脂質代謝改善剤
【課題】 長期間摂取しても安全な脂質代謝改善剤を提供することを課題とする。
【解決手段】 グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、下記の特徴を有する分岐α−グルカン：
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンを含有する脂質代謝改善剤を提供することによって上記課題を解決する。
【解決手段】 グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、下記の特徴を有する分岐α−グルカン：
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンを含有する脂質代謝改善剤を提供することによって上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐α−グルカンを有効成分とする脂質代謝改善剤に関し、詳細には、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカン、及び、マルトース及びグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、α−グルコシル転移することによって、当該分岐α−グルカンを生成する分岐α−グルカンを含んでなる脂質代謝改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活や生活習慣の洋風化に伴い、高カロリー、高脂肪食を摂取する機会が増えて、高脂血症、さらには、肥満乃至標準体重を超過した過体重のヒトが増加している。肥満や過体重に加えて、高血圧や高脂血症などの生活習慣病の因子を有する場合は、メタボリックシンドロームと呼ばれ、その状態が継続すると、心筋梗塞、脳卒中、ＩＩ型糖尿病などの心血管性疾患を発症するリスクが増大するといわれており、これらを回避するためにも、脂質代謝をコントロールすることは、ますます重要になってきている。脂質代謝を改善して、体重の超過を抑制及び／又は予防するために一般に栄養士によって提唱されている方法としては、低カロリーまたは低脂肪養生法が知られている。また、脂質代謝改善に訴求した食品も市販されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、低カロリー食は風味が単調であるために長期間経つとその人によって拒絶される場合がある。また、健康補助食品にあっても、その味質や食感などに問題があり、これらを長期間継続することはできない場合などには、そのリバウンドがおこり、これらの療法を開始前するよりも脂質代謝が増悪する結果となったり、健康に障害がでる場合すら認められる。
【０００３】
近年、高脂血症やメタボリックシンドロームの予防乃至改善用の食品素材として、食物繊維が注目されている。食物繊維とは、本来、動物が消化し難いセルロース、リグニン、ヘミセルロース、ペクチンなど植物細胞成分を意味するものの、広義には、アミラーゼで消化されない難消化性の水溶性多糖類も含まれ、これらは水溶性食物繊維と呼ばれている。近年、食物繊維は、その本来の機能としての整腸作用、血中コレステロール低下作用、血糖調節作用などに加えて、腸内フローラを改善するプレバイオティクスとしての機能も注目されつつある。しかしながら、食物繊維はカルシウムと並んで日本人の食生活で不足している栄養素と言われており、現在の日本人の平均的な食物繊維摂取量は、平成６年に出された第５次改定「日本人の栄養所要量」において示された食物繊維の目標摂取量２０〜２５ｇ／日に対し、目標の５〜８割にしか達していないことが指摘されている（例えば、非特許文献１などを参照）。このような状況下、各種飲食物の原料として利用でき、且つ、水溶性食物繊維として有用な難消化性の多糖類が種々提案されている。
【０００４】
例えば、水溶性食物繊維として、難消化澱粉（湿熱処理ハイアミロースコーンスターチ）、グァーガム分解物、グルコマンナン、低分子アルギン酸など、自然界に存在する多糖を原料とするものが市場に流通している。しかしながら、これらはいずれも粘性が高く、食品に添加した場合、風味・食感を損なうなどの欠点を有することから、その利用は一部に限定されている。一方、低粘度の水溶性食物繊維として、ポリデキストロース（米国ファイザー社が開発）や難消化性デキストリンが食品分野で広く利用されている。ポリデキストロースは、グルコースとソルビトール及びクエン酸を高真空下で加熱し、化学的な反応により重合させて得られる合成多糖であり、グルコースが１，２、１，３、１，４、１，６、１，２，６、１，４，６位などでグルコシド結合した複雑な分岐を有することが知られている。また、難消化性デキストリンは、化学的な反応により澱粉を分解すると同時に転移や逆合成反応を起こさせ、澱粉が本来有さない、１，２、１，３、１，２，４、１，３，４の各グルコシド結合を導入することにより消化性を低減させた合成多糖である。この難消化性デキストリンは、澱粉に少量の塩酸を添加し、粉末の状態で加熱して得た焙焼デキストリンを水に溶解し、α−アミラーゼを添加して加水分解して得られた低粘度溶液を精製し、濃縮、噴霧乾燥して製造されている。難消化性デキストリンには、さらに消化性を低減させる目的で、グルコアミラーゼを添加して可消化部分をグルコースにまで分解し、グルコースを分離除去して同様に精製、噴霧乾燥して製造した製品もある。これらポリデキストロースや難消化性デキストリンに導入された新たなグルコシド結合はα−及びβ−の両アノマー型が共に含まれ、さらに還元末端グルコース残基は部分的に１，６−アンヒドロ−グルコースに変化していると言われている（例えば、非特許文献２などを参照）。しかしながら、難消化性デキストリンは、原料澱粉からの収率が低く、加えて、着色し易く、工業生産する上で大きな欠点となっている。また、ポリデキストロースや難消化性デキストリンも、これら単独では、十分な脂質代謝改善効果が得られない場合もある。
【０００５】
グルカンにおけるグルコースの結合様式であるグルコシド結合（以下、本明細書では「グルコシド結合」を単に「結合」と略称する。）の内、α−１，６結合はα−１，４結合に比べてアミラーゼで分解され難いことから、α−１，６結合を多く含むグルカンにも水溶性食物繊維としての用途が期待できる。例えば、乳酸菌に属するロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のデキストランスクラーゼ（ＥＣ ２．４．１．５）によりスクロースを原料として製造されるデキストランは、グルコースが主にα−１，６結合で重合したグルカンであって、α−１，２結合及びα−１，３結合の分岐を有する場合もある。ロイコノストック・メセンテロイデス Ｂ−５１２Ｆ株由来のデキストランスクラーゼを用いた場合、得られるデキストランにおける結合のα−１，６結合の含量は９０％以上にもなり、難消化性であることが期待される。しかしながら、デキストランは、スクロースからの収率が低く、また、粘性が高いため精製操作が煩雑で、コスト高になることから、水溶性食物繊維として利用しようとする試みはほとんど行われていない。
【０００６】
また、安価な澱粉にアミラーゼを作用させ、主としてα−１，４結合を分解することによりα−１，６結合の含量を高めて水溶性食物繊維を調製しようとする試みも為されている。特許文献２には、澱粉液化液に、α−アミラーゼとβ−アミラーゼの混合物を作用させた後、残存するデキストリン部を回収することにより、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合を１０〜２０％に高めた分岐デキストリンを調製する方法が提案されている。しかしながら、この分岐デキストリンは、澱粉が本来持つ分岐（α−１，６結合）を保持しつつ、グルコースがα−１，４結合で連なった直鎖部分を取り除くことでα−１，６結合の割合を高めるという方法で製造されるため、原料澱粉からの収率が低く、また、大幅な消化性の低減が期待できないなどの課題がある。また、澱粉部分分解物（デキストリン）に作用しα−１，６結合を導入する酵素として、デキストリンデキストラナーゼ（ＥＣ ２．１．１．２）が知られている（例えば、非特許文献３を参照）。デキストリンデキストラナーゼは、澱粉部分分解物に作用し、主としてα−１，６グルコシル転移反応を触媒することにより、デキストラン構造（グルコースがα−１，６結合で連なった構造）を生成する酵素であるものの、従来から知られている、酢酸菌に属するアセトバクター・カプスラタム(Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ)由来のデキストリンデキストラナーゼは、α−１，６結合の導入割合が少ない（例えば、非特許文献４などを参照）こと、また、酵素自体の安定性が低いことなどの問題点があり、現実に使用されるに至っていない。このような状況下、従来の難消化性グルカンの持つ上記のごとき物性的な問題を解決でき、且つ、脂質代謝改善作用に優れた新規難消化性グルカン（食物繊維）を含有する脂質代謝改善剤の提供が強く望まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３１５３７９号公報
【特許文献２】特開２００１−１１１０１号公報
【非特許文献１】『食物繊維の市場動向を探る』、「食品と開発」、第３４巻、第２号、第２４乃至２７頁（１９９９年）
【非特許文献２】『低分子水溶性食物繊維』、食品成分シリーズ「食物繊維の科学」、第１１６頁乃至１３１頁、朝倉書店（１９９７年）
【非特許文献３】山本一也ら、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー』、第５６巻、(１９９２年)、第１６９頁乃至１７３頁
【非特許文献４】鈴木雅之ら、「ジャーナル・オブ・アプライド・グリコサイエンス(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、第４８巻、第２号、第１４３頁乃至１５１頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、長期間摂取しても安全な、食物繊維を含有する脂質代謝改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを原料（基質）とし、分岐（本明細書において、「分岐」とは、グルカンにおけるグルコースの結合様式の内、α−１，４結合以外のグルコースの結合様式を意味する）を比較的多く有する分岐α−グルカンを広く探索した。その結果、土壌から単離した微生物、ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株が産生する新規なα−グルコシル転移酵素を、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用させたときに生成する下記に示す特徴を有するα−１，４、α−１，６、α−１，３、α−１，４，６及びα−１，３，６結合を有する分岐α−グルカンが、原料α−１，４グルカンに比べて、α−１，６結合の割合が大幅に増加しており、且つ、α−１，３及びα−１，３，６結合を有し、顕著な難消化性を示す水溶性食物繊維であり、これを配合した組成物が、脂質代謝改善剤として有用であることを見出した。さらに、当該分岐α−グルカンは、意外にも、固状の組成物の形態で摂取するよりも液状の組成物の形態で摂取する方が、分岐α−グルカンの配合割合を少なくしても、その生理機能を効果的に発揮できることを見出して本発明を完成した。
【００１０】
当該分岐α−グルカンの特徴：
メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である。
【００１１】
すなわち、本発明は、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンを配合した脂質代謝改善剤、とりわけ、液液の形態の脂質代謝改善剤を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、脂質代謝を効果的に改善することができるので、血中インスリンの上昇、血中脂質の増加、内臓脂肪の蓄積などを効果的に抑制乃至予防することができる。また、本発明の脂質代謝改善剤は、長期間摂取しても副作用の心配がなく安心して使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で言うグルカンとは、グルコースを構成糖とするグルコース重合度３以上のオリゴ糖ないしは多糖を意味する。本発明で使用する分岐α−グルカンは、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする。
【００１４】
本発明でいうメチル化分析とは、多糖又はオリゴ糖においてこれを構成する単糖の結合様式を決定する方法として一般的に知られている方法である。メチル化分析をグルカンにおけるグルコースの結合様式の分析に用いる場合、まず、グルカンを構成するグルコース残基における全ての遊離の水酸基をメチル化し、次いで、完全メチル化したグルカンを加水分解する。次いで、加水分解により得られたメチル化グルコースを還元してアノマー型を消去したメチル化グルシトールとし、さらに、このメチル化グルシトールにおける遊離の水酸基をアセチル化することにより部分メチル化グルシトールアセテート（以下、本明細書では、「部分メチル化グルシトールアセテート」におけるアセチル化された部位と「グルシトールアセテート」の表記を省略して、「部分メチル化物」と略称する場合がある。）を得る。得られる部分メチル化物を、ガスクロマトグラフィーで分析することにより、グルカンにおいて結合様式がそれぞれ異なるグルコース残基に由来する各種部分メチル化物は、ガスクロマトグラムにおける全ての部分メチル化物のピーク面積に占めるピーク面積の百分率（％）で表すことができる。そして、このピーク面積％から当該グルカンにおける結合様式の異なるグルコース残基の存在比、すなわち、各グルコシド結合の存在比率を決定することができる。本願明細書においては、部分メチル化物についての「比」は、メチル化分析のガスクロマトグラムにおけるピーク面積の比を意味し、部分メチル化物についての「％」はメチル化分析のガスクロマトグラムにおける「面積％」を意味するものとする。
【００１５】
上述した（１）における、２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，６−トリメチル化物」と略称する）とはＣ−４位が１，４結合にあずかるグルコース残基を意味し、２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，４−トリメチル化物」と略称する）はＣ−６位が１，６結合にあずかるグルコース残基を意味する。そして、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：０．６乃至１：４の範囲にある」とは、すなわちメチル化分析における部分メチル化グルシトールアセテートのガスクロマトグラムにおいて、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計に対するＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の割合が３７．５乃至８０．０％の範囲を示すことを意味する。
【００１６】
上述した（２）における、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との合計が部分メチル化物の６０％以上を占める」とは、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計がグルカンを構成する全グルコース残基の６０％以上を占めることを意味する。
【００１７】
同様に、上述した（３）における、「２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトール」（以下、「２，４，６−トリメチル化物」と略称する）とは、Ｃ−３位が１，３結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４，６−トリメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上１０％未満である」とは、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位のみが結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上１０％未満存在することを意味する。
【００１８】
さらに同様に、上述した（４）における「２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトール」（以下、「２，４−ジメチル化物と略称する」）とは、Ｃ−３位及びＣ−６位の両方がそれぞれ１，３結合と１，６結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４−ジメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上である」とは、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位とＣ−６位が結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上存在することを意味する。
【００１９】
上記の（１）乃至（４）の条件を全て充足する本発明で使用する分岐α−グルカンは、これまで知られていない新規なグルカンである。本発明で使用する分岐α−グルカンは、メチル化分析において、上記（１）乃至（４）の条件を充足する限り、グルコース残基の結合順序は特に限定されない。
【００２０】
本発明で使用する分岐α−グルカンは、通常、様々なグルコース重合度を有する分岐α−グルカンの混合物の形態にあり、そのグルコース重合度は、通常、１０以上である。また、本発明で使用する分岐α−グルカンにおいて、その重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は、通常、２０未満である。
【００２１】
さらに、本発明で使用する分岐α−グルカンは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−１，２、α−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれの結合であっても加水分解する特徴を有するイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）を作用させると、消化物の固形物当たりイソマルトースを、通常、２５質量％以上５０質量％以下生成する。
【００２２】
また、本発明で使用する分岐α−グルカンは、平成８年５月厚生省告示第１４６号の栄養表示基準、「栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）」における第８項、「食物繊維」に記載された、「高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）」に準じて水溶性食物繊維含量を求めると、水溶性食物繊維を、通常、４０質量％以上含有する。上記高速液体クロマトグラフ法（以下、本明細書では「酵素−ＨＰＬＣ法」と略称する）の概略を説明するならば、試料を熱安定α−アミラーゼ、プロテアーゼ及びアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）による一連の酵素処理により分解処理し、イオン交換樹脂により処理液から蛋白質、有機酸、無機塩類を除去することにより高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用の試料溶液を調製する。次いで、ゲル濾過ＨＰＬＣに供し、クロマトグラムにおける、未消化グルカンとグルコースのピーク面積を求め、それぞれのピーク面積と、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法により求めておいた試料溶液中のグルコース量を用いて、試料の水溶性食物繊維含量を算出する方法である。本法の詳細については後述の実験の項で説明する。
【００２３】
本発明で使用する分岐α−グルカンは、後述する実験１９−２乃至１９−４に示すように、経口摂取しても唾液α−アミラーゼ、膵液α−アミラーゼや小腸粘膜酵素（小腸粘膜α−グルコシダーゼ）による分解を受け難いことから、消化吸収されにくく、血糖を急激に上昇させたり、インスリンの分泌を刺激することの少ない、低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。また、当該分岐α−グルカンは、口腔内の微生物によって、酸発酵を起こし難く、スクロースと併用した場合にも歯垢の原因となる不溶性デキストランの生成を抑制する作用を有しているので、低う蝕性又は抗う蝕性糖質としても有利に利用できる。さらに、実験１５−５に示すように、当該分岐α−グルカンは、マウスを用いた急性毒性試験において、何ら毒性を示さないグルカンである。
【００２４】
さらに、当該分岐α−グルカンは、後述する実験２０及び２１に示すように、通常の澱粉質とともに摂取すると、澱粉質のみを摂取した場合に比べ、血糖値やインスリンの上昇を抑制する生理作用を有していることから、血糖上昇抑制剤として使用することもできる。
【００２５】
またさらに、上記生理作用に加えて、当該分岐α−グルカンは、後述する実験２２に示すように、摂取することにより、血中の中性脂肪やコレステロールの上昇を抑制する作用を有していることから、脂質代謝改善剤として使用することができる。さらに、当該分岐α−グルカンは、内臓脂肪の蓄積を抑制する作用を有していることから、内臓脂肪蓄積抑制剤、さらには、腹囲の増加抑制剤、メタボリツクシンドロームの予防剤乃至治療剤としても有利に利用できる。
【００２６】
当該分岐α−グルカンを脂質代謝改善剤の有効成分として用いる場合、分岐α−グルカンは、水溶性食物繊維含量が高いものほど作用効果に優れていることから、水溶性食物繊維として、通常、４０質量％以上、望ましくは、５０質量％以上、さらに望ましくは、６０質量％以上含有するものが好適に利用できる。
【００２７】
本発明で使用する分岐α−グルカンの調製に使用するα−グルコシル転移酵素とは、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、実質的に加水分解することなくα−グルコシル転移を触媒することにより、本発明で使用する分岐α−グルカンを生成する酵素を意味する。当該α−グルコシル転移酵素は、加水分解活性が弱い点、低濃度から高濃度まで基質溶液の濃度に依存せず効率の良い転移活性を有する点、及び、α−１，３及びα−１，３，６結合をも生成する点で、従来公知の真菌由来α−グルコシダーゼや酢酸菌由来デキストリンデキストラナーゼとは異なる酵素である。
【００２８】
α−グルコシル転移酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。マルトースを最終濃度１ｗ／ｖ％となるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液５ｍｌに、酵素液０．５ｍｌを加え４０℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．５ｍｌと５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより反応停止させた後、反応液中のグルコース量を、常法に従ってグルコース・オキシダーゼ法で測定し、反応によって生成したグルコース量を算出する。α−グルコシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【００２９】
本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の１つの具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定；
【００３０】
また、このα−グルコシル転移酵素の別の具体例としては、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、約５０℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定；
【００３１】
これらのα−グルコシル転移酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として微生物が挙げられ、とりわけ、本発明者らが土壌より単離した微生物ＰＰ７１０株又はＰＰ３４９株が好適に用いられる。以下、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の産生能を有する微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株の同定試験において判明した菌学的諸性質を表１及び２にそれぞれ示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
以上の菌学的性質に基づき、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８６年）、及び、『リボソーマルデータベース』（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を参考にして、微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株と公知菌との異同をそれぞれ検討した。その結果、微生物ＰＰ７１０株は、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）に属する微生物であり、微生物ＰＰ３４９株は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する微生物であることが判明した。本発明者等は、これら２菌株をそれぞれ、新規微生物バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９と命名し、いずれも平成１８年２月１日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、それぞれ受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１及びＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０として受託された。本発明で使用するα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物には、上記菌株はもとより、上記菌株に突然変異を誘発し、選抜して得られる酵素高産生変異株なども包含される。
【００３５】
α−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３６】
α−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養、半連続培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００３７】
このようにしてα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養した後、α−グルコシル転移酵素を含む培養物を回収する。α−グルコシル転移酵素活性は、培養微生物がバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）のいずれの場合も、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液はそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００３８】
さらに、α−グルコシル転移酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、α−グルコシル転移酵素を斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００３９】
上記のように本発明で使用するα−グルコシル転移酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、調製用電気泳動などの方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。
【００４０】
α−グルコシル転移酵素の基質となるグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、及びマルトース以上のマルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレーテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９、以下、本明細書では「ＣＧＴａｓｅ」と略称する）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。さらには、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切酵素を作用させることも随意である。澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であってもよい。澱粉から本発明で使用する分岐α−グルカンを製造するに際しては、上記のような原料澱粉を、通常、糊化及び／又は液化して用いるのが好適である。澱粉の糊化・液化の方法自体は、公知の方法を採用することができる。さらに、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の基質は、エーテル化澱粉（ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、酢酸澱粉など）、エステル化澱粉（リン酸化澱粉、オクテニルコハク酸澱粉など）及び架橋澱粉（アセチル化アジピン酸架橋澱粉、リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉など）など、澱粉の一部を化学的方法により誘導体化した化工澱粉であってもよい。
【００４１】
α−グルコシル転移酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．５％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の反応は進行して分岐α−グルカンを生成する。工業的には、基質濃度は１％（ｗ／ｖ）以上、望ましくは５乃至６０％（ｗ／ｖ）、更に望ましくは、１０乃至５０％（ｗ／ｖ）の範囲から選ばれる濃度が好適であり、この条件下で、本発明で使用する分岐α−グルカンを有利に生成させることができる。反応温度は反応が進行する温度、すなわち６０℃付近までの温度で行えばよい。好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４乃至８の範囲、好ましくはｐＨ５乃至７の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００４２】
例えば、澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に、α−グルコシル転移酵素を作用させた場合の分岐α−グルカンの生成メカニズムは、以下のように推察される。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらも、α−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する本発明で使用する分岐α−グルカンを生成する。
【００４３】
また、α−グルコシル転移酵素産生能を有するバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）は、その培養物中に本発明で使用するα−グルコシル転移酵素のみならず、ある種のアミラーゼをも同時に産生し、意外にも、α−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用してマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用させると、α−グルコシル転移酵素を単独で作用させた場合よりも水溶性食物繊維含量を更に高めた分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【００４４】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）が産生するアミラーゼとしては、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
（１）作用
澱粉を加水分解するとともにグリコシル基の転移を触媒し、シクロデキストリンをも生成する。プルランを加水分解しパノースを生成する；
（２）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、５８，０００±１０，０００ダルトン；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５５℃；
（４）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下で６乃至７；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定、
ｐＨ６．０、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下で５０℃まで安定；及び
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ６．０〜８．０の範囲で安定；
【００４５】
本発明で使用する分岐α−グルカンを調製する際に、α−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させた場合に得られる分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量が、α−グルコシル転移酵素のみを用いて調製した分岐α−グルカンの場合よりも高い理由としては、α−グルコシル転移酵素の作用で生成する分岐α−グルカンに対し、アミラーゼがさらにグリコシル基を転移し、グルカンにおける分岐の程度（頻度）をさらに高めたものと推察される。
【００４６】
また、酵素反応によって当該分岐α−グルカンを調製する際、他の公知のアミラーゼを併用して反応させることにより、分岐α−グルカンの分子量分布を調節することも、また、消化性をさらに低減した分岐α−グルカンにすることも、さらには還元力を低減することも有利に実施できる。例えば、澱粉液化液に、α−グルコシル転移酵素とともに、α−アミラーゼやＣＧＴａｓｅなど、澱粉の内部のα−１，４結合を加水分解し、新たな非還元末端グルコース残基を生じさせる酵素を併用して作用させることにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させ消化性の低減に寄与するα−１，３、α−１，６及びα−１，３，６結合の割合をさらに増加させることも有利に実施できる。また、イソアミラーゼなどの澱粉枝切り酵素を併用することにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させたり、特開平７−１４３８７６号公報などに開示された非還元性糖質生成酵素（別名：マルトオリゴシルトレハロース生成酵素（ＥＣ ５．４．９９．１５））を併用することにより、還元末端部分を部分的にトレハロース構造に変換して還元力を低減させることも有利に実施できる。
【００４７】
また、本発明で使用する分岐α−グルカンは、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含有する栄養培地で、α−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生成する分岐α−グルカンを採取することによっても製造することができる。
【００４８】
上記の反応又は培養によって得られた分岐α−グルカンは、そのまま分岐α−グルカン製品とすることもできる。また、必要に応じて、反応液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、可消化部分を加水分解した後、非消化部分を分画により回収したり、酵母などを用いた発酵処理によりグルコースをはじめとする分解物を除去したりすることにより、消化性のさらに低減した分岐α−グルカンを調製することもできる。一般的には、分岐α−グルカンを含有する反応液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００４９】
α−グルコシル転移酵素を、糊化澱粉や比較的低ＤＥ（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、好ましくはＤＥ２０未満の澱粉部分分解物に作用さて、本発明で使用する分岐α−グルカンを調製する場合、グルコースやマルトースなどの低分子オリゴ糖をほとんど生成しないので、得られる反応生成物をカラムクロマトグラフィーなどの精製手段で精製する必要は特にないものの、用途など目的に応じてさらに分画することも随意である。この分画にイオン交換クロマトグラフィーを採用する場合、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを有利に用いることができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００５０】
また、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンにα−グルコシル転移酵素を作用させても当該分岐α−グルカンを調製することができるが、さらに当該分岐α−グルカンをイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９）で消化することにより、食物繊維成分の含量を増やすことも有利に実施できる。ちなみに、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンにα−グルコシル転移酵素を作用させて調製した該分岐α−グルカンに、イソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９）を作用させると、イソマルトースが基質固形物当たり２５質量％以上５０質量％以下生成する。
【００５１】
このようにして得られた本発明で使用する分岐α−グルカンは溶液のまま利用できるものの、保存に有利で、且つ、用途によっては利用しやすいように、乾燥し、粉末品とするのが望ましい。乾燥には、通常、凍結乾燥、或いは噴霧乾燥やドラム乾燥などの方法を用いることができる。乾燥物は、必要に応じて、粉砕し粉末化することも、篩別又は造粒して、特定粒度の範囲に整えることも有利に実施できる。
【００５２】
また、当該分岐α−グルカンは、難消化性であり、経口摂取すると食物繊維作用により優れた脂質代謝改善作用を発揮することができるので、脂質代謝改善剤としてはもとより、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤、乃至、予防剤、腹囲の増加抑制剤、メタボリツクシンドロームの予防剤乃至治療剤などとしても有利に利用できる。また、当該分岐α−グルカンを有効成分として配合した本発明の脂質代謝改善剤は、固状よりも液状の形態の方が、組成物における配合割合が低くても優れた脂質代謝改善作用をはじめとする生理機能を発揮するという特徴を有している。
【００５３】
本発明の脂質代謝改善剤の投与剤型としては、各種の形態が利用目的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤等の経口剤、座剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の非経口剤が挙げられる。
【００５４】
上記本発明の脂質代謝改善剤は、分岐α−グルカンを、そのまま製剤として単独で使用してもよいが、必要に応じて、製剤学的に許容される食品素材や、食品添加物、医薬品、医薬品添加物、医薬部外品添加物などの添加剤と組み合わせた経口用製剤又は高カロリー輸液剤などとするか、若しくは輸液製剤などに添加して非経口用の製剤とすることもできる。具体的には、例えば、界面活性剤、防腐剤（抗菌剤）、保湿剤、増粘剤、水溶性高分子、抗酸化剤、キレート剤、色素、香料、ｐＨ調整剤、ビタミン類、各種アミノ酸、電解質、水、アルコール類、有機溶媒、動物や植物のエキス等と組み合わせて、公知の方法により製剤化すればよい。より具体的には、経口剤の製造に際しては、例えば、通常用いられる乳糖、白糖、マルトース、トレハロース、環状四糖、デキストリン、澱粉、結晶セルロース、コーンスターチ等の賦形剤、カルボキシメチルセルロース、寒天、ゼラチン末等の崩壊剤、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖等のコーティング剤等を使用すればよい。また、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の経口液剤、注射剤の製造に際しては、注射用蒸留水、生理食塩水等に溶解ないし、懸濁し、例えば、無機又は有機の酸あるいは塩基等のｐＨ調整剤、等張化剤、安定化剤、希釈剤等を必要により添加すればよい。
【００５５】
また、本発明の脂質代謝改善剤は、そのままで、あるいは、他の糖質、甘味料、増量剤、賦形剤、結合剤と混合して、既存の飲食品に配合して利用することも随意である。具体的には、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような甘味料と、また、デキストリン、澱粉、デキストラン、乳糖などのような増量剤と混合して、粉末、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体など各種形状に成形して、飲食品に配合することもできる。
【００５６】
また、本発明の脂質代謝改善剤は飲食品に配合した場合でも、有効成分の分岐α−グルカンは消化され難いので、脂質代謝改善効果を発揮することができる。具体的には、例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬などの漬物類、たくわん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、ミネラルウオーター、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、茶飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物に配合すればよい。また、本発明の脂質代謝改善剤は液状形態の方が固状より、組成物への配合割合が低くても、脂質代謝改善作用などの生理機能を効果的に発揮できるので、清涼飲料、アルコール飲料、スープ、ドリンク剤などの液状形態で使用するのが特に望ましい。
【００５７】
また、本発明の脂質代謝改善剤は、家畜、家禽などの飼育動物のための飼料、餌料などとして脂質代謝改善の目的で使用することができる。
【００５８】
以上、本発明の脂質代謝改善剤に有効成分の分岐α−グルカンを含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程において含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、組成物の、通常、０．１質量％以上、望ましくは、１質量％以上含有せしめるのが好適である。組成物が固状の場合には、１質量％以上配合するのが望ましく２％以上が特に望ましい。液状の場合には、０．５質量％以上配合するのが望ましく１％以上が特に望ましい。配合量が０．１質量％未満では、脂質代謝改善効果が発揮されない場合がある。
【００５９】
以下、実験により本発明で使用する分岐α−グルカンとその分岐α−グルカンの調製に使用するα−グルコシル転移酵素、及び、当該分岐α−グルカンの持つ生理作用を詳細に説明する。
【００６０】
＜実験１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
＜実験１−１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社販売）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社販売）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ１本に１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００６１】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除去し、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、２．８単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約２０ｍｌを得た。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．１８Ｍ付近から０．４５Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６２】
＜実験１−２：α−グルコシル転移酵素を用いた分岐α−グルカンの調製＞
実験１−１で得たα−グルコシル転移酵素標品１００ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８５．８％の収率で得た。
【００６３】
＜実験２：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
【００６４】
＜実験２−１：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験１−１と同様に培養したものを種培養とした。
【００６５】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、０．５３単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．０５Ｍ付近から０．２Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６６】
＜実験２−２：α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
実験２−１で得たα−グルコシル転移酵素標品２０ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８３．６％の収率で得た。
【００６７】
以下の実験３及び４では、実験１−２で得たグルカンと実験２−２で得たグルカンを区別する目的で、それぞれを「グルカンＡ」及び「グルカンＢ」と呼称する。
【００６８】
＜実験３：グルカンＡ及びＢの水溶性食物繊維としての評価＞
得られたグルカンの水溶性食物繊維含量を、栄養表示基準（平成８年５月厚生省告示第１４６号）における栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）、８．食物繊維、（２）高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）記載の方法に準じて下記の方法により調べた。酵素処理用のキットとして、総食物繊維測定キット（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｆｉｂｅｒ，Ｔｏｔａｌ，Ａｓｓａｙ，Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ、シグマ社製）を用いた。また、グルカンＡ及びＢの調製に用いた基質である澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を対照１とし、市販の難消化性グルカン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）を対照２として、同様にそれぞれの水溶性食物繊維含量を調べた。
【００６９】
＜分析用試料溶液の調製＞
被験試料として固形分０．１ｇのグルカンを試験管にとり、０．０８Ｍリン酸緩衝液５ｍｌを添加しｐＨを６．０に調整した。これに、食物繊維測定キット付属の熱安定α−アミラーゼ（バチルス・リケニホルミス由来耐熱性α−アミラーゼ、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、沸騰水浴中で５分毎に攪拌しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られた反応液に、０．２７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液約１ｍｌを添加しｐＨを７．５に調整した後、キット付属のプロテアーゼ（バチルス・リケニホルミス由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られたプロテアーゼ処理液に０．３２５Ｍ塩酸を約１ｍｌ添加し、ｐＨを４．３に調整した後、キット付属のアミログルコシダーゼ（アスペルギルス・ニガー由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。次いで、得られた反応液約７ｍｌを、イオン交換樹脂（オルガノ株式会社販売のアンバーライトＩＲＡ−６７（ＯＨ型）とアンバーライト２００ＣＴ（Ｈ型）を１：１で混合）にＳＶ１．０で通液することにより脱塩し、さらに約３倍量の脱イオン水にて溶出し、溶出液の総量を約２８ｍｌとした。得られた溶出液をエバポレーターにて濃縮し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過した後、メスフラスコで２５ｍｌに定容したものを分析用試料溶液とした。
【００７０】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
上記で得られた分析用試料溶液は、下記の条件による高速液体クロマトグラフィーに供した。
カラム ：ＴＧＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ×長さ３００ｍｍ，株式会社東ソー製）２本を直列に連結したもの
溶離液 ：脱イオン水
試料糖濃度：０．８質量％
カラム温度：８０℃
流 速 ：０．５ｍｌ／分
検 出 ：示差屈折計
注入量 ：２０μｌ
分析時間：５０分
【００７１】
＜被験試料の水溶性食物繊維含量の算出＞
上記で得られたクロマトグラムにおいて、酵素処理によっても分解されずに残存する未消化グルカンを水溶性食物繊維とした。この水溶性食物繊維と分解されて生成したグルコースのピーク面積をそれぞれ求め、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法にて定量した分析用試料溶液中のグルコース量を用いて、下記の式１により水溶性食物繊維量を求めた。さらに、下記の式２により被験試料の水溶性食物繊維含量を求めた。
【００７２】
式１：
【数１】
【００７３】
式２：
【数２】
【００７４】
上記の酵素−ＨＰＬＣ法により求めたグルカンＡ及びグルカンＢの水溶性食物繊維含量はそれぞれ４２．１質量％及び４１．８質量％であった。一方、対照１の澱粉部分分解物は酵素処理により全てグルコースにまで分解され、水溶性食物繊維含量は０質量％と評価された。また、対照２の市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）のそれは４８．７質量％であった。これらの結果は、水溶性食物繊維を含まない澱粉部分分解物を基質としてα−グルコシル転移酵素を作用させることにより、市販の難消化性デキストリンとほぼ同等の水溶性食物繊維含量を示すグルカンを容易に調製できることを示している。
【００７５】
＜実験４：グルカンＡ及びＢの構造解析＞
＜実験４−１：メチル化分析＞
実験１−２及び２−２の方法で得たグルカンＡ及びＢについて、常法に従って、メチル化分析を行い、下記の条件によるガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。結果を表３にまとめた。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
カラム ：ＤＢ−５ キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ×膜厚１μｍ，Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
キャリアーガス ：ヘリウム
カラム温度：１３０℃で２分間保持した後、２５０℃まで５℃／分で昇温し、２５０℃で２０分間保持
流 速 ：１．０ｍｌ／分
検 出 ：ＦＩＤ
注入量 ：３μｌ（スプリット１／３０）
分析時間：４６分
【００７６】
【表３】
【００７７】
表３の結果から明らかなように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素によりそれぞれ調製したグルカンＡ及びＢのメチル化分析の結果を、基質である澱粉部分分解物のそれと比較すると、いずれのグルカンの場合も、２，３，６−トリメチル化物が著しく減少しており、一方、２，３，４−トリメチル化物が３０％以上まで著しく増加していた。このことは、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の反応によって、グルコースが主としてα−１，４結合によって重合した構造を有する澱粉部分分解物が、α−１，６結合を３０％以上含む分岐α−グルカンに変換されたことを物語っている。また、２，３，４，６−テトラメチル化物、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物が増加していることから、非還元末端グルコース、α−１，３結合及びα−１，３，６結合が新たに生成していることも判明した。グルカンＡの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ１．１％及び０．８％であり、グルカンＢの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ０．９％及び１．１％であった。さらに、グルカンＡ及びＢにおいて、２，３−ジメチル化物の存在比は基質とほとんど差がないことから、基質に元々存在する分岐であるα−１，４，６結合に大きな変化はないと考えられた。この結果から、グルカンＡ及びＢは、基質である澱粉部分分解物とは大きく異なり、グルコースの結合様式がα−１，４結合及びα−１，６結合を主体とし、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも僅かに有する分岐グルカン（分岐α−グルカン）であることが判明した。なお、分岐α−グルカンＡ及びＢを構成するグルコースの１位のアノマー型は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析において、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、全てα型であることが判明した。
【００７８】
＜実験４−２：分岐α−グルカンＡ及びＢのイソマルトデキストラナーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ及びＢの構造を特徴づける目的で、イソマルトデキストラナーゼ消化試験を行った。分岐α−グルカンＡ及びＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアルスロバクター・グロビホルミス由来のイソマルトデキストラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所内にて調製）を基質固形物１グラム当たり１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その反応液中の糖組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略称する。）及びガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」と略称する）を用いて調べた。ＨＰＬＣは、カラムに『ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳ』（株式会社三菱化学製造）２本を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。ＧＣは、常法に従って糖質をトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）した後、カラムに『２％シリコンＯＶ−１７ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ／ＡＷ−ＤＭＳ』（株式会社ジー・エル・サイエンス製造）を用い、１分間当たり７．５℃の昇温速度で温度１６０℃から３２０℃まで昇温した。キャリアーガスとして窒素ガスを用い、検出はＦＩＤ法にて行った。イソマルトデキストラナーゼ消化において、分岐α−グルカンの調製に用いた基質である澱粉部分分解物からはイソマルトースが全く生成しなかったのに対し、分岐α−グルカンＡからは糖組成として２８．４質量％のイソマルトースが、また、分岐α−グルカンＢからは糖組成として２７．２質量％のイソマルトースが、それぞれ生成した。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがイソマルトース構造をそれぞれ、少なくとも２８．４質量％及び２７．２質量％程度含んでいることを示しており、分岐α−グルカンではα−１，６結合の割合が増加していることを示した実験４−１におけるメチル化分析の結果を支持するものである。なお、イソマルトデキストラナーゼは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−グルコシド結合であれば、それがα−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれであっても加水分解する特異性を有していることから、得られたイソマルトースが分岐α−グルカンＡ及びＢにおいてどのような結合様式で結合しているのか、その詳細は不明である。
【００７９】
＜実験４−３：分岐α−グルカンＡ及びＢのα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ又はＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼアマノＬ』、天野エンザイム製）及びリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来グルコアミラーゼを同時に作用させ消化試験を行った。基質固形物１グラム当たりα−グルコシダーゼを５，０００単位とグルコアミラーゼを１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その酵素反応液の糖組成を実験４−２と同じ条件でＨＰＬＣを用いて調べた。その結果、グルカンＡ及びＢはいずれも、基質である澱粉部分分解物の場合と同様に、実質的に全てグルコースにまで分解された。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがいずれもグルコースを構成糖とするα−グルカンであることを示すものである。
【００８０】
＜実験４−４：分子量分布分析＞
分岐α−グルカンＡ及びＢについて、分子量分布を常法のゲル濾過ＨＰＬＣ法にて分析した。ゲル濾過ＨＰＬＣは、カラムに『ＴＳＫ ＧＥＬ α−Ｍ』（株式会社東ソー製）を２本連結したものを用い、溶離液に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、カラム温度４０℃、流速０．３ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。なお、試料中のグルカンの分子量は、分子量測定用プルラン標準品（株式会社林原生物化学研究所販売）を同様にゲル濾過分析に供して作成した分子量の検量線に基づき算出した。図１に分岐α−グルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム（図１における符号ｂ及びｃ）を、基質として用いた澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』）のそれ（図１における符号ａ）と比較しつつ、それぞれ示した。なお、図１における符号イ、ロ、ハ、ニ及びホは、それぞれ、分子量１，０００，０００、１００，０００、１０，０００、１，０００及び１００ダルトンに相当する溶出位置を意味する（後述する図１５乃至１９においても同様）。また、ゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づき各試料の分子量分布を分析した結果を表４に示した。
【００８１】
【表４】
【００８２】
基質として用いた澱粉部分分解物が、分子量分布分析においてグルコース重合度４９９及び６．３に相当する位置に２つのピーク（図１のクロマトグラムａにおける符号１及び２）を有する糖質混合物であるのに対して、分岐α−グルカンＡは、グルコース重合度３８４、２２．２、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｂにおける符号３、４、５及び６）を有する糖質の混合物、また、分岐α−グルカンＢは、グルコース重合度４３３、２２．８、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｃにおける符号７、８、９及び１０）を有する糖質の混合物であった。符号６及び１０のピークはグルコースに相当するものの、その含量はごく僅かであることから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来酵素の加水分解作用は僅かであることがわかる。表４から明らかなように、基質である澱粉部分分解物に比べ、グルカンＡ及びＢの数平均分子量及び重量平均分子量は共に６０％程度に減少しており、全体として低分子化していた。また、分子量分布の拡がりの指標である重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）が澱粉部分分解物とグルカンＡ及びＢ間でそれほど変化していないことから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素は、澱粉部分分解物の非還元末端にのみ作用していると考えられた。
【００８３】
以上の結果から、基質として用いた澱粉部分分解物においてはグルコースの結合様式の約９０％がα−１，４結合であり、わずかにα−１，４，６結合を有しているのに対し、グルカンＡ及びＢは、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合が極めて高く、α−１，４，６結合に加えて、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも有する分岐を有するグルカンであることが判明した。このような構造を有する分岐α−グルカンはこれまで全く知られていない。
【００８４】
メチル化分析の結果に基づいて分岐α−グルカンの構造を推定し、その構造を模式的に示した図を基質である澱粉部分分解物のそれとともに図２に示した。図２中、符号１及び２は、それぞれ原料澱粉部分分解物及び分岐α−グルカンの模式図である。なお、図２において、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆはそれぞれ、澱粉部分分解物または分岐α−グルカンにおける、非還元末端グルコース残基、α−１，３結合しているグルコース残基、α−１，４結合しているグルコース残基、α−１，６結合しているグルコース残基、α−１，３，６結合しているグルコース残基及びα−１，４，６結合しているグルコース残基を意味している。また、同模式図におけるグルコース間の斜め破線、横実線及び縦実線はそれぞれ、α−１，３結合、α−１，４結合及びα−１，６結合を意味している。
【００８５】
＜実験５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０株由来α−グルコシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００８６】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約２．７単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約２．６単位／ｍｌであった。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０によって生産される−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００８７】
＜実験６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験５で得た培養上清のうち、約４Ｌ（総活性約１０，４００単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約６５ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約７４単位／ｍｌであった（総活性約４，７８０単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量９ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３．３ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表５に示す。
【００８８】
【表５】
【００８９】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００９０】
＜実験７：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験７−１：分子量＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【００９１】
＜実験７−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図３（至適温度）及び図４（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５０乃至５５℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３であることが判明した。
【００９２】
＜実験７−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（温度安定性）及び図６（ｐＨ安定性）に示した。図５及び図６から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素は４０℃まで安定であり、また、ｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定であった。
【００９３】
＜実験７−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表６に示す。
【００９４】
【表６】
【００９５】
表６の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【００９６】
＜実験８：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験５と同様に培養して種培養とした。
【００９７】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至７．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約０．３６単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約０．４２単位／ｍｌであった。アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９によって生産される本α−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００９８】
＜実験９：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験８で得た培養上清約１８Ｌ（総活性約７，５６０単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、遠心分離して不溶物を除き、粗酵素液約５００ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約１４単位／ｍｌであった（総活性約７，０００単位）。この粗酵素液に終濃度２Ｍとなるように硫安を添加し、遠心分離して不溶物を除き、２Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、ゲルに吸着し、硫安濃度２Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．６Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表７に示す。
【００９９】
【表７】
【０１００】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１０１】
＜実験１０：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験１０−１：分子量＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１０２】
＜実験１０−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図７（至適温度）及び図８（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で約５０℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０であることが判明した。
【０１０３】
＜実験１０−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験９方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図９（温度安定性）及び図１０（ｐＨ安定性）に示した。図９及び図１０から明らかなように、本発明のアルスロバクター・グロビホルミス由来α−グルコシル転移酵素は、４０℃まで安定であり、ｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１０４】
＜実験１０−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験９の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
表８の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【０１０７】
＜実験１１：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、α−グルコシル転移酵素の基質特異性を調べた。メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、グルコース、スクロース、マルトース、イソマルトース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ラクトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトトリオース又はイソパノースを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ１０単位ずつ加え、基質濃度を１ｗ／ｖ％になるように調製し、これを４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、１０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、加熱することにより糖質を検出した。ＴＬＣにおける基質糖質以外の反応生成物の生成の有無を調べ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表９に示す。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素についても基質特異性を同様にして調べた結果、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素と同様であった。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
表９の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素は、試験した糖質のうち、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースによく作用し、また、ニゲロース、イソマルトース、ネオトレハロース、イソマルトトリオース、イソパノースに作用した。さらに、コージビオースにも僅かに作用した。作用した糖質からは、いずれも分解生成物と共に、糖転移生成物も認められた。一方、このα−グルコシル転移酵素は、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、トレハロース、セロビオース、スクロース、ラクトースなどには作用が認められなかった。これらの結果及び本α−グルコシル転移酵素が澱粉部分分解物に作用し分岐α−グルカンを生成することより、本酵素はマルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカン又はグルコースから構成されるα−グルコオリゴ糖に幅広く作用することが判明した。
【０１１０】
＜実験１２：作用メカニズム＞
α−グルコシル転移酵素の作用メカニズムを検討するため、最小の基質であるマルトースに作用させた場合の生成糖の構造を調べた。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であった。本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１１１】
＜実験１２−１：マルトースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ及びＧＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ及びＧＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。結果を表１０に示す。
【０１１２】
【表１０】
【０１１３】
表１０の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、α−グルコシル転移酵素の作用により、基質マルトースから、主としてグルコース、マルトトリオース及びパノースが生成した。さらに反応２時間及び４時間からグルコース重合度４及び５のオリゴ糖が生成した。反応が進むと、マルトトリオースは反応２時間（１４．４％）をピークに、また、パノースは反応４時間（２９．３％）をピークに減少し、その減少とともにイソマルトースの増加が認められた。さらに、反応４８時間までイソマルトース及び重合度４以上のオリゴ糖の増加が認められた。
【０１１４】
これらの結果から推察すると、α−グルコシル転移酵素はマルトースに作用し、反応初期において、α−１，４グルコシル転移とα−１，６グルコシル転移の両グルコシル転移を触媒することにより、グルコース、マルトトリオース及びパノースを生成し、反応の進行にともない、グルコースにα−１，６グルコシル転移したイソマルトースや、そのイソマルトースにα−１，４グルコシル転移及びα−１，６グルコシル転移したイソパノース及びイソマルトトリオースが生成することがわかった。本実験においては、多種類存在する重合度４以上のオリゴ糖を同定することは困難であることから、実験１２−２において、マルトースより重合度の高いマルトペンタオースを基質として、さらに反応メカニズムを解析した。
【０１１５】
＜実験１２−２：マルトペンタオースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトペンタオース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。また、酵素反応液について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。生成する部分メチル化物の組成からグルコースの結合様式における各グルコシド結合の存在比を求めた。また、実験４−２と同様にイソマルトデキストラナーゼ消化試験も行った。反応中の糖組成の変化を表１１に、反応生成物のメチル化分析とイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表１２に示す。
【０１１６】
【表１１】
【０１１７】
【表１２】
【０１１８】
表１１及び１２の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、基質マルトペンタオースから、基質よりグルコース重合度が１小さいオリゴ糖とグルコース重合度が１大きいオリゴ糖が優先的に生成したことから、本酵素がグルコシル転移を触媒していることが確認された。さらに反応が進むと、種々のグルコース重合度を有する反応生成物が生成し、反応２４時間後には、グルコース重合度９以上のグルカンが２１．１％にも達した。メチル化分析の結果から、反応が進行するにつれて、反応生成物においては１，４結合したグルコース残基が減少するとともに、１，６結合したグルコース残基が顕著に増加し、また、１，３結合したグルコース残基、１，４，６結合したグルコース残基及び１，３，６結合したグルコース残基が徐々に増加することが判明した。また、イソマルトデキストラナーゼ消化後の糖組成におけるイソマルトース含量もまた、反応の進行とともに顕著に増加することが判明した。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１１９】
実験１２−１及び１２−２の結果から、α−グルコシル転移酵素の反応メカニズムは以下のように考えられた。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらもα−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する分岐α−グルカンを生成する。
【０１２０】
＜実験１３：α−グルコシル転移反応と反応液の還元力の変化＞
マルトース水溶液（最終濃度１又は３０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形物１グラム当たり４単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。反応液中に残存するマルトース量を実験４−２に記載のＨＰＬＣ法及びＧＣ法で定量した。また、酵素反応液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で、全糖量をアンスロン法で定量し、次式、 還元力＝（還元糖量／全糖量）×１００ で還元力を算出した。結果を表１３に示す。
【０１２１】
【表１３】
【０１２２】
表１３の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素をマルトースに作用させたところ、マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低い場合には、ごく僅かな還元力の増加が認められ、また、マルトース濃度が３０ｗ／ｖ％と比較的高い場合には、ほとんど反応液の還元力の増加は認められなかった。マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低く、且つ、マルトースの残存量が１０％以下の場合においても反応液の還元力の増加がごく僅かであることは、このα−グルコシル転移酵素は本質的に転移反応を触媒する酵素であり、反応に際してほとんど加水分解を行わないことを意味している。このα−グルコシル転移酵素は効率良くα−グルコシル転移を行う酵素であることがわかった。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１２３】
＜実験１４：分岐α−グルカンの生成における精製α−グルコシル転移酵素と粗酵素の比較＞
分岐α−グルカンの工業的生産を考慮した場合、α−グルコシル転移酵素の粗酵素が使用できれば酵素を精製する手間と労力が省けることとなり、より好適である。そこで、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて、実験１−２で調製したグルカンＡと同等の分岐α−グルカンが得られるか否かを検討した。実験１−１に記載した方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０を培養し、培養上清を硫安塩析し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析したものをα−グルコシル転移酵素の粗酵素液とした。この粗酵素液を実験１−２に記載した方法で澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）に作用させ、固形分濃度３０％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８８．２％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンを「グルカンＣ」と名付け、そのメチル化分析を行った結果を表１４に、また、実験４及び実験３に記載した方法によって分子量分布及び水溶性食物繊維含量を測定した結果を表１５にそれぞれ示す。なお、表１４及び表１５には、比較のため表３及び表４より調製の原料とした澱粉部分分解物と部分精製α−グルコシル転移酵素を用いて調製したグルカンＡのデータをそれぞれ再掲した。
【０１２４】
【表１４】
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
表１４に示すように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて調製したグルカンＣは、意外にも、メチル化分析において、非還元末端グルコース残基に相当する２，３，４，６−テトラメチル化物と、α−１，６結合したグルコース残基に相当する２，３，４−トリメチル化物の含量がグルカンＡに比べ増加していた。この結果は、グルカンＣにはグルカンＡに比べて非還元末端が多く、また、α−１，６結合がより多く存在することを物語っている。さらに、グルカンＣでは２，４−ジメチル化物が４．８％と、グルカンＡの０．８％に比べ増加していた。この結果は、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基が増加していることを示している。
【０１２７】
また、表１５から明らかなように、グルカンＣは、グルカンＡに比べ数平均分子量及び重量平均分子量がいずれも小さく（グルコース重合度が小さく）、遙かに高い水溶性食物繊維含量を示した。この結果は、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素には、α−グルコシル転移酵素とは相違する他の酵素が混在しており、その混在酵素が分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に寄与していることを示唆するものである。
【０１２８】
＜実験１５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在する酵素の同定と単離・精製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在し、分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に関与する酵素を同定し、単離・精製する実験を行った。
【０１２９】
＜実験１５−１：混在する酵素の同定と活性測定＞
実験１−１と同じ方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を培養し、得られた培養上清約３Ｌを硫安塩析した後、１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に対して透析して得た透析液約４０ｍｌを粗酵素液とした。この粗酵素液を、２ｗ／ｖ％可溶性澱粉溶液又は２ｗ／ｖ％プルラン溶液にｐＨ６．０、４０℃で１６時間作用させ、１００℃、１０分間加熱して反応を停止させた後、縦１０ｃｍ、横２０ｃｍのシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）ＴＬＣプレートを用いたＴＬＣに供した。展開溶媒としてｎ−ブタノール：ピリジン：水（容量比６：４：１）を用いて２回展開を行い、２０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、１００℃で５分間加熱して生成物のスポットを検出した。その結果、可溶性澱粉からは、マルトース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の生成が、また、プルランからは僅かなイソマルトースとパノースの生成が認められた。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）のα−グルコシル転移酵素の粗酵素には澱粉を分解し、さらにプルランをも分解するアミラーゼが混在していることが判明した。
【０１３０】
混在するアミラーゼの活性は、以下のようにして測定した。すなわち、短鎖アミロース（商品名「アミロースＥＸ−Ｉ」、株式会社林原生物化学研究所販売、平均重合度１７）を最終濃度１ｗ／ｖ％となるように１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液２ｍｌに、酵素液０．２ｍｌを加え３５℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．２ｍｌを８ｍｌの０．０２Ｎ硫酸溶液に混合し、反応停止させた後、０．２ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液を添加し、２５℃で１５分間保持した後に６６０ｎｍの吸光度を測定する。別途反応０時間の反応液について同様に測定し、反応時間当たりのヨウ素呈色の減少を測定する。アミラーゼの活性１単位は、上記の条件下で２０ｍｇの短鎖アミロースの６６０ｎｍにおける吸光度（ヨウ素呈色）を１０％低下させる酵素量の１０倍量と定義した。
【０１３１】
＜実験１５−２：混在アミラーゼの単離・精製＞
実験１５−１で調製した粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。アミラーゼは、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１．５Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、ファルマシアバイオテク製『リソース ＰＨＥ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。目的のアミラーゼは、１．５Ｍ硫安、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース ＰＨＥ』ゲルに吸着し、硫安濃度１．５Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、濃縮した後、ファルマシアバイオテク製『スーパーデックス ２００ｐｇ』ゲルを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１１８ｍｌ）に供し、０．２Ｍ食塩、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出した。活性画分を回収し、ファルマシアバイオテク製『リソース Ｑ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。アミラーゼは、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース Ｑ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。得られた活性画分をアミラーゼ精製標品とした。各精製の各工程におけるアミラーゼ活性、アミラーゼの比活性及び収率を表１６に示す。
【０１３２】
【表１６】
【０１３３】
精製したアミラーゼ標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１３４】
＜実験１６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの性質＞
＜実験１６−１：分子量＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、当該アミラーゼの分子量は５８，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１３５】
＜実験１６−２：アミラーゼの至適温度及び至適ｐＨ＞
実験１５−２の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼ精製標品を用いて、アミラーゼ活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図１１（至適温度）及び図１２（至適ｐＨ）に示した。当該アミラーゼの至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５５℃であり、至適ｐＨは３５℃、３０分間反応の条件下で６．０乃至７．０であることが判明した。
【０１３６】
＜実験１６−３：アミラーゼの温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０又は１ｍＭ塩化カルシウムを含む同緩衝液）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図１３（温度安定性）及び図１４（ｐＨ安定性）に示した。図１３及び図１４から明らかなように、当該アミラーゼはカルシウムイオン非存在下では４０℃まで安定であり、１ｍＭカルシウムイオン存在下では５０℃まで安定であった。また、当該アミラーゼはｐＨ６．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１３７】
＜実験１６−５：アミラーゼの基質特異性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、当該アミラーゼの各種基質への作用を調べたところ、当該アミラーゼは、澱粉、マルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを加水分解するとともに、グリコシル転移をも触媒することが判明した。また、当該アミラーゼは、澱粉からシクロデキストリンを生成し、プルランを加水分解してパノースを生成する作用を有することも判明した。
【０１３８】
＜実験１７：α−グルコシル転移酵素とアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品と実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、実験１４に記載したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いたグルカンＣの調製が再現できるか否かを検討した。すなわち、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、実験１５―２の方法で得たアミラーゼを固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた後、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１５に示した。図１５において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである（α−グルコシル転移酵素のみ１０単位作用させた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムは図１に示したグルカンＡのクロマトグラムとほぼ同様であり、図１５では省略した。後述する図１７〜２０についても同様）。これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１７に示す。また、基質として用いた澱粉部分分解物について調べた分子量分布分析と水溶性食物繊維含量の結果（α−グルコシル転移酵素０単位、アミラーゼ０単位）を表１７に併記した。
【０１３９】
【表１７】
【０１４０】
表１７の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素にアミラーゼを併用すると、得られる分岐α−グルカンの分子量は低下し、水溶性食物繊維含量は飛躍的に増加した。また、アミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．１まで低下した。さらに、得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位以上で約７６質量％にまで達した。
【０１４１】
この結果から、実験１４においてバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて得られたグルカンＣにおいて、分子量が小さく、食物繊維含量が高くなったのは、粗酵素に混在するアミラーゼに起因することが確認された。混在するアミラーゼが、基質である澱粉部分分解物およびα−グルコシル転移酵素の産物である分岐α−グルカンを部分的に加水分解することにより分岐α−グルカンの分子量を低下させ、また、グリコシル基をさらに分岐α−グルカンに転移することにより、結果的に食物繊維含量を高めるよう作用しているものと推察される。さらに、この結果は、アミラーゼをこのα−グルコシル転移酵素と組み合わせることにより分子量が小さく、水溶性食物繊維含量を高めた分岐α−グルカンを製造できることを示している。
【０１４２】
＜実験１８：α−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
本発明で使用するα−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用して、澱粉部分分解物に作用させて分岐α−グルカンを調製し、その構造的な特徴及び水溶性食物繊維含量を検討した。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であったことから、本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１４３】
＜実験１８−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼに変えて、シュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、５０、２００、５００又は１，０００単位加えた以外は実験１７と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１６に示した。図１６において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１８に示す。
【０１４４】
【表１８】
【０１４５】
表１８のα−グルコシル転移酵素のみを澱粉部分分解物に作用させた場合の結果から明らかなように、α−グルコシル転移酵素のみでは分子量分布に大きな影響を及ぼさないものの、表１８及び図１６の結果から明らかなように、イソアミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。イソアミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１０００単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは１．９まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度２０．６にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、イソアミラーゼの作用量にあまり影響されず、４０乃至４４質量％程度であった。
【０１４６】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素にさらにイソアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量をほとんど変化させることなく、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１４７】
＜実験１８−２：α−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えて市販のα−アミラーゼ（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１７に示した。図１７において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、α−アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１９に示す。
【０１４８】
【表１９】
【０１４９】
図１７及び表１９の結果から明らかなように、α−アミラーゼの作用量が多くなるにつれて得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。α−アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１７の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．４まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度１１．８にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、α−アミラーゼの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められた。
【０１５０】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量が増加し、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１５１】
＜実験１８−３：α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えてバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１８に示した。図１８において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、ＣＧＴａｓｅを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２０に示す。
【０１５２】
【表２０】
【０１５３】
図１８及び表２０の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるにつれて、数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。ＣＧＴａｓｅの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１８の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは３．２まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度７９．１にピークを有する分子量分布を示した。一方、分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められ、実験１８−２のα−アミラーゼを併用した場合よりも顕著に増加し、ＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり１．０単位用いた場合では、水溶性食物繊維含量は７０．５質量％に達した。
【０１５４】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素にＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることで、分子量が低下し、水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンが調製できることが判明した。ＣＧＴａｓｅはα−１，４結合の加水分解作用と共に転移作用をも有していることから、α−アミラーゼと比較して極端に分子量を低下させることなく、非還元末端グルコシル残基を生成するため、α−グルコシル転移酵素の作用頻度が高くなり、α−アミラーゼ添加よりも水溶性食物繊維含量が増加した分岐α−グルカンが得られたものと推察される。
【０１５５】
＜実験１８−４：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
実験１８−１に記載した実験において、さらにバチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり０又は１．０単位を加えた以外は実験１８−１と同様にして反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１９に示した。図１９において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、いずれもα−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅをそれぞれ１０単位及び１単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２１に示す。
【０１５６】
【表２１】
【０１５７】
図１９及び表２１の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素と固形物１グラム当たり１単位のＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンの重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は３．２まで低下し、さらに固形物１グラム当たり１０００単位のイソアミラーゼを併用した場合（図１９の符号ｅ）には１．９まで低下した。α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量は約７０質量％にまで増加し、さらにイソアミラーゼを併用した場合にも低下することなく、高い含量を維持していた。
【０１５８】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、分子量が顕著に低下すると共に水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンを調製できることが判明した。
【０１５９】
＜実験１９：分岐α−グルカンの機能性＞
水溶性食物繊維含量が最も高く、分子量が比較的小さい分岐α−グルカンとして、実験１８−４において固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位ＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンを選択し、当該分岐α−グルカンの消化性及び構造的な特徴及び機能性を検討した。
【０１６０】
＜実験１９−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの精製＞
固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位のＣＧＴａｓｅを用い、実験１８−４と同様に反応させて得た分岐α−グルカンの反応液を、濾過して不溶物を除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０％の分岐α−グルカン含有液を、用いた澱粉から固形物当り８５．８％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンのメチル化分析を実験４−１記載の方法で行った結果を表２２に示した。また、実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法で行った分子量分布分析、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法で求めた水溶性食物繊維含量、実験４−２記載のイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表２３にまとめた。
【０１６１】
【表２２】
【０１６２】
【表２３】
【０１６３】
表２２及び２３の結果から明らかなように、得られた分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物を１対２．４の比で含有し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７７．５％を占めていた。また、本分岐α−グルカンにおいて、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．６％及び２．４％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量５，４８０ダルトン、Ｍｗ／Ｍｎ２．３を示し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量が６８．６質量％、イソマルトデキストラナーゼ消化により、糖組成当たりイソマルトースを３６．４質量％生成するグルカンであった。
【０１６４】
当該分岐α−グルカンの有用性を評価する目的で、実験１９−１で調製した分岐α−グルカンを用いて、う蝕原性、消化性、血糖値とインスリン量に及ぼす影響、及び急性毒性を実験１９−２乃至１９−７で調べた。
【０１６５】
＜実験１９−２：分岐α−グルカンのう蝕原性菌による酸発酵性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用い、『インフェクション・アンド・イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）』、第３９巻、４３乃至４９頁（１９８３年）に記載の大島らの方法に準じて、う蝕原性菌を用いた酸発酵性試験を行った。う蝕原性菌として、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５株及びストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＯＭＺ−１７６株の２株を用いた。対照として、スクロースを用いて同様に操作した。結果を表２４に示す。
【０１６６】
【表２４】
【０１６７】
表２４の結果から明らかなように、酸発酵を受けるスクロースの場合はｐＨ約４にまで低下するのに対して、当該分岐α−グルカンは、ストレプトコッカス・ソブリナス及びストレプトコッカス・ミュータンスによる酸発酵をほとんど受けず、ｐＨは約６を維持しており、歯のエナメル質が脱灰する臨界ｐＨである５．５より高いｐＨであった。当該分岐α−グルカンは、う蝕原性が極めて低いことが確認された。
【０１６８】
＜実験１９−３：分岐α−グルカンの消化性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、日本栄養食糧学会誌、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０）に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内において唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素による分岐α−グルカンの消化性を調べた。対照として、市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。結果を表２５に示す。
【０１６９】
【表２５】
【０１７０】
表２５の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンは、唾液アミラーゼ、人工胃液によっては全く消化されず、膵液アミラーゼでごく僅か分解された。また、対照の難消化性デキストリンの小腸粘膜酵素による分解率が４１．１％であるのに対して、分岐α−グルカンの分解率は１６．４％と低く、当該分岐α−グルカンは市販の難消化性デキストリンよりもさらに消化され難いことが判明した。
【０１７１】
＜実験１９−４：分岐α−グルカンの摂取が血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、血糖値の上昇及びインスリンの上昇を調べた。７週齢のウィスター系雄ラット各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて分岐α−グルカンの水溶液を経口投与した。投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇとした。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値はグルコース・オキシダーゼ法で測定し、インスリン量はラットインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所製造）を用いて測定した。対照１としてグルコースを、また、対照２として市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。それぞれの試験系における血糖値及びインスリン量の結果をそれぞれ表２６及び表２７に示す。
【０１７２】
【表２６】
【０１７３】
【表２７】
【０１７４】
表２６及び表２７の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリンと同様に、血糖値の上昇及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べ低いことが判明した。
【０１７５】
＜実験１９−５：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、当該分岐α−グルカンは無毒性であり、投与可能な最大量においても死亡例は認められず、そのＬＤ５０値は、５ｇ／ｋｇ−マウス体重以上であった。
【０１７６】
＜実験２０：分岐α−グルカンの血糖上昇抑制作用＞
実験１９−４において、分岐α−グルカンの摂取により、血糖値及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べて低いことが判明したので、後述する実施例５の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、分岐α−グルカンの摂取が血糖上昇に与える影響をさらに詳細に検討した。
【０１７７】
＜実験２０−１：分岐α−グルカンの摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
分岐α−グルカンが、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学工業株式会社販売）摂取後の血糖上昇に与える影響を検討した。ラット飼育用飼料（株式会社林原生物化学研究所調製、「ＡＩＮ−９３Ｇ」；ジャーナル・オブ・ニュートリッション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、第１２３巻、第１９３９−１９５１頁（１９９３）参照、以下「精製飼料」という。後述の表３３に示す配合組成を参照）で、１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）３群各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）と分岐α−グルカンとを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として、０．１５ｇ、０．３０ｇ又は０．７５ｇとした。ラットの血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットに澱粉部分分解物のみを固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重経口投与した。また、対照２として、分岐α−グルカンに換えて、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社製造）を、澱粉部分分解物と同時に、２群各群５匹のラットに、体重１ｋｇ当り固形物として０．１５ｇ又は０．７５ｇの何れかを経口投与した。それぞれの試験系における血糖値の変化、血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積）、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表２８、表２９、表３０及び表３１に示す。
【０１７８】
【表２８】
【０１７９】
【表２９】
【０１８０】
【表３０】
【０１８１】
【表３１】
【０１８２】
表２８乃至表３１の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、用量依存的に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇を、澱粉部分分解物を単独で摂取させた場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの上昇抑制効果の程度を比較すると、測定した何れの指標においても、当該分岐α−グルカンの方が市販の難消化性デキストリンよりも強い抑制効果を示した。
【０１８３】
＜実験２０−２：澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量への分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２０−１において、分岐α−グルカンが、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を何れも抑制することが判明したので、この分岐α−グルカンの分子量の違いが、糖質負荷時の血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用に及ぼす影響を検討した。すなわち、原料澱粉部分分解物、α−グルコシル転移酵素、アミラーゼの使用量等を調整して、表３２に示す重量平均分子量の分岐α−グルカンを調製した。実験２０−１と同様に、精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）９群各群５匹を用いて、１日絶食後、８群各群５匹のラットには、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）又は表３２に示す分岐α−グルカンの何れかを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として０．７５ｇとした。残りの１群５匹のラットには、澱粉部分分解物のみをラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇ経口投与し、対照群とした。これらのラットの血液を、経口投与直前及び投与３０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液をヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。各群における血糖値及びインスリン量の測定結果を表３２に併せて示す。なお、投与後の採血時間は、澱粉部分分解物のみを投与した場合に、血糖値及び血中インスリン量がピークとなる投与３０分後とした。
【０１８４】
【表３２】
【０１８５】
表３２の結果から明らかなように、重量平均分子量が１，１６８乃至２００，０００の範囲にある分岐α−グルカンは、何れも澱粉部分分解物を経口投与した後の血糖値及びインスリン量の上昇を抑制した。また、この血糖値及びインスリン量の上昇抑制効果の強さの程度で比較すると、分岐α−グルカンの分子量が１，１６８乃至６０，０００（水溶性食物繊維含量が５８．１乃至８０．４質量％）の場合に抑制効果が顕著となり、２，６７０乃至４４，１５１（水溶性食物繊維含量が６４．２乃至８０．４質量％）の場合に特に強い抑制効果が認められた。
【０１８６】
＜実験２０−３：分岐α−グルカンの長期摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験２０−１において、分岐α−グルカンの摂取により、糖質負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンを長期摂取後（８週間）に、糖質負荷時の血糖値、血糖値ＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇抑制作用を検討した。精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）５群各群５匹を使用した。３群各群５匹のラットを、各々表３３に示す分岐α−グルカン（固形物換算）を１、２又は５質量％配合した３種類の試験飼料の何れかで８週間飼育した。飼育期間中の餌及び水は自由摂取とした。試験飼料での飼育４週間と８週間で、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物の水溶液を固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重となるように経口投与した。ラットの血液を、投与直前、投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットを精製飼料のみで飼育した。また、残りの１群５匹のラットは、対照２として、精製飼料のコーンスターチの一部を、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社販売）で置き換えた表３３に示す配合組成の飼料で飼育した。飼育４週間と８週間とはほぼ同じ結果となったので、試験飼料で飼育４週間における、それぞれの試験系における血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表３４、表３５、表３６及び表３７に示す。
【０１８７】
【表３３】
【０１８８】
【表３４】
【０１８９】
【表３５】
【０１９０】
【表３６】
【０１９１】
【表３７】
【０１９２】
表３４乃至３７の結果から明らかなように当該分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を、精製飼料のみで飼育した場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの数値上昇の抑制は、飼料に配合した分岐α−グルカンの濃度に依存しており、その効果は固形物として、分岐α−グルカンを２質量％配合した場合に顕著となり、５質量％では特に強い抑制が認められた。また、市販の難消化性デキストリンを、固形物として５質量％配合した飼料で飼育したラットにおける、これらの指標の抑制の程度は、固形分として分岐α−グルカンを１質量％配合した飼料と同程度の抑制が認められたことから、当該分岐α−グルカンは、当該難消化性デキストリンよりも、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇抑制効果に優れていることが確認された。更に、澱粉部分分解物投与前の血糖値及びインスリン量を比較すると、分岐α−グルカンを固形物として２質量％又は５質量％配合した飼料を摂取させた群では、精製飼料のみ或いは難消化性デキストリンを固形物として５質量％含む飼料を摂取させた群よりも低く、当該当該分岐α−グルカンは、長期摂取により空腹時血糖値及び血中インスリン量を、市販の難消化性デキストリンよりも効果的に抑制する作用を有していることも明らかになった。なお、試験飼料又は対照飼料で飼育４週間及び８週間で、ラットの体重を比較したところ、何れの群間でも、平均体重に差は認められなかったので、本実験で確認された分岐α−グルカンによる血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用は、ラットの健康状態には何ら影響を与えないと判断した。
【０１９３】
＜実験２１：分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及びインスリン量に与える影響＞
分岐α−グルカンをラットに摂取させると澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べて、血糖値及びインスリン量の増加が抑制されることが明らかになったので、分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及び血中のインスリン量に与える影響を調べる試験を行った。市販の澱粉部分分解物（松谷化学工業株式会社販売、商品名「パインデックス＃１」）及び後述する実施例５の方法に準じて調製した分岐α−グルカンを用いて、ヒトでの血糖値及びインスリンの上昇を調べた。健康なボランティアの男性１２名（年齢２６乃至５４歳、平均４１±７歳）を被験者として、試験前日の２１時以降、翌日の試験開始時（９時頃）までの間、水以外の飲食物の摂取を禁止した。この被験者に、まず澱粉部分分解物５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を、摂取開始から２分以内に摂取させた。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後に採血した。次いで、１週間以上の間隔をあけて、同じ被験者に分岐α−グルカン５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を用いた以外は澱粉部分分解物の場合と同様にして試験し、採血した。それぞれの血液の血糖値及びインスリン量を、民間の臨床検査機関（社団法人岡山市医師会総合メディカルセンター）に委託して測定した。試験標品摂取時の血糖値及びインスリン量の経時的な変化、及び、その数値に基づき計算した、摂取直後乃至摂取１２０分間血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積：ＡＵＣ０−２ｈｒ（ｍｇ・ｈｒ／ｄｌ））及びインスリン量のＡＵＣ０−２ｈｒ（μＵ・ｈｒ／ｄｌ）値、摂取直後乃至摂取１２０分間の血糖値のＡＵＣ値の増加量及びインスリン量のＡＵＣ値の増加量（ΔＡＵＣ０−２ｈｒ）を、表３８にまとめて示す。
【０１９４】
【表３８】
【０１９５】
表３８の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンをヒトが摂取した場合には、ラットを用いた実験（実験２０）と同様に、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値が、澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べ有意に低いことが判明した。
【０１９６】
＜実験２２：分岐α−グルカンの生体内脂質低減作用＞
実験１９−４、実験２１において、分岐α−グルカンを摂取することにより、血糖値及び血中のインスリン量の上昇が低くなることが判明したので、当該分岐α−グルカンの摂取が生体内脂質に及ぼす影響についても検討した。
【０１９７】
＜実験２２−１：分岐α−グルカンの摂取が脂肪吸収に与える影響＞
後述する実施例５の方法で調製した分岐α−グルカンを用いて、７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に４群各群１５匹に分けて、１週間、表３３に示す精製飼料で予備飼育後、２群各１５匹は、同表に示す分岐α−グルカンを固形物として５質量％配合した組成の飼料（試験飼料）で、週間または８週間飼育した。残りの２群各１５匹は、対照として、精製飼料で同様に４週間または８週間飼育した。分岐α−グルカン配合飼料で飼育した１群１５匹を飼育開始４週間で、及び、残り１群１５匹を８週間で、各々、エーテル麻酔下で下大静脈より採血後屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪量、血清脂質、腸粘膜湿質量および盲腸内容物などを調べた。対照のラットも同様に処理した。その結果を表３９に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重と摂餌量を測定しながら、実験２０−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。また、解剖前は一晩絶食とした。分岐α−グルカン配合飼料飼育４週間及び８週間の体重増加量、摂餌量、飼料利用効率（体重増加量／摂餌量）、解剖時の、体重、臓器等の質量、腸粘膜質量、内臓脂肪質量、盲腸内の内容物の質量、水分、ｐＨを表３９に示す。また、血清脂質の測定結果も表３９に併せて示す。なお、血清脂質のうち、中性脂肪、総コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールの測定は、それぞれ市販の中性脂肪トリグリセライド測定用キット（商品名「トリグリセライド Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）、総コレステロール測定用キット（商品名「コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売、）及びＨＤＬ−コレステロール測定用キット（商品名「ＨＤＬ−コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）を使用した。また、総コレステロール値からＨＤＬ−コレステロール値を減じてＬＤＬ−コレステロール値とした。
【０１９８】
【表３９】
【０１９９】
表３９の結果から明らかなように、分岐α−グルカンを、固形物として５質量％配合した飼料を摂取させると、精製飼料のみで飼育した場合に比して、摂取４週間では、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示し、摂取８週間では、腎臓周囲及び睾丸周囲脂肪のいずれも有意に低値を示し、その低下は、特に睾丸周囲脂肪で顕著であった。また、摂取４週間及び８週間で腸粘膜質量が有意に増加し、その増加は摂取８週間で顕著となった。また、摂取８週間で盲腸内ｐＨが有意に低下した。さらに、血清脂質についてみると、中性脂肪値が摂取８週間で、総コレステロールが摂取４週間及び８週間で、何れも低下傾向を示し、ＬＤＬ−コレステロールも低下した。これら以外の測定値は、対照と差は認められなかった。なお、具体的なデータは示さないが、盲腸内の有機酸濃度は、対照と差は認められなかった。この結果は、分岐α−グルカンが、生体内脂質の低減作用を有することを物語っている。また、腸粘膜の質量増加が認められることから、分岐α−グルカンによる脂質の過剰蓄積の抑制や実験２０乃至２１で確認された耐糖性の増強には、この試験で確認されたムチン分泌の増大を伴う小腸粘膜層の肥厚に起因する消化酵素の作用性低下や消化されたグルコースや脂肪の消化・吸収阻害、遅延が、重要な役割を果たしていると推察される。
【０２００】
＜実験２２−２：生体内脂質の過剰蓄積抑制に与える分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２２−１において、分岐α−グルカンの摂取により、生体内脂質の過剰蓄積が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンの重量平均分子量の違いによる作用を検討した。すなわち、精製飼料に、実験２０−２で使用したものと同じ重量平均分子量の異なる８種類の分岐α−グルカンを、それぞれ固形物として５質量％配合した８種類の試験飼料を調製した。ウィスター系ラット雌性７週齢（日本チャールスリバー株式会社販売）４５匹を、無作為に９群各群５匹に分けて、１週間、精製飼料で予備飼育した。このラットのうち、８群については、表４０に示す重量平均分子量の異なる分岐α−グルカンの何れかを配合した試験飼料（試験飼料１乃至８）で８週間飼育した。残りの１群５匹のラットは、精製飼料でそのまま８週間飼育し、対照群とした。分岐α−グルカンを配合した飼料を摂取して８週間経過したラット及び精製飼料を摂取して８週間経過した対照群のラットを、それぞれエーテル麻酔下で採血後、屠殺して、その腸間膜周囲、腎臓周囲及び睾丸周囲の脂肪質量（湿質量）、並びに、血清中の中性脂肪及び総コレステロールを、実験２２−１と同じ方法で測定した。結果を表４０に示す。
【０２０１】
【表４０】
【０２０２】
表４０の結果から明らかなように、重量平均分子量が異なる分岐α−グルカンを摂取させた場合、何れの群においても内臓脂肪質量及び血清脂質量が、対照群よりも低値となり、当該分岐α−グルカンが内臓脂肪質量及び血清脂質量の上昇を抑制することが分かった。また、この抑制効果の程度で比較すると、分岐α−グルカンの重量平均分子量が２，６７０乃至４４，１５１のもので効果が顕著となり、２，６７０乃至２５，６１８の場合に特に強い効果が認められた。
【０２０３】
＜実験２２−３：分岐α−グルカンの摂取量の違いが内臓蓄積脂肪に与える影響＞
７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に５群各群５匹に分けて、１週間、市販の固形飼料で予備飼育後、３群各５匹は、分岐α−グルカンを１、２又は５質量％配合した表３３に示す配合の精製飼料（各々、試験飼料１、試験飼料２又は試験飼料３）で４週間飼育した。残りの２群各５匹の内、１群５匹は、市販の難消化性デキストリン（松谷化学販売、商品類「ファイバーソルＩＩ」）を５質量％配合した表３３に示す精製飼料で４週間飼育した（対照１）。また、残りの１群５匹は、表３３に示す精製飼料で４週間飼育した（対照２）。分岐α−グルカンを配合した精製飼料で４週間飼育後、各群のラットを、各々、屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪量を測定した。対照１及び２のラットも同様に処理した。その結果を表４１に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重と摂餌量を測定しながら、実験２２−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。なお、解剖前のラットは一晩絶食とした。また、分岐α−グルカン或いは難消化性デキストリンを配合した精製飼料で４週間飼育したときの、飼育期間中の餌の総摂取量に分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの配合割合（％）を乗じ、１００で除して、当該飼料で飼育した期間中の分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの総摂取量を計算し、さらに、飼育期間（２８日）で、除して、１日当たりの分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの摂取量を計算して、表４１に併せて示す。
【０２０４】
【表４１】
【０２０５】
表４１の結果から明らかなように、分岐α−グルカンを、固形物として１質量％配合した精製飼料（試験飼料１）を４週間摂取させると、精製飼料のみで飼育した場合（対照２）に比して、睾丸周囲の内臓脂肪質量が低値を示し、２又は５質量％配合した精製飼料（試験飼料２又は試験飼料３）を４週間摂取させると、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示し、睾丸周囲脂肪質量は有意に低値を示した。腸間膜周囲脂肪質量は、分岐α−グルカンを、固形物として１又は２質量％配合した精製飼料（試験飼料１又は試験飼料２）で飼育した場合には、精製飼料のみで飼育した場合（対照２）に比して増加し、５質量％配合した精製飼料（試験飼料３）で飼育した場合には、精製飼料で飼育した場合（対照２）と差は認められなかった。また、５質量％市販難消化性デキストリンを配合した精製飼料を４週間摂取させた場合（対照１）には、精製飼料のみで飼育した場合（対照２）に比して、腸間膜周囲脂肪質量に差は認められず、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示したものの、個体間の脂肪質量の変動幅が大きく、有意な差は認められなかった。分岐α−グルカンと市販難消化性デキストリンとを摂取させた場合の、内臓脂肪蓄積に対する抑制効果の強さを比較すると、分岐α−グルカンの方が強く、その効果は、睾丸周囲脂肪について顕著であった。この結果は、当該分岐α−グルカンが、内臓脂肪、とりわけ、睾丸周囲脂肪の蓄積抑制作用を有することを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、各群間で、体重の増加量、摂餌量に有意の差は認められなかった。
【０２０６】
＜実験２２−４：分岐α−グルカンの摂取形態の違いが内臓蓄積脂肪に与える影響＞
７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に５群各１１匹に分けて、１週間、市販の固形飼料で飼育後、３群各１１匹は、後述する実施例５の方法で調製した分岐α−グルカンを、０．５、１又は２質量％含む脱イオン水（各々、試験飲水１、試験飲水２又は試験飲水３）を飲水として与えながら、市販のラット用固形飼料で４週間飼育した。残りの２群各１１匹の内、１群１１匹は、市販の難消化性デキストリン（松谷化学販売、商品類「ファイバーソルＩＩ」）を２質量％含む脱イオン水を飲水として与えながら、市販のラット用固形飼料で４週間飼育した（対照１）。また、残りの１群１１匹は、脱イオン水を飲水として与えながら、市販のラット用固形飼料で同様に４週間飼育した（対照２）。分岐α−グルカンを含む飲水で４週間飼育後の各群のラットを、屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪質量を測定した。対照１及び２のラットも同様に処理した。その結果を表４２に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重、摂餌量と飲水の摂取量を測定しながら、実験２２−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。また、分岐α−グルカン或いは難消化性デキストリンを含む飲水で４週間飼育したときの、飼育期間中の飲水の総摂取量に分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの含有割合（％）を乗じ、１００で除して、当該飲水で飼育した期間中の分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの総摂取量を計算し、さらに、飼育期間（２８日）で、除して、１日当たりの分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの摂取量を計算して、表４２に併せて示す。
【０２０７】
【表４２】
【０２０８】
表４２の結果から明らかなように、分岐α−グルカンを、固形物として０．５、１又は２質量％含む飲水（試験飲水１、試験飲水２又は試験飲水３）を与えて４週間飼育すると、脱イオン水のみで飼育した場合（対照２）に比して、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が何れも有意に低値を示した。また市販難消化性デキストリンを５質量％含む飲水を与えて４週間飼育した場合（対照１）にも、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が何れも有意に低値を示した。分岐α−グルカンと市販難消化性デキストリンとを飲水摂取させた場合の、内臓脂肪蓄積に対する抑制効果の強さを比較すると、分岐α−グルカンの方が強く、その効果の差は、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪の何れの部位について顕著であった。また、飼育条件は違うものの、分岐α−グルカンを混餌摂取させた場合（実験２２−３）と飲水に溶解して摂取させた場合との内臓脂肪質量を比較すると、例えば、２質量％分岐α−グルカン配合精製飼料（試験飼料２）と０．５質量％含有飲水（試験飲水１）で４週間飼育した場合には、１日あたりの分岐α−グルカン摂取量は、各々０．７１ｇ及び０．３４ｇと、０．５質量％分岐α−グルカン含有飲水で飼育した場合の方が、分岐α−グルカンの１日あたり摂取量は少ないにも拘わらず、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪の何れの部位について、飲水摂取の方が脂肪質量の増加の抑制が顕著であった。具体的には、２質量％分岐α−グルカン配合精製飼料（試験飼料２）で飼育した場合には睾丸周囲脂肪質量のみが対照２と有意の差が認められただけで、腸間膜周囲脂肪質量は対照２に比して増加したのに対して、０．５質量％含有飲水（試験飲水１）で飼育した場合には、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲の脂肪質量が何れも有意に低値を示した。この結果は、当該分岐α−グルカンが、優れた内臓脂肪の蓄積抑制作用を有することを物語っている。また、当該分岐α−グルカンは、混餌摂取よりも飲水に溶解して摂取する方が、摂取量が同じ場合、内臓脂肪蓄積抑制効果に優れていることを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、各群間で、体重の増加量、摂餌量及び飲水の摂取量に有意の差は認められなかった。
【０２０９】
以上の実験の結果から、当該分岐α−グルカンは、炭水化物や脂質摂取後の血中インスリン上昇抑制剤、内臓脂肪蓄積抑制剤及び脂質代謝改善剤として利用できることが判明した。さらに、実験２２の結果から、分岐α−グルカンは、固状の形態で摂取するよりも、溶液の形態で摂取する方が、摂取量が同じ場合には、その生理機能を効果的に発揮でき、また、その生理作用は市販の難消化性デキストリンよりも強いことも判明した。
【０２１０】
以下、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の製造例を実施例１及び２に、本発明の脂質代謝改善剤の有効成分である分岐α−グルカンの製造例を実施例３乃至６に示す。また、本発明の脂質代謝改善剤の有効成分である分岐α−グルカンの物理化学的性質を実施例７に例示する。本発明の脂質代謝改善剤である分岐α−グルカンを含有せしめた脂質代謝改善剤を実施例８乃至１５に示す。
【実施例１】
【０２１１】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を実験５の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮粗酵素液を調製した。本濃縮粗酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は２００単位／ｍｌであった。また、本濃縮酵素液には約２５単位／ｍｌのアミラーゼ活性も認められた。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明で使用するα−グルカンの製造に有利に利用できる。
【実施例２】
【０２１２】
アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を実験８の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮酵素液を調製した。本濃縮酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は５０単位／ｍｌであった。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明で使用する分岐α−グルカンの製造に有利に利用できる。
【実施例３】
【０２１３】
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実施例１の方法で得た濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１０単位加え、４０℃、４８時間作用させた。反応終了後、反応液を９５℃に加熱し、１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度５０質量％の分岐α−グルカン溶液を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析における２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１対１．３を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７０．３％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の３．０％及び４．８％であった。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量６，２２０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．２であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化により、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．１質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７５．８質量％であった。本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例４】
【０２１４】
３０％タピオカ澱粉乳に最終濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり０．２質量％になるように加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液を、オートクレーブ（１２０℃）を１０分間行った後、４０℃に冷却し、これに実施例２の方法で調製したα−グルコシル転移酵素の濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１：１．６を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の８０．０％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．４及び１．７％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量１０，３３０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．９であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．７質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は６８．６質量％であった。本分岐α−グルカンは、本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例５】
【０２１５】
２７．１質量％トウモロコシ澱粉液化液（加水分解率３．６％）に、最終濃度０．３質量％となるように亜硫酸水素ナトリウムを、また、最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加えた後、５０℃に冷却し、これに実施例１の方法で調製した濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１１．１単位加え、さらに、５０℃、ｐＨ６．０で６８時間作用させた。その反応液を８０℃で６０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：２．５を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６８．４％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．６及び６．８％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量４，０９７ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．１であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７９．４質量％であった。本分岐α−グルカンは、本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例６】
【０２１６】
濃縮粗酵素液に替えて実験６の方法で調製したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来の精製α−グルコシル転移酵素を用い、シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を基質固形物１グラム当たり１，０００単位加えた以外は実施例５と同様にして分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比は１：４を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６７．９％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．３及び５．３％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量２，９７９ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．０であった。さらに、本分岐α−グルカンはイソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７７質量％であった。本分岐α−グルカンは、本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例７】
【０２１７】
実施例５で調製した分岐α−グルカンについて、常法に従って物理化学的性質を調べ、本発明で使用する分岐α−グルカンの性質の一例として表４３にまとめた。
【０２１８】
【表４３】
【実施例８】
【０２１９】
＜脂質代謝改善剤＞
原乳１００質量部に実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液２質量部及び蔗糖３重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して、加糖練乳形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を使用したスイーツや料理を摂取すれば、効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例９】
【０２２０】
＜脂質代謝改善剤＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末５０質量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）５０質量部を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料形態の脂質代謝改善剤を得た。本品は液状なので、摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１０】
【０２２１】
＜脂質代謝改善剤＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１０質量部、含水結晶トレハロース２０質量部、無水結晶マルチトール２０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、及び粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液をバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して粉末ジュース形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を水に溶解してジュースとして摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１１】
【０２２２】
＜脂質代謝改善剤＞
コーンスターチ１００質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液３０質量部、トレハロース含水結晶７０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装してカスタードクリーム形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を、シューに詰めるなどして、摂取すれば、脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１２】
【０２２３】
＜脂質代謝改善剤＞
原料小豆１０質量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、小豆粒餡約２１質量部を得た。この生あんに蔗糖１４質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液５質量部と水４質量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えて粒餡を壊さないように練り上げ、餡形態の脂質代謝改善剤を約３５質量部得た。本品を使用して餡パン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などを製造し、摂取すれば脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１３】
【０２２４】
＜脂質代謝改善剤＞
小麦粉１００質量部、イースト菌２質量部、蔗糖５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１質量部および無機フード０．１質量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げて、パン形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を摂取すれば脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１４】
【０２２５】
＜脂質代謝改善剤＞
４０質量％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を水に溶解して摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１５】
【０２２６】
＜脂質代謝改善剤＞
実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物を２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして、流動食形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１６】
【０２２７】
＜脂質代謝改善剤＞
実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末３０質量部、茶抽出物０．１質量部、グァバ葉抽出物０．０１質量部、Ｌ−カルニチン酒石酸塩０．０２質量部、蔗糖糖１質量部、α、α−トレハロース２質量部、チアミン０．００１質量部に水を加えて、全量を５００質量部とし、３５０ｍｌずつペットボトルに充填して、清涼飲料形態の脂質代謝改善剤を調製した。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１７】
【０２２８】
＜脂質代謝改善剤＞
焙煎され、挽かれたレギュラーコーヒー用の豆を、常法により、沸騰水道水を用いて、９０℃で、５分間ネルドリップして、コーヒー抽出液を得た。このコーヒー抽出液５０質量部、実施例６の方法で調製した分岐α−グルカン４質量部、牛乳３．５質量部、グラニュー糖６質量部を混合し、全体として１００質量部になるように沸騰水道水を加えた。次に、５質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨを６．５に調整し、２５０ｍｌずつスチール缶に充填して、湯浴中で、９３℃になるまで予備加熱した後、密封し、１２３℃で、１５分間殺菌し、次いで、流水中で、１時間急冷して、缶コーヒー形態の脂質代謝改善剤を調製した。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１８】
【０２２９】
＜脂質代謝改善剤＞
実施例６の方法で調製した分岐α−グルカン粉末３質量部、フマル酸第一鉄０．０６質量部、イノシトール０．１質量部、塩化カルニチン０．２質量部、硝酸チアミン０．０１質量部、リン酸リボフラビンナトリウム０．０１質量部、塩酸ピリドキシン０．０１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸１質量部、アミノエチルスルホン酸２質量部、キシリトール４質量部、α，α−トレハロース５質量部、エリスリトール５、クエン酸０．８質量部、安息香酸ナトリウム０．０６質量部、ミックスフルーツフレーバー０．１質量部に適量のクエン酸ナトリウムを加え、精製水に溶解した後、ｐＨを３．０に調整し、精製水を加えて全量を１００質量部とした。この液をろ紙でろ過し、滅菌装置を用いて、ろ液を８０℃で２５分間加熱滅菌した後、１００ｍｌずつ、ガラス瓶に充填しキャップを施して内服液形態の脂質代謝改善剤を調製した。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【産業上の利用可能性】
【０２３０】
本発明の脂質代謝改善剤は、有効成分である分岐α−グルカンの安全性が高く、消化性も市販の難消化性デキストリンと遜色がなく、しかも、優れた脂質代謝改善作用を備えている。また、本発明の脂質代謝改善剤は、長期間摂取しても副作用がなく、安心して使用することができ。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素標品をそれぞれ用いて澱粉部分分解物より調製したグルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図２】澱粉部分分解物及び本発明で使用する分岐α−グルカンの構造を模式的に示す図である。
【図３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図７】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図８】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図９】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１０】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適温度を示す図である。
【図１２】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図１３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの温度安定性を示す図である。
【図１４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図１５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とアミラーゼ精製品とを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とイソアミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１７】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とα−アミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１８】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とＣＧＴａｓｅとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１９】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品と、イソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【符号の説明】
【０２３２】
図１及び図１５〜１９において、
イ：分子量１０００，０００ダルトンに相当する溶出位置
ロ：分子量１００，０００ダルトンに相当する溶出位置
ハ：分子量１０，０００ダルトンに相当する溶出位置
ニ：分子量１，０００ダルトンに相当する溶出位置
ホ：分子量１００ダルトンに相当する溶出位置
図１において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：グルカンＡのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：グルカンＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
１：グルコース重合度４９９に相当する位置
２：グルコース重合度６．３に相当する位置
３：グルコース重合度３８４に相当する位置
４：グルコース重合度２２．２に相当する位置
５：グルコース重合度１０．９に相当する位置
６：グルコース重合度１に相当する位置
７：グルコース重合度４３３に相当する位置
８：グルコース重合度２２．８に相当する位置
９：グルコース重合度１０．９に相当する位置
１０：グルコース重合度１に相当する位置
図２において、
１：澱粉部分分解物の模式図
２：本発明で使用する分岐α−グルカンの模式図
ａ：非還元末端グルコース残基
ｂ：α−１，３結合しているグルコース残基
ｃ：α−１，４結合しているグルコース残基
ｄ：α−１，６結合しているグルコース残基
ｅ：α−１，３，６結合しているグルコース残基
ｆ：α−１，４，６結合しているグルコース残基
斜め向き破線：α−１，３結合
横向き実線：α−１，４結合
縦向き実線：α−１，６結合
図１３において、
●：カルシウムイオン非存在下
○：１ｍＭカルシウムイオン存在下
図１５において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１６において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１７において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１８において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１９において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐α−グルカンを有効成分とする脂質代謝改善剤に関し、詳細には、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカン、及び、マルトース及びグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、α−グルコシル転移することによって、当該分岐α−グルカンを生成する分岐α−グルカンを含んでなる脂質代謝改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活や生活習慣の洋風化に伴い、高カロリー、高脂肪食を摂取する機会が増えて、高脂血症、さらには、肥満乃至標準体重を超過した過体重のヒトが増加している。肥満や過体重に加えて、高血圧や高脂血症などの生活習慣病の因子を有する場合は、メタボリックシンドロームと呼ばれ、その状態が継続すると、心筋梗塞、脳卒中、ＩＩ型糖尿病などの心血管性疾患を発症するリスクが増大するといわれており、これらを回避するためにも、脂質代謝をコントロールすることは、ますます重要になってきている。脂質代謝を改善して、体重の超過を抑制及び／又は予防するために一般に栄養士によって提唱されている方法としては、低カロリーまたは低脂肪養生法が知られている。また、脂質代謝改善に訴求した食品も市販されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、低カロリー食は風味が単調であるために長期間経つとその人によって拒絶される場合がある。また、健康補助食品にあっても、その味質や食感などに問題があり、これらを長期間継続することはできない場合などには、そのリバウンドがおこり、これらの療法を開始前するよりも脂質代謝が増悪する結果となったり、健康に障害がでる場合すら認められる。
【０００３】
近年、高脂血症やメタボリックシンドロームの予防乃至改善用の食品素材として、食物繊維が注目されている。食物繊維とは、本来、動物が消化し難いセルロース、リグニン、ヘミセルロース、ペクチンなど植物細胞成分を意味するものの、広義には、アミラーゼで消化されない難消化性の水溶性多糖類も含まれ、これらは水溶性食物繊維と呼ばれている。近年、食物繊維は、その本来の機能としての整腸作用、血中コレステロール低下作用、血糖調節作用などに加えて、腸内フローラを改善するプレバイオティクスとしての機能も注目されつつある。しかしながら、食物繊維はカルシウムと並んで日本人の食生活で不足している栄養素と言われており、現在の日本人の平均的な食物繊維摂取量は、平成６年に出された第５次改定「日本人の栄養所要量」において示された食物繊維の目標摂取量２０〜２５ｇ／日に対し、目標の５〜８割にしか達していないことが指摘されている（例えば、非特許文献１などを参照）。このような状況下、各種飲食物の原料として利用でき、且つ、水溶性食物繊維として有用な難消化性の多糖類が種々提案されている。
【０００４】
例えば、水溶性食物繊維として、難消化澱粉（湿熱処理ハイアミロースコーンスターチ）、グァーガム分解物、グルコマンナン、低分子アルギン酸など、自然界に存在する多糖を原料とするものが市場に流通している。しかしながら、これらはいずれも粘性が高く、食品に添加した場合、風味・食感を損なうなどの欠点を有することから、その利用は一部に限定されている。一方、低粘度の水溶性食物繊維として、ポリデキストロース（米国ファイザー社が開発）や難消化性デキストリンが食品分野で広く利用されている。ポリデキストロースは、グルコースとソルビトール及びクエン酸を高真空下で加熱し、化学的な反応により重合させて得られる合成多糖であり、グルコースが１，２、１，３、１，４、１，６、１，２，６、１，４，６位などでグルコシド結合した複雑な分岐を有することが知られている。また、難消化性デキストリンは、化学的な反応により澱粉を分解すると同時に転移や逆合成反応を起こさせ、澱粉が本来有さない、１，２、１，３、１，２，４、１，３，４の各グルコシド結合を導入することにより消化性を低減させた合成多糖である。この難消化性デキストリンは、澱粉に少量の塩酸を添加し、粉末の状態で加熱して得た焙焼デキストリンを水に溶解し、α−アミラーゼを添加して加水分解して得られた低粘度溶液を精製し、濃縮、噴霧乾燥して製造されている。難消化性デキストリンには、さらに消化性を低減させる目的で、グルコアミラーゼを添加して可消化部分をグルコースにまで分解し、グルコースを分離除去して同様に精製、噴霧乾燥して製造した製品もある。これらポリデキストロースや難消化性デキストリンに導入された新たなグルコシド結合はα−及びβ−の両アノマー型が共に含まれ、さらに還元末端グルコース残基は部分的に１，６−アンヒドロ−グルコースに変化していると言われている（例えば、非特許文献２などを参照）。しかしながら、難消化性デキストリンは、原料澱粉からの収率が低く、加えて、着色し易く、工業生産する上で大きな欠点となっている。また、ポリデキストロースや難消化性デキストリンも、これら単独では、十分な脂質代謝改善効果が得られない場合もある。
【０００５】
グルカンにおけるグルコースの結合様式であるグルコシド結合（以下、本明細書では「グルコシド結合」を単に「結合」と略称する。）の内、α−１，６結合はα−１，４結合に比べてアミラーゼで分解され難いことから、α−１，６結合を多く含むグルカンにも水溶性食物繊維としての用途が期待できる。例えば、乳酸菌に属するロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のデキストランスクラーゼ（ＥＣ ２．４．１．５）によりスクロースを原料として製造されるデキストランは、グルコースが主にα−１，６結合で重合したグルカンであって、α−１，２結合及びα−１，３結合の分岐を有する場合もある。ロイコノストック・メセンテロイデス Ｂ−５１２Ｆ株由来のデキストランスクラーゼを用いた場合、得られるデキストランにおける結合のα−１，６結合の含量は９０％以上にもなり、難消化性であることが期待される。しかしながら、デキストランは、スクロースからの収率が低く、また、粘性が高いため精製操作が煩雑で、コスト高になることから、水溶性食物繊維として利用しようとする試みはほとんど行われていない。
【０００６】
また、安価な澱粉にアミラーゼを作用させ、主としてα−１，４結合を分解することによりα−１，６結合の含量を高めて水溶性食物繊維を調製しようとする試みも為されている。特許文献２には、澱粉液化液に、α−アミラーゼとβ−アミラーゼの混合物を作用させた後、残存するデキストリン部を回収することにより、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合を１０〜２０％に高めた分岐デキストリンを調製する方法が提案されている。しかしながら、この分岐デキストリンは、澱粉が本来持つ分岐（α−１，６結合）を保持しつつ、グルコースがα−１，４結合で連なった直鎖部分を取り除くことでα−１，６結合の割合を高めるという方法で製造されるため、原料澱粉からの収率が低く、また、大幅な消化性の低減が期待できないなどの課題がある。また、澱粉部分分解物（デキストリン）に作用しα−１，６結合を導入する酵素として、デキストリンデキストラナーゼ（ＥＣ ２．１．１．２）が知られている（例えば、非特許文献３を参照）。デキストリンデキストラナーゼは、澱粉部分分解物に作用し、主としてα−１，６グルコシル転移反応を触媒することにより、デキストラン構造（グルコースがα−１，６結合で連なった構造）を生成する酵素であるものの、従来から知られている、酢酸菌に属するアセトバクター・カプスラタム(Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ)由来のデキストリンデキストラナーゼは、α−１，６結合の導入割合が少ない（例えば、非特許文献４などを参照）こと、また、酵素自体の安定性が低いことなどの問題点があり、現実に使用されるに至っていない。このような状況下、従来の難消化性グルカンの持つ上記のごとき物性的な問題を解決でき、且つ、脂質代謝改善作用に優れた新規難消化性グルカン（食物繊維）を含有する脂質代謝改善剤の提供が強く望まれている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３１５３７９号公報
【特許文献２】特開２００１−１１１０１号公報
【非特許文献１】『食物繊維の市場動向を探る』、「食品と開発」、第３４巻、第２号、第２４乃至２７頁（１９９９年）
【非特許文献２】『低分子水溶性食物繊維』、食品成分シリーズ「食物繊維の科学」、第１１６頁乃至１３１頁、朝倉書店（１９９７年）
【非特許文献３】山本一也ら、『バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー』、第５６巻、(１９９２年)、第１６９頁乃至１７３頁
【非特許文献４】鈴木雅之ら、「ジャーナル・オブ・アプライド・グリコサイエンス(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、第４８巻、第２号、第１４３頁乃至１５１頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、長期間摂取しても安全な、食物繊維を含有する脂質代謝改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明者らは、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを原料（基質）とし、分岐（本明細書において、「分岐」とは、グルカンにおけるグルコースの結合様式の内、α−１，４結合以外のグルコースの結合様式を意味する）を比較的多く有する分岐α−グルカンを広く探索した。その結果、土壌から単離した微生物、ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株が産生する新規なα−グルコシル転移酵素を、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンに作用させたときに生成する下記に示す特徴を有するα−１，４、α−１，６、α−１，３、α−１，４，６及びα−１，３，６結合を有する分岐α−グルカンが、原料α−１，４グルカンに比べて、α−１，６結合の割合が大幅に増加しており、且つ、α−１，３及びα−１，３，６結合を有し、顕著な難消化性を示す水溶性食物繊維であり、これを配合した組成物が、脂質代謝改善剤として有用であることを見出した。さらに、当該分岐α−グルカンは、意外にも、固状の組成物の形態で摂取するよりも液状の組成物の形態で摂取する方が、分岐α−グルカンの配合割合を少なくしても、その生理機能を効果的に発揮できることを見出して本発明を完成した。
【００１０】
当該分岐α−グルカンの特徴：
メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である。
【００１１】
すなわち、本発明は、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする分岐α−グルカンを配合した脂質代謝改善剤、とりわけ、液液の形態の脂質代謝改善剤を提供することによって上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、脂質代謝を効果的に改善することができるので、血中インスリンの上昇、血中脂質の増加、内臓脂肪の蓄積などを効果的に抑制乃至予防することができる。また、本発明の脂質代謝改善剤は、長期間摂取しても副作用の心配がなく安心して使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で言うグルカンとは、グルコースを構成糖とするグルコース重合度３以上のオリゴ糖ないしは多糖を意味する。本発明で使用する分岐α−グルカンは、グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である；
ことを特徴とする。
【００１４】
本発明でいうメチル化分析とは、多糖又はオリゴ糖においてこれを構成する単糖の結合様式を決定する方法として一般的に知られている方法である。メチル化分析をグルカンにおけるグルコースの結合様式の分析に用いる場合、まず、グルカンを構成するグルコース残基における全ての遊離の水酸基をメチル化し、次いで、完全メチル化したグルカンを加水分解する。次いで、加水分解により得られたメチル化グルコースを還元してアノマー型を消去したメチル化グルシトールとし、さらに、このメチル化グルシトールにおける遊離の水酸基をアセチル化することにより部分メチル化グルシトールアセテート（以下、本明細書では、「部分メチル化グルシトールアセテート」におけるアセチル化された部位と「グルシトールアセテート」の表記を省略して、「部分メチル化物」と略称する場合がある。）を得る。得られる部分メチル化物を、ガスクロマトグラフィーで分析することにより、グルカンにおいて結合様式がそれぞれ異なるグルコース残基に由来する各種部分メチル化物は、ガスクロマトグラムにおける全ての部分メチル化物のピーク面積に占めるピーク面積の百分率（％）で表すことができる。そして、このピーク面積％から当該グルカンにおける結合様式の異なるグルコース残基の存在比、すなわち、各グルコシド結合の存在比率を決定することができる。本願明細書においては、部分メチル化物についての「比」は、メチル化分析のガスクロマトグラムにおけるピーク面積の比を意味し、部分メチル化物についての「％」はメチル化分析のガスクロマトグラムにおける「面積％」を意味するものとする。
【００１５】
上述した（１）における、２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，６−トリメチル化物」と略称する）とはＣ−４位が１，４結合にあずかるグルコース残基を意味し、２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，４−トリメチル化物」と略称する）はＣ−６位が１，６結合にあずかるグルコース残基を意味する。そして、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：０．６乃至１：４の範囲にある」とは、すなわちメチル化分析における部分メチル化グルシトールアセテートのガスクロマトグラムにおいて、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計に対するＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の割合が３７．５乃至８０．０％の範囲を示すことを意味する。
【００１６】
上述した（２）における、「２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との合計が部分メチル化物の６０％以上を占める」とは、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−４位のみが結合にあずかるグルコース残基とＣ−１位以外にＣ−６位のみが結合にあずかるグルコース残基の合計がグルカンを構成する全グルコース残基の６０％以上を占めることを意味する。
【００１７】
同様に、上述した（３）における、「２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトール」（以下、「２，４，６−トリメチル化物」と略称する）とは、Ｃ−３位が１，３結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４，６−トリメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上１０％未満である」とは、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位のみが結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上１０％未満存在することを意味する。
【００１８】
さらに同様に、上述した（４）における「２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトール」（以下、「２，４−ジメチル化物と略称する」）とは、Ｃ−３位及びＣ−６位の両方がそれぞれ１，３結合と１，６結合にあずかるグルコース残基を意味し、「２，４−ジメチル化物が部分メチル化物の０．５％以上である」とは、本発明で使用する分岐α−グルカンは、Ｃ−１位以外にＣ−３位とＣ−６位が結合にあずかるグルコース残基がグルカンを構成する全グルコース残基の０．５％以上存在することを意味する。
【００１９】
上記の（１）乃至（４）の条件を全て充足する本発明で使用する分岐α−グルカンは、これまで知られていない新規なグルカンである。本発明で使用する分岐α−グルカンは、メチル化分析において、上記（１）乃至（４）の条件を充足する限り、グルコース残基の結合順序は特に限定されない。
【００２０】
本発明で使用する分岐α−グルカンは、通常、様々なグルコース重合度を有する分岐α−グルカンの混合物の形態にあり、そのグルコース重合度は、通常、１０以上である。また、本発明で使用する分岐α−グルカンにおいて、その重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は、通常、２０未満である。
【００２１】
さらに、本発明で使用する分岐α−グルカンは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−１，２、α−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれの結合であっても加水分解する特徴を有するイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）を作用させると、消化物の固形物当たりイソマルトースを、通常、２５質量％以上５０質量％以下生成する。
【００２２】
また、本発明で使用する分岐α−グルカンは、平成８年５月厚生省告示第１４６号の栄養表示基準、「栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）」における第８項、「食物繊維」に記載された、「高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）」に準じて水溶性食物繊維含量を求めると、水溶性食物繊維を、通常、４０質量％以上含有する。上記高速液体クロマトグラフ法（以下、本明細書では「酵素−ＨＰＬＣ法」と略称する）の概略を説明するならば、試料を熱安定α−アミラーゼ、プロテアーゼ及びアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）による一連の酵素処理により分解処理し、イオン交換樹脂により処理液から蛋白質、有機酸、無機塩類を除去することにより高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用の試料溶液を調製する。次いで、ゲル濾過ＨＰＬＣに供し、クロマトグラムにおける、未消化グルカンとグルコースのピーク面積を求め、それぞれのピーク面積と、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法により求めておいた試料溶液中のグルコース量を用いて、試料の水溶性食物繊維含量を算出する方法である。本法の詳細については後述の実験の項で説明する。
【００２３】
本発明で使用する分岐α−グルカンは、後述する実験１９−２乃至１９−４に示すように、経口摂取しても唾液α−アミラーゼ、膵液α−アミラーゼや小腸粘膜酵素（小腸粘膜α−グルコシダーゼ）による分解を受け難いことから、消化吸収されにくく、血糖を急激に上昇させたり、インスリンの分泌を刺激することの少ない、低カロリーの水溶性食物繊維として利用することができる。また、当該分岐α−グルカンは、口腔内の微生物によって、酸発酵を起こし難く、スクロースと併用した場合にも歯垢の原因となる不溶性デキストランの生成を抑制する作用を有しているので、低う蝕性又は抗う蝕性糖質としても有利に利用できる。さらに、実験１５−５に示すように、当該分岐α−グルカンは、マウスを用いた急性毒性試験において、何ら毒性を示さないグルカンである。
【００２４】
さらに、当該分岐α−グルカンは、後述する実験２０及び２１に示すように、通常の澱粉質とともに摂取すると、澱粉質のみを摂取した場合に比べ、血糖値やインスリンの上昇を抑制する生理作用を有していることから、血糖上昇抑制剤として使用することもできる。
【００２５】
またさらに、上記生理作用に加えて、当該分岐α−グルカンは、後述する実験２２に示すように、摂取することにより、血中の中性脂肪やコレステロールの上昇を抑制する作用を有していることから、脂質代謝改善剤として使用することができる。さらに、当該分岐α−グルカンは、内臓脂肪の蓄積を抑制する作用を有していることから、内臓脂肪蓄積抑制剤、さらには、腹囲の増加抑制剤、メタボリツクシンドロームの予防剤乃至治療剤としても有利に利用できる。
【００２６】
当該分岐α−グルカンを脂質代謝改善剤の有効成分として用いる場合、分岐α−グルカンは、水溶性食物繊維含量が高いものほど作用効果に優れていることから、水溶性食物繊維として、通常、４０質量％以上、望ましくは、５０質量％以上、さらに望ましくは、６０質量％以上含有するものが好適に利用できる。
【００２７】
本発明で使用する分岐α−グルカンの調製に使用するα−グルコシル転移酵素とは、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、実質的に加水分解することなくα−グルコシル転移を触媒することにより、本発明で使用する分岐α−グルカンを生成する酵素を意味する。当該α−グルコシル転移酵素は、加水分解活性が弱い点、低濃度から高濃度まで基質溶液の濃度に依存せず効率の良い転移活性を有する点、及び、α−１，３及びα−１，３，６結合をも生成する点で、従来公知の真菌由来α−グルコシダーゼや酢酸菌由来デキストリンデキストラナーゼとは異なる酵素である。
【００２８】
α−グルコシル転移酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。マルトースを最終濃度１ｗ／ｖ％となるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液５ｍｌに、酵素液０．５ｍｌを加え４０℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．５ｍｌと５ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより反応停止させた後、反応液中のグルコース量を、常法に従ってグルコース・オキシダーゼ法で測定し、反応によって生成したグルコース量を算出する。α−グルコシル転移酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのグルコースを生成する酵素量と定義する。
【００２９】
本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の１つの具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０乃至５５℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定；
【００３０】
また、このα−グルコシル転移酵素の別の具体例としては、下記の理化学的性質を有するα−グルコシル転移酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、９０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、約５０℃；
（３）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０；
（４）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定；
【００３１】
これらのα−グルコシル転移酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として微生物が挙げられ、とりわけ、本発明者らが土壌より単離した微生物ＰＰ７１０株又はＰＰ３４９株が好適に用いられる。以下、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の産生能を有する微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株の同定試験において判明した菌学的諸性質を表１及び２にそれぞれ示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
以上の菌学的性質に基づき、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８６年）、及び、『リボソーマルデータベース』（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を参考にして、微生物ＰＰ７１０株及びＰＰ３４９株と公知菌との異同をそれぞれ検討した。その結果、微生物ＰＰ７１０株は、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）に属する微生物であり、微生物ＰＰ３４９株は、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）に属する微生物であることが判明した。本発明者等は、これら２菌株をそれぞれ、新規微生物バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９と命名し、いずれも平成１８年２月１日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託し、それぞれ受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１及びＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０として受託された。本発明で使用するα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物には、上記菌株はもとより、上記菌株に突然変異を誘発し、選抜して得られる酵素高産生変異株なども包含される。
【００３５】
α−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３６】
α−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物の培養は、通常、温度１５乃至３７℃でｐＨ５．５乃至１０の範囲、好ましくは温度２０乃至３４℃でｐＨ５．５乃至８．５の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養条件における培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したりするなどの手段を適宜採用する。また、培養方式は、回分培養、半連続培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００３７】
このようにしてα−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養した後、α−グルコシル転移酵素を含む培養物を回収する。α−グルコシル転移酵素活性は、培養微生物がバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）のいずれの場合も、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには常法の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液はそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には、濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空膜などを用いた膜濃縮法などを採用することができる。
【００３８】
さらに、α−グルコシル転移酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、α−グルコシル転移酵素を斯界において常用されている適宜の方法により固定化することもできる。固定化の方法としては、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００３９】
上記のように本発明で使用するα−グルコシル転移酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、斯界において常用されている適宜の方法、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、調製用電気泳動などの方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。
【００４０】
α−グルコシル転移酵素の基質となるグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンとしては、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼまたは酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、及びマルトース以上のマルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物が挙げられる。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレーテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９、以下、本明細書では「ＣＧＴａｓｅ」と略称する）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。さらには、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）などの澱粉枝切酵素を作用させることも随意である。澱粉は、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であってもよい。澱粉から本発明で使用する分岐α−グルカンを製造するに際しては、上記のような原料澱粉を、通常、糊化及び／又は液化して用いるのが好適である。澱粉の糊化・液化の方法自体は、公知の方法を採用することができる。さらに、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の基質は、エーテル化澱粉（ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、酢酸澱粉など）、エステル化澱粉（リン酸化澱粉、オクテニルコハク酸澱粉など）及び架橋澱粉（アセチル化アジピン酸架橋澱粉、リン酸架橋澱粉、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋澱粉など）など、澱粉の一部を化学的方法により誘導体化した化工澱粉であってもよい。
【００４１】
α−グルコシル転移酵素を基質に作用させるに際し、その基質濃度は特に限定されず、例えば、基質濃度０．５％（ｗ／ｖ）の比較的低濃度の溶液を用いた場合でも、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の反応は進行して分岐α−グルカンを生成する。工業的には、基質濃度は１％（ｗ／ｖ）以上、望ましくは５乃至６０％（ｗ／ｖ）、更に望ましくは、１０乃至５０％（ｗ／ｖ）の範囲から選ばれる濃度が好適であり、この条件下で、本発明で使用する分岐α−グルカンを有利に生成させることができる。反応温度は反応が進行する温度、すなわち６０℃付近までの温度で行えばよい。好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４乃至８の範囲、好ましくはｐＨ５乃至７の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。
【００４２】
例えば、澱粉又はその部分分解物やアミロースの水溶液に、α−グルコシル転移酵素を作用させた場合の分岐α−グルカンの生成メカニズムは、以下のように推察される。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらも、α−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する本発明で使用する分岐α−グルカンを生成する。
【００４３】
また、α−グルコシル転移酵素産生能を有するバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）は、その培養物中に本発明で使用するα−グルコシル転移酵素のみならず、ある種のアミラーゼをも同時に産生し、意外にも、α−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用してマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用させると、α−グルコシル転移酵素を単独で作用させた場合よりも水溶性食物繊維含量を更に高めた分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【００４４】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）が産生するアミラーゼとしては、下記の理化学的性質を有するものが挙げられる。
（１）作用
澱粉を加水分解するとともにグリコシル基の転移を触媒し、シクロデキストリンをも生成する。プルランを加水分解しパノースを生成する；
（２）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、５８，０００±１０，０００ダルトン；
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５５℃；
（４）至適ｐＨ
３５℃、３０分間反応の条件下で６乃至７；
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で４０℃まで安定、
ｐＨ６．０、１ｍＭ Ｃａ２＋イオン存在下で５０℃まで安定；及び
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ６．０〜８．０の範囲で安定；
【００４５】
本発明で使用する分岐α−グルカンを調製する際に、α−グルコシル転移酵素とこのアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させた場合に得られる分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量が、α−グルコシル転移酵素のみを用いて調製した分岐α−グルカンの場合よりも高い理由としては、α−グルコシル転移酵素の作用で生成する分岐α−グルカンに対し、アミラーゼがさらにグリコシル基を転移し、グルカンにおける分岐の程度（頻度）をさらに高めたものと推察される。
【００４６】
また、酵素反応によって当該分岐α−グルカンを調製する際、他の公知のアミラーゼを併用して反応させることにより、分岐α−グルカンの分子量分布を調節することも、また、消化性をさらに低減した分岐α−グルカンにすることも、さらには還元力を低減することも有利に実施できる。例えば、澱粉液化液に、α−グルコシル転移酵素とともに、α−アミラーゼやＣＧＴａｓｅなど、澱粉の内部のα−１，４結合を加水分解し、新たな非還元末端グルコース残基を生じさせる酵素を併用して作用させることにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させ消化性の低減に寄与するα−１，３、α−１，６及びα−１，３，６結合の割合をさらに増加させることも有利に実施できる。また、イソアミラーゼなどの澱粉枝切り酵素を併用することにより、分子量分布の幅を狭め、粘度を低減させたり、特開平７−１４３８７６号公報などに開示された非還元性糖質生成酵素（別名：マルトオリゴシルトレハロース生成酵素（ＥＣ ５．４．９９．１５））を併用することにより、還元末端部分を部分的にトレハロース構造に変換して還元力を低減させることも有利に実施できる。
【００４７】
また、本発明で使用する分岐α−グルカンは、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを含有する栄養培地で、α−グルコシル転移酵素産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生成する分岐α−グルカンを採取することによっても製造することができる。
【００４８】
上記の反応又は培養によって得られた分岐α−グルカンは、そのまま分岐α−グルカン製品とすることもできる。また、必要に応じて、反応液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、可消化部分を加水分解した後、非消化部分を分画により回収したり、酵母などを用いた発酵処理によりグルコースをはじめとする分解物を除去したりすることにより、消化性のさらに低減した分岐α−グルカンを調製することもできる。一般的には、分岐α−グルカンを含有する反応液はさらに精製して用いられる。精製方法としては、糖の精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離などの１種または２種以上の精製方法が適宜採用できる。
【００４９】
α−グルコシル転移酵素を、糊化澱粉や比較的低ＤＥ（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、好ましくはＤＥ２０未満の澱粉部分分解物に作用さて、本発明で使用する分岐α−グルカンを調製する場合、グルコースやマルトースなどの低分子オリゴ糖をほとんど生成しないので、得られる反応生成物をカラムクロマトグラフィーなどの精製手段で精製する必要は特にないものの、用途など目的に応じてさらに分画することも随意である。この分画にイオン交換クロマトグラフィーを採用する場合、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを有利に用いることができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００５０】
また、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンにα−グルコシル転移酵素を作用させても当該分岐α−グルカンを調製することができるが、さらに当該分岐α−グルカンをイソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９）で消化することにより、食物繊維成分の含量を増やすことも有利に実施できる。ちなみに、マルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンにα−グルコシル転移酵素を作用させて調製した該分岐α−グルカンに、イソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９）を作用させると、イソマルトースが基質固形物当たり２５質量％以上５０質量％以下生成する。
【００５１】
このようにして得られた本発明で使用する分岐α−グルカンは溶液のまま利用できるものの、保存に有利で、且つ、用途によっては利用しやすいように、乾燥し、粉末品とするのが望ましい。乾燥には、通常、凍結乾燥、或いは噴霧乾燥やドラム乾燥などの方法を用いることができる。乾燥物は、必要に応じて、粉砕し粉末化することも、篩別又は造粒して、特定粒度の範囲に整えることも有利に実施できる。
【００５２】
また、当該分岐α−グルカンは、難消化性であり、経口摂取すると食物繊維作用により優れた脂質代謝改善作用を発揮することができるので、脂質代謝改善剤としてはもとより、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤、乃至、予防剤、腹囲の増加抑制剤、メタボリツクシンドロームの予防剤乃至治療剤などとしても有利に利用できる。また、当該分岐α−グルカンを有効成分として配合した本発明の脂質代謝改善剤は、固状よりも液状の形態の方が、組成物における配合割合が低くても優れた脂質代謝改善作用をはじめとする生理機能を発揮するという特徴を有している。
【００５３】
本発明の脂質代謝改善剤の投与剤型としては、各種の形態が利用目的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤等の経口剤、座剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の非経口剤が挙げられる。
【００５４】
上記本発明の脂質代謝改善剤は、分岐α−グルカンを、そのまま製剤として単独で使用してもよいが、必要に応じて、製剤学的に許容される食品素材や、食品添加物、医薬品、医薬品添加物、医薬部外品添加物などの添加剤と組み合わせた経口用製剤又は高カロリー輸液剤などとするか、若しくは輸液製剤などに添加して非経口用の製剤とすることもできる。具体的には、例えば、界面活性剤、防腐剤（抗菌剤）、保湿剤、増粘剤、水溶性高分子、抗酸化剤、キレート剤、色素、香料、ｐＨ調整剤、ビタミン類、各種アミノ酸、電解質、水、アルコール類、有機溶媒、動物や植物のエキス等と組み合わせて、公知の方法により製剤化すればよい。より具体的には、経口剤の製造に際しては、例えば、通常用いられる乳糖、白糖、マルトース、トレハロース、環状四糖、デキストリン、澱粉、結晶セルロース、コーンスターチ等の賦形剤、カルボキシメチルセルロース、寒天、ゼラチン末等の崩壊剤、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、シリカ、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖等のコーティング剤等を使用すればよい。また、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の経口液剤、注射剤の製造に際しては、注射用蒸留水、生理食塩水等に溶解ないし、懸濁し、例えば、無機又は有機の酸あるいは塩基等のｐＨ調整剤、等張化剤、安定化剤、希釈剤等を必要により添加すればよい。
【００５５】
また、本発明の脂質代謝改善剤は、そのままで、あるいは、他の糖質、甘味料、増量剤、賦形剤、結合剤と混合して、既存の飲食品に配合して利用することも随意である。具体的には、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、トレハロース、蜂蜜、メープルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、スクラロース、Ｌ−アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような甘味料と、また、デキストリン、澱粉、デキストラン、乳糖などのような増量剤と混合して、粉末、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体など各種形状に成形して、飲食品に配合することもできる。
【００５６】
また、本発明の脂質代謝改善剤は飲食品に配合した場合でも、有効成分の分岐α−グルカンは消化され難いので、脂質代謝改善効果を発揮することができる。具体的には、例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料への品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べったら漬、千枚漬などの漬物類、たくわん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、タラ、タイ、エビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、ミネラルウオーター、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、茶飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物に配合すればよい。また、本発明の脂質代謝改善剤は液状形態の方が固状より、組成物への配合割合が低くても、脂質代謝改善作用などの生理機能を効果的に発揮できるので、清涼飲料、アルコール飲料、スープ、ドリンク剤などの液状形態で使用するのが特に望ましい。
【００５７】
また、本発明の脂質代謝改善剤は、家畜、家禽などの飼育動物のための飼料、餌料などとして脂質代謝改善の目的で使用することができる。
【００５８】
以上、本発明の脂質代謝改善剤に有効成分の分岐α−グルカンを含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程において含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、組成物の、通常、０．１質量％以上、望ましくは、１質量％以上含有せしめるのが好適である。組成物が固状の場合には、１質量％以上配合するのが望ましく２％以上が特に望ましい。液状の場合には、０．５質量％以上配合するのが望ましく１％以上が特に望ましい。配合量が０．１質量％未満では、脂質代謝改善効果が発揮されない場合がある。
【００５９】
以下、実験により本発明で使用する分岐α−グルカンとその分岐α−グルカンの調製に使用するα−グルコシル転移酵素、及び、当該分岐α−グルカンの持つ生理作用を詳細に説明する。
【００６０】
＜実験１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
＜実験１−１：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社販売）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社販売）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社販売）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ１本に１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００６１】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除去し、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、２．８単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約２０ｍｌを得た。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．１８Ｍ付近から０．４５Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６２】
＜実験１−２：α−グルコシル転移酵素を用いた分岐α−グルカンの調製＞
実験１−１で得たα−グルコシル転移酵素標品１００ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８５．８％の収率で得た。
【００６３】
＜実験２：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
【００６４】
＜実験２−１：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験１−１と同様に培養したものを種培養とした。
【００６５】
５００ｍｌ容三角フラスコ１２本に種培養と同じ組成の液体培地を１００ｍｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約１ｍｌずつを接種し、温度２７℃、２４時間回転振盪培養した。培養後、三角フラスコから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、得られた培養上清のα−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、０．５３単位／ｍｌであった。この培養上清約１Ｌに、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析した。この粗酵素液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２０ｍｌ）に供した。非吸着タンパク質を溶出後、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させ、食塩濃度約０．０５Ｍ付近から０．２Ｍ付近に溶出した画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。得られた透析液をα−グルコシル転移酵素標品とした。
【００６６】
＜実験２−２：α−グルコシル転移酵素を用いたグルカンの調製＞
実験２−１で得たα−グルコシル転移酵素標品２０ｍｌを酵素液として用いて、これに終濃度３０ｗ／ｖ％になるように澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を添加し、７２時間、４０℃で反応させた後、約１００℃で１０分間、熱処理することによって反応を停止した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０質量％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８３．６％の収率で得た。
【００６７】
以下の実験３及び４では、実験１−２で得たグルカンと実験２−２で得たグルカンを区別する目的で、それぞれを「グルカンＡ」及び「グルカンＢ」と呼称する。
【００６８】
＜実験３：グルカンＡ及びＢの水溶性食物繊維としての評価＞
得られたグルカンの水溶性食物繊維含量を、栄養表示基準（平成８年５月厚生省告示第１４６号）における栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）、８．食物繊維、（２）高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）記載の方法に準じて下記の方法により調べた。酵素処理用のキットとして、総食物繊維測定キット（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｆｉｂｅｒ，Ｔｏｔａｌ，Ａｓｓａｙ，Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ、シグマ社製）を用いた。また、グルカンＡ及びＢの調製に用いた基質である澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を対照１とし、市販の難消化性グルカン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）を対照２として、同様にそれぞれの水溶性食物繊維含量を調べた。
【００６９】
＜分析用試料溶液の調製＞
被験試料として固形分０．１ｇのグルカンを試験管にとり、０．０８Ｍリン酸緩衝液５ｍｌを添加しｐＨを６．０に調整した。これに、食物繊維測定キット付属の熱安定α−アミラーゼ（バチルス・リケニホルミス由来耐熱性α−アミラーゼ、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、沸騰水浴中で５分毎に攪拌しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られた反応液に、０．２７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液約１ｍｌを添加しｐＨを７．５に調整した後、キット付属のプロテアーゼ（バチルス・リケニホルミス由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。得られたプロテアーゼ処理液に０．３２５Ｍ塩酸を約１ｍｌ添加し、ｐＨを４．３に調整した後、キット付属のアミログルコシダーゼ（アスペルギルス・ニガー由来、シグマ社製）溶液０．０１ｍｌを加え、アルミ箔で覆い、６０℃の水浴中で振盪しつつ３０分間反応させ、冷却した。次いで、得られた反応液約７ｍｌを、イオン交換樹脂（オルガノ株式会社販売のアンバーライトＩＲＡ−６７（ＯＨ型）とアンバーライト２００ＣＴ（Ｈ型）を１：１で混合）にＳＶ１．０で通液することにより脱塩し、さらに約３倍量の脱イオン水にて溶出し、溶出液の総量を約２８ｍｌとした。得られた溶出液をエバポレーターにて濃縮し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過した後、メスフラスコで２５ｍｌに定容したものを分析用試料溶液とした。
【００７０】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
上記で得られた分析用試料溶液は、下記の条件による高速液体クロマトグラフィーに供した。
カラム ：ＴＧＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ×長さ３００ｍｍ，株式会社東ソー製）２本を直列に連結したもの
溶離液 ：脱イオン水
試料糖濃度：０．８質量％
カラム温度：８０℃
流 速 ：０．５ｍｌ／分
検 出 ：示差屈折計
注入量 ：２０μｌ
分析時間：５０分
【００７１】
＜被験試料の水溶性食物繊維含量の算出＞
上記で得られたクロマトグラムにおいて、酵素処理によっても分解されずに残存する未消化グルカンを水溶性食物繊維とした。この水溶性食物繊維と分解されて生成したグルコースのピーク面積をそれぞれ求め、別途、常法のグルコース・オキシダーゼ法にて定量した分析用試料溶液中のグルコース量を用いて、下記の式１により水溶性食物繊維量を求めた。さらに、下記の式２により被験試料の水溶性食物繊維含量を求めた。
【００７２】
式１：
【数１】
【００７３】
式２：
【数２】
【００７４】
上記の酵素−ＨＰＬＣ法により求めたグルカンＡ及びグルカンＢの水溶性食物繊維含量はそれぞれ４２．１質量％及び４１．８質量％であった。一方、対照１の澱粉部分分解物は酵素処理により全てグルコースにまで分解され、水溶性食物繊維含量は０質量％と評価された。また、対照２の市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社販売）のそれは４８．７質量％であった。これらの結果は、水溶性食物繊維を含まない澱粉部分分解物を基質としてα−グルコシル転移酵素を作用させることにより、市販の難消化性デキストリンとほぼ同等の水溶性食物繊維含量を示すグルカンを容易に調製できることを示している。
【００７５】
＜実験４：グルカンＡ及びＢの構造解析＞
＜実験４−１：メチル化分析＞
実験１−２及び２−２の方法で得たグルカンＡ及びＢについて、常法に従って、メチル化分析を行い、下記の条件によるガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。結果を表３にまとめた。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
カラム ：ＤＢ−５ キャピラリーカラム（内径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ×膜厚１μｍ，Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
キャリアーガス ：ヘリウム
カラム温度：１３０℃で２分間保持した後、２５０℃まで５℃／分で昇温し、２５０℃で２０分間保持
流 速 ：１．０ｍｌ／分
検 出 ：ＦＩＤ
注入量 ：３μｌ（スプリット１／３０）
分析時間：４６分
【００７６】
【表３】
【００７７】
表３の結果から明らかなように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素によりそれぞれ調製したグルカンＡ及びＢのメチル化分析の結果を、基質である澱粉部分分解物のそれと比較すると、いずれのグルカンの場合も、２，３，６−トリメチル化物が著しく減少しており、一方、２，３，４−トリメチル化物が３０％以上まで著しく増加していた。このことは、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の反応によって、グルコースが主としてα−１，４結合によって重合した構造を有する澱粉部分分解物が、α−１，６結合を３０％以上含む分岐α−グルカンに変換されたことを物語っている。また、２，３，４，６−テトラメチル化物、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物が増加していることから、非還元末端グルコース、α−１，３結合及びα−１，３，６結合が新たに生成していることも判明した。グルカンＡの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ１．１％及び０．８％であり、グルカンＢの部分メチル化物における２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物の含量は、それぞれ０．９％及び１．１％であった。さらに、グルカンＡ及びＢにおいて、２，３−ジメチル化物の存在比は基質とほとんど差がないことから、基質に元々存在する分岐であるα−１，４，６結合に大きな変化はないと考えられた。この結果から、グルカンＡ及びＢは、基質である澱粉部分分解物とは大きく異なり、グルコースの結合様式がα−１，４結合及びα−１，６結合を主体とし、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも僅かに有する分岐グルカン（分岐α−グルカン）であることが判明した。なお、分岐α−グルカンＡ及びＢを構成するグルコースの１位のアノマー型は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析において、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、全てα型であることが判明した。
【００７８】
＜実験４−２：分岐α−グルカンＡ及びＢのイソマルトデキストラナーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ及びＢの構造を特徴づける目的で、イソマルトデキストラナーゼ消化試験を行った。分岐α−グルカンＡ及びＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアルスロバクター・グロビホルミス由来のイソマルトデキストラナーゼ（株式会社林原生物化学研究所内にて調製）を基質固形物１グラム当たり１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その反応液中の糖組成を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略称する。）及びガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」と略称する）を用いて調べた。ＨＰＬＣは、カラムに『ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０４ＳＳ』（株式会社三菱化学製造）２本を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。ＧＣは、常法に従って糖質をトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）した後、カラムに『２％シリコンＯＶ−１７ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ Ｗ／ＡＷ−ＤＭＳ』（株式会社ジー・エル・サイエンス製造）を用い、１分間当たり７．５℃の昇温速度で温度１６０℃から３２０℃まで昇温した。キャリアーガスとして窒素ガスを用い、検出はＦＩＤ法にて行った。イソマルトデキストラナーゼ消化において、分岐α−グルカンの調製に用いた基質である澱粉部分分解物からはイソマルトースが全く生成しなかったのに対し、分岐α−グルカンＡからは糖組成として２８．４質量％のイソマルトースが、また、分岐α−グルカンＢからは糖組成として２７．２質量％のイソマルトースが、それぞれ生成した。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがイソマルトース構造をそれぞれ、少なくとも２８．４質量％及び２７．２質量％程度含んでいることを示しており、分岐α−グルカンではα−１，６結合の割合が増加していることを示した実験４−１におけるメチル化分析の結果を支持するものである。なお、イソマルトデキストラナーゼは、グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−グルコシド結合であれば、それがα−１，３、α−１，４及びα−１，６結合のいずれであっても加水分解する特異性を有していることから、得られたイソマルトースが分岐α−グルカンＡ及びＢにおいてどのような結合様式で結合しているのか、その詳細は不明である。
【００７９】
＜実験４−３：分岐α−グルカンＡ及びＢのα−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ消化試験＞
分岐α−グルカンＡ又はＢの水溶液（最終濃度１ｗ／ｖ％）にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来α−グルコシダーゼ（商品名『トランスグルコシダーゼアマノＬ』、天野エンザイム製）及びリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）由来グルコアミラーゼを同時に作用させ消化試験を行った。基質固形物１グラム当たりα−グルコシダーゼを５，０００単位とグルコアミラーゼを１００単位加え、５０℃、ｐＨ５．０で１６時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、その酵素反応液の糖組成を実験４−２と同じ条件でＨＰＬＣを用いて調べた。その結果、グルカンＡ及びＢはいずれも、基質である澱粉部分分解物の場合と同様に、実質的に全てグルコースにまで分解された。この結果は、分岐α−グルカンＡ及びＢがいずれもグルコースを構成糖とするα−グルカンであることを示すものである。
【００８０】
＜実験４−４：分子量分布分析＞
分岐α−グルカンＡ及びＢについて、分子量分布を常法のゲル濾過ＨＰＬＣ法にて分析した。ゲル濾過ＨＰＬＣは、カラムに『ＴＳＫ ＧＥＬ α−Ｍ』（株式会社東ソー製）を２本連結したものを用い、溶離液に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、カラム温度４０℃、流速０．３ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製造）を用いて行った。なお、試料中のグルカンの分子量は、分子量測定用プルラン標準品（株式会社林原生物化学研究所販売）を同様にゲル濾過分析に供して作成した分子量の検量線に基づき算出した。図１に分岐α−グルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム（図１における符号ｂ及びｃ）を、基質として用いた澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』）のそれ（図１における符号ａ）と比較しつつ、それぞれ示した。なお、図１における符号イ、ロ、ハ、ニ及びホは、それぞれ、分子量１，０００，０００、１００，０００、１０，０００、１，０００及び１００ダルトンに相当する溶出位置を意味する（後述する図１５乃至１９においても同様）。また、ゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づき各試料の分子量分布を分析した結果を表４に示した。
【００８１】
【表４】
【００８２】
基質として用いた澱粉部分分解物が、分子量分布分析においてグルコース重合度４９９及び６．３に相当する位置に２つのピーク（図１のクロマトグラムａにおける符号１及び２）を有する糖質混合物であるのに対して、分岐α−グルカンＡは、グルコース重合度３８４、２２．２、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｂにおける符号３、４、５及び６）を有する糖質の混合物、また、分岐α−グルカンＢは、グルコース重合度４３３、２２．８、１０．９及び１に相当する位置に４つのピーク（図１のクロマトグラムｃにおける符号７、８、９及び１０）を有する糖質の混合物であった。符号６及び１０のピークはグルコースに相当するものの、その含量はごく僅かであることから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来酵素の加水分解作用は僅かであることがわかる。表４から明らかなように、基質である澱粉部分分解物に比べ、グルカンＡ及びＢの数平均分子量及び重量平均分子量は共に６０％程度に減少しており、全体として低分子化していた。また、分子量分布の拡がりの指標である重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）が澱粉部分分解物とグルカンＡ及びＢ間でそれほど変化していないことから、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素は、澱粉部分分解物の非還元末端にのみ作用していると考えられた。
【００８３】
以上の結果から、基質として用いた澱粉部分分解物においてはグルコースの結合様式の約９０％がα−１，４結合であり、わずかにα−１，４，６結合を有しているのに対し、グルカンＡ及びＢは、α−１，４結合に対するα−１，６結合の割合が極めて高く、α−１，４，６結合に加えて、α−１，３結合及びα−１，３，６結合をも有する分岐を有するグルカンであることが判明した。このような構造を有する分岐α−グルカンはこれまで全く知られていない。
【００８４】
メチル化分析の結果に基づいて分岐α−グルカンの構造を推定し、その構造を模式的に示した図を基質である澱粉部分分解物のそれとともに図２に示した。図２中、符号１及び２は、それぞれ原料澱粉部分分解物及び分岐α−グルカンの模式図である。なお、図２において、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆはそれぞれ、澱粉部分分解物または分岐α−グルカンにおける、非還元末端グルコース残基、α−１，３結合しているグルコース残基、α−１，４結合しているグルコース残基、α−１，６結合しているグルコース残基、α−１，３，６結合しているグルコース残基及びα−１，４，６結合しているグルコース残基を意味している。また、同模式図におけるグルコース間の斜め破線、横実線及び縦実線はそれぞれ、α−１，３結合、α−１，４結合及びα−１，６結合を意味している。
【００８５】
＜実験５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０株由来α−グルコシル転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸第一鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００８６】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約２．７単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約２．６単位／ｍｌであった。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０によって生産される−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００８７】
＜実験６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験５で得た培養上清のうち、約４Ｌ（総活性約１０，４００単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液約６５ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約７４単位／ｍｌであった（総活性約４，７８０単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量９ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ブチル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルを用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３．３ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した『ＣＭ−５ＰＷ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．４Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表５に示す。
【００８８】
【表５】
【００８９】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００９０】
＜実験７：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験７−１：分子量＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【００９１】
＜実験７−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図３（至適温度）及び図４（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５０乃至５５℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で５．０乃至６．３であることが判明した。
【００９２】
＜実験７−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図５（温度安定性）及び図６（ｐＨ安定性）に示した。図５及び図６から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素は４０℃まで安定であり、また、ｐＨ３．５乃至８．４の範囲で安定であった。
【００９３】
＜実験７−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表６に示す。
【００９４】
【表６】
【００９５】
表６の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【００９６】
＜実験８：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）由来α−グルコシル転移酵素の調製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０に替えてアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を接種した以外は実験５と同様に培養して種培養とした。
【００９７】
容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至７．０に保ちつつ、２４時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。培養液及び培養上清について、α−グルコシル転移酵素活性を測定したところ、培養液の該酵素活性は約０．３６単位／ｍｌ、培養上清の該酵素活性は約０．４２単位／ｍｌであった。アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９によって生産される本α−グルコシル転移酵素はその大部分が菌体外に存在することが判明した。
【００９８】
＜実験９：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の精製＞
実験８で得た培養上清約１８Ｌ（総活性約７，５６０単位）に、８０％飽和となるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、遠心分離して不溶物を除き、粗酵素液約５００ｍｌを得た。粗酵素液中のα−グルコシル転移酵素活性は約１４単位／ｍｌであった（総活性約７，０００単位）。この粗酵素液に終濃度２Ｍとなるように硫安を添加し、遠心分離して不溶物を除き、２Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量３００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、ゲルに吸着し、硫安濃度２Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．６Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析後、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１００ｍｌ）に供した。α−グルコシル転移酵素活性は、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。各精製の各工程におけるα−グルコシル転移酵素活性、α−グルコシル転移酵素の比活性及び収率を表７に示す。
【００９９】
【表７】
【０１００】
精製したα−グルコシル転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１０１】
＜実験１０：アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の性質＞
＜実験１０−１：分子量＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、本α−グルコシル転移酵素の分子量は９０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１０２】
＜実験１０−２：酵素反応の至適温度及び至適ｐＨ＞
実験９の方法で得たアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図７（至適温度）及び図８（至適ｐＨ）に示した。本α−グルコシル転移酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で約５０℃であり、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応の条件下で約６．０であることが判明した。
【０１０３】
＜実験１０−３：酵素の温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験９方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、本酵素の温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図９（温度安定性）及び図１０（ｐＨ安定性）に示した。図９及び図１０から明らかなように、本発明のアルスロバクター・グロビホルミス由来α−グルコシル転移酵素は、４０℃まで安定であり、ｐＨ４．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１０４】
＜実験１０−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験９の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表８に示す。
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
表８の結果から明らかなように、本α−グルコシル転移酵素の活性は、Ｈｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ｃｕ２＋イオンで阻害されることが判明した。
【０１０７】
＜実験１１：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、α−グルコシル転移酵素の基質特異性を調べた。メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、グルコース、スクロース、マルトース、イソマルトース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ラクトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトトリオース又はイソパノースを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を基質固形物１グラム当たりそれぞれ１０単位ずつ加え、基質濃度を１ｗ／ｖ％になるように調製し、これを４０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液の糖質を調べるため、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開するシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）を行い、１０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、加熱することにより糖質を検出した。ＴＬＣにおける基質糖質以外の反応生成物の生成の有無を調べ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。結果を表９に示す。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素についても基質特異性を同様にして調べた結果、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素と同様であった。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
表９の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素は、試験した糖質のうち、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースによく作用し、また、ニゲロース、イソマルトース、ネオトレハロース、イソマルトトリオース、イソパノースに作用した。さらに、コージビオースにも僅かに作用した。作用した糖質からは、いずれも分解生成物と共に、糖転移生成物も認められた。一方、このα−グルコシル転移酵素は、メチル−α−グルコシド、メチル−β−グルコシド、パラニトロフェニル−α−グルコシド、パラニトロフェニル−β−グルコシド、トレハロース、セロビオース、スクロース、ラクトースなどには作用が認められなかった。これらの結果及び本α−グルコシル転移酵素が澱粉部分分解物に作用し分岐α−グルカンを生成することより、本酵素はマルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカン又はグルコースから構成されるα−グルコオリゴ糖に幅広く作用することが判明した。
【０１１０】
＜実験１２：作用メカニズム＞
α−グルコシル転移酵素の作用メカニズムを検討するため、最小の基質であるマルトースに作用させた場合の生成糖の構造を調べた。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であった。本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１１１】
＜実験１２−１：マルトースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成をＨＰＬＣ及びＧＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ及びＧＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。結果を表１０に示す。
【０１１２】
【表１０】
【０１１３】
表１０の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、α−グルコシル転移酵素の作用により、基質マルトースから、主としてグルコース、マルトトリオース及びパノースが生成した。さらに反応２時間及び４時間からグルコース重合度４及び５のオリゴ糖が生成した。反応が進むと、マルトトリオースは反応２時間（１４．４％）をピークに、また、パノースは反応４時間（２９．３％）をピークに減少し、その減少とともにイソマルトースの増加が認められた。さらに、反応４８時間までイソマルトース及び重合度４以上のオリゴ糖の増加が認められた。
【０１１４】
これらの結果から推察すると、α−グルコシル転移酵素はマルトースに作用し、反応初期において、α−１，４グルコシル転移とα−１，６グルコシル転移の両グルコシル転移を触媒することにより、グルコース、マルトトリオース及びパノースを生成し、反応の進行にともない、グルコースにα−１，６グルコシル転移したイソマルトースや、そのイソマルトースにα−１，４グルコシル転移及びα−１，６グルコシル転移したイソパノース及びイソマルトトリオースが生成することがわかった。本実験においては、多種類存在する重合度４以上のオリゴ糖を同定することは困難であることから、実験１２−２において、マルトースより重合度の高いマルトペンタオースを基質として、さらに反応メカニズムを解析した。
【０１１５】
＜実験１２−２：マルトペンタオースからの生成物＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のマルトペンタオース水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たα−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形分１グラム当たり１０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣは、実験４−２に記載の条件を用いて行った。また、酵素反応液について、常法に従って、メチル化分析を行いガスクロマトグラフィー法で部分メチル化物を調べた。生成する部分メチル化物の組成からグルコースの結合様式における各グルコシド結合の存在比を求めた。また、実験４−２と同様にイソマルトデキストラナーゼ消化試験も行った。反応中の糖組成の変化を表１１に、反応生成物のメチル化分析とイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表１２に示す。
【０１１６】
【表１１】
【０１１７】
【表１２】
【０１１８】
表１１及び１２の結果から明らかなように、反応初期（反応１時間）において、基質マルトペンタオースから、基質よりグルコース重合度が１小さいオリゴ糖とグルコース重合度が１大きいオリゴ糖が優先的に生成したことから、本酵素がグルコシル転移を触媒していることが確認された。さらに反応が進むと、種々のグルコース重合度を有する反応生成物が生成し、反応２４時間後には、グルコース重合度９以上のグルカンが２１．１％にも達した。メチル化分析の結果から、反応が進行するにつれて、反応生成物においては１，４結合したグルコース残基が減少するとともに、１，６結合したグルコース残基が顕著に増加し、また、１，３結合したグルコース残基、１，４，６結合したグルコース残基及び１，３，６結合したグルコース残基が徐々に増加することが判明した。また、イソマルトデキストラナーゼ消化後の糖組成におけるイソマルトース含量もまた、反応の進行とともに顕著に増加することが判明した。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１１９】
実験１２−１及び１２−２の結果から、α−グルコシル転移酵素の反応メカニズムは以下のように考えられた。
１）本酵素は、基質としてマルトース及び／又はグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、非還元末端グルコース残基を他のα−１，４グルカンの非還元末端グルコース残基に主としてα−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、非還元末端グルコース残基の４位又は６位水酸基にグルコースがα−結合したα−１，４グルカン（グルコース重合度が１増加したα−グルカン）と、グルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンを生成する。
２）本酵素はさらに、１）で生じたグルコース重合度が１減じたα−１，４グルカンに作用し、１）で生じたグルコース重合度が１増加したα−グルカンに対して、１）と同様に分子間α−１，４又はα−１，６グルコシル転移することにより、１）で生成したグルコース重合度が１増加したα−グルカンの非還元末端グルコース残基の４又は６位水酸基にグルコースをさらに転移し、鎖長を伸長する。
３）上記１）及び２）の反応を繰り返すことにより、マルトース及び／又はグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンからα−１，４及びα−１，６結合を有するグルカンを生成する。
４）本酵素は、さらに、頻度は低いながらもα−１，３グルコシル転移やグルカンの内部にあるα−１，６結合したグルコース残基に対するα−１，４又はα−１，３グルコシル転移を触媒することにより、α−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合をも有するグルカンを生成する。
５）上記１）乃至４）の反応が繰り返される結果として、グルコースが主としてα−１，４結合及びα−１，６結合で結合し、僅かながらα−１，３結合、α−１，４，６結合及びα−１，３，６結合を有する分岐α−グルカンを生成する。
【０１２０】
＜実験１３：α−グルコシル転移反応と反応液の還元力の変化＞
マルトース水溶液（最終濃度１又は３０ｗ／ｖ％）に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えた後、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を、基質固形物１グラム当たり４単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で作用させ、経時的にサンプリングを行い、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。反応液中に残存するマルトース量を実験４−２に記載のＨＰＬＣ法及びＧＣ法で定量した。また、酵素反応液の還元糖量をソモギー・ネルソン法で、全糖量をアンスロン法で定量し、次式、 還元力＝（還元糖量／全糖量）×１００ で還元力を算出した。結果を表１３に示す。
【０１２１】
【表１３】
【０１２２】
表１３の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素をマルトースに作用させたところ、マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低い場合には、ごく僅かな還元力の増加が認められ、また、マルトース濃度が３０ｗ／ｖ％と比較的高い場合には、ほとんど反応液の還元力の増加は認められなかった。マルトース濃度が１ｗ／ｖ％と比較的低く、且つ、マルトースの残存量が１０％以下の場合においても反応液の還元力の増加がごく僅かであることは、このα−グルコシル転移酵素は本質的に転移反応を触媒する酵素であり、反応に際してほとんど加水分解を行わないことを意味している。このα−グルコシル転移酵素は効率良くα−グルコシル転移を行う酵素であることがわかった。なお、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いて同様に試験した場合も、ほぼ同様な結果が得られた。
【０１２３】
＜実験１４：分岐α−グルカンの生成における精製α−グルコシル転移酵素と粗酵素の比較＞
分岐α−グルカンの工業的生産を考慮した場合、α−グルコシル転移酵素の粗酵素が使用できれば酵素を精製する手間と労力が省けることとなり、より好適である。そこで、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて、実験１−２で調製したグルカンＡと同等の分岐α−グルカンが得られるか否かを検討した。実験１−１に記載した方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０を培養し、培養上清を硫安塩析し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に対して透析したものをα−グルコシル転移酵素の粗酵素液とした。この粗酵素液を実験１−２に記載した方法で澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）に作用させ、固形分濃度３０％のグルカン溶液を、基質として用いた澱粉部分分解物から固形物当り８８．２％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンを「グルカンＣ」と名付け、そのメチル化分析を行った結果を表１４に、また、実験４及び実験３に記載した方法によって分子量分布及び水溶性食物繊維含量を測定した結果を表１５にそれぞれ示す。なお、表１４及び表１５には、比較のため表３及び表４より調製の原料とした澱粉部分分解物と部分精製α−グルコシル転移酵素を用いて調製したグルカンＡのデータをそれぞれ再掲した。
【０１２４】
【表１４】
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
表１４に示すように、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて調製したグルカンＣは、意外にも、メチル化分析において、非還元末端グルコース残基に相当する２，３，４，６−テトラメチル化物と、α−１，６結合したグルコース残基に相当する２，３，４−トリメチル化物の含量がグルカンＡに比べ増加していた。この結果は、グルカンＣにはグルカンＡに比べて非還元末端が多く、また、α−１，６結合がより多く存在することを物語っている。さらに、グルカンＣでは２，４−ジメチル化物が４．８％と、グルカンＡの０．８％に比べ増加していた。この結果は、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基が増加していることを示している。
【０１２７】
また、表１５から明らかなように、グルカンＣは、グルカンＡに比べ数平均分子量及び重量平均分子量がいずれも小さく（グルコース重合度が小さく）、遙かに高い水溶性食物繊維含量を示した。この結果は、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素には、α−グルコシル転移酵素とは相違する他の酵素が混在しており、その混在酵素が分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に寄与していることを示唆するものである。
【０１２８】
＜実験１５：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在する酵素の同定と単離・精製＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素に混在し、分岐α−グルカンにおけるα−１，６結合の増加、１，３結合と１，６結合の両方にあずかるグルコース残基の増加、低分子化、及び、水溶性食物繊維含量の増加に関与する酵素を同定し、単離・精製する実験を行った。
【０１２９】
＜実験１５−１：混在する酵素の同定と活性測定＞
実験１−１と同じ方法でバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を培養し、得られた培養上清約３Ｌを硫安塩析した後、１ｍＭの塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に対して透析して得た透析液約４０ｍｌを粗酵素液とした。この粗酵素液を、２ｗ／ｖ％可溶性澱粉溶液又は２ｗ／ｖ％プルラン溶液にｐＨ６．０、４０℃で１６時間作用させ、１００℃、１０分間加熱して反応を停止させた後、縦１０ｃｍ、横２０ｃｍのシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）ＴＬＣプレートを用いたＴＬＣに供した。展開溶媒としてｎ−ブタノール：ピリジン：水（容量比６：４：１）を用いて２回展開を行い、２０％硫酸−メタノール溶液を噴霧した後、１００℃で５分間加熱して生成物のスポットを検出した。その結果、可溶性澱粉からは、マルトース及びグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の生成が、また、プルランからは僅かなイソマルトースとパノースの生成が認められた。バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）のα−グルコシル転移酵素の粗酵素には澱粉を分解し、さらにプルランをも分解するアミラーゼが混在していることが判明した。
【０１３０】
混在するアミラーゼの活性は、以下のようにして測定した。すなわち、短鎖アミロース（商品名「アミロースＥＸ−Ｉ」、株式会社林原生物化学研究所販売、平均重合度１７）を最終濃度１ｗ／ｖ％となるように１ｍＭの塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液２ｍｌに、酵素液０．２ｍｌを加え３５℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．２ｍｌを８ｍｌの０．０２Ｎ硫酸溶液に混合し、反応停止させた後、０．２ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液を添加し、２５℃で１５分間保持した後に６６０ｎｍの吸光度を測定する。別途反応０時間の反応液について同様に測定し、反応時間当たりのヨウ素呈色の減少を測定する。アミラーゼの活性１単位は、上記の条件下で２０ｍｇの短鎖アミロースの６６０ｎｍにおける吸光度（ヨウ素呈色）を１０％低下させる酵素量の１０倍量と定義した。
【０１３１】
＜実験１５−２：混在アミラーゼの単離・精製＞
実験１５−１で調製した粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量７０ｍｌ）に供した。アミラーゼは、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｓ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１．５Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、ファルマシアバイオテク製『リソース ＰＨＥ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。目的のアミラーゼは、１．５Ｍ硫安、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース ＰＨＥ』ゲルに吸着し、硫安濃度１．５Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．３Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、濃縮した後、ファルマシアバイオテク製『スーパーデックス ２００ｐｇ』ゲルを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１１８ｍｌ）に供し、０．２Ｍ食塩、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて溶出した。活性画分を回収し、ファルマシアバイオテク製『リソース Ｑ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１ｍｌ）に供した。アミラーゼは、１ｍＭの塩化カルシウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『リソース Ｑ』ゲルに吸着せず、非吸着画分に溶出した。得られた活性画分をアミラーゼ精製標品とした。各精製の各工程におけるアミラーゼ活性、アミラーゼの比活性及び収率を表１６に示す。
【０１３２】
【表１６】
【０１３３】
精製したアミラーゼ標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１３４】
＜実験１６：バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの性質＞
＜実験１６−１：分子量＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、当該アミラーゼの分子量は５８，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【０１３５】
＜実験１６−２：アミラーゼの至適温度及び至適ｐＨ＞
実験１５−２の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼ精製標品を用いて、アミラーゼ活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活性測定の方法に準じて調べた。これらの結果を図１１（至適温度）及び図１２（至適ｐＨ）に示した。当該アミラーゼの至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で５５℃であり、至適ｐＨは３５℃、３０分間反応の条件下で６．０乃至７．０であることが判明した。
【０１３６】
＜実験１６−３：アミラーゼの温度安定性及びｐＨ安定性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、温度安定性及びｐＨ安定性を調べた。温度安定性は、酵素溶液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０又は１ｍＭ塩化カルシウムを含む同緩衝液）を各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図１３（温度安定性）及び図１４（ｐＨ安定性）に示した。図１３及び図１４から明らかなように、当該アミラーゼはカルシウムイオン非存在下では４０℃まで安定であり、１ｍＭカルシウムイオン存在下では５０℃まで安定であった。また、当該アミラーゼはｐＨ６．０乃至８．０の範囲で安定であった。
【０１３７】
＜実験１６−５：アミラーゼの基質特異性＞
実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、当該アミラーゼの各種基質への作用を調べたところ、当該アミラーゼは、澱粉、マルトース及びグルコース重合度３以上のα−１，４グルカンを加水分解するとともに、グリコシル転移をも触媒することが判明した。また、当該アミラーゼは、澱粉からシクロデキストリンを生成し、プルランを加水分解してパノースを生成する作用を有することも判明した。
【０１３８】
＜実験１７：α−グルコシル転移酵素とアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品と実験１５−２の方法で得たアミラーゼ精製標品を用いて、実験１４に記載したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いたグルカンＣの調製が再現できるか否かを検討した。すなわち、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実験６の方法で得たバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、実験１５―２の方法で得たアミラーゼを固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた後、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１５に示した。図１５において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである（α−グルコシル転移酵素のみ１０単位作用させた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムは図１に示したグルカンＡのクロマトグラムとほぼ同様であり、図１５では省略した。後述する図１７〜２０についても同様）。これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１７に示す。また、基質として用いた澱粉部分分解物について調べた分子量分布分析と水溶性食物繊維含量の結果（α−グルコシル転移酵素０単位、アミラーゼ０単位）を表１７に併記した。
【０１３９】
【表１７】
【０１４０】
表１７の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素にアミラーゼを併用すると、得られる分岐α−グルカンの分子量は低下し、水溶性食物繊維含量は飛躍的に増加した。また、アミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．１まで低下した。さらに、得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり０．５単位以上で約７６質量％にまで達した。
【０１４１】
この結果から、実験１４においてバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の粗酵素を用いて得られたグルカンＣにおいて、分子量が小さく、食物繊維含量が高くなったのは、粗酵素に混在するアミラーゼに起因することが確認された。混在するアミラーゼが、基質である澱粉部分分解物およびα−グルコシル転移酵素の産物である分岐α−グルカンを部分的に加水分解することにより分岐α−グルカンの分子量を低下させ、また、グリコシル基をさらに分岐α−グルカンに転移することにより、結果的に食物繊維含量を高めるよう作用しているものと推察される。さらに、この結果は、アミラーゼをこのα−グルコシル転移酵素と組み合わせることにより分子量が小さく、水溶性食物繊維含量を高めた分岐α−グルカンを製造できることを示している。
【０１４２】
＜実験１８：α−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製＞
本発明で使用するα−グルコシル転移酵素と他の公知のアミラーゼを併用して、澱粉部分分解物に作用させて分岐α−グルカンを調製し、その構造的な特徴及び水溶性食物繊維含量を検討した。なお、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素を用いた場合と、アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素を用いた場合の結果は同等であったことから、本実験では、バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製標品を用いた結果を示す。
【０１４３】
＜実験１８−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼに変えて、シュードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、５０、２００、５００又は１，０００単位加えた以外は実験１７と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１６に示した。図１６において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１８に示す。
【０１４４】
【表１８】
【０１４５】
表１８のα−グルコシル転移酵素のみを澱粉部分分解物に作用させた場合の結果から明らかなように、α−グルコシル転移酵素のみでは分子量分布に大きな影響を及ぼさないものの、表１８及び図１６の結果から明らかなように、イソアミラーゼの作用量が多くなるにつれて、得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量は共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。イソアミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１０００単位の場合、Ｍｗ／Ｍｎは１．９まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度２０．６にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、イソアミラーゼの作用量にあまり影響されず、４０乃至４４質量％程度であった。
【０１４６】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素にさらにイソアミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量をほとんど変化させることなく、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１４７】
＜実験１８−２：α−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えて市販のα−アミラーゼ（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセ生化学工業株式会社製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１７に示した。図１７において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、α−アミラーゼを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表１９に示す。
【０１４８】
【表１９】
【０１４９】
図１７及び表１９の結果から明らかなように、α−アミラーゼの作用量が多くなるにつれて得られる分岐α−グルカンの数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。α−アミラーゼの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１７の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは２．４まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度１１．８にピークを有する分子量分布を示した。一方、各反応条件により得られた分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、α−アミラーゼの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められた。
【０１５０】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素にα−アミラーゼを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、水溶性食物繊維含量が増加し、分子量が低下した分岐α−グルカンを製造できることが判明した。
【０１５１】
＜実験１８−３：α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼに変えてバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり０、０．１、０．２、０．５又は１．０単位加えた以外は実験１８−１と同様に反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１８に示した。図１８において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ、α−グルコシル転移酵素をいずれも１０単位とし、ＣＧＴａｓｅを０．１単位、０．２単位、０．５単位及び１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２０に示す。
【０１５２】
【表２０】
【０１５３】
図１８及び表２０の結果から明らかなように、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるにつれて、数平均分子量及び重量平均分子量が共に低下し、さらに重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）も低下したことから、分子量分布の幅が狭くなることが判明した。ＣＧＴａｓｅの作用量が固形物１グラム当たり１．０単位（図１８の符号ｅ）の場合、Ｍｗ／Ｍｎは３．２まで低下し、分岐α−グルカンは、グルコース重合度７９．１にピークを有する分子量分布を示した。一方、分岐α−グルカンにおける水溶性食物繊維の含量は、ＣＧＴａｓｅの作用量が多くなるほど増加する傾向が認められ、実験１８−２のα−アミラーゼを併用した場合よりも顕著に増加し、ＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり１．０単位用いた場合では、水溶性食物繊維含量は７０．５質量％に達した。
【０１５４】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素にＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることで、分子量が低下し、水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンが調製できることが判明した。ＣＧＴａｓｅはα−１，４結合の加水分解作用と共に転移作用をも有していることから、α−アミラーゼと比較して極端に分子量を低下させることなく、非還元末端グルコシル残基を生成するため、α−グルコシル転移酵素の作用頻度が高くなり、α−アミラーゼ添加よりも水溶性食物繊維含量が増加した分岐α−グルカンが得られたものと推察される。
【０１５５】
＜実験１８−４：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの調製と得られた分岐α−グルカンの分子量分布と水溶性食物繊維含量＞
実験１８−１に記載した実験において、さらにバチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅを固形物１グラム当たり０又は１．０単位を加えた以外は実験１８−１と同様にして反応させた。各反応条件によりそれぞれ得た分岐α−グルカンを実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法に供して得たクロマトグラムを、基質として用いた澱粉部分分解物のそれとともに図１９に示した。図１９において、符号ａは基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムであり、符号ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、いずれもα−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅをそれぞれ１０単位及び１単位とし、イソアミラーゼを５０単位、２００単位、５００単位及び１，０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラムである。また、これらゲル濾過ＨＰＬＣで得たクロマトグラムに基づく各分岐α−グルカンの分子量分布分析の結果と、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法にて調べた水溶性食物繊維含量を併せて表２１に示す。
【０１５６】
【表２１】
【０１５７】
図１９及び表２１の結果から明らかなように、このα−グルコシル転移酵素と固形物１グラム当たり１単位のＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンの重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は３．２まで低下し、さらに固形物１グラム当たり１０００単位のイソアミラーゼを併用した場合（図１９の符号ｅ）には１．９まで低下した。α−グルコシル転移酵素とＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンの水溶性食物繊維含量は約７０質量％にまで増加し、さらにイソアミラーゼを併用した場合にも低下することなく、高い含量を維持していた。
【０１５８】
この結果から、このα−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して澱粉部分分解物に作用させることにより、分子量が顕著に低下すると共に水溶性食物繊維含量が顕著に増加した分岐α−グルカンを調製できることが判明した。
【０１５９】
＜実験１９：分岐α−グルカンの機能性＞
水溶性食物繊維含量が最も高く、分子量が比較的小さい分岐α−グルカンとして、実験１８−４において固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位ＣＧＴａｓｅを組み合わせて調製した分岐α−グルカンを選択し、当該分岐α−グルカンの消化性及び構造的な特徴及び機能性を検討した。
【０１６０】
＜実験１９−１：α−グルコシル転移酵素とイソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用した分岐α−グルカンの精製＞
固形物１グラム当たり１０単位のα−グルコシル転移酵素、５０単位のイソアミラーゼ、及び１単位のＣＧＴａｓｅを用い、実験１８−４と同様に反応させて得た分岐α−グルカンの反応液を、濾過して不溶物を除去した後、三菱化学製イオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』と『ダイヤイオンＷＡ３０』及びオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで濃縮し、固形分濃度３０％の分岐α−グルカン含有液を、用いた澱粉から固形物当り８５．８％の収率で得た。得られた分岐α−グルカンのメチル化分析を実験４−１記載の方法で行った結果を表２２に示した。また、実験４−４記載のゲル濾過ＨＰＬＣ法で行った分子量分布分析、実験３記載の酵素−ＨＰＬＣ法で求めた水溶性食物繊維含量、実験４−２記載のイソマルトデキストラナーゼ消化試験の結果を表２３にまとめた。
【０１６１】
【表２２】
【０１６２】
【表２３】
【０１６３】
表２２及び２３の結果から明らかなように、得られた分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物を１対２．４の比で含有し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７７．５％を占めていた。また、本分岐α−グルカンにおいて、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．６％及び２．４％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量５，４８０ダルトン、Ｍｗ／Ｍｎ２．３を示し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量が６８．６質量％、イソマルトデキストラナーゼ消化により、糖組成当たりイソマルトースを３６．４質量％生成するグルカンであった。
【０１６４】
当該分岐α−グルカンの有用性を評価する目的で、実験１９−１で調製した分岐α−グルカンを用いて、う蝕原性、消化性、血糖値とインスリン量に及ぼす影響、及び急性毒性を実験１９−２乃至１９−７で調べた。
【０１６５】
＜実験１９−２：分岐α−グルカンのう蝕原性菌による酸発酵性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用い、『インフェクション・アンド・イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）』、第３９巻、４３乃至４９頁（１９８３年）に記載の大島らの方法に準じて、う蝕原性菌を用いた酸発酵性試験を行った。う蝕原性菌として、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５株及びストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＯＭＺ−１７６株の２株を用いた。対照として、スクロースを用いて同様に操作した。結果を表２４に示す。
【０１６６】
【表２４】
【０１６７】
表２４の結果から明らかなように、酸発酵を受けるスクロースの場合はｐＨ約４にまで低下するのに対して、当該分岐α−グルカンは、ストレプトコッカス・ソブリナス及びストレプトコッカス・ミュータンスによる酸発酵をほとんど受けず、ｐＨは約６を維持しており、歯のエナメル質が脱灰する臨界ｐＨである５．５より高いｐＨであった。当該分岐α−グルカンは、う蝕原性が極めて低いことが確認された。
【０１６８】
＜実験１９−３：分岐α−グルカンの消化性試験＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、日本栄養食糧学会誌、第４３巻、第２３乃至２９頁（１９９０）に記載の岡田らの方法に準じて、試験管内において唾液アミラーゼ、人工胃液、膵液アミラーゼ及び小腸粘膜酵素による分岐α−グルカンの消化性を調べた。対照として、市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。結果を表２５に示す。
【０１６９】
【表２５】
【０１７０】
表２５の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンは、唾液アミラーゼ、人工胃液によっては全く消化されず、膵液アミラーゼでごく僅か分解された。また、対照の難消化性デキストリンの小腸粘膜酵素による分解率が４１．１％であるのに対して、分岐α−グルカンの分解率は１６．４％と低く、当該分岐α−グルカンは市販の難消化性デキストリンよりもさらに消化され難いことが判明した。
【０１７１】
＜実験１９−４：分岐α−グルカンの摂取が血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、血糖値の上昇及びインスリンの上昇を調べた。７週齢のウィスター系雄ラット各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて分岐α−グルカンの水溶液を経口投与した。投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇとした。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値はグルコース・オキシダーゼ法で測定し、インスリン量はラットインスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所製造）を用いて測定した。対照１としてグルコースを、また、対照２として市販の難消化性デキストリン（商品名『パインファイバー』、松谷化学工業株式会社製造）を用いた。それぞれの試験系における血糖値及びインスリン量の結果をそれぞれ表２６及び表２７に示す。
【０１７２】
【表２６】
【０１７３】
【表２７】
【０１７４】
表２６及び表２７の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリンと同様に、血糖値の上昇及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べ低いことが判明した。
【０１７５】
＜実験１９−５：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実験１９−１の方法で得た分岐α−グルカンを経口投与して急性毒性試験を行った。その結果、当該分岐α−グルカンは無毒性であり、投与可能な最大量においても死亡例は認められず、そのＬＤ５０値は、５ｇ／ｋｇ−マウス体重以上であった。
【０１７６】
＜実験２０：分岐α−グルカンの血糖上昇抑制作用＞
実験１９−４において、分岐α−グルカンの摂取により、血糖値及びインスリン量の上昇が、グルコースに比べて低いことが判明したので、後述する実施例５の方法で得た分岐α−グルカンを用いて、分岐α−グルカンの摂取が血糖上昇に与える影響をさらに詳細に検討した。
【０１７７】
＜実験２０−１：分岐α−グルカンの摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
分岐α−グルカンが、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学工業株式会社販売）摂取後の血糖上昇に与える影響を検討した。ラット飼育用飼料（株式会社林原生物化学研究所調製、「ＡＩＮ−９３Ｇ」；ジャーナル・オブ・ニュートリッション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、第１２３巻、第１９３９−１９５１頁（１９９３）参照、以下「精製飼料」という。後述の表３３に示す配合組成を参照）で、１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）３群各群５匹を用いて、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）と分岐α−グルカンとを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として、０．１５ｇ、０．３０ｇ又は０．７５ｇとした。ラットの血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して、血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットに澱粉部分分解物のみを固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重経口投与した。また、対照２として、分岐α−グルカンに換えて、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社製造）を、澱粉部分分解物と同時に、２群各群５匹のラットに、体重１ｋｇ当り固形物として０．１５ｇ又は０．７５ｇの何れかを経口投与した。それぞれの試験系における血糖値の変化、血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積）、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表２８、表２９、表３０及び表３１に示す。
【０１７８】
【表２８】
【０１７９】
【表２９】
【０１８０】
【表３０】
【０１８１】
【表３１】
【０１８２】
表２８乃至表３１の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、用量依存的に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇を、澱粉部分分解物を単独で摂取させた場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの上昇抑制効果の程度を比較すると、測定した何れの指標においても、当該分岐α−グルカンの方が市販の難消化性デキストリンよりも強い抑制効果を示した。
【０１８３】
＜実験２０−２：澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量への分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２０−１において、分岐α−グルカンが、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を何れも抑制することが判明したので、この分岐α−グルカンの分子量の違いが、糖質負荷時の血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用に及ぼす影響を検討した。すなわち、原料澱粉部分分解物、α−グルコシル転移酵素、アミラーゼの使用量等を調整して、表３２に示す重量平均分子量の分岐α−グルカンを調製した。実験２０−１と同様に、精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）９群各群５匹を用いて、１日絶食後、８群各群５匹のラットには、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物（固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重）又は表３２に示す分岐α−グルカンの何れかを溶解した水溶液を経口投与した。分岐α−グルカンの投与量はラット体重１ｋｇ当り固形物として０．７５ｇとした。残りの１群５匹のラットには、澱粉部分分解物のみをラット体重１ｋｇ当り固形物として１．５ｇ経口投与し、対照群とした。これらのラットの血液を、経口投与直前及び投与３０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液をヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。各群における血糖値及びインスリン量の測定結果を表３２に併せて示す。なお、投与後の採血時間は、澱粉部分分解物のみを投与した場合に、血糖値及び血中インスリン量がピークとなる投与３０分後とした。
【０１８４】
【表３２】
【０１８５】
表３２の結果から明らかなように、重量平均分子量が１，１６８乃至２００，０００の範囲にある分岐α−グルカンは、何れも澱粉部分分解物を経口投与した後の血糖値及びインスリン量の上昇を抑制した。また、この血糖値及びインスリン量の上昇抑制効果の強さの程度で比較すると、分岐α−グルカンの分子量が１，１６８乃至６０，０００（水溶性食物繊維含量が５８．１乃至８０．４質量％）の場合に抑制効果が顕著となり、２，６７０乃至４４，１５１（水溶性食物繊維含量が６４．２乃至８０．４質量％）の場合に特に強い抑制効果が認められた。
【０１８６】
＜実験２０−３：分岐α−グルカンの長期摂取が澱粉部分分解物摂取時の血糖値及びインスリン量に与える影響＞
実験２０−１において、分岐α−グルカンの摂取により、糖質負荷時の血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンを長期摂取後（８週間）に、糖質負荷時の血糖値、血糖値ＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の上昇抑制作用を検討した。精製飼料で１週間予備飼育した７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）５群各群５匹を使用した。３群各群５匹のラットを、各々表３３に示す分岐α−グルカン（固形物換算）を１、２又は５質量％配合した３種類の試験飼料の何れかで８週間飼育した。飼育期間中の餌及び水は自由摂取とした。試験飼料での飼育４週間と８週間で、１日絶食後、胃ゾンデにて、澱粉部分分解物の水溶液を固形物として１．５ｇ／ｋｇ・体重となるように経口投与した。ラットの血液を、投与直前、投与１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後、１８０分後、２４０分後に尾静脈から採血した。それぞれの血液を、ヘパリン処理済採血管に採取し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０分間）して血漿を得た。血糖値とインスリン量とを実験１９−４と同じ方法で測定した。対照１として、１群５匹のラットを精製飼料のみで飼育した。また、残りの１群５匹のラットは、対照２として、精製飼料のコーンスターチの一部を、市販の難消化性デキストリン（商品名『ファイバーソル２』、松谷化学工業株式会社販売）で置き換えた表３３に示す配合組成の飼料で飼育した。飼育４週間と８週間とはほぼ同じ結果となったので、試験飼料で飼育４週間における、それぞれの試験系における血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値の測定結果をそれぞれ表３４、表３５、表３６及び表３７に示す。
【０１８７】
【表３３】
【０１８８】
【表３４】
【０１８９】
【表３５】
【０１９０】
【表３６】
【０１９１】
【表３７】
【０１９２】
表３４乃至３７の結果から明らかなように当該分岐α−グルカンは、市販の難消化性デキストリン（対照２）と同様に、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇を、精製飼料のみで飼育した場合（対照１）に比べ抑制することが判明した。また、これらの数値上昇の抑制は、飼料に配合した分岐α−グルカンの濃度に依存しており、その効果は固形物として、分岐α−グルカンを２質量％配合した場合に顕著となり、５質量％では特に強い抑制が認められた。また、市販の難消化性デキストリンを、固形物として５質量％配合した飼料で飼育したラットにおける、これらの指標の抑制の程度は、固形分として分岐α−グルカンを１質量％配合した飼料と同程度の抑制が認められたことから、当該分岐α−グルカンは、当該難消化性デキストリンよりも、糖質（澱粉部分分解物）負荷時の、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣの上昇抑制効果に優れていることが確認された。更に、澱粉部分分解物投与前の血糖値及びインスリン量を比較すると、分岐α−グルカンを固形物として２質量％又は５質量％配合した飼料を摂取させた群では、精製飼料のみ或いは難消化性デキストリンを固形物として５質量％含む飼料を摂取させた群よりも低く、当該当該分岐α−グルカンは、長期摂取により空腹時血糖値及び血中インスリン量を、市販の難消化性デキストリンよりも効果的に抑制する作用を有していることも明らかになった。なお、試験飼料又は対照飼料で飼育４週間及び８週間で、ラットの体重を比較したところ、何れの群間でも、平均体重に差は認められなかったので、本実験で確認された分岐α−グルカンによる血糖値及びインスリン量の上昇抑制作用は、ラットの健康状態には何ら影響を与えないと判断した。
【０１９３】
＜実験２１：分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及びインスリン量に与える影響＞
分岐α−グルカンをラットに摂取させると澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べて、血糖値及びインスリン量の増加が抑制されることが明らかになったので、分岐α−グルカンの摂取がヒトの血糖値及び血中のインスリン量に与える影響を調べる試験を行った。市販の澱粉部分分解物（松谷化学工業株式会社販売、商品名「パインデックス＃１」）及び後述する実施例５の方法に準じて調製した分岐α−グルカンを用いて、ヒトでの血糖値及びインスリンの上昇を調べた。健康なボランティアの男性１２名（年齢２６乃至５４歳、平均４１±７歳）を被験者として、試験前日の２１時以降、翌日の試験開始時（９時頃）までの間、水以外の飲食物の摂取を禁止した。この被験者に、まず澱粉部分分解物５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を、摂取開始から２分以内に摂取させた。血液を、経口投与直前、経口投与１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後に採血した。次いで、１週間以上の間隔をあけて、同じ被験者に分岐α−グルカン５０ｇ（固形物換算）を水に溶解して全量２００ｍｌとした試験標品を用いた以外は澱粉部分分解物の場合と同様にして試験し、採血した。それぞれの血液の血糖値及びインスリン量を、民間の臨床検査機関（社団法人岡山市医師会総合メディカルセンター）に委託して測定した。試験標品摂取時の血糖値及びインスリン量の経時的な変化、及び、その数値に基づき計算した、摂取直後乃至摂取１２０分間血糖値のＡＵＣ値（血中濃度−時間曲線下面積：ＡＵＣ０−２ｈｒ（ｍｇ・ｈｒ／ｄｌ））及びインスリン量のＡＵＣ０−２ｈｒ（μＵ・ｈｒ／ｄｌ）値、摂取直後乃至摂取１２０分間の血糖値のＡＵＣ値の増加量及びインスリン量のＡＵＣ値の増加量（ΔＡＵＣ０−２ｈｒ）を、表３８にまとめて示す。
【０１９４】
【表３８】
【０１９５】
表３８の結果から明らかなように、当該分岐α−グルカンをヒトが摂取した場合には、ラットを用いた実験（実験２０）と同様に、血糖値、血糖値のＡＵＣ値、インスリン量及びインスリン量のＡＵＣ値が、澱粉部分分解物を摂取させた場合に比べ有意に低いことが判明した。
【０１９６】
＜実験２２：分岐α−グルカンの生体内脂質低減作用＞
実験１９−４、実験２１において、分岐α−グルカンを摂取することにより、血糖値及び血中のインスリン量の上昇が低くなることが判明したので、当該分岐α−グルカンの摂取が生体内脂質に及ぼす影響についても検討した。
【０１９７】
＜実験２２−１：分岐α−グルカンの摂取が脂肪吸収に与える影響＞
後述する実施例５の方法で調製した分岐α−グルカンを用いて、７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に４群各群１５匹に分けて、１週間、表３３に示す精製飼料で予備飼育後、２群各１５匹は、同表に示す分岐α−グルカンを固形物として５質量％配合した組成の飼料（試験飼料）で、週間または８週間飼育した。残りの２群各１５匹は、対照として、精製飼料で同様に４週間または８週間飼育した。分岐α−グルカン配合飼料で飼育した１群１５匹を飼育開始４週間で、及び、残り１群１５匹を８週間で、各々、エーテル麻酔下で下大静脈より採血後屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪量、血清脂質、腸粘膜湿質量および盲腸内容物などを調べた。対照のラットも同様に処理した。その結果を表３９に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重と摂餌量を測定しながら、実験２０−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。また、解剖前は一晩絶食とした。分岐α−グルカン配合飼料飼育４週間及び８週間の体重増加量、摂餌量、飼料利用効率（体重増加量／摂餌量）、解剖時の、体重、臓器等の質量、腸粘膜質量、内臓脂肪質量、盲腸内の内容物の質量、水分、ｐＨを表３９に示す。また、血清脂質の測定結果も表３９に併せて示す。なお、血清脂質のうち、中性脂肪、総コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールの測定は、それぞれ市販の中性脂肪トリグリセライド測定用キット（商品名「トリグリセライド Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）、総コレステロール測定用キット（商品名「コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売、）及びＨＤＬ−コレステロール測定用キット（商品名「ＨＤＬ−コレステロール Ｅ−テスト ワコー」、和光純薬工業株式会社販売）を使用した。また、総コレステロール値からＨＤＬ−コレステロール値を減じてＬＤＬ−コレステロール値とした。
【０１９８】
【表３９】
【０１９９】
表３９の結果から明らかなように、分岐α−グルカンを、固形物として５質量％配合した飼料を摂取させると、精製飼料のみで飼育した場合に比して、摂取４週間では、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示し、摂取８週間では、腎臓周囲及び睾丸周囲脂肪のいずれも有意に低値を示し、その低下は、特に睾丸周囲脂肪で顕著であった。また、摂取４週間及び８週間で腸粘膜質量が有意に増加し、その増加は摂取８週間で顕著となった。また、摂取８週間で盲腸内ｐＨが有意に低下した。さらに、血清脂質についてみると、中性脂肪値が摂取８週間で、総コレステロールが摂取４週間及び８週間で、何れも低下傾向を示し、ＬＤＬ−コレステロールも低下した。これら以外の測定値は、対照と差は認められなかった。なお、具体的なデータは示さないが、盲腸内の有機酸濃度は、対照と差は認められなかった。この結果は、分岐α−グルカンが、生体内脂質の低減作用を有することを物語っている。また、腸粘膜の質量増加が認められることから、分岐α−グルカンによる脂質の過剰蓄積の抑制や実験２０乃至２１で確認された耐糖性の増強には、この試験で確認されたムチン分泌の増大を伴う小腸粘膜層の肥厚に起因する消化酵素の作用性低下や消化されたグルコースや脂肪の消化・吸収阻害、遅延が、重要な役割を果たしていると推察される。
【０２００】
＜実験２２−２：生体内脂質の過剰蓄積抑制に与える分岐α−グルカンの分子量の影響＞
実験２２−１において、分岐α−グルカンの摂取により、生体内脂質の過剰蓄積が抑制されることが判明したので、当該分岐α−グルカンの重量平均分子量の違いによる作用を検討した。すなわち、精製飼料に、実験２０−２で使用したものと同じ重量平均分子量の異なる８種類の分岐α−グルカンを、それぞれ固形物として５質量％配合した８種類の試験飼料を調製した。ウィスター系ラット雌性７週齢（日本チャールスリバー株式会社販売）４５匹を、無作為に９群各群５匹に分けて、１週間、精製飼料で予備飼育した。このラットのうち、８群については、表４０に示す重量平均分子量の異なる分岐α−グルカンの何れかを配合した試験飼料（試験飼料１乃至８）で８週間飼育した。残りの１群５匹のラットは、精製飼料でそのまま８週間飼育し、対照群とした。分岐α−グルカンを配合した飼料を摂取して８週間経過したラット及び精製飼料を摂取して８週間経過した対照群のラットを、それぞれエーテル麻酔下で採血後、屠殺して、その腸間膜周囲、腎臓周囲及び睾丸周囲の脂肪質量（湿質量）、並びに、血清中の中性脂肪及び総コレステロールを、実験２２−１と同じ方法で測定した。結果を表４０に示す。
【０２０１】
【表４０】
【０２０２】
表４０の結果から明らかなように、重量平均分子量が異なる分岐α−グルカンを摂取させた場合、何れの群においても内臓脂肪質量及び血清脂質量が、対照群よりも低値となり、当該分岐α−グルカンが内臓脂肪質量及び血清脂質量の上昇を抑制することが分かった。また、この抑制効果の程度で比較すると、分岐α−グルカンの重量平均分子量が２，６７０乃至４４，１５１のもので効果が顕著となり、２，６７０乃至２５，６１８の場合に特に強い効果が認められた。
【０２０３】
＜実験２２−３：分岐α−グルカンの摂取量の違いが内臓蓄積脂肪に与える影響＞
７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に５群各群５匹に分けて、１週間、市販の固形飼料で予備飼育後、３群各５匹は、分岐α−グルカンを１、２又は５質量％配合した表３３に示す配合の精製飼料（各々、試験飼料１、試験飼料２又は試験飼料３）で４週間飼育した。残りの２群各５匹の内、１群５匹は、市販の難消化性デキストリン（松谷化学販売、商品類「ファイバーソルＩＩ」）を５質量％配合した表３３に示す精製飼料で４週間飼育した（対照１）。また、残りの１群５匹は、表３３に示す精製飼料で４週間飼育した（対照２）。分岐α−グルカンを配合した精製飼料で４週間飼育後、各群のラットを、各々、屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪量を測定した。対照１及び２のラットも同様に処理した。その結果を表４１に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重と摂餌量を測定しながら、実験２２−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。なお、解剖前のラットは一晩絶食とした。また、分岐α−グルカン或いは難消化性デキストリンを配合した精製飼料で４週間飼育したときの、飼育期間中の餌の総摂取量に分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの配合割合（％）を乗じ、１００で除して、当該飼料で飼育した期間中の分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの総摂取量を計算し、さらに、飼育期間（２８日）で、除して、１日当たりの分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの摂取量を計算して、表４１に併せて示す。
【０２０４】
【表４１】
【０２０５】
表４１の結果から明らかなように、分岐α−グルカンを、固形物として１質量％配合した精製飼料（試験飼料１）を４週間摂取させると、精製飼料のみで飼育した場合（対照２）に比して、睾丸周囲の内臓脂肪質量が低値を示し、２又は５質量％配合した精製飼料（試験飼料２又は試験飼料３）を４週間摂取させると、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示し、睾丸周囲脂肪質量は有意に低値を示した。腸間膜周囲脂肪質量は、分岐α−グルカンを、固形物として１又は２質量％配合した精製飼料（試験飼料１又は試験飼料２）で飼育した場合には、精製飼料のみで飼育した場合（対照２）に比して増加し、５質量％配合した精製飼料（試験飼料３）で飼育した場合には、精製飼料で飼育した場合（対照２）と差は認められなかった。また、５質量％市販難消化性デキストリンを配合した精製飼料を４週間摂取させた場合（対照１）には、精製飼料のみで飼育した場合（対照２）に比して、腸間膜周囲脂肪質量に差は認められず、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が低値を示したものの、個体間の脂肪質量の変動幅が大きく、有意な差は認められなかった。分岐α−グルカンと市販難消化性デキストリンとを摂取させた場合の、内臓脂肪蓄積に対する抑制効果の強さを比較すると、分岐α−グルカンの方が強く、その効果は、睾丸周囲脂肪について顕著であった。この結果は、当該分岐α−グルカンが、内臓脂肪、とりわけ、睾丸周囲脂肪の蓄積抑制作用を有することを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、各群間で、体重の増加量、摂餌量に有意の差は認められなかった。
【０２０６】
＜実験２２−４：分岐α−グルカンの摂取形態の違いが内臓蓄積脂肪に与える影響＞
７週齢のウィスター系雄性ラット（日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に５群各１１匹に分けて、１週間、市販の固形飼料で飼育後、３群各１１匹は、後述する実施例５の方法で調製した分岐α−グルカンを、０．５、１又は２質量％含む脱イオン水（各々、試験飲水１、試験飲水２又は試験飲水３）を飲水として与えながら、市販のラット用固形飼料で４週間飼育した。残りの２群各１１匹の内、１群１１匹は、市販の難消化性デキストリン（松谷化学販売、商品類「ファイバーソルＩＩ」）を２質量％含む脱イオン水を飲水として与えながら、市販のラット用固形飼料で４週間飼育した（対照１）。また、残りの１群１１匹は、脱イオン水を飲水として与えながら、市販のラット用固形飼料で同様に４週間飼育した（対照２）。分岐α−グルカンを含む飲水で４週間飼育後の各群のラットを、屠殺し、解剖して、内臓蓄積脂肪質量を測定した。対照１及び２のラットも同様に処理した。その結果を表４２に示す。なお、ラットの飼育は、試験期間中を通じて、２又は３日おきに体重、摂餌量と飲水の摂取量を測定しながら、実験２２−１と同様に餌及び水は飼育期間中を通じて自由摂取とした。また、分岐α−グルカン或いは難消化性デキストリンを含む飲水で４週間飼育したときの、飼育期間中の飲水の総摂取量に分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの含有割合（％）を乗じ、１００で除して、当該飲水で飼育した期間中の分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの総摂取量を計算し、さらに、飼育期間（２８日）で、除して、１日当たりの分岐α−グルカン又は難消化性デキストリンの摂取量を計算して、表４２に併せて示す。
【０２０７】
【表４２】
【０２０８】
表４２の結果から明らかなように、分岐α−グルカンを、固形物として０．５、１又は２質量％含む飲水（試験飲水１、試験飲水２又は試験飲水３）を与えて４週間飼育すると、脱イオン水のみで飼育した場合（対照２）に比して、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が何れも有意に低値を示した。また市販難消化性デキストリンを５質量％含む飲水を与えて４週間飼育した場合（対照１）にも、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪質量が何れも有意に低値を示した。分岐α−グルカンと市販難消化性デキストリンとを飲水摂取させた場合の、内臓脂肪蓄積に対する抑制効果の強さを比較すると、分岐α−グルカンの方が強く、その効果の差は、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪の何れの部位について顕著であった。また、飼育条件は違うものの、分岐α−グルカンを混餌摂取させた場合（実験２２−３）と飲水に溶解して摂取させた場合との内臓脂肪質量を比較すると、例えば、２質量％分岐α−グルカン配合精製飼料（試験飼料２）と０．５質量％含有飲水（試験飲水１）で４週間飼育した場合には、１日あたりの分岐α−グルカン摂取量は、各々０．７１ｇ及び０．３４ｇと、０．５質量％分岐α−グルカン含有飲水で飼育した場合の方が、分岐α−グルカンの１日あたり摂取量は少ないにも拘わらず、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲脂肪の何れの部位について、飲水摂取の方が脂肪質量の増加の抑制が顕著であった。具体的には、２質量％分岐α−グルカン配合精製飼料（試験飼料２）で飼育した場合には睾丸周囲脂肪質量のみが対照２と有意の差が認められただけで、腸間膜周囲脂肪質量は対照２に比して増加したのに対して、０．５質量％含有飲水（試験飲水１）で飼育した場合には、腸間膜周囲、腎臓周囲および睾丸周囲の脂肪質量が何れも有意に低値を示した。この結果は、当該分岐α−グルカンが、優れた内臓脂肪の蓄積抑制作用を有することを物語っている。また、当該分岐α−グルカンは、混餌摂取よりも飲水に溶解して摂取する方が、摂取量が同じ場合、内臓脂肪蓄積抑制効果に優れていることを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、各群間で、体重の増加量、摂餌量及び飲水の摂取量に有意の差は認められなかった。
【０２０９】
以上の実験の結果から、当該分岐α−グルカンは、炭水化物や脂質摂取後の血中インスリン上昇抑制剤、内臓脂肪蓄積抑制剤及び脂質代謝改善剤として利用できることが判明した。さらに、実験２２の結果から、分岐α−グルカンは、固状の形態で摂取するよりも、溶液の形態で摂取する方が、摂取量が同じ場合には、その生理機能を効果的に発揮でき、また、その生理作用は市販の難消化性デキストリンよりも強いことも判明した。
【０２１０】
以下、本発明で使用するα−グルコシル転移酵素の製造例を実施例１及び２に、本発明の脂質代謝改善剤の有効成分である分岐α−グルカンの製造例を実施例３乃至６に示す。また、本発明の脂質代謝改善剤の有効成分である分岐α−グルカンの物理化学的性質を実施例７に例示する。本発明の脂質代謝改善剤である分岐α−グルカンを含有せしめた脂質代謝改善剤を実施例８乃至１５に示す。
【実施例１】
【０２１１】
バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）を実験５の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮粗酵素液を調製した。本濃縮粗酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は２００単位／ｍｌであった。また、本濃縮酵素液には約２５単位／ｍｌのアミラーゼ活性も認められた。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明で使用するα−グルカンの製造に有利に利用できる。
【実施例２】
【０２１２】
アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７０）を実験８の方法に準じて、ファーメンターで約２４時間培養した。培養後、遠心分離して培養液上清を回収し、８０％飽和となるように硫安を添加して４℃、２４時間放置することにより塩析した。塩析物を遠心分離して回収し、これに２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、膜濃縮して濃縮酵素液を調製した。本濃縮酵素液のα−グルコシル転移酵素活性は５０単位／ｍｌであった。本品は、澱粉質の基質を用いた本発明で使用する分岐α−グルカンの製造に有利に利用できる。
【実施例３】
【０２１３】
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社販売）を濃度３０質量％になるよう水に溶解し、これをｐＨ６．０に調整し、実施例１の方法で得た濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１０単位加え、４０℃、４８時間作用させた。反応終了後、反応液を９５℃に加熱し、１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度５０質量％の分岐α−グルカン溶液を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析における２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１対１．３を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の７０．３％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の３．０％及び４．８％であった。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量６，２２０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．２であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化により、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．１質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７５．８質量％であった。本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例４】
【０２１４】
３０％タピオカ澱粉乳に最終濃度０．１質量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製造、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり０．２質量％になるように加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液を、オートクレーブ（１２０℃）を１０分間行った後、４０℃に冷却し、これに実施例２の方法で調製したα−グルコシル転移酵素の濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１０単位加え、さらに、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製）を固形物１グラム当たり１単位加え、４０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物との比が１：１．６を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の８０．０％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の１．４及び１．７％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量１０，３３０ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．９であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．７質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は６８．６質量％であった。本分岐α−グルカンは、本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例５】
【０２１５】
２７．１質量％トウモロコシ澱粉液化液（加水分解率３．６％）に、最終濃度０．３質量％となるように亜硫酸水素ナトリウムを、また、最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加えた後、５０℃に冷却し、これに実施例１の方法で調製した濃縮粗酵素液を、α−グルコシル転移酵素活性として基質固形物１グラム当たり１１．１単位加え、さらに、５０℃、ｐＨ６．０で６８時間作用させた。その反応液を８０℃で６０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比が１：２．５を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６８．４％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．６及び６．８％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量４，０９７ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．１であった。さらに、本分岐α−グルカンは、イソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを３５．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７９．４質量％であった。本分岐α−グルカンは、本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例６】
【０２１６】
濃縮粗酵素液に替えて実験６の方法で調製したバチルス・サーキュランス ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７１）由来の精製α−グルコシル転移酵素を用い、シュードモナス・アミロデラモサ由来のイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を基質固形物１グラム当たり１，０００単位加えた以外は実施例５と同様にして分岐α−グルカン粉末を得た。本分岐α−グルカンは、メチル化分析において、部分メチル化物である２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の比は１：４を示し、２，３，６−トリメチル化物と２，３，４−トリメチル化物の合計は部分メチル化物の６７．９％を占めていた。また、２，４，６−トリメチル化物及び２，４−ジメチル化物は、それぞれ部分メチル化物の２．３及び５．３％を示した。また、本分岐α−グルカンは、重量平均分子量２，９７９ダルトンであり、重量平均分子量を数平均分子量で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）は２．０であった。さらに、本分岐α−グルカンはイソマルトデキストラナーゼ消化において、消化物の固形物当たりイソマルトースを４０．６質量％生成し、酵素−ＨＰＬＣ法により求めた水溶性食物繊維含量は７７質量％であった。本分岐α−グルカンは、本品は、脂質代謝改善剤として、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で利用できる。また本品は、そのままで、部分精製して、分画して、さらには、これらを配合した組成物の形態で血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例７】
【０２１７】
実施例５で調製した分岐α−グルカンについて、常法に従って物理化学的性質を調べ、本発明で使用する分岐α−グルカンの性質の一例として表４３にまとめた。
【０２１８】
【表４３】
【実施例８】
【０２１９】
＜脂質代謝改善剤＞
原乳１００質量部に実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液２質量部及び蔗糖３重量を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して、加糖練乳形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を使用したスイーツや料理を摂取すれば、効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例９】
【０２２０】
＜脂質代謝改善剤＞
脱脂粉乳１７５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末５０質量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標『乳果オリゴ』）５０質量部を水１、５００質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料形態の脂質代謝改善剤を得た。本品は液状なので、摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１０】
【０２２１】
＜脂質代謝改善剤＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１０質量部、含水結晶トレハロース２０質量部、無水結晶マルチトール２０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、及び粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液をバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して粉末ジュース形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を水に溶解してジュースとして摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１１】
【０２２２】
＜脂質代謝改善剤＞
コーンスターチ１００質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液３０質量部、トレハロース含水結晶７０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装してカスタードクリーム形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を、シューに詰めるなどして、摂取すれば、脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１２】
【０２２３】
＜脂質代謝改善剤＞
原料小豆１０質量部に、常法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし、水溶性夾雑物を除去して、小豆粒餡約２１質量部を得た。この生あんに蔗糖１４質量部、実施例３の方法で得た分岐α−グルカン溶液５質量部と水４質量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダオイルを加えて粒餡を壊さないように練り上げ、餡形態の脂質代謝改善剤を約３５質量部得た。本品を使用して餡パン、まんじゅう、団子、最中、氷菓などを製造し、摂取すれば脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１３】
【０２２４】
＜脂質代謝改善剤＞
小麦粉１００質量部、イースト菌２質量部、蔗糖５質量部、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１質量部および無機フード０．１質量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２時間発酵させ、その後３０分間熟成、焼き上げて、パン形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を摂取すれば脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１４】
【０２２５】
＜脂質代謝改善剤＞
４０質量％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を水に溶解して摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１５】
【０２２６】
＜脂質代謝改善剤＞
実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物を２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして、流動食形態の脂質代謝改善剤を得た。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１６】
【０２２７】
＜脂質代謝改善剤＞
実施例４の方法で得た分岐α−グルカン粉末３０質量部、茶抽出物０．１質量部、グァバ葉抽出物０．０１質量部、Ｌ−カルニチン酒石酸塩０．０２質量部、蔗糖糖１質量部、α、α−トレハロース２質量部、チアミン０．００１質量部に水を加えて、全量を５００質量部とし、３５０ｍｌずつペットボトルに充填して、清涼飲料形態の脂質代謝改善剤を調製した。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１７】
【０２２８】
＜脂質代謝改善剤＞
焙煎され、挽かれたレギュラーコーヒー用の豆を、常法により、沸騰水道水を用いて、９０℃で、５分間ネルドリップして、コーヒー抽出液を得た。このコーヒー抽出液５０質量部、実施例６の方法で調製した分岐α−グルカン４質量部、牛乳３．５質量部、グラニュー糖６質量部を混合し、全体として１００質量部になるように沸騰水道水を加えた。次に、５質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨを６．５に調整し、２５０ｍｌずつスチール缶に充填して、湯浴中で、９３℃になるまで予備加熱した後、密封し、１２３℃で、１５分間殺菌し、次いで、流水中で、１時間急冷して、缶コーヒー形態の脂質代謝改善剤を調製した。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【実施例１８】
【０２２９】
＜脂質代謝改善剤＞
実施例６の方法で調製した分岐α−グルカン粉末３質量部、フマル酸第一鉄０．０６質量部、イノシトール０．１質量部、塩化カルニチン０．２質量部、硝酸チアミン０．０１質量部、リン酸リボフラビンナトリウム０．０１質量部、塩酸ピリドキシン０．０１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸１質量部、アミノエチルスルホン酸２質量部、キシリトール４質量部、α，α−トレハロース５質量部、エリスリトール５、クエン酸０．８質量部、安息香酸ナトリウム０．０６質量部、ミックスフルーツフレーバー０．１質量部に適量のクエン酸ナトリウムを加え、精製水に溶解した後、ｐＨを３．０に調整し、精製水を加えて全量を１００質量部とした。この液をろ紙でろ過し、滅菌装置を用いて、ろ液を８０℃で２５分間加熱滅菌した後、１００ｍｌずつ、ガラス瓶に充填しキャップを施して内服液形態の脂質代謝改善剤を調製した。本品を摂取すれば、同量の分岐α−グルカンを固状の組成物の形態で摂取するよりも効果的に脂質代謝の改善をはかることができる。また、本品は、血中のインスリンや中性脂肪の上昇抑制剤乃至予防剤、内臓脂肪蓄積抑制剤乃至予防剤として利用することもできる。
【産業上の利用可能性】
【０２３０】
本発明の脂質代謝改善剤は、有効成分である分岐α−グルカンの安全性が高く、消化性も市販の難消化性デキストリンと遜色がなく、しかも、優れた脂質代謝改善作用を備えている。また、本発明の脂質代謝改善剤は、長期間摂取しても副作用がなく、安心して使用することができ。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来及びアルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来のα−グルコシル転移酵素標品をそれぞれ用いて澱粉部分分解物より調製したグルカンＡ及びＢのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図２】澱粉部分分解物及び本発明で使用する分岐α−グルカンの構造を模式的に示す図である。
【図３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図７】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適温度を示す図である。
【図８】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図９】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図１０】アルスロバクター・グロビホルミスＰＰ３４９由来α−グルコシル転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図１１】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適温度を示す図である。
【図１２】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図１３】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼの温度安定性を示す図である。
【図１４】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来アミラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図１５】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とアミラーゼ精製品とを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１６】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とイソアミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１７】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とα−アミラーゼとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１８】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品とＣＧＴａｓｅとを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【図１９】バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来α−グルコシル転移酵素精製品と、イソアミラーゼ及びＣＧＴａｓｅを併用して調製した分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣのクロマトグラムを基質である澱粉部分分解物のそれと比較した図である。
【符号の説明】
【０２３２】
図１及び図１５〜１９において、
イ：分子量１０００，０００ダルトンに相当する溶出位置
ロ：分子量１００，０００ダルトンに相当する溶出位置
ハ：分子量１０，０００ダルトンに相当する溶出位置
ニ：分子量１，０００ダルトンに相当する溶出位置
ホ：分子量１００ダルトンに相当する溶出位置
図１において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：グルカンＡのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：グルカンＢのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
１：グルコース重合度４９９に相当する位置
２：グルコース重合度６．３に相当する位置
３：グルコース重合度３８４に相当する位置
４：グルコース重合度２２．２に相当する位置
５：グルコース重合度１０．９に相当する位置
６：グルコース重合度１に相当する位置
７：グルコース重合度４３３に相当する位置
８：グルコース重合度２２．８に相当する位置
９：グルコース重合度１０．９に相当する位置
１０：グルコース重合度１に相当する位置
図２において、
１：澱粉部分分解物の模式図
２：本発明で使用する分岐α−グルカンの模式図
ａ：非還元末端グルコース残基
ｂ：α−１，３結合しているグルコース残基
ｃ：α−１，４結合しているグルコース残基
ｄ：α−１，６結合しているグルコース残基
ｅ：α−１，３，６結合しているグルコース残基
ｆ：α−１，４，６結合しているグルコース残基
斜め向き破線：α−１，３結合
横向き実線：α−１，４結合
縦向き実線：α−１，６結合
図１３において、
●：カルシウムイオン非存在下
○：１ｍＭカルシウムイオン存在下
図１５において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、アミラーゼを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１６において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１７において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、α−アミラーゼを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１８において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．２単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを０．５単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、ＣＧＴａｓｅを１．０単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
図１９において、
ａ：基質とした澱粉部分分解物のゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｂ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５０単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｃ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを２００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｄ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを５００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
ｅ：基質１グラム当たりα−グルコシル転移酵素を１０単位、イソアミラーゼを１０００単位、ＣＧＴａｓｅを１単位作用させて得られた分岐α−グルカンのゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラム
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、下記の特徴を有する分岐α−グルカンを含有する脂質代謝改善剤。
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である。
【請求項２】
分岐α−グルカンのグルコース重合度が１０以上であって、重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）が２０未満である請求項１記載の脂質代謝改善剤。
【請求項３】
分岐α−グルカンが、イソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）消化により、消化物の固形物当たりイソマルトースを２５質量％以上５０質量％以下生成することを特徴とする請求項１又は２記載の脂質代謝改善剤。
【請求項４】
分岐α−グルカンが、高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）により求めた水溶性食物繊維含量が４０質量％以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項５】
分岐α−グルカンと共に食品素材、食品添加物、医薬品、医薬品添加物、医薬部外品添加物から選ばれる１種または２種以上を配合してなる請求項１乃至４の何れかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項６】
液状の形態であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項７】
脂質代謝改善作用を有することを標榜してなる請求項１乃至６のいずれかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れかに記載の脂質代謝改善剤の、血中インスリン上昇抑制剤又は予防剤、血中中性脂肪上昇制剤又は予防剤、乃至、内臓脂肪蓄積抑制剤又は予防剤としての使用。
【請求項１】
グルコースを構成糖とするα−グルカンであって、メチル化分析において、下記の特徴を有する分岐α−グルカンを含有する脂質代謝改善剤。
（１）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；
（２）２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの６０％以上を占める；
（３）２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満である；及び
（４）２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上である。
【請求項２】
分岐α−グルカンのグルコース重合度が１０以上であって、重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）が２０未満である請求項１記載の脂質代謝改善剤。
【請求項３】
分岐α−グルカンが、イソマルトデキストラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．９４）消化により、消化物の固形物当たりイソマルトースを２５質量％以上５０質量％以下生成することを特徴とする請求項１又は２記載の脂質代謝改善剤。
【請求項４】
分岐α−グルカンが、高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）により求めた水溶性食物繊維含量が４０質量％以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項５】
分岐α−グルカンと共に食品素材、食品添加物、医薬品、医薬品添加物、医薬部外品添加物から選ばれる１種または２種以上を配合してなる請求項１乃至４の何れかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項６】
液状の形態であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項７】
脂質代謝改善作用を有することを標榜してなる請求項１乃至６のいずれかに記載の脂質代謝改善剤。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れかに記載の脂質代謝改善剤の、血中インスリン上昇抑制剤又は予防剤、血中中性脂肪上昇制剤又は予防剤、乃至、内臓脂肪蓄積抑制剤又は予防剤としての使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
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【図７】
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【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１０−１００５８３（Ｐ２０１０−１００５８３Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７４９６９（Ｐ２００８−２７４９６９）
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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