組成物
本発明は、細胞生物学および医学の領域であり、人工的骨髄様環境を作成するための組成物とそのインビトロ法、およびその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学および医学の領域であり、人工的骨髄様環境を作成するための組成物とそのインビトロ法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトでは、「骨髄微小環境」（ＢＭＥ）と呼ぶ特殊な環境が骨小腔内に存在し、これは少なくとも１０類の異なる血球、骨の回復に必要な細胞、および広範な種々の分化細胞を生み出すことができる多数の幹細胞／前駆細胞の生成のための主要な部位を構成する。ヒトの健康は、「造血」と呼ばれるプロセスにより産生される異なる血球の絶え間ない供給に決定的に依存している。ＢＭＥは、体内を循環する少数の多能性幹細胞や前駆細胞（ＳＰＣ）に、全体の造血プロセスを構成する１０種類もの異なる血球を生成するように指令する。ＳＰＣは体内に広く分布しているため、自然の機構が、ａ）ＳＰＣが骨髄の外からＢＭＥに帰る（ＳＰＣ帰巣と呼ばれる）、ｂ）ＳＰＣとＢＭＥとの適当な接着性相互作用（移植と呼ばれる）を促進することによりＢＭＥ内にＳＰＣを保持する、ｃ）休止ＳＰＣを活性型に変えてその増殖を促進する、ｄ）多数のしばしば矛盾するシグナルにもかかわらずアポトーシスに対してＳＰＣを生き残らせる（ＳＰＣの生存と呼ばれる）、ｅ）ＳＰＣに、自己再生（より多くのＳＰＣを産生するため）または系統の運命決定（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）と分化（より多くの成熟血球を産生するため）の経路に沿って増殖するように指令するように機能する。従ってＳＰＣが関与する造血におけるＢＭＥの役割は、個体の一生を通して効率的な多系統の血球生成を確実にするために、個々に制御され微妙にバランスされた一連の工程として構築される。
【０００３】
血球産生の維持と最適化を引き起こすＳＰＣ機能（帰巣、移植、休止状態からの活性化、活性化ＳＰＣの休止の誘導、細胞の生存、自己再生、系統の運命決定と分化に沿った成長）に関する全プロセスはＢＭＥにより制御されるが、この制御に関与する正確な機構が科学者によって完全には理解されておらず、上記のインビトロまたはインビボの記載の１つまたはそれ以上の工程を制御し種々の他の用途を可能にするＢＭＥ様環境の作成のための方法は先行技術には存在しない。
【０００４】
先行技術では、骨髄中に存在する補助細胞は、ＳＰＣが必要とする微小環境の生成のためのすぐ近くの種々のサイトカインや成長制御物質のみを提供し、従って造血に必要なかかる成分の受動的な供給源として機能すると考えられてきた。文献で一般的な他の見解は、まれな集団の補助細胞のみがＳＰＣ成長を支持する能力を有するというものである。本出願人はそのような考え方には反対であり、適切な条件が与えられれば任意の補助細胞がＳＰＣに優れたシグナルを提供することを見いした。本出願人は、血球生成が増強されるかまたは制御される人工的骨髄様環境の作成を助ける組成物を開発した。本発明により開示される組成物と方法は、造血のすべての工程が大きく改良されるようなものである。さらに本発明は、所望の作用が現れるには、ＳＰＣがＡＢＭＥを構成する補助細胞にわずかに接触することが必要であることを強調し、従って補助細胞が積極的な役割を果たすことを強調する。すなわち先行技術では、ＳＰＣを拡張する試みが行われてきた。しかし現在のところ、インビトロで有効な人工的ＢＭＥを作成することにより血球生成を実質的に改良または制御ことは可能ではない。本発明はこのニーズを満たす。
【０００５】
発明の目的：
本発明の主要な目的は、血球生成が増強または制御される人工的骨髄様環境の作成を助ける組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、かかる環境を調製するための方法を提供することである。
【発明の開示】
【０００６】
発明の詳細な説明：
Ｉ．組成物：
従ってある態様において本発明は、血球の制御生成のための人工的インビトロ骨髄環境（ＡＢＭＥ）を開発するのに有用な組成物であって：
（ｉ）間葉細胞、
（ii）生物学的物質、化学的物質、および免疫学的物質から選択される造血調節物質；および
（iii）ＡＢＭＥ作成のためおよび本発明を実施するための培地
を含んでなる組成物に関する。
【０００７】
本明細書において用語「造血調節物質（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」は、これが使用されない標準から、インビトロ造血の１つまたはそれ以上の工程を変化させることができる物質を意味し、これにより、１つまたはそれ以上の系統のより多くの血球が生成されるか、または２つまたはそれ以上の系統の血球の相対的比率が変化し、間葉細胞の細胞内シグナルまたはＳＰＣまたはその両方に対する調節作用を通して作用する。かかる物質は、生物学的物質、化学的物質、または免疫学的物質でもよい。造血調節物質は、人工的インビトロＢＭＥの生成に必須であり、本発明は造血調節物質のいくつかの例を提供する。３種類の造血調節物質が有効であることがわかっている：ａ）生物学的、ｂ）化学的、およびｃ）免疫学的。これらの調節物質は本明細書において「造血調節物質」または「ヘマモジュレーター（ｈｅｍａｔｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」と呼ぶ。
【０００８】
生物学的造血調節物質：
生物学的物質または生物学的造血調節物質は、１）細胞から調製された適当な調整培地；２）成長因子および細胞刺激物質、例えばトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、または３）天然のタンパク質、例えばフィブロネクチン、ビブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、およびインテグリン結合ドメインもしくは活性化ドメインを含有するこれらの断片、およびインテグリンのようなこれらの受容体の調節物質、から選択される。該天然のタンパク質は、種および属全体にわたる天然に存在する相同的遺伝子から得られるタンパク質、およびこれらの合成作成された機能性相同物もしくは模倣物がある。かかる生物学的造血調節物質は、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ自己再生、ＳＰＣ移植、分化のための系統へのＳＰＣの運命決定、および強い血球生成に有用な標的細胞中の複数の細胞内シグナルを生成または維持することにより作用する。組成物中の生物学的物質の濃度範囲は、約０．１ナノモル〜５０マイクロモルである。
【０００９】
化学的造血調節物質：
造血調節物質として使用される化学的物質または化学的造血調節物質は、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ自己再生、ＳＰＣ移植、分化のための系統へのＳＰＣの運命決定、および強い血球生成に有用な標的細胞中の特異的細胞内シグナル伝達の増強物質または調節物質でもよい。かかる化学的物質は、タンパク質、ペプチドまたはこれらの機能的同族体と構造的に関連してもしなくてもよく、特異的細胞内シグナルの増強物質として作用する。化学造血調節物質は：
（ｉ）タンパク質キナーゼＣ増強物質、（ii）タンパク質キナーゼを含む環状グアノシン１リン酸（ｃＧＭＰ）活性化プロセスの増強物質、（iii）焦点接着キナーゼの増強物質、（iv）ＰＩ３−キナーゼ、ＰＤキナーゼ、Ａｋｔキナーゼ、およびＡｋｔ活性化経路の他の下流のメンバーを同時に活性化する増強物質、（ｖ）Ｃａ++シグナル伝達の調節物質、Ｃａ++−カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼを含む、（vi）インテグリン結合キナーゼの増強物質、および（vii）（ｉ）〜（vi）から選択される２つまたはそれ以上の増強物質の適当な組合せを含むコンビナトリアル増強物質、から選択される。前記したペプチドとタンパク質試薬は、個々のアミノ酸に従いその３文字コードにより特定し、配列の続きはＮ末端で開始しＣ末端で終止する。
【００１０】
タンパク質キナーゼＣ増強物質は、脂質様物質、例えば天然または合成ジアシルグリセロール、ファルネシルチオトリアゾール、または非脂質様化学物質、例えば（−）インドラクタムＶ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテートにより例示されるホルボールエステル基のメンバー、または細胞中の生成したジアシルグリセロールが長期間機能できるように細胞中のジアシルグリセロールリパーゼ酵素を阻害する物質、例えば１，６−ビス（シクロヘキシルオキシイミノカルボニルアミノ）ヘキサン（Ｕ−５７９０８）、でもよい。ｃＧＭＰ活性化プロセスの増強物質は、ｃＧＭＰ様化合物でもよく、これは容易に細胞に入り、タンパク質キナーゼを含むｃＧＭＰ依存性プロセスを直接または間接に増強する。かかる化合物は、８−（４−クロロフェニルチオ）グアノシン３’，５’−サイクリック１リン酸塩、アデノシン３’，５’−サイクリックモノホスホチオエート−Ｒｐ−異性体塩、またはその特異的ホスホジエステラーゼにより細胞内のｃＧＭＰの破壊を阻害する化合物、例えばザプリナスト（Ｚａｐｒｉｎａｓｔ）およびシルデナフィル（Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）およびこれらの機能的同族体でもよい。焦点接着キナーゼ増強物質は、間葉細胞と相互作用できるか、または特にその細胞表面上に存在する種々のインテグリン分子と相互作用できるタンパク質またはペプチドモチーフでもよく、その後焦点接着キナーゼは活性化され、同時に細胞内でインテグリン受容体関連シグナルが生成され、増強または維持される。線状ペプチド性の造血調節物質は本明細書に記載され、すべての場合に、アミノ酸の標準的３文字コードで記載されるペプチド／タンパク質配列とアミノ末端アミノ酸で開始されカルボキシ末端アミノ酸で終止する配列を有する。ペプチド造血調節物質の例は、Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ、配列モチーフ「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒｉｎｅ」を有する配列を含む線状または「ヘッドツーテイル（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）環状ペプチド」またはその機能性同族体；インテグリン結合キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、およびＡｋｔ−キナーゼの増強物質はペプチド、Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ、配列モチーフ「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ」を有する線状または環状ペプチド、およびタンパク質ＴＧＦβ１である。
【００１１】
化学的物質は、細胞内貯蔵からＣａ++イオンを放出するかまたはＣａ++チャネルの活性化によりより多くの細胞外Ｃａ++イオンが細胞に入り、その後にプロテインキナーゼを含むいくつかのＣａ++依存性酵素が活性化されることを可能にするカルシウム動員物質でもよく、かかる造血調節物質は、タプシガルギン、シクロピアゾン酸、および８−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）オクチル−３，４，５−トリメトキシベンゾエート（ＴＭＢ−８）により例示される。化学造血調節物質は間葉細胞内のチロシンキナーゼのインヒビターでもよく、３−アミノ−２，４−ジシアノ−５−（３’，４，５’−トリヒドロキシフェニル）ペンタ−２，４−ジエノニトリル（トリホスチンＡＧ１８３、チルホスチンＡ５１と同義）により例示される。
【００１２】
化学的造血調節物質は、ペプチドＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＧｌｙのようなＦＧＦ受容体機能の制御物質でもよく、これは間葉細胞で使用されて、そのままＡＢＭＥを形成するかまたは他の造血調節物質（例えばＴＧＦβ１）により形成されるＡＢＭＥの相乗的増強物質となる。
【００１３】
さらに造血調節物質は、酸化窒素、間質細胞由来因子−１アルファ（以後「ＳＤＦ−１アルファ」と呼ぶ）および間質細胞由来因子−１ベータ（以後「ＳＤＦ−１ベータ」と呼ぶ）のような拡散性の化学メッセンジャーを介するシグナル伝達を促進する物質でもよい。本発明者は、間葉細胞が酸化窒素、ＳＤＦ−１アルファ、およびＳＤＦ−１ベータを産生することができ、ＡＢＭＥの組成物が生成した後、これらの化学メッセンジャーがＡＢＭＥにより産生量が増加することを見いだした。酸化窒素、ＳＤＦ−１アルファ、およびＳＤＦ−１ベータは、後述するように強固な造血を刺激するＡＢＭＥの機能的機構に関与する。ＳＤＦ−１アルファ、およびＳＤＦ−１ベータの分子はＳＰＣの誘引物質として作用し、ＳＰＣが長距離を化学移動してＡＢＭＥに達することを可能にする。間葉細胞からのＳＤＦ−１アルファおよびＳＤＦ−１ベータ分泌が上昇している場合、これらにより形成される化学走化性勾配が大きくなり、より長距離に達することができるようになり、これらの影響範囲が拡大し、ＡＢＭＥの周りの環境のより広い部分からのＳＰＣの採取が促進される。ＳＤＦ−１アルファとＳＤＦ−１ベータは移植を助け、ＳＰＣとそこから得られる子孫の成長のインデューサーとしても作用して、強い造血を促進する。
【００１４】
本発明者は造血調節物質が、ＡＢＭＥを形成する間葉細胞中で例えばコネクシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３）のようなギャップジャンクションタンパク質の発現を上昇させることができることを確定した。コネクシン４３は、細胞内通信を促進する天然の造血中に重要な役割を果たす。
【００１５】
本発明者は、ＡＢＭＥ中の酸化窒素含量の増加が強い血球生成に有用な影響を与えることを確定した。酸化窒素は反応性が高く、非常に迅速に酸素分子と結合し、従って破壊される。従って間葉細胞内の酸素含量の有効な低下を促進するかまたは低酸素症を誘導する物質は、酸化窒素シグナル伝達の延長を促進し、ＡＢＭＥの機能に有用な影響を示す。細胞の低酸素状態はまた、ＡＢＭＥ機能を促進するＶＥＧＦの放出、脈管形成および血管形成を促進する新しい血管を生成する内皮細胞の動員と活性化を含む新規遺伝子発現の促進因子であり、これはインビボの血管形成に密接に関連している。酸素圧の低下を含む環境は、ＳＰＣの表面上のＣＸＣＲ４受容体の発現を促進し、ＣＸＣＲ４分子の上昇したかかるＳＰＣはより良くガイドされ、ＳＤＦ−１介在化学誘引を介してＡＢＭＥに誘引される。間葉細胞中の酸化窒素は、この拡散性メッセンジャーを「酸化窒素ドナー」から標的細胞に人工的に導入することにより増加させることができ、例えばこれらに、ｓ−ニトロソペニシラミン（ＳＮＰ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ジアゼノレート−２−オキシド（ＤＥＡＮＯＮＯａｔｅ）などのいくつかの化合物を用いて生成した酸化窒素の可逆性付加物を接触させることにより、より良好な関連する性質が、接触した細胞により示される。
【００１６】
造血調節物質は、間葉細胞のインテグリン受容体、焦点接着キナーゼ、ｂＦＧＦ−受容体を活性化できるモチーフを含む線状または環状ペプチドである化学的物質でもよい。このようなアルファ５：ベータ１の調節物質、アルファ２：ベータ１の調節物質、アルファ２ｂ：ベータ３の調節物質、アルファＶ：ベータ５の調節物質、アルファＶ：ベータ３の調節物質、アルファ４：ベータ１の調節物質、フィブロネクチン接着促進因子（ＦＡＫ−アクチベーター）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒのようなインテグリン調節物質、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＧｌｙのようなｂＦＧＦ制御物質、天然のフィブロネクチンまたは種々のインテグリン相互作用ドメインを含有するフィブロネクチンのサブフラグメント、細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、およびゼラチン結合ドメイン。該化学的物質の量は約０．１〜１００マイクロモルでもよい。
【００１７】
造血調節物質は、酸素依存性死滅ドメインモチーフ（その一例はＨＩＦ−１αである）が関与するタンパク質または転写因子の細胞内分解を防止できる化学的物質でもよい。
【００１８】
免疫学的造血調節物質：
本明細書で定義される免疫学的造血調節物質は、特に間葉細胞のような標的細胞中のインテグリン受容体からの細胞接着シグナルを活性化できる、抗体またはその機能性同族体でもよい。免疫学的造血調節物質の選択された非限定例は、インテグリンベータサブユニットに対する活性化抗体である。かかる免疫学的造血調節物質は、標的細胞を５０％またはそれ以上に凝集させるのに充分な濃度で使用される。
【００１９】
造血調節物質のプライミング：
生物学的、化学的または免疫学的造血調節物質の一部は、ＳＰＣに接触してこれらをプライムまたは活性化するのに随時使用され、次によりよい結果のためにＡＢＭＥとともに使用される。プライミング造血調節物質のいくつかの例は：ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼインヒビター（３アミノベンズアミド）、ＴＧＦベータ１の潜伏関連ペプチド、グリコ−結合体を含有する細胞表面関連マンノース６−ホスフェート、ＩＧＦＩおよびＩＧＦIIエフェクター、ｃＧＭＰシグナル伝達の増強物質がある。
上記物質がタンパク質である場合、これはその同族体、合成作成または人工的に工学作成した分子を含む。
【００２０】
本発明で使用される間葉細胞は、肝臓、骨髄腸骨稜、大腿骨、および肋骨から得られる細胞または間葉幹細胞を意味する。通常選択される細胞は、造血コロニーを生成できないものである。さらにこれらの細胞は、均一または不均一でもよく、繊維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞のような細胞を含む。上記の増殖培地は、動物細胞を培養するのに適したものである。培地は、胎児牛血清（ＦＢＳ）および随時メチルセルロース、エリスロポエチン、造血成長および分化因子、およびインターロイキンを補足した、イスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ最小基本培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０から選択される。
【００２１】
本発明の実施において、ＡＢＭＥ接触の初期のサイクル（通常４８〜７２時間の短時間）で増幅されたＳＰＣは単離することができ、かかる新鮮なＡＢＭＥとの接触を１回またはそれ以上の回数繰り返してさらなる利点を得ることにより、さらに増幅することができる。
【００２２】
ＩＩ．キット
本発明はまた、人工的骨髄環境（ＡＢＭＥ）を作成するための、およびこれを種々の応用（血球生成の１つまたはそれ以上の個々の工程の制御を達成することを含む）に使用するための有用なキットまたは複数のキットであって：
ａ）前節で記載したものから選択される生物学的、化学的または免疫学的物質である１つまたはそれ以上の造血調節物質、
ｂ）ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液、ＩＭＤＭを含む造血調節物質の希釈剤、
ｃ）間葉細胞を培養するのに適した培地、例えば前節で記載した成長補助物質を含むダルベッコー培地、ＲＰＭＩ−１６４０、ＩＭＤＭ、
ｄ）ＰＢＳまたはＩＭＤＭのような使用された造血調節物質を除去するのに有用な水溶液、
ｅ）ＡＢＭＥの細胞を採取するのに有用な、および／またはさらなる使用のために活性化ＳＰＣをリサイクルするのに有用な溶液、例えばタンパク質分解酵素、インヒビター、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液、
ｆ）幹前駆細胞をプライムするための造血調節物質の溶液（このような物質は前節で記載したものと同じである）、
ｇ）プライムした幹前駆細胞を使用する前にプライミング物質を除去するための洗浄溶液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水またはＩＭＤＭ、
ｈ）ＡＢＭＥの支持鋳型または足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ＡＢＭＥの細胞、造血促進成長、分化および生存因子、増殖培地、および随時メチルセルロース、血清、適当な足場を含む、インビトロの血球生成のための培地、および
ｉ）指示のマニュアル
を含むキットを提供する。
【００２３】
足場は、フィブロネクチン、コラーゲン、または任意の他の同様の基質の２つまたはそれ以上の基質を含む。
【００２４】
キットは、ｉ）ＡＢＭＥを生成する所定の間葉細胞集団の品質を評価するための、ii）その可能な造血調節物質機能のための生物学的、化学的および免疫学的物質の定量的スクリーニングのための、iii）強い血球生成のためにＡＢＭＥを調製し、幹前駆細胞をプライムするための、iv）単一のまたは複数の系統でインビトロで生成された血球の組成を変化させるＡＢＭＥを調製するための、ｖ）ある試料中に存在する幹前駆細胞の休止状態を誘導するための、他の試薬を随時含有する。この試薬系は市販の包装された形で、試薬の適合性が許容するなら組成物または混合物として、試験装置の構成で、またはより典型的には試験キットで、すなわち必要な試薬を使用してアッセイを実施するための説明書を有する、１つまたはそれ以上の容器、装置などのパッケージされた組合せとして提供される。
【００２５】
上記物質のプライミングの具体例は以下の通りである：
【表１】
【００２６】
ＩＩＩ 相乗作用：
血球の成長のための条件は骨髄（体内）で最も適しているため、当該分野において血球の増殖と成長は骨髄（体内）でのみ起きると、当該分野では考えられてきた。これらの条件を体外に作成し、血球の成長を増強することは困難であると考えられてきた。これらの仮説に反して本発明者は、血球の制御された成長と増殖に適したインビトロ環境を開発することを助ける新規組成物とキットを開発した。適当な細胞と、造血調節物質および場合によりＡＢＭＥ細胞の支持体とを補足した培地との組合せを使用する環境が開発される。こうして作成した環境は、造血に非常に適しており、天然のＢＭＥに似ている。ＡＢＭＥは、（ｉ）より強い化学誘引による帰巣の増強；（ii）間葉細胞とＳＰＣとの細胞接着を促進することによる移植の増強；（iii）Ｂａｄのようなアポトーシス促進性分子を減少させることによるアポトーシスシグナルに対するＳＰＣの生存の増強；（iv）骨髄系統およびリンパ球系統に沿ったＳＰＣの運命決定；（ｖ）自己再生および分化経路に沿ったその増殖を促進するための休止ＳＰＣの活性化；および（vi）必要な場合のＳＰＣ休止状態の誘導、を促進する。
【００２７】
さらに本発明の組成物は、すべての成分が使用される時のみ、人工的骨髄様環境を生成することができＳＰＣと造血細胞の成長を促進することができることがわかった。間葉細胞は、造血調節物質による処理無しで使用されると、維持されないし、効率的な人工的骨髄様環境（ＢＭＥ）も作成されない。この結果を与えるのは成分の組合せ（すなわち、細胞と適切な造血調節物質を含む処理培地）のみである。従って本発明の組成物とキットは相乗的であり、驚くべきことに人工的骨髄様環境を作成することが発見され、この結果は、成分が単独に使用される時観察されないものである。従って組成物とキットは相乗的である。
【００２８】
ＩＶ．方法
ある実施態様において本発明は、人工的骨髄環境を作成するための方法であって：
（ｉ）間葉細胞を得て、これを適切な増殖培地中で培養する工程；
（ii）間葉細胞に造血調節物質を２０分〜２４時間接触させる工程（こうして、その細胞内シグナル伝達経路が活性化され、これらは骨髄環境のような性質を獲得する）；
（iii）前駆細胞（ＳＰＣ）を得て、場合によりこれをプライムする工程；
（iv）ＡＢＭＥとの相乗的参加を可能にする細胞内シグナル伝達経路を活性化してより多くの血球の生成するために、上記工程（ii）のように処理した間葉細胞にＳＰＣを接触させ、これを場合により造血調節物質と接触させる工程；
（ｖ）プライムしたＳＰＣにＡＢＭＥまたは培地中の活性化間葉細胞を２０分またはそれ以上接触させて、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ移植、ＳＰＣ活性化、ＳＰＣ自己再生、リンパ球および骨髄系統に沿ったＳＰＣの運命決定を達成して強い造血を得る工程、を含むことを特徴とする方法を提供する。この方法はまた、造血調節物質の適切な選択により、具体的な目的のためのＳＰＣ休止を誘導するのに使用することもできる。
【００２９】
間葉細胞は、腸骨稜から得られる細胞、成体の肋骨または大腿骨から採取される骨髄細胞を含み、２０％ヒトもしくは胎児牛血清補足イスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）のような適当な培養培地で、細胞が増殖し、通常細胞培養で３〜４回の連続継代後約３〜６週間で１０7個またはそれ以上の間葉細胞が得られる条件下で維持される。「細胞培養条件」は、培養物を３７℃および５〜７％二酸化炭素の加湿雰囲気中で無菌条件下で適切な細胞培養グレードのプラスチック（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）中で維持することを含む。
【００３０】
上記したように使用される血球生成のための培地は、２０％血清を有し、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−３、およびＩＬー６）、幹細胞因子、系統特異的成長因子（例えば、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）、および０．８％までのメチルセルロースを補足したＩＭＤＭでもよく、培養物は、血球コロニーが良く成長するかまたはコロニーを形成しさらなる分析と使用のために成長が明らか／区別可能になる条件下で１２〜１４時間維持される。ＡＢＭＥ機能の定量性を評価するために同様に設計されたアッセイは、以後「ＡＢＭＥのための定量的造血コロニー形成アッセイ（ＨＣＦＡ−ＡＢＭＥ）」と呼ぶ。
【００３１】
ＡＢＭＥ作成のために使用された間葉細胞の量は、ＡＢＭＥで処理されるＳＰＣの数に依存し、方法は、必要な間葉細胞数を増加または減少に合うように適切にスケールが決定される。通常間葉細胞の量は、標的ＳＰＣの１．５倍である。
【００３２】
間葉細胞に造血調節物質を接触させる工程は、２０％血清を有するＩＭＤＭ中の造血調節物質の適切な溶液／懸濁物で間葉細胞を覆い、標準的細胞培養条件で細胞を０．５〜２４時間維持することにより行われ、こうして細胞が活性化され、ＡＢＭＥ様性質が誘導され、これは造血調節物質適用が除去された後でさえ、充分な期間有用に維持される。
【００３３】
ＡＢＭＥ細胞が、使用されるＳＰＣ細胞と比較して１．５倍過剰であるように、場合によりＳＰＣまたはＳＰＣを含有する細胞の集団（例：骨髄から単離された単核細胞、臍帯血からの有核細胞、ＳＰＣ動員後の末梢血からの有核細胞）を調製されたＡＢＭＥと混合してもよい。ＳＰＣとＡＢＭＥは一般的な培地に懸濁されて、適切な培養条件下で少なくとも３０分間維持される。ＳＰＣが適当な表面上で接着性にされると、ＡＢＭＥ細胞はその上または周りで被覆することができる。さらに各具体的な応用により必要な他の試薬を補足した、ＩＭＤＭ、２０％血清、および０．８％メチルセルロースを含む培地を使用して、ＡＢＭＥとＳＰＣの両方を被覆してもよい。
【００３４】
具体的な造血調節物質が使用される濃度、および最適の結果を得るためにあるバッチの間葉細胞が接触される時間は変化し、これらの正確な詳細は個々の場合に決定され、本明細書に記載の造血調節物質の有用な濃度範囲および処理時間は単に指針である。
【００３５】
別の実施態様においてこの方法は、インキュベーション中に拡散によりインサイチュで生成される造血のインヒビターを減少させる含有するコンパートメント培養物に適合するように改変され、ここでＡＢＭＥとＳＰＣの細胞はあるコンパートメント中に含有され、必要なもしくは好ましい成長因子および分化因子または造血調節物質を有する培地を、別のおよび交換可能なコンパートメントからの細胞に接触させる。
【００３６】
さらに別の実施態様において方法はフロー培養系に適合するように改変され、ここでＡＢＭＥとＳＰＣの細胞はある支持体／コンパートメントに含有され、こうして自然にインサイチュで生成する造血インヒビターの蓄積を避けるために、培養培地を構成する適用培地、造血調節物質を有する接触培地、洗浄液、分化培地が、プログラムされた方法で細胞に浸透または通過することを可能にし、細胞への連続的栄養供給を可能にして結果が改良される。
【００３７】
本発明者は研究の過程で、強い造血を促進するためにＡＢＭＥが準備できているかまたはＳＰＣが活性化されていることがわかった場合は、間葉細胞の造血調節物質への接触を続けることが必須ではないことを見いだした。同じ数のＳＰＣが標準としての間葉細胞またはＡＢＭＥと、本来同等の実験条件下で接触されると、非常に多数のＳＰＣがＡＢＭＥに動員され、これらがさらにＨＣＦＡについて処理されると、標準と比較してＡＢＭＥでコロニー数の有意な上昇が見られ、帰巣の増強、より有効な移植、および強い血球生成を示唆している。この結果は、試料中に存在する活性化ＳＰＣの比率の上昇を意味し、これは、一部のＳＰＣが休止状態を励起させて活性化状態に入り、および／または自己再生を受けて活性化ＳＰＣ細胞の比率を上昇させたことをさらに示唆する。
【００３８】
別の実施態様において本発明者は、正常なＳＰＣが休止状態と等しい状態を達成するように、ＡＢＭＥの機能を調節する負の造血調節物質を同定した。かかる調節は、細胞サイクル制御特性において差を有する正常なＳＰＣと病的ＳＰＣとを区別するためのプロトコールの開発を可能にする。すなわちこの方法は、抗新生物薬を使用してインビトロで白血病ＳＰＣの選択的破壊のための治療法を支持してインビボの化学療法に伴う有害な副作用を避ける。
【００３９】
本発明を以下の実施例により例示するが、これらは例示目的であり、決して本発明の範囲または概念を限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１
ａ）間葉細胞の入手と調製：
腸骨稜または肋骨から得られる骨髄細胞をイスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）に充分分散させて単一細胞懸濁物を得て、同じ培地で少なくとも３回洗浄して、それぞれ２〜３０００ｒｐｍ（５００〜１０００×ｇ）で５分間遠心分離して細胞を採取する。洗浄した骨髄細胞（少なくとも１０8個の細胞）を最大７日間ＩＭＤＭと２０％胎児牛血清またはヒト血清中で細胞培養条件下で維持する。こうして数日で得られた典型的な標準的組織培養グレードのプラスチック（Ｔ−２５フラスコ、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）上の接着性細胞層を普通のＩＭＤＭで洗浄し、同じ培地中の標準的細胞培養物を数回継代してさらに拡張する。典型的には３回の継代後、固有の造血すなわちメチルセルロースアッセイで造血コロニーを与える能力が失われる。１０8個の骨髄細胞から出発して３〜６回の継代で少なくとも１０7個の間葉細胞が得られる。こうして得られた間葉細胞は、後述の方法でＡＢＭＥを作成するのに適している。
【００４１】
ｂ）ＡＢＭＥで使用するのに適したＳＰＣの調製
上記工程（ａ）で得られた洗浄した骨髄細胞を注意深くフィコール−ハイパークの勾配（密度１．００７、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、セントルイス、ミズーリ州）上に重層し、クボタ遠心分離機（クボタコーポレーション（Ｋｕｂｏｔａ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本国１１３−００３３、東京都文京区）のスイングアウトローターで１５００ｒｐｍ（１０００×ｇ）で１５分間遠心分離する。界面層から単核細胞（ＭＮＣ）が採取され、１０００×ｇでの連続的遠心分離と再懸濁によりＩＭＤＭで３回洗浄する。次に２０％ヒト血清または胎児牛血清を補足したＩＭＤＭにＭＮＣを適当な密度（１０5〜１０7ＭＮＣ／ｍｌ）で懸濁する。ここで調製したＭＮＣはそのままＡＢＭＥとともに使用される。ここで単離されたＭＮＣと同様の環境でＳＰＣはインビボで見つかる可能性が高い。
【００４２】
例示目的でこの方法は、上記２つの条件をシミュレートするために、ＭＮＣならびに高度に濃縮されたＣＤ３４+抗原を発現するＳＰＣとともに試験される。必要な場合、ＣＤ３４+細胞はＣＤ３４+細胞単離キット（ダイナール（Ｄｙｎａｌ）、スメスタッド（Ｓｍｅｓｔａｄ）、Ｎ−０３０９、オスロ、ノルウェイ）を使用して製造業者の説明書に従ってＭＮＣ画分から常法で回収されるが、他の適当な方法を使用してもよい。ＣＤ３４+細胞はまた、適当な方法を使用して骨髄からまたは臍帯血から動員した後、白血球搬出法により採取される。ＡＢＭＥへの提示の前または後にＣＤ３４-（ＣＤ３４陰性）前駆体から生成したＣＤ３４+細胞は、所望の結果を与える。こうして調製されたＳＰＣはまた、適当なヘマト調節物質でプライムするのに適している。
【００４３】
ｃ）間葉細胞は一定数のＳＰＣから造血を刺激する：
間葉細胞がＳＰＣ細胞の運命に直接影響を与えることを調べるために、いくつかの実験を行った。あるセットの実験で間葉細胞を別々に培養し、ほとんど５０，０００個の細胞を、過剰量の種々の精製したおよびヒト特異的サイトカインおよび造血コロニー刺激成長因子（ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、トロント、カナダ）とともにＩＭＤＭ中に０．８％メチルセルロースおよび２０〜３０％血清を含む典型的なＨＣＦＡ培地に暴露した。さらに詳しくはＨＣＦＡで日常的に使用される造血成長因子の量は、２国際単位／ミリリットル（２Ｉ．Ｕ．ｍｌ-1）のエリスロポエチン（ＥＰＯ）、５０ナノグラム／ミリリットル（５０ｎｇ／ｍｌ-1）の幹細胞因子（ＳＣＦ）および２０ナノグラム／ミリリットル（２０ｎｇ／ｍｌ-1）ずつの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびインターロイキン−６（ＩＬー６）である｛すべての成長因子とサイトカインはステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（バンクーバー、カナダ）から｝。本明細書に記載の方法により調製される間葉細胞は、過剰量のすべての必要な成長因子を与えても、それ自体でコロニー形成アッセイ培地で造血コロニーを形成することができなかった。
【００４４】
別のセットの実験において５０，０００個の同じ間葉細胞をまず約１００，０００個のＭＮＣと混合し、３７℃で少なくとも３０分間維持し、コロニー生成アッセイのために処理した。いくつかの実験で、これらの２つの種類の細胞を混合すると、ＭＮＣの細胞のみを使用した標準と比較して、造血コロニーの数と細胞充実性の改良が見られた。増加は１．５〜１０倍であった。間葉細胞のみを使用して得られたコロニー形成の増強は、試料間で変動が大きく予測不可能であった。ＭＮＣと間葉細胞を一緒に処理した時のみ数と細胞充実性が上昇して造血コロニーが形成されたことは、間葉細胞により作り出される、ＭＮＣ中に存在するＳＰＣがより生産性である新しい環境の証拠である。この増加は、自己再生および両方の因子の組合せによる、あらかじめ存在するが休止状態のＳＰＣの活性化と新しいＳＰＣの生成を引き起こす。
【００４５】
ｄ）間葉細胞に造血調節物質を接触させるとより良好な結果が得られる：
異なるバッチの間葉細胞は同じ造血調節物質に対して応答が異なるため、造血調節物質の実際の用途には、その用量と接触する期間の最適化を必要とする。多くの実験から本発明者は、一般に便利な出発点は、１〜２５ナノグラム／ｍｌ（活性成分について）の範囲の生物学的造血調節物質、１０ｎＭ〜５０マイクロモル溶液の範囲の化学的造血調節物質、および１０〜５０ピコモル溶液の範囲の免疫学的造血調節物質の使用であることを確定した。
【００４６】
ＡＢＭＥを作成するために間葉細胞を、２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭに含有される造血調節物質を含む接触培地で所望の期間（８〜２４時間の範囲）カバーして、取り出した。次に接触させた細胞を、造血調節物質の無い接触培地（ＩＭＤＭ＋２０％ＦＣＳ）を使用して２回洗浄し、そのまままたは間葉細胞を採取した後使用し、これはインビトロＡＢＭＥの組成である。場合によりＡＢＭＥ細胞は支持体上で構成され、これはより良好な結果のために細胞を２つまたはそれ以上の次元に分散させる。必要な数のＭＮＣ／ＳＰＣおよびＡＢＭＥの細胞を取り、適当な期間（０．５〜６時間の範囲）一緒に維持し、次にインビトロ造血コロニー形成アッセイまたは造血のために処理する。
【００４７】
すなわち本発明者は４セットの実験を行った：（ａ）単核細胞を未処理の間葉細胞に暴露した；（ｂ）ＭＮＣを生物学的物質［ＴＧＦβ１］と接触させた間葉細胞に暴露した；（ｃ）ＭＮＣを化学的物質１［１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール、１３アセテート／（−）インドラクタムＶ］と接触させた間葉細胞に暴露した；および（ｄ）ＭＮＣを免疫学的物質［活性化、抗インテグリンベータ３抗体］で処理した間葉細胞に暴露した。結果を図１に示すが、以下の通りである：
（Ａ）この場合、低い細胞充実性の血球コロニーはほとんど生成しなかった；
（Ｂ）（Ａ）より数が多く細胞充実性の高い血球コロニーが形成された；
（Ｃ）（Ａ）より少なくとも４倍大きく（Ｂ）より大きい、細胞の大きなコロニーが観察された；
（Ｄ）驚くべきことに（Ａ）または（Ｂ）より多い高密度の細胞コロニーが形成された。
【００４８】
実施例２：
生物学的造血調節物質の作用
調製法は以下を含む：ＩＭＤＭ、２０％血清、および細胞から造血調節物質−ＣＭを放出するために適切な量（例：エリスロポエチン２Ｉ．Ｕ．ｍｌ-1；ＧＭ−ＣＳＦ２０〜５０ｎｇ．ｍｌ-1）で必要な適当な調節物質（例：エリスロポエチンとＧＭ−ＣＳＦ）を含む１ミリリットルの培地に、細胞培養条件下で３７℃で維持したＭＮＣ（＞１０7個の細胞）。適当な期間（８〜９６時間の範囲）後、冷却クボタ遠心分離機（５０００×ｇ、１５分）で遠心分離した後細胞を取り出し、上清として得られた生物学的造血調節物質−ＣＭをそのまま、またはさらに処理して存在する活性成分を濃縮した後使用した。ＣＭの処理は一般に約４℃の冷却環境で行われ、親和性クロマトグラフィーの原理を使用した。簡単に説明すると、マトリックス（例えばヘパリンセファロース）上に固定化した適当な親和性リガンドを取り、低塩緩衝液中で造血調節物質−ＣＭを吸収させ、吸収しない成分をローディング緩衝液で洗い流し、造血調節物質−ＣＭの活性成分をまず高塩（例えば１．５モルＮａＣｌ）緩衝液により溶出し、次に濃縮し、保存緩衝液と平衡化させ、将来の使用のために−７０℃で保存した。他の２つの生物学的造血調節物質（すなわち、生物学的物質−１と生物学的物質−２）は、それぞれＴＧＦβ１とＦＧＦ−２であると確認された。
【００４９】
生物学的造血調節物質−ＣＭ、ＴＧＦβ１、およびＦＧＦ−２は適切な条件下で同様に効率的なＡＢＭＥであった；しかしそれぞれにおいて生成されたＡＢＭＥは異なっていた。典型的には生物学的造血調節物質−ＣＭ、ＴＧＦβ１、およびＦＧＦ−２は、ＩＭＤＭと２０％ヒト血清または胎児牛血清中１〜２５ナノグラムｍｌ-1の濃度範囲で使用して間葉細胞に８〜２４時間細胞培養条件下で接触させてＡＢＭＥを作成した。図２に示すように、造血調節物質のみを使用した時（図２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅ）より強いＡＢＭＥ関連の性質が現れたが、間葉細胞を使用しない場合（図２Ａ）または生物学的造血調節物質無しで使用した場合（図２Ｂ）はそうではなかった。図は、各場合に生成された血球の密度を示し、これはコロニーの細胞充実度に比例する。最良のコロニーは、間葉細胞に造血調節物質を接触させる時にのみ形成される。
【００５０】
実施例３：コロニー形成に対する生物学的造血調節物質の作用
本発明者は、ＴＧＦβ１とＦＧＦ−２の使用により得られたＡＢＭＥが、別々に使用した時、間葉細胞からＡＢＭＥを作成するのにほぼ同じ強さであり、各ＡＢＭＥが顕著に弱まることなくその親間葉細胞と自由に混合することを、実験により確定した。
【００５１】
間葉細胞を使用する定量的、系統特異的コロニー形成アッセイに関するあるセットの実験を行った：（Ａ）どの生物学的物質とも接触せず［図３Ａ対照］、またはＴＧＦβ１［図３Ａ 生物学的物質１］またはＦＧＦ−２［図３Ａ 生物学的物質２］と接触した後。顆粒球−赤芽球−単球およびマクロファージ（ＧＥＭＭ）、バースト形成単位−赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）および顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）を含むいくつかの特異的系統に沿ったコロニー形成は、両方のＡＢＭＥにより均一に刺激されること、およびＴＧＦβ１とＦＧＦ−２は、この作用を維持する各ＡＢＭＥを作成するのにほぼ同じ強さであることが明らかである。特にＧＥＭＭコロニー形成の刺激は、ＡＢＭＥが多能性前駆体を刺激して、自己再生に等しいより多くの新しい多能性細胞を生成することができることを示す。
【００５２】
図３Ｂにおいて本出願人は、ＴＧＦβ１またはＦＧＦ−２の使用により作成されるＡＢＭＥがいずれも、個々に試験すると未処理間葉細胞に適合性であることを証明した。従ってこれらの２つのＡＢＭＥのそれぞれは、未処理間葉細胞と混合するのに適している。これに対して両方のＡＢＭＥを等しい比率で混合すると、組合せは個々の場合より弱いＡＢＭＥであった。これは、これらが互いに拮抗性であり同一ではないことを明瞭に示している。
【００５３】
実施例４：コロニー形成に対する化学的造血調節物質の作用
本発明者は、細胞内シグナル生成および／または種々のタンパク質キナーゼ、特にｃＧＭＰ依存性キナーゼ、脂質依存性キナーゼ（例、ＰＫＣ）、ホスファチジルイノシトールホスフェート依存性キナーゼおよびファミリー（Ｐ１３Ｋ、ＰＤＫ、Ａｋｔ、ｐＢａｄ、ｍＴＯＲ）、細胞接着依存性キナーゼ（ＦＡＫ、ＩＬＫ）、受容体チロシンキナーゼ（例：ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２Ｒ）、受容体−セリン／スレオニンキナーゼ（例：ＴＧＦβ１受容体）、および細胞内Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ（例：ＭＡＰＫ−キナーゼおよびｐ３８ＭＡＰＫキナーゼ）、Ｃａ++イオン依存性キナーゼ（Ｃａ++−ＣａＭ依存性キナーゼ）の機能の維持を調節するいくつかの造血調節物質を試験し、かかる機能をもたらすことができる任意の新しい分子は造血調節物質の候補であることを示した。
【００５４】
ＡＢＭＥ作成について、間葉細胞を適当な期間（５分〜２４時間の範囲）２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭ（適切な量の造血調節物質も存在する）を使用して接触させた。高濃度の造血調節物質も長い接触時間も良好な結果は与えないため、有効な造血調節物質溶液の調製と間葉細胞を接触させる期間は注意深い最適化が必要である；有用な範囲は造血調節物質について１ナノモル〜１００μモルであり、接触期間は５分〜２４時間である。
【００５５】
別の態様において本発明者は、生物学的物質と化学的物質のいくつかの組合せは相乗的に作用し、いずれか１つのみを使用した時と比較してより良好なＡＢＭＥが作成されることを確定した。
【００５６】
別の態様において本発明は、適当な化学的造血調節物質を使用して血球生成を抑制できることを確定した。これらは、ＳＰＣ休止を促進することを示すために「陰性造血調節物質」と呼ばれる。かかる造血調節物質は、もし優勢であるなら、他の造血調節物質の刺激作用を弱めることができる。
【００５７】
図４は、異なる造血調節物質の使用が、種々の系統で異なって血球生成を刺激することができるＡＢＭＥを作成することを示す。図４Ｂと４Ｃは、コロニー形成に対する化学的造血調節物質の作用を示す。図４Ｄは、生物学的造血調節物質と化学的造血調節物質との組合せの作用がＡＢＭＥ作成において相乗作用を示すことができるを示す。図４Ｅは、陰性造血調節物質によるＡＢＭＥの用量依存性の減弱を示す。
【００５８】
実施例５：免疫学的造血調節物質
本発明者は、インテグリン受容体を介して間葉細胞上の接着性相互作用を活性化できる抗体試薬またはその機能性同族体は、造血調節物質として作用することを確定した。さらにかかる免疫学的造血調節物質は生物学的造血調節物質および／または化学的造血調節物質と相乗作用して、インビトロでより良好なＡＢＭＥを作成する。かかる免疫学的造血調節物質は、２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭを含む培地中１０〜１００マイクログラム．ｍｌ-1の範囲で有用性である。間葉細胞にこの培地を適当な期間（１〜２４時間の範囲）、間葉細胞がＡＢＭＥを生成する培養条件下で接触させる。別の態様において免疫学的造血調節物質の使用は、より良好な結果を得るために化学的造血調節物質および／または生物学的造血調節物質の使用と組合せることができる。
【００５９】
図５に示すように、間葉細胞が使用されるとほんのわずかの血球コロニーしかが形成されない（対照：黒い棒）。これに対して免疫学的造血調節物質の溶液（ヒトベータ３インテグリンサブユニットに対する抗体）を、２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭを含む培地に懸濁した５０マイクログラム／ミリリットルの溶液を使用して間葉細胞を１時間接触させると、間葉細胞は非常に有効なＡＢＭＥを生成し、インビトロでのコロニー形成と血球生成が増強された。
【００６０】
実施例６：ＳＰＣをＡＢＭＥに接触させる前にＳＰＣをさらにプライムすることにより結果を改良する
ＳＰＣまたはＳＰＣを有するＭＮＣの集団はまた、特異的化学的物質で別々にプライムして、これらがＡＢＭＥに接触した後、より多くの良好な血球コロニーを形成するようにすることができる。ＳＰＣのプライミング自体が、プライミングの無い細胞と比較してより良好でより多くのコロニーを形成できるが、最良の結果は、プライムしたＳＰＣをＡＢＭＥと組合せた時に得られた。本発明者は、ＳＰＣをプライムすることができ、改良されたコロニー形成／血球コロニーを与える少なくとも１０個の異なる化学的物質を同定し、これはこの方法もまた、新しいプライミング物質（潜伏関連ペプチド、３−アミノベンズアミド、ＩＧＦ−１とII、マンノース６ｐ含有グリコール結合体）の同定に有用であることを意味する。プライミング物質はインテグリン性接着に関連するシグナルを活性化することができ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、マンノース６−ホスフェート／ＩＧＦII受容体、ｃＧＭＰ依存性機能を活性化するか、またはＳＰＣに対するポリ（ＡＤＰ−リボースホスフェート）ポリメラーゼ機能を阻害することができ、これらに機能的に相同的な新しい分子はプライミング物質として受容されることを示す。これらのプライミング物質は造血を有意に調節したため、これらは造血調節物質として受容される。
【００６１】
実施例７：帰巣の調節：
実験Ａ
５×１０5個の間葉細胞を、２０％血清を含有するＩＭＤＭ中直径３５ｍｍのシャーレ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）で成長させた。細胞がコンフルエンスになった後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ギブコビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））（ＰＢＳ）で２回洗浄し、培地を１０ｎｇｍｌ-1のＴＧＦβ１含有処理培地と交換しして、３７℃の５％ＣＯ2の標準的細胞培養環境に戻した。４時間後処理培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％血清を含有するＩＭＤＭの１ｍｌでカバーし、３７℃で５％ＣＯ2でのインキュベーションを続けた。１８時間後調整培地を採取し、ＣＤ３４+ＳＰＣのインビトロ帰巣を支える能力について測定した。別の平行実験において、等しい数の間葉細胞も使用し、ＴＧＦβ１を使用せず、この実験から得られた調整培地を比較のために標準として使用した。結果を図６（ａ〜ｃ）に示す。ＴＧＦβ１で間葉細胞を処理後（こうしてこれらは活性ＡＢＭＥを生成する）、有意に多い量のＳＤＦ−１αを放出され、これはそこにＳＰＣを誘引するためにＡＢＭＥの近傍に化学的勾配を作成することができ、こうしてこの帰巣を促進する。図６（ａ〜ｂ）に示すように、未処理の間葉細胞は、ＴＧＦβ１で処理した間葉細胞と比較して、まったくまたはほとんどぎりぎりの帰巣しか示さない。帰巣は、適当な量の中和抗体をＳＤＦ−１αまたはその受容体ＣＸＣＲ−４に加えて、ＳＰＣの化学誘引に対するその作用を中和することにより、またはプロセスの特異性を示すＳＤＦ１の外からの添加により勾配を破壊することにより、帰巣を調節することができた。
【００６２】
実験Ｂ
間葉細胞を無菌の１ｃｍ×１ｃｍのカバーガラス上でほぼコンフルエンスまで増殖させて、１０ｎｇｍｌ-1のＴＧＦβ１を含有する処理培地でカバーし、加湿無菌雰囲気と５％ＣＯ2中で１８時間インキュベートした。次にカバーガラスをＰＢＳで洗浄し、こうして作成したＡＢＭＥを２０％血清を有する０．２ｍｌのＩＭＤＭ中２×１０6個のＭＮＣまたは２×１０5個のＣＤ３４+細胞の懸濁物でカバーした。３７℃で１時間後カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、細胞を固定し、ＣＤ３４+特異抗体（クローンＨＰＣＡ１、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）で染色した。結果を図６（ｄ〜ｆ）に示す。結合したＣＤ３４+細胞の数を計測し、ＴＧＦβ１を使用しなかった平行参照実験で結合した同様の細胞の数と比較した。間葉細胞でＴＧＦβ１により生成されたＡＢＭＥは、参照カバーガラスと比較して有意に多い数のＣＤ３４+細胞が結合し、ＡＢＭＥへのこれらの細胞の帰巣は間葉細胞単独より優れていた。図６（ｄ〜ｆ）から、間葉細胞をＴＧＦβ１で処理すると、間葉細胞へのＣＤ３４+細胞の接着が増加することがわかる。
【００６３】
実施例８：移植の調節
図６ｄで見られたＡＢＭＥへのＣＤ３４+細胞の接着が機能的に関連しているかどうか、そしてもしそうならかかる移植を促進するどのような機構がＡＢＭＥにより使用されているかを決定するために、移植実験を行った。
【００６４】
間葉細胞（２４ウェルディッシュ中５×１０4細胞／ウェル）をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。間葉細胞中のαｉｉｂ：β３インテグリンシグナル伝達を選択的に活性化する化学的造血調節物質［ビオチン−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ*−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｔｙｒ−ＯＭｅ）Ａｒｇ−Ｃｙｓ*Ｌｙｓ（Ｃ*−Ｃ*の間で環化した）、１０マイクログラムｍｌ-1、１８時間］を使用してＡＢＭＥを調製した。生成したＡＢＭＥをＰＢＳで２回洗浄し、αｉｉｂ：β３インテグリンの相互作用を阻害する別のペプチド［１−アダマンタンアセチル−Ｃｙｓ*Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃ（Ｃｙｓ*−Ｃｙｓ*の間で環化した）］の存在下または非存在下で、０．２ｍｌのＣＤ３４+ＳＰＣ細胞（１０5ｍｌ-1）の懸濁物で１時間カバーした。インキュベーションの最後に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、造血コロニー形成アッセイ（ＨＣＦＡ）のために処理した。造血コロニー形成のために、結合したＳＰＣを有するＡＢＭＥ細胞をマルチウェルディッシュから採取し、２０％血清、０．８％メチルセルロース、および過剰量の種々の精製およびヒト特異的サイトカイン、および造血コロニー刺激成長因子［ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（バンクーバー、オンタリオ、カナダ）から］を含有する１ｍｌのＩＭＤＭに再懸濁した。さらに詳しくはＨＣＦＡで通常使用される造血成長因子の量は、２国際単位／ミリリットル（２ＩＵ．ｍｌ-1）のエリスロポエチン（ＥＰＯ）、５０ナノグラム／ミリリットル（５０ｎｇ／ｍｌ-1）の幹細胞因子（ＳＣＦ）および２０ナノグラム／ミリリットル（２０ｎｇ／ｍｌ-1）ずつの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびインターロイキン−６（ＩＬー６）であった。細胞を造血コロニーが大きくなるまで１２〜１４日間インキュベートした。結果を図７に示す。ペプチド化学調節物質により生成したＡＢＭＥは、有意に多い造血コロニーを生成することができたが、この造血調節物質機能は阻害性ペプチドで阻害され、コロニー数はインヒビター用量依存性に低下した。結果は、αｉｉｂ：β３インテグリン相互作用を介してＡＢＭＥへのＳＰＣにより確立された接触が機能的に関連し、障害された場合はＡＢＭＥの機能を弱めることを明らかに示している。従ってこれらの結果は、造血調節物質によるＡＢＭＥへのＳＰＣの接着の促進は機能的に関連し、インビトロのＳＰＣ移植に等しく、さらにこの移植はインビトロで調節することができることを明らかに示す。
【００６５】
実施例９：系統の運命決定の調節
造血中のＳＰＣの系統の運命決定は、生成される成熟Ｂリンパ球の組成に影響を与える。ＡＢＭＥの適切な使用により２つの系統の成熟血球生成の組成を改変できることを示すために、系統の運命決定実験を行った。
【００６６】
間葉細胞（２４ウェルディッシュ中５×１０4細胞／ウェル）をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。２つの生物学的造血調節物質（ＴＧＦβ１ １０ｎｇｍｌ-1、ｂＦＧＦ １０ｎｇｍｌ-1、１８時間）を別々に使用して、２つのＡＢＭＥを調製した。生成したＡＢＭＥをＰＢＳで２回洗浄し、ＣＤ３４+ＳＰＣ細胞（１０5ｍｌ-1）の懸濁物０．２ｍｌで３７℃で１時間カバーした。次に洗浄後ディッシュのすべての細胞を採取し、ＨＣＦＡで使用した。１４日後、生成した成熟血球を採取し、懸濁物のアリコートを顕微鏡で観察して成熟リンパ系細胞と骨髄系細胞を同定し計測した。結果を図８ａに示す。ｂＦＧＦにより調製したＡＢＭＥを使用した時、より多くのリンパ系細胞が産生され、ＡＢＭＥを調製するためにＴＧＦβ１を使用した時は、より多くの骨髄系細胞生成を支持した。これらの結果は、特異的造血調節物質を選択して調製したＡＢＭＥを使用して、系統の運命決定を調節し、生成された成熟血球中の骨髄系細胞およびリンパ系細胞の組成物または産生を改変できることを明瞭に示す。
【００６７】
この実験は、生成した成熟血球の組成は赤芽球系細胞および骨髄系細胞について改変することができることを証明するために行った。間葉細胞（２４ウェルディッシュ中５×１０4細胞／ウェル）をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。１つのウェルの細胞をカルシウムイオンキレート物質であるＢＡＰＴＡ（５マイクロモル）のジブロモ誘導体で１時間処理したが、別のウェルにはＢＡＰＴＡ誘導体の無い培地のみを加えた。３７℃で１時間インキュベーション後、両方のウェルにＴＧＦβ１を加え（１０ｎｇｍｌ-1）、さらに１８時間インキュベーションを続けた。両方のウェルで生成したＡＢＭＥを洗浄し、ＣＤ３４+ＳＰＣを使用してＨＣＦＡのために使用した。１４日後成熟血球を採取し、赤芽球系および骨髄系系統の細胞について定量した。結果を図８ｂに示す。結果は、ジブロモＢＡＰＴＡ誘導体をＡＢＭＥの生成のために使用すると、ジブロモＢＡＰＴＡを使用しなかった標準実験と比較して、赤芽球系細胞および骨髄系細胞集団の比率の有意な差があることを示した。
【００６８】
実施例１０：細胞生存の調節
ＡＢＭＥが細胞生存を促進する性質を有するかどうかを調べるために実験を行った。ホスホ（セリン４７３）Ａｋｔ／ＰＫＢ、ホスホール−Ｂａｄのような生存促進分子の存在について間葉細胞を調べると、これらの物質が細胞中に非常に少量存在することがわかった。しかし間葉細胞を使用してＡＢＭＥを調製すると、ＡＢＭＥ細胞中ではホスホ（セリン４７３）Ａｋｔ／ＰＫＢ、ホスホ−Ｂａｄ、活性化酸化窒素シンターゼのような生存促進因子の有意なアップレギュレーションがあった。これらの結果は、生存促進因子がＡＢＭＥ中で活性化され、従ってこれらはＡＢＭＥとの接触中にＳＰＣに輸送されることを示す。別のセットの実験では、３アミノベンズアミドを使用してポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの阻害によりＳＰＣ中で生存促進シグナルがアップレギュレートされた。結果を図９（ａ〜ｄ）に示す。結果は、この処理後ＳＰＣは、生成される造血コロニーの数を相乗的に増加させることができ、ＳＰＣ−細胞生存がインビトロで調節できることを示した。
【００６９】
実施例１１：自己再生の調節
実験Ａ
ＭＮＣ中に存在する休止状態の原始前駆体がＡＢＭＥと接触すると刺激されて、混合系統からなる（ＧＥＭＭ）より多くのコロニーを形成するかどうかを調べるために実験を行った。
【００７０】
間葉細胞をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。生物学的造血調節物質すなわちＴＧＦベータ１（２０ｎｇｍｌ-1）を使用してＡＢＭＥを調製した。生成したＡＢＭＥをＰＢＳで２回洗浄し、非酵素溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で細胞を分離させた。一定数のＭＮＣ（すなわち２×１０5）を種々の用量の分離した間葉細胞（２×１０4、５×１０4、１×１０5）と混合し、１時間インキュベートした。インキュベーションの最後に細胞を造血コロニー形成アッセイ（ＨＣＦＡ）のために処理した。対照間葉細胞に対してＡＢＭＥの細胞を実験で使用すると、ＧＥＭＭコロニー形成の用量依存性上昇が観察された（図１０ａ）。第２にＧＥＭＭ生成の刺激については、最も高い濃度（１×１０5）の間葉細胞より最も低い濃度のＡＢＭＥからの細胞（２×１０4）でより効率的であり、ほぼ１０倍の効率の上昇を示した。
【００７１】
実験Ｂ
ＳＰＣ自己再生の点でＡＢＭＥは利点を有するかどうかを調べるために実験を行った。
【００７２】
間葉細胞を無菌の１ｃｍ×１ｃｍのカバーガラス上でほぼコンフルエンスまで増殖させて、１０ｎｇｍｌ-1のＴＧＦβ１を含有する処理培地でカバーし、加湿無菌雰囲気と５％ＣＯ2中で１８時間インキュベートした。次にカバーガラスをＰＢＳで洗浄し、こうして作成したＡＢＭＥを２０％血清を有する０．２ｍｌのＩＭＤＭ中２×１０5個のＣＤ３４+細胞の懸濁物でカバーした。１時間後、細胞を洗浄し、結合した細胞を０．８％メチルセルロースと成長因子とを含有する２０％血清を有する培地でカバーした。４８時間後のＣＤ３４+細胞の数の変化をＣＤ３４+特異抗体（クローンＨＰＣＡ１、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）で追跡した。結果を図１０ｂに示す。ＴＧＦβ１を使用しなかった他の実験と比較して、ＡＢＭＥはより多くのＣＤ３４+細胞増殖を支持することがわかった。さらにＡＢＭＥは、間葉細胞と比較して有意に多量の自己再生のプロモーターＪａｇｇｅｄ１を含有することが確定された（図１０ｃ）。
【００７３】
実施例１２：正常な酸素条件下での低酸素症の誘導
具体的な造血調節物質を使用して正常な酸素条件下で低酸素症を作成する可能性を調べるために、これらの実験を行った。
【００７４】
実験Ａ
生物学的調節物質すなわちＴＧＦβ１を使用して上記実験＃１に示した詳細に従って、ＡＢＭＥ生成のために間葉細胞を処理した。所定の時間後細胞を固定し、ＨＩＦ１α（これは低酸素症に関連する特異的転写因子である）に対する抗体を用いて免疫染色した。対照細胞と比較して、ＴＧＦβ１で処理した間葉細胞ではＨＩＦ１αの明瞭な核発現が見られた（図１１ａ）。
【００７５】
実験Ｂ
生物学的調節物質すなわちＴＧＦβ１を使用して上記実施例７（ａ）に示した詳細に従って、ＡＢＭＥ生成のために間葉細胞を処理し、２００μＭのヒポキシ（Ｈｙｐｏｘｙ）プローブ（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、アメリカ合衆国）で４８時間インキュベートした。細胞を固定し、標識物の検出に特異的な抗体を用いて免疫染色した。結果を図１１ｂに示す。ＴＧＦβ１を使用して作成したＡＢＭＥは標識物の高い取り込みを示し、低酸素症条件の存在を示した。
【００７６】
実施例１３：造血機能における適合性についての間葉細胞の評価
実施例８に記載した方法で、ＡＢＭＥ生成における間葉細胞の有用性を評価するために種々の間葉細胞のスクリーニングを行うことができる。結果を図１２に示し、ここで２つの別の骨髄試料から培養した間葉細胞集団と接触した時の造血調節物質の効力が比較される。同じバッチのＳＰＣを使用しある既知の造血調節物質を標準点として維持して、ある間葉細胞試料の「ＡＢＭＥ生成能力」を評価することができる。
【００７７】
実施例１４：造血調節物質のスクリーニング：
実施例８に記載した方法で間葉細胞を使用して、しかし種々の可能な造血調節物質の補助物質を有する処理培地を使用して、新規造血調節物質をスクリーニングすることができる。結果を図１３に示すが、ここでＡＢＭＥ生成について刺激性対阻害性造血調節物質の作用が示される。既知の造血調節物質を標準点として取り込み、同じバッチのＳＰＣを使用するなら、標準造血調節物質に換算してＡＢＭＥを導入する能力について試験物質を評価することができ、陽性／陰性；強力／余り強力ではない／無効な造血調節物質などとして判定される。
【００７８】
本発明で使用された材料：
本発明で使用したすべての材料は市販されている。骨髄、ＳＰＣ、間葉細胞、培養培地、成長因子と分化因子、インターロイキン、血清、抗体のような生物学的物質は、バイオテクノロジー会社、例えばカンブレックス・バイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、アメリカ合衆国；アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、アメリカ合衆国；ギブコビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、アメリカ合衆国；シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、アメリカ合衆国；サンタクルツバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アメリカ合衆国；ネオマーカー（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒ）、アメリカ合衆国；ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国；ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、バンクーバー、オンタリオ、カナダ；バッケム（Ｂａｃｈｅｍ）、スイス；アレクシス社（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、スイス；プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アメリカ合衆国；ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、英国などから得た。細胞分離製品は、ダイナール（Ｄｙｎａｌ）、ノルウェー、から；メチルセルロースはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、アメリカ合衆国から；細胞培養関連プラスチックはベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国；コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）、アメリカ合衆国から；細胞培養関連装置（例えば二酸化炭素インキュベーター）はフォルマ（Ｆｏｒｍａ）、アメリカ合衆国から；光学的装置例えば種々のタイプの顕微鏡はツァイス（Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ；オリンパス社（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本、およびニコン、日本、から得た。
【００７９】
本発明の利点と工業応用：
本発明の組成はＡＢＭＥの作成に使用され、これは以下：
ａ）自然のまたは人工的造血の異なる工程を調節するのに、
ｂ）健康なおよび疾患の骨髄細胞中の骨髄機能を評価するのに、
ｃ）体内の内因性サイトカインおよび成長／分化因子のレベルに影響を与えることなく、自然の造血を迅速に増強するのに、
ｄ）自己造血を刺激することにより、ＳＰＣ移植で観察される移植片対宿主反応病を最小にまたは排除するのに、
ｅ）適当な遺伝子または分子を導入して新規機能の作成においてインビトロ移植ＳＰＣを使用するのに、
ｆ）インビトロ移植可能なおよび移植不可能なＳＰＣを選択的に破壊するのに、
ｇ）インビトロで１つまたはそれ以上の系統の血球の強い成長を促進するのに、
ｈ）当該分野で公知の方法により骨髄から白血病前駆細胞を排除するのに、
ｉ）正常酸素条件下で細胞の低酸素状態を促進するのに、
ｊ）正常なおよび病的なＳＰＣの休止状態を誘導するのに、
ｋ）造血の１つまたはそれ以上の工程を制御する新しい薬剤を発見するのに、
ｌ）ＳＰＣを非造血細胞の運命に分化またはその逆を可能にする新しい薬剤を発見するのに、
ｍ）新に生成された免疫細胞を、細胞性または抗体性免疫応答により、選択された生物学的標的を破壊するように養成するのに、
ｎ）新に生成された免疫細胞を、自己の正常な標的細胞を避けて自己免疫疾患の弱体作用を防止するように養成するのに、
ｏ）新に生成された免疫細胞を、寛容を誘導して同種組織インプラントを許容するように養成するのに、有用である。
【００８０】
本発明を詳細に説明したが、これは本発明の精神と範囲を逸脱することなく、かつ過度の実験をすることなく、ある広範囲の同等のパラメータ、濃度、および条件内で実施できることを当業者は理解されたい。
本発明を詳細に説明したが、これは本発明の精神と範囲を逸脱することなく、かつ過度の実験をすることなく、ある広範囲の同等のパラメータ、濃度、および条件内で実施できることを当業者は理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａ〜１Ｄ：図１は、異なる種類の培地に単核細胞を蒔いた時の造血コロニーの生成を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｅ：図２Ｂは、ＭＮＣを間葉細胞と混合することによるコロニー形成アッセイの結果を示し、２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅは、それぞれ生物学的、化学的または免疫学的造血調節物質の間葉細胞との接触工程を含めた後の結果を示す。２Ａは、間葉細胞の無いＭＮＣのみから生成されるコロニーの性質を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、それぞれ別々に使用した時ＴＧＦβ１とＦＧＦ−２の使用で効力の等しいＡＢＭＥが生成されることを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、コロニー生成と造血細胞の成長に及ぼす種々の造血調節物質の作用を示す。
【図５】図５は、免疫学的造血調節物質の作用とその効力を示す。
【図６】図６（ａ−ｃ）は、ＡＢＭＥ中に存在する間葉細胞が、適当な造血調節物質で処理されるとＳＤＦ１αのような化学走化性分子の発現量を増加させ、従って遊走または帰巣および接着が増強されることを示す。
【図７】図７は、異なる造血調節物質の適切な組合せを選択することにより造血が調節されることを示す。棒は、一定数のＭＮＣが使用される時生成する造血コロニーと、活性化および阻害性タイプの造血調節物質を使用して間葉細胞で生成されるＡＢＭＥを示す。
【図８】図８（ａ−ｂ）は、適当な造血調節物質で作成したＡＢＭＥをＨＳＰＣに接触させることによる、ＨＳＰＣの系統の運命決定の変化を示す。
【図９】図９（ａ−ｄ）は、細胞生存因子を適当な造血調節物質で処理することによるＡＢＭＥ中の細胞生存因子の増加を示す。
【図１０】図１０（ａ−ｂ）は、適当な造血調節物質を使用することによるＳＰＣの自己再生分裂の上昇を示す。図１０（ｃ）は、自己再生を指示する調製されたＡＢＭＥ細胞中のシグナル伝達分離Ｊａｇｇｅｄ１の発現を上昇を示す。
【図１１】図１１（ａ−ｂ）は、適当な造血調節物質の使用による標準酸素条件下での細胞の低酸素環境の作成を示す。
【図１２】図１２は、ある造血調節物質に接触した時にＡＢＭＥを生成する２つまたはそれ以上のある間葉細胞集団の相対的効力の評価を示す。
【図１３】図１３は、ＡＢＭＥ生成についての刺激性または阻害性造血調節物質のスクリーニングを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学および医学の領域であり、人工的骨髄様環境を作成するための組成物とそのインビトロ法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトでは、「骨髄微小環境」（ＢＭＥ）と呼ぶ特殊な環境が骨小腔内に存在し、これは少なくとも１０類の異なる血球、骨の回復に必要な細胞、および広範な種々の分化細胞を生み出すことができる多数の幹細胞／前駆細胞の生成のための主要な部位を構成する。ヒトの健康は、「造血」と呼ばれるプロセスにより産生される異なる血球の絶え間ない供給に決定的に依存している。ＢＭＥは、体内を循環する少数の多能性幹細胞や前駆細胞（ＳＰＣ）に、全体の造血プロセスを構成する１０種類もの異なる血球を生成するように指令する。ＳＰＣは体内に広く分布しているため、自然の機構が、ａ）ＳＰＣが骨髄の外からＢＭＥに帰る（ＳＰＣ帰巣と呼ばれる）、ｂ）ＳＰＣとＢＭＥとの適当な接着性相互作用（移植と呼ばれる）を促進することによりＢＭＥ内にＳＰＣを保持する、ｃ）休止ＳＰＣを活性型に変えてその増殖を促進する、ｄ）多数のしばしば矛盾するシグナルにもかかわらずアポトーシスに対してＳＰＣを生き残らせる（ＳＰＣの生存と呼ばれる）、ｅ）ＳＰＣに、自己再生（より多くのＳＰＣを産生するため）または系統の運命決定（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）と分化（より多くの成熟血球を産生するため）の経路に沿って増殖するように指令するように機能する。従ってＳＰＣが関与する造血におけるＢＭＥの役割は、個体の一生を通して効率的な多系統の血球生成を確実にするために、個々に制御され微妙にバランスされた一連の工程として構築される。
【０００３】
血球産生の維持と最適化を引き起こすＳＰＣ機能（帰巣、移植、休止状態からの活性化、活性化ＳＰＣの休止の誘導、細胞の生存、自己再生、系統の運命決定と分化に沿った成長）に関する全プロセスはＢＭＥにより制御されるが、この制御に関与する正確な機構が科学者によって完全には理解されておらず、上記のインビトロまたはインビボの記載の１つまたはそれ以上の工程を制御し種々の他の用途を可能にするＢＭＥ様環境の作成のための方法は先行技術には存在しない。
【０００４】
先行技術では、骨髄中に存在する補助細胞は、ＳＰＣが必要とする微小環境の生成のためのすぐ近くの種々のサイトカインや成長制御物質のみを提供し、従って造血に必要なかかる成分の受動的な供給源として機能すると考えられてきた。文献で一般的な他の見解は、まれな集団の補助細胞のみがＳＰＣ成長を支持する能力を有するというものである。本出願人はそのような考え方には反対であり、適切な条件が与えられれば任意の補助細胞がＳＰＣに優れたシグナルを提供することを見いした。本出願人は、血球生成が増強されるかまたは制御される人工的骨髄様環境の作成を助ける組成物を開発した。本発明により開示される組成物と方法は、造血のすべての工程が大きく改良されるようなものである。さらに本発明は、所望の作用が現れるには、ＳＰＣがＡＢＭＥを構成する補助細胞にわずかに接触することが必要であることを強調し、従って補助細胞が積極的な役割を果たすことを強調する。すなわち先行技術では、ＳＰＣを拡張する試みが行われてきた。しかし現在のところ、インビトロで有効な人工的ＢＭＥを作成することにより血球生成を実質的に改良または制御ことは可能ではない。本発明はこのニーズを満たす。
【０００５】
発明の目的：
本発明の主要な目的は、血球生成が増強または制御される人工的骨髄様環境の作成を助ける組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、かかる環境を調製するための方法を提供することである。
【発明の開示】
【０００６】
発明の詳細な説明：
Ｉ．組成物：
従ってある態様において本発明は、血球の制御生成のための人工的インビトロ骨髄環境（ＡＢＭＥ）を開発するのに有用な組成物であって：
（ｉ）間葉細胞、
（ii）生物学的物質、化学的物質、および免疫学的物質から選択される造血調節物質；および
（iii）ＡＢＭＥ作成のためおよび本発明を実施するための培地
を含んでなる組成物に関する。
【０００７】
本明細書において用語「造血調節物質（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」は、これが使用されない標準から、インビトロ造血の１つまたはそれ以上の工程を変化させることができる物質を意味し、これにより、１つまたはそれ以上の系統のより多くの血球が生成されるか、または２つまたはそれ以上の系統の血球の相対的比率が変化し、間葉細胞の細胞内シグナルまたはＳＰＣまたはその両方に対する調節作用を通して作用する。かかる物質は、生物学的物質、化学的物質、または免疫学的物質でもよい。造血調節物質は、人工的インビトロＢＭＥの生成に必須であり、本発明は造血調節物質のいくつかの例を提供する。３種類の造血調節物質が有効であることがわかっている：ａ）生物学的、ｂ）化学的、およびｃ）免疫学的。これらの調節物質は本明細書において「造血調節物質」または「ヘマモジュレーター（ｈｅｍａｔｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」と呼ぶ。
【０００８】
生物学的造血調節物質：
生物学的物質または生物学的造血調節物質は、１）細胞から調製された適当な調整培地；２）成長因子および細胞刺激物質、例えばトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、または３）天然のタンパク質、例えばフィブロネクチン、ビブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、およびインテグリン結合ドメインもしくは活性化ドメインを含有するこれらの断片、およびインテグリンのようなこれらの受容体の調節物質、から選択される。該天然のタンパク質は、種および属全体にわたる天然に存在する相同的遺伝子から得られるタンパク質、およびこれらの合成作成された機能性相同物もしくは模倣物がある。かかる生物学的造血調節物質は、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ自己再生、ＳＰＣ移植、分化のための系統へのＳＰＣの運命決定、および強い血球生成に有用な標的細胞中の複数の細胞内シグナルを生成または維持することにより作用する。組成物中の生物学的物質の濃度範囲は、約０．１ナノモル〜５０マイクロモルである。
【０００９】
化学的造血調節物質：
造血調節物質として使用される化学的物質または化学的造血調節物質は、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ自己再生、ＳＰＣ移植、分化のための系統へのＳＰＣの運命決定、および強い血球生成に有用な標的細胞中の特異的細胞内シグナル伝達の増強物質または調節物質でもよい。かかる化学的物質は、タンパク質、ペプチドまたはこれらの機能的同族体と構造的に関連してもしなくてもよく、特異的細胞内シグナルの増強物質として作用する。化学造血調節物質は：
（ｉ）タンパク質キナーゼＣ増強物質、（ii）タンパク質キナーゼを含む環状グアノシン１リン酸（ｃＧＭＰ）活性化プロセスの増強物質、（iii）焦点接着キナーゼの増強物質、（iv）ＰＩ３−キナーゼ、ＰＤキナーゼ、Ａｋｔキナーゼ、およびＡｋｔ活性化経路の他の下流のメンバーを同時に活性化する増強物質、（ｖ）Ｃａ++シグナル伝達の調節物質、Ｃａ++−カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼを含む、（vi）インテグリン結合キナーゼの増強物質、および（vii）（ｉ）〜（vi）から選択される２つまたはそれ以上の増強物質の適当な組合せを含むコンビナトリアル増強物質、から選択される。前記したペプチドとタンパク質試薬は、個々のアミノ酸に従いその３文字コードにより特定し、配列の続きはＮ末端で開始しＣ末端で終止する。
【００１０】
タンパク質キナーゼＣ増強物質は、脂質様物質、例えば天然または合成ジアシルグリセロール、ファルネシルチオトリアゾール、または非脂質様化学物質、例えば（−）インドラクタムＶ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール１３−アセテートにより例示されるホルボールエステル基のメンバー、または細胞中の生成したジアシルグリセロールが長期間機能できるように細胞中のジアシルグリセロールリパーゼ酵素を阻害する物質、例えば１，６−ビス（シクロヘキシルオキシイミノカルボニルアミノ）ヘキサン（Ｕ−５７９０８）、でもよい。ｃＧＭＰ活性化プロセスの増強物質は、ｃＧＭＰ様化合物でもよく、これは容易に細胞に入り、タンパク質キナーゼを含むｃＧＭＰ依存性プロセスを直接または間接に増強する。かかる化合物は、８−（４−クロロフェニルチオ）グアノシン３’，５’−サイクリック１リン酸塩、アデノシン３’，５’−サイクリックモノホスホチオエート−Ｒｐ−異性体塩、またはその特異的ホスホジエステラーゼにより細胞内のｃＧＭＰの破壊を阻害する化合物、例えばザプリナスト（Ｚａｐｒｉｎａｓｔ）およびシルデナフィル（Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）およびこれらの機能的同族体でもよい。焦点接着キナーゼ増強物質は、間葉細胞と相互作用できるか、または特にその細胞表面上に存在する種々のインテグリン分子と相互作用できるタンパク質またはペプチドモチーフでもよく、その後焦点接着キナーゼは活性化され、同時に細胞内でインテグリン受容体関連シグナルが生成され、増強または維持される。線状ペプチド性の造血調節物質は本明細書に記載され、すべての場合に、アミノ酸の標準的３文字コードで記載されるペプチド／タンパク質配列とアミノ末端アミノ酸で開始されカルボキシ末端アミノ酸で終止する配列を有する。ペプチド造血調節物質の例は、Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ、配列モチーフ「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒｉｎｅ」を有する配列を含む線状または「ヘッドツーテイル（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）環状ペプチド」またはその機能性同族体；インテグリン結合キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、およびＡｋｔ−キナーゼの増強物質はペプチド、Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ、配列モチーフ「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ」を有する線状または環状ペプチド、およびタンパク質ＴＧＦβ１である。
【００１１】
化学的物質は、細胞内貯蔵からＣａ++イオンを放出するかまたはＣａ++チャネルの活性化によりより多くの細胞外Ｃａ++イオンが細胞に入り、その後にプロテインキナーゼを含むいくつかのＣａ++依存性酵素が活性化されることを可能にするカルシウム動員物質でもよく、かかる造血調節物質は、タプシガルギン、シクロピアゾン酸、および８−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）オクチル−３，４，５−トリメトキシベンゾエート（ＴＭＢ−８）により例示される。化学造血調節物質は間葉細胞内のチロシンキナーゼのインヒビターでもよく、３−アミノ−２，４−ジシアノ−５−（３’，４，５’−トリヒドロキシフェニル）ペンタ−２，４−ジエノニトリル（トリホスチンＡＧ１８３、チルホスチンＡ５１と同義）により例示される。
【００１２】
化学的造血調節物質は、ペプチドＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＧｌｙのようなＦＧＦ受容体機能の制御物質でもよく、これは間葉細胞で使用されて、そのままＡＢＭＥを形成するかまたは他の造血調節物質（例えばＴＧＦβ１）により形成されるＡＢＭＥの相乗的増強物質となる。
【００１３】
さらに造血調節物質は、酸化窒素、間質細胞由来因子−１アルファ（以後「ＳＤＦ−１アルファ」と呼ぶ）および間質細胞由来因子−１ベータ（以後「ＳＤＦ−１ベータ」と呼ぶ）のような拡散性の化学メッセンジャーを介するシグナル伝達を促進する物質でもよい。本発明者は、間葉細胞が酸化窒素、ＳＤＦ−１アルファ、およびＳＤＦ−１ベータを産生することができ、ＡＢＭＥの組成物が生成した後、これらの化学メッセンジャーがＡＢＭＥにより産生量が増加することを見いだした。酸化窒素、ＳＤＦ−１アルファ、およびＳＤＦ−１ベータは、後述するように強固な造血を刺激するＡＢＭＥの機能的機構に関与する。ＳＤＦ−１アルファ、およびＳＤＦ−１ベータの分子はＳＰＣの誘引物質として作用し、ＳＰＣが長距離を化学移動してＡＢＭＥに達することを可能にする。間葉細胞からのＳＤＦ−１アルファおよびＳＤＦ−１ベータ分泌が上昇している場合、これらにより形成される化学走化性勾配が大きくなり、より長距離に達することができるようになり、これらの影響範囲が拡大し、ＡＢＭＥの周りの環境のより広い部分からのＳＰＣの採取が促進される。ＳＤＦ−１アルファとＳＤＦ−１ベータは移植を助け、ＳＰＣとそこから得られる子孫の成長のインデューサーとしても作用して、強い造血を促進する。
【００１４】
本発明者は造血調節物質が、ＡＢＭＥを形成する間葉細胞中で例えばコネクシン４３（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３）のようなギャップジャンクションタンパク質の発現を上昇させることができることを確定した。コネクシン４３は、細胞内通信を促進する天然の造血中に重要な役割を果たす。
【００１５】
本発明者は、ＡＢＭＥ中の酸化窒素含量の増加が強い血球生成に有用な影響を与えることを確定した。酸化窒素は反応性が高く、非常に迅速に酸素分子と結合し、従って破壊される。従って間葉細胞内の酸素含量の有効な低下を促進するかまたは低酸素症を誘導する物質は、酸化窒素シグナル伝達の延長を促進し、ＡＢＭＥの機能に有用な影響を示す。細胞の低酸素状態はまた、ＡＢＭＥ機能を促進するＶＥＧＦの放出、脈管形成および血管形成を促進する新しい血管を生成する内皮細胞の動員と活性化を含む新規遺伝子発現の促進因子であり、これはインビボの血管形成に密接に関連している。酸素圧の低下を含む環境は、ＳＰＣの表面上のＣＸＣＲ４受容体の発現を促進し、ＣＸＣＲ４分子の上昇したかかるＳＰＣはより良くガイドされ、ＳＤＦ−１介在化学誘引を介してＡＢＭＥに誘引される。間葉細胞中の酸化窒素は、この拡散性メッセンジャーを「酸化窒素ドナー」から標的細胞に人工的に導入することにより増加させることができ、例えばこれらに、ｓ−ニトロソペニシラミン（ＳＮＰ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ジアゼノレート−２−オキシド（ＤＥＡＮＯＮＯａｔｅ）などのいくつかの化合物を用いて生成した酸化窒素の可逆性付加物を接触させることにより、より良好な関連する性質が、接触した細胞により示される。
【００１６】
造血調節物質は、間葉細胞のインテグリン受容体、焦点接着キナーゼ、ｂＦＧＦ−受容体を活性化できるモチーフを含む線状または環状ペプチドである化学的物質でもよい。このようなアルファ５：ベータ１の調節物質、アルファ２：ベータ１の調節物質、アルファ２ｂ：ベータ３の調節物質、アルファＶ：ベータ５の調節物質、アルファＶ：ベータ３の調節物質、アルファ４：ベータ１の調節物質、フィブロネクチン接着促進因子（ＦＡＫ−アクチベーター）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒのようなインテグリン調節物質、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＧｌｙのようなｂＦＧＦ制御物質、天然のフィブロネクチンまたは種々のインテグリン相互作用ドメインを含有するフィブロネクチンのサブフラグメント、細胞結合ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、およびゼラチン結合ドメイン。該化学的物質の量は約０．１〜１００マイクロモルでもよい。
【００１７】
造血調節物質は、酸素依存性死滅ドメインモチーフ（その一例はＨＩＦ−１αである）が関与するタンパク質または転写因子の細胞内分解を防止できる化学的物質でもよい。
【００１８】
免疫学的造血調節物質：
本明細書で定義される免疫学的造血調節物質は、特に間葉細胞のような標的細胞中のインテグリン受容体からの細胞接着シグナルを活性化できる、抗体またはその機能性同族体でもよい。免疫学的造血調節物質の選択された非限定例は、インテグリンベータサブユニットに対する活性化抗体である。かかる免疫学的造血調節物質は、標的細胞を５０％またはそれ以上に凝集させるのに充分な濃度で使用される。
【００１９】
造血調節物質のプライミング：
生物学的、化学的または免疫学的造血調節物質の一部は、ＳＰＣに接触してこれらをプライムまたは活性化するのに随時使用され、次によりよい結果のためにＡＢＭＥとともに使用される。プライミング造血調節物質のいくつかの例は：ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼインヒビター（３アミノベンズアミド）、ＴＧＦベータ１の潜伏関連ペプチド、グリコ−結合体を含有する細胞表面関連マンノース６−ホスフェート、ＩＧＦＩおよびＩＧＦIIエフェクター、ｃＧＭＰシグナル伝達の増強物質がある。
上記物質がタンパク質である場合、これはその同族体、合成作成または人工的に工学作成した分子を含む。
【００２０】
本発明で使用される間葉細胞は、肝臓、骨髄腸骨稜、大腿骨、および肋骨から得られる細胞または間葉幹細胞を意味する。通常選択される細胞は、造血コロニーを生成できないものである。さらにこれらの細胞は、均一または不均一でもよく、繊維芽細胞、マクロファージ、骨芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞のような細胞を含む。上記の増殖培地は、動物細胞を培養するのに適したものである。培地は、胎児牛血清（ＦＢＳ）および随時メチルセルロース、エリスロポエチン、造血成長および分化因子、およびインターロイキンを補足した、イスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ最小基本培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０から選択される。
【００２１】
本発明の実施において、ＡＢＭＥ接触の初期のサイクル（通常４８〜７２時間の短時間）で増幅されたＳＰＣは単離することができ、かかる新鮮なＡＢＭＥとの接触を１回またはそれ以上の回数繰り返してさらなる利点を得ることにより、さらに増幅することができる。
【００２２】
ＩＩ．キット
本発明はまた、人工的骨髄環境（ＡＢＭＥ）を作成するための、およびこれを種々の応用（血球生成の１つまたはそれ以上の個々の工程の制御を達成することを含む）に使用するための有用なキットまたは複数のキットであって：
ａ）前節で記載したものから選択される生物学的、化学的または免疫学的物質である１つまたはそれ以上の造血調節物質、
ｂ）ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液、ＩＭＤＭを含む造血調節物質の希釈剤、
ｃ）間葉細胞を培養するのに適した培地、例えば前節で記載した成長補助物質を含むダルベッコー培地、ＲＰＭＩ−１６４０、ＩＭＤＭ、
ｄ）ＰＢＳまたはＩＭＤＭのような使用された造血調節物質を除去するのに有用な水溶液、
ｅ）ＡＢＭＥの細胞を採取するのに有用な、および／またはさらなる使用のために活性化ＳＰＣをリサイクルするのに有用な溶液、例えばタンパク質分解酵素、インヒビター、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液、
ｆ）幹前駆細胞をプライムするための造血調節物質の溶液（このような物質は前節で記載したものと同じである）、
ｇ）プライムした幹前駆細胞を使用する前にプライミング物質を除去するための洗浄溶液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水またはＩＭＤＭ、
ｈ）ＡＢＭＥの支持鋳型または足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ＡＢＭＥの細胞、造血促進成長、分化および生存因子、増殖培地、および随時メチルセルロース、血清、適当な足場を含む、インビトロの血球生成のための培地、および
ｉ）指示のマニュアル
を含むキットを提供する。
【００２３】
足場は、フィブロネクチン、コラーゲン、または任意の他の同様の基質の２つまたはそれ以上の基質を含む。
【００２４】
キットは、ｉ）ＡＢＭＥを生成する所定の間葉細胞集団の品質を評価するための、ii）その可能な造血調節物質機能のための生物学的、化学的および免疫学的物質の定量的スクリーニングのための、iii）強い血球生成のためにＡＢＭＥを調製し、幹前駆細胞をプライムするための、iv）単一のまたは複数の系統でインビトロで生成された血球の組成を変化させるＡＢＭＥを調製するための、ｖ）ある試料中に存在する幹前駆細胞の休止状態を誘導するための、他の試薬を随時含有する。この試薬系は市販の包装された形で、試薬の適合性が許容するなら組成物または混合物として、試験装置の構成で、またはより典型的には試験キットで、すなわち必要な試薬を使用してアッセイを実施するための説明書を有する、１つまたはそれ以上の容器、装置などのパッケージされた組合せとして提供される。
【００２５】
上記物質のプライミングの具体例は以下の通りである：
【表１】
【００２６】
ＩＩＩ 相乗作用：
血球の成長のための条件は骨髄（体内）で最も適しているため、当該分野において血球の増殖と成長は骨髄（体内）でのみ起きると、当該分野では考えられてきた。これらの条件を体外に作成し、血球の成長を増強することは困難であると考えられてきた。これらの仮説に反して本発明者は、血球の制御された成長と増殖に適したインビトロ環境を開発することを助ける新規組成物とキットを開発した。適当な細胞と、造血調節物質および場合によりＡＢＭＥ細胞の支持体とを補足した培地との組合せを使用する環境が開発される。こうして作成した環境は、造血に非常に適しており、天然のＢＭＥに似ている。ＡＢＭＥは、（ｉ）より強い化学誘引による帰巣の増強；（ii）間葉細胞とＳＰＣとの細胞接着を促進することによる移植の増強；（iii）Ｂａｄのようなアポトーシス促進性分子を減少させることによるアポトーシスシグナルに対するＳＰＣの生存の増強；（iv）骨髄系統およびリンパ球系統に沿ったＳＰＣの運命決定；（ｖ）自己再生および分化経路に沿ったその増殖を促進するための休止ＳＰＣの活性化；および（vi）必要な場合のＳＰＣ休止状態の誘導、を促進する。
【００２７】
さらに本発明の組成物は、すべての成分が使用される時のみ、人工的骨髄様環境を生成することができＳＰＣと造血細胞の成長を促進することができることがわかった。間葉細胞は、造血調節物質による処理無しで使用されると、維持されないし、効率的な人工的骨髄様環境（ＢＭＥ）も作成されない。この結果を与えるのは成分の組合せ（すなわち、細胞と適切な造血調節物質を含む処理培地）のみである。従って本発明の組成物とキットは相乗的であり、驚くべきことに人工的骨髄様環境を作成することが発見され、この結果は、成分が単独に使用される時観察されないものである。従って組成物とキットは相乗的である。
【００２８】
ＩＶ．方法
ある実施態様において本発明は、人工的骨髄環境を作成するための方法であって：
（ｉ）間葉細胞を得て、これを適切な増殖培地中で培養する工程；
（ii）間葉細胞に造血調節物質を２０分〜２４時間接触させる工程（こうして、その細胞内シグナル伝達経路が活性化され、これらは骨髄環境のような性質を獲得する）；
（iii）前駆細胞（ＳＰＣ）を得て、場合によりこれをプライムする工程；
（iv）ＡＢＭＥとの相乗的参加を可能にする細胞内シグナル伝達経路を活性化してより多くの血球の生成するために、上記工程（ii）のように処理した間葉細胞にＳＰＣを接触させ、これを場合により造血調節物質と接触させる工程；
（ｖ）プライムしたＳＰＣにＡＢＭＥまたは培地中の活性化間葉細胞を２０分またはそれ以上接触させて、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ移植、ＳＰＣ活性化、ＳＰＣ自己再生、リンパ球および骨髄系統に沿ったＳＰＣの運命決定を達成して強い造血を得る工程、を含むことを特徴とする方法を提供する。この方法はまた、造血調節物質の適切な選択により、具体的な目的のためのＳＰＣ休止を誘導するのに使用することもできる。
【００２９】
間葉細胞は、腸骨稜から得られる細胞、成体の肋骨または大腿骨から採取される骨髄細胞を含み、２０％ヒトもしくは胎児牛血清補足イスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）のような適当な培養培地で、細胞が増殖し、通常細胞培養で３〜４回の連続継代後約３〜６週間で１０7個またはそれ以上の間葉細胞が得られる条件下で維持される。「細胞培養条件」は、培養物を３７℃および５〜７％二酸化炭素の加湿雰囲気中で無菌条件下で適切な細胞培養グレードのプラスチック（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）中で維持することを含む。
【００３０】
上記したように使用される血球生成のための培地は、２０％血清を有し、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−３、およびＩＬー６）、幹細胞因子、系統特異的成長因子（例えば、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）、および０．８％までのメチルセルロースを補足したＩＭＤＭでもよく、培養物は、血球コロニーが良く成長するかまたはコロニーを形成しさらなる分析と使用のために成長が明らか／区別可能になる条件下で１２〜１４時間維持される。ＡＢＭＥ機能の定量性を評価するために同様に設計されたアッセイは、以後「ＡＢＭＥのための定量的造血コロニー形成アッセイ（ＨＣＦＡ−ＡＢＭＥ）」と呼ぶ。
【００３１】
ＡＢＭＥ作成のために使用された間葉細胞の量は、ＡＢＭＥで処理されるＳＰＣの数に依存し、方法は、必要な間葉細胞数を増加または減少に合うように適切にスケールが決定される。通常間葉細胞の量は、標的ＳＰＣの１．５倍である。
【００３２】
間葉細胞に造血調節物質を接触させる工程は、２０％血清を有するＩＭＤＭ中の造血調節物質の適切な溶液／懸濁物で間葉細胞を覆い、標準的細胞培養条件で細胞を０．５〜２４時間維持することにより行われ、こうして細胞が活性化され、ＡＢＭＥ様性質が誘導され、これは造血調節物質適用が除去された後でさえ、充分な期間有用に維持される。
【００３３】
ＡＢＭＥ細胞が、使用されるＳＰＣ細胞と比較して１．５倍過剰であるように、場合によりＳＰＣまたはＳＰＣを含有する細胞の集団（例：骨髄から単離された単核細胞、臍帯血からの有核細胞、ＳＰＣ動員後の末梢血からの有核細胞）を調製されたＡＢＭＥと混合してもよい。ＳＰＣとＡＢＭＥは一般的な培地に懸濁されて、適切な培養条件下で少なくとも３０分間維持される。ＳＰＣが適当な表面上で接着性にされると、ＡＢＭＥ細胞はその上または周りで被覆することができる。さらに各具体的な応用により必要な他の試薬を補足した、ＩＭＤＭ、２０％血清、および０．８％メチルセルロースを含む培地を使用して、ＡＢＭＥとＳＰＣの両方を被覆してもよい。
【００３４】
具体的な造血調節物質が使用される濃度、および最適の結果を得るためにあるバッチの間葉細胞が接触される時間は変化し、これらの正確な詳細は個々の場合に決定され、本明細書に記載の造血調節物質の有用な濃度範囲および処理時間は単に指針である。
【００３５】
別の実施態様においてこの方法は、インキュベーション中に拡散によりインサイチュで生成される造血のインヒビターを減少させる含有するコンパートメント培養物に適合するように改変され、ここでＡＢＭＥとＳＰＣの細胞はあるコンパートメント中に含有され、必要なもしくは好ましい成長因子および分化因子または造血調節物質を有する培地を、別のおよび交換可能なコンパートメントからの細胞に接触させる。
【００３６】
さらに別の実施態様において方法はフロー培養系に適合するように改変され、ここでＡＢＭＥとＳＰＣの細胞はある支持体／コンパートメントに含有され、こうして自然にインサイチュで生成する造血インヒビターの蓄積を避けるために、培養培地を構成する適用培地、造血調節物質を有する接触培地、洗浄液、分化培地が、プログラムされた方法で細胞に浸透または通過することを可能にし、細胞への連続的栄養供給を可能にして結果が改良される。
【００３７】
本発明者は研究の過程で、強い造血を促進するためにＡＢＭＥが準備できているかまたはＳＰＣが活性化されていることがわかった場合は、間葉細胞の造血調節物質への接触を続けることが必須ではないことを見いだした。同じ数のＳＰＣが標準としての間葉細胞またはＡＢＭＥと、本来同等の実験条件下で接触されると、非常に多数のＳＰＣがＡＢＭＥに動員され、これらがさらにＨＣＦＡについて処理されると、標準と比較してＡＢＭＥでコロニー数の有意な上昇が見られ、帰巣の増強、より有効な移植、および強い血球生成を示唆している。この結果は、試料中に存在する活性化ＳＰＣの比率の上昇を意味し、これは、一部のＳＰＣが休止状態を励起させて活性化状態に入り、および／または自己再生を受けて活性化ＳＰＣ細胞の比率を上昇させたことをさらに示唆する。
【００３８】
別の実施態様において本発明者は、正常なＳＰＣが休止状態と等しい状態を達成するように、ＡＢＭＥの機能を調節する負の造血調節物質を同定した。かかる調節は、細胞サイクル制御特性において差を有する正常なＳＰＣと病的ＳＰＣとを区別するためのプロトコールの開発を可能にする。すなわちこの方法は、抗新生物薬を使用してインビトロで白血病ＳＰＣの選択的破壊のための治療法を支持してインビボの化学療法に伴う有害な副作用を避ける。
【００３９】
本発明を以下の実施例により例示するが、これらは例示目的であり、決して本発明の範囲または概念を限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１
ａ）間葉細胞の入手と調製：
腸骨稜または肋骨から得られる骨髄細胞をイスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）に充分分散させて単一細胞懸濁物を得て、同じ培地で少なくとも３回洗浄して、それぞれ２〜３０００ｒｐｍ（５００〜１０００×ｇ）で５分間遠心分離して細胞を採取する。洗浄した骨髄細胞（少なくとも１０8個の細胞）を最大７日間ＩＭＤＭと２０％胎児牛血清またはヒト血清中で細胞培養条件下で維持する。こうして数日で得られた典型的な標準的組織培養グレードのプラスチック（Ｔ−２５フラスコ、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）上の接着性細胞層を普通のＩＭＤＭで洗浄し、同じ培地中の標準的細胞培養物を数回継代してさらに拡張する。典型的には３回の継代後、固有の造血すなわちメチルセルロースアッセイで造血コロニーを与える能力が失われる。１０8個の骨髄細胞から出発して３〜６回の継代で少なくとも１０7個の間葉細胞が得られる。こうして得られた間葉細胞は、後述の方法でＡＢＭＥを作成するのに適している。
【００４１】
ｂ）ＡＢＭＥで使用するのに適したＳＰＣの調製
上記工程（ａ）で得られた洗浄した骨髄細胞を注意深くフィコール−ハイパークの勾配（密度１．００７、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、セントルイス、ミズーリ州）上に重層し、クボタ遠心分離機（クボタコーポレーション（Ｋｕｂｏｔａ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本国１１３−００３３、東京都文京区）のスイングアウトローターで１５００ｒｐｍ（１０００×ｇ）で１５分間遠心分離する。界面層から単核細胞（ＭＮＣ）が採取され、１０００×ｇでの連続的遠心分離と再懸濁によりＩＭＤＭで３回洗浄する。次に２０％ヒト血清または胎児牛血清を補足したＩＭＤＭにＭＮＣを適当な密度（１０5〜１０7ＭＮＣ／ｍｌ）で懸濁する。ここで調製したＭＮＣはそのままＡＢＭＥとともに使用される。ここで単離されたＭＮＣと同様の環境でＳＰＣはインビボで見つかる可能性が高い。
【００４２】
例示目的でこの方法は、上記２つの条件をシミュレートするために、ＭＮＣならびに高度に濃縮されたＣＤ３４+抗原を発現するＳＰＣとともに試験される。必要な場合、ＣＤ３４+細胞はＣＤ３４+細胞単離キット（ダイナール（Ｄｙｎａｌ）、スメスタッド（Ｓｍｅｓｔａｄ）、Ｎ−０３０９、オスロ、ノルウェイ）を使用して製造業者の説明書に従ってＭＮＣ画分から常法で回収されるが、他の適当な方法を使用してもよい。ＣＤ３４+細胞はまた、適当な方法を使用して骨髄からまたは臍帯血から動員した後、白血球搬出法により採取される。ＡＢＭＥへの提示の前または後にＣＤ３４-（ＣＤ３４陰性）前駆体から生成したＣＤ３４+細胞は、所望の結果を与える。こうして調製されたＳＰＣはまた、適当なヘマト調節物質でプライムするのに適している。
【００４３】
ｃ）間葉細胞は一定数のＳＰＣから造血を刺激する：
間葉細胞がＳＰＣ細胞の運命に直接影響を与えることを調べるために、いくつかの実験を行った。あるセットの実験で間葉細胞を別々に培養し、ほとんど５０，０００個の細胞を、過剰量の種々の精製したおよびヒト特異的サイトカインおよび造血コロニー刺激成長因子（ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、トロント、カナダ）とともにＩＭＤＭ中に０．８％メチルセルロースおよび２０〜３０％血清を含む典型的なＨＣＦＡ培地に暴露した。さらに詳しくはＨＣＦＡで日常的に使用される造血成長因子の量は、２国際単位／ミリリットル（２Ｉ．Ｕ．ｍｌ-1）のエリスロポエチン（ＥＰＯ）、５０ナノグラム／ミリリットル（５０ｎｇ／ｍｌ-1）の幹細胞因子（ＳＣＦ）および２０ナノグラム／ミリリットル（２０ｎｇ／ｍｌ-1）ずつの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびインターロイキン−６（ＩＬー６）である｛すべての成長因子とサイトカインはステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（バンクーバー、カナダ）から｝。本明細書に記載の方法により調製される間葉細胞は、過剰量のすべての必要な成長因子を与えても、それ自体でコロニー形成アッセイ培地で造血コロニーを形成することができなかった。
【００４４】
別のセットの実験において５０，０００個の同じ間葉細胞をまず約１００，０００個のＭＮＣと混合し、３７℃で少なくとも３０分間維持し、コロニー生成アッセイのために処理した。いくつかの実験で、これらの２つの種類の細胞を混合すると、ＭＮＣの細胞のみを使用した標準と比較して、造血コロニーの数と細胞充実性の改良が見られた。増加は１．５〜１０倍であった。間葉細胞のみを使用して得られたコロニー形成の増強は、試料間で変動が大きく予測不可能であった。ＭＮＣと間葉細胞を一緒に処理した時のみ数と細胞充実性が上昇して造血コロニーが形成されたことは、間葉細胞により作り出される、ＭＮＣ中に存在するＳＰＣがより生産性である新しい環境の証拠である。この増加は、自己再生および両方の因子の組合せによる、あらかじめ存在するが休止状態のＳＰＣの活性化と新しいＳＰＣの生成を引き起こす。
【００４５】
ｄ）間葉細胞に造血調節物質を接触させるとより良好な結果が得られる：
異なるバッチの間葉細胞は同じ造血調節物質に対して応答が異なるため、造血調節物質の実際の用途には、その用量と接触する期間の最適化を必要とする。多くの実験から本発明者は、一般に便利な出発点は、１〜２５ナノグラム／ｍｌ（活性成分について）の範囲の生物学的造血調節物質、１０ｎＭ〜５０マイクロモル溶液の範囲の化学的造血調節物質、および１０〜５０ピコモル溶液の範囲の免疫学的造血調節物質の使用であることを確定した。
【００４６】
ＡＢＭＥを作成するために間葉細胞を、２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭに含有される造血調節物質を含む接触培地で所望の期間（８〜２４時間の範囲）カバーして、取り出した。次に接触させた細胞を、造血調節物質の無い接触培地（ＩＭＤＭ＋２０％ＦＣＳ）を使用して２回洗浄し、そのまままたは間葉細胞を採取した後使用し、これはインビトロＡＢＭＥの組成である。場合によりＡＢＭＥ細胞は支持体上で構成され、これはより良好な結果のために細胞を２つまたはそれ以上の次元に分散させる。必要な数のＭＮＣ／ＳＰＣおよびＡＢＭＥの細胞を取り、適当な期間（０．５〜６時間の範囲）一緒に維持し、次にインビトロ造血コロニー形成アッセイまたは造血のために処理する。
【００４７】
すなわち本発明者は４セットの実験を行った：（ａ）単核細胞を未処理の間葉細胞に暴露した；（ｂ）ＭＮＣを生物学的物質［ＴＧＦβ１］と接触させた間葉細胞に暴露した；（ｃ）ＭＮＣを化学的物質１［１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール、１３アセテート／（−）インドラクタムＶ］と接触させた間葉細胞に暴露した；および（ｄ）ＭＮＣを免疫学的物質［活性化、抗インテグリンベータ３抗体］で処理した間葉細胞に暴露した。結果を図１に示すが、以下の通りである：
（Ａ）この場合、低い細胞充実性の血球コロニーはほとんど生成しなかった；
（Ｂ）（Ａ）より数が多く細胞充実性の高い血球コロニーが形成された；
（Ｃ）（Ａ）より少なくとも４倍大きく（Ｂ）より大きい、細胞の大きなコロニーが観察された；
（Ｄ）驚くべきことに（Ａ）または（Ｂ）より多い高密度の細胞コロニーが形成された。
【００４８】
実施例２：
生物学的造血調節物質の作用
調製法は以下を含む：ＩＭＤＭ、２０％血清、および細胞から造血調節物質−ＣＭを放出するために適切な量（例：エリスロポエチン２Ｉ．Ｕ．ｍｌ-1；ＧＭ−ＣＳＦ２０〜５０ｎｇ．ｍｌ-1）で必要な適当な調節物質（例：エリスロポエチンとＧＭ−ＣＳＦ）を含む１ミリリットルの培地に、細胞培養条件下で３７℃で維持したＭＮＣ（＞１０7個の細胞）。適当な期間（８〜９６時間の範囲）後、冷却クボタ遠心分離機（５０００×ｇ、１５分）で遠心分離した後細胞を取り出し、上清として得られた生物学的造血調節物質−ＣＭをそのまま、またはさらに処理して存在する活性成分を濃縮した後使用した。ＣＭの処理は一般に約４℃の冷却環境で行われ、親和性クロマトグラフィーの原理を使用した。簡単に説明すると、マトリックス（例えばヘパリンセファロース）上に固定化した適当な親和性リガンドを取り、低塩緩衝液中で造血調節物質−ＣＭを吸収させ、吸収しない成分をローディング緩衝液で洗い流し、造血調節物質−ＣＭの活性成分をまず高塩（例えば１．５モルＮａＣｌ）緩衝液により溶出し、次に濃縮し、保存緩衝液と平衡化させ、将来の使用のために−７０℃で保存した。他の２つの生物学的造血調節物質（すなわち、生物学的物質−１と生物学的物質−２）は、それぞれＴＧＦβ１とＦＧＦ−２であると確認された。
【００４９】
生物学的造血調節物質−ＣＭ、ＴＧＦβ１、およびＦＧＦ−２は適切な条件下で同様に効率的なＡＢＭＥであった；しかしそれぞれにおいて生成されたＡＢＭＥは異なっていた。典型的には生物学的造血調節物質−ＣＭ、ＴＧＦβ１、およびＦＧＦ−２は、ＩＭＤＭと２０％ヒト血清または胎児牛血清中１〜２５ナノグラムｍｌ-1の濃度範囲で使用して間葉細胞に８〜２４時間細胞培養条件下で接触させてＡＢＭＥを作成した。図２に示すように、造血調節物質のみを使用した時（図２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅ）より強いＡＢＭＥ関連の性質が現れたが、間葉細胞を使用しない場合（図２Ａ）または生物学的造血調節物質無しで使用した場合（図２Ｂ）はそうではなかった。図は、各場合に生成された血球の密度を示し、これはコロニーの細胞充実度に比例する。最良のコロニーは、間葉細胞に造血調節物質を接触させる時にのみ形成される。
【００５０】
実施例３：コロニー形成に対する生物学的造血調節物質の作用
本発明者は、ＴＧＦβ１とＦＧＦ−２の使用により得られたＡＢＭＥが、別々に使用した時、間葉細胞からＡＢＭＥを作成するのにほぼ同じ強さであり、各ＡＢＭＥが顕著に弱まることなくその親間葉細胞と自由に混合することを、実験により確定した。
【００５１】
間葉細胞を使用する定量的、系統特異的コロニー形成アッセイに関するあるセットの実験を行った：（Ａ）どの生物学的物質とも接触せず［図３Ａ対照］、またはＴＧＦβ１［図３Ａ 生物学的物質１］またはＦＧＦ−２［図３Ａ 生物学的物質２］と接触した後。顆粒球−赤芽球−単球およびマクロファージ（ＧＥＭＭ）、バースト形成単位−赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）および顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）を含むいくつかの特異的系統に沿ったコロニー形成は、両方のＡＢＭＥにより均一に刺激されること、およびＴＧＦβ１とＦＧＦ−２は、この作用を維持する各ＡＢＭＥを作成するのにほぼ同じ強さであることが明らかである。特にＧＥＭＭコロニー形成の刺激は、ＡＢＭＥが多能性前駆体を刺激して、自己再生に等しいより多くの新しい多能性細胞を生成することができることを示す。
【００５２】
図３Ｂにおいて本出願人は、ＴＧＦβ１またはＦＧＦ−２の使用により作成されるＡＢＭＥがいずれも、個々に試験すると未処理間葉細胞に適合性であることを証明した。従ってこれらの２つのＡＢＭＥのそれぞれは、未処理間葉細胞と混合するのに適している。これに対して両方のＡＢＭＥを等しい比率で混合すると、組合せは個々の場合より弱いＡＢＭＥであった。これは、これらが互いに拮抗性であり同一ではないことを明瞭に示している。
【００５３】
実施例４：コロニー形成に対する化学的造血調節物質の作用
本発明者は、細胞内シグナル生成および／または種々のタンパク質キナーゼ、特にｃＧＭＰ依存性キナーゼ、脂質依存性キナーゼ（例、ＰＫＣ）、ホスファチジルイノシトールホスフェート依存性キナーゼおよびファミリー（Ｐ１３Ｋ、ＰＤＫ、Ａｋｔ、ｐＢａｄ、ｍＴＯＲ）、細胞接着依存性キナーゼ（ＦＡＫ、ＩＬＫ）、受容体チロシンキナーゼ（例：ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２Ｒ）、受容体−セリン／スレオニンキナーゼ（例：ＴＧＦβ１受容体）、および細胞内Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ（例：ＭＡＰＫ−キナーゼおよびｐ３８ＭＡＰＫキナーゼ）、Ｃａ++イオン依存性キナーゼ（Ｃａ++−ＣａＭ依存性キナーゼ）の機能の維持を調節するいくつかの造血調節物質を試験し、かかる機能をもたらすことができる任意の新しい分子は造血調節物質の候補であることを示した。
【００５４】
ＡＢＭＥ作成について、間葉細胞を適当な期間（５分〜２４時間の範囲）２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭ（適切な量の造血調節物質も存在する）を使用して接触させた。高濃度の造血調節物質も長い接触時間も良好な結果は与えないため、有効な造血調節物質溶液の調製と間葉細胞を接触させる期間は注意深い最適化が必要である；有用な範囲は造血調節物質について１ナノモル〜１００μモルであり、接触期間は５分〜２４時間である。
【００５５】
別の態様において本発明者は、生物学的物質と化学的物質のいくつかの組合せは相乗的に作用し、いずれか１つのみを使用した時と比較してより良好なＡＢＭＥが作成されることを確定した。
【００５６】
別の態様において本発明は、適当な化学的造血調節物質を使用して血球生成を抑制できることを確定した。これらは、ＳＰＣ休止を促進することを示すために「陰性造血調節物質」と呼ばれる。かかる造血調節物質は、もし優勢であるなら、他の造血調節物質の刺激作用を弱めることができる。
【００５７】
図４は、異なる造血調節物質の使用が、種々の系統で異なって血球生成を刺激することができるＡＢＭＥを作成することを示す。図４Ｂと４Ｃは、コロニー形成に対する化学的造血調節物質の作用を示す。図４Ｄは、生物学的造血調節物質と化学的造血調節物質との組合せの作用がＡＢＭＥ作成において相乗作用を示すことができるを示す。図４Ｅは、陰性造血調節物質によるＡＢＭＥの用量依存性の減弱を示す。
【００５８】
実施例５：免疫学的造血調節物質
本発明者は、インテグリン受容体を介して間葉細胞上の接着性相互作用を活性化できる抗体試薬またはその機能性同族体は、造血調節物質として作用することを確定した。さらにかかる免疫学的造血調節物質は生物学的造血調節物質および／または化学的造血調節物質と相乗作用して、インビトロでより良好なＡＢＭＥを作成する。かかる免疫学的造血調節物質は、２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭを含む培地中１０〜１００マイクログラム．ｍｌ-1の範囲で有用性である。間葉細胞にこの培地を適当な期間（１〜２４時間の範囲）、間葉細胞がＡＢＭＥを生成する培養条件下で接触させる。別の態様において免疫学的造血調節物質の使用は、より良好な結果を得るために化学的造血調節物質および／または生物学的造血調節物質の使用と組合せることができる。
【００５９】
図５に示すように、間葉細胞が使用されるとほんのわずかの血球コロニーしかが形成されない（対照：黒い棒）。これに対して免疫学的造血調節物質の溶液（ヒトベータ３インテグリンサブユニットに対する抗体）を、２０％ヒト血清または胎児牛血清を有するＩＭＤＭを含む培地に懸濁した５０マイクログラム／ミリリットルの溶液を使用して間葉細胞を１時間接触させると、間葉細胞は非常に有効なＡＢＭＥを生成し、インビトロでのコロニー形成と血球生成が増強された。
【００６０】
実施例６：ＳＰＣをＡＢＭＥに接触させる前にＳＰＣをさらにプライムすることにより結果を改良する
ＳＰＣまたはＳＰＣを有するＭＮＣの集団はまた、特異的化学的物質で別々にプライムして、これらがＡＢＭＥに接触した後、より多くの良好な血球コロニーを形成するようにすることができる。ＳＰＣのプライミング自体が、プライミングの無い細胞と比較してより良好でより多くのコロニーを形成できるが、最良の結果は、プライムしたＳＰＣをＡＢＭＥと組合せた時に得られた。本発明者は、ＳＰＣをプライムすることができ、改良されたコロニー形成／血球コロニーを与える少なくとも１０個の異なる化学的物質を同定し、これはこの方法もまた、新しいプライミング物質（潜伏関連ペプチド、３−アミノベンズアミド、ＩＧＦ−１とII、マンノース６ｐ含有グリコール結合体）の同定に有用であることを意味する。プライミング物質はインテグリン性接着に関連するシグナルを活性化することができ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、マンノース６−ホスフェート／ＩＧＦII受容体、ｃＧＭＰ依存性機能を活性化するか、またはＳＰＣに対するポリ（ＡＤＰ−リボースホスフェート）ポリメラーゼ機能を阻害することができ、これらに機能的に相同的な新しい分子はプライミング物質として受容されることを示す。これらのプライミング物質は造血を有意に調節したため、これらは造血調節物質として受容される。
【００６１】
実施例７：帰巣の調節：
実験Ａ
５×１０5個の間葉細胞を、２０％血清を含有するＩＭＤＭ中直径３５ｍｍのシャーレ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）で成長させた。細胞がコンフルエンスになった後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ギブコビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ））（ＰＢＳ）で２回洗浄し、培地を１０ｎｇｍｌ-1のＴＧＦβ１含有処理培地と交換しして、３７℃の５％ＣＯ2の標準的細胞培養環境に戻した。４時間後処理培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％血清を含有するＩＭＤＭの１ｍｌでカバーし、３７℃で５％ＣＯ2でのインキュベーションを続けた。１８時間後調整培地を採取し、ＣＤ３４+ＳＰＣのインビトロ帰巣を支える能力について測定した。別の平行実験において、等しい数の間葉細胞も使用し、ＴＧＦβ１を使用せず、この実験から得られた調整培地を比較のために標準として使用した。結果を図６（ａ〜ｃ）に示す。ＴＧＦβ１で間葉細胞を処理後（こうしてこれらは活性ＡＢＭＥを生成する）、有意に多い量のＳＤＦ−１αを放出され、これはそこにＳＰＣを誘引するためにＡＢＭＥの近傍に化学的勾配を作成することができ、こうしてこの帰巣を促進する。図６（ａ〜ｂ）に示すように、未処理の間葉細胞は、ＴＧＦβ１で処理した間葉細胞と比較して、まったくまたはほとんどぎりぎりの帰巣しか示さない。帰巣は、適当な量の中和抗体をＳＤＦ−１αまたはその受容体ＣＸＣＲ−４に加えて、ＳＰＣの化学誘引に対するその作用を中和することにより、またはプロセスの特異性を示すＳＤＦ１の外からの添加により勾配を破壊することにより、帰巣を調節することができた。
【００６２】
実験Ｂ
間葉細胞を無菌の１ｃｍ×１ｃｍのカバーガラス上でほぼコンフルエンスまで増殖させて、１０ｎｇｍｌ-1のＴＧＦβ１を含有する処理培地でカバーし、加湿無菌雰囲気と５％ＣＯ2中で１８時間インキュベートした。次にカバーガラスをＰＢＳで洗浄し、こうして作成したＡＢＭＥを２０％血清を有する０．２ｍｌのＩＭＤＭ中２×１０6個のＭＮＣまたは２×１０5個のＣＤ３４+細胞の懸濁物でカバーした。３７℃で１時間後カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、細胞を固定し、ＣＤ３４+特異抗体（クローンＨＰＣＡ１、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）で染色した。結果を図６（ｄ〜ｆ）に示す。結合したＣＤ３４+細胞の数を計測し、ＴＧＦβ１を使用しなかった平行参照実験で結合した同様の細胞の数と比較した。間葉細胞でＴＧＦβ１により生成されたＡＢＭＥは、参照カバーガラスと比較して有意に多い数のＣＤ３４+細胞が結合し、ＡＢＭＥへのこれらの細胞の帰巣は間葉細胞単独より優れていた。図６（ｄ〜ｆ）から、間葉細胞をＴＧＦβ１で処理すると、間葉細胞へのＣＤ３４+細胞の接着が増加することがわかる。
【００６３】
実施例８：移植の調節
図６ｄで見られたＡＢＭＥへのＣＤ３４+細胞の接着が機能的に関連しているかどうか、そしてもしそうならかかる移植を促進するどのような機構がＡＢＭＥにより使用されているかを決定するために、移植実験を行った。
【００６４】
間葉細胞（２４ウェルディッシュ中５×１０4細胞／ウェル）をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。間葉細胞中のαｉｉｂ：β３インテグリンシグナル伝達を選択的に活性化する化学的造血調節物質［ビオチン−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ*−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｔｙｒ−ＯＭｅ）Ａｒｇ−Ｃｙｓ*Ｌｙｓ（Ｃ*−Ｃ*の間で環化した）、１０マイクログラムｍｌ-1、１８時間］を使用してＡＢＭＥを調製した。生成したＡＢＭＥをＰＢＳで２回洗浄し、αｉｉｂ：β３インテグリンの相互作用を阻害する別のペプチド［１−アダマンタンアセチル−Ｃｙｓ*Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃ（Ｃｙｓ*−Ｃｙｓ*の間で環化した）］の存在下または非存在下で、０．２ｍｌのＣＤ３４+ＳＰＣ細胞（１０5ｍｌ-1）の懸濁物で１時間カバーした。インキュベーションの最後に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、造血コロニー形成アッセイ（ＨＣＦＡ）のために処理した。造血コロニー形成のために、結合したＳＰＣを有するＡＢＭＥ細胞をマルチウェルディッシュから採取し、２０％血清、０．８％メチルセルロース、および過剰量の種々の精製およびヒト特異的サイトカイン、および造血コロニー刺激成長因子［ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（バンクーバー、オンタリオ、カナダ）から］を含有する１ｍｌのＩＭＤＭに再懸濁した。さらに詳しくはＨＣＦＡで通常使用される造血成長因子の量は、２国際単位／ミリリットル（２ＩＵ．ｍｌ-1）のエリスロポエチン（ＥＰＯ）、５０ナノグラム／ミリリットル（５０ｎｇ／ｍｌ-1）の幹細胞因子（ＳＣＦ）および２０ナノグラム／ミリリットル（２０ｎｇ／ｍｌ-1）ずつの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）およびインターロイキン−６（ＩＬー６）であった。細胞を造血コロニーが大きくなるまで１２〜１４日間インキュベートした。結果を図７に示す。ペプチド化学調節物質により生成したＡＢＭＥは、有意に多い造血コロニーを生成することができたが、この造血調節物質機能は阻害性ペプチドで阻害され、コロニー数はインヒビター用量依存性に低下した。結果は、αｉｉｂ：β３インテグリン相互作用を介してＡＢＭＥへのＳＰＣにより確立された接触が機能的に関連し、障害された場合はＡＢＭＥの機能を弱めることを明らかに示している。従ってこれらの結果は、造血調節物質によるＡＢＭＥへのＳＰＣの接着の促進は機能的に関連し、インビトロのＳＰＣ移植に等しく、さらにこの移植はインビトロで調節することができることを明らかに示す。
【００６５】
実施例９：系統の運命決定の調節
造血中のＳＰＣの系統の運命決定は、生成される成熟Ｂリンパ球の組成に影響を与える。ＡＢＭＥの適切な使用により２つの系統の成熟血球生成の組成を改変できることを示すために、系統の運命決定実験を行った。
【００６６】
間葉細胞（２４ウェルディッシュ中５×１０4細胞／ウェル）をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。２つの生物学的造血調節物質（ＴＧＦβ１ １０ｎｇｍｌ-1、ｂＦＧＦ １０ｎｇｍｌ-1、１８時間）を別々に使用して、２つのＡＢＭＥを調製した。生成したＡＢＭＥをＰＢＳで２回洗浄し、ＣＤ３４+ＳＰＣ細胞（１０5ｍｌ-1）の懸濁物０．２ｍｌで３７℃で１時間カバーした。次に洗浄後ディッシュのすべての細胞を採取し、ＨＣＦＡで使用した。１４日後、生成した成熟血球を採取し、懸濁物のアリコートを顕微鏡で観察して成熟リンパ系細胞と骨髄系細胞を同定し計測した。結果を図８ａに示す。ｂＦＧＦにより調製したＡＢＭＥを使用した時、より多くのリンパ系細胞が産生され、ＡＢＭＥを調製するためにＴＧＦβ１を使用した時は、より多くの骨髄系細胞生成を支持した。これらの結果は、特異的造血調節物質を選択して調製したＡＢＭＥを使用して、系統の運命決定を調節し、生成された成熟血球中の骨髄系細胞およびリンパ系細胞の組成物または産生を改変できることを明瞭に示す。
【００６７】
この実験は、生成した成熟血球の組成は赤芽球系細胞および骨髄系細胞について改変することができることを証明するために行った。間葉細胞（２４ウェルディッシュ中５×１０4細胞／ウェル）をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。１つのウェルの細胞をカルシウムイオンキレート物質であるＢＡＰＴＡ（５マイクロモル）のジブロモ誘導体で１時間処理したが、別のウェルにはＢＡＰＴＡ誘導体の無い培地のみを加えた。３７℃で１時間インキュベーション後、両方のウェルにＴＧＦβ１を加え（１０ｎｇｍｌ-1）、さらに１８時間インキュベーションを続けた。両方のウェルで生成したＡＢＭＥを洗浄し、ＣＤ３４+ＳＰＣを使用してＨＣＦＡのために使用した。１４日後成熟血球を採取し、赤芽球系および骨髄系系統の細胞について定量した。結果を図８ｂに示す。結果は、ジブロモＢＡＰＴＡ誘導体をＡＢＭＥの生成のために使用すると、ジブロモＢＡＰＴＡを使用しなかった標準実験と比較して、赤芽球系細胞および骨髄系細胞集団の比率の有意な差があることを示した。
【００６８】
実施例１０：細胞生存の調節
ＡＢＭＥが細胞生存を促進する性質を有するかどうかを調べるために実験を行った。ホスホ（セリン４７３）Ａｋｔ／ＰＫＢ、ホスホール−Ｂａｄのような生存促進分子の存在について間葉細胞を調べると、これらの物質が細胞中に非常に少量存在することがわかった。しかし間葉細胞を使用してＡＢＭＥを調製すると、ＡＢＭＥ細胞中ではホスホ（セリン４７３）Ａｋｔ／ＰＫＢ、ホスホ−Ｂａｄ、活性化酸化窒素シンターゼのような生存促進因子の有意なアップレギュレーションがあった。これらの結果は、生存促進因子がＡＢＭＥ中で活性化され、従ってこれらはＡＢＭＥとの接触中にＳＰＣに輸送されることを示す。別のセットの実験では、３アミノベンズアミドを使用してポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの阻害によりＳＰＣ中で生存促進シグナルがアップレギュレートされた。結果を図９（ａ〜ｄ）に示す。結果は、この処理後ＳＰＣは、生成される造血コロニーの数を相乗的に増加させることができ、ＳＰＣ−細胞生存がインビトロで調節できることを示した。
【００６９】
実施例１１：自己再生の調節
実験Ａ
ＭＮＣ中に存在する休止状態の原始前駆体がＡＢＭＥと接触すると刺激されて、混合系統からなる（ＧＥＭＭ）より多くのコロニーを形成するかどうかを調べるために実験を行った。
【００７０】
間葉細胞をＩＭＤＭ＋２０％胎児牛血清でほとんどコンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。生物学的造血調節物質すなわちＴＧＦベータ１（２０ｎｇｍｌ-1）を使用してＡＢＭＥを調製した。生成したＡＢＭＥをＰＢＳで２回洗浄し、非酵素溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で細胞を分離させた。一定数のＭＮＣ（すなわち２×１０5）を種々の用量の分離した間葉細胞（２×１０4、５×１０4、１×１０5）と混合し、１時間インキュベートした。インキュベーションの最後に細胞を造血コロニー形成アッセイ（ＨＣＦＡ）のために処理した。対照間葉細胞に対してＡＢＭＥの細胞を実験で使用すると、ＧＥＭＭコロニー形成の用量依存性上昇が観察された（図１０ａ）。第２にＧＥＭＭ生成の刺激については、最も高い濃度（１×１０5）の間葉細胞より最も低い濃度のＡＢＭＥからの細胞（２×１０4）でより効率的であり、ほぼ１０倍の効率の上昇を示した。
【００７１】
実験Ｂ
ＳＰＣ自己再生の点でＡＢＭＥは利点を有するかどうかを調べるために実験を行った。
【００７２】
間葉細胞を無菌の１ｃｍ×１ｃｍのカバーガラス上でほぼコンフルエンスまで増殖させて、１０ｎｇｍｌ-1のＴＧＦβ１を含有する処理培地でカバーし、加湿無菌雰囲気と５％ＣＯ2中で１８時間インキュベートした。次にカバーガラスをＰＢＳで洗浄し、こうして作成したＡＢＭＥを２０％血清を有する０．２ｍｌのＩＭＤＭ中２×１０5個のＣＤ３４+細胞の懸濁物でカバーした。１時間後、細胞を洗浄し、結合した細胞を０．８％メチルセルロースと成長因子とを含有する２０％血清を有する培地でカバーした。４８時間後のＣＤ３４+細胞の数の変化をＣＤ３４+特異抗体（クローンＨＰＣＡ１、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国）で追跡した。結果を図１０ｂに示す。ＴＧＦβ１を使用しなかった他の実験と比較して、ＡＢＭＥはより多くのＣＤ３４+細胞増殖を支持することがわかった。さらにＡＢＭＥは、間葉細胞と比較して有意に多量の自己再生のプロモーターＪａｇｇｅｄ１を含有することが確定された（図１０ｃ）。
【００７３】
実施例１２：正常な酸素条件下での低酸素症の誘導
具体的な造血調節物質を使用して正常な酸素条件下で低酸素症を作成する可能性を調べるために、これらの実験を行った。
【００７４】
実験Ａ
生物学的調節物質すなわちＴＧＦβ１を使用して上記実験＃１に示した詳細に従って、ＡＢＭＥ生成のために間葉細胞を処理した。所定の時間後細胞を固定し、ＨＩＦ１α（これは低酸素症に関連する特異的転写因子である）に対する抗体を用いて免疫染色した。対照細胞と比較して、ＴＧＦβ１で処理した間葉細胞ではＨＩＦ１αの明瞭な核発現が見られた（図１１ａ）。
【００７５】
実験Ｂ
生物学的調節物質すなわちＴＧＦβ１を使用して上記実施例７（ａ）に示した詳細に従って、ＡＢＭＥ生成のために間葉細胞を処理し、２００μＭのヒポキシ（Ｈｙｐｏｘｙ）プローブ（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、アメリカ合衆国）で４８時間インキュベートした。細胞を固定し、標識物の検出に特異的な抗体を用いて免疫染色した。結果を図１１ｂに示す。ＴＧＦβ１を使用して作成したＡＢＭＥは標識物の高い取り込みを示し、低酸素症条件の存在を示した。
【００７６】
実施例１３：造血機能における適合性についての間葉細胞の評価
実施例８に記載した方法で、ＡＢＭＥ生成における間葉細胞の有用性を評価するために種々の間葉細胞のスクリーニングを行うことができる。結果を図１２に示し、ここで２つの別の骨髄試料から培養した間葉細胞集団と接触した時の造血調節物質の効力が比較される。同じバッチのＳＰＣを使用しある既知の造血調節物質を標準点として維持して、ある間葉細胞試料の「ＡＢＭＥ生成能力」を評価することができる。
【００７７】
実施例１４：造血調節物質のスクリーニング：
実施例８に記載した方法で間葉細胞を使用して、しかし種々の可能な造血調節物質の補助物質を有する処理培地を使用して、新規造血調節物質をスクリーニングすることができる。結果を図１３に示すが、ここでＡＢＭＥ生成について刺激性対阻害性造血調節物質の作用が示される。既知の造血調節物質を標準点として取り込み、同じバッチのＳＰＣを使用するなら、標準造血調節物質に換算してＡＢＭＥを導入する能力について試験物質を評価することができ、陽性／陰性；強力／余り強力ではない／無効な造血調節物質などとして判定される。
【００７８】
本発明で使用された材料：
本発明で使用したすべての材料は市販されている。骨髄、ＳＰＣ、間葉細胞、培養培地、成長因子と分化因子、インターロイキン、血清、抗体のような生物学的物質は、バイオテクノロジー会社、例えばカンブレックス・バイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、アメリカ合衆国；アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、アメリカ合衆国；ギブコビーアールエル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、アメリカ合衆国；シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、アメリカ合衆国；サンタクルツバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アメリカ合衆国；ネオマーカー（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒ）、アメリカ合衆国；ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国；ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、バンクーバー、オンタリオ、カナダ；バッケム（Ｂａｃｈｅｍ）、スイス；アレクシス社（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、スイス；プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アメリカ合衆国；ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、英国などから得た。細胞分離製品は、ダイナール（Ｄｙｎａｌ）、ノルウェー、から；メチルセルロースはシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、アメリカ合衆国から；細胞培養関連プラスチックはベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、アメリカ合衆国；コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）、アメリカ合衆国から；細胞培養関連装置（例えば二酸化炭素インキュベーター）はフォルマ（Ｆｏｒｍａ）、アメリカ合衆国から；光学的装置例えば種々のタイプの顕微鏡はツァイス（Ｚｅｉｓｓ）、ドイツ；オリンパス社（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、日本、およびニコン、日本、から得た。
【００７９】
本発明の利点と工業応用：
本発明の組成はＡＢＭＥの作成に使用され、これは以下：
ａ）自然のまたは人工的造血の異なる工程を調節するのに、
ｂ）健康なおよび疾患の骨髄細胞中の骨髄機能を評価するのに、
ｃ）体内の内因性サイトカインおよび成長／分化因子のレベルに影響を与えることなく、自然の造血を迅速に増強するのに、
ｄ）自己造血を刺激することにより、ＳＰＣ移植で観察される移植片対宿主反応病を最小にまたは排除するのに、
ｅ）適当な遺伝子または分子を導入して新規機能の作成においてインビトロ移植ＳＰＣを使用するのに、
ｆ）インビトロ移植可能なおよび移植不可能なＳＰＣを選択的に破壊するのに、
ｇ）インビトロで１つまたはそれ以上の系統の血球の強い成長を促進するのに、
ｈ）当該分野で公知の方法により骨髄から白血病前駆細胞を排除するのに、
ｉ）正常酸素条件下で細胞の低酸素状態を促進するのに、
ｊ）正常なおよび病的なＳＰＣの休止状態を誘導するのに、
ｋ）造血の１つまたはそれ以上の工程を制御する新しい薬剤を発見するのに、
ｌ）ＳＰＣを非造血細胞の運命に分化またはその逆を可能にする新しい薬剤を発見するのに、
ｍ）新に生成された免疫細胞を、細胞性または抗体性免疫応答により、選択された生物学的標的を破壊するように養成するのに、
ｎ）新に生成された免疫細胞を、自己の正常な標的細胞を避けて自己免疫疾患の弱体作用を防止するように養成するのに、
ｏ）新に生成された免疫細胞を、寛容を誘導して同種組織インプラントを許容するように養成するのに、有用である。
【００８０】
本発明を詳細に説明したが、これは本発明の精神と範囲を逸脱することなく、かつ過度の実験をすることなく、ある広範囲の同等のパラメータ、濃度、および条件内で実施できることを当業者は理解されたい。
本発明を詳細に説明したが、これは本発明の精神と範囲を逸脱することなく、かつ過度の実験をすることなく、ある広範囲の同等のパラメータ、濃度、および条件内で実施できることを当業者は理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａ〜１Ｄ：図１は、異なる種類の培地に単核細胞を蒔いた時の造血コロニーの生成を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｅ：図２Ｂは、ＭＮＣを間葉細胞と混合することによるコロニー形成アッセイの結果を示し、２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅは、それぞれ生物学的、化学的または免疫学的造血調節物質の間葉細胞との接触工程を含めた後の結果を示す。２Ａは、間葉細胞の無いＭＮＣのみから生成されるコロニーの性質を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、それぞれ別々に使用した時ＴＧＦβ１とＦＧＦ−２の使用で効力の等しいＡＢＭＥが生成されることを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、コロニー生成と造血細胞の成長に及ぼす種々の造血調節物質の作用を示す。
【図５】図５は、免疫学的造血調節物質の作用とその効力を示す。
【図６】図６（ａ−ｃ）は、ＡＢＭＥ中に存在する間葉細胞が、適当な造血調節物質で処理されるとＳＤＦ１αのような化学走化性分子の発現量を増加させ、従って遊走または帰巣および接着が増強されることを示す。
【図７】図７は、異なる造血調節物質の適切な組合せを選択することにより造血が調節されることを示す。棒は、一定数のＭＮＣが使用される時生成する造血コロニーと、活性化および阻害性タイプの造血調節物質を使用して間葉細胞で生成されるＡＢＭＥを示す。
【図８】図８（ａ−ｂ）は、適当な造血調節物質で作成したＡＢＭＥをＨＳＰＣに接触させることによる、ＨＳＰＣの系統の運命決定の変化を示す。
【図９】図９（ａ−ｄ）は、細胞生存因子を適当な造血調節物質で処理することによるＡＢＭＥ中の細胞生存因子の増加を示す。
【図１０】図１０（ａ−ｂ）は、適当な造血調節物質を使用することによるＳＰＣの自己再生分裂の上昇を示す。図１０（ｃ）は、自己再生を指示する調製されたＡＢＭＥ細胞中のシグナル伝達分離Ｊａｇｇｅｄ１の発現を上昇を示す。
【図１１】図１１（ａ−ｂ）は、適当な造血調節物質の使用による標準酸素条件下での細胞の低酸素環境の作成を示す。
【図１２】図１２は、ある造血調節物質に接触した時にＡＢＭＥを生成する２つまたはそれ以上のある間葉細胞集団の相対的効力の評価を示す。
【図１３】図１３は、ＡＢＭＥ生成についての刺激性または阻害性造血調節物質のスクリーニングを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰＣ機能と骨髄プロセスのいくつかの工程を調節するための人工的骨髄様環境（ＡＢＭＥ）を開発するための組成物であって：
ａ］間葉細胞の培養物；
ｂ］細胞内シグナル伝達を活性化することができる造血調節物質または複数の調節物質、ここで当該造血調節物質は、例えば生物学的物質、化学的物質、免疫調節剤、およびこれらの１つまたはそれ以上の適当な組合せよりなる群から選択される；
ｃ］適当な血清（例えばＦＢＳまたはヒト血清；５〜３０％）または他の血清代替物を補足し、および場合により造血調節物質、メチルセルロース、エリスロポエチン、造血成長および分化因子、インターロイキン１ベータ、インターロイキン３、およびインターロイキン６を補足した、イスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ最少基本培地（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０のような哺乳動物細胞の培養に適した培地から選択される処理培地、適用培地または接触培地；
ｄ］追加の細胞外マトリックスまたは２つまたはそれ以上の次元でマトリックスを形成することができるその模倣物の成分を含む細胞の支持体
を含む組成物。
【請求項２】
処理培地、適用培地または接触培地は、１つまたはそれ以上の造血調節物質、胎児牛血清もしくは哺乳動物源（５〜３０％）から選択される血清、または適当な血清代替物、エリスロポエチンもしくはその模倣物：２ＩＵ／ｍｌの精製された成長因子および分化因子、および濃度範囲１〜１０ナノモルで使用されるインターロイキン、および０．８％メチルセルロースを補足されたＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０のような哺乳動物細胞の培養に適した培地を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
造血調節物質は以下の表Ｉに記載された調節物質から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物：
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【請求項４】
間葉細胞は哺乳動物の胎児、好ましくはヒト起源の胎児から得られた組織から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
間葉細胞は哺乳動物起源、好ましくはヒト起源の臍帯血と胎盤から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
間葉細胞は哺乳動物、好ましくはヒト起源の腸骨稜、肋骨、大腿骨、または任意の他の適当な骨試料から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
人工的骨髄環境の作成及び本明細書に記載の種々の目的のためのその使用であって：
ｉ）好ましくは胎児牛血清および場合によりメチルセルロースとエリスロポエチンを補足したイスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ最小基本培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０から選択される哺乳動物細胞の培養に適した増殖培地で間葉細胞を得て増殖させる工程、
ii）上記ｉ）で調製された間葉細胞に、請求項３に記載の造血調節物質または複数の調節物質を少なくとも３０分間接触させて、こうして間葉細胞を活性化してＡＢＭＥを生成する工程、
iii）場合により、工程ii）のＡＢＭＥ細胞を洗浄して造血調節物質を除去する工程、
iv）工程７．iii）で作成されたＡＢＭＥの細胞に、ＳＰＣをそのまままたは場合によりこれらをプライミング造血調節物質で処理した後に接触させて、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ移植、ＳＰＣ自己再生のような特徴を有する造血を活性化し、骨髄様環境でインビトロで存在するような血球を強固に生成する工程、
ｖ）場合により、工程ivで得られたＳＰＣを新鮮なＡＢＭＥと１回またはそれ以上のサイクルの接触で処理して、ＳＰＣ集団および運命決定された前駆体を漸次拡張し、より大きな利点を達成する工程、
を含むことを特徴とする方法及び使用。
【請求項８】
骨髄組織または複数の組織に造血調節物質を接触させてそのＡＢＭＥ関連性質を改良することにより、骨髄組織または複数の組織をインビトロで回復させる方法。
【請求項９】
請求項１の組成物と請求項７の方法に従いインビトロでＡＢＭＥをまず調製し、これを、外科の分野の公知の方法により受容者に移植することによる、天然の組織中の骨髄環境を調節する方法。
【請求項１０】
造血調節物質として使用するための新しい生物学的、化学的または免疫学的物質を発見するための方法。
【請求項１１】
インビトロでＡＢＭＥを生成する相対的効力において、間葉細胞を与えることができる複数の組織試料を比較する方法。
【請求項１２】
請求項３から選択される適当な造血調節物質で調製されるＡＢＭＥを使用して、ＳＰＣの休止状態を誘導する方法。
【請求項１３】
正常なＳＰＣと病的ＳＰＣとを区別する方法。
【請求項１４】
ＳＰＣの骨髄集団から白血病前駆体を追い出す方法。
【請求項１５】
正常な酸素条件下で間葉細胞の低酸素状態を誘導し維持する方法。
【請求項１６】
インビトロで血球生成を制御するための人工的骨髄環境（ＡＢＭＥ）を作成するのに有用なキットであって：
ａ）生物学的、化学的または免疫学的物質である１つまたはそれ以上の造血調節物質、
ｂ）ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液、ＩＭＤＭを含む造血調節物質の希釈剤、
ｃ）間葉細胞を培養するのに適した培地、例えば成長補助物質を補足したダルベッコー培地、ＲＰＭＩ−１６４０、ＩＭＤＭ、
ｄ）リン酸緩衝化生理食塩水またはＩＭＤＭのような使用された造血調節物質を除去するのに有用な水溶液、
ｅ）ＡＢＭＥの細胞を採取するのに有用な、および／またはさらなる使用のために活性化ＳＰＣをリサイクルするのに有用な溶液、例えばタンパク質分解酵素、インヒビター、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液、
ｆ）幹前駆細胞をプライムするための造血調節物質の溶液、
ｇ）プライムした幹前駆細胞を使用する前にプライミング物質を除去するための洗浄溶液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水またはＩＭＤＭ、
ｈ）ＡＢＭＥの支持鋳型または足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ＡＢＭＥの細胞、造血促進成長因子、分化因子および生存因子、増殖培地、および随時メチルセルロース、血清を含む、インビトロの血球生成のための培地、および
ｉ）指示のマニュアル
を含むキット。
【請求項１７】
請求項５に記載のキットであって、造血調節物質のための希釈剤、造血調節物質を間葉細胞に接触させてＡＢＭＥを作成するのに適した培地、使用された造血調節物質を除去するのに有用な溶液、ＡＢＭＥの細胞および／または活性化ＳＰＣを採取するための溶液、ＳＰＣをさらにＡＢＭＥと相乗作用できるようにするプライミング物質として作用する造血調節物質の溶液、その使用後のプライミング物質を除去するために洗浄溶液、インビトロ移植、ＳＰＣ活性化、ＳＰＣ自己再生、および強い血球生成を促進するためのＡＢＭＥにプライムしたＳＰＣを接触させるための培地、をさらに含むキット。
【請求項１】
ＳＰＣ機能と骨髄プロセスのいくつかの工程を調節するための人工的骨髄様環境（ＡＢＭＥ）を開発するための組成物であって：
ａ］間葉細胞の培養物；
ｂ］細胞内シグナル伝達を活性化することができる造血調節物質または複数の調節物質、ここで当該造血調節物質は、例えば生物学的物質、化学的物質、免疫調節剤、およびこれらの１つまたはそれ以上の適当な組合せよりなる群から選択される；
ｃ］適当な血清（例えばＦＢＳまたはヒト血清；５〜３０％）または他の血清代替物を補足し、および場合により造血調節物質、メチルセルロース、エリスロポエチン、造血成長および分化因子、インターロイキン１ベータ、インターロイキン３、およびインターロイキン６を補足した、イスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ最少基本培地（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０のような哺乳動物細胞の培養に適した培地から選択される処理培地、適用培地または接触培地；
ｄ］追加の細胞外マトリックスまたは２つまたはそれ以上の次元でマトリックスを形成することができるその模倣物の成分を含む細胞の支持体
を含む組成物。
【請求項２】
処理培地、適用培地または接触培地は、１つまたはそれ以上の造血調節物質、胎児牛血清もしくは哺乳動物源（５〜３０％）から選択される血清、または適当な血清代替物、エリスロポエチンもしくはその模倣物：２ＩＵ／ｍｌの精製された成長因子および分化因子、および濃度範囲１〜１０ナノモルで使用されるインターロイキン、および０．８％メチルセルロースを補足されたＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０のような哺乳動物細胞の培養に適した培地を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
造血調節物質は以下の表Ｉに記載された調節物質から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物：
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【請求項４】
間葉細胞は哺乳動物の胎児、好ましくはヒト起源の胎児から得られた組織から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
間葉細胞は哺乳動物起源、好ましくはヒト起源の臍帯血と胎盤から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
間葉細胞は哺乳動物、好ましくはヒト起源の腸骨稜、肋骨、大腿骨、または任意の他の適当な骨試料から得られることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
人工的骨髄環境の作成及び本明細書に記載の種々の目的のためのその使用であって：
ｉ）好ましくは胎児牛血清および場合によりメチルセルロースとエリスロポエチンを補足したイスコブ改変ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ最小基本培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０から選択される哺乳動物細胞の培養に適した増殖培地で間葉細胞を得て増殖させる工程、
ii）上記ｉ）で調製された間葉細胞に、請求項３に記載の造血調節物質または複数の調節物質を少なくとも３０分間接触させて、こうして間葉細胞を活性化してＡＢＭＥを生成する工程、
iii）場合により、工程ii）のＡＢＭＥ細胞を洗浄して造血調節物質を除去する工程、
iv）工程７．iii）で作成されたＡＢＭＥの細胞に、ＳＰＣをそのまままたは場合によりこれらをプライミング造血調節物質で処理した後に接触させて、ＳＰＣ帰巣、ＳＰＣ移植、ＳＰＣ自己再生のような特徴を有する造血を活性化し、骨髄様環境でインビトロで存在するような血球を強固に生成する工程、
ｖ）場合により、工程ivで得られたＳＰＣを新鮮なＡＢＭＥと１回またはそれ以上のサイクルの接触で処理して、ＳＰＣ集団および運命決定された前駆体を漸次拡張し、より大きな利点を達成する工程、
を含むことを特徴とする方法及び使用。
【請求項８】
骨髄組織または複数の組織に造血調節物質を接触させてそのＡＢＭＥ関連性質を改良することにより、骨髄組織または複数の組織をインビトロで回復させる方法。
【請求項９】
請求項１の組成物と請求項７の方法に従いインビトロでＡＢＭＥをまず調製し、これを、外科の分野の公知の方法により受容者に移植することによる、天然の組織中の骨髄環境を調節する方法。
【請求項１０】
造血調節物質として使用するための新しい生物学的、化学的または免疫学的物質を発見するための方法。
【請求項１１】
インビトロでＡＢＭＥを生成する相対的効力において、間葉細胞を与えることができる複数の組織試料を比較する方法。
【請求項１２】
請求項３から選択される適当な造血調節物質で調製されるＡＢＭＥを使用して、ＳＰＣの休止状態を誘導する方法。
【請求項１３】
正常なＳＰＣと病的ＳＰＣとを区別する方法。
【請求項１４】
ＳＰＣの骨髄集団から白血病前駆体を追い出す方法。
【請求項１５】
正常な酸素条件下で間葉細胞の低酸素状態を誘導し維持する方法。
【請求項１６】
インビトロで血球生成を制御するための人工的骨髄環境（ＡＢＭＥ）を作成するのに有用なキットであって：
ａ）生物学的、化学的または免疫学的物質である１つまたはそれ以上の造血調節物質、
ｂ）ジメチルスルホキシド、リン酸緩衝液、ＩＭＤＭを含む造血調節物質の希釈剤、
ｃ）間葉細胞を培養するのに適した培地、例えば成長補助物質を補足したダルベッコー培地、ＲＰＭＩ−１６４０、ＩＭＤＭ、
ｄ）リン酸緩衝化生理食塩水またはＩＭＤＭのような使用された造血調節物質を除去するのに有用な水溶液、
ｅ）ＡＢＭＥの細胞を採取するのに有用な、および／またはさらなる使用のために活性化ＳＰＣをリサイクルするのに有用な溶液、例えばタンパク質分解酵素、インヒビター、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶液、
ｆ）幹前駆細胞をプライムするための造血調節物質の溶液、
ｇ）プライムした幹前駆細胞を使用する前にプライミング物質を除去するための洗浄溶液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水またはＩＭＤＭ、
ｈ）ＡＢＭＥの支持鋳型または足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）、ＡＢＭＥの細胞、造血促進成長因子、分化因子および生存因子、増殖培地、および随時メチルセルロース、血清を含む、インビトロの血球生成のための培地、および
ｉ）指示のマニュアル
を含むキット。
【請求項１７】
請求項５に記載のキットであって、造血調節物質のための希釈剤、造血調節物質を間葉細胞に接触させてＡＢＭＥを作成するのに適した培地、使用された造血調節物質を除去するのに有用な溶液、ＡＢＭＥの細胞および／または活性化ＳＰＣを採取するための溶液、ＳＰＣをさらにＡＢＭＥと相乗作用できるようにするプライミング物質として作用する造血調節物質の溶液、その使用後のプライミング物質を除去するために洗浄溶液、インビトロ移植、ＳＰＣ活性化、ＳＰＣ自己再生、および強い血球生成を促進するためのＡＢＭＥにプライムしたＳＰＣを接触させるための培地、をさらに含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５３１１６６（Ｐ２００８−５３１１６６Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５７６０２（Ｐ２００７−５５７６０２）
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２２４９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９２６５０
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０７２９３８３７）ナショナル センター フォー セル サイエンシズ (1)
【出願人】（５０７２９３８４８）タタ インスティテュート オブ ファンダメンタル リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００２２４９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９２６５０
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０７２９３８３７）ナショナル センター フォー セル サイエンシズ (1)
【出願人】（５０７２９３８４８）タタ インスティテュート オブ ファンダメンタル リサーチ (1)
【Ｆターム（参考）】
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