腫瘍性疾患を治療するための組成物及び方法
【課題】ボルテゾミブ耐性を克服するための療法を提供することを課題とする。
【解決手段】腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬であって、式（Ｉ）：（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含み、該腫瘍性疾患が少なくとも１つの他の化学療法剤に耐性である、医薬を提供する。
【解決手段】腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬であって、式（Ｉ）：（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含み、該腫瘍性疾患が少なくとも１つの他の化学療法剤に耐性である、医薬を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学及び医学の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、腫瘍性疾患、例えば癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国における死亡の主因である。癌を治療するための新規のアプローチを見出すための著しい努力にもかかわらず、主要な治療選択肢は依然として、外科手術、化学療法及び放射線療法の単独又は組合せである。しかしながら外科手術及び放射線療法は一般的に、かなり限定された型の癌にのみ有用であり、そして播種性疾患を有する患者を治療するための用途は限定されている。化学療法は、転移性癌又は散在性癌、例えば白血病を有する患者を治療するのに一般的に有用な方法である。化学療法は治療的有用性を提供し得るが、それはしばしば、化学療法剤に耐性となる患者の癌細胞のために、この疾患を治癒することができない。
【０００３】
したがって、癌を治療するための付加的化学療法に対する必要性が存在する。新規の潜在的に有用な化学療法剤及び抗菌薬を同定するために個々の研究者、大学及び会社により、継続的努力が為されている。
【０００４】
再発性／難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療のためのボルテゾミブ(Bortezomib)／ＰＳ−３４１療法の開発の成功によって、有効な治療的戦略としてプロテアソーム抑制が確立された。ジペプチドボロン酸類似体ボルテゾミブは、２６Ｓプロテアソーム複合体を標的化し、その機能を抑制する強力で高度に選択的及び可逆的なプロテアソーム阻害薬である。２６Ｓプロテアソームは、細胞内タンパク質分解を媒介するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）依存性多触媒性(multicatalystic)プロテアーゼである。ミスフォールド又は損傷した
タンパク質のプロテアソーム分解は、２６Ｓプロテアーゼの１９Ｓ制御サブユニットによるポリユビキチン化タンパク質の認識、及びその後の低ポリペプチドへの加水分解により進行する。ボルテゾミブは、トリプシン活性又はカスパーゼ様プロテアソーム活性を変更することなく、主にキモトリプシン活性を抑制する。ＮＦ−ｋＢの抑制に加えて、ボルテゾミブは、１）細胞周期制御タンパク質；２）形質細胞分化因子Ｘ−ボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）の転写活性を調節することによるＵＰＲ経路；３）ｐ５３媒介性アポトーシス／ＭＤＭ２；４）ＤＮＡ修復メカニズム；５）内因性（カスパーゼ−９媒介性）及び外因性（カスパーゼ−８媒介性）細胞死カスケードの両方による古典的ストレス−応答経路を標的化することによりＭＭ生物学に対して多面発現的作用を有する。具体的には、ボルテゾミブはＪＮＫを活性化し、これがミトコンドリア・アポトーシスシグナル伝達：ミトコンドリアからサイトゾルへのチトクローム−ｃ（ｃｙｔｏ−ｃ）及びカスパーゼの二次ミトコンドリア活性剤（Ｓｍａｃ）の放出と、その後のカスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の活性化を誘発する。しかしながら内因性の耐性及び後天性耐性は共にすでに観察されており、現在、ボルテゾミブ耐性を克服するための療法は存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、式（Ｉ）：
【０００６】
【化１】
【０００７】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを腫瘍性疾患患者に投与することを包含する、腫瘍性疾患の治療方法であり、腫瘍性疾患が少なくとも１つの他の化学療法剤に対する耐性になりやすい。
【０００８】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグ（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）を、少なくとも１つの付加的化学療法剤と組合せて、腫瘍性疾患患者に投与することを包含する、腫瘍性疾患の治療方法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグ（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）、及び少なくとも１つの付加的化学療法剤を含む、薬学的組成物である。
【００１０】
本発明の別の態様は、少なくとも２つのプロテアソーム阻害薬の相乗的組合せを腫瘍性疾患患者に投与することを包含する、腫瘍性疾患の治療方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＮＰＩ−００５２によるヒト赤血球由来の２０Ｓプロテアソームにおけるキモトリプシン様、カスパーゼ様及びトリプシン様プロテアソーム活性の阻害を示す図である。
【図２】マウスにおけるＮＰＩ−００５２のｉｎ ｖｉｖｏキモトリプシン様活性を示す図である。
【図３】ＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞をＮＰＩ−００５２（７ｎＭ）で処理し、３７℃でＡｄａＹ（125Ｉ）Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共にタンパク質抽出物をインキュベートした後に得られたオートラジオグラフィーを示す図である。
【図４】ＭＭ．１Ｓ細胞をＮＰＩ−００５２で処理し、次にダンシル−Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共にインキュベートした後に得られた免疫ブロット法を示す図である。
【図５Ａ】指示用量のＮＰＩ−００５２で２４時間処理した種々の多発性骨髄腫細胞様の細胞生存度を示す図である。
【図５Ｂ】患者から得られたＭＭ細胞のＮＰＩ−００５２で処理後のアポトーシスのＤＮＡ断片化検定を示す図である。
【図６】患者から得られた骨髄間質細胞のＮＰＩ−００５２で処理後のアポトーシスのＤＮＡ断片化検定を示す図である。
【図７】ＩＬ−６又はＩＧＦ−Ｉの存在下又は非存在下でのＮＰＩ−００５２又はＤｅｘによる処理後のＭＭ．１Ｓ細胞生存度のＭＴＴ検定を示す図である。
【図８】ＭＭ．１Ｓ細胞のＶＥＧＦ誘導性移動に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図９】Ｂｃｌ２過剰発現ＭＭ．１Ｓの細胞生存度に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ａ】マウスに経口投与した場合の腫瘍増殖に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｂ】マウスに経口投与した場合の腫瘍増殖に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｃ】マウスに経口投与した場合の生存に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｄ】マウスに経口投与した場合の体重に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｅ】ＮＰＩ−００５２処理マウス及び対照処理マウスからの接種部位の組織切片を示す図である。
【図１０Ｆ】マウスに静脈内投与した場合の腫瘍増殖に及ぼすＮＰＩ−００５２及びボルテゾミブの作用を比較する図である。
【図１０Ｇ】マウスに静脈内投与した場合の生存に及ぼすＮＰＩ−００５２及びボルテゾミブの作用を比較する図である。
【図１１Ａ】ＣＭＸＲｏｓと共にインキュベートしたＭＭ．１Ｓ細胞におけるミトコンドリア膜電位に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１１Ｂ】膜透過性染料ジヒドロエチジウム（ＨＥ）で染色したＭＭ．１Ｓ細胞におけるスーパーオキシド生成に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１１Ｃ】ＮＰＩ−００５２で処理したＭＭ．１Ｓ細胞から得られたミトコンドリアタンパク質画分及びサイトゾルタンパク質画分の免疫ブロット法を示す図である。
【図１１Ｄ】ＮＰＩ−００５２で処理し、抗カスパーゼ−９抗体で分析したＭＭ．１Ｓ細胞から得られたサイトゾルタンパク質の免疫ブロット法を示す図である。
【図１１Ｅ】ＮＰＩ−００５２で処理し、抗カスパーゼ−８抗体で分析したＭＭ．１Ｓ細胞から得られたサイトゾルタンパク質の免疫ブロット法を示す図である。
【図１１Ｆ】ＮＰＩ−００５２で処理し、そしてＰＡＲＰ及びカスパーゼ−３切断検定の両方によりアポトーシスに関して評価したＭＭ．１Ｓ又はＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞の免疫ブロットを示す図である。
【図１２Ａ】カスパーゼ−３、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９阻害薬の存在下又は非存在下でＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理後のＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１２Ｂ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理後のベクター単独、ＤＮ−カスパーゼ−８及びＤＮ−カスパーゼ−９でトランスフェクトされた細胞に関するＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１２Ｃ】デキサメタゾン又は抗ＦａｓＭｏＡｂで処理したＤＮ−カスパーゼ−８及びＤＮ−カスパーゼ−９トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞からのサイトゾル抽出物の免疫ブロット法を示す図である。
【図１２Ｄ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理後のベクター又はＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化細胞に関するＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１２Ｅ】指示濃度のＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理し、抗Ｂａｘ又は抗Ｈｓｐ６０抗体で分析したＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞からのミトコンドリアタンパク質抽出物の免疫ブロット法を示す図である。
【図１２Ｆ】指示濃度のＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理した野生型又は欠失Ｂａｘ（ノックアウト）を有するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の細胞生存度を示す図である。
【図１３】指示濃度のＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理した５つの健常ドナー由来の正常リンパ球の生存度を示す図である。
【図１４Ａ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブでの処理後のベクター単独又はＢｃｌ−２でトランスフェクトした細胞に関するＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１４Ｂ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理したベクタートランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞又はＢｃｌ−２トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞由来のサイトゾル抽出物の免疫ブロット法を示す図である。
【図１５】指示濃度のＮＰＩ−００５２、ボルテゾミブ又はＮＰＩ−００５２＋ボルテゾミブで処理したＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞の細胞生存度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態において、式（Ｉ）：
【００１３】
【化２】
【００１４】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり得る）の化合物は、本明細書中に記載されているような使用のために提供される。一実施形態では、Ｘは塩素である。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【００１５】
【化３】
【００１６】
による立体化学を有する。式（ＩＩ）の化合物（式中、Ｘ＝Ｃｌ）は、本明細書中ではＮＰＩ−００５２とも呼ばれる。式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の化合物は、海洋性グラム陽性放線菌であるサリノスポラ（Salinospora）の発酵に由来し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される化合物のプロドラッグ、代謝産物、立体異性体及び薬学的に許容可能な塩が、本明細書中に記載されるような使用のために提供される。
【００１８】
「プロドラッグ」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで親薬剤に転換される薬剤を指す。いくつかの場
合には、プロドラッグが親薬剤より投与するのが容易であり得るため、プロドラッグはしばしば有用である。例えばプロドラッグは経口投与により生物学的利用可能であるが、一方、親薬剤はそうではない。プロドラッグは、親薬剤を上回る薬学的組成物中での改善された溶解度を有し得る。プロドラッグの一例は、水溶性が移動度にとって有害である細胞膜を通る透過を促進するためにエステル（「プロドラッグ」）として投与されるが、次に、水溶性が有益である細胞内に一旦入ると、活性実体(active entity：アクティブエンティティ)であるカルボン酸に代謝的に加水分解される化合物であるが、これに限定されな
い。プロドラッグのさらなる例は酸基に結合される短いペプチド（ポリアミノ酸）であり得るが、このペプチドは代謝されて、活性部分を示す。適切なプロドラッグ誘導体の選択及び調製のための従来の手法は、例えば「Design of Prodrugs」（H. Bundgaard編, Elsevier, 1985）（これは、その全体において参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００１９】
「プロドラッグエステル」という用語は、生理学的条件下で加水分解される任意のいくつかのエステル形成基の付加により形成される本明細書中に開示された化合物の誘導体を指す。プロドラッグエステル基の例としては、ピボイルオキシメチル、アセトキシメチル、フタリジル、インダニル及びメトキシメチル、並びに当該技術分野で既知の他のこのような基、例えば（５−Ｒ−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基が挙げられる。プロドラッグエステル基の他の例は、例えばT. Higuchi及びV. Stella著「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975)、及び「Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application」, E.B. Roche編, Pergamon Press: New York, 14-21 (1987)（カルボキシル
基を含有する化合物のためのプロドラッグとして有用なエステルの例を提示）に見出され得る（上記の参考文献は各々、その全体において参照により本明細書中で援用される）。
【００２０】
本明細書中に開示される化合物の代謝産物としては、生物学的環境中への化合物の導入時に生成される活性種が挙げられる。
【００２１】
本明細書中に開示される化合物が少なくとも１つのキラル中心を有する場合、それらはラセミ化合物として、又はエナンチオマーとして存在し得る。このような異性体及びその混合物はすべて、本発明の範囲内に含まれる、ということに留意すべきである。さらに本明細書中に開示される化合物の結晶形態のいくつかは、多形体として存在し得る。このような多形体は、本発明の一実施形態に含まれる。さらに、本発明の化合物のいくつかは、水（即ち水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。このような溶媒和物は、本発明の一実施形態に含まれる。
【００２２】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、それが投与される生物体に対して有意の刺激を生じないし、その化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない化合物の塩を指す。いくつかの実施形態では、この塩は化合物の酸付加塩である。薬学的な塩は、化合物を無機酸、例えばハロゲン化水素酸（例えば塩酸又は臭化水素酸）、硫酸、硝酸、リン酸等と反応させることにより得ることができる。薬学的な塩は、化合物を有機酸、例えば脂肪族又は芳香族のカルボン酸又はスルホン酸（例えば酢酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸又はナフタレンスルホン酸）と反応させることによっても得ることができる。薬学的な塩は、化合物を塩基と反応させて、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩、有機塩基の塩、例えばジクロロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｃ1〜Ｃ7アルキルアミン、シクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミンの塩、並びにアミノ酸、例えばアルギニン、リジン等との塩等の塩を形成することによっても得ることができる。
【００２３】
薬学的処方物の製造が薬学的賦形剤と塩の形態での活性成分とを密接に混合することを包含する場合には、非塩基性、即ち酸性又は中性の賦形剤である薬学的賦形剤を用いるのが望ましい。
【００２４】
種々の実施形態において、本明細書中に開示される化合物は、単独で、本明細書中に開示される他の化合物と組合せて、或いは本明細書中に記載される治療領域における1つ又は
複数の他の薬剤と組合せて用いられ得る。
【００２５】
「ハロゲン原子」という用語は、本明細書中で用いる場合、元素の周期表の第７列の放射性安定原子のうちのいずれか１つ、例えばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味し、フッ素及び塩素が好ましい。
【００２６】
「エステル」という用語は、式−（Ｒ）n−ＣＯＯＲ’（式中、Ｒ及びＲ’は、独立して
、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（炭素環を介して結合される）及びヘテロ脂環式（炭素環を介して結合される）から成る群から独立して選択され、ｎは０又は１である）を有する化学的部分を指す。
【００２７】
「アミド」とは、式−（Ｒ）n−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’又は−（Ｒ）n−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（炭素環を介して結合される）及びヘテロ脂環式（炭素環を介して結合される）から成る群から選択され、ｎは０又は１である）を有する化学的部分である。アミドは、本発明の分子と結合し、それによりプロドラッグを形成するアミノ酸又はペプチド分子であり得る。
【００２８】
本発明の化合物上の任意のアミン、ヒドロキシ又はカルボキシル側鎖は、エステル化又はアミド化され得る。この目的を達成するために用いられるべき手法及び具体的な基は当業者に既知であり、Greene及びWuts著「Protective Groups in Organic Synthesis」,第３
版, John Wiley & Sons, New York, NY, 1999（これは参照にその全体においてより本明
細書中で援用される）のような参考文献出典に容易に見出され得る。
【００２９】
「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」という用語は、本明細書中で用いる場合、本発明の化合物が所定試料の質量の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％又は２０重量％、最も好ましくは少なくとも５０重量％又は７５重量％を含有するように、本発明の化合物が通常、それらの天然状態で会合される他の異なる化合物を含有していない、本明細書中に開示される化合物を指す。
【００３０】
使用方法
本明細書中に示される実施例により実証されるように、式（Ｉ）の化合物は、キモトリプシン様、トリプシン様及びカスパーゼ様プロテアソーム活性を阻害する。これに対してボルテゾミブは、キモトリプシン様プロテアソーム活性のみを阻害することが示されている（Goldberg, A.L. & Rock, K. (2002) Nat Med 8, 338-40及びAdams, J. (2004) Nat Rev
Cancer 4, 349-60を参照されたい）（これらは共に、全体において参照により本明細書
中で援用される）。式（Ｉ）の化合物は、ボルテゾミブとは異なる作用メカニズムを有することがさらに実証される。さらに、式（Ｉ）の化合物は、種々の多発性骨髄腫細胞株、例えばデキサメタゾン感受性ＭＭ．１Ｓ、デキサメタゾン耐性ＭＭ．１Ｒ、ＲＰＭＩ−８２２６、ＯＰＭ２、Ｕ２６６及びドキソルビシン耐性Ｄｏｘ−４０（これらに限定されない）においてアポトーシスを誘導する。式Ｉの化合物は、デキサメタゾン、ボルテゾミブ及びサリドマイドを用いた複数の従来の療法後に再発したヒト多発性骨髄腫から得られる細胞株におけるアポトーシスも誘導した。したがって式（Ｉ）の化合物は、他の化学療法剤、例えばデキサメタゾン、ドキソルビシン、ボルテゾミブ／ＰＳ−３４１及びサリドマイドに耐性であるＭＭ細胞に対して有効である。
【００３１】
したがって、一実施形態では、少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性になりやすい腫瘍性疾患の治療方法が提供され、これは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグエステルを患者、例えばヒトに投与することを包含する。「少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性」とは、患者への化学療法剤の投与が腫瘍性疾患の症候の有意な改善を生じないことを意味する。腫瘍性疾患が腫瘍により特性化されるいくつかの実施形態では、「少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性」とは、化学療法剤の投与が腫瘍の増殖の明らかな抑制又は腫瘍のサイズの低減を生じないことを意味する。「少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性」は、薬剤が耐性腫瘍細胞に曝露される場合、明らかなアポトーシスが誘導されないことも意味し得る。少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性に「なりやすい」とは、腫瘍性疾患が一般的に少なくとも１つの化学療法剤に対して耐性であるか、又は化学療法剤の反復投与時に耐性を発現することを意味する。
【００３２】
本明細書中の実施例は、式（Ｉ）の化合物が、ボルテゾミブと組合されると、ＭＭ細胞における相乗的アポトーシスを誘発することも実証する。したがって式（Ｉ）の化合物は、薬剤が別々に投与された場合よりも低用量の各薬剤を用いてアポトーシスを達成するためにボルテゾミブ／ＰＳ−３４１と組合せて投与され、それにより薬剤の毒性を低減し得る。驚くべきことに、これらの結果は、２つの異なるプロテアソーム阻害薬を投与することにより相乗的結果が得られることを実証する。「相乗的」とは、２つ以上の薬剤の組合せが１．０未満の組合せ指数（ＣＩ）を生じることを意味する。式（Ｉ）の化合物と非プロテアソーム阻害薬との組合せは相加的作用を与えることも実証された。「相加的」とは、２つ以上の薬剤の組合せが約１のＣＩを生じることを意味する。ＣＩは、例えば以下の方程式：ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２＋（Ｄ）１（Ｄ）２／（Ｄｘ
）１（Ｄｘ）２（式中、（Ｄ）１及び（Ｄ）２は、組合せて用いられる場合にｘ作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量であり；（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は単独で用いられる場合、同じｘ作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量である）に従ってチョウ・タラレイ（Chou-Talalay）法により、確定され得る。
【００３３】
したがって、一実施形態では、腫瘍性疾患を治療するための方法が提供され、これは２つ以上のプロテアソーム阻害薬を相乗的組合せで投与することを包含する。組合せられるプロテアソーム阻害薬の種類の非限定的な例としては、ペプチドボロネートプロテアソーム阻害薬、ペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害薬及び非ペプチドプロテアソーム阻害薬が挙げられる。ペプチドボロネートプロテアソーム阻害薬の非限定的な例は、ボルテゾミブである。ペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害薬の非限定的な例は、ＭＧ−１３２である。非ペプチドプロテアソーム阻害薬の非限定的な例としては、オムラリド及び式（Ｉ）の化合物が挙げられる。一実施形態では、プロテアソーム阻害薬の少なくとも１つは式（Ｉ）の化合物又はボルテゾミブである。「組合せ」投与とは、それらが実際に投与された時間又は方法に関係なく、２つ以上の薬剤が同時に患者の血流中に見出され得ることを意味する。一実施形態では、これらの薬剤を同時に投与する。このような一実施形態では、組合せ投与は、単一剤形で薬剤を組合せることにより成し遂げられる。別の実施形態では、薬剤は逐次的に投与される。一実施形態では、薬剤は、同一経路により、例えば経口的に投与される。別の実施形態では、薬剤は、異なる経路により投与され、例えば１つは経口的に、もう１つは静脈内に投与される。有益な一実施形態では、２つ以上の薬剤の薬物動態は実質的に同じである。
【００３４】
一実施形態では、腫瘍性疾患の治療方法が提供され、これは式（Ｉ）の化合物を別の化学療法剤と組合せて投与することを包含する。一実施形態では、他の化学療法剤はデキサメタゾン、ドキソルビシン又はサリドマイドである。一実施形態では、他の化学療法剤は、別のプロテアソーム阻害薬、例えばボルテゾミブである。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物を付加的化学療法剤と組合わせた薬学的組成物が提供される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、上記の方法のいずれかにより治療される腫瘍性疾患は、乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から選択される癌であり得る。一実施形態では、腫瘍性疾患は多発性骨髄腫である。
【００３６】
薬学的組成物
別の態様では、本発明の開示は、生理学的に許容可能な界面活性剤、担体、希釈剤、賦形剤、平滑化剤、懸濁剤、皮膜形成物質及びコーティング助剤或いはその組合せ；並びに本明細書中に開示される化合物又は組合せを含む薬学的組成物に関する。治療的使用のための許容可能な担体又は希釈剤は製薬業界で既知であり、そして、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」,第１８版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）に記載されている。防腐剤、安定剤、染料、甘味剤、芳香剤、香味料等が、薬学的組成物中に提供される。例えば安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、並びにｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルは、防腐剤として付加され得る。さらに、酸化防止剤及び懸濁剤が用いられ得る。種々の実施形態では、アルコール、エステル、硫酸化脂肪族アルコール等は界面活性剤として用いられ得る；スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶化セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸塩、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等は賦形剤として用いられ得る；ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等は平滑化剤として用いられ得る；ヤシ油、オリーブ油、ゴマ油、落花
生油、ダイズ油は、懸濁剤又は滑剤として用いられ得る；セルロース又は糖のような炭水化物の誘導体としての酢酸フタル酸セルロース、若しくはポリビニルの誘導体としてのメチルアセテート・メタクリレートコポリマーは、懸濁剤として用いられ得る；そして可塑剤、例えばフタル酸エステル等は懸濁剤として用いられ得る。
【００３７】
「薬学的組成物」という用語は、他の化学成分、例えば希釈剤又は担体と本明細書中に開示された化合物の混合物又はその化合物の組合せを指す。薬学的組成物は、生物体への化合物の投与を促す。化合物を投与する多数の技法、例えば経口、注射、エーロゾル、非経口及び局所的投与が当該技術分野に存在するが、これらに限定されない。薬学的組成物は、化合物を無機又は有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等と反応させることによっても得られる。
【００３８】
「担体」という用語は、細胞又は組織中への化合物の組み込みを促す化合物を定義する。例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞又は組織中への多数の有機化合物の取り込みを促すので、一般に利用される担体である。
【００３９】
「希釈剤」という用語は、対象の化合物を溶解し、化合物の生物学的に活性な形態を安定化する水中に希釈される化合物を定義する。緩衝溶液中に溶解される塩は、当該技術分野で希釈剤として利用される。一般に用いられる一緩衝溶液はヒト血液の塩状態を模倣するため、リン酸塩緩衝生理食塩水である。緩衝塩は低濃度で溶液のｐＨを制御し得るため、緩衝希釈剤は化合物の生物活性をめったに改質しない。
【００４０】
「生理学的に許容可能な」という用語は、化合物の生物活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を定義する。
【００４１】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、それ自体、又は適切な担体若しくは賦形剤（単数又は複数）と混合される薬学的組成物中で、ヒト患者に投与され得る。本出願の化合物の処方及び投与のための技法は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 Mack Publishing Co., Easton, PA,第１８版, 1990に見出され得る。
【００４２】
適切な投与経路としては、例えば経口、直腸、経粘膜、局所又は腸投与；非経口的送達、例えば筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射、並びにくも膜下腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻内又は眼内注射が挙げられる。化合物は、予定速度での長期及び／又は時限の、パルス投与のための、徐放性剤形、例えばデポー注射(depot injection)、浸透圧ポンプ、ピル、
経皮（電気輸送を含めた）パッチ等でも投与され得る。
【００４３】
本発明の薬学的組成物は、それ自体既知である様式、例えば従来の混合、溶解、造粒、ドラジェ製法、水簸、乳化、被包、封入又は錠剤法で製造され得る。
【００４４】
したがって本発明に従って用いるための薬学的組成物は、薬学的に用いられ得る製剤への活性化合物の加工処理を促す賦形剤及び助剤を含む1つ又は複数の生理学的に許容可能な
担体を用いて、従来の様式で処方され得る。適切な処方物は、選択される投与経路によって決定する。任意の既知の技法、担体及び賦形剤は、当該技術分野で、例えば上記のRemington's Pharmaceutical Sciencesにおいて適切に、且つ理解されるように用いられ得る
。
【００４５】
注射剤は、従来の形態で、注射前に液体中の溶液又は懸濁液に適した固体形態で液体溶液若しくは懸濁液として、又は乳濁液として調製され得る。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタ
ミン酸ナトリウム、塩酸システイン等である。さらに、所望により、注射可能な薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ緩衝剤等を含有し得る。生理学的適合性緩衝液としては、ハンクス溶液、リンガー溶液又は生理食塩緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。所望により、吸収増強調製物（例えばリポソーム）が利用され得る。
【００４６】
経粘膜投与のためには、浸透されるべきバリアに適した浸透剤が処方物中に用いられ得る。
【００４７】
例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒若しくはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、又は他の有機油、例えばダイズ油、グレープフルーツ油若しくはアーモンド油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエート又はトリグリセリド、若しくはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含有し得る。懸濁液は、適切な安定剤、又は高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増大する薬剤も適宜含有し得る。注射用の処方物は、単位剤形で、例えばアンプル中で、又は多用量容器中で、付加的防腐剤と共に存在し得る。組成物は、油状ビヒクル又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液のような形態を取り得て、処方剤、例えば懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤を含有し得る。代替的には活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質無含有滅菌水との構成のために粉末形態であり得る。
【００４８】
経口投与のためには、活性化合物を当該技術分野で既知の薬学的に許容可能な担体と組合せることにより、化合物は容易に処方され得る。このような担体は、治療されるべき患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。経口使用のための薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、任意にその結果生じる混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物を加工処理し、所望により適切な助剤を付加した後、錠剤又はドラジェコアを得ることにより生成され得る。適切な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖（例えばラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトール）；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが付加され得る。ドラジェコアは、適切なコーティングを備えている。この目的のために、濃縮糖溶液が用いられ、これは任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有し得る。染料又は顔料は、同定のために、又は活性化合物用量の異なる組合せを特性化するために、錠剤又はドラジェコーティングに付加され得る。この目的のために、濃縮糖溶液が用いられ、これは、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有し得る。染料又は顔料は、同定のために、又は活性化合物用量の異なる組合せを特性化するために、錠剤又はドラジェコーティングに付加され得る。
【００４９】
経口的に用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチン製のプッシュ・フィットカプセル、並びにゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールから作られる軟質密閉カプセルが挙げられる。プッシュ・フィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムのような滑剤、
及び任意に安定剤との混合物中に活性成分を含有し得る。軟質カプセル中では、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコール中に溶解されるか、又は懸濁され得る。さらに、安定剤が付加され得る。経口投与のための処方物はすべて、このような投与に適した投与量であるべきである。
【００５０】
頬側投与のためには、組成物は、従来の形態で処方される錠剤又はロゼンジの形態を取り得る。
【００５１】
吸入による投与のために、本発明に従って用いる化合物は、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザーからのエーロゾル噴霧供給(presentation)の形態で簡便に送達される。加圧エーロゾルの場合、投与量単位は、計測量を送達するための弁を提供することにより確定され得る。化合物及び適切な粉末基剤、例えばラクトース又はデンプンの混合粉末を含有する、例えば吸入器又は通気器に用いるためのゼラチンのカプセル及びカートリッジが処方され得る。
【００５２】
眼内、鼻内及び耳内送達を含む使用のための製薬業界で既知の種々の薬学的組成物が、さらに本明細書中に開示される。これらの使用のための適切な浸透剤は、当該技術分野で一般的に既知である。眼内送達のための薬学的組成物としては、水溶性形態での、例えば点眼薬中の、又はジェランガム（Shedden他, Clin. Ther., 23(3): 440-50 (2001)）又はヒドロゲル（Mayer他, Ophthalmologica, 210(2): 101-3 (1996)）中の活性化合物の点眼水溶液；眼軟膏；眼懸濁液、例えば液体担体媒質中に懸濁されるマイクロ粒子、薬剤含有低ポリマー粒子（Joshi, A., J. Ocul. Pharmacol., 10(1): 29-45 (1994)）、脂質溶解性
処方物（Alm他, Prog. Clin. Biol. Res., 312: 447-58 (1989)）、及びマイクロスフェ
ア（Mordenti, Toxicol. Sci., 52(1): 101-6 (1999)）；並びに眼球挿入物が挙げられる（上記の参考文献はすべて、その全体において参照により本明細書中で援用される）。このような適切な薬学的処方物は、最も頻繁に、且つ好ましくは安定性及び快適性のために滅菌性で、等張性でありそして緩衝化されるよう処方される。鼻内送達のための薬学的組成物は、正常繊毛作用の維持を保証するために多くの点で鼻分泌物をシミュレートするようにしばしば調製される液滴及び噴霧剤も含み得る。Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１８版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)（これはその全体において参
照により本明細書中で援用される）に開示されたように、そして当業者に既知であるように、適切な処方物は最も頻繁に、及び好ましくは等張性で、５．５〜６．５のｐＨを維持するためにわずかに緩衝化され、そして最も頻繁で、且つ好ましくは、抗細菌性防腐剤及び適切な薬剤安定剤を含む。耳内送達のための薬学的処方物としては、耳における局所的適用のための懸濁剤及び軟膏が挙げられる。このような耳用処方物に一般的な溶媒としては、グリセリン及び水が挙げられる。
【００５３】
化合物は、例えば従来の座薬基剤（例えばココアバター又は他のグリセリド）を含有する座薬又は保留浣腸等の直腸用組成物中にも処方され得る。
【００５４】
前記の処方物に加えて、化合物は、デポー製剤としても処方され得る。このような長期作用処方物は、埋込み（例えば皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与され得る。したがって、例えば化合物は、適切な高分子物質若しくは疎水性物質（例えば許容可能な油中の乳濁液として）、又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、処方され得る。
【００５５】
疎水性化合物に関しては、適切な薬学的担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー及び水相を含む共溶媒系であり得る。用いられる一般的な共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であって、これは、無水エタノール中の容量に取り入れられる３％ｗ
／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標）及び６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の溶液である。当然の帰結として、共溶媒系の割合は、その溶解度及び毒性特質を破壊することなくかなり変化し得る。さらに、共溶媒構成成分の同一性は変更され得る：例えば他の低毒性非極性界面活性剤が、ポリソルベート８０（商標）の代わりに用いられ得る；ポリエチレングリコールの画分サイズは、変化し得る；他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンが、ポリエチレングリコールに取って代わり得る；そして他の糖又は多糖がデキストロースの代わりになり得る。
【００５６】
代替的には、疎水性薬学的化合物のための他の送達系が用いられ得る。リポソーム及び乳濁液は、疎水性薬剤のための送達ビヒクル又は担体の既知の例である。特定の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドも用いられ得るが、通常はより大きな毒性という犠牲を払う。さらに、化合物は、徐放系、例えば治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを用いて送達され得る。種々の徐放性物質が確立されており、これは当業者に既知である。徐放性カプセルは、それらの化学的性質によって、数週間から１００日を超えるまでの間、化合物を放出し得る。治療用試薬の化学的性質及び生物学的安定性によって、タンパク質安定化のための付加的戦略が用いられ得る。
【００５７】
細胞内に投与されるように意図される薬剤は、当業者に既知の技法を用いて投与され得る。例えばこのような薬剤は、リポソーム中に被包され得る。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在する分子はすべて、水溶液内部に組み入れられる。リポソーム内容物は、外部ミクロ環境から保護され、そしてリポソームが細胞膜と融合するため、細胞質中に効率的に送達される。リポソームは、組織特異的抗体で被覆され得る。リポソームは、所望の器官により選択的に標的化され、取り込まれる。代替的には疎水性有機低分子は、細胞内に直接投与され得る。
【００５８】
付加的治療薬又は診断薬が、薬学的組成物中に組み入れられる。代替的に又は付加的に、薬学的組成物は、他の治療薬又は診断薬を含有する他の組成物と組合され得る。
【００５９】
投与方法
化合物又は薬学的組成物は、任意の適切な手段により患者に投与され得る。投与方法の非限定的な例としては、とりわけ、（ａ）経口経路による投与、この投与としてはカプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップ又は他のこのような形態での投与が挙げられる；（ｂ）非経口経路、例えば直腸、膣、尿道内、眼球内、鼻内又は耳内による投与、この投与としては水性懸濁液、油状調製物等として、又はドリップ、スプレー、座薬、サルブ(salve)、軟膏等としての投与が挙げられる；（ｃ）注射による皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内
、皮内、眼窩内、きょう膜内、脊髄内、胸骨内等、例えば注入ポンプ送達による投与；（ｄ）局在的、例えば腎臓又は心臓域での直接的注射による、例えばデポー剤埋込みによる投与；並びに（ｅ）局所的投与、本発明の化合物を生存組織と接触させるのに適していると当業者に思われるようなもの、が挙げられる。
【００６０】
投与に適した薬学的組成物としては、その意図される目的を達成するのに有効な量で活性成分が含有される組成物が挙げられる。単回用量として必要とされる本明細書中に開示される化合物の治療的に有効な量は、投与経路、治療中の動物の種類、例えばヒト、及び考慮中の特定動物の身体的特質によって決まる。用量は所望の作用を達成するよう調整され得るが、体重、食餌、併用薬のような因子、及び医薬業界の当業者が認識するその他の因子によって決まる。さらに具体的には、治療的に有効な量は、疾患の症候を予防、軽減、若しくは改善するのに、又は治療中の被験者を延命させるのに有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の確定は、特に本明細書中に提示される詳細な開示の点から見て、十分に当業者の能力内である。
【００６１】
当業者に容易に明らかであるように、投与されるべき有用なｉｎ ｖｉｖｏ投与量並びに
特定の投与方式は、治療される哺乳類の年齢、体重及び種類、用いられる特定化合物、並びにこれらの化合物が用いられる特定用途によって変わる。有効投与量レベル、即ち所望の結果を達成するのに必要な投与量レベルの確定は、決められた薬理学的方法を用いて、当業者により成し遂げられ得る。一般的には、製品のヒト臨床適用は低投与量レベルで開始され、投与量レベルは所望の作用が達成されるまで増大される。代替的には、確立された薬理学的方法を用いて本発明の方法により同定される組成物の有用な用量及び投与経路を確立するために、許容可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が用いられ得る。
【００６２】
非ヒト動物試験では、可能性のある製品の適用は、より高い投与量レベルで開始され、投与量は所望の作用がもはや達成されないか、又は副作用が消失するまで低減される。投与量は、所望の影響及び治療指標によって、広範に変動し得る。一般的には、投与量は、約１０μｇ／体重１ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。代替的には投与量は、当業者に理解されるように、患者の体表面積に基づいて算定され得る。
【００６３】
本発明の薬学的組成物の正確な処方、投与経路及び投与量は、患者の症状を考慮して、個々の医者により選択され得る（例えばFingl他(1975)著「The Pharmacological Basis of Therapeutics」を参照されたい）（これは、その全体において参照により、特に第１章１ページを参照することにより、本明細書中で援用される）。一般的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、約０．５〜１０００ｍｇ／患者の体重１ｋｇであり得る。投与は、患者に必要とされる場合、単一回であるか、又は１日若しくはそれ以上の日数の間に投与される一続きの２回以上の投与であり得る。化合物のヒト投与量が少なくともいくつかの症状に関して確立された場合、本発明は、確立されたヒト投与量と同じ投与量、又はその約０．１％〜５００％、さらに好ましくは約２５％〜２５０％である投与量を用いる。新たに発見された薬学的化合物の場合のように、ヒト投与量が確立されない場合、適切なヒト投与量はＥＤ50値若しくはＩＤ50値、又は動物における毒性試験及び有効性試験により制限されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ試験から得られる他の適切な値から推測され得る。
【００６４】
担当医は、毒性又は器官機能不全のために投与を終結、中断又は調整する方法及び時機を知っていることに留意すべきである。逆に言えば、臨床応答が適切でなかった場合、より高いレベルに治療を調整する（毒性を取り除く）ことも、担当医は知っている。対象の疾病の管理において投与される用量の大きさは、治療されるべき症状の重症度によって、そして投与経路に合わせて変わる。例えば症状の重症度は、一部は、標準的な予後評価法により評価され得る。さらに、用量、そしておそらくは投与頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答によって変わる。上記のものに相当するプログラムが、獣医学で用いられ得る。
【００６５】
的確な投与量は薬剤毎に確定されるが、多くの場合、投与量に関する多少の普遍化がなされ得る。成人患者に関する１日の投与量レジメンは、例えば０．１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば５〜２００ｍｇの各活性成分の経口用量であり得る。他の実施形態では、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜６０ｍｇ、例えば１〜４０ｍｇの各活性成分の静脈内、皮下又は筋肉内用量が用いられる。薬学的に許容可能な塩の投与の場合、投与量は遊離塩基として算定され得る。いくつかの実施形態では、組成物は１〜４回／日投与される。代替的には本発明の組成物は、好ましくは１０００ｍｇ／日までの各活性成分の用量で、連続静脈内注入により投与され得る。当業者により理解されるように、特定の状況では、特に侵攻性の疾患又は感染を効果的に且つ積極的に治療するために、上記の好ましい投与量範囲を超えるか、又ははるかに超える量で、
本明細書中に開示される化合物を投与する必要があり得る。いくつかの実施形態では、化合物は、連続治療期間、例えば１週間以上、又は数ヶ月若しくは数年間、投与される。
【００６６】
投与量及び投与間隔は、独立して調整されて、調節作用又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な血漿レベルの活性部分を提供し得る。ＭＥＣは各化合物で変わるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから概算され得る。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体
の特質及び投与経路によって変わる。しかしながらＨＰＬＣ検定又はバイオアッセイを用いて、血漿濃度を確定し得る。
【００６７】
投与間隔は、ＭＥＣ値を用いても確定され得る。組成物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の間、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持するレジメンを用いて投与されるべきである。
【００６８】
局在投与又は選択的取込みの場合、薬剤の有効局在濃度は、血漿濃度と関連しなくてもよい。
【００６９】
投与される組成物の量は、もちろん、治療中の被験者、被験者の体重、罹患重症度、投与様式並びに処方医の判断によって決まる。
【００７０】
本明細書中に開示される化合物は、既知の方法を用いて、有効性及び毒性に関して評価され得る。例えば特定の化合物、又は特定の化学的部分を共有するその化合物のサブセットの毒物学は、細胞株、例えば哺乳類、好ましくはヒト細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒
性を確定することにより確立され得る。このような試験の結果により、動物、例えば哺乳類、さらに具体的にはヒトにおける毒性をしばしば予測できる。代替的には動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ又はサルにおける特定の化合物の毒性は、既知の方法を用いて確定され得る。特定化合物の有効性は、いくつかの認識された方法、例えばｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ方法、動物モデル又はヒト臨床試験を用いて確立され得る。認識されたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏモデルは、ほとんどすべてのクラスの症状、例えば癌、心臓血管性疾患及び種々の免疫不全（これらに限定されない）に存在する。同様に、許容可能な動物モデルは、このような症状を治療するための化学物質の有効性を確立するために用いられ得る。有効性を確定するためにモデルを選択する場合、適切なモデル、投与量及び投与経路、並びにレジメンを選択するように最先端の技術により当業者は指導され得る。もちろん、ヒト臨床試験も、ヒトにおける化合物の有効性を確定するために用いられ得る。
【００７１】
組成物は、所望により、活性成分を含有する1つ又は複数の単位剤形を含有し得るパック
又はディスペンサー装置中に提供され得る。このパックは、例えば金属又はプラスチック箔（例えばブリスター包装）を含み得る。パック又はディスペンサー装置は、投与のための取扱説明書を添付し得る。パック又はディスペンサー装置は、薬剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定される形態で容器に関連する表示も添付され得るが、この表示は、ヒト投与又は動物投与のための薬剤の形態についての政府機関による承認を反映する。例えばこのような表示は、処方薬剤に関して米国食品医薬品局により認可された標識付け、又は認可製品挿入物であり得る。適合性の薬学的担体で処方した本発明の化合物を含む組成物も調製し、適切な容器に入れて、指示症状の治療のために標識付けし得る。
【実施例１】
【００７２】
一般手法
細胞培養及び試薬
Ｄｅｘ感受性ＭＭ．１Ｓ及びＤｅｘ耐性ＭＭ．１ＲヒトＭＭ細胞株を、Steven Rosen博士（Northwestern University, Chicago, IL）から入手した（Moalli, P.A., Pillay, S.,
Weiner, D., Leikin, R. & Rosen, S.T. (1992) Blood 79, 213-22及びChauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson,
P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002)
Blood 100, 2187-94参照）（これらは共に、その全体において参照により本明細書中で
援用される）。ＲＰＭＩ−８２２６及びドキソルビシン（Ｄｏｘ）耐性（Ｄｏｘ−４０）細胞を、William Dalton博士（Moffit Cancer Center, Tampa, FL）から入手した。Ｕ２
６６及びＯＰＭ２ ＭＭ細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Rockville, MD）から入手した。ヒト腫瘍細胞株ＤＵ１４５、ＨＴ−２９、ジャーカット、ＬｏＶｏ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＯＶＣＡＲ
−３、ＰＡＮＣ−１及びＰＣ−３は、ATCC（Manassas, VA）から購入した。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、ＭＭ細胞株を増殖させた。複数回の以前の療法、例えばデキサメタゾン（Ｄｅｘ）、メルファラン、サリドマイド又はボルテゾミブ後に再発している患者から、ＭＭ細胞を新たに単離した。ＣＤ１３８（シンデカン−１）マイクロビーズ及び自動ＭＡＣＳ磁気細胞選別機（Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA）を用いて、ＣＤ１３８陽性選択法により、患者の骨髄試料からＭＭ細胞を精製した（Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002) Blood 100, 2187-94参照）（これはそ
の全体において参照により本明細書中で援用される）。正常ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−２７ｓｋをATCCから入手して、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｍＭのＬ−グルタミン及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。種々の濃度の式ＩＩ（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（Nereus Pharmaceuticals, Inc, San Diego, CA）、ボルテゾミブ又はＤｅｘ（Sigma Chemical Co, St. Louis, MO）で細胞を処理した。
【００７３】
細胞生存度及びアポトーシス検定
製造業者の取扱説明書（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）に従って、及びChauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002) Blood 100, 2187-94（これはその全体において参照により本明細
書中で援用される）に記載されているように、臭化３−（４，５−ジメチルチオゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ；Chemicon International Inc., Temecula, CA）検定により、細胞生存度を評価した。細胞死の検出ＥＬＩＳＡｐｌｕ
ｓを利用して、製造業者の取扱説明書（Roch Applied Sciences, Indianapolis, IN）に
従って、細胞死を定量した。
【実施例２】
【００７４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ２０Ｓプロテアソーム活性検定
Stein, R.L., Melandri, F. & Dick, L. (1996) Biochemistry 35, 3899-908及びLightcap, E.S., McCormack, T.A., Pien, C.S., Chau, V., Adams, J. & Elliott, P.J. (2000)
Clin Chem 46, 673-83（これらは共にその全体において参照により本明細書中で援用さ
れる）に記載されているように、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を測定した。精製したヒト赤血球由来の２０Ｓプロテアソームを、Biomol, Plymouth Meeting, PAから入手した。それぞれペプチド基質としてＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ（Boston Biochem, Cambridge, MA）及びＢｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ（Bachem Bioscience, King of Prussia, PA）を用いて、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性、
カスパーゼ様活性及びトリプシン様活性を測定した。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎ
ｔ９６ウェルマイクロプレートリーダー（Thermo Electron, Waltham, MA）を用いて、切断ペプチド基質の蛍光を測定した。Ｓ字形用量応答可変勾配モデルを用いて、プリズム（
GraphPad Software）により、ＥＣ50値を算定した。最大相対蛍光の５０％が阻害される
薬剤濃度としてＥＣ50値を定義した。結果（図１にプロットした）は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物が異なる濃度ではあるが、３つのプロテアソーム活性すべてを阻害することを示した。
【実施例３】
【００７５】
マウス（単回の静脈内投与又は経口投与）における全血液細胞中のｅｘ ｖｉｖｏ２０Ｓ
プロテアソーム活性の分析
式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がｉｎ ｖｉｖｏでプロテアソーム活性を阻害するか否
かを直接的に確定するために、１００％ＤＭＳＯ中に式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物を溶解し、５％ソルトール（ソルトール（登録商標）ＨＳ１５；ポリエチレングリコール６６０ １２−ヒドロキシステアレート、BASF、Shreveport, LA）中に順次希釈して、２％
ＤＭＳＯという最終濃度を生じた。対照ビヒクルは、２％ＤＭＳＯ及び９８％（５％ソルトール（登録商標）ＨＳ１５）で構成された。１０ｍＬ／ｋｇの容量で静脈内に又は経口的に種々の濃度の化合物を用いて、Bolder BioPATH, Inc. （Boulder, CO）で、雄Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（５匹／群、体重２０〜２５ｇ）を処理した。１群の動物は、プロテアソーム活性のベースラインを確立するために、未処理であった。化合物投与の９０分後に、動物を麻酔し、心臓穿刺により血液を抜き取った。パックした全血液細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳで洗浄し、ｅｘ ｖｉｖｏプロテアソーム活性の測定のた
めにドライアイス上で凍結した。ペプチド基質ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを用いて、白血球（ＷＢＣ）溶解物中の２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を測定した。細胞溶解物のタンパク質濃度を用いて、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を正常化した。個々のマウスの２０Ｓプロテアソーム活性を、平均活性を表す水平バーを用いて、図２に示す。ベースラインは、未処理マウスから調製されたＷＢＣ溶解物中で観察された２０Ｓプロテアソーム活性を表す。結果（図２に図示）は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物が、用量依存的に白血球中の２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害することを示す。重要なことに、これらの発見により、化合物が経口的に活性で、ｉｎ ｖｉｖｏでプロテアソ
ーム活性を阻害することが確立された。
【実施例４】
【００７６】
ＭＭ細胞におけるプロテアソーム活性の変化誘発の測定（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏで多発性骨髄腫細胞中のプロテアソ
ーム活性に影響を及ぼすか否かの確定を、ＡｄａＹ125Ｉａｈｘ3Ｌ3ＶＳとの競合実験を
用いて実行した。この検定では、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により標的化されない部位は、ＡｄａＹ（125Ｉ）Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳにより標識化され、オートラジオグラフィー
により可視化されるが、一方、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により標的化される部位はオートラジオグラムでは観察され得ない。ＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃ
ｌ）（７ｎＭ）の化合物と共に、３０分間、１時間、３時間又は６時間インキュベートし、細胞溶解をガラスビーズを用いて実施した。タンパク質抽出物６０μｇをヨウ化プロテアソーム阻害薬ＡｄａＹ125Ｉａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共に３７℃で２時間インキュベートした
。次に、還元試料緩衝液中で煮沸することによりタンパク質を変性させ、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した後、オートラジオグラフィーを行った。図３で示され得るように、プロテアソームのベータ−５（β−５）サブユニットは、対照細胞より処理細胞中で顕著に低くＡｄａＹ（125Ｉ）Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳにより標識化される。β−５サブユニ
ットがキモトリプシン様活性を媒介するので、これらの結果は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がβ−５サブユニットと結合し、それによりＭＭ．１Ｓ細胞中のキモトリプシン様活性を阻害することを示唆する。さらに化合物（７ｎＭ）によるＭＭ．１Ｓ細胞の６時間の処理は、β−２サブユニット（トリプシン活性）及びβ−１サブユニット（カスパーゼ様活性）の標識化も低減させた（データは示されていない）。
【実施例５】
【００７７】
ＭＭ細胞におけるプロテアソーム活性の変化誘発の測定（ｉｎ ｖｉｖｏ）
すべての活性プロテアソームサブユニットを共有結合的に修飾するダンシル−Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳを伴う競合実験を用いて、プロテアソーム活性のｉｎ ｖｉｖｏ測定を実行した。こ
の阻害薬は、ダンシル部分に対する抗体を用いて免疫ブロット法により可視化され得るダンシルスルホンアミドヘキサノイルハプテンを含有する。ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）（７ｎＭ）の化合物で、３０分間、１時間又は３時間処理し、その後、５μＭダンシル−Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共に３７℃で１時間インキュベートした。それらをＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０）中で３０分間インキュベートすることにより、細胞を溶解し、その後、５分間遠心分離して、膜画分、核及び細胞残屑を除去した。タンパク質抽出物６０μｇを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、その後、ポリクローナル抗ダンシルポリクローナル抗体（１：７５００、ウサギ、Molecular Probes）及びホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Southern Biotech）を用いて免疫ブロット分析した。増感化学発光（Western Lightning, Perkin-Elmer）により、ブロットを展開した。
図４で見られ得るように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物によるＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、β−５サブユニットのダンシルＡｈｘ3Ｌ3ＶＳ標識化を低減する。さらに、この化合物は、より高濃度（それぞれ１ｎＭ及び２０ｎＭ）ではあるが、β−１サブユニット及びβ−２サブユニットのダンシルＡｈｘ3Ｌ3ＶＳ標識も低減する。これに対して、より高用量のボルテゾミブによるＭＭ．１Ｓの処理は、β−２サブユニットを抑制しない（データは示されていない）。総合すると、これらの発見は、ＭＭ細胞中での３つのプロテアソーム活性すべてを阻害する式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の能力を実証する。
【実施例６】
【００７８】
ＭＭ細胞生存度に及ぼす作用
製造業者の取扱説明書（Roch Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）に従って、
そしてChauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. &
Anderson, K.C. (2002) Blood 100, 2187-94に記載されているように（これらはその全
体において参照により本明細書中で援用される）、臭化３−（４，５−ジメチルチオゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ；Chemicon International
Inc., Temecula, CA）検定により、細胞生存度を評価した。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の
化合物による２４時間のＭＭ．１Ｓ（−■−）、Ｄｅｘ耐性ＭＭ．１Ｒ（−□−）、ＲＰＭＩ−８２２６（−●−）、ドキソルビシン耐性Ｄｏｘ−４０（−◆−）、ＯＰＭ２（−○−）及びＵ２６６（−◇−）細胞の処理後の細胞生存度を図５Ａに示す。結果は、３つの個々の実験からの平均±ＳＤである（Ｐ＜０．００５；すべての細胞株に関してｎ＝３）。すべての細胞株における細胞生存度の用量依存性の有意の低減が観察された（ＩＣ50範囲７〜２４ｎＭ）。
【００７９】
精製した患者ＭＭ細胞に関しても、細胞生存度を評価した。Ｄｅｘ、ボルテゾミブ及びサリドマイドを含めた複数の従来療法後に再発している９人のＭＭ患者から新たに単離された腫瘍細胞を、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（１０ｎＭ）で２４時間処理し、アポトーシスに関して分析した。図５Ｂに示すように、ＤＮＡ断片化検定により測定されるような有意のアポトーシスをこれらの細胞において観察した（Ｐ＜０．００５；ｎ＝２）。プロット値は、三重反復実験試料の平均±ＳＤである。重要なことに、実験した患者９人のうち４人はボルテゾミブ療法に対して難治性であり、５人はサリドマイド及びＤｅｘ療法に対して耐性であった。これらのデータは、１）式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は従来の治療及びボルテゾミブ療法に感受性及び耐性のＭＭ細胞においてアポトーシスを誘導し；そして２）ＭＭ細胞に関する化合物のＩＣ50はナノモル濃度内であることを示唆する。
【実施例７】
【００８０】
骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）生存度に及ぼす作用
ＭＭ細胞は主として骨髄微小環境中に局在し、ＢＭＳＣとのそれらの相互作用はＭＭ細胞の増殖を媒介し、且つ薬剤誘導性アポトーシスに対して防御するサイトカインの産生を誘導する（Anderson, K.C. (2003) Cancer 97, 796-801（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって５人の患者ＭＭ由来のＢＭＳＣに及ぼす式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の作用を確定した。図６に示すように、ＤＮＡ断片化検定により立証されるようなこれらの細胞におけるアポトーシスを、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（２０ｎＭ）による２４時間のＢＭＳＣ（患者番号１〜５）の処理は誘導しない。示した陽性対照は、検定に関する内部対照である。５人のＭＭ患者のうちの２人から精製したＭＭ細胞（ＣＤ１３８＋）も同じ実験内で調べた。結果は、三重反復実験試料からの平均±ＳＤである。化合物は、精製（ＣＤ１３８陽性）患者ＭＭ細胞のアポトーシスの有意の（１０〜１２倍）増大を誘発した。これらの結果は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がＭＭ細胞に直接的に作用するが、ＢＭＳＣには直接的に作用しないことを示唆する。
【実施例８】
【００８１】
組換えヒトインターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６）及び組換えヒトインスリン様成長因子−Ｉ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）抗アポトーシス薬の作用
ＢＭＳＣへのＭＭ細胞の付着は、ＢＭＳＣからのＩＬ−６及びＩＧＦ−Ｉ分泌を誘導し、これはＭＭ細胞の増殖を調節するだけでなく、化学療法に対して防御する（Hardin, J., MacLeod, S., Grigorieva, I., Chang, R., Barlogie, B., Xiao, H. & Epstein, J. (1994) Blood 84, 3063-70及びChauhan, D., Kharbanda, S., Ogata, A., Urashima, M., Teoh, G., Robertson, M., Kufe, D.W. & Anderson, K.C. (1997) Blood 89, 227-234（こ
れらは共にその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって、ｒｈＩＬ−６又はｒｈＩＧＦ−Ｉが式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘導されるＭＭ細胞におけるアポトーシスを抑制するか否かを評価した。ｒｈＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）又はｒｈＩＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）又はＤｅｘ（０．５μＭ）で２４時間、ＭＭ．１Ｓ細胞を処理した。２４時間目に細胞を回収し、ＭＴＴ検定により生存度を分析した。図７に示すように、平均細胞生存度は、化合物単独での処理後では４７±２．３％；化合物＋ｒｈＩＬ−６では５１．２±３．２％（Ｐ＝０．２６、ウィルコクソン試験）及び化合物＋ｒｈＩＧＦ−Ｉでは５０．３％±２．０％（Ｐ＝０．２８）であった。平均生存度は、Ｄｅｘでの処理後で５１±２．１％、Ｄｅｘ＋ｒｈＩＬ−６に関しては９２±５．５％（Ｐ＝０．０５、片側ウィルコクソン順位和試験により測定した場合）であった。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである。これらの発見は、ＩＬ−６もＩＧＦ−Ｉも式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の抗ＭＭ活性を阻害しないことを示唆する。これに対して、他の試験では、ＩＬ−６及びＩＧＦ−Ｉは共にＤｅｘ誘導性低減化ＭＭ．１Ｓ細胞生存度を阻害する（Chauhan, D., Hideshima, T. & Anderson, K.C. (2003) Int J Hematol 78, 114-20及びMitsiades, C.S., Mitsiades, N., Poulaki, V., Schlossman, R., Akiyama, M., Chauhan, D., Hideshima, T., Treon, S.P., Munshi, N.C., Richardson, P.G. & Anderson, K.C. (2002) Oncogene 21, 5673-83（これらは共にその全体において参照により本明細書中で援
用される）参照）。したがって、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、ＭＭ細胞に及ぼすＩＬ−６及びＩＧＦ−Ｉの増殖及び防御作用を克服し、ＭＭ細胞に対するこの化合物及びＤｅｘに関して異なる作用メカニズムを示すことをデータは示唆する。高血清レベルのＩＬ−６は、ＩＬ−６又はＩＧＦ−Ｉの存在下でさえＭＭ細胞アポトーシスを誘導する、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の能力と結びつけられる臨床的化学耐性及び治療の失敗をもたらすという報告は、この化合物が進行型ＭＭを有する患者における薬剤耐性を克服し得ることを示唆する（Kyrstsonis, M.C., Dedoussis, G., Baxevanis, C., Stamatelou, M. & Maniatis, A. (1996) Br J Haematol 92, 420-422（これはその全体において参照に
より本明細書中で援用される）参照）。
【実施例９】
【００８２】
ＭＭ細胞の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導性移動に及ぼす影響
ＶＥＧＦは骨髄微小環境中で増大され、ＭＭ細胞における移動、増殖及び新血管形成を誘発する（Podar, K., Tai, Y.T., Lin, B.K., Narsimhan, R.P., Sattler, M., Kijima, T., Salgia, R., Gupta, D., Chauhan, D. & Anderson, K.C. (2002) J Biol Chem 277, 7875-81（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がＭＭ細胞のＶＥＧＦ誘導性移動を変えるか否かを評価した。この化合物（７又は１０ｎＭ）の存在下又は非存在下で、ＶＥＧＦ誘導性移動を実験した。Podar, K., Tai, Y.T., Davies, F.E., Lentzsch, S., Sattler, M., Hideshima, T., Lin, B.K., Gupta, D., Shima, Y., Chauhan, D., Mitsiades, C., Raje, N., Richardson, P. & Anderson, K.C. (2001) Blood 98, 428-35（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）でこれまでに記載されるように細胞移動を検定した。図８に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、ＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞のＶＥＧ
Ｆ誘導性移動を有意に（Ｐ＜０．０５）低減させる。これらの発見は、この化合物が、骨髄へのＭＭ細胞の回帰(horming)及び末梢血中へのそれらの放出(egress)の両方を負に調
節し得ることを示す。
【実施例１０】
【００８３】
Ｂｃｌ２媒介性防御作用に及ぼす影響
Ｂｃｌ２は、癌細胞、例えばＭＭにおいて従来の治療に対する耐性を付与する（Cory, S.
& Adams, J.M. (2002) Nat Rev Cancer 2, 647-56及びGazitt, Y., Fey, V., Thomas, C. & Alvarez, R. (1998) Int J Oncol 13, 397-405（これらはその全体において共に参照により本明細書中で援用される）参照）。Ｂｃｌ２は、ボルテゾミブ誘導性アポトーシスを適度に減衰し得る。したがってＭＭ．１Ｓ細胞のＢｃｌ２の異所性発現が式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物に対する応答性に影響を及ぼすか否かを評価した。ＭＭ．１Ｓ細胞を安定的にＢｃｌ２構築物でトランスフェクトして、ＭＴＴ検定を用いて細胞生存度の変化に関して分析した。図９に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、用量依存的に、Ｂｃｌ２トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞の細胞生存度を有意に低減する（Ｐ＜０．００５）。それにもかかわらず、この化合物は、エンプティーベクター(empty vector
：空ベクター)トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞と比較して、１５±１．１％低いＢｃ
ｌ２トランスフェクト化細胞の細胞死を誘導した。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである。これらの発見は、この化合物がＢｃｌ２媒介性防御を克服し得ることを示唆する。
【実施例１１】
【００８４】
マウス腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏ評価
６週齢の三重免疫欠損ベージュ・ヌード・ｘｉｄ（ＢＮＸ）マウスを、Frederick Cancer
Research and Development Center （Frederick, MD）から入手した。動物試験はすべて、Animal Ethics Committee of the Dana-Farber Cancer Instituteにより認可されたプ
ロトコルに従って実行した。毒性の徴候に関して、マウスを毎日観察した。イソフロウラン（isoflourane）吸入を用いて麻酔下で末端放血を実行し、ＣＯ2窒息により動物を屠殺した。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物のｉｎ ｖｉｖｏ抗ＭＭ活性を測定するために、
２１匹のＢＮＸマウスに、ＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｌ中の３×１０7個のＲＰＭ
Ｉ８２２６ＭＭ細胞を側腹部に皮下接種した。腫瘍が測定可能になったら、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）を摂取する処理群又はビヒクルのみを摂取する対照群（ｎ＝７）にマウスを割り当てた。測定可能腫瘍の発現後に、薬剤処理を開始した。薬剤（０．２５ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）を、週２回、経口的に投与した。垂直直径の連続的なカリパスによる測定を１日おき
に実行して、以下の式：４／２４×（最小直径）２×（最大直径）を用いて腫瘍容積を算定した。腫瘍が２ｃｍ以上になるか、又は壊死性になった場合、動物を屠殺した。腫瘍増殖試験のために、７匹のマウスを各群で用いた。
【００８５】
図１０Ａ〜Ｃに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物による腫瘍保有マウスの処理は有意にＭＭ腫瘍増殖を抑制し、これらのマウスを延命させるが、ビヒクル単独ではそうではなかった。対照群のマウスはすべて進行性腫瘍を発症したが、一方、処理マウスの７０％において腫瘍の完全退行が観察された。図１０Ｂの上方パネルのマウスは経口用量のビヒクル単独を摂取したが、一方、下方パネルのマウスは式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を摂取した。図１０Ｂの左側のパネルは、マウスの右側腹部で増殖中の皮下形質細胞腫の拡大である。処理の第１日から死亡まで、生存率を評価した；マウスの腫瘍直径が２ｃｍに達するか、又はそれらが瀕死状態になった時に、マウスを屠殺した（図１０Ｃ）。さらに処理１２週間後でさえ、神経学的行動変化は観察されなかった。投与された化合物の濃度はマウスにより良好に耐容され、体重損失の徴候はなかった。未処理及び処理群の両方のマウスを、毎週計量した。マウス体重の平均変化を、図１０Ｄに示す。
【００８６】
３００日目の分析は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物処理マウスの５７％において腫瘍の再発が認められないことを示した（図１０Ｃ）。さらに、接種部位で実施した組織学的分析は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物処理マウス対ビヒクル処理マウスにおける形質細胞の消失を確認した（それぞれ図１０Ｅの左側のパネル及び右側のパネル）。これらのデータは、この化合物は経口的に活性であり、ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＭ腫瘍増殖を抑制し
、延命させることを示す。
【実施例１２】
【００８７】
ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の比較分析
式（ＩＩ）の化合物及びボルテゾミブのｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較するために、上記のよ
うなマウスモデルを、週に２回、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（０．１５ｍｇ／ｋｇ（静脈内））又はボルテゾミブ（１．０ｍｇ／ｋｇ（静脈内））で処理した。両方の薬剤は有意に腫瘍進行を低減し（ｐ＜０．０１）、延命させた（ｐ＝０．０１３７）（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。
【実施例１３】
【００８８】
抗ＭＭ活性を媒介するメカニズム
ミトコンドリアは、ストレス中のアポトーシス誘導に重要な役割を果たす（Bossy-Wetzel, E. & Green, D.R. (1999) Mutat Res 434, 243-51及びChauhan, D. & Anderson, K.C. (2003) Apoptosis 8, 337-43（これらは共に参照により本明細書中で援用される）参照）。血清飢餓ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で１２時間処理し、最後の２０分間ＣＭＸＲｏｓと共にインキュベートし、３７℃で２０分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の親油性陽イオン性染料ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）（Molecular Probes, Eugene, OR）で染色し、フローサイトメトリーにより
分析して、ΔΨｍ（ミトコンドリア膜電位）の変化に関して検定した。最後の１５分間、膜透過性染料ジヒドロエチジウム（ＨＥ）で細胞を染色することにより、スーパーオキシド（Ｏ2-）産生を測定した。スーパーオキシドアニオンはＨＥを蛍光エチジウムに酸化し、フローサイトメトリーによる分析を可能にする。
【００８９】
図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物はΔΨｍを低減し（ＣＭＸＲｏｓ陰性細胞数の増加（Ｐ＜０．００５、ｎ＝２）により立証される）、ＭＭ．１Ｓ細胞におけるＯ2-産生を誘発する。結果は、２つの個々の実験の平均±ＳＤである。ΔΨｍの変化は、サイトゾルへのミトコンドリアタンパク質ｃｙｔｏ−ｃ及びＳｍａｃ
の放出と、それによるカスパーゼ９及びカスパーゼ３の誘発に関連する（Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L. & Wand, X. (2000) Cell 102, 33-42及びLiu, X., Naekyung Kim, C., Yang, J., Jemmerson, R. & Wang, X. (1996) Cell 86, 147-157（これらはその全体
において共に参照により本明細書中で援用される）参照）。
【００９０】
図１１Ｃに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物によるＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、ミトコンドリアｃｙｔｏ−ｃ（上方、左側のパネル）及びｓｍａｃ（上方、右側のパネル）の低減、並びにサイトゾル画分中のこれらのタンパク質の同時増大を誘発する（それぞれ中央のパネル、左側のパネル及び右側のパネル）。抗Ｈｓｐ６０（下方、左側のパネル）及び抗チューブリン（下方、右側のパネル）抗体による免疫ブロットの再プローブ化は、ミトコンドリア抽出物の精製並びにタンパク質の等負荷を確認する。ミトコンドリアアポトーシス誘導タンパク質ｃｙｔｏ−ｃ及びＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出は、カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の活性化を誘導する。ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で２４時間処理し、回収し、ミトコンドリア及びサイトゾルタンパク質画分を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、抗ｃｙｔｏ−ｃ（上方のパネル）又は抗Ｓｍａｃ（中央のパネル）抗体での免疫ブロット法により分析した。タンパク質の等負荷及びミトコンドリア画分の純度に関する対照として、ぞれぞれ抗チューブリン（下方右側のパネル）及び抗Ｈｓｐ６０抗体（下方左側のパネル）を用いてフィルターも再プローブ化した。ブロットは、３つの個々の実験を代表するものである。
【００９１】
ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で２４時間処理し、回収し、サイトゾルタンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、抗カスパーゼ−８抗体及び抗カスパーゼ−９抗体での免疫ブロット法により分析した。図１１Ｄに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物によるＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、カスパーゼ−９のタンパク質分解性切断を誘導する。さらにこの化合物は、カスパーゼ−８も活性化する（図１１Ｅ）。カスパーゼ−９（ミトコンドリア依存性）及びカスパーゼ−８（ミトコンドリア非依存性）は共に、一般的な下流のエフェクター、カスパーゼ−３をタンパク質分解的に切断し、活性化して、ＰＡＲＰ切断を生じることが既知である（Miller, L.K. (1999) Trends Cell Biol 9, 323-8（これはその全体において参照により本明細書中で援用
される）参照）。したがって、ＭＭ．１Ｓ又はＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝
Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で２４時間処理し、ＰＡＲＰ及びカスパーゼ−３切断検定の両方によりアポトーシスに関して評価した。全タンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。抗ＰＡＲＰ（上方のパネル）又は抗カスパーゼ−３（下方のパネル）抗体を用いて、溶解物の免疫ブロット分析を実施した。「ＦＬ」は「全長」を示し、「ＣＦ」は切断断片を意味する。このデータはさらに、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がカスパーゼ−３及びＰＡＲＰ切断を誘発することを示す（図１１Ｆ）。
【００９２】
チトクローム−ｃ、Ｓｍａｃ、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９又はカスパーゼ−３（Cell Signaling, Beverly, MA）、チューブリン（Sigma, St. Louis, MO）、ＰＡＲＰ、Ｈ
ｓｐ６０又はＢａｘ（BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA）に対する抗体を用い
て、免疫ブロット分析を実施した。増感化学発光（ＥＣＬ；Amersham Arlington Heights, IL）により、ブロットを現像した。
【実施例１４】
【００９３】
ボルテゾミブと比較した、ＭＭ細胞のアポトーシスの機構的差異
カスパーゼ−９阻害薬（ＬＥＨＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−８阻害薬（ＩＥＴＤ−ｆｍｋ）又はカスパーゼ−３阻害薬（Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）の存在下又は非存在下で、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブでＭＭ．１Ｓ細胞を処理した。図１２Ａに示すように、カスパーゼ−３阻害は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブ誘導性アポトーシスの両方を顕著に抑
制する。結果は、４つの個々の実験の平均±ＳＤである（Ｐ＜０．００４）。カスパーゼ−８の阻害は式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘発される細胞死の有意の低減をもたらした（Ｐ＜０．００５、ｎ＝４）が、一方、カスパーゼ−９のみの阻害はこの化合物により誘発されるＭＭ．１Ｓ細胞の生存度の低減を中等度に阻害した。これに対して、ＭＭ．１Ｓ細胞におけるボルテゾミブ誘導性の生存度の低減は、カスパーゼ−８阻害薬又はカスパーゼ−９阻害薬の存在下で等しく阻害される（Ｐ＜０．００５）。同時に、これらのデータは、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９の活性化はボルテゾミブ誘発性の細胞死中に等しく一因となるが、一方、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘発されるアポトーシスは主にカスパーゼ−８シグナル伝達経路を経由して進行することを示唆する。
【００９４】
優性−陰性（ＤＮ）戦略を用いた遺伝子試験により、これらの生化学的データを確認した。ベクター単独、ＤＮ−カスパーゼ−８、ＤＮ−カスパーゼ−９又はＤＮ−ＦＡＤＤを用いて製造業者の取扱説明書（Amaxa Biosystems, Germany）に従って、細胞株Ｎｕｃｌｅ
ｏｆｅｃｔｏキットＶを用いてＭＭ．１Ｓ細胞を一過的にトランスフェクトし、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）単独を含有するベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクト後、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーにより選択し、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブで処理し、生存度に関して分析した。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（ＩＣ５０、７ｎＭ）によるＤＮ−カスパーゼ−８トランスフェクト化ＭＭ細胞の処理は、ＤＮ−カスパーゼ−９でトランスフェクトされた細胞と比較して、これらの細胞の生存を顕著に増大させた（図１２Ｂ）。これに対して、ボルテゾミブ（ＩＣ５０、５ｎＭ）を用いたＤＮ−カスパーゼ−８又はＤＮ−カスパーゼ−９トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、生存を同程度に増大させた。これらの細胞中のカスパーゼ−９（Ｄｅｘ）及びカスパーゼ−８の既知の誘導物質（抗Ｆａｓ ＭｏＡｂ）（Chauhan他, 1997）を用いたＭＭ．１Ｓ細胞の処理により、ＤＮ−カスパーゼ−８又はＤＮ−カスパーゼ−９の機能的特異性を確認した（図１２Ｃ）。これらのデータは、（１）式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性ＭＭ細胞アポトーシスは主にカスパーゼ−８により媒介され；そして（２）ボルテゾミブ誘導性アポトーシスはカスパーゼ−８及びカスパーゼ−９活性化の両方を必要とすることを示唆する。
【００９５】
次に、カスパーゼ−８活性化をもたらす上流シグナル伝達経路の抑制が式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブに対する応答に影響を及ぼすか否かを確定した。Ｆａｓ会合デスドメイン（ＦＡＤＤ）タンパク質は、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー、例えばＦａｓの結合時に集合して、プロカスパーゼ−８のタンパク質分解性プロセシング及び自己活性化を生じる死誘導性シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の重要な部分である。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブは共にカスパーゼ−８活性化を誘発するため、ＭＭ細胞中でのこの事象の間のＦＡＤＤの役割を、ＤＮ−ＦＡＤＤを用いて評価した。ＤＮ−ＦＡＤＤによるＦＡＤＤの阻害は、エンプティーベクタートランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞と比較して、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性細胞傷害性を有意に減衰した（ベクタートランスフェクト化細胞における生存可能細胞４２％±２．０％対ＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化細胞における生存可能細胞７６％±５．１％；ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。ＤＮ−ＦＡＤＤは、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性カスパーゼ−８活性化を低減させた。しかしながら最小量のカスパーゼ−８活性化は依然として認められ（データは示されていない）、これはＦＡＤＤ以外のカスパーゼ−８の上流活性化因子によるものであり得る。ボルテゾミブによるＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、ベクタートランスフェクト化細胞と比較して生存率が１６％だけ増大させたことは重要であった（ベクタートランスフェクト化細胞における生存可能細胞３９％±２．４％対ＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化細胞における生存可能細胞５５％±４．１％；ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。これらのデータは、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９阻害試験と結びつけて考えると、式（ＩＩ）の化合物がボルテゾミブより強くＦＡＤＤ−カスパーゼ−８シグナル伝達軸に依存していることを示唆し、これはさらに、ＭＭ
細胞中での式（ＩＩ）の化合物対ボルテゾミブの作用の示差的メカニズムを確認する。
【００９６】
Ｂａｘはミトコンドリア・アポトーシス経路を誘導することを従来の試験は確立している（Wei, M.C., Zong, W.X., Cheng, E.H., Lindsten, T., Panoutsakopoulou, V., Ross, A.J., Roth, K.A., MacGregor, G.R., Thompson, C.B. & Korsmeyer, S.J. (2001) Science 292, 727-30及びLei, K., Nimnual, A., Zong, W.X., Kennedy, N.J., Flavell, R.A., Thompson, C.B., Bar-Sagi, D. & Davis, R.J. (2002) Mol Cell Biol 22, 4929-42（
これらは共にその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘導されるＭＭ細胞アポトーシスがＢａｘの変化と相関するか否かを評価した。ＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物
又はボルテゾミブで処理し、ミトコンドリアタンパク質抽出物を抗Ｂａｘ又は抗Ｈｓｐ６０抗体を用いた免疫ブロット分析に供した。図１２Ｅに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、ミトコンドリア中のＢａｘレベルの増大を、例えあったとしても、ほとんど誘導しない。ブロットは、３つの個々の実験を代表する。ボルテゾミブがミトコンドリア中のＢａｘの有意な蓄積を誘発することは重要である。
【００９７】
野生型Ｂａｘ又はノックアウトを保有するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブで４８時間処理し、ＭＴＴ検定により細胞生存度に関して分析した。図１２Ｆに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物はＢａｘ（ＷＴ）及びＢａｘ（ノックアウト）の両方の生存度を低減させるが、一方、Ｂａｘの欠失はボルテゾミブに対する有意な耐性を付与する。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである（Ｐ＜０．０５）。これらのデータは、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブにより誘導されるアポトーシス中のＢａｘの示差的要求を示し、これらの薬剤の異なる作用メカニズムを示唆する。
【実施例１５】
【００９８】
ボルテゾミブと比較した場合の正常リンパ球に及ぼす示差的影響
ボルテゾミブ療法は、患者における毒性と関連している。したがって正常細胞に及ぼす式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブの影響を比較した。５人の健常ドナーからのリンパ球を、種々の濃度（０〜２０ｎＭ）の式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブ（０〜２０ｎＭ）で７２時間処理し、ＭＴＴ検定により細胞傷害性に関して分析した。図１３に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、より高い用量（２０ｎＭ）でさえ、正常リンパ球の生存を有意に低減しない（Ｐ＝０．２７、Ｊ−Ｔ傾向検定から）。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである。これに対して、ボルテゾミブは、６〜１０ｎＭの低濃度でさえ、リンパ球の生存度を有意に低減させる。患者ＭＭ細胞のＩＣ50は、正常リンパ球に影響を及ぼさない式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の濃度で達成されるが、一方、ＭＭ細胞に関するボルテゾミブのＩＣ50は正常リンパ球の生存度の５０％の低減を誘発することは注目すべきである。同時に、これらのデータは、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は選択的な抗ＭＭ活性を有し、特に、それはボルテゾミブより正常細胞に対して低毒性であることを示唆する。
【００９９】
式（ＩＩ）の化合物又はボルテゾミブが正常リンパ球及び皮膚線維芽細胞におけるプロテアソーム活性を変えるか否かにおいても調べた。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブは、これらの細胞におけるプロテアソーム活性を有意に阻害した。２０ｎＭの式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブは、キモトリプシン様プロテアソーム活性のそれぞれ９９％又は５９±１１％の阻害を誘発した（データは示されていない）。したがって２０ｎＭの式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は正常リンパ球における有意の細胞傷害性を誘発しなかったが、これらの細胞中でのキモトリプシン様プロテアソーム活性を低減させた。同様に、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（３１７ｎＭ）又はボルテゾミブ（１５ｎＭ）に関するＩＣ50での正常ＣＣＤ−２７ｓｋ線維芽細胞の処理も、プロテア
ソーム活性を阻害した（データは示されていない）。
【実施例１６】
【０１００】
ボルテゾミブと比較した場合のＢｃｌ−２過剰発現ＭＭ細胞に及ぼす示差的影響
アポトーシス中、ＢａｘはＢｃｌ−２の抗アポトーシス機能を中和し、それによりｃｙｔｏ−ｃ放出及びカスパーゼ−９活性化を促す。Ｂｃｌ−２は、癌細胞、例えばＭＭにおける薬剤耐性を付与し、ボルテゾミブ誘導性致死に対する部分的防御を提供する。したがってＭＭ．１Ｓ細胞におけるＢｃｌ−２の異所性発現が、ＭＭ細胞における細胞傷害性及び後ミトコンドリア・アポトーシスシグナル伝達を誘発する式（ＩＩ）の化合物又はボルテゾミブの能力に影響を及ぼすか否かを評価した。Ｂｃｌ−２の過剰発現は、両方の薬剤で処理された細胞の生存度の適度の増大を促進した：式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物に関しては、Ｂｃｌ−２トランスフェクト化細胞の生存度５０％±２．６％対ベクタートランスフェクト化細胞の生存度３９％±１．５％（ｐ＜０．０５）；及びボルテゾミブに関しては、Ｂｃｌ−２トランスフェクト化細胞の生存度６１％±２．９％対ベクタートランスフェクト化細胞の生存度４０％±２．１％（ｐ＜０．０５）（図１４Ａ）。ボルテゾミブに応答するＢｃｌ−２トランスフェクト体の生存増大は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物に応答するもの（１１％）より大きかった（２１％）（ｐ＜０．０４；ｎ＝３）（図１４Ａ）。さらにボルテゾミブは対照ベクタートランスフェクト化細胞における有意なカスパーゼ−９切断を誘発したが、これは、Ｂｃｌ−２−トランスフェクト化細胞では顕著に減衰される（濃度計で３倍低減）。これに対して、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性カスパーゼ−９切断は、Ｂｃｌ−２過剰発現により最小限に影響される（図１４Ｂ）。これらの発見は、生存度結果と合わせて考えると、Ｂｃｌ−２は式（ＩＩ）の化合物より多くのボルテゾミブに対する防御を提供することを示唆する。
【実施例１７】
【０１０１】
組合せ治療
図１５に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物をボルテゾミブと組合せて用いた２４時間のＭＭ．１Ｓ又はＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞の処理は、相乗的増殖抑制を誘導する。
結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである（Ｐ＜０．００５）。「ＣａｌｃｕＳｙｎ」ソフトウエアプログラム（Biosoft, Ferguson, MO及びCambridge, UK）によるアイソボログラム分析を用いて、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の抗ＭＭ薬剤及びボルテゾミブ間の相互作用を分析した。細胞生存度検定（ＭＴＴ）のデータを、薬剤処理細胞対未処理細胞において増殖が影響された細胞の画分（ＦＡ）として表した。ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムは、以下の方程式：「ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２＋（Ｄ）１（Ｄ）２／（Ｄｘ）１（Ｄｘ）２」（式中、（Ｄ）１及び（Ｄ）２は、組合せて用いた場合に×作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量であり、（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は、単独で用いた場合に、同じ×作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量である）に従ってチョウ・タラレイ法に基づいている。ＣＩ＝１である場合、この方程式は保存アイソボログラムを表し、相加的作用を示す。１．０未満のＣＩ値は、相乗的作用を示す。ボルテゾミブ＋ＮＰＩ−００５２に関して１．０未満の組合せ指数（ＣＩ）を得たが、これは相乗的作用を示す。さらに、他の治療計画というよりむしろ、併用して投与された場合、最大の抗ＭＭ活性を得た。低用量の式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物とボルテゾミブとの併用は、正常ＰＢＭＮＣの生存度に有意に影響を及ぼさない（データは示されていない）。したがってボルテゾミブと式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物とによる組合せ療法は、１）毒性以下(sub-toxic)濃度の各薬剤の使用を可能にし、２）薬剤耐性の発現を遅延するか又は防止し、３
）これらの薬剤の相乗的用量の増大を可能にして、アポトーシス閾値を増大させることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学及び医学の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、腫瘍性疾患、例えば癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国における死亡の主因である。癌を治療するための新規のアプローチを見出すための著しい努力にもかかわらず、主要な治療選択肢は依然として、外科手術、化学療法及び放射線療法の単独又は組合せである。しかしながら外科手術及び放射線療法は一般的に、かなり限定された型の癌にのみ有用であり、そして播種性疾患を有する患者を治療するための用途は限定されている。化学療法は、転移性癌又は散在性癌、例えば白血病を有する患者を治療するのに一般的に有用な方法である。化学療法は治療的有用性を提供し得るが、それはしばしば、化学療法剤に耐性となる患者の癌細胞のために、この疾患を治癒することができない。
【０００３】
したがって、癌を治療するための付加的化学療法に対する必要性が存在する。新規の潜在的に有用な化学療法剤及び抗菌薬を同定するために個々の研究者、大学及び会社により、継続的努力が為されている。
【０００４】
再発性／難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療のためのボルテゾミブ(Bortezomib)／ＰＳ−３４１療法の開発の成功によって、有効な治療的戦略としてプロテアソーム抑制が確立された。ジペプチドボロン酸類似体ボルテゾミブは、２６Ｓプロテアソーム複合体を標的化し、その機能を抑制する強力で高度に選択的及び可逆的なプロテアソーム阻害薬である。２６Ｓプロテアソームは、細胞内タンパク質分解を媒介するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）依存性多触媒性(multicatalystic)プロテアーゼである。ミスフォールド又は損傷した
タンパク質のプロテアソーム分解は、２６Ｓプロテアーゼの１９Ｓ制御サブユニットによるポリユビキチン化タンパク質の認識、及びその後の低ポリペプチドへの加水分解により進行する。ボルテゾミブは、トリプシン活性又はカスパーゼ様プロテアソーム活性を変更することなく、主にキモトリプシン活性を抑制する。ＮＦ−ｋＢの抑制に加えて、ボルテゾミブは、１）細胞周期制御タンパク質；２）形質細胞分化因子Ｘ−ボックス結合タンパク質−１（ＸＢＰ−１）の転写活性を調節することによるＵＰＲ経路；３）ｐ５３媒介性アポトーシス／ＭＤＭ２；４）ＤＮＡ修復メカニズム；５）内因性（カスパーゼ−９媒介性）及び外因性（カスパーゼ−８媒介性）細胞死カスケードの両方による古典的ストレス−応答経路を標的化することによりＭＭ生物学に対して多面発現的作用を有する。具体的には、ボルテゾミブはＪＮＫを活性化し、これがミトコンドリア・アポトーシスシグナル伝達：ミトコンドリアからサイトゾルへのチトクローム−ｃ（ｃｙｔｏ−ｃ）及びカスパーゼの二次ミトコンドリア活性剤（Ｓｍａｃ）の放出と、その後のカスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の活性化を誘発する。しかしながら内因性の耐性及び後天性耐性は共にすでに観察されており、現在、ボルテゾミブ耐性を克服するための療法は存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、式（Ｉ）：
【０００６】
【化１】
【０００７】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグを腫瘍性疾患患者に投与することを包含する、腫瘍性疾患の治療方法であり、腫瘍性疾患が少なくとも１つの他の化学療法剤に対する耐性になりやすい。
【０００８】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグ（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）を、少なくとも１つの付加的化学療法剤と組合せて、腫瘍性疾患患者に投与することを包含する、腫瘍性疾患の治療方法である。
【０００９】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグ（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）、及び少なくとも１つの付加的化学療法剤を含む、薬学的組成物である。
【００１０】
本発明の別の態様は、少なくとも２つのプロテアソーム阻害薬の相乗的組合せを腫瘍性疾患患者に投与することを包含する、腫瘍性疾患の治療方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＮＰＩ−００５２によるヒト赤血球由来の２０Ｓプロテアソームにおけるキモトリプシン様、カスパーゼ様及びトリプシン様プロテアソーム活性の阻害を示す図である。
【図２】マウスにおけるＮＰＩ−００５２のｉｎ ｖｉｖｏキモトリプシン様活性を示す図である。
【図３】ＭＭ．１Ｓ多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞をＮＰＩ−００５２（７ｎＭ）で処理し、３７℃でＡｄａＹ（125Ｉ）Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共にタンパク質抽出物をインキュベートした後に得られたオートラジオグラフィーを示す図である。
【図４】ＭＭ．１Ｓ細胞をＮＰＩ−００５２で処理し、次にダンシル−Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共にインキュベートした後に得られた免疫ブロット法を示す図である。
【図５Ａ】指示用量のＮＰＩ−００５２で２４時間処理した種々の多発性骨髄腫細胞様の細胞生存度を示す図である。
【図５Ｂ】患者から得られたＭＭ細胞のＮＰＩ−００５２で処理後のアポトーシスのＤＮＡ断片化検定を示す図である。
【図６】患者から得られた骨髄間質細胞のＮＰＩ−００５２で処理後のアポトーシスのＤＮＡ断片化検定を示す図である。
【図７】ＩＬ−６又はＩＧＦ−Ｉの存在下又は非存在下でのＮＰＩ−００５２又はＤｅｘによる処理後のＭＭ．１Ｓ細胞生存度のＭＴＴ検定を示す図である。
【図８】ＭＭ．１Ｓ細胞のＶＥＧＦ誘導性移動に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図９】Ｂｃｌ２過剰発現ＭＭ．１Ｓの細胞生存度に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ａ】マウスに経口投与した場合の腫瘍増殖に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｂ】マウスに経口投与した場合の腫瘍増殖に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｃ】マウスに経口投与した場合の生存に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｄ】マウスに経口投与した場合の体重に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１０Ｅ】ＮＰＩ−００５２処理マウス及び対照処理マウスからの接種部位の組織切片を示す図である。
【図１０Ｆ】マウスに静脈内投与した場合の腫瘍増殖に及ぼすＮＰＩ−００５２及びボルテゾミブの作用を比較する図である。
【図１０Ｇ】マウスに静脈内投与した場合の生存に及ぼすＮＰＩ−００５２及びボルテゾミブの作用を比較する図である。
【図１１Ａ】ＣＭＸＲｏｓと共にインキュベートしたＭＭ．１Ｓ細胞におけるミトコンドリア膜電位に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１１Ｂ】膜透過性染料ジヒドロエチジウム（ＨＥ）で染色したＭＭ．１Ｓ細胞におけるスーパーオキシド生成に及ぼすＮＰＩ−００５２の作用を示す図である。
【図１１Ｃ】ＮＰＩ−００５２で処理したＭＭ．１Ｓ細胞から得られたミトコンドリアタンパク質画分及びサイトゾルタンパク質画分の免疫ブロット法を示す図である。
【図１１Ｄ】ＮＰＩ−００５２で処理し、抗カスパーゼ−９抗体で分析したＭＭ．１Ｓ細胞から得られたサイトゾルタンパク質の免疫ブロット法を示す図である。
【図１１Ｅ】ＮＰＩ−００５２で処理し、抗カスパーゼ−８抗体で分析したＭＭ．１Ｓ細胞から得られたサイトゾルタンパク質の免疫ブロット法を示す図である。
【図１１Ｆ】ＮＰＩ−００５２で処理し、そしてＰＡＲＰ及びカスパーゼ−３切断検定の両方によりアポトーシスに関して評価したＭＭ．１Ｓ又はＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞の免疫ブロットを示す図である。
【図１２Ａ】カスパーゼ−３、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９阻害薬の存在下又は非存在下でＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理後のＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１２Ｂ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理後のベクター単独、ＤＮ−カスパーゼ−８及びＤＮ−カスパーゼ−９でトランスフェクトされた細胞に関するＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１２Ｃ】デキサメタゾン又は抗ＦａｓＭｏＡｂで処理したＤＮ−カスパーゼ−８及びＤＮ−カスパーゼ−９トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞からのサイトゾル抽出物の免疫ブロット法を示す図である。
【図１２Ｄ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理後のベクター又はＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化細胞に関するＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１２Ｅ】指示濃度のＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理し、抗Ｂａｘ又は抗Ｈｓｐ６０抗体で分析したＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞からのミトコンドリアタンパク質抽出物の免疫ブロット法を示す図である。
【図１２Ｆ】指示濃度のＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理した野生型又は欠失Ｂａｘ（ノックアウト）を有するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の細胞生存度を示す図である。
【図１３】指示濃度のＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理した５つの健常ドナー由来の正常リンパ球の生存度を示す図である。
【図１４Ａ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブでの処理後のベクター単独又はＢｃｌ−２でトランスフェクトした細胞に関するＭＭ．１Ｓ細胞生存度を示す図である。
【図１４Ｂ】ＮＰＩ−００５２又はボルテゾミブで処理したベクタートランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞又はＢｃｌ−２トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞由来のサイトゾル抽出物の免疫ブロット法を示す図である。
【図１５】指示濃度のＮＰＩ−００５２、ボルテゾミブ又はＮＰＩ−００５２＋ボルテゾミブで処理したＭＭ．１Ｓ及びＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞の細胞生存度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態において、式（Ｉ）：
【００１３】
【化２】
【００１４】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり得る）の化合物は、本明細書中に記載されているような使用のために提供される。一実施形態では、Ｘは塩素である。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
【００１５】
【化３】
【００１６】
による立体化学を有する。式（ＩＩ）の化合物（式中、Ｘ＝Ｃｌ）は、本明細書中ではＮＰＩ−００５２とも呼ばれる。式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の化合物は、海洋性グラム陽性放線菌であるサリノスポラ（Salinospora）の発酵に由来し得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される化合物のプロドラッグ、代謝産物、立体異性体及び薬学的に許容可能な塩が、本明細書中に記載されるような使用のために提供される。
【００１８】
「プロドラッグ」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで親薬剤に転換される薬剤を指す。いくつかの場
合には、プロドラッグが親薬剤より投与するのが容易であり得るため、プロドラッグはしばしば有用である。例えばプロドラッグは経口投与により生物学的利用可能であるが、一方、親薬剤はそうではない。プロドラッグは、親薬剤を上回る薬学的組成物中での改善された溶解度を有し得る。プロドラッグの一例は、水溶性が移動度にとって有害である細胞膜を通る透過を促進するためにエステル（「プロドラッグ」）として投与されるが、次に、水溶性が有益である細胞内に一旦入ると、活性実体(active entity：アクティブエンティティ)であるカルボン酸に代謝的に加水分解される化合物であるが、これに限定されな
い。プロドラッグのさらなる例は酸基に結合される短いペプチド（ポリアミノ酸）であり得るが、このペプチドは代謝されて、活性部分を示す。適切なプロドラッグ誘導体の選択及び調製のための従来の手法は、例えば「Design of Prodrugs」（H. Bundgaard編, Elsevier, 1985）（これは、その全体において参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００１９】
「プロドラッグエステル」という用語は、生理学的条件下で加水分解される任意のいくつかのエステル形成基の付加により形成される本明細書中に開示された化合物の誘導体を指す。プロドラッグエステル基の例としては、ピボイルオキシメチル、アセトキシメチル、フタリジル、インダニル及びメトキシメチル、並びに当該技術分野で既知の他のこのような基、例えば（５−Ｒ−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基が挙げられる。プロドラッグエステル基の他の例は、例えばT. Higuchi及びV. Stella著「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975)、及び「Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application」, E.B. Roche編, Pergamon Press: New York, 14-21 (1987)（カルボキシル
基を含有する化合物のためのプロドラッグとして有用なエステルの例を提示）に見出され得る（上記の参考文献は各々、その全体において参照により本明細書中で援用される）。
【００２０】
本明細書中に開示される化合物の代謝産物としては、生物学的環境中への化合物の導入時に生成される活性種が挙げられる。
【００２１】
本明細書中に開示される化合物が少なくとも１つのキラル中心を有する場合、それらはラセミ化合物として、又はエナンチオマーとして存在し得る。このような異性体及びその混合物はすべて、本発明の範囲内に含まれる、ということに留意すべきである。さらに本明細書中に開示される化合物の結晶形態のいくつかは、多形体として存在し得る。このような多形体は、本発明の一実施形態に含まれる。さらに、本発明の化合物のいくつかは、水（即ち水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。このような溶媒和物は、本発明の一実施形態に含まれる。
【００２２】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、それが投与される生物体に対して有意の刺激を生じないし、その化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない化合物の塩を指す。いくつかの実施形態では、この塩は化合物の酸付加塩である。薬学的な塩は、化合物を無機酸、例えばハロゲン化水素酸（例えば塩酸又は臭化水素酸）、硫酸、硝酸、リン酸等と反応させることにより得ることができる。薬学的な塩は、化合物を有機酸、例えば脂肪族又は芳香族のカルボン酸又はスルホン酸（例えば酢酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸又はナフタレンスルホン酸）と反応させることによっても得ることができる。薬学的な塩は、化合物を塩基と反応させて、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩、有機塩基の塩、例えばジクロロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｃ1〜Ｃ7アルキルアミン、シクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミンの塩、並びにアミノ酸、例えばアルギニン、リジン等との塩等の塩を形成することによっても得ることができる。
【００２３】
薬学的処方物の製造が薬学的賦形剤と塩の形態での活性成分とを密接に混合することを包含する場合には、非塩基性、即ち酸性又は中性の賦形剤である薬学的賦形剤を用いるのが望ましい。
【００２４】
種々の実施形態において、本明細書中に開示される化合物は、単独で、本明細書中に開示される他の化合物と組合せて、或いは本明細書中に記載される治療領域における1つ又は
複数の他の薬剤と組合せて用いられ得る。
【００２５】
「ハロゲン原子」という用語は、本明細書中で用いる場合、元素の周期表の第７列の放射性安定原子のうちのいずれか１つ、例えばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味し、フッ素及び塩素が好ましい。
【００２６】
「エステル」という用語は、式−（Ｒ）n−ＣＯＯＲ’（式中、Ｒ及びＲ’は、独立して
、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（炭素環を介して結合される）及びヘテロ脂環式（炭素環を介して結合される）から成る群から独立して選択され、ｎは０又は１である）を有する化学的部分を指す。
【００２７】
「アミド」とは、式−（Ｒ）n−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’又は−（Ｒ）n−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（炭素環を介して結合される）及びヘテロ脂環式（炭素環を介して結合される）から成る群から選択され、ｎは０又は１である）を有する化学的部分である。アミドは、本発明の分子と結合し、それによりプロドラッグを形成するアミノ酸又はペプチド分子であり得る。
【００２８】
本発明の化合物上の任意のアミン、ヒドロキシ又はカルボキシル側鎖は、エステル化又はアミド化され得る。この目的を達成するために用いられるべき手法及び具体的な基は当業者に既知であり、Greene及びWuts著「Protective Groups in Organic Synthesis」,第３
版, John Wiley & Sons, New York, NY, 1999（これは参照にその全体においてより本明
細書中で援用される）のような参考文献出典に容易に見出され得る。
【００２９】
「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」という用語は、本明細書中で用いる場合、本発明の化合物が所定試料の質量の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％又は２０重量％、最も好ましくは少なくとも５０重量％又は７５重量％を含有するように、本発明の化合物が通常、それらの天然状態で会合される他の異なる化合物を含有していない、本明細書中に開示される化合物を指す。
【００３０】
使用方法
本明細書中に示される実施例により実証されるように、式（Ｉ）の化合物は、キモトリプシン様、トリプシン様及びカスパーゼ様プロテアソーム活性を阻害する。これに対してボルテゾミブは、キモトリプシン様プロテアソーム活性のみを阻害することが示されている（Goldberg, A.L. & Rock, K. (2002) Nat Med 8, 338-40及びAdams, J. (2004) Nat Rev
Cancer 4, 349-60を参照されたい）（これらは共に、全体において参照により本明細書
中で援用される）。式（Ｉ）の化合物は、ボルテゾミブとは異なる作用メカニズムを有することがさらに実証される。さらに、式（Ｉ）の化合物は、種々の多発性骨髄腫細胞株、例えばデキサメタゾン感受性ＭＭ．１Ｓ、デキサメタゾン耐性ＭＭ．１Ｒ、ＲＰＭＩ−８２２６、ＯＰＭ２、Ｕ２６６及びドキソルビシン耐性Ｄｏｘ−４０（これらに限定されない）においてアポトーシスを誘導する。式Ｉの化合物は、デキサメタゾン、ボルテゾミブ及びサリドマイドを用いた複数の従来の療法後に再発したヒト多発性骨髄腫から得られる細胞株におけるアポトーシスも誘導した。したがって式（Ｉ）の化合物は、他の化学療法剤、例えばデキサメタゾン、ドキソルビシン、ボルテゾミブ／ＰＳ−３４１及びサリドマイドに耐性であるＭＭ細胞に対して有効である。
【００３１】
したがって、一実施形態では、少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性になりやすい腫瘍性疾患の治療方法が提供され、これは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくはプロドラッグエステルを患者、例えばヒトに投与することを包含する。「少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性」とは、患者への化学療法剤の投与が腫瘍性疾患の症候の有意な改善を生じないことを意味する。腫瘍性疾患が腫瘍により特性化されるいくつかの実施形態では、「少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性」とは、化学療法剤の投与が腫瘍の増殖の明らかな抑制又は腫瘍のサイズの低減を生じないことを意味する。「少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性」は、薬剤が耐性腫瘍細胞に曝露される場合、明らかなアポトーシスが誘導されないことも意味し得る。少なくとも１つの化学療法剤に対する耐性に「なりやすい」とは、腫瘍性疾患が一般的に少なくとも１つの化学療法剤に対して耐性であるか、又は化学療法剤の反復投与時に耐性を発現することを意味する。
【００３２】
本明細書中の実施例は、式（Ｉ）の化合物が、ボルテゾミブと組合されると、ＭＭ細胞における相乗的アポトーシスを誘発することも実証する。したがって式（Ｉ）の化合物は、薬剤が別々に投与された場合よりも低用量の各薬剤を用いてアポトーシスを達成するためにボルテゾミブ／ＰＳ−３４１と組合せて投与され、それにより薬剤の毒性を低減し得る。驚くべきことに、これらの結果は、２つの異なるプロテアソーム阻害薬を投与することにより相乗的結果が得られることを実証する。「相乗的」とは、２つ以上の薬剤の組合せが１．０未満の組合せ指数（ＣＩ）を生じることを意味する。式（Ｉ）の化合物と非プロテアソーム阻害薬との組合せは相加的作用を与えることも実証された。「相加的」とは、２つ以上の薬剤の組合せが約１のＣＩを生じることを意味する。ＣＩは、例えば以下の方程式：ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２＋（Ｄ）１（Ｄ）２／（Ｄｘ
）１（Ｄｘ）２（式中、（Ｄ）１及び（Ｄ）２は、組合せて用いられる場合にｘ作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量であり；（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は単独で用いられる場合、同じｘ作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量である）に従ってチョウ・タラレイ（Chou-Talalay）法により、確定され得る。
【００３３】
したがって、一実施形態では、腫瘍性疾患を治療するための方法が提供され、これは２つ以上のプロテアソーム阻害薬を相乗的組合せで投与することを包含する。組合せられるプロテアソーム阻害薬の種類の非限定的な例としては、ペプチドボロネートプロテアソーム阻害薬、ペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害薬及び非ペプチドプロテアソーム阻害薬が挙げられる。ペプチドボロネートプロテアソーム阻害薬の非限定的な例は、ボルテゾミブである。ペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害薬の非限定的な例は、ＭＧ−１３２である。非ペプチドプロテアソーム阻害薬の非限定的な例としては、オムラリド及び式（Ｉ）の化合物が挙げられる。一実施形態では、プロテアソーム阻害薬の少なくとも１つは式（Ｉ）の化合物又はボルテゾミブである。「組合せ」投与とは、それらが実際に投与された時間又は方法に関係なく、２つ以上の薬剤が同時に患者の血流中に見出され得ることを意味する。一実施形態では、これらの薬剤を同時に投与する。このような一実施形態では、組合せ投与は、単一剤形で薬剤を組合せることにより成し遂げられる。別の実施形態では、薬剤は逐次的に投与される。一実施形態では、薬剤は、同一経路により、例えば経口的に投与される。別の実施形態では、薬剤は、異なる経路により投与され、例えば１つは経口的に、もう１つは静脈内に投与される。有益な一実施形態では、２つ以上の薬剤の薬物動態は実質的に同じである。
【００３４】
一実施形態では、腫瘍性疾患の治療方法が提供され、これは式（Ｉ）の化合物を別の化学療法剤と組合せて投与することを包含する。一実施形態では、他の化学療法剤はデキサメタゾン、ドキソルビシン又はサリドマイドである。一実施形態では、他の化学療法剤は、別のプロテアソーム阻害薬、例えばボルテゾミブである。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物を付加的化学療法剤と組合わせた薬学的組成物が提供される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、上記の方法のいずれかにより治療される腫瘍性疾患は、乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から選択される癌であり得る。一実施形態では、腫瘍性疾患は多発性骨髄腫である。
【００３６】
薬学的組成物
別の態様では、本発明の開示は、生理学的に許容可能な界面活性剤、担体、希釈剤、賦形剤、平滑化剤、懸濁剤、皮膜形成物質及びコーティング助剤或いはその組合せ；並びに本明細書中に開示される化合物又は組合せを含む薬学的組成物に関する。治療的使用のための許容可能な担体又は希釈剤は製薬業界で既知であり、そして、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」,第１８版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）に記載されている。防腐剤、安定剤、染料、甘味剤、芳香剤、香味料等が、薬学的組成物中に提供される。例えば安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、並びにｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルは、防腐剤として付加され得る。さらに、酸化防止剤及び懸濁剤が用いられ得る。種々の実施形態では、アルコール、エステル、硫酸化脂肪族アルコール等は界面活性剤として用いられ得る；スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶化セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸塩、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム等は賦形剤として用いられ得る；ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等は平滑化剤として用いられ得る；ヤシ油、オリーブ油、ゴマ油、落花
生油、ダイズ油は、懸濁剤又は滑剤として用いられ得る；セルロース又は糖のような炭水化物の誘導体としての酢酸フタル酸セルロース、若しくはポリビニルの誘導体としてのメチルアセテート・メタクリレートコポリマーは、懸濁剤として用いられ得る；そして可塑剤、例えばフタル酸エステル等は懸濁剤として用いられ得る。
【００３７】
「薬学的組成物」という用語は、他の化学成分、例えば希釈剤又は担体と本明細書中に開示された化合物の混合物又はその化合物の組合せを指す。薬学的組成物は、生物体への化合物の投与を促す。化合物を投与する多数の技法、例えば経口、注射、エーロゾル、非経口及び局所的投与が当該技術分野に存在するが、これらに限定されない。薬学的組成物は、化合物を無機又は有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等と反応させることによっても得られる。
【００３８】
「担体」という用語は、細胞又は組織中への化合物の組み込みを促す化合物を定義する。例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞又は組織中への多数の有機化合物の取り込みを促すので、一般に利用される担体である。
【００３９】
「希釈剤」という用語は、対象の化合物を溶解し、化合物の生物学的に活性な形態を安定化する水中に希釈される化合物を定義する。緩衝溶液中に溶解される塩は、当該技術分野で希釈剤として利用される。一般に用いられる一緩衝溶液はヒト血液の塩状態を模倣するため、リン酸塩緩衝生理食塩水である。緩衝塩は低濃度で溶液のｐＨを制御し得るため、緩衝希釈剤は化合物の生物活性をめったに改質しない。
【００４０】
「生理学的に許容可能な」という用語は、化合物の生物活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を定義する。
【００４１】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、それ自体、又は適切な担体若しくは賦形剤（単数又は複数）と混合される薬学的組成物中で、ヒト患者に投与され得る。本出願の化合物の処方及び投与のための技法は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 Mack Publishing Co., Easton, PA,第１８版, 1990に見出され得る。
【００４２】
適切な投与経路としては、例えば経口、直腸、経粘膜、局所又は腸投与；非経口的送達、例えば筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射、並びにくも膜下腔内、直接脳室内、腹腔内、鼻内又は眼内注射が挙げられる。化合物は、予定速度での長期及び／又は時限の、パルス投与のための、徐放性剤形、例えばデポー注射(depot injection)、浸透圧ポンプ、ピル、
経皮（電気輸送を含めた）パッチ等でも投与され得る。
【００４３】
本発明の薬学的組成物は、それ自体既知である様式、例えば従来の混合、溶解、造粒、ドラジェ製法、水簸、乳化、被包、封入又は錠剤法で製造され得る。
【００４４】
したがって本発明に従って用いるための薬学的組成物は、薬学的に用いられ得る製剤への活性化合物の加工処理を促す賦形剤及び助剤を含む1つ又は複数の生理学的に許容可能な
担体を用いて、従来の様式で処方され得る。適切な処方物は、選択される投与経路によって決定する。任意の既知の技法、担体及び賦形剤は、当該技術分野で、例えば上記のRemington's Pharmaceutical Sciencesにおいて適切に、且つ理解されるように用いられ得る
。
【００４５】
注射剤は、従来の形態で、注射前に液体中の溶液又は懸濁液に適した固体形態で液体溶液若しくは懸濁液として、又は乳濁液として調製され得る。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタ
ミン酸ナトリウム、塩酸システイン等である。さらに、所望により、注射可能な薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ緩衝剤等を含有し得る。生理学的適合性緩衝液としては、ハンクス溶液、リンガー溶液又は生理食塩緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。所望により、吸収増強調製物（例えばリポソーム）が利用され得る。
【００４６】
経粘膜投与のためには、浸透されるべきバリアに適した浸透剤が処方物中に用いられ得る。
【００４７】
例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに活性化合物の懸濁液は、適切な油状注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒若しくはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、又は他の有機油、例えばダイズ油、グレープフルーツ油若しくはアーモンド油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエート又はトリグリセリド、若しくはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含有し得る。懸濁液は、適切な安定剤、又は高濃度溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増大する薬剤も適宜含有し得る。注射用の処方物は、単位剤形で、例えばアンプル中で、又は多用量容器中で、付加的防腐剤と共に存在し得る。組成物は、油状ビヒクル又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液のような形態を取り得て、処方剤、例えば懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤を含有し得る。代替的には活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質無含有滅菌水との構成のために粉末形態であり得る。
【００４８】
経口投与のためには、活性化合物を当該技術分野で既知の薬学的に許容可能な担体と組合せることにより、化合物は容易に処方され得る。このような担体は、治療されるべき患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。経口使用のための薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、任意にその結果生じる混合物を粉砕し、そして顆粒の混合物を加工処理し、所望により適切な助剤を付加した後、錠剤又はドラジェコアを得ることにより生成され得る。適切な賦形剤は、特に、充填剤、例えば糖（例えばラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトール）；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが付加され得る。ドラジェコアは、適切なコーティングを備えている。この目的のために、濃縮糖溶液が用いられ、これは任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有し得る。染料又は顔料は、同定のために、又は活性化合物用量の異なる組合せを特性化するために、錠剤又はドラジェコーティングに付加され得る。この目的のために、濃縮糖溶液が用いられ、これは、任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有し得る。染料又は顔料は、同定のために、又は活性化合物用量の異なる組合せを特性化するために、錠剤又はドラジェコーティングに付加され得る。
【００４９】
経口的に用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチン製のプッシュ・フィットカプセル、並びにゼラチン及び可塑剤、例えばグリセロール又はソルビトールから作られる軟質密閉カプセルが挙げられる。プッシュ・フィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムのような滑剤、
及び任意に安定剤との混合物中に活性成分を含有し得る。軟質カプセル中では、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコール中に溶解されるか、又は懸濁され得る。さらに、安定剤が付加され得る。経口投与のための処方物はすべて、このような投与に適した投与量であるべきである。
【００５０】
頬側投与のためには、組成物は、従来の形態で処方される錠剤又はロゼンジの形態を取り得る。
【００５１】
吸入による投与のために、本発明に従って用いる化合物は、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザーからのエーロゾル噴霧供給(presentation)の形態で簡便に送達される。加圧エーロゾルの場合、投与量単位は、計測量を送達するための弁を提供することにより確定され得る。化合物及び適切な粉末基剤、例えばラクトース又はデンプンの混合粉末を含有する、例えば吸入器又は通気器に用いるためのゼラチンのカプセル及びカートリッジが処方され得る。
【００５２】
眼内、鼻内及び耳内送達を含む使用のための製薬業界で既知の種々の薬学的組成物が、さらに本明細書中に開示される。これらの使用のための適切な浸透剤は、当該技術分野で一般的に既知である。眼内送達のための薬学的組成物としては、水溶性形態での、例えば点眼薬中の、又はジェランガム（Shedden他, Clin. Ther., 23(3): 440-50 (2001)）又はヒドロゲル（Mayer他, Ophthalmologica, 210(2): 101-3 (1996)）中の活性化合物の点眼水溶液；眼軟膏；眼懸濁液、例えば液体担体媒質中に懸濁されるマイクロ粒子、薬剤含有低ポリマー粒子（Joshi, A., J. Ocul. Pharmacol., 10(1): 29-45 (1994)）、脂質溶解性
処方物（Alm他, Prog. Clin. Biol. Res., 312: 447-58 (1989)）、及びマイクロスフェ
ア（Mordenti, Toxicol. Sci., 52(1): 101-6 (1999)）；並びに眼球挿入物が挙げられる（上記の参考文献はすべて、その全体において参照により本明細書中で援用される）。このような適切な薬学的処方物は、最も頻繁に、且つ好ましくは安定性及び快適性のために滅菌性で、等張性でありそして緩衝化されるよう処方される。鼻内送達のための薬学的組成物は、正常繊毛作用の維持を保証するために多くの点で鼻分泌物をシミュレートするようにしばしば調製される液滴及び噴霧剤も含み得る。Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１８版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)（これはその全体において参
照により本明細書中で援用される）に開示されたように、そして当業者に既知であるように、適切な処方物は最も頻繁に、及び好ましくは等張性で、５．５〜６．５のｐＨを維持するためにわずかに緩衝化され、そして最も頻繁で、且つ好ましくは、抗細菌性防腐剤及び適切な薬剤安定剤を含む。耳内送達のための薬学的処方物としては、耳における局所的適用のための懸濁剤及び軟膏が挙げられる。このような耳用処方物に一般的な溶媒としては、グリセリン及び水が挙げられる。
【００５３】
化合物は、例えば従来の座薬基剤（例えばココアバター又は他のグリセリド）を含有する座薬又は保留浣腸等の直腸用組成物中にも処方され得る。
【００５４】
前記の処方物に加えて、化合物は、デポー製剤としても処方され得る。このような長期作用処方物は、埋込み（例えば皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与され得る。したがって、例えば化合物は、適切な高分子物質若しくは疎水性物質（例えば許容可能な油中の乳濁液として）、又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として、処方され得る。
【００５５】
疎水性化合物に関しては、適切な薬学的担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー及び水相を含む共溶媒系であり得る。用いられる一般的な共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系であって、これは、無水エタノール中の容量に取り入れられる３％ｗ
／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標）及び６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の溶液である。当然の帰結として、共溶媒系の割合は、その溶解度及び毒性特質を破壊することなくかなり変化し得る。さらに、共溶媒構成成分の同一性は変更され得る：例えば他の低毒性非極性界面活性剤が、ポリソルベート８０（商標）の代わりに用いられ得る；ポリエチレングリコールの画分サイズは、変化し得る；他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンが、ポリエチレングリコールに取って代わり得る；そして他の糖又は多糖がデキストロースの代わりになり得る。
【００５６】
代替的には、疎水性薬学的化合物のための他の送達系が用いられ得る。リポソーム及び乳濁液は、疎水性薬剤のための送達ビヒクル又は担体の既知の例である。特定の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドも用いられ得るが、通常はより大きな毒性という犠牲を払う。さらに、化合物は、徐放系、例えば治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを用いて送達され得る。種々の徐放性物質が確立されており、これは当業者に既知である。徐放性カプセルは、それらの化学的性質によって、数週間から１００日を超えるまでの間、化合物を放出し得る。治療用試薬の化学的性質及び生物学的安定性によって、タンパク質安定化のための付加的戦略が用いられ得る。
【００５７】
細胞内に投与されるように意図される薬剤は、当業者に既知の技法を用いて投与され得る。例えばこのような薬剤は、リポソーム中に被包され得る。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在する分子はすべて、水溶液内部に組み入れられる。リポソーム内容物は、外部ミクロ環境から保護され、そしてリポソームが細胞膜と融合するため、細胞質中に効率的に送達される。リポソームは、組織特異的抗体で被覆され得る。リポソームは、所望の器官により選択的に標的化され、取り込まれる。代替的には疎水性有機低分子は、細胞内に直接投与され得る。
【００５８】
付加的治療薬又は診断薬が、薬学的組成物中に組み入れられる。代替的に又は付加的に、薬学的組成物は、他の治療薬又は診断薬を含有する他の組成物と組合され得る。
【００５９】
投与方法
化合物又は薬学的組成物は、任意の適切な手段により患者に投与され得る。投与方法の非限定的な例としては、とりわけ、（ａ）経口経路による投与、この投与としてはカプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップ又は他のこのような形態での投与が挙げられる；（ｂ）非経口経路、例えば直腸、膣、尿道内、眼球内、鼻内又は耳内による投与、この投与としては水性懸濁液、油状調製物等として、又はドリップ、スプレー、座薬、サルブ(salve)、軟膏等としての投与が挙げられる；（ｃ）注射による皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内
、皮内、眼窩内、きょう膜内、脊髄内、胸骨内等、例えば注入ポンプ送達による投与；（ｄ）局在的、例えば腎臓又は心臓域での直接的注射による、例えばデポー剤埋込みによる投与；並びに（ｅ）局所的投与、本発明の化合物を生存組織と接触させるのに適していると当業者に思われるようなもの、が挙げられる。
【００６０】
投与に適した薬学的組成物としては、その意図される目的を達成するのに有効な量で活性成分が含有される組成物が挙げられる。単回用量として必要とされる本明細書中に開示される化合物の治療的に有効な量は、投与経路、治療中の動物の種類、例えばヒト、及び考慮中の特定動物の身体的特質によって決まる。用量は所望の作用を達成するよう調整され得るが、体重、食餌、併用薬のような因子、及び医薬業界の当業者が認識するその他の因子によって決まる。さらに具体的には、治療的に有効な量は、疾患の症候を予防、軽減、若しくは改善するのに、又は治療中の被験者を延命させるのに有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の確定は、特に本明細書中に提示される詳細な開示の点から見て、十分に当業者の能力内である。
【００６１】
当業者に容易に明らかであるように、投与されるべき有用なｉｎ ｖｉｖｏ投与量並びに
特定の投与方式は、治療される哺乳類の年齢、体重及び種類、用いられる特定化合物、並びにこれらの化合物が用いられる特定用途によって変わる。有効投与量レベル、即ち所望の結果を達成するのに必要な投与量レベルの確定は、決められた薬理学的方法を用いて、当業者により成し遂げられ得る。一般的には、製品のヒト臨床適用は低投与量レベルで開始され、投与量レベルは所望の作用が達成されるまで増大される。代替的には、確立された薬理学的方法を用いて本発明の方法により同定される組成物の有用な用量及び投与経路を確立するために、許容可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が用いられ得る。
【００６２】
非ヒト動物試験では、可能性のある製品の適用は、より高い投与量レベルで開始され、投与量は所望の作用がもはや達成されないか、又は副作用が消失するまで低減される。投与量は、所望の影響及び治療指標によって、広範に変動し得る。一般的には、投与量は、約１０μｇ／体重１ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。代替的には投与量は、当業者に理解されるように、患者の体表面積に基づいて算定され得る。
【００６３】
本発明の薬学的組成物の正確な処方、投与経路及び投与量は、患者の症状を考慮して、個々の医者により選択され得る（例えばFingl他(1975)著「The Pharmacological Basis of Therapeutics」を参照されたい）（これは、その全体において参照により、特に第１章１ページを参照することにより、本明細書中で援用される）。一般的には、患者に投与される組成物の用量範囲は、約０．５〜１０００ｍｇ／患者の体重１ｋｇであり得る。投与は、患者に必要とされる場合、単一回であるか、又は１日若しくはそれ以上の日数の間に投与される一続きの２回以上の投与であり得る。化合物のヒト投与量が少なくともいくつかの症状に関して確立された場合、本発明は、確立されたヒト投与量と同じ投与量、又はその約０．１％〜５００％、さらに好ましくは約２５％〜２５０％である投与量を用いる。新たに発見された薬学的化合物の場合のように、ヒト投与量が確立されない場合、適切なヒト投与量はＥＤ50値若しくはＩＤ50値、又は動物における毒性試験及び有効性試験により制限されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ試験から得られる他の適切な値から推測され得る。
【００６４】
担当医は、毒性又は器官機能不全のために投与を終結、中断又は調整する方法及び時機を知っていることに留意すべきである。逆に言えば、臨床応答が適切でなかった場合、より高いレベルに治療を調整する（毒性を取り除く）ことも、担当医は知っている。対象の疾病の管理において投与される用量の大きさは、治療されるべき症状の重症度によって、そして投与経路に合わせて変わる。例えば症状の重症度は、一部は、標準的な予後評価法により評価され得る。さらに、用量、そしておそらくは投与頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答によって変わる。上記のものに相当するプログラムが、獣医学で用いられ得る。
【００６５】
的確な投与量は薬剤毎に確定されるが、多くの場合、投与量に関する多少の普遍化がなされ得る。成人患者に関する１日の投与量レジメンは、例えば０．１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば５〜２００ｍｇの各活性成分の経口用量であり得る。他の実施形態では、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜６０ｍｇ、例えば１〜４０ｍｇの各活性成分の静脈内、皮下又は筋肉内用量が用いられる。薬学的に許容可能な塩の投与の場合、投与量は遊離塩基として算定され得る。いくつかの実施形態では、組成物は１〜４回／日投与される。代替的には本発明の組成物は、好ましくは１０００ｍｇ／日までの各活性成分の用量で、連続静脈内注入により投与され得る。当業者により理解されるように、特定の状況では、特に侵攻性の疾患又は感染を効果的に且つ積極的に治療するために、上記の好ましい投与量範囲を超えるか、又ははるかに超える量で、
本明細書中に開示される化合物を投与する必要があり得る。いくつかの実施形態では、化合物は、連続治療期間、例えば１週間以上、又は数ヶ月若しくは数年間、投与される。
【００６６】
投与量及び投与間隔は、独立して調整されて、調節作用又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な血漿レベルの活性部分を提供し得る。ＭＥＣは各化合物で変わるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータから概算され得る。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体
の特質及び投与経路によって変わる。しかしながらＨＰＬＣ検定又はバイオアッセイを用いて、血漿濃度を確定し得る。
【００６７】
投与間隔は、ＭＥＣ値を用いても確定され得る。組成物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の間、ＭＥＣを上回る血漿レベルを維持するレジメンを用いて投与されるべきである。
【００６８】
局在投与又は選択的取込みの場合、薬剤の有効局在濃度は、血漿濃度と関連しなくてもよい。
【００６９】
投与される組成物の量は、もちろん、治療中の被験者、被験者の体重、罹患重症度、投与様式並びに処方医の判断によって決まる。
【００７０】
本明細書中に開示される化合物は、既知の方法を用いて、有効性及び毒性に関して評価され得る。例えば特定の化合物、又は特定の化学的部分を共有するその化合物のサブセットの毒物学は、細胞株、例えば哺乳類、好ましくはヒト細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒
性を確定することにより確立され得る。このような試験の結果により、動物、例えば哺乳類、さらに具体的にはヒトにおける毒性をしばしば予測できる。代替的には動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ又はサルにおける特定の化合物の毒性は、既知の方法を用いて確定され得る。特定化合物の有効性は、いくつかの認識された方法、例えばｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ方法、動物モデル又はヒト臨床試験を用いて確立され得る。認識されたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏモデルは、ほとんどすべてのクラスの症状、例えば癌、心臓血管性疾患及び種々の免疫不全（これらに限定されない）に存在する。同様に、許容可能な動物モデルは、このような症状を治療するための化学物質の有効性を確立するために用いられ得る。有効性を確定するためにモデルを選択する場合、適切なモデル、投与量及び投与経路、並びにレジメンを選択するように最先端の技術により当業者は指導され得る。もちろん、ヒト臨床試験も、ヒトにおける化合物の有効性を確定するために用いられ得る。
【００７１】
組成物は、所望により、活性成分を含有する1つ又は複数の単位剤形を含有し得るパック
又はディスペンサー装置中に提供され得る。このパックは、例えば金属又はプラスチック箔（例えばブリスター包装）を含み得る。パック又はディスペンサー装置は、投与のための取扱説明書を添付し得る。パック又はディスペンサー装置は、薬剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定される形態で容器に関連する表示も添付され得るが、この表示は、ヒト投与又は動物投与のための薬剤の形態についての政府機関による承認を反映する。例えばこのような表示は、処方薬剤に関して米国食品医薬品局により認可された標識付け、又は認可製品挿入物であり得る。適合性の薬学的担体で処方した本発明の化合物を含む組成物も調製し、適切な容器に入れて、指示症状の治療のために標識付けし得る。
【実施例１】
【００７２】
一般手法
細胞培養及び試薬
Ｄｅｘ感受性ＭＭ．１Ｓ及びＤｅｘ耐性ＭＭ．１ＲヒトＭＭ細胞株を、Steven Rosen博士（Northwestern University, Chicago, IL）から入手した（Moalli, P.A., Pillay, S.,
Weiner, D., Leikin, R. & Rosen, S.T. (1992) Blood 79, 213-22及びChauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson,
P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002)
Blood 100, 2187-94参照）（これらは共に、その全体において参照により本明細書中で
援用される）。ＲＰＭＩ−８２２６及びドキソルビシン（Ｄｏｘ）耐性（Ｄｏｘ−４０）細胞を、William Dalton博士（Moffit Cancer Center, Tampa, FL）から入手した。Ｕ２
６６及びＯＰＭ２ ＭＭ細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Rockville, MD）から入手した。ヒト腫瘍細胞株ＤＵ１４５、ＨＴ−２９、ジャーカット、ＬｏＶｏ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＯＶＣＡＲ
−３、ＰＡＮＣ−１及びＰＣ−３は、ATCC（Manassas, VA）から購入した。１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、ＭＭ細胞株を増殖させた。複数回の以前の療法、例えばデキサメタゾン（Ｄｅｘ）、メルファラン、サリドマイド又はボルテゾミブ後に再発している患者から、ＭＭ細胞を新たに単離した。ＣＤ１３８（シンデカン−１）マイクロビーズ及び自動ＭＡＣＳ磁気細胞選別機（Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA）を用いて、ＣＤ１３８陽性選択法により、患者の骨髄試料からＭＭ細胞を精製した（Chauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002) Blood 100, 2187-94参照）（これはそ
の全体において参照により本明細書中で援用される）。正常ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−２７ｓｋをATCCから入手して、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｍＭのＬ−グルタミン及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。種々の濃度の式ＩＩ（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（Nereus Pharmaceuticals, Inc, San Diego, CA）、ボルテゾミブ又はＤｅｘ（Sigma Chemical Co, St. Louis, MO）で細胞を処理した。
【００７３】
細胞生存度及びアポトーシス検定
製造業者の取扱説明書（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）に従って、及びChauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. & Anderson, K.C. (2002) Blood 100, 2187-94（これはその全体において参照により本明細
書中で援用される）に記載されているように、臭化３−（４，５−ジメチルチオゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ；Chemicon International Inc., Temecula, CA）検定により、細胞生存度を評価した。細胞死の検出ＥＬＩＳＡｐｌｕ
ｓを利用して、製造業者の取扱説明書（Roch Applied Sciences, Indianapolis, IN）に
従って、細胞死を定量した。
【実施例２】
【００７４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ２０Ｓプロテアソーム活性検定
Stein, R.L., Melandri, F. & Dick, L. (1996) Biochemistry 35, 3899-908及びLightcap, E.S., McCormack, T.A., Pien, C.S., Chau, V., Adams, J. & Elliott, P.J. (2000)
Clin Chem 46, 673-83（これらは共にその全体において参照により本明細書中で援用さ
れる）に記載されているように、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を測定した。精製したヒト赤血球由来の２０Ｓプロテアソームを、Biomol, Plymouth Meeting, PAから入手した。それぞれペプチド基質としてＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、Ｚ−ＬＬＥ−ＡＭＣ（Boston Biochem, Cambridge, MA）及びＢｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ（Bachem Bioscience, King of Prussia, PA）を用いて、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性、
カスパーゼ様活性及びトリプシン様活性を測定した。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎ
ｔ９６ウェルマイクロプレートリーダー（Thermo Electron, Waltham, MA）を用いて、切断ペプチド基質の蛍光を測定した。Ｓ字形用量応答可変勾配モデルを用いて、プリズム（
GraphPad Software）により、ＥＣ50値を算定した。最大相対蛍光の５０％が阻害される
薬剤濃度としてＥＣ50値を定義した。結果（図１にプロットした）は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物が異なる濃度ではあるが、３つのプロテアソーム活性すべてを阻害することを示した。
【実施例３】
【００７５】
マウス（単回の静脈内投与又は経口投与）における全血液細胞中のｅｘ ｖｉｖｏ２０Ｓ
プロテアソーム活性の分析
式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がｉｎ ｖｉｖｏでプロテアソーム活性を阻害するか否
かを直接的に確定するために、１００％ＤＭＳＯ中に式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物を溶解し、５％ソルトール（ソルトール（登録商標）ＨＳ１５；ポリエチレングリコール６６０ １２−ヒドロキシステアレート、BASF、Shreveport, LA）中に順次希釈して、２％
ＤＭＳＯという最終濃度を生じた。対照ビヒクルは、２％ＤＭＳＯ及び９８％（５％ソルトール（登録商標）ＨＳ１５）で構成された。１０ｍＬ／ｋｇの容量で静脈内に又は経口的に種々の濃度の化合物を用いて、Bolder BioPATH, Inc. （Boulder, CO）で、雄Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（５匹／群、体重２０〜２５ｇ）を処理した。１群の動物は、プロテアソーム活性のベースラインを確立するために、未処理であった。化合物投与の９０分後に、動物を麻酔し、心臓穿刺により血液を抜き取った。パックした全血液細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳで洗浄し、ｅｘ ｖｉｖｏプロテアソーム活性の測定のた
めにドライアイス上で凍結した。ペプチド基質ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを用いて、白血球（ＷＢＣ）溶解物中の２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を測定した。細胞溶解物のタンパク質濃度を用いて、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を正常化した。個々のマウスの２０Ｓプロテアソーム活性を、平均活性を表す水平バーを用いて、図２に示す。ベースラインは、未処理マウスから調製されたＷＢＣ溶解物中で観察された２０Ｓプロテアソーム活性を表す。結果（図２に図示）は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物が、用量依存的に白血球中の２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害することを示す。重要なことに、これらの発見により、化合物が経口的に活性で、ｉｎ ｖｉｖｏでプロテアソ
ーム活性を阻害することが確立された。
【実施例４】
【００７６】
ＭＭ細胞におけるプロテアソーム活性の変化誘発の測定（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がｉｎ ｖｉｔｒｏで多発性骨髄腫細胞中のプロテアソ
ーム活性に影響を及ぼすか否かの確定を、ＡｄａＹ125Ｉａｈｘ3Ｌ3ＶＳとの競合実験を
用いて実行した。この検定では、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により標的化されない部位は、ＡｄａＹ（125Ｉ）Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳにより標識化され、オートラジオグラフィー
により可視化されるが、一方、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により標的化される部位はオートラジオグラムでは観察され得ない。ＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃ
ｌ）（７ｎＭ）の化合物と共に、３０分間、１時間、３時間又は６時間インキュベートし、細胞溶解をガラスビーズを用いて実施した。タンパク質抽出物６０μｇをヨウ化プロテアソーム阻害薬ＡｄａＹ125Ｉａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共に３７℃で２時間インキュベートした
。次に、還元試料緩衝液中で煮沸することによりタンパク質を変性させ、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した後、オートラジオグラフィーを行った。図３で示され得るように、プロテアソームのベータ−５（β−５）サブユニットは、対照細胞より処理細胞中で顕著に低くＡｄａＹ（125Ｉ）Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳにより標識化される。β−５サブユニ
ットがキモトリプシン様活性を媒介するので、これらの結果は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がβ−５サブユニットと結合し、それによりＭＭ．１Ｓ細胞中のキモトリプシン様活性を阻害することを示唆する。さらに化合物（７ｎＭ）によるＭＭ．１Ｓ細胞の６時間の処理は、β−２サブユニット（トリプシン活性）及びβ−１サブユニット（カスパーゼ様活性）の標識化も低減させた（データは示されていない）。
【実施例５】
【００７７】
ＭＭ細胞におけるプロテアソーム活性の変化誘発の測定（ｉｎ ｖｉｖｏ）
すべての活性プロテアソームサブユニットを共有結合的に修飾するダンシル−Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳを伴う競合実験を用いて、プロテアソーム活性のｉｎ ｖｉｖｏ測定を実行した。こ
の阻害薬は、ダンシル部分に対する抗体を用いて免疫ブロット法により可視化され得るダンシルスルホンアミドヘキサノイルハプテンを含有する。ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）（７ｎＭ）の化合物で、３０分間、１時間又は３時間処理し、その後、５μＭダンシル−Ａｈｘ3Ｌ3ＶＳと共に３７℃で１時間インキュベートした。それらをＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０）中で３０分間インキュベートすることにより、細胞を溶解し、その後、５分間遠心分離して、膜画分、核及び細胞残屑を除去した。タンパク質抽出物６０μｇを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、その後、ポリクローナル抗ダンシルポリクローナル抗体（１：７５００、ウサギ、Molecular Probes）及びホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Southern Biotech）を用いて免疫ブロット分析した。増感化学発光（Western Lightning, Perkin-Elmer）により、ブロットを展開した。
図４で見られ得るように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物によるＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、β−５サブユニットのダンシルＡｈｘ3Ｌ3ＶＳ標識化を低減する。さらに、この化合物は、より高濃度（それぞれ１ｎＭ及び２０ｎＭ）ではあるが、β−１サブユニット及びβ−２サブユニットのダンシルＡｈｘ3Ｌ3ＶＳ標識も低減する。これに対して、より高用量のボルテゾミブによるＭＭ．１Ｓの処理は、β−２サブユニットを抑制しない（データは示されていない）。総合すると、これらの発見は、ＭＭ細胞中での３つのプロテアソーム活性すべてを阻害する式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の能力を実証する。
【実施例６】
【００７８】
ＭＭ細胞生存度に及ぼす作用
製造業者の取扱説明書（Roch Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）に従って、
そしてChauhan, D., Catley, L., Hideshima, T., Li, G., Leblanc, R., Gupta, D., Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R.L., Podar, K., Weller, E., Munshi, N. &
Anderson, K.C. (2002) Blood 100, 2187-94に記載されているように（これらはその全
体において参照により本明細書中で援用される）、臭化３−（４，５−ジメチルチオゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ；Chemicon International
Inc., Temecula, CA）検定により、細胞生存度を評価した。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の
化合物による２４時間のＭＭ．１Ｓ（−■−）、Ｄｅｘ耐性ＭＭ．１Ｒ（−□−）、ＲＰＭＩ−８２２６（−●−）、ドキソルビシン耐性Ｄｏｘ−４０（−◆−）、ＯＰＭ２（−○−）及びＵ２６６（−◇−）細胞の処理後の細胞生存度を図５Ａに示す。結果は、３つの個々の実験からの平均±ＳＤである（Ｐ＜０．００５；すべての細胞株に関してｎ＝３）。すべての細胞株における細胞生存度の用量依存性の有意の低減が観察された（ＩＣ50範囲７〜２４ｎＭ）。
【００７９】
精製した患者ＭＭ細胞に関しても、細胞生存度を評価した。Ｄｅｘ、ボルテゾミブ及びサリドマイドを含めた複数の従来療法後に再発している９人のＭＭ患者から新たに単離された腫瘍細胞を、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（１０ｎＭ）で２４時間処理し、アポトーシスに関して分析した。図５Ｂに示すように、ＤＮＡ断片化検定により測定されるような有意のアポトーシスをこれらの細胞において観察した（Ｐ＜０．００５；ｎ＝２）。プロット値は、三重反復実験試料の平均±ＳＤである。重要なことに、実験した患者９人のうち４人はボルテゾミブ療法に対して難治性であり、５人はサリドマイド及びＤｅｘ療法に対して耐性であった。これらのデータは、１）式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は従来の治療及びボルテゾミブ療法に感受性及び耐性のＭＭ細胞においてアポトーシスを誘導し；そして２）ＭＭ細胞に関する化合物のＩＣ50はナノモル濃度内であることを示唆する。
【実施例７】
【００８０】
骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）生存度に及ぼす作用
ＭＭ細胞は主として骨髄微小環境中に局在し、ＢＭＳＣとのそれらの相互作用はＭＭ細胞の増殖を媒介し、且つ薬剤誘導性アポトーシスに対して防御するサイトカインの産生を誘導する（Anderson, K.C. (2003) Cancer 97, 796-801（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって５人の患者ＭＭ由来のＢＭＳＣに及ぼす式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の作用を確定した。図６に示すように、ＤＮＡ断片化検定により立証されるようなこれらの細胞におけるアポトーシスを、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（２０ｎＭ）による２４時間のＢＭＳＣ（患者番号１〜５）の処理は誘導しない。示した陽性対照は、検定に関する内部対照である。５人のＭＭ患者のうちの２人から精製したＭＭ細胞（ＣＤ１３８＋）も同じ実験内で調べた。結果は、三重反復実験試料からの平均±ＳＤである。化合物は、精製（ＣＤ１３８陽性）患者ＭＭ細胞のアポトーシスの有意の（１０〜１２倍）増大を誘発した。これらの結果は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がＭＭ細胞に直接的に作用するが、ＢＭＳＣには直接的に作用しないことを示唆する。
【実施例８】
【００８１】
組換えヒトインターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６）及び組換えヒトインスリン様成長因子−Ｉ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）抗アポトーシス薬の作用
ＢＭＳＣへのＭＭ細胞の付着は、ＢＭＳＣからのＩＬ−６及びＩＧＦ−Ｉ分泌を誘導し、これはＭＭ細胞の増殖を調節するだけでなく、化学療法に対して防御する（Hardin, J., MacLeod, S., Grigorieva, I., Chang, R., Barlogie, B., Xiao, H. & Epstein, J. (1994) Blood 84, 3063-70及びChauhan, D., Kharbanda, S., Ogata, A., Urashima, M., Teoh, G., Robertson, M., Kufe, D.W. & Anderson, K.C. (1997) Blood 89, 227-234（こ
れらは共にその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって、ｒｈＩＬ−６又はｒｈＩＧＦ−Ｉが式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘導されるＭＭ細胞におけるアポトーシスを抑制するか否かを評価した。ｒｈＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）又はｒｈＩＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）又はＤｅｘ（０．５μＭ）で２４時間、ＭＭ．１Ｓ細胞を処理した。２４時間目に細胞を回収し、ＭＴＴ検定により生存度を分析した。図７に示すように、平均細胞生存度は、化合物単独での処理後では４７±２．３％；化合物＋ｒｈＩＬ−６では５１．２±３．２％（Ｐ＝０．２６、ウィルコクソン試験）及び化合物＋ｒｈＩＧＦ−Ｉでは５０．３％±２．０％（Ｐ＝０．２８）であった。平均生存度は、Ｄｅｘでの処理後で５１±２．１％、Ｄｅｘ＋ｒｈＩＬ−６に関しては９２±５．５％（Ｐ＝０．０５、片側ウィルコクソン順位和試験により測定した場合）であった。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである。これらの発見は、ＩＬ−６もＩＧＦ−Ｉも式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の抗ＭＭ活性を阻害しないことを示唆する。これに対して、他の試験では、ＩＬ−６及びＩＧＦ−Ｉは共にＤｅｘ誘導性低減化ＭＭ．１Ｓ細胞生存度を阻害する（Chauhan, D., Hideshima, T. & Anderson, K.C. (2003) Int J Hematol 78, 114-20及びMitsiades, C.S., Mitsiades, N., Poulaki, V., Schlossman, R., Akiyama, M., Chauhan, D., Hideshima, T., Treon, S.P., Munshi, N.C., Richardson, P.G. & Anderson, K.C. (2002) Oncogene 21, 5673-83（これらは共にその全体において参照により本明細書中で援
用される）参照）。したがって、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、ＭＭ細胞に及ぼすＩＬ−６及びＩＧＦ−Ｉの増殖及び防御作用を克服し、ＭＭ細胞に対するこの化合物及びＤｅｘに関して異なる作用メカニズムを示すことをデータは示唆する。高血清レベルのＩＬ−６は、ＩＬ−６又はＩＧＦ−Ｉの存在下でさえＭＭ細胞アポトーシスを誘導する、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の能力と結びつけられる臨床的化学耐性及び治療の失敗をもたらすという報告は、この化合物が進行型ＭＭを有する患者における薬剤耐性を克服し得ることを示唆する（Kyrstsonis, M.C., Dedoussis, G., Baxevanis, C., Stamatelou, M. & Maniatis, A. (1996) Br J Haematol 92, 420-422（これはその全体において参照に
より本明細書中で援用される）参照）。
【実施例９】
【００８２】
ＭＭ細胞の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導性移動に及ぼす影響
ＶＥＧＦは骨髄微小環境中で増大され、ＭＭ細胞における移動、増殖及び新血管形成を誘発する（Podar, K., Tai, Y.T., Lin, B.K., Narsimhan, R.P., Sattler, M., Kijima, T., Salgia, R., Gupta, D., Chauhan, D. & Anderson, K.C. (2002) J Biol Chem 277, 7875-81（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がＭＭ細胞のＶＥＧＦ誘導性移動を変えるか否かを評価した。この化合物（７又は１０ｎＭ）の存在下又は非存在下で、ＶＥＧＦ誘導性移動を実験した。Podar, K., Tai, Y.T., Davies, F.E., Lentzsch, S., Sattler, M., Hideshima, T., Lin, B.K., Gupta, D., Shima, Y., Chauhan, D., Mitsiades, C., Raje, N., Richardson, P. & Anderson, K.C. (2001) Blood 98, 428-35（これはその全体において参照により本明細書中で援用される）でこれまでに記載されるように細胞移動を検定した。図８に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、ＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞のＶＥＧ
Ｆ誘導性移動を有意に（Ｐ＜０．０５）低減させる。これらの発見は、この化合物が、骨髄へのＭＭ細胞の回帰(horming)及び末梢血中へのそれらの放出(egress)の両方を負に調
節し得ることを示す。
【実施例１０】
【００８３】
Ｂｃｌ２媒介性防御作用に及ぼす影響
Ｂｃｌ２は、癌細胞、例えばＭＭにおいて従来の治療に対する耐性を付与する（Cory, S.
& Adams, J.M. (2002) Nat Rev Cancer 2, 647-56及びGazitt, Y., Fey, V., Thomas, C. & Alvarez, R. (1998) Int J Oncol 13, 397-405（これらはその全体において共に参照により本明細書中で援用される）参照）。Ｂｃｌ２は、ボルテゾミブ誘導性アポトーシスを適度に減衰し得る。したがってＭＭ．１Ｓ細胞のＢｃｌ２の異所性発現が式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物に対する応答性に影響を及ぼすか否かを評価した。ＭＭ．１Ｓ細胞を安定的にＢｃｌ２構築物でトランスフェクトして、ＭＴＴ検定を用いて細胞生存度の変化に関して分析した。図９に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、用量依存的に、Ｂｃｌ２トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞の細胞生存度を有意に低減する（Ｐ＜０．００５）。それにもかかわらず、この化合物は、エンプティーベクター(empty vector
：空ベクター)トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞と比較して、１５±１．１％低いＢｃ
ｌ２トランスフェクト化細胞の細胞死を誘導した。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである。これらの発見は、この化合物がＢｃｌ２媒介性防御を克服し得ることを示唆する。
【実施例１１】
【００８４】
マウス腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏ評価
６週齢の三重免疫欠損ベージュ・ヌード・ｘｉｄ（ＢＮＸ）マウスを、Frederick Cancer
Research and Development Center （Frederick, MD）から入手した。動物試験はすべて、Animal Ethics Committee of the Dana-Farber Cancer Instituteにより認可されたプ
ロトコルに従って実行した。毒性の徴候に関して、マウスを毎日観察した。イソフロウラン（isoflourane）吸入を用いて麻酔下で末端放血を実行し、ＣＯ2窒息により動物を屠殺した。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物のｉｎ ｖｉｖｏ抗ＭＭ活性を測定するために、
２１匹のＢＮＸマウスに、ＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｌ中の３×１０7個のＲＰＭ
Ｉ８２２６ＭＭ細胞を側腹部に皮下接種した。腫瘍が測定可能になったら、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物０．２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）を摂取する処理群又はビヒクルのみを摂取する対照群（ｎ＝７）にマウスを割り当てた。測定可能腫瘍の発現後に、薬剤処理を開始した。薬剤（０．２５ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇ）を、週２回、経口的に投与した。垂直直径の連続的なカリパスによる測定を１日おき
に実行して、以下の式：４／２４×（最小直径）２×（最大直径）を用いて腫瘍容積を算定した。腫瘍が２ｃｍ以上になるか、又は壊死性になった場合、動物を屠殺した。腫瘍増殖試験のために、７匹のマウスを各群で用いた。
【００８５】
図１０Ａ〜Ｃに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物による腫瘍保有マウスの処理は有意にＭＭ腫瘍増殖を抑制し、これらのマウスを延命させるが、ビヒクル単独ではそうではなかった。対照群のマウスはすべて進行性腫瘍を発症したが、一方、処理マウスの７０％において腫瘍の完全退行が観察された。図１０Ｂの上方パネルのマウスは経口用量のビヒクル単独を摂取したが、一方、下方パネルのマウスは式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を摂取した。図１０Ｂの左側のパネルは、マウスの右側腹部で増殖中の皮下形質細胞腫の拡大である。処理の第１日から死亡まで、生存率を評価した；マウスの腫瘍直径が２ｃｍに達するか、又はそれらが瀕死状態になった時に、マウスを屠殺した（図１０Ｃ）。さらに処理１２週間後でさえ、神経学的行動変化は観察されなかった。投与された化合物の濃度はマウスにより良好に耐容され、体重損失の徴候はなかった。未処理及び処理群の両方のマウスを、毎週計量した。マウス体重の平均変化を、図１０Ｄに示す。
【００８６】
３００日目の分析は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物処理マウスの５７％において腫瘍の再発が認められないことを示した（図１０Ｃ）。さらに、接種部位で実施した組織学的分析は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物処理マウス対ビヒクル処理マウスにおける形質細胞の消失を確認した（それぞれ図１０Ｅの左側のパネル及び右側のパネル）。これらのデータは、この化合物は経口的に活性であり、ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＭ腫瘍増殖を抑制し
、延命させることを示す。
【実施例１２】
【００８７】
ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の比較分析
式（ＩＩ）の化合物及びボルテゾミブのｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較するために、上記のよ
うなマウスモデルを、週に２回、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（０．１５ｍｇ／ｋｇ（静脈内））又はボルテゾミブ（１．０ｍｇ／ｋｇ（静脈内））で処理した。両方の薬剤は有意に腫瘍進行を低減し（ｐ＜０．０１）、延命させた（ｐ＝０．０１３７）（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）。
【実施例１３】
【００８８】
抗ＭＭ活性を媒介するメカニズム
ミトコンドリアは、ストレス中のアポトーシス誘導に重要な役割を果たす（Bossy-Wetzel, E. & Green, D.R. (1999) Mutat Res 434, 243-51及びChauhan, D. & Anderson, K.C. (2003) Apoptosis 8, 337-43（これらは共に参照により本明細書中で援用される）参照）。血清飢餓ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で１２時間処理し、最後の２０分間ＣＭＸＲｏｓと共にインキュベートし、３７℃で２０分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の親油性陽イオン性染料ＣＭＸＲｏｓ（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ）（Molecular Probes, Eugene, OR）で染色し、フローサイトメトリーにより
分析して、ΔΨｍ（ミトコンドリア膜電位）の変化に関して検定した。最後の１５分間、膜透過性染料ジヒドロエチジウム（ＨＥ）で細胞を染色することにより、スーパーオキシド（Ｏ2-）産生を測定した。スーパーオキシドアニオンはＨＥを蛍光エチジウムに酸化し、フローサイトメトリーによる分析を可能にする。
【００８９】
図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物はΔΨｍを低減し（ＣＭＸＲｏｓ陰性細胞数の増加（Ｐ＜０．００５、ｎ＝２）により立証される）、ＭＭ．１Ｓ細胞におけるＯ2-産生を誘発する。結果は、２つの個々の実験の平均±ＳＤである。ΔΨｍの変化は、サイトゾルへのミトコンドリアタンパク質ｃｙｔｏ−ｃ及びＳｍａｃ
の放出と、それによるカスパーゼ９及びカスパーゼ３の誘発に関連する（Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L. & Wand, X. (2000) Cell 102, 33-42及びLiu, X., Naekyung Kim, C., Yang, J., Jemmerson, R. & Wang, X. (1996) Cell 86, 147-157（これらはその全体
において共に参照により本明細書中で援用される）参照）。
【００９０】
図１１Ｃに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物によるＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、ミトコンドリアｃｙｔｏ−ｃ（上方、左側のパネル）及びｓｍａｃ（上方、右側のパネル）の低減、並びにサイトゾル画分中のこれらのタンパク質の同時増大を誘発する（それぞれ中央のパネル、左側のパネル及び右側のパネル）。抗Ｈｓｐ６０（下方、左側のパネル）及び抗チューブリン（下方、右側のパネル）抗体による免疫ブロットの再プローブ化は、ミトコンドリア抽出物の精製並びにタンパク質の等負荷を確認する。ミトコンドリアアポトーシス誘導タンパク質ｃｙｔｏ−ｃ及びＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出は、カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３の活性化を誘導する。ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で２４時間処理し、回収し、ミトコンドリア及びサイトゾルタンパク質画分を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、抗ｃｙｔｏ−ｃ（上方のパネル）又は抗Ｓｍａｃ（中央のパネル）抗体での免疫ブロット法により分析した。タンパク質の等負荷及びミトコンドリア画分の純度に関する対照として、ぞれぞれ抗チューブリン（下方右側のパネル）及び抗Ｈｓｐ６０抗体（下方左側のパネル）を用いてフィルターも再プローブ化した。ブロットは、３つの個々の実験を代表するものである。
【００９１】
ＭＭ．１Ｓ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で２４時間処理し、回収し、サイトゾルタンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、抗カスパーゼ−８抗体及び抗カスパーゼ−９抗体での免疫ブロット法により分析した。図１１Ｄに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物によるＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、カスパーゼ−９のタンパク質分解性切断を誘導する。さらにこの化合物は、カスパーゼ−８も活性化する（図１１Ｅ）。カスパーゼ−９（ミトコンドリア依存性）及びカスパーゼ−８（ミトコンドリア非依存性）は共に、一般的な下流のエフェクター、カスパーゼ−３をタンパク質分解的に切断し、活性化して、ＰＡＲＰ切断を生じることが既知である（Miller, L.K. (1999) Trends Cell Biol 9, 323-8（これはその全体において参照により本明細書中で援用
される）参照）。したがって、ＭＭ．１Ｓ又はＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝
Ｃｌ）の化合物（７ｎＭ）で２４時間処理し、ＰＡＲＰ及びカスパーゼ−３切断検定の両方によりアポトーシスに関して評価した。全タンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。抗ＰＡＲＰ（上方のパネル）又は抗カスパーゼ−３（下方のパネル）抗体を用いて、溶解物の免疫ブロット分析を実施した。「ＦＬ」は「全長」を示し、「ＣＦ」は切断断片を意味する。このデータはさらに、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物がカスパーゼ−３及びＰＡＲＰ切断を誘発することを示す（図１１Ｆ）。
【００９２】
チトクローム−ｃ、Ｓｍａｃ、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９又はカスパーゼ−３（Cell Signaling, Beverly, MA）、チューブリン（Sigma, St. Louis, MO）、ＰＡＲＰ、Ｈ
ｓｐ６０又はＢａｘ（BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA）に対する抗体を用い
て、免疫ブロット分析を実施した。増感化学発光（ＥＣＬ；Amersham Arlington Heights, IL）により、ブロットを現像した。
【実施例１４】
【００９３】
ボルテゾミブと比較した、ＭＭ細胞のアポトーシスの機構的差異
カスパーゼ−９阻害薬（ＬＥＨＤ−ＦＭＫ）、カスパーゼ−８阻害薬（ＩＥＴＤ−ｆｍｋ）又はカスパーゼ−３阻害薬（Ｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）の存在下又は非存在下で、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブでＭＭ．１Ｓ細胞を処理した。図１２Ａに示すように、カスパーゼ−３阻害は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブ誘導性アポトーシスの両方を顕著に抑
制する。結果は、４つの個々の実験の平均±ＳＤである（Ｐ＜０．００４）。カスパーゼ−８の阻害は式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘発される細胞死の有意の低減をもたらした（Ｐ＜０．００５、ｎ＝４）が、一方、カスパーゼ−９のみの阻害はこの化合物により誘発されるＭＭ．１Ｓ細胞の生存度の低減を中等度に阻害した。これに対して、ＭＭ．１Ｓ細胞におけるボルテゾミブ誘導性の生存度の低減は、カスパーゼ−８阻害薬又はカスパーゼ−９阻害薬の存在下で等しく阻害される（Ｐ＜０．００５）。同時に、これらのデータは、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９の活性化はボルテゾミブ誘発性の細胞死中に等しく一因となるが、一方、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘発されるアポトーシスは主にカスパーゼ−８シグナル伝達経路を経由して進行することを示唆する。
【００９４】
優性−陰性（ＤＮ）戦略を用いた遺伝子試験により、これらの生化学的データを確認した。ベクター単独、ＤＮ−カスパーゼ−８、ＤＮ−カスパーゼ−９又はＤＮ−ＦＡＤＤを用いて製造業者の取扱説明書（Amaxa Biosystems, Germany）に従って、細胞株Ｎｕｃｌｅ
ｏｆｅｃｔｏキットＶを用いてＭＭ．１Ｓ細胞を一過的にトランスフェクトし、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）単独を含有するベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクト後、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーにより選択し、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブで処理し、生存度に関して分析した。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（ＩＣ５０、７ｎＭ）によるＤＮ−カスパーゼ−８トランスフェクト化ＭＭ細胞の処理は、ＤＮ−カスパーゼ−９でトランスフェクトされた細胞と比較して、これらの細胞の生存を顕著に増大させた（図１２Ｂ）。これに対して、ボルテゾミブ（ＩＣ５０、５ｎＭ）を用いたＤＮ−カスパーゼ−８又はＤＮ−カスパーゼ−９トランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、生存を同程度に増大させた。これらの細胞中のカスパーゼ−９（Ｄｅｘ）及びカスパーゼ−８の既知の誘導物質（抗Ｆａｓ ＭｏＡｂ）（Chauhan他, 1997）を用いたＭＭ．１Ｓ細胞の処理により、ＤＮ−カスパーゼ−８又はＤＮ−カスパーゼ−９の機能的特異性を確認した（図１２Ｃ）。これらのデータは、（１）式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性ＭＭ細胞アポトーシスは主にカスパーゼ−８により媒介され；そして（２）ボルテゾミブ誘導性アポトーシスはカスパーゼ−８及びカスパーゼ−９活性化の両方を必要とすることを示唆する。
【００９５】
次に、カスパーゼ−８活性化をもたらす上流シグナル伝達経路の抑制が式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブに対する応答に影響を及ぼすか否かを確定した。Ｆａｓ会合デスドメイン（ＦＡＤＤ）タンパク質は、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー、例えばＦａｓの結合時に集合して、プロカスパーゼ−８のタンパク質分解性プロセシング及び自己活性化を生じる死誘導性シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の重要な部分である。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブは共にカスパーゼ−８活性化を誘発するため、ＭＭ細胞中でのこの事象の間のＦＡＤＤの役割を、ＤＮ−ＦＡＤＤを用いて評価した。ＤＮ−ＦＡＤＤによるＦＡＤＤの阻害は、エンプティーベクタートランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞と比較して、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性細胞傷害性を有意に減衰した（ベクタートランスフェクト化細胞における生存可能細胞４２％±２．０％対ＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化細胞における生存可能細胞７６％±５．１％；ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。ＤＮ−ＦＡＤＤは、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性カスパーゼ−８活性化を低減させた。しかしながら最小量のカスパーゼ−８活性化は依然として認められ（データは示されていない）、これはＦＡＤＤ以外のカスパーゼ−８の上流活性化因子によるものであり得る。ボルテゾミブによるＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化ＭＭ．１Ｓ細胞の処理は、ベクタートランスフェクト化細胞と比較して生存率が１６％だけ増大させたことは重要であった（ベクタートランスフェクト化細胞における生存可能細胞３９％±２．４％対ＤＮ−ＦＡＤＤトランスフェクト化細胞における生存可能細胞５５％±４．１％；ｐ＜０．０５）（図１２Ｄ）。これらのデータは、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９阻害試験と結びつけて考えると、式（ＩＩ）の化合物がボルテゾミブより強くＦＡＤＤ−カスパーゼ−８シグナル伝達軸に依存していることを示唆し、これはさらに、ＭＭ
細胞中での式（ＩＩ）の化合物対ボルテゾミブの作用の示差的メカニズムを確認する。
【００９６】
Ｂａｘはミトコンドリア・アポトーシス経路を誘導することを従来の試験は確立している（Wei, M.C., Zong, W.X., Cheng, E.H., Lindsten, T., Panoutsakopoulou, V., Ross, A.J., Roth, K.A., MacGregor, G.R., Thompson, C.B. & Korsmeyer, S.J. (2001) Science 292, 727-30及びLei, K., Nimnual, A., Zong, W.X., Kennedy, N.J., Flavell, R.A., Thompson, C.B., Bar-Sagi, D. & Davis, R.J. (2002) Mol Cell Biol 22, 4929-42（
これらは共にその全体において参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物により誘導されるＭＭ細胞アポトーシスがＢａｘの変化と相関するか否かを評価した。ＭＭ．１Ｓ ＭＭ細胞を式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物
又はボルテゾミブで処理し、ミトコンドリアタンパク質抽出物を抗Ｂａｘ又は抗Ｈｓｐ６０抗体を用いた免疫ブロット分析に供した。図１２Ｅに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、ミトコンドリア中のＢａｘレベルの増大を、例えあったとしても、ほとんど誘導しない。ブロットは、３つの個々の実験を代表する。ボルテゾミブがミトコンドリア中のＢａｘの有意な蓄積を誘発することは重要である。
【００９７】
野生型Ｂａｘ又はノックアウトを保有するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブで４８時間処理し、ＭＴＴ検定により細胞生存度に関して分析した。図１２Ｆに示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物はＢａｘ（ＷＴ）及びＢａｘ（ノックアウト）の両方の生存度を低減させるが、一方、Ｂａｘの欠失はボルテゾミブに対する有意な耐性を付与する。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである（Ｐ＜０．０５）。これらのデータは、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブにより誘導されるアポトーシス中のＢａｘの示差的要求を示し、これらの薬剤の異なる作用メカニズムを示唆する。
【実施例１５】
【００９８】
ボルテゾミブと比較した場合の正常リンパ球に及ぼす示差的影響
ボルテゾミブ療法は、患者における毒性と関連している。したがって正常細胞に及ぼす式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブの影響を比較した。５人の健常ドナーからのリンパ球を、種々の濃度（０〜２０ｎＭ）の式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物又はボルテゾミブ（０〜２０ｎＭ）で７２時間処理し、ＭＴＴ検定により細胞傷害性に関して分析した。図１３に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は、より高い用量（２０ｎＭ）でさえ、正常リンパ球の生存を有意に低減しない（Ｐ＝０．２７、Ｊ−Ｔ傾向検定から）。結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである。これに対して、ボルテゾミブは、６〜１０ｎＭの低濃度でさえ、リンパ球の生存度を有意に低減させる。患者ＭＭ細胞のＩＣ50は、正常リンパ球に影響を及ぼさない式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物の濃度で達成されるが、一方、ＭＭ細胞に関するボルテゾミブのＩＣ50は正常リンパ球の生存度の５０％の低減を誘発することは注目すべきである。同時に、これらのデータは、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は選択的な抗ＭＭ活性を有し、特に、それはボルテゾミブより正常細胞に対して低毒性であることを示唆する。
【００９９】
式（ＩＩ）の化合物又はボルテゾミブが正常リンパ球及び皮膚線維芽細胞におけるプロテアソーム活性を変えるか否かにおいても調べた。式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブは、これらの細胞におけるプロテアソーム活性を有意に阻害した。２０ｎＭの式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物及びボルテゾミブは、キモトリプシン様プロテアソーム活性のそれぞれ９９％又は５９±１１％の阻害を誘発した（データは示されていない）。したがって２０ｎＭの式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物は正常リンパ球における有意の細胞傷害性を誘発しなかったが、これらの細胞中でのキモトリプシン様プロテアソーム活性を低減させた。同様に、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物（３１７ｎＭ）又はボルテゾミブ（１５ｎＭ）に関するＩＣ50での正常ＣＣＤ−２７ｓｋ線維芽細胞の処理も、プロテア
ソーム活性を阻害した（データは示されていない）。
【実施例１６】
【０１００】
ボルテゾミブと比較した場合のＢｃｌ−２過剰発現ＭＭ細胞に及ぼす示差的影響
アポトーシス中、ＢａｘはＢｃｌ−２の抗アポトーシス機能を中和し、それによりｃｙｔｏ−ｃ放出及びカスパーゼ−９活性化を促す。Ｂｃｌ−２は、癌細胞、例えばＭＭにおける薬剤耐性を付与し、ボルテゾミブ誘導性致死に対する部分的防御を提供する。したがってＭＭ．１Ｓ細胞におけるＢｃｌ−２の異所性発現が、ＭＭ細胞における細胞傷害性及び後ミトコンドリア・アポトーシスシグナル伝達を誘発する式（ＩＩ）の化合物又はボルテゾミブの能力に影響を及ぼすか否かを評価した。Ｂｃｌ−２の過剰発現は、両方の薬剤で処理された細胞の生存度の適度の増大を促進した：式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物に関しては、Ｂｃｌ−２トランスフェクト化細胞の生存度５０％±２．６％対ベクタートランスフェクト化細胞の生存度３９％±１．５％（ｐ＜０．０５）；及びボルテゾミブに関しては、Ｂｃｌ−２トランスフェクト化細胞の生存度６１％±２．９％対ベクタートランスフェクト化細胞の生存度４０％±２．１％（ｐ＜０．０５）（図１４Ａ）。ボルテゾミブに応答するＢｃｌ−２トランスフェクト体の生存増大は、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物に応答するもの（１１％）より大きかった（２１％）（ｐ＜０．０４；ｎ＝３）（図１４Ａ）。さらにボルテゾミブは対照ベクタートランスフェクト化細胞における有意なカスパーゼ−９切断を誘発したが、これは、Ｂｃｌ−２−トランスフェクト化細胞では顕著に減衰される（濃度計で３倍低減）。これに対して、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物誘導性カスパーゼ−９切断は、Ｂｃｌ−２過剰発現により最小限に影響される（図１４Ｂ）。これらの発見は、生存度結果と合わせて考えると、Ｂｃｌ−２は式（ＩＩ）の化合物より多くのボルテゾミブに対する防御を提供することを示唆する。
【実施例１７】
【０１０１】
組合せ治療
図１５に示すように、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物をボルテゾミブと組合せて用いた２４時間のＭＭ．１Ｓ又はＭＭ．１Ｒ ＭＭ細胞の処理は、相乗的増殖抑制を誘導する。
結果は、３つの個々の実験の平均±ＳＤである（Ｐ＜０．００５）。「ＣａｌｃｕＳｙｎ」ソフトウエアプログラム（Biosoft, Ferguson, MO及びCambridge, UK）によるアイソボログラム分析を用いて、式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の抗ＭＭ薬剤及びボルテゾミブ間の相互作用を分析した。細胞生存度検定（ＭＴＴ）のデータを、薬剤処理細胞対未処理細胞において増殖が影響された細胞の画分（ＦＡ）として表した。ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムは、以下の方程式：「ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２＋（Ｄ）１（Ｄ）２／（Ｄｘ）１（Ｄｘ）２」（式中、（Ｄ）１及び（Ｄ）２は、組合せて用いた場合に×作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量であり、（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は、単独で用いた場合に、同じ×作用を有する薬剤１及び薬剤２の用量である）に従ってチョウ・タラレイ法に基づいている。ＣＩ＝１である場合、この方程式は保存アイソボログラムを表し、相加的作用を示す。１．０未満のＣＩ値は、相乗的作用を示す。ボルテゾミブ＋ＮＰＩ−００５２に関して１．０未満の組合せ指数（ＣＩ）を得たが、これは相乗的作用を示す。さらに、他の治療計画というよりむしろ、併用して投与された場合、最大の抗ＭＭ活性を得た。低用量の式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物とボルテゾミブとの併用は、正常ＰＢＭＮＣの生存度に有意に影響を及ぼさない（データは示されていない）。したがってボルテゾミブと式（ＩＩ）（Ｘ＝Ｃｌ）の化合物とによる組合せ療法は、１）毒性以下(sub-toxic)濃度の各薬剤の使用を可能にし、２）薬剤耐性の発現を遅延するか又は防止し、３
）これらの薬剤の相乗的用量の増大を可能にして、アポトーシス閾値を増大させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬であって、式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含み、該腫瘍性疾患が少なくとも１つの他の化学療法剤に耐性である、医薬。
【請求項２】
Ｘが塩素である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化２】
の構造を有する、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記腫瘍性疾患が癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
前記癌が乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から成る群から選択される、請求項４
に記載の医薬。
【請求項６】
前記癌が多発性骨髄腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌又は黒色腫から成る群から選択される、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記患者がヒトである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬であって、少なくとも１つの付加的な化学療法剤と組合わせて、式（Ｉ）：
【化３】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬。
【請求項１０】
Ｘが塩素である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化４】
の構造を有する、請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
前記腫瘍性疾患が癌である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１３】
前記癌が乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から成る群から選択される、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
前記癌が多発性骨髄腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌又は黒色腫から成る群から選択される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
前記患者がヒトである、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１７】
前記他の化学療法剤がデキサメタゾンである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１８】
前記他の化学療法剤がサリドマイドである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１９】
前記組合せが相乗的である、請求項９〜１８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２０】
前記組合せが相加的である、請求項９〜１８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２１】
式（Ｉ）：
【化５】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、並びに少なくとも１つの付加的化学療法剤を含む薬学的組成物。
【請求項２２】
Ｘが塩素である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化６】
の構造を有する、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記他の化学療法剤がデキサメタゾンである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記他の化学療法剤がサリドマイドである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
式（Ｉ）：
【化７】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、プロテアソーム阻害薬の相乗的組合せを含む、腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬。
【請求項２７】
前記腫瘍性疾患が癌である、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
前記癌が乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、
胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から成る群から選択される、請求項２７に記載の医薬。
【請求項２９】
前記癌が多発性骨髄腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌又は黒色腫から成る群から選択される、請求項２８に記載の医薬。
【請求項３０】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項２９に記載の医薬。
【請求項３１】
前記患者がヒトである、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３２】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化８】
の構造を有する、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１】
腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬であって、式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含み、該腫瘍性疾患が少なくとも１つの他の化学療法剤に耐性である、医薬。
【請求項２】
Ｘが塩素である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化２】
の構造を有する、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記腫瘍性疾患が癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
前記癌が乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から成る群から選択される、請求項４
に記載の医薬。
【請求項６】
前記癌が多発性骨髄腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌又は黒色腫から成る群から選択される、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記患者がヒトである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬であって、少なくとも１つの付加的な化学療法剤と組合わせて、式（Ｉ）：
【化３】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬。
【請求項１０】
Ｘが塩素である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化４】
の構造を有する、請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
前記腫瘍性疾患が癌である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１３】
前記癌が乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から成る群から選択される、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
前記癌が多発性骨髄腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌又は黒色腫から成る群から選択される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
前記患者がヒトである、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１７】
前記他の化学療法剤がデキサメタゾンである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１８】
前記他の化学療法剤がサリドマイドである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１９】
前記組合せが相乗的である、請求項９〜１８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２０】
前記組合せが相加的である、請求項９〜１８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項２１】
式（Ｉ）：
【化５】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、並びに少なくとも１つの付加的化学療法剤を含む薬学的組成物。
【請求項２２】
Ｘが塩素である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化６】
の構造を有する、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記他の化学療法剤がデキサメタゾンである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記他の化学療法剤がサリドマイドである、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
式（Ｉ）：
【化７】
（式中、Ｘはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群から選択される）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、プロテアソーム阻害薬の相乗的組合せを含む、腫瘍性疾患患者における腫瘍性疾患を治療するための医薬。
【請求項２７】
前記腫瘍性疾患が癌である、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
前記癌が乳癌、肉腫、白血病、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、
胃癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、内分泌癌、皮膚癌、黒色腫、血管腫、及び脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）癌から成る群から選択される、請求項２７に記載の医薬。
【請求項２９】
前記癌が多発性骨髄腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌又は黒色腫から成る群から選択される、請求項２８に記載の医薬。
【請求項３０】
前記癌が多発性骨髄腫である、請求項２９に記載の医薬。
【請求項３１】
前記患者がヒトである、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項３２】
前記式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
【化８】
の構造を有する、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の医薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−２３６８６２（Ｐ２０１２−２３６８６２Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１９８２６３（Ｐ２０１２−１９８２６３）
【出願日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【分割の表示】特願２００７−５４４５４５（Ｐ２００７−５４４５４５）の分割
【原出願日】平成１７年１２月２日（２００５．１２．２）
【出願人】（５０７１８３９５２）ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【分割の表示】特願２００７−５４４５４５（Ｐ２００７−５４４５４５）の分割
【原出願日】平成１７年１２月２日（２００５．１２．２）
【出願人】（５０７１８３９５２）ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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