュレーション法としても期待でき、さらに、迅速化を利用することにより、臨床分析等への応用も期待できる。本発明の糖たん白質糖鎖の分析方法で得られた標識糖鎖は、容易に非標識糖鎖に変換することができるので、本発明の製造方法は、糖鎖標準品の製造法として極めて価値が高い独創的な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
次に、本発明の最良の形態を、Ｆｍｏｃ試薬を蛍光試薬として用いた場合を例として説明するが、本発明はこの例に限定されるものではない。
【００４２】
［糖たん白質糖鎖のプロファイル分析］（実施形態１）
（１）グリコシルアミンの遊離
先ず、糖たん白質を、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いる酵素的遊離法によりグリコシルアミン型の糖鎖を得る。より具体的な条件の例を示すと、試料となる糖たん白質を、２０ｍＭリン酸バッファーに１〜１０ｍｇ／ｍＬ程度になるように溶解し、この溶液１００μＬに対し、１ｕｎｉｔ／μＬのＰＮＧａｓｅＦを、１０μＬ（１０ ｕｎｉｔ）加え、３７℃で保温することにより、酵素的にＮ−結合型糖鎖をグリコシルアミン型糖鎖として遊離させる。緩衝液のｐＨは、最終的に得られる標識糖鎖の回収量に極めて重要であるので、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の、好ましくはｐＨ８．０からｐＨ９．０の適当なｐＨの緩衝液を使用して酵素反応を実施する。酵素反応時間は、１時間〜２４時間（より好ましくは２〜５時間程度）で良好な結果が得られる。
【００４３】
（２）グリコシルアミンの標識及び精製
このようにして得られた遊離のグリコシルアミンを含む酵素反応溶液に、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．５）又は精製水を加え全量を４００μＬとした後、５ｍｇ／ｍＬのＦｍｏｃ−Ｃｌアセトン溶液の２００μＬを加えて、３７℃で１時間放置後、クロロホルムを３００μＬ加え激しく攪拌し、層分離後、過剰のＦｍｏｃを含むクロロホルム層を捨てる。このクロロホルムによる抽出操作をさらに２回繰り返し、標識されたグリコシルアミン（Ｎ−結合型糖鎖）を含む水層を直接ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析に供するか、又は減圧乾固し適量の水に溶解して一部をＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析に供する。
【００４４】
（３）ＨＰＬＣ−ＦＬＤによる分析
ＨＰＬＣ−ＦＬＤによるＦｍｏｃ標識糖鎖のプロファイル分析法としては、以下のような条件が例示される。
【００４５】
装置：島津ＬＣ−１０ＡＤポンプ、島津ＤＧＵ−１２Ａデガッサ、日立６５５−Ａ５２カラムオーブン、Ｊａｓｃｏ ＦＰ−９２０蛍光検出器
分析カラム：昭和電工Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ ４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ
移動相Ａ：２％酢酸アセトニトリル溶液
移動相Ｂ：５％酢酸３％トリエチルアミン水溶液
溶出条件：グラジエント、０分（２０％Ｂ）→１０分（２０％Ｂ）→９０分（９０％Ｂ）→９０．１分（９５％Ｂ）→１０５分（３０％Ｂ）→１０５．１分（２０％Ｂ）→１２０分（２０％Ｂ）
カラム温度：５０℃
検出：励起波長２６６ ｎｍ、蛍光波長３１０ ｎｍ
【００４６】
［非標識糖鎖の製造］（実施形態２）
前記実施形態１の方法により、糖たん白質から遊離されＨＰＬＣにより分取された蛍光標識糖鎖（グリコシルアミン）を用い、以下の方法により非標識糖鎖標準品を製造する。すなわち、ＨＰＬＣにより分取された１フラクションである、蛍光標識糖鎖を含む水溶液（２０μＬ）にジメチルホルムアミド３０μＬ及びモルホリン２０μＬを加え３７℃で１０分以上静置する。その後ジエチルエーテル５００μＬを加え激しく攪拌し、遠心後水層を回収して乾固すると、非標識糖鎖が定量的に回収される。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
実施例１ フェツインの糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に３本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるフェツイン（ウシ由来）を糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図１（ｂ）に示す。なお同じフェツインより還元アミノ化法により得られた２−アミノ安息香酸標識糖鎖を注入量として５倍量用いて分析した結果を図１（ａ）に示した。本発明の方法（実施形態１）は、還元アミノ化法の場合より、数倍の感度であり、かつ同様な分離パターン、同様な定量性が得られた。
【００４９】
実施例２ フェツインの糖鎖の脱Ｆｍｏｃ化
実施形態２に述べた方法に従い、実施例１により得られたＦｍｏｃ化糖鎖（ＨＰＬＣの溶出液）の脱Ｆｍｏｃ化を実施した。結果を図１（ｃ）に示す。Ｆｍｏｃ化糖鎖を検出する波長において、Ｆｍｏｃ糖鎖溶出範囲に全くピークが認められなかったことから、脱Ｆｍｏｃ化反応は完全に行われ、非標識糖鎖が得られたことが示された。さらにこの非標識糖鎖を２−アミノ安息香酸で標識し、２−アミノ安息香酸標識糖鎖を検出する波長においてＨＰＬＣ分析を実施した。結果を図１（ｄ）に示す。２−アミノ安息香酸標識糖鎖の糖鎖プロファイルが得られたことから、図１（ｃ）の試料中に非標識糖鎖が存在したことが示された。
【００５０】
実施例３ 目的の糖鎖構造を有する非標識糖鎖の製造
実施例１と同様の操作で得られたクロマトグラムにおいて、最大ピークの相当するフラクションを回収した（図１（ｂ）のピークＡ）。このピークは、シアル酸を３残基有する３本分枝型糖鎖であることが知られており、単一の構造である。このＦｍｏｃ化糖鎖を実施の形態２の方法により、脱Ｆｍｏｃ化操作を行った。これにより、シアル酸を３残基有する３本分枝型糖鎖の非標識体が得られた。これを確認するためにさらにこの糖鎖を２−アミノ安息香酸で標識し、２−アミノ安息香酸標識糖鎖を検出する波長においてＨＰＬＣ分析した。この結果、フェツイン由来２−アミノ安息香酸標識糖鎖のクロマトグラム（図１（ｄ））における当該ピークと同様の保持時間に単一のピークを得た（図１（ｅ））。このことより、フェツイン中に含まれるシアル酸を３残基有する３本分枝型糖鎖の非標識体が高純度で調製されていたことが示された。
【００５１】
実施例４ a１−酸性糖たん白質の糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に４本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるa１−酸性糖たん白質（ヒト由来）を試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ａ）に示す。a１−酸性糖たん白質に特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５２】
実施例５ トランスフェリンの糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に２本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるトランスフェリン（ヒト由来）を糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ｂ）に示す。トランスフェリンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５３】
実施例６ フィブリノーゲンの糖鎖プロファイル分析
還元末端に複数のシアル酸を有する主に２本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるフィブリノーゲンを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ｃ）に示す。フィブリノーゲンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５４】
実施例７ チログロブリンの糖鎖プロファイル分析
マンノース５〜９残基を含む高マンノース型糖鎖及び還元末端に複数のシアル酸を有する主に３本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるチログロブリンを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図３（ｄ）に示す。チログロブリンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５５】
実施例８ 組み換え体イムノグロブリンＧの糖鎖プロファイル分析
還元末端にほとんどシアル酸を有しない主に２本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られる市販抗体医薬品であるイムノグロブリンＧを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図４（ａ）に示す。組み換え体イムノグロブリンＧに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５６】
実施例９ 卵白アルブミンの糖鎖プロファイル分析
還元末端にシアル酸を有しない主に高マンノース型及び混合型糖鎖をもつことが知られる卵白アルブミンを鶏卵白から精製したものを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図４（ｂ）に示す。卵白アルブミンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【００５７】
実施例１０ リボヌクレアーゼＢの糖鎖プロファイル分析
マンノース５〜９残基を含む高マンノース型糖鎖を有することが知られるリボヌクレアーゼＢを糖たん白質試料として、実施形態１に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図４（ｃ）に示す。リボヌクレアーゼＢに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】フェツイン由来の糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤのクロマトグラムを示す図である。
【図２】標識反応の反応時間とＨＰＬＣ−ＦＬＤのピーク高さとの関係を示すグラフ図である。
【図３】各種糖たん白質由来の糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤのクロマトグラムを示す図である。
【図４】各種糖たん白質由来の糖鎖のＨＰＬＣ−ＦＬＤのクロマトグラムを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行う工程、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析する工程を有することを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項２】
糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離が、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦを用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項３】
グリコシルアミンのアミノ基に対する蛍光標識を、Ｆｍｏｃ−Ｃｌを用いて行うことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項４】
蛍光標識が行われる水溶液に、水に不溶な有機溶媒を添加して混合、撹拌後、水層と有機溶媒層を分離し、分離された有機溶媒層を除去する工程をさらに有することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項５】
ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行い、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析するとともに分取し、分取された所定フラクション中のグリコシルアミン型糖鎖より蛍光性官能基を脱離することを特徴とする非標識糖鎖の製造方法。
【請求項６】
アミノ基を蛍光標識する試薬、及び標識の脱離のための試薬を含むことを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析用キット。
【請求項７】
さらに、標準糖たん白質を含むことを特徴とする請求項６に記載の糖たん白質糖鎖の分析用キット。
【請求項１】
ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行う工程、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析する工程を有することを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項２】
糖たん白質よりのＮ−結合型糖鎖の遊離が、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦを用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項３】
グリコシルアミンのアミノ基に対する蛍光標識を、Ｆｍｏｃ−Ｃｌを用いて行うことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項４】
蛍光標識が行われる水溶液に、水に不溶な有機溶媒を添加して混合、撹拌後、水層と有機溶媒層を分離し、分離された有機溶媒層を除去する工程をさらに有することを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
【請求項５】
ｐＨ６−９に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりＮ−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行い、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をＨＰＬＣ−ＦＬＤにより分析するとともに分取し、分取された所定フラクション中のグリコシルアミン型糖鎖より蛍光性官能基を脱離することを特徴とする非標識糖鎖の製造方法。
【請求項６】
アミノ基を蛍光標識する試薬、及び標識の脱離のための試薬を含むことを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析用キット。
【請求項７】
さらに、標準糖たん白質を含むことを特徴とする請求項６に記載の糖たん白質糖鎖の分析用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−３８６７４（Ｐ２００６−３８６７４Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２００４０（Ｐ２００４−２２００４０）
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（５０４２８９５９８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（５０４２８９５９８）
【Ｆターム（参考）】
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