自己免疫疾患を治療するためにＢヘルパーＴ細胞を減少させる方法
本発明は、薬学的に許容される担体及び少なくとも１つのＩＬ−１２阻害剤、例えば遮断抗ＩＬ−１２抗体又はその断片を含む有効量の治療組成物を、自己免疫障害を有する対象に投与することによって自己免疫疾患を治療するための組成物及び方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、免疫応答をモジュレートする分野、より具体的には、ＢヘルパーＴ細胞の活性を減少させることによって自己免疫疾患を診断、予防及び治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、この背景技術は自己免疫応答に対する治療に関連して記載する。
【０００３】
多くの化学及び生物学的免疫治療法が自己免疫障害を治療するために開発されている。典型的に、免疫治療法は、自己免疫障害が始まった後に、例えばステロイド又は抗免疫細胞抗体などの化学剤を用いて免疫応答全体を弱めることによってその自己免疫障害を治療しようと試みられている。例えば、そのような方法の一つは、Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１９及びＣＤ７４又はＨＬＡ−ＤＲ抗原に結合する抗体を投与することによって自己免疫障害を治療する試みである。しかしながら、この抗体は、それらの正常な機能に関係なく全てのＢ細胞を標的とし、標的の自己免疫応答だけでなく免疫応答全体を弱めてしまう。
【０００４】
そのような特許の一つは、Ｂ細胞を標的とする抗体を用いる自己免疫障害の免疫療法に関する、Goldenberg, et al.に発行された米国特許第７，０７４，４０３号明細書である。この特許は、自己免疫障害を治療する効果的手段を提供するための、Ｂ細胞抗原に結合する抗体の使用を教示している。コンジュゲートされ得るか、又は裸（naked）であり得る抗体及び断片が、単独又は多様な治療で使用される。抗体は二重特異性抗体であってもよく、融合タンパク質として、又はハイブリッド、多特異性抗体として組換えによって産生されてもよい。
【０００５】
Ways, et al.に発行された米国特許第６，１０３，７１３号明細書は、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害することによる自己免疫疾患の治療的処置、並びにアイソザイム選択的ＰＫＣ阻害剤：（Ｓ）−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（（２’’−エトキシ）−３’‘‘（Ｏ）−４’‘‘−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−（３，３’−インドリル）］−１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオン及びその薬学的に許容される塩を用いる自己免疫疾患及び／又は疾患の兆候の治療を教示している。
【０００６】
別の例は、自己免疫障害又は炎症性障害を予防及び治療するためにＣＤ２アンタゴニストを投与／投薬する方法に関する、Dingivanによって出願された米国特許出願公開第２００７００２５９９０号明細書である。その出願は、１又は２以上のＣＤ２アンタゴニストを用いて対象における自己免疫障害又は炎症性障害を予防又は治療するための組成物、及び１又は２以上のＣＤ２結合分子を対象に投与することによってその対象における自己免疫障害又は炎症性障害を予防又は治療するための方法を教示している。この発明は、ＣＤ２結合分子の投薬及び末梢血リンパ球の枯渇を誘導する薬剤の投与に関連する有害作用又は望ましくない副作用を回避又は減少させながら改善された効果を生じる投与方法を提供している。
【０００７】
さらに別の出願は、可溶性ＣＴＬＡ４分子及びＤＭＡＲＤ又はＮＳＡＩＤを用いて自己免疫疾患を治療する方法に関する、Cohen, et al.によって出願された米国特許出願公開第２００４００２２７８７号明細書である。手短に述べると、内因性Ｂ７分子がそれらのリガンドに結合することを遮断する可溶性ＣＴＬＡ４分子を単独で、又は疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ，Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug）を含む他の薬剤と組み合わせて、対象に投与することにより、リウマチ性疾患などの免疫系疾患を治療するための組成物及び方法が教示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，０７４，４０３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１０３，７１３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７００２５９９０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４００２２７８７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、免疫応答を調節するため、より具体的には、ＢヘルパーＴ細胞活性を調節するための組成物及び方法を含む。ＩＬ−１２は、免疫グロブリン分泌細胞へのＢ細胞の増殖、成熟及び活性化の主要な調節因子であることが見出されている。ＩＬ−１２が、Ｔ細胞サブセットの発達及び活性化並びにそれらによるＩＬ−２１の分泌を制御することによって、このＴ細胞の主要な集団であるＢヘルパーＴ細胞を調節することが本明細書で実証される。生理学的に、若年性皮膚筋炎（ＪＤＭ，juvenile dermatomyositis）、全身性関節炎（ＳＹＳ，systemic arthritis）、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ，systemic lupus erythematosus）などの自己免疫性抗体を含む自己免疫障害において、それらの自己免疫疾患患者の血液中でＢヘルパーＴ細胞の存在が増加することが本明細書で発見され、実証された。さらに、ＩＬ−１２は、自己免疫疾患を有する患者由来のＴ細胞によるＩＬ−２１の分泌における主要な分子であることが実証された。
【００１０】
本発明は、自己免疫疾患を治療するためにＢヘルパーＴ細胞の数又は活性を減少させるための組成物及び方法を含む。そのような方法の一つは、ＢヘルパーＴ細胞の発達及びそれらによるＩＬ−２１の分泌を阻害するためにＩＬ−１２活性を遮断することを含む。別の方法は、ＣＸＣＲ５を含む、モノクローナル抗体を用いてＢヘルパーＴ細胞の数を減少させる。さらに別の方法は、ＩＣＯＳを遮断することによってＢヘルパーＴ細胞からのＩＬ−２１の分泌を減少させることを含む。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、ＢヘルパーＴ細胞を減少させ、それにより例えばＢ細胞による自己免疫性抗体分泌を減少させるのに十分な量でＩＬ−１２阻害剤を含む有効量の治療組成物を、自己免疫障害を有する対象に投与することによって自己免疫障害を治療するための組成物及び方法を含む。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、少なくとも１つの遮断抗ＩＬ−１２抗体又はその断片を含む。別の態様において、その方法はさらに、薬学的に許容される担体を含む。一実施形態において、ＩＬ−１２阻害剤は、１回当たり１〜１，０００ｍｇの用量で投与されるＩＬ−１２阻害抗体を含む。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤はＩＬ−１２阻害抗体を含み、対象にその抗体を反復用量で与える。さらに別の態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、ヒト以下の霊長類の抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択される抗ＩＬ−１２抗体を含む。別の態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、ＩＬ−１２のＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又は他の核酸阻害剤を含む。
【００１２】
本発明により治療され得る自己免疫疾患の非限定的な例としては、例えば、自己免疫性抗体が自己免疫応答を誘発する自己免疫疾患、例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎（thromboangitis ubiterans）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎及び線維性肺胞炎が挙げられる。本発明のさらに別の態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞又はマクロファージ又は炎症性サイトカインに対する二次治療薬と共に提供され得る。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、抗原に対する抗原特異的Ｂ細胞応答を高める方法であって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、ＢヘルパーＴ細胞を発達及び活性化させるのに十分な有効量のＩＬ−１２を用いて、抗原負荷した樹状細胞の存在下でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を成熟させるステップとを含み、ＩＬ−１２で処理したＢヘルパーＴ細胞がナノモル量（nanomolar amounts）のＩＬ−２１を分泌する、方法である。一態様において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、負の選択によって末梢血単核細胞から単離される。別の態様において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる。別の態様において、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、癌又は毒素から選択される。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、Ｂ細胞による自己免疫性抗体の分泌によって引き起こされる自己免疫障害のための治療を必要とする疑いのある患者を同定するステップと、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞を阻害するのに十分な量の抗ＩＬ−１２阻害剤で患者を治療するステップとを含む、自己免疫疾患をモジュレートする組成物及び方法を含む。一態様において、抗ＩＬ−１２阻害剤は、抗ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＡｂ又は抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂ、抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂ、抗ＩＬ−１２受容体、可溶性の不活性ＩＬ−１２及びそれらの組合せを含む。別の態様において、抗ＩＬ−１２阻害剤は、ＩＬ−１２受容体アンタゴニストを含む。さらに別の態様において、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は負の選択によって選択される。一態様において、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる。別の態様において、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は、活性化樹状細胞の存在下で活性化される。一態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、関節炎、全身性関節炎及び乾癬性関節炎から選択される。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、自己免疫性抗体の発達の前に自己免疫疾患に感受性である疑いのある対象に提供される。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、ＩＬ−１２の存在下で標的抗原を発現する活性化樹状細胞の存在下でナイーブＣＤ４Ｔ細胞を成熟させるステップとを含む方法によって作製されるＢ細胞ヘルパーＴ細胞であり、成熟したＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は、抗原に応答してナノモル量のＩＬ−２１を放出する。
【００１６】
本発明の別の態様は、ＩＬ−２１分泌ＢヘルパーＴ細胞を、ＩＬ−１２阻害剤を含む組成物に曝露することにより、免疫グロブリン分泌細胞へのＢ細胞の増殖、成熟及び活性化を調節する組成物及び方法を含む。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞によるＩＬ−２１及びＩＦＮ−γの両方の分泌を減少させる。別の実施形態において、本発明は、ナノモル量のＩＬ−２１の放出を誘発するのに十分な量のＩＬ−１２と共にナイーブＣＤ４Ｔ細胞をインキュベートするステップを含む、ＢヘルパーＴ細胞を濃縮する方法を含む。
【００１７】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、ここで、添付された図と共に本発明の詳細な説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＩＬ−１２が、ＩＬ−２１を分泌するようにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図２】ＩＬ−１２で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、免疫グロブリンを生成するようにＢ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図３】ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−２１及びＩＣＯＳを介してＢ細胞を補助することを示すグラフである。
【図４】活性化ＤＣがＩＬ−１２を介してＩＬ−２１産生ＣＤ４−Ｔ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図５】遮断ＩＬ−１２がＢ細胞を補助できるＴ細胞の発達を阻害することを示すグラフである。
【図６】ＩＬ−１２がメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１分泌の分泌を制御することを示すグラフである。
【図７】ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞が、ＤＭ中の炎症部位に主に蓄積することを示す図である。
【図８】自己免疫疾患患者の血液中の増加した頻度の機能的ＢヘルパーＴ細胞を示す図である。
【図９】活動性ＪＤＭ患者から得た末梢血単核細胞によるＳＥＢに応答して増加したＩＬ−２１分泌を示すグラフである。
【図１０】ＪＤＭ患者由来のＰＢＭＣによるＩＬ−２１分泌がＩＬ−１２に依存することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の様々な実施形態の構造及び使用を以下で詳細に論じるが、本発明が、広範な具体的文脈において具現化できる多くの適用可能は発明の概念を提供することを理解するべきである。本明細書において議論される具体的な実施形態は、本発明を行う且つ使用するための具体的方法を説明するのみであって、本発明の範囲を定めるものではない。
【００２０】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下で定義する。本明細書中で定義される用語は、本発明に関する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「この（the）」などの用語は、単一の存在物のみを称することを意図するものでなく、説明のために具体例を使用する場合の一般的な種類を含む。本明細書中の専門用語は、本発明の具体的な実施形態を記述するために使用されるが、これらの用語の使用は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き本発明の範囲を定めるものではない。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、対象がＢ細胞により調節される自己免疫障害を治療する必要があることを同定するステップである。この同定は、対象又は医療従事者の判断により行うことができ、主観的（例えば見解）であっても、又は客観的（例えば試験又は診断方法によって測定可能）であってもよい。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「治療する」、「治療」及び「治療している」という用語は、ＩＬ−１２の存在下で抗原負荷した抗原提示細胞（例えば樹状細胞）によるＴ細胞の活性化に応答して多量のＩＬ−２１を分泌するＢヘルパーＴ細胞によって媒介される自己免疫応答を標的とする本発明の１又は２以上の治療法を施すことから生じる、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の進行、重症度及び／又は持続期間の減少又は改善或いはＢ細胞により調節される自己免疫障害の１又は２以上の症状（好ましくは１又は２以上の認識できる症状）の改善を指す。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「予防する」、「予防」及び「予防している」という用語は、所与のＢ細胞により調節される自己免疫障害を獲得するか又は発達する危険性の減少、或いは所与のＢ細胞により調節される自己免疫障害の１又は２以上の症状の再発、発症又は発達の減少又は阻害を指す。一実施形態において、ＩＬ−１２阻害剤は、予防手段として、本明細書に記載される障害のいずれかに対する遺伝的素因を有する疑いのある患者（例えばヒト）に投与される。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の重症度、持続期間、進行又は発症を減少又は改善し、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の進行を予防し、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の退行を引き起こし、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害に関連する症状の再発、発達、発症又は進行を予防し、或いは別の治療法の予防効果又は治療効果を高める又は向上させるのに十分であるＩＬ−１２阻害剤の量を指す。一実施形態において、本発明による治療により、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の少なくとも１つの症状又は兆候が、インビボ又はインビトロで測定して、少なくとも約１０％、又はさらには２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％減少又は予防される。
【００２５】
本発明は、Freireich et al., (1966) Cancer Chemother Rep 50: 219に記載される動物及びヒトに対する投与量（体の表面積１ｍ２当たりのミリグラムに基づく）の相互関係を認識する。体の表面積は、患者の身長及び体重からおおよそ測定され得る。例えば、Scientific Tables,Geigy Pharmaceuticals,Ardley,N.Y.,1970,537を参照されたい。本発明の化合物の有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲、又は範囲の下限が０．００１ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇのいずれかの量であり、且つ範囲の上限が０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇのいずれかの量であるいずれかの範囲（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。有効用量はまた、当業者によって認識されるように、治療される疾患、投与経路、賦形剤の使用、及び他の薬剤の使用などの他の治療的処置との同時使用の可能性に応じて変わる。
【００２６】
実施において、本発明の組成物及び方法は、単独で、又は医薬組成物の成分として、静脈内、経口、非経口、吸入噴霧により、局所、直腸内、経鼻、口腔、経膣又は注入リザーバーを介して投与できる抗ＩＬ−１２阻害剤を含んでもよい。本発明のＩＬ−１２阻害剤及び方法の他の非限定的な送達例としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、幹内（intrastemal）、鞘内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術が挙げられる。特定の実施形態において、ＢヘルパーＴ細胞は、単離され、インビトロにおいて処置され、次いで治療するために対象に戻されてもよい。
【００２７】
例えば、本発明は、滅菌注射組成物、例えば滅菌注射水性又は油性懸濁剤として調製され、投与されてもよく、適切な分散剤又は湿潤剤（例えばTween80など）及び懸濁化剤を用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤化できる。滅菌注射用製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール溶液などの、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液剤又は懸濁剤であってもよい。使用され得る許容される媒体及び溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液及び生理食塩水がある。さらに、無菌の不揮発性油が、従来のように溶媒又は懸濁媒質（例えば合成モノグリセリド又はジグリセリド）として使用される。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油又はヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型において天然の薬学的に許容される油であるため、注射用製剤において有用である。これらの油剤又は懸濁剤はまた、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、又はカルボキシメチルセルロース（carboxymnethyl cellulose）若しくは同様の分散剤を含んでもよい。Tween若しくはSpan又は他の同様の乳化剤などの他の一般的に使用される界面活性剤或いは薬学的に許容される固体、液体又は他の剤形の製造において一般的に使用される生物学的利用能増強剤もまた、製剤化の目的のために使用されてもよい。
【００２８】
本発明の別の例は、限定されないが、カプセル剤、錠剤、乳剤及び水性懸濁剤、分散剤及び液剤を含む、任意の経口的に許容される剤形であり得る経口投与用の組成物である。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体としてはラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの平滑剤もまた、典型的に加えられる。カプセル剤の形態における経口投与のために、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤又は乳剤が経口投与される場合、活性成分は、乳化剤又は懸濁化剤と混合された油性相に懸濁又は溶解されてもよい。所望の場合、特定の甘味剤、矯味矯臭剤、又は着色剤が加えられてもよい。鼻エアロゾル又は吸入組成物は、製剤の分野において周知の技術に従って調製でき、ベンジルアルコール若しくは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フッ化炭素、及び／又は当技術分野において公知の他の可溶化剤若しくは分散剤を使用して、生理食塩水中の液剤として調製できる。本発明の化合物はまた、直腸投与のための坐剤の形態で投与できる。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、一般に治療される対象に有害でない、ＩＬ−１２阻害剤が組み込まれ得る薬剤（活性又は不活性）を指す。例えば、本発明の化合物と特異的で、より可溶性の複合体を形成する、シクロデキストリンなどの可溶化剤、又は１若しくは２以上の可溶化剤が、本発明の化合物を送達するための医薬賦形剤として使用されてもよい。他の担体の例としては、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、及び色素剤が挙げられる。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「動物」、「対象」、「哺乳動物」及び「患者」という用語は、限定されないが、ヒト又はウシ、サル、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターなどの動物を含む。
【００３１】
Ｂ細胞により調節される自己免疫障害を治療又は予防することを必要とする患者においてそのＢ細胞により調節される自己免疫障害を治療又は予防するための方法はさらに、投与される患者に有効量のＩＬ−１２阻害剤を投与するステップを含み得る。ＩＬ−１２阻害剤はまた、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害又はその症状を予防又は治療するために従来のように使用されるものなどの他の治療剤と共に送達されてもよい。そのような併用療法処置において、ＩＬ−１２阻害剤及び他の薬剤の両方が、従来の方法によって哺乳動物（例えばヒトの男性又は女性）に投与されてもよい。それらの薬剤は、単一の剤形又は別個の剤形で投与されてもよい。他の治療剤の有効量は当業者に周知である。本開示を考慮して、当業者は、他の治療剤の最適な有効量の範囲を決定できる。本発明の特定の実施形態において、本発明のＩＬ−１２阻害剤の有効量は、第２の治療剤がＩＬ−１２阻害剤の効果を増強するか、又は高める場合に減少されてもよい。
【００３２】
併用療法のための薬剤の例としては、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば限定されないが、ＴＮＦ抗体又は断片、可溶性ＴＮＦ受容体又は断片、それらの融合タンパク質、或いは低分子ＴＮＦアンタゴニスト）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩剤、麻酔剤、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ，non-steroid anti-inflammatory drug）、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、駆虫薬、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン（flurorquinolone）、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌剤）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止痢薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン（erythropieitin）（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Neupogen）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Leukine）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、サイクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗欝薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、睡眠薬、交感神経模倣薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくはアナログ、ドルナーゼアルファ（Pulmozyme）、サイトカイン又はサイトカインアンタゴニストが挙げられ得る。適切な投薬量は、当技術分野において周知である。例えば、関連部分が本明細書に参照として組み込まれる、Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif.(2000)を参照されたい。
【００３３】
本発明を用いて診断、予防又は治療され得る自己免疫疾患の非限定的な例としては、少なくとも部分的に又はさらには主に、自己抗原に対する免疫グロブリン応答を含み得る自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、若年発症糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、炎症性腸疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、グレーブス病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃の萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄疾患、多発性硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、クレスト症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症、及び毛細血管拡張症）、成人発症型糖尿病（II型糖尿病）、男性及び女性自己免疫不妊症、強直性脊椎炎（ankylosing spondolytis）、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎（polyarteritis nedosa）、全身性壊死性血管炎、若年発症関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、再発性流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形紅斑、心臓切開術後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮剥離症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギウス症、サムプター症候群（Sampter's syndrome）、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎（eosinophilic faciitis）、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、糸球体腎炎、移植片対宿主病、移植拒絶、ヒト免疫不全ウイルス感染症、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、予防接種後症候群、先天性風疹感染、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン−ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、クリオグロブリン血症、ワルデンストロームマクログロブリン血症、エプスタイン−バーウイルス感染、流行性耳下腺炎、エヴァンズ症候群、及び自己免疫性腺機能不全などの自己免疫疾患が挙げられる。
【００３４】
本発明者らは、ＩＬ−１２がヒトにおける抗体応答を調節する主要な分子であることを発見した。機能的ＢヘルパーＴ細胞の頻度が、ＪＤＭ、ＳＹＳ及びＳＬＥを含む、自己免疫疾患において増加することも見出した。ＢヘルパーＴ細胞を標的とすることは、自己免疫疾患における治療的アプローチとして今まで特許請求されていなかった。本発明を用いると、１）ＢヘルパーＴ細胞の発達を阻害するためにＩＬ−１２を遮断すること、２）ＢヘルパーＴ細胞によるＩＬ−２１の分泌を阻害するためにＩＬ−１２を遮断すること、及び３）例えばＣＸＣＲ５又はＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を用いることによって体におけるＢヘルパーＴ細胞の数を減少させるためにそれらのＢヘルパーＴ細胞を標的とすることがここで可能になる。
【００３５】
例えば、皮膚筋炎、及び全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患患者から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ，peripheral blood mononuclear cell）を、ＩＬ−１２中和抗体（抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂ）の存在下又は非存在下で超抗原エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ，superantigen enterotoxin B）と共に培養し、ＩＬ−２１分泌を培養の２日目に分析することが見出された。ＩＬ−１２遮断抗体の添加は、ＳＥＢ反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌を著しく阻害した。したがって、ＩＬ−１２を遮断することは、抗体応答の発達において主要な役割を果たす、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１の分泌を減少させる。
【００３６】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の単離。ＰＢＭＣを、成人健常ボランティアから得たアフェレーシス血液サンプルからフィコール勾配遠心分離により精製し、液体窒素中の１０％のＤＭＳＯ中で凍結を維持した。ナイーブＣＤ４−Ｔ細胞をまず、負の選択により濃縮した：ＰＢＭＣを精製したＣＤ８（HIT8a、eBiosciences社製）、ＣＤ１１ｂ（LM1/2、ATCC）、ＣＤ１１ｃ（B-ly6、BD Biosciences社製）、ＣＤ１４（M5E2、ATCC）、ＣＤ１５（W6D3、BD Biosciences社製）、ＣＤ１６（3G8、Beckman Coulter社製）、ＣＤ１９（J4.119、Beckman Coulter社製）、ＣＤ４５ＲＯ（UCHL1、BD Biosciences社製）、ＣＤ５６（C218、Beckman Coulter社製）及びＨＬＡ−ＤＲ（B8.12.2、Beckman Coulter社製）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、４℃で３０分間インキュベートし、次いでDynabeads Pan Mouse IgG（Dynal社製）と、４℃で３０分間インキュベートした。抗体結合細胞をマグネット（Dynal社製）で除去した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をさらに、ＣＤ８ ＰＥ（RPA-T8、eBiosciences社製）、ＣＤ５６ ＰＥ（B159，BD Biosciences社製）、ＨＬＡ−ＤＲ ＰＥ（G46-6、BD Biosciences社製）、ＣＤ４５ＲＡ Tricolor（MEM-56、Caltag社製）及びＣＤ４＋ Pacific Blue（S3.5、Caltag社製）ｍＡｂで染色した後、ＣＤ８− ＣＤ５６− ＨＬＡ−ＤＲ− ＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ４＋細胞としてFACSAria（BD Biosciences社製）で分取することによって精製した。細胞純度は９９％を超えた。
【００３７】
Ｂ細胞の単離。Ｂ細胞をまず、CD19 MicroBeads及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec社製）を用いる陽性選択によりアフェレーシスＰＢＭＣから濃縮した。次いで、ナイーブ及びメモリーＢ細胞を、ＩｇＤ ＦＩＴＣ（IA6-2、BD社製）、ＣＤ２７ ＰＥ（L128、BD Biosciences社製）、ＣＤ３ ＡＰＣ（SK7、BD Biosciences社製）、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（S-HCL-3、BD Biosciences社製）及びＣＤ１４ ＡＰＣ（TuK4、Caltag社製）ｍＡｂで染色した後、ＩｇＤ＋ ＣＤ２７− ＣＤ３− ＣＤ１１ｃ− ＣＤ１４−細胞及びＩｇＤ− ＣＤ２７＋ ＣＤ３− ＣＤ１１ｃ− ＣＤ１４−細胞としてそれぞれFACSAriaで分類した。細胞純度は９８％を超えた。
【００３８】
ＤＣ及びナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養。単核細胞を、Monocyte Isolation Kit II（Miltenyi Biotec社製）を用いる負の選択によってＰＢＭＣから単離した。ＤＣを、６ウェルプレート（２×１０６細胞／３ｍｌ／ウェル）中で１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸（全てSigma社製）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐ７．２及び１０％の加熱不活性化したＦＢＳ（Hyclone社製）を含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地（GIBCO社製）中の５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（R&D社製）及び１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Leukine社製）を用いて単核細胞を培養することによって生成した。サイトカインを２日ごとに加えた。６日目に、樹状細胞を、放射線を照射したＣＤ４０ＬでトランスフェクトしたＬ細胞、ＰＧＮ（５μｇ／ｍｌ、InvivoGen社製）、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich社製）、フラジェリン（２０ｎｇ／ｍｌ、InvivoGen社製）、ＣＬ０９７（イミダゾキノリン化合物、５μｇ／ｍｌ、InvivoGen社製）、加熱殺菌した大腸菌（Escherichia coli）（１０８／ｍｌ、Invitrogen社製）、加熱殺菌した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（１０８／ｍｌ、InvivoGen社製）、又は加熱殺菌したポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）（１０８／ｍｌ、InvivoGen社製）で刺激した。６時間の刺激後、ＴＬＲ−リガンド又は加熱殺菌した細菌に曝露したＤＣを収集し、注意深く洗浄し：ＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＬ細胞で刺激したＤＣを、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（S-HCL-3、BD Biosciences社製）及びＣＤ４０Ｌ ＰＥ（TROP1、BD Biosciences社製）ｍＡｂでの染色後、FACSによってＣＤ１１ｃ＋ＣＤ４０Ｌ−ＤＣとして回収した。活性化ＤＣ（１．３×１０３細胞／ウェル）を、９６ウェル丸底プレート中のＲＰＭＩ完全培地中で同種異系のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（４×１０４細胞／ウェル）と共に７日間培養した。一部の実験において、１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１２ｐ４０（C8.6、eBiosciences社製）又は抗ＩＬ−１２ｐ７０（M122、Pierce社製）遮断ｍＡｂを培養物に加えた。ＩＬ−１２分泌を評価するために、６時間の刺激で収集したＤＣを、平底９６ウェルプレート（２×１０５細胞／ウェル）中でさらに２４時間培養し、分泌したＩＬ−１２を、ＩＬ−１２ｐ７０ＥＬＩＳＡキット（eBiosciences社製）を用いて測定した。
【００３９】
ＣＤ３／ＣＤ２８によるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、ヒト組換えサイトカイン：ＩＬ−１β（R&D社製）、ＩＬ−６（R&D社製）、ＩＬ−１０（R&D社製）、ＩＬ−１２（R&D社製）、ＩＬ−１８（R&D社製）、ＩＬ−２３（eBiosciences社製）、ＩＬ−２７（R&D社製）、ＴＮＦ（R&D社製）、（各々１０ｎｇ／ｍｌ又は示した濃度にて）又はＩＦＮ−α（ＩＦＮ−α２ｂ、５００ＩＵ／ｍｌ、Schering社製）の存在下で、平底９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ完全培地中でプレートに結合したＣＤ３ ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ、OKT3、ATCC）及び可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ、ＣＤ２８．２、BD Biosciences社製）で刺激した。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を７日目に分析した。一部の実験において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μＭのカルボキシフルオセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（Molecular Probes社製）で標識して、Ｔ細胞の増殖を追跡した。
【００４０】
細胞内サイトカイン染色。７日間刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ホルボールミリステートアセテート（２５ｎｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich社製）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich社製）で６時間、最後の４時間はGolgiPlug（BD Biosciences社製）の存在下で再刺激した。次いで、細胞を固定し、Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilizationキット（BD Biosciences社製）を用いて透過処理し、細胞質中で発現したサイトカインを、ＩＬ−２１ ＰＥ又はＡＰＣ（3A3-N2、eBiosciences社製）、ＩＬ−１７Ａ ＰＥ（64DEC17、eBiosciences社製）、及びＩＦＮγ ＡＰＣ（B27、BD Biosciences社製）ｍＡｂを用いて分析した。細胞を、１％のパラホルムアルデヒドで固定した後、FACS Calibur又はFACS CantoIIで採取した。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＦＳＣ高細胞）中のサイトカイン発現を、Flowjoソフトウェア（TreeStar社製）を用いて分析した。
【００４１】
活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、残留ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを除去するために、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（S-HCL-3、BD Biosciences社製）での染色後、ＦＳＣ高細胞（ＣＤ３／２８刺激）、又はＣＤ１１ｃ低ＦＳＣ高細胞（ＤＣで共培養）として７日目に分類した。分類したＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６平底ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）中の１０％のＦＢＳを補充したYssel培地（Gemini社製）中でプレートに結合したＣＤ３ ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）及び可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）で再刺激した。２４時間後、産生したＩＬ−２１レベルを、Luminexアッセイを用いて評価した。
【００４２】
Luminex技術を使用するヒトＩＬ−２１ビーズベースアッセイの開発。TGCTGGCTA及びTGAによって結合されており、マウスシグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバー１シグナルペプチド（gb|EDL39054.1|）残基１〜２４、ＧＬ、gb|ABN54273.1|セルロソームアンカリングタンパク質残基１０５０〜１２１９、ＬＥＡＤ、及びgb|AAG29348.1|ヒトインターロイキン２１残基３０〜１６２をコードする配列を、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＭ８（Seed社製、１９８７）のHindIII-NotI間に挿入するためにＰＣＲを使用した。このベクターは、コヒーシン−ＩＬ−２１融合タンパク質の分泌を誘導した。天然のヒトＩＬ−２１の分泌を誘導するベクターを、CACCに先行するref|NM_021803.1|残基４７〜５３５を、pIRES2-DsRed2（Clontech社製）のNheI-NotI間に挿入することによって操作した。分泌タンパク質を、１Ｌのトランスフェクション当たり１．３ｍｌの２９３Fectin試薬で１ｍｇの全プラスミドＤＮＡに基づいて製造業者のプロトコルに従ってFreeStyle（商標）293Expression System（Invitrogen社製）を用いて生成した。トランスフェクトした細胞を３日間培養し、培養上清を収集し、０．５％のペニシリン／ストレプトマイシン（Biosource社製）を含む新鮮な293Freestyle（商標）培地（Invitrogen社製）を、２日間インキュベーションを継続しながら加えた。培養上清（１Ｌ）を、ＰＢＳで洗浄した２０ｍｌのＱセファロースカラム（GE Healthcare社製）に導入し、次いでＰＢＳ＋１ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で溶出した。溶出した画分を、注文製の１ｍｌの抗コヒーシンｍＡｂカラムに通し、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍのグリシン ｐＨ２．７で溶出し、次いでＤＰＢＳに対して透析した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、濃度は２８０ｎｍにおける理論的吸光係数に基づいた。
【００４３】
ヒトＩＬ−２１に対するマウスｍＡｂを、迅速な反復免疫戦略により生成した。手短に述べると、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０μｇのコヒーシンＩＬ−２１融合タンパク質及びＲｉｂｉ又はＣｐＧ（1017 ISS、Dynavax社製）アジュバントを用いて、３０〜４０日の期間７〜９回、フットパッド注射により免疫化した。高くなった血清力価の観測時に、低い血清耐性に適合されている、Ｐ３×６３、Ａｇ８．６５３（ATCC CRL-1580）及び／又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株とのＰＥＧ誘導性体細胞融合のために、鼠径及び膝窩の流入領域リンパ節を収集する前に１０μｇの追加免疫を３〜４日与えた。１：２５の希釈でハイブリドーマ上清を、対照コヒーシン融合タンパク質で０．５μｇ／ｍｌにて、又は０．２μｇ／ｍｌのコヒーシン−ＩＬ−２１にてコーティングしたプレートを用いて直接ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。上清をまた、モノクローナル抗体を係留するためにヤギ抗マウスＩｇＧでコーティングしたプレートを用いて捕捉ＥＬＩＳＡフォーマットにおいてスクリーニングし、０．０６２５μｇ／ｍｌにてビオチン化したＩＬ−２１、続いてニュートラアビジン−ＨＲＰで検出した。最も強力な抗体を生じるハイブリドーマは、純粋な抗体の産生のためにクローニングされ、規模を合わされた単一細胞であった。ｍＡｂを、ＩＬ−２１を検出できる対を確立するためにチェッカーボードＥＬＩＳＡフォーマット（checkerboard ELISA format）において試験した。ｍＡｂを２μｇ／ｍｌにてプレートに結合させ、次いで２ｎｇ／ｍｌ及び２０ｐｇ／ｍｌにてＩＬ−２１、次いで１００ｎｇ／ｍｌにてビオチン化ｍＡｂとインキュベートし、続いてニュートラアビジン−ＨＲＰで検出する。首尾よく対を形成したｍＡｂをさらに、１００ｎｇ／ｍｌ〜４５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２１滴定によってこのＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングし、１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ｍＡｂパートナーで検出した。ＥＬＩＳＡにおいて最も感受性であったそれらの抗体を、ビーズにコンジュゲートし（タンパク質のカルボキシル化ミクロスフェアに対する２段階のカルボジイミドカップリングのためのLuminex Corporationプロトコル、２００６年１月）、４０００ｐｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの連続滴定の組換えヒトＩＬ−２１並びに天然のヒトＩＬ−２１を含むと予想されるイノマイシン及びＰＭＡで刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞からの上清の希釈物とインキュベートした。検出ｍＡｂをビオチン化し、０．５μｇ／ｍｌにて使用した。選択したｍＡｂ対は、ＩＬ−２１発現ベクターをトランスフェクトした２９３Ｆ細胞から分泌されたＩＬ−２１を検出した。２つの市販供給源からの組換えＩＬ−２１より著しく強力であったコヒーシン−ＩＬ−２１を標準物として使用した。
【００４４】
最後のLuminexアッセイは、少なくとも４０００ｐｇ／ｍｌの範囲にわたって１ｐｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１に感受性であった。ＩＬ−２１対を、Upstate Beadlyte Human 26 plex multiplex標準物で試験した。この分析物のいずれも交差反応はなかった。ＩＬ−２１対はまた、Upstate human 22 plexで多重化され得る。Luminexビーズコンジュゲーション及び一般的アッセイ条件はGiavedoni, et al.により詳述される（Giavedoni, 2005）。SeroMAPビーズ（region 26）を、５００μｌの５０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．０中の５μｇのｍＡｂにて最適な１×１０７ビーズの結合で使用した。検出ｍＡｂのビオチン化を、２５×NHS-LCビオチン（Pierce社製）で行い、このアッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌにて使用した。２μｇ／ｍｌにてProzyme社製のPhycolink Strepavidin R-Phycoerythrin PJ31Sをレポーターとして使用した。
【００４５】
Ｔ細胞及びＢ細胞の共培養。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を上記のように分類し、エンドトキシンが低下したＳＥＢ（０．２５ｎｇ／ｍｌ；Toxin technology, Inc社製）の存在下で、９６ウェル丸底プレート中のYssel培地／１０％のＦＢＳ中で自己メモリーＢ細胞（各々４×１０４細胞／ウェル）と共培養した。一部の実験において、抗ＩＬ−２ｍＡｂ（PAB956、BIIR社製）、抗ＩＬ−４ｍＡｂ（MP4-25D2、BD社製）、抗ＩＬ−１０ｍＡｂ（PAB548、BIIR社製）、抗ＩＦＮ−γｍＡｂ（B27、BD Biosciences社製）、ＩＣＯＳ−Ｌ−ｍＩｇＦｃ（Ancell社製）、ＩｇＧ１Ｆｃ又はＩＬ−２１Ｒ／Ｆｃ（両方ともR&D systems社製）を培養物に加えた。培地中で産生したＩｇ（ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ）を、６又は１４日目にＥＬＩＳＡにより分析した。
【００４６】
Ｉｇ ＥＬＩＳＡ。Ｉｇの測定のために、培養上清を、５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ Ａｂ（全てSouthernBiotech, Inc.社製）でコーティングした９６ウェルマイクロプレート（Nunc社製）中で、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、（それぞれ、１／２０００、１／２５００又は１／２５００の最終希釈にて）アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ又はＩｇＡ Ａｂ（全てSouthernBiotech, Inc.社製）と共に、室温にて１時間インキュベートした。次いで、プレートを、広範囲に洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma社製）とインキュベートした。反応を３ＮのＮａＯＨで停止し、吸光度をSpectraMaxプレートリーダー（Molecular Devices社製）により読み取った。
【００４７】
ＳＥＢとのＰＢＭＣ培養。精製した新鮮なＰＢＭＣ（２．５×１０５細胞／ウェル）を、抗ＩＬ−１２ｐ４０又はＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂの存在下又は非存在下で、９６ウェルプレート中で４８時間、ＳＥＢ（０．１μｇ／ｍｌ）と培養し、分泌したサイトカインをLuminexにより測定した。
【００４８】
ＣＤ４−Ｔ細胞表現型の分析。ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞亜集団を分析するために、自己免疫疾患患者及び年齢が一致した健常者から得た新鮮な全血サンプルを、抗ＣＸＣＲ５−Ａｌｅｘａ ４８８、ＣＣＲ６−ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤ、ＣＸＣＲ３−ＰＣ５、ＣＣＲ４−ＰＣ７、ＩＣＯＳ−ＡＰＣ、ＣＤ３−ＡＦ７００、ＣＤ８−ＡＰＣ Ｈ７、ＣＤ４５ＲＡ Pacific Blue、及びＣＤ４５ Pacific Orange ｍＡｂで染色した。細胞を、FACSAriaを用いて採取し、FlowJoソフトウェア（TreeStar社製）で分析した。
【００４９】
ＢヘルパーＴ細胞の発達のための主要因子としてのＩＬ−１２。ＩＬ−２１は、Ｔ細胞サイトカイン及びＮＫＴ細胞サイトカインであり、それらは免疫系の多くの細胞で作用する。特に、ＩＬ−２１は、抗体分泌形質細胞に対してＢ細胞の成長及び分化を促進する。図１は、ＩＬ−１２の存在下で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、多量のＩＬ−２１を産生することを示す。手短に述べると、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、サイトカイン（５００ＩＵ／ｍｌにおけるＩＦＮ−αを除いて１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、プレートに結合した抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂで７日間刺激した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−αは、ＩＬ−２１を分泌できるＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導しなかった。しかしながら、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２１を産生できるＣＤ４＋Ｔ細胞の発達を促進した。ＣＤ３／ＣＤ２８による再活性化の際に、ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナノグラム量のＩＬ−２１（２００μｌ当たり５×１０４細胞の培養物中に３．３±０．４ｎｇ／ｍｌ、平均±ｓｅｍ、ｎ＝５）を分泌できたが、ＩＬ−２３で初回刺激したものはピコグラム量（４０±４ｐｇ／ｍｌ、平均±ｓｅｍ、ｎ＝５）のみを分泌した。したがって、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２１を産生するようにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を強く誘導する。
【００５０】
図２は、ＩＬ−１２の存在下で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、免疫グロブリンを産生するように自己Ｂ細胞を誘導できることを示す。手短に述べると、ＩＬ−１２又は他のサイトカインの存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂにより活性化したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を７日目に分類し、抗ＩｇＭ ｍＡｂ及びＣｐＧ（ＴＬＲ−９リガンド）で予め活性化した自己血液ＩｇＤ＋ＣＤ２７−ナイーブＢ細胞と共培養した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ, staphylococcal enterotoxin B）、超抗原をＴ−Ｂ相互作用を誘導するために加え、分泌したＩｇを１４日目に測定した。サイトカインで初回刺激していないＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｉｇを分泌するようにナイーブＢ細胞を誘導できなかった（Ａ、なし）。対照的に、ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡを含む、Ｉｇを分泌するようにナイーブＢ細胞を誘導した。ＩＬ−２３で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したナイーブＢ細胞は、著しく低い量のＩｇを産生した。
【００５１】
同様に、ＩＬ−１２で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２３で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞より著しく高い量でＩｇＤ−ＣＤ２７＋メモリーＢ細胞からのＩｇ産生を誘導した（Ｂ）。したがって、ＩＬ−１２は、Ｂ細胞を補助できる細胞になるようにＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する。
【００５２】
図３は、ＩＬ−１２の存在下で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＬ−２１に依存的に免疫グロブリンを産生するようにＢ細胞を誘導することを示す。手短に述べると、ＩＬ−２１の機能を阻害する、可溶性ＩＬ−２１受容体／Ｆｃキメラタンパク質を、ＩＬ−１２で初回刺激したＢ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養物に加えた。遮断ＩＬ−２１は、Ｂ細胞がＩｇを分泌するのを著しく阻害した。したがって、ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌したＩＬ−２１は、Ｂ細胞による抗体産生の誘導において基本的な役割を果たす。
【００５３】
図４は、活性化ＤＣが、ＩＬ−１２を介してＩＬ−２１産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することを示す。手短に述べると、ＤＣを、大腸菌（グラム陰性）、黄色ブドウ球菌（グラム陽性）、及びポルフィロモナス・ジンジバリス（グラム陽性）を含む加熱殺菌した細菌と６時間インキュベートし、次いで同種異系ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と培養した。７日目に分類した活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂで２４時間再刺激して、ＩＬ−２１分泌を測定した。細菌により活性化したＤＣで初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、刺激されていないＤＣで初回刺激したものより多いＩＬ−２１を分泌した。ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の両方を阻害する、抗ＩＬ−１２ｐ４０遮断ｍＡｂの添加は、ＤＣ−Ｔ細胞共培養の間、細菌により活性化したＤＣによるＩＬ−２１産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の発達を著しく阻害した。特に、ＩＬ−１２のみを阻害する、抗ＩＬ−１２ｐ７０遮断ｍＡｂの添加は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１分泌を著しく阻害するのに十分であった（８５±５％の阻害、平均±ｓ．ｅ．ｍ．ｎ＝５）。したがって、細菌を感知したＤＣによるＩＬ−２１産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導はＩＬ−１２により媒介された。
【００５４】
図５は、遮断ＩＬ−１２が、Ｂ細胞を補助できるＴ細胞の発達を阻害することを示す。手短に述べると、細菌により活性化したＤＣと培養することにより活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞を７日目に分類し、自己メモリーＢ細胞と共培養した。細菌により活性化したＤＣで初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｉｇを産生するようにＢ細胞を誘導した。Ｂ細胞によるＩｇ分泌の誘導は、抗ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＡｂをＤＣ−Ｔ細胞共培養の間に加えた場合に著しく損なわれた。しかしながら、抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂでＩＬ−１２を遮断することは、ＢヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の発達を阻害するのに十分であった。したがって、活性化ＤＣにより分泌したＩＬ−１２は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＢヘルパーＴ細胞への分化に不可欠である。
【００５５】
ＩＬ−１２はＩＬ−２１分泌を制御する。図６は、ＩＬ−１２がメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１分泌の分泌を制御することを示す。手短に述べると、単核細胞（ＰＢＭＣ）を成人健常者の血液サンプルから単離し、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で刺激した。産生したＩＬ−２１レベルを培養の４８時間に分析した。ＰＢＭＣは、４８時間ＳＥＢと培養した場合、多量のＩＬ−２１を産生した（Ａ、７４０±２５０ｐｇ／ｍｌ、平均±ｓ．ｅ．ｍ．ｎ＝７）。抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂで４８時間の活性化時間の間にＩＬ−１２を遮断することは、ＩＬ−２１分泌の著しい低下を生じた（Ａ及びＢ、１１０±３０ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝７、ｐ＜０．０５）。抗ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＡｂでのＩＬ−１２及びＩＬ−２３の両方の遮断は、ＩＬ−１２のみを遮断するのに匹敵するレベルでＩＬ−２１分泌を低下させた（１２０±４０ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝６）。ＩＬ−１２を遮断することは、ＩＬ−２、ＩＬ−５、及びＩＬ−１７を含む他のサイトカインの分泌を変化させなかった（Ｂ）。したがって、ＩＬ−１２を遮断することは、ＩＬ−２１及びＩＦＮ−γの両方の分泌を特異的に阻害した。したがって、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２１産生メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に直接的に作用し、ＩＬ−２１の分泌を促進する。
【００５６】
自己免疫疾患の血液中の機能的ＢヘルパーＴ細胞の増加した頻度
自己抗体関連自己免疫疾患の例：皮膚筋炎（ＤＭ，dermatomyositis）
ＤＭは自己免疫炎症性筋疾患である。ＤＭを有する患者は近位筋力低下及び特徴のある皮膚発疹を含む全身性炎症の特徴を示す。米国におけるＪＤＭの発生率は、１年当たり１００万人の子供当たり３．２人である。発症する平均年齢は７歳であるが、２５％の患者は発症時、４歳より若い。米国において、少女対少年の比は２．３対１である。成人のＤＭは、４０〜６０歳の範囲で最も多く、米国において１００，０００人の中から約２人で観察される。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞は主にＤＭの炎症部位に蓄積する（図７）。多くのＤＭ患者は広範なレパートリーの自己抗体を示すので、Ｂ細胞は、ＤＭ発症において重要であると提案されている。実際に、リツキシマブ（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）を用いる２つの最近のパイロット試験は、Ｂ細胞の欠失がＤＭ患者に有益であることを示した。
【００５７】
図８は、若年性皮膚筋炎（ＪＤＭ）患者を含む、自己免疫疾患患者が、健常者対照と比較して、偏ったＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞サブセットを示すことを証明する。
【００５８】
ＣＸＣＲ５、ケモカイン受容体を発現する血液ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗体応答に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを表す。ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３ ｍＡｂ及びＩＣＯＳで刺激した場合、多量のＩＬ−２１を分泌する。ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞内で、３種の主要な亜集団を同定した：Ｔｈ１（ＣＸＣＲ３＋）、Ｔｈ２（ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６−）及びＴｈ１７（ＣＣＲ６＋）細胞。Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞は効率的なＢ細胞ヘルパーであるが、Ｔｈ１細胞はＢ細胞を完全に補助できない（Ａ）。
【００５９】
全身性関節炎（ＳＹＳ）及びＪＤＭ患者を表したＰＢＭＣの表現型分析は、年齢が一致した健常者対照より少ないＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１（ＣＸＣＲ３＋）及び多いＣＸＣＲ５＋Ｔｈ２（ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６−）細胞を示す（Ｂに示す）。ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１７（ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６＋）細胞の頻度は、健常者対照よりＪＤＭ及びＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）において高かった。さらに、ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞集団の頻度は、他の自己免疫疾患のものよりＪＤＭにおいて高かった。ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ２細胞集団はＳＬＥにおいて著しく高く、ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１７細胞集団は乾癬性関節炎（ＰＳＯＡ，psoriatic arthritis）においてより高かった。注目すべきことに、最も高いＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１７細胞を示した４人のＪＤＭ患者のうちの３人は、研究したコホートの中で最も病気が重く、最も難治性の患者であった（筋肉酵素の継続的上昇、ＣＭＡＳは４０未満であり、持続性の皮膚発疹）。ＪＤＭにおけるＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１細胞の頻度は、他の２つの自己免疫疾患においてより著しく低かった。したがって、ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットは、最も効率的なＢ細胞ヘルパーを表す、Ｔｈ２及び／又はＴｈ１７細胞に対してＳＹＳ、ＳＬＥ及びＪＤＭにおいて偏った。この免疫異常調節は、病原性自己反応性Ｂ細胞の生成の原因となり得る。
【００６０】
活動性ＪＤＭ患者から得たメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞による増加したＩＬ−２１分泌。図９は、活動性ＪＤＭ患者から得た末梢血単核細胞が多量のＩＬ−２１を分泌することを実証する。手短に述べると、新鮮なＰＢＭＣを、乾癬性関節炎（ＰＳＯＡ）、ＪＤＭ、ＳＹＳ、及びＳＬＥ小児患者から得て、ＳＥＢで刺激した。産生したＩＬ−２１レベルを４８時間に測定した。注目すべきことに、最も高いＩＬ−２１分泌を示した（円で示した）５人のＪＤＭ患者のうちの３人は、プレドニゾロンの投与を必要とされる活動性患者の中であった。したがって、活動性ＪＤＭ患者の血球は、活性化時に多量のＩＬ−２１を分泌する。
【００６１】
図１０は、ＩＬ−１２が、自己免疫疾患患者から得たＰＢＭＣによるＩＬ−２１分泌の誘導においても主要なサイトカインであることを示す。手短に述べると、ＪＤＭ、ＳＹＳ、及びＳＬＥ患者からのＰＢＭＣを、ＩＬ−１２中和ｍＡｂの存在下又は非存在下で、ＳＥＢで刺激し、分泌したＩＬ−２１レベルを分析した。ＩＬ−２１分泌は、全ての試験した自己免疫疾患由来のＰＢＭＣの培養物中のＩＬ−１２を遮断することにより著しく阻害し（ＪＤＭ：ｎ＝２０、ｐ＝０．００２７；ＳＹＳ：ｎ＝７、ｐ＝０．０１５；ＳＬＥ：ｎ＝１５、ｐ＝０．００２、対応ｔ検定）、これは、成人健常者から得たサンプルによる研究結果と一致する。したがって、ＩＬ−１２は、ＪＤＭ、ＳＹＳ、及びＳＬＥを含む、自己免疫疾患においてメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌の誘導に不可欠な役割を果たす。
【００６２】
本明細書で論じられたいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に関しても、実行することができ、逆も同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
【００６３】
本明細書に記載された特定の実施形態は、例証として示されており、本発明の限定として示されるのではないことは、理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に用いることができる。当業者は、本明細書に記載された特定の手順の多数の均等物を認識し、又は日常的な実験だけを用いて確かめることができよう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲によって網羅されている。
【００６４】
本明細書で言及された全ての刊行物及び特許出願は、本発明に関する当業者の技術のレベルを示している。全ての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が明確且つ個別に示されて参照により組み込まれているかのように、同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６５】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において用語「含むこと（comprising）」と共に用いられる場合の用語「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、「１の（one）」を意味することができるが、それはまた、「１又は２以上」、「少なくとも１の」、及び「１又は１より多い」という意味と一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指す、又は代替物が相互排他的であることを明確に示されていない限り、「及び／又は」を意味するように用いられるが、本開示は、代替物のみを指す定義と「及び／又は」を支持する。本出願を通して、用語「約」は、値が、装置、その値を決定するために用いられることになっている方法についての誤差の固有の変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００６６】
本明細書及び特許請求の範囲に用いられる場合、用語「含むこと（comprising）」（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含むこと（comprising）の任意の形）、「有すること（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」などの有すること（having）の任意の形）、「含むこと（including）」（及び「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含むこと（including）の任意の形）、又は「含むこと（containing）」（及び「含む（contains）」及び「含む（contain）」などの含むこと（containing）の任意の形）は、包括的であり、又は限度を設定せず、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。
【００６７】
本明細書に用いられる場合、用語「又はそれらの組合せ」は、その用語の前にある列挙された項目の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び特定の状況において順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢもの少なくとも１つを含むことを意図される。この例に関して引き続き述べると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１又は２以上の項目又は用語の反復を含む組合せが明確に含まれる。当業者は、状況から他に明らかなことがない限り、典型的には、任意の組合せにおいて項目又は用語の数への制限はないことを理解されよう。
【００６８】
本明細書に開示及び主張された組成物及び／又は方法の全ては、本開示に照らせば、過度の実験なしに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載された組成物及び／又は方法、及び方法のステップにおいて、又はステップの順序において、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、改変を適用することができることは、当業者にとって明らかであり得る。当業者にとって明らかな全てのそのような類似した代替形態及び修正形態は、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念内にあると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、免疫応答をモジュレートする分野、より具体的には、ＢヘルパーＴ細胞の活性を減少させることによって自己免疫疾患を診断、予防及び治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、この背景技術は自己免疫応答に対する治療に関連して記載する。
【０００３】
多くの化学及び生物学的免疫治療法が自己免疫障害を治療するために開発されている。典型的に、免疫治療法は、自己免疫障害が始まった後に、例えばステロイド又は抗免疫細胞抗体などの化学剤を用いて免疫応答全体を弱めることによってその自己免疫障害を治療しようと試みられている。例えば、そのような方法の一つは、Ｂ細胞抗原、例えばＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１９及びＣＤ７４又はＨＬＡ−ＤＲ抗原に結合する抗体を投与することによって自己免疫障害を治療する試みである。しかしながら、この抗体は、それらの正常な機能に関係なく全てのＢ細胞を標的とし、標的の自己免疫応答だけでなく免疫応答全体を弱めてしまう。
【０００４】
そのような特許の一つは、Ｂ細胞を標的とする抗体を用いる自己免疫障害の免疫療法に関する、Goldenberg, et al.に発行された米国特許第７，０７４，４０３号明細書である。この特許は、自己免疫障害を治療する効果的手段を提供するための、Ｂ細胞抗原に結合する抗体の使用を教示している。コンジュゲートされ得るか、又は裸（naked）であり得る抗体及び断片が、単独又は多様な治療で使用される。抗体は二重特異性抗体であってもよく、融合タンパク質として、又はハイブリッド、多特異性抗体として組換えによって産生されてもよい。
【０００５】
Ways, et al.に発行された米国特許第６，１０３，７１３号明細書は、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化及び／又は増殖を阻害することによる自己免疫疾患の治療的処置、並びにアイソザイム選択的ＰＫＣ阻害剤：（Ｓ）−３，４−［Ｎ，Ｎ’−１，１’−（（２’’−エトキシ）−３’‘‘（Ｏ）−４’‘‘−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−ブタン）−ビス−（３，３’−インドリル）］−１（Ｈ）−ピロール−２，５−ジオン及びその薬学的に許容される塩を用いる自己免疫疾患及び／又は疾患の兆候の治療を教示している。
【０００６】
別の例は、自己免疫障害又は炎症性障害を予防及び治療するためにＣＤ２アンタゴニストを投与／投薬する方法に関する、Dingivanによって出願された米国特許出願公開第２００７００２５９９０号明細書である。その出願は、１又は２以上のＣＤ２アンタゴニストを用いて対象における自己免疫障害又は炎症性障害を予防又は治療するための組成物、及び１又は２以上のＣＤ２結合分子を対象に投与することによってその対象における自己免疫障害又は炎症性障害を予防又は治療するための方法を教示している。この発明は、ＣＤ２結合分子の投薬及び末梢血リンパ球の枯渇を誘導する薬剤の投与に関連する有害作用又は望ましくない副作用を回避又は減少させながら改善された効果を生じる投与方法を提供している。
【０００７】
さらに別の出願は、可溶性ＣＴＬＡ４分子及びＤＭＡＲＤ又はＮＳＡＩＤを用いて自己免疫疾患を治療する方法に関する、Cohen, et al.によって出願された米国特許出願公開第２００４００２２７８７号明細書である。手短に述べると、内因性Ｂ７分子がそれらのリガンドに結合することを遮断する可溶性ＣＴＬＡ４分子を単独で、又は疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ，Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug）を含む他の薬剤と組み合わせて、対象に投与することにより、リウマチ性疾患などの免疫系疾患を治療するための組成物及び方法が教示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，０７４，４０３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１０３，７１３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７００２５９９０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４００２２７８７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、免疫応答を調節するため、より具体的には、ＢヘルパーＴ細胞活性を調節するための組成物及び方法を含む。ＩＬ−１２は、免疫グロブリン分泌細胞へのＢ細胞の増殖、成熟及び活性化の主要な調節因子であることが見出されている。ＩＬ−１２が、Ｔ細胞サブセットの発達及び活性化並びにそれらによるＩＬ−２１の分泌を制御することによって、このＴ細胞の主要な集団であるＢヘルパーＴ細胞を調節することが本明細書で実証される。生理学的に、若年性皮膚筋炎（ＪＤＭ，juvenile dermatomyositis）、全身性関節炎（ＳＹＳ，systemic arthritis）、及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ，systemic lupus erythematosus）などの自己免疫性抗体を含む自己免疫障害において、それらの自己免疫疾患患者の血液中でＢヘルパーＴ細胞の存在が増加することが本明細書で発見され、実証された。さらに、ＩＬ−１２は、自己免疫疾患を有する患者由来のＴ細胞によるＩＬ−２１の分泌における主要な分子であることが実証された。
【００１０】
本発明は、自己免疫疾患を治療するためにＢヘルパーＴ細胞の数又は活性を減少させるための組成物及び方法を含む。そのような方法の一つは、ＢヘルパーＴ細胞の発達及びそれらによるＩＬ−２１の分泌を阻害するためにＩＬ−１２活性を遮断することを含む。別の方法は、ＣＸＣＲ５を含む、モノクローナル抗体を用いてＢヘルパーＴ細胞の数を減少させる。さらに別の方法は、ＩＣＯＳを遮断することによってＢヘルパーＴ細胞からのＩＬ−２１の分泌を減少させることを含む。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、ＢヘルパーＴ細胞を減少させ、それにより例えばＢ細胞による自己免疫性抗体分泌を減少させるのに十分な量でＩＬ−１２阻害剤を含む有効量の治療組成物を、自己免疫障害を有する対象に投与することによって自己免疫障害を治療するための組成物及び方法を含む。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、少なくとも１つの遮断抗ＩＬ−１２抗体又はその断片を含む。別の態様において、その方法はさらに、薬学的に許容される担体を含む。一実施形態において、ＩＬ−１２阻害剤は、１回当たり１〜１，０００ｍｇの用量で投与されるＩＬ−１２阻害抗体を含む。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤はＩＬ−１２阻害抗体を含み、対象にその抗体を反復用量で与える。さらに別の態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、ヒト以下の霊長類の抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択される抗ＩＬ−１２抗体を含む。別の態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、ＩＬ−１２のＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又は他の核酸阻害剤を含む。
【００１２】
本発明により治療され得る自己免疫疾患の非限定的な例としては、例えば、自己免疫性抗体が自己免疫応答を誘発する自己免疫疾患、例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎（thromboangitis ubiterans）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎及び線維性肺胞炎が挙げられる。本発明のさらに別の態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞又はマクロファージ又は炎症性サイトカインに対する二次治療薬と共に提供され得る。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、抗原に対する抗原特異的Ｂ細胞応答を高める方法であって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、ＢヘルパーＴ細胞を発達及び活性化させるのに十分な有効量のＩＬ−１２を用いて、抗原負荷した樹状細胞の存在下でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を成熟させるステップとを含み、ＩＬ−１２で処理したＢヘルパーＴ細胞がナノモル量（nanomolar amounts）のＩＬ−２１を分泌する、方法である。一態様において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、負の選択によって末梢血単核細胞から単離される。別の態様において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる。別の態様において、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、癌又は毒素から選択される。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、Ｂ細胞による自己免疫性抗体の分泌によって引き起こされる自己免疫障害のための治療を必要とする疑いのある患者を同定するステップと、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞を阻害するのに十分な量の抗ＩＬ−１２阻害剤で患者を治療するステップとを含む、自己免疫疾患をモジュレートする組成物及び方法を含む。一態様において、抗ＩＬ−１２阻害剤は、抗ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＡｂ又は抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂ、抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂ、抗ＩＬ−１２受容体、可溶性の不活性ＩＬ−１２及びそれらの組合せを含む。別の態様において、抗ＩＬ−１２阻害剤は、ＩＬ−１２受容体アンタゴニストを含む。さらに別の態様において、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は負の選択によって選択される。一態様において、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる。別の態様において、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は、活性化樹状細胞の存在下で活性化される。一態様において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、関節炎、全身性関節炎及び乾癬性関節炎から選択される。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、自己免疫性抗体の発達の前に自己免疫疾患に感受性である疑いのある対象に提供される。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、ＩＬ−１２の存在下で標的抗原を発現する活性化樹状細胞の存在下でナイーブＣＤ４Ｔ細胞を成熟させるステップとを含む方法によって作製されるＢ細胞ヘルパーＴ細胞であり、成熟したＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞は、抗原に応答してナノモル量のＩＬ−２１を放出する。
【００１６】
本発明の別の態様は、ＩＬ−２１分泌ＢヘルパーＴ細胞を、ＩＬ−１２阻害剤を含む組成物に曝露することにより、免疫グロブリン分泌細胞へのＢ細胞の増殖、成熟及び活性化を調節する組成物及び方法を含む。一態様において、ＩＬ−１２阻害剤は、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞によるＩＬ−２１及びＩＦＮ−γの両方の分泌を減少させる。別の実施形態において、本発明は、ナノモル量のＩＬ−２１の放出を誘発するのに十分な量のＩＬ−１２と共にナイーブＣＤ４Ｔ細胞をインキュベートするステップを含む、ＢヘルパーＴ細胞を濃縮する方法を含む。
【００１７】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、ここで、添付された図と共に本発明の詳細な説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＩＬ−１２が、ＩＬ−２１を分泌するようにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図２】ＩＬ−１２で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、免疫グロブリンを生成するようにＢ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図３】ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ−２１及びＩＣＯＳを介してＢ細胞を補助することを示すグラフである。
【図４】活性化ＤＣがＩＬ−１２を介してＩＬ−２１産生ＣＤ４−Ｔ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図５】遮断ＩＬ−１２がＢ細胞を補助できるＴ細胞の発達を阻害することを示すグラフである。
【図６】ＩＬ−１２がメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１分泌の分泌を制御することを示すグラフである。
【図７】ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞が、ＤＭ中の炎症部位に主に蓄積することを示す図である。
【図８】自己免疫疾患患者の血液中の増加した頻度の機能的ＢヘルパーＴ細胞を示す図である。
【図９】活動性ＪＤＭ患者から得た末梢血単核細胞によるＳＥＢに応答して増加したＩＬ−２１分泌を示すグラフである。
【図１０】ＪＤＭ患者由来のＰＢＭＣによるＩＬ−２１分泌がＩＬ−１２に依存することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の様々な実施形態の構造及び使用を以下で詳細に論じるが、本発明が、広範な具体的文脈において具現化できる多くの適用可能は発明の概念を提供することを理解するべきである。本明細書において議論される具体的な実施形態は、本発明を行う且つ使用するための具体的方法を説明するのみであって、本発明の範囲を定めるものではない。
【００２０】
本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下で定義する。本明細書中で定義される用語は、本発明に関する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「この（the）」などの用語は、単一の存在物のみを称することを意図するものでなく、説明のために具体例を使用する場合の一般的な種類を含む。本明細書中の専門用語は、本発明の具体的な実施形態を記述するために使用されるが、これらの用語の使用は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き本発明の範囲を定めるものではない。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、対象がＢ細胞により調節される自己免疫障害を治療する必要があることを同定するステップである。この同定は、対象又は医療従事者の判断により行うことができ、主観的（例えば見解）であっても、又は客観的（例えば試験又は診断方法によって測定可能）であってもよい。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「治療する」、「治療」及び「治療している」という用語は、ＩＬ−１２の存在下で抗原負荷した抗原提示細胞（例えば樹状細胞）によるＴ細胞の活性化に応答して多量のＩＬ−２１を分泌するＢヘルパーＴ細胞によって媒介される自己免疫応答を標的とする本発明の１又は２以上の治療法を施すことから生じる、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の進行、重症度及び／又は持続期間の減少又は改善或いはＢ細胞により調節される自己免疫障害の１又は２以上の症状（好ましくは１又は２以上の認識できる症状）の改善を指す。
【００２３】
本明細書において使用される場合、「予防する」、「予防」及び「予防している」という用語は、所与のＢ細胞により調節される自己免疫障害を獲得するか又は発達する危険性の減少、或いは所与のＢ細胞により調節される自己免疫障害の１又は２以上の症状の再発、発症又は発達の減少又は阻害を指す。一実施形態において、ＩＬ−１２阻害剤は、予防手段として、本明細書に記載される障害のいずれかに対する遺伝的素因を有する疑いのある患者（例えばヒト）に投与される。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の重症度、持続期間、進行又は発症を減少又は改善し、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の進行を予防し、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の退行を引き起こし、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害に関連する症状の再発、発達、発症又は進行を予防し、或いは別の治療法の予防効果又は治療効果を高める又は向上させるのに十分であるＩＬ−１２阻害剤の量を指す。一実施形態において、本発明による治療により、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害の少なくとも１つの症状又は兆候が、インビボ又はインビトロで測定して、少なくとも約１０％、又はさらには２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％減少又は予防される。
【００２５】
本発明は、Freireich et al., (1966) Cancer Chemother Rep 50: 219に記載される動物及びヒトに対する投与量（体の表面積１ｍ２当たりのミリグラムに基づく）の相互関係を認識する。体の表面積は、患者の身長及び体重からおおよそ測定され得る。例えば、Scientific Tables,Geigy Pharmaceuticals,Ardley,N.Y.,1970,537を参照されたい。本発明の化合物の有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲、又は範囲の下限が０．００１ｍｇ／ｋｇ〜９００ｍｇ／ｋｇのいずれかの量であり、且つ範囲の上限が０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇのいずれかの量であるいずれかの範囲（例えば、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。有効用量はまた、当業者によって認識されるように、治療される疾患、投与経路、賦形剤の使用、及び他の薬剤の使用などの他の治療的処置との同時使用の可能性に応じて変わる。
【００２６】
実施において、本発明の組成物及び方法は、単独で、又は医薬組成物の成分として、静脈内、経口、非経口、吸入噴霧により、局所、直腸内、経鼻、口腔、経膣又は注入リザーバーを介して投与できる抗ＩＬ−１２阻害剤を含んでもよい。本発明のＩＬ−１２阻害剤及び方法の他の非限定的な送達例としては、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、幹内（intrastemal）、鞘内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術が挙げられる。特定の実施形態において、ＢヘルパーＴ細胞は、単離され、インビトロにおいて処置され、次いで治療するために対象に戻されてもよい。
【００２７】
例えば、本発明は、滅菌注射組成物、例えば滅菌注射水性又は油性懸濁剤として調製され、投与されてもよく、適切な分散剤又は湿潤剤（例えばTween80など）及び懸濁化剤を用いて当技術分野において公知の技術に従って製剤化できる。滅菌注射用製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール溶液などの、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射液剤又は懸濁剤であってもよい。使用され得る許容される媒体及び溶媒の中には、マンニトール、水、リンガー溶液及び生理食塩水がある。さらに、無菌の不揮発性油が、従来のように溶媒又は懸濁媒質（例えば合成モノグリセリド又はジグリセリド）として使用される。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油又はヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型において天然の薬学的に許容される油であるため、注射用製剤において有用である。これらの油剤又は懸濁剤はまた、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、又はカルボキシメチルセルロース（carboxymnethyl cellulose）若しくは同様の分散剤を含んでもよい。Tween若しくはSpan又は他の同様の乳化剤などの他の一般的に使用される界面活性剤或いは薬学的に許容される固体、液体又は他の剤形の製造において一般的に使用される生物学的利用能増強剤もまた、製剤化の目的のために使用されてもよい。
【００２８】
本発明の別の例は、限定されないが、カプセル剤、錠剤、乳剤及び水性懸濁剤、分散剤及び液剤を含む、任意の経口的に許容される剤形であり得る経口投与用の組成物である。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体としてはラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの平滑剤もまた、典型的に加えられる。カプセル剤の形態における経口投与のために、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤又は乳剤が経口投与される場合、活性成分は、乳化剤又は懸濁化剤と混合された油性相に懸濁又は溶解されてもよい。所望の場合、特定の甘味剤、矯味矯臭剤、又は着色剤が加えられてもよい。鼻エアロゾル又は吸入組成物は、製剤の分野において周知の技術に従って調製でき、ベンジルアルコール若しくは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フッ化炭素、及び／又は当技術分野において公知の他の可溶化剤若しくは分散剤を使用して、生理食塩水中の液剤として調製できる。本発明の化合物はまた、直腸投与のための坐剤の形態で投与できる。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、一般に治療される対象に有害でない、ＩＬ−１２阻害剤が組み込まれ得る薬剤（活性又は不活性）を指す。例えば、本発明の化合物と特異的で、より可溶性の複合体を形成する、シクロデキストリンなどの可溶化剤、又は１若しくは２以上の可溶化剤が、本発明の化合物を送達するための医薬賦形剤として使用されてもよい。他の担体の例としては、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、及び色素剤が挙げられる。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「動物」、「対象」、「哺乳動物」及び「患者」という用語は、限定されないが、ヒト又はウシ、サル、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターなどの動物を含む。
【００３１】
Ｂ細胞により調節される自己免疫障害を治療又は予防することを必要とする患者においてそのＢ細胞により調節される自己免疫障害を治療又は予防するための方法はさらに、投与される患者に有効量のＩＬ−１２阻害剤を投与するステップを含み得る。ＩＬ−１２阻害剤はまた、Ｂ細胞により調節される自己免疫障害又はその症状を予防又は治療するために従来のように使用されるものなどの他の治療剤と共に送達されてもよい。そのような併用療法処置において、ＩＬ−１２阻害剤及び他の薬剤の両方が、従来の方法によって哺乳動物（例えばヒトの男性又は女性）に投与されてもよい。それらの薬剤は、単一の剤形又は別個の剤形で投与されてもよい。他の治療剤の有効量は当業者に周知である。本開示を考慮して、当業者は、他の治療剤の最適な有効量の範囲を決定できる。本発明の特定の実施形態において、本発明のＩＬ−１２阻害剤の有効量は、第２の治療剤がＩＬ−１２阻害剤の効果を増強するか、又は高める場合に減少されてもよい。
【００３２】
併用療法のための薬剤の例としては、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば限定されないが、ＴＮＦ抗体又は断片、可溶性ＴＮＦ受容体又は断片、それらの融合タンパク質、或いは低分子ＴＮＦアンタゴニスト）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩剤、麻酔剤、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ，non-steroid anti-inflammatory drug）、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、駆虫薬、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン（flurorquinolone）、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌剤）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止痢薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン（erythropieitin）（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Neupogen）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、Leukine）、免疫化薬、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、サイクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗欝薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、睡眠薬、交感神経模倣薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくはアナログ、ドルナーゼアルファ（Pulmozyme）、サイトカイン又はサイトカインアンタゴニストが挙げられ得る。適切な投薬量は、当技術分野において周知である。例えば、関連部分が本明細書に参照として組み込まれる、Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif.(2000)を参照されたい。
【００３３】
本発明を用いて診断、予防又は治療され得る自己免疫疾患の非限定的な例としては、少なくとも部分的に又はさらには主に、自己抗原に対する免疫グロブリン応答を含み得る自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、若年発症糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、炎症性腸疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎、多発性内分泌腺不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、グレーブス病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃の萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄疾患、多発性硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、クレスト症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症、及び毛細血管拡張症）、成人発症型糖尿病（II型糖尿病）、男性及び女性自己免疫不妊症、強直性脊椎炎（ankylosing spondolytis）、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合性結合組織疾患、結節性多発動脈炎（polyarteritis nedosa）、全身性壊死性血管炎、若年発症関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、再発性流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形紅斑、心臓切開術後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮剥離症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギウス症、サムプター症候群（Sampter's syndrome）、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎（eosinophilic faciitis）、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、糸球体腎炎、移植片対宿主病、移植拒絶、ヒト免疫不全ウイルス感染症、エコーウイルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、予防接種後症候群、先天性風疹感染、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン−ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、クリオグロブリン血症、ワルデンストロームマクログロブリン血症、エプスタイン−バーウイルス感染、流行性耳下腺炎、エヴァンズ症候群、及び自己免疫性腺機能不全などの自己免疫疾患が挙げられる。
【００３４】
本発明者らは、ＩＬ−１２がヒトにおける抗体応答を調節する主要な分子であることを発見した。機能的ＢヘルパーＴ細胞の頻度が、ＪＤＭ、ＳＹＳ及びＳＬＥを含む、自己免疫疾患において増加することも見出した。ＢヘルパーＴ細胞を標的とすることは、自己免疫疾患における治療的アプローチとして今まで特許請求されていなかった。本発明を用いると、１）ＢヘルパーＴ細胞の発達を阻害するためにＩＬ−１２を遮断すること、２）ＢヘルパーＴ細胞によるＩＬ−２１の分泌を阻害するためにＩＬ−１２を遮断すること、及び３）例えばＣＸＣＲ５又はＩＣＯＳに対するモノクローナル抗体を用いることによって体におけるＢヘルパーＴ細胞の数を減少させるためにそれらのＢヘルパーＴ細胞を標的とすることがここで可能になる。
【００３５】
例えば、皮膚筋炎、及び全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患患者から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ，peripheral blood mononuclear cell）を、ＩＬ−１２中和抗体（抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂ）の存在下又は非存在下で超抗原エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ，superantigen enterotoxin B）と共に培養し、ＩＬ−２１分泌を培養の２日目に分析することが見出された。ＩＬ−１２遮断抗体の添加は、ＳＥＢ反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌を著しく阻害した。したがって、ＩＬ−１２を遮断することは、抗体応答の発達において主要な役割を果たす、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１の分泌を減少させる。
【００３６】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の単離。ＰＢＭＣを、成人健常ボランティアから得たアフェレーシス血液サンプルからフィコール勾配遠心分離により精製し、液体窒素中の１０％のＤＭＳＯ中で凍結を維持した。ナイーブＣＤ４−Ｔ細胞をまず、負の選択により濃縮した：ＰＢＭＣを精製したＣＤ８（HIT8a、eBiosciences社製）、ＣＤ１１ｂ（LM1/2、ATCC）、ＣＤ１１ｃ（B-ly6、BD Biosciences社製）、ＣＤ１４（M5E2、ATCC）、ＣＤ１５（W6D3、BD Biosciences社製）、ＣＤ１６（3G8、Beckman Coulter社製）、ＣＤ１９（J4.119、Beckman Coulter社製）、ＣＤ４５ＲＯ（UCHL1、BD Biosciences社製）、ＣＤ５６（C218、Beckman Coulter社製）及びＨＬＡ−ＤＲ（B8.12.2、Beckman Coulter社製）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、４℃で３０分間インキュベートし、次いでDynabeads Pan Mouse IgG（Dynal社製）と、４℃で３０分間インキュベートした。抗体結合細胞をマグネット（Dynal社製）で除去した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をさらに、ＣＤ８ ＰＥ（RPA-T8、eBiosciences社製）、ＣＤ５６ ＰＥ（B159，BD Biosciences社製）、ＨＬＡ−ＤＲ ＰＥ（G46-6、BD Biosciences社製）、ＣＤ４５ＲＡ Tricolor（MEM-56、Caltag社製）及びＣＤ４＋ Pacific Blue（S3.5、Caltag社製）ｍＡｂで染色した後、ＣＤ８− ＣＤ５６− ＨＬＡ−ＤＲ− ＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ４＋細胞としてFACSAria（BD Biosciences社製）で分取することによって精製した。細胞純度は９９％を超えた。
【００３７】
Ｂ細胞の単離。Ｂ細胞をまず、CD19 MicroBeads及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec社製）を用いる陽性選択によりアフェレーシスＰＢＭＣから濃縮した。次いで、ナイーブ及びメモリーＢ細胞を、ＩｇＤ ＦＩＴＣ（IA6-2、BD社製）、ＣＤ２７ ＰＥ（L128、BD Biosciences社製）、ＣＤ３ ＡＰＣ（SK7、BD Biosciences社製）、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（S-HCL-3、BD Biosciences社製）及びＣＤ１４ ＡＰＣ（TuK4、Caltag社製）ｍＡｂで染色した後、ＩｇＤ＋ ＣＤ２７− ＣＤ３− ＣＤ１１ｃ− ＣＤ１４−細胞及びＩｇＤ− ＣＤ２７＋ ＣＤ３− ＣＤ１１ｃ− ＣＤ１４−細胞としてそれぞれFACSAriaで分類した。細胞純度は９８％を超えた。
【００３８】
ＤＣ及びナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養。単核細胞を、Monocyte Isolation Kit II（Miltenyi Biotec社製）を用いる負の選択によってＰＢＭＣから単離した。ＤＣを、６ウェルプレート（２×１０６細胞／３ｍｌ／ウェル）中で１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸（全てSigma社製）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐ７．２及び１０％の加熱不活性化したＦＢＳ（Hyclone社製）を含有するＲＰＭＩ １６４０完全培地（GIBCO社製）中の５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（R&D社製）及び１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Leukine社製）を用いて単核細胞を培養することによって生成した。サイトカインを２日ごとに加えた。６日目に、樹状細胞を、放射線を照射したＣＤ４０ＬでトランスフェクトしたＬ細胞、ＰＧＮ（５μｇ／ｍｌ、InvivoGen社製）、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich社製）、フラジェリン（２０ｎｇ／ｍｌ、InvivoGen社製）、ＣＬ０９７（イミダゾキノリン化合物、５μｇ／ｍｌ、InvivoGen社製）、加熱殺菌した大腸菌（Escherichia coli）（１０８／ｍｌ、Invitrogen社製）、加熱殺菌した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（１０８／ｍｌ、InvivoGen社製）、又は加熱殺菌したポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）（１０８／ｍｌ、InvivoGen社製）で刺激した。６時間の刺激後、ＴＬＲ−リガンド又は加熱殺菌した細菌に曝露したＤＣを収集し、注意深く洗浄し：ＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＬ細胞で刺激したＤＣを、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（S-HCL-3、BD Biosciences社製）及びＣＤ４０Ｌ ＰＥ（TROP1、BD Biosciences社製）ｍＡｂでの染色後、FACSによってＣＤ１１ｃ＋ＣＤ４０Ｌ−ＤＣとして回収した。活性化ＤＣ（１．３×１０３細胞／ウェル）を、９６ウェル丸底プレート中のＲＰＭＩ完全培地中で同種異系のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（４×１０４細胞／ウェル）と共に７日間培養した。一部の実験において、１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１２ｐ４０（C8.6、eBiosciences社製）又は抗ＩＬ−１２ｐ７０（M122、Pierce社製）遮断ｍＡｂを培養物に加えた。ＩＬ−１２分泌を評価するために、６時間の刺激で収集したＤＣを、平底９６ウェルプレート（２×１０５細胞／ウェル）中でさらに２４時間培養し、分泌したＩＬ−１２を、ＩＬ−１２ｐ７０ＥＬＩＳＡキット（eBiosciences社製）を用いて測定した。
【００３９】
ＣＤ３／ＣＤ２８によるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、ヒト組換えサイトカイン：ＩＬ−１β（R&D社製）、ＩＬ−６（R&D社製）、ＩＬ−１０（R&D社製）、ＩＬ−１２（R&D社製）、ＩＬ−１８（R&D社製）、ＩＬ−２３（eBiosciences社製）、ＩＬ−２７（R&D社製）、ＴＮＦ（R&D社製）、（各々１０ｎｇ／ｍｌ又は示した濃度にて）又はＩＦＮ−α（ＩＦＮ−α２ｂ、５００ＩＵ／ｍｌ、Schering社製）の存在下で、平底９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ完全培地中でプレートに結合したＣＤ３ ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ、OKT3、ATCC）及び可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ、ＣＤ２８．２、BD Biosciences社製）で刺激した。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を７日目に分析した。一部の実験において、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μＭのカルボキシフルオセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（Molecular Probes社製）で標識して、Ｔ細胞の増殖を追跡した。
【００４０】
細胞内サイトカイン染色。７日間刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ホルボールミリステートアセテート（２５ｎｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich社製）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich社製）で６時間、最後の４時間はGolgiPlug（BD Biosciences社製）の存在下で再刺激した。次いで、細胞を固定し、Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilizationキット（BD Biosciences社製）を用いて透過処理し、細胞質中で発現したサイトカインを、ＩＬ−２１ ＰＥ又はＡＰＣ（3A3-N2、eBiosciences社製）、ＩＬ−１７Ａ ＰＥ（64DEC17、eBiosciences社製）、及びＩＦＮγ ＡＰＣ（B27、BD Biosciences社製）ｍＡｂを用いて分析した。細胞を、１％のパラホルムアルデヒドで固定した後、FACS Calibur又はFACS CantoIIで採取した。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＦＳＣ高細胞）中のサイトカイン発現を、Flowjoソフトウェア（TreeStar社製）を用いて分析した。
【００４１】
活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、残留ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを除去するために、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（S-HCL-3、BD Biosciences社製）での染色後、ＦＳＣ高細胞（ＣＤ３／２８刺激）、又はＣＤ１１ｃ低ＦＳＣ高細胞（ＤＣで共培養）として７日目に分類した。分類したＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６平底ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル）中の１０％のＦＢＳを補充したYssel培地（Gemini社製）中でプレートに結合したＣＤ３ ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）及び可溶性ＣＤ２８ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）で再刺激した。２４時間後、産生したＩＬ−２１レベルを、Luminexアッセイを用いて評価した。
【００４２】
Luminex技術を使用するヒトＩＬ−２１ビーズベースアッセイの開発。TGCTGGCTA及びTGAによって結合されており、マウスシグナリングリンパ球活性化分子ファミリーメンバー１シグナルペプチド（gb|EDL39054.1|）残基１〜２４、ＧＬ、gb|ABN54273.1|セルロソームアンカリングタンパク質残基１０５０〜１２１９、ＬＥＡＤ、及びgb|AAG29348.1|ヒトインターロイキン２１残基３０〜１６２をコードする配列を、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＭ８（Seed社製、１９８７）のHindIII-NotI間に挿入するためにＰＣＲを使用した。このベクターは、コヒーシン−ＩＬ−２１融合タンパク質の分泌を誘導した。天然のヒトＩＬ−２１の分泌を誘導するベクターを、CACCに先行するref|NM_021803.1|残基４７〜５３５を、pIRES2-DsRed2（Clontech社製）のNheI-NotI間に挿入することによって操作した。分泌タンパク質を、１Ｌのトランスフェクション当たり１．３ｍｌの２９３Fectin試薬で１ｍｇの全プラスミドＤＮＡに基づいて製造業者のプロトコルに従ってFreeStyle（商標）293Expression System（Invitrogen社製）を用いて生成した。トランスフェクトした細胞を３日間培養し、培養上清を収集し、０．５％のペニシリン／ストレプトマイシン（Biosource社製）を含む新鮮な293Freestyle（商標）培地（Invitrogen社製）を、２日間インキュベーションを継続しながら加えた。培養上清（１Ｌ）を、ＰＢＳで洗浄した２０ｍｌのＱセファロースカラム（GE Healthcare社製）に導入し、次いでＰＢＳ＋１ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で溶出した。溶出した画分を、注文製の１ｍｌの抗コヒーシンｍＡｂカラムに通し、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍのグリシン ｐＨ２．７で溶出し、次いでＤＰＢＳに対して透析した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、濃度は２８０ｎｍにおける理論的吸光係数に基づいた。
【００４３】
ヒトＩＬ−２１に対するマウスｍＡｂを、迅速な反復免疫戦略により生成した。手短に述べると、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０μｇのコヒーシンＩＬ−２１融合タンパク質及びＲｉｂｉ又はＣｐＧ（1017 ISS、Dynavax社製）アジュバントを用いて、３０〜４０日の期間７〜９回、フットパッド注射により免疫化した。高くなった血清力価の観測時に、低い血清耐性に適合されている、Ｐ３×６３、Ａｇ８．６５３（ATCC CRL-1580）及び／又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株とのＰＥＧ誘導性体細胞融合のために、鼠径及び膝窩の流入領域リンパ節を収集する前に１０μｇの追加免疫を３〜４日与えた。１：２５の希釈でハイブリドーマ上清を、対照コヒーシン融合タンパク質で０．５μｇ／ｍｌにて、又は０．２μｇ／ｍｌのコヒーシン−ＩＬ−２１にてコーティングしたプレートを用いて直接ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。上清をまた、モノクローナル抗体を係留するためにヤギ抗マウスＩｇＧでコーティングしたプレートを用いて捕捉ＥＬＩＳＡフォーマットにおいてスクリーニングし、０．０６２５μｇ／ｍｌにてビオチン化したＩＬ−２１、続いてニュートラアビジン−ＨＲＰで検出した。最も強力な抗体を生じるハイブリドーマは、純粋な抗体の産生のためにクローニングされ、規模を合わされた単一細胞であった。ｍＡｂを、ＩＬ−２１を検出できる対を確立するためにチェッカーボードＥＬＩＳＡフォーマット（checkerboard ELISA format）において試験した。ｍＡｂを２μｇ／ｍｌにてプレートに結合させ、次いで２ｎｇ／ｍｌ及び２０ｐｇ／ｍｌにてＩＬ−２１、次いで１００ｎｇ／ｍｌにてビオチン化ｍＡｂとインキュベートし、続いてニュートラアビジン−ＨＲＰで検出する。首尾よく対を形成したｍＡｂをさらに、１００ｎｇ／ｍｌ〜４５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２１滴定によってこのＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングし、１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ｍＡｂパートナーで検出した。ＥＬＩＳＡにおいて最も感受性であったそれらの抗体を、ビーズにコンジュゲートし（タンパク質のカルボキシル化ミクロスフェアに対する２段階のカルボジイミドカップリングのためのLuminex Corporationプロトコル、２００６年１月）、４０００ｐｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの連続滴定の組換えヒトＩＬ−２１並びに天然のヒトＩＬ−２１を含むと予想されるイノマイシン及びＰＭＡで刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞からの上清の希釈物とインキュベートした。検出ｍＡｂをビオチン化し、０．５μｇ／ｍｌにて使用した。選択したｍＡｂ対は、ＩＬ−２１発現ベクターをトランスフェクトした２９３Ｆ細胞から分泌されたＩＬ−２１を検出した。２つの市販供給源からの組換えＩＬ−２１より著しく強力であったコヒーシン−ＩＬ−２１を標準物として使用した。
【００４４】
最後のLuminexアッセイは、少なくとも４０００ｐｇ／ｍｌの範囲にわたって１ｐｇ／ｍｌのｈＩＬ−２１に感受性であった。ＩＬ−２１対を、Upstate Beadlyte Human 26 plex multiplex標準物で試験した。この分析物のいずれも交差反応はなかった。ＩＬ−２１対はまた、Upstate human 22 plexで多重化され得る。Luminexビーズコンジュゲーション及び一般的アッセイ条件はGiavedoni, et al.により詳述される（Giavedoni, 2005）。SeroMAPビーズ（region 26）を、５００μｌの５０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．０中の５μｇのｍＡｂにて最適な１×１０７ビーズの結合で使用した。検出ｍＡｂのビオチン化を、２５×NHS-LCビオチン（Pierce社製）で行い、このアッセイにおいて０．５μｇ／ｍｌにて使用した。２μｇ／ｍｌにてProzyme社製のPhycolink Strepavidin R-Phycoerythrin PJ31Sをレポーターとして使用した。
【００４５】
Ｔ細胞及びＢ細胞の共培養。活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を上記のように分類し、エンドトキシンが低下したＳＥＢ（０．２５ｎｇ／ｍｌ；Toxin technology, Inc社製）の存在下で、９６ウェル丸底プレート中のYssel培地／１０％のＦＢＳ中で自己メモリーＢ細胞（各々４×１０４細胞／ウェル）と共培養した。一部の実験において、抗ＩＬ−２ｍＡｂ（PAB956、BIIR社製）、抗ＩＬ−４ｍＡｂ（MP4-25D2、BD社製）、抗ＩＬ−１０ｍＡｂ（PAB548、BIIR社製）、抗ＩＦＮ−γｍＡｂ（B27、BD Biosciences社製）、ＩＣＯＳ−Ｌ−ｍＩｇＦｃ（Ancell社製）、ＩｇＧ１Ｆｃ又はＩＬ−２１Ｒ／Ｆｃ（両方ともR&D systems社製）を培養物に加えた。培地中で産生したＩｇ（ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ）を、６又は１４日目にＥＬＩＳＡにより分析した。
【００４６】
Ｉｇ ＥＬＩＳＡ。Ｉｇの測定のために、培養上清を、５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ Ａｂ（全てSouthernBiotech, Inc.社製）でコーティングした９６ウェルマイクロプレート（Nunc社製）中で、室温にて２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、（それぞれ、１／２０００、１／２５００又は１／２５００の最終希釈にて）アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ又はＩｇＡ Ａｂ（全てSouthernBiotech, Inc.社製）と共に、室温にて１時間インキュベートした。次いで、プレートを、広範囲に洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma社製）とインキュベートした。反応を３ＮのＮａＯＨで停止し、吸光度をSpectraMaxプレートリーダー（Molecular Devices社製）により読み取った。
【００４７】
ＳＥＢとのＰＢＭＣ培養。精製した新鮮なＰＢＭＣ（２．５×１０５細胞／ウェル）を、抗ＩＬ−１２ｐ４０又はＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂの存在下又は非存在下で、９６ウェルプレート中で４８時間、ＳＥＢ（０．１μｇ／ｍｌ）と培養し、分泌したサイトカインをLuminexにより測定した。
【００４８】
ＣＤ４−Ｔ細胞表現型の分析。ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞亜集団を分析するために、自己免疫疾患患者及び年齢が一致した健常者から得た新鮮な全血サンプルを、抗ＣＸＣＲ５−Ａｌｅｘａ ４８８、ＣＣＲ６−ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ−ＥＣＤ、ＣＸＣＲ３−ＰＣ５、ＣＣＲ４−ＰＣ７、ＩＣＯＳ−ＡＰＣ、ＣＤ３−ＡＦ７００、ＣＤ８−ＡＰＣ Ｈ７、ＣＤ４５ＲＡ Pacific Blue、及びＣＤ４５ Pacific Orange ｍＡｂで染色した。細胞を、FACSAriaを用いて採取し、FlowJoソフトウェア（TreeStar社製）で分析した。
【００４９】
ＢヘルパーＴ細胞の発達のための主要因子としてのＩＬ−１２。ＩＬ−２１は、Ｔ細胞サイトカイン及びＮＫＴ細胞サイトカインであり、それらは免疫系の多くの細胞で作用する。特に、ＩＬ−２１は、抗体分泌形質細胞に対してＢ細胞の成長及び分化を促進する。図１は、ＩＬ−１２の存在下で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、多量のＩＬ−２１を産生することを示す。手短に述べると、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、サイトカイン（５００ＩＵ／ｍｌにおけるＩＦＮ−αを除いて１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、プレートに結合した抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂで７日間刺激した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−αは、ＩＬ−２１を分泌できるＣＤ４＋ Ｔ細胞を誘導しなかった。しかしながら、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２１を産生できるＣＤ４＋Ｔ細胞の発達を促進した。ＣＤ３／ＣＤ２８による再活性化の際に、ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ナノグラム量のＩＬ−２１（２００μｌ当たり５×１０４細胞の培養物中に３．３±０．４ｎｇ／ｍｌ、平均±ｓｅｍ、ｎ＝５）を分泌できたが、ＩＬ−２３で初回刺激したものはピコグラム量（４０±４ｐｇ／ｍｌ、平均±ｓｅｍ、ｎ＝５）のみを分泌した。したがって、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２１を産生するようにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を強く誘導する。
【００５０】
図２は、ＩＬ−１２の存在下で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、免疫グロブリンを産生するように自己Ｂ細胞を誘導できることを示す。手短に述べると、ＩＬ−１２又は他のサイトカインの存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂにより活性化したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を７日目に分類し、抗ＩｇＭ ｍＡｂ及びＣｐＧ（ＴＬＲ−９リガンド）で予め活性化した自己血液ＩｇＤ＋ＣＤ２７−ナイーブＢ細胞と共培養した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ, staphylococcal enterotoxin B）、超抗原をＴ−Ｂ相互作用を誘導するために加え、分泌したＩｇを１４日目に測定した。サイトカインで初回刺激していないＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｉｇを分泌するようにナイーブＢ細胞を誘導できなかった（Ａ、なし）。対照的に、ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡを含む、Ｉｇを分泌するようにナイーブＢ細胞を誘導した。ＩＬ−２３で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したナイーブＢ細胞は、著しく低い量のＩｇを産生した。
【００５１】
同様に、ＩＬ−１２で初回刺激したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２３で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞より著しく高い量でＩｇＤ−ＣＤ２７＋メモリーＢ細胞からのＩｇ産生を誘導した（Ｂ）。したがって、ＩＬ−１２は、Ｂ細胞を補助できる細胞になるようにＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導する。
【００５２】
図３は、ＩＬ−１２の存在下で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＩＬ−２１に依存的に免疫グロブリンを産生するようにＢ細胞を誘導することを示す。手短に述べると、ＩＬ−２１の機能を阻害する、可溶性ＩＬ−２１受容体／Ｆｃキメラタンパク質を、ＩＬ−１２で初回刺激したＢ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養物に加えた。遮断ＩＬ−２１は、Ｂ細胞がＩｇを分泌するのを著しく阻害した。したがって、ＩＬ−１２で初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌したＩＬ−２１は、Ｂ細胞による抗体産生の誘導において基本的な役割を果たす。
【００５３】
図４は、活性化ＤＣが、ＩＬ−１２を介してＩＬ−２１産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導することを示す。手短に述べると、ＤＣを、大腸菌（グラム陰性）、黄色ブドウ球菌（グラム陽性）、及びポルフィロモナス・ジンジバリス（グラム陽性）を含む加熱殺菌した細菌と６時間インキュベートし、次いで同種異系ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と培養した。７日目に分類した活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂで２４時間再刺激して、ＩＬ−２１分泌を測定した。細菌により活性化したＤＣで初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、刺激されていないＤＣで初回刺激したものより多いＩＬ−２１を分泌した。ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の両方を阻害する、抗ＩＬ−１２ｐ４０遮断ｍＡｂの添加は、ＤＣ−Ｔ細胞共培養の間、細菌により活性化したＤＣによるＩＬ−２１産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の発達を著しく阻害した。特に、ＩＬ−１２のみを阻害する、抗ＩＬ−１２ｐ７０遮断ｍＡｂの添加は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１分泌を著しく阻害するのに十分であった（８５±５％の阻害、平均±ｓ．ｅ．ｍ．ｎ＝５）。したがって、細菌を感知したＤＣによるＩＬ−２１産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導はＩＬ−１２により媒介された。
【００５４】
図５は、遮断ＩＬ−１２が、Ｂ細胞を補助できるＴ細胞の発達を阻害することを示す。手短に述べると、細菌により活性化したＤＣと培養することにより活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞を７日目に分類し、自己メモリーＢ細胞と共培養した。細菌により活性化したＤＣで初回刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｉｇを産生するようにＢ細胞を誘導した。Ｂ細胞によるＩｇ分泌の誘導は、抗ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＡｂをＤＣ−Ｔ細胞共培養の間に加えた場合に著しく損なわれた。しかしながら、抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂでＩＬ−１２を遮断することは、ＢヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の発達を阻害するのに十分であった。したがって、活性化ＤＣにより分泌したＩＬ−１２は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＢヘルパーＴ細胞への分化に不可欠である。
【００５５】
ＩＬ−１２はＩＬ−２１分泌を制御する。図６は、ＩＬ−１２がメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２１分泌の分泌を制御することを示す。手短に述べると、単核細胞（ＰＢＭＣ）を成人健常者の血液サンプルから単離し、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で刺激した。産生したＩＬ−２１レベルを培養の４８時間に分析した。ＰＢＭＣは、４８時間ＳＥＢと培養した場合、多量のＩＬ−２１を産生した（Ａ、７４０±２５０ｐｇ／ｍｌ、平均±ｓ．ｅ．ｍ．ｎ＝７）。抗ＩＬ−１２ｐ７０ ｍＡｂで４８時間の活性化時間の間にＩＬ−１２を遮断することは、ＩＬ−２１分泌の著しい低下を生じた（Ａ及びＢ、１１０±３０ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝７、ｐ＜０．０５）。抗ＩＬ−１２ｐ４０ ｍＡｂでのＩＬ−１２及びＩＬ−２３の両方の遮断は、ＩＬ−１２のみを遮断するのに匹敵するレベルでＩＬ−２１分泌を低下させた（１２０±４０ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝６）。ＩＬ−１２を遮断することは、ＩＬ−２、ＩＬ−５、及びＩＬ−１７を含む他のサイトカインの分泌を変化させなかった（Ｂ）。したがって、ＩＬ−１２を遮断することは、ＩＬ−２１及びＩＦＮ−γの両方の分泌を特異的に阻害した。したがって、ＩＬ−１２は、ＩＬ−２１産生メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞に直接的に作用し、ＩＬ−２１の分泌を促進する。
【００５６】
自己免疫疾患の血液中の機能的ＢヘルパーＴ細胞の増加した頻度
自己抗体関連自己免疫疾患の例：皮膚筋炎（ＤＭ，dermatomyositis）
ＤＭは自己免疫炎症性筋疾患である。ＤＭを有する患者は近位筋力低下及び特徴のある皮膚発疹を含む全身性炎症の特徴を示す。米国におけるＪＤＭの発生率は、１年当たり１００万人の子供当たり３．２人である。発症する平均年齢は７歳であるが、２５％の患者は発症時、４歳より若い。米国において、少女対少年の比は２．３対１である。成人のＤＭは、４０〜６０歳の範囲で最も多く、米国において１００，０００人の中から約２人で観察される。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞は主にＤＭの炎症部位に蓄積する（図７）。多くのＤＭ患者は広範なレパートリーの自己抗体を示すので、Ｂ細胞は、ＤＭ発症において重要であると提案されている。実際に、リツキシマブ（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）を用いる２つの最近のパイロット試験は、Ｂ細胞の欠失がＤＭ患者に有益であることを示した。
【００５７】
図８は、若年性皮膚筋炎（ＪＤＭ）患者を含む、自己免疫疾患患者が、健常者対照と比較して、偏ったＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞サブセットを示すことを証明する。
【００５８】
ＣＸＣＲ５、ケモカイン受容体を発現する血液ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗体応答に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットを表す。ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３ ｍＡｂ及びＩＣＯＳで刺激した場合、多量のＩＬ−２１を分泌する。ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞内で、３種の主要な亜集団を同定した：Ｔｈ１（ＣＸＣＲ３＋）、Ｔｈ２（ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６−）及びＴｈ１７（ＣＣＲ６＋）細胞。Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞は効率的なＢ細胞ヘルパーであるが、Ｔｈ１細胞はＢ細胞を完全に補助できない（Ａ）。
【００５９】
全身性関節炎（ＳＹＳ）及びＪＤＭ患者を表したＰＢＭＣの表現型分析は、年齢が一致した健常者対照より少ないＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１（ＣＸＣＲ３＋）及び多いＣＸＣＲ５＋Ｔｈ２（ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６−）細胞を示す（Ｂに示す）。ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１７（ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ６＋）細胞の頻度は、健常者対照よりＪＤＭ及びＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）において高かった。さらに、ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞集団の頻度は、他の自己免疫疾患のものよりＪＤＭにおいて高かった。ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ２細胞集団はＳＬＥにおいて著しく高く、ＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１７細胞集団は乾癬性関節炎（ＰＳＯＡ，psoriatic arthritis）においてより高かった。注目すべきことに、最も高いＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１７細胞を示した４人のＪＤＭ患者のうちの３人は、研究したコホートの中で最も病気が重く、最も難治性の患者であった（筋肉酵素の継続的上昇、ＣＭＡＳは４０未満であり、持続性の皮膚発疹）。ＪＤＭにおけるＣＸＣＲ５＋Ｔｈ１細胞の頻度は、他の２つの自己免疫疾患においてより著しく低かった。したがって、ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットは、最も効率的なＢ細胞ヘルパーを表す、Ｔｈ２及び／又はＴｈ１７細胞に対してＳＹＳ、ＳＬＥ及びＪＤＭにおいて偏った。この免疫異常調節は、病原性自己反応性Ｂ細胞の生成の原因となり得る。
【００６０】
活動性ＪＤＭ患者から得たメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞による増加したＩＬ−２１分泌。図９は、活動性ＪＤＭ患者から得た末梢血単核細胞が多量のＩＬ−２１を分泌することを実証する。手短に述べると、新鮮なＰＢＭＣを、乾癬性関節炎（ＰＳＯＡ）、ＪＤＭ、ＳＹＳ、及びＳＬＥ小児患者から得て、ＳＥＢで刺激した。産生したＩＬ−２１レベルを４８時間に測定した。注目すべきことに、最も高いＩＬ−２１分泌を示した（円で示した）５人のＪＤＭ患者のうちの３人は、プレドニゾロンの投与を必要とされる活動性患者の中であった。したがって、活動性ＪＤＭ患者の血球は、活性化時に多量のＩＬ−２１を分泌する。
【００６１】
図１０は、ＩＬ−１２が、自己免疫疾患患者から得たＰＢＭＣによるＩＬ−２１分泌の誘導においても主要なサイトカインであることを示す。手短に述べると、ＪＤＭ、ＳＹＳ、及びＳＬＥ患者からのＰＢＭＣを、ＩＬ−１２中和ｍＡｂの存在下又は非存在下で、ＳＥＢで刺激し、分泌したＩＬ−２１レベルを分析した。ＩＬ−２１分泌は、全ての試験した自己免疫疾患由来のＰＢＭＣの培養物中のＩＬ−１２を遮断することにより著しく阻害し（ＪＤＭ：ｎ＝２０、ｐ＝０．００２７；ＳＹＳ：ｎ＝７、ｐ＝０．０１５；ＳＬＥ：ｎ＝１５、ｐ＝０．００２、対応ｔ検定）、これは、成人健常者から得たサンプルによる研究結果と一致する。したがって、ＩＬ−１２は、ＪＤＭ、ＳＹＳ、及びＳＬＥを含む、自己免疫疾患においてメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２１分泌の誘導に不可欠な役割を果たす。
【００６２】
本明細書で論じられたいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、キット、試薬、又は組成物に関しても、実行することができ、逆も同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
【００６３】
本明細書に記載された特定の実施形態は、例証として示されており、本発明の限定として示されるのではないことは、理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態に用いることができる。当業者は、本明細書に記載された特定の手順の多数の均等物を認識し、又は日常的な実験だけを用いて確かめることができよう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲によって網羅されている。
【００６４】
本明細書で言及された全ての刊行物及び特許出願は、本発明に関する当業者の技術のレベルを示している。全ての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が明確且つ個別に示されて参照により組み込まれているかのように、同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６５】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において用語「含むこと（comprising）」と共に用いられる場合の用語「１つの（a）」又は「１つの（an）」の使用は、「１の（one）」を意味することができるが、それはまた、「１又は２以上」、「少なくとも１の」、及び「１又は１より多い」という意味と一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指す、又は代替物が相互排他的であることを明確に示されていない限り、「及び／又は」を意味するように用いられるが、本開示は、代替物のみを指す定義と「及び／又は」を支持する。本出願を通して、用語「約」は、値が、装置、その値を決定するために用いられることになっている方法についての誤差の固有の変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００６６】
本明細書及び特許請求の範囲に用いられる場合、用語「含むこと（comprising）」（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含むこと（comprising）の任意の形）、「有すること（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」などの有すること（having）の任意の形）、「含むこと（including）」（及び「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含むこと（including）の任意の形）、又は「含むこと（containing）」（及び「含む（contains）」及び「含む（contain）」などの含むこと（containing）の任意の形）は、包括的であり、又は限度を設定せず、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。
【００６７】
本明細書に用いられる場合、用語「又はそれらの組合せ」は、その用語の前にある列挙された項目の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び特定の状況において順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢもの少なくとも１つを含むことを意図される。この例に関して引き続き述べると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１又は２以上の項目又は用語の反復を含む組合せが明確に含まれる。当業者は、状況から他に明らかなことがない限り、典型的には、任意の組合せにおいて項目又は用語の数への制限はないことを理解されよう。
【００６８】
本明細書に開示及び主張された組成物及び／又は方法の全ては、本開示に照らせば、過度の実験なしに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本明細書に記載された組成物及び／又は方法、及び方法のステップにおいて、又はステップの順序において、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、改変を適用することができることは、当業者にとって明らかであり得る。当業者にとって明らかな全てのそのような類似した代替形態及び修正形態は、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念内にあると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢヘルパーＴ細胞活性を遮断するのに十分な量でＩＬ−１２阻害剤を含む有効量の治療組成物を、自己免疫障害を有する対象に投与するステップを含む、自己免疫障害を治療するための方法。
【請求項２】
ＩＬ−１２阻害剤が少なくとも１つの遮断抗ＩＬ−１２抗体又はその断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−１２阻害剤が、１回当たり１〜１，０００ｍｇの用量で投与されるＩＬ−１２阻害抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩＬ−１２阻害剤がＩＬ−１２阻害抗体を含み、対象に前記抗体を反復用量で与える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ−１２阻害剤が、ヒト人間以下の霊長類の抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択される抗ＩＬ−１２抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＩＬ−１２阻害剤がＩＬ−１２のＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又は他の核酸阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎及び線維性肺胞炎からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞又はマクロファージ又は炎症性サイトカインに対する二次治療薬を別個に投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗原に対する抗原特異的Ｂ細胞応答を高める方法であって、
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、
ＢヘルパーＴ細胞を発達及び活性化させるのに十分な有効量のＩＬ−１２を用いて、抗原負荷した樹状細胞の存在下で前記ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を成熟させるステップと
を含み、前記ＩＬ−１２で処理したＢヘルパーＴ細胞がナノモル量のＩＬ−２１を分泌する、方法。
【請求項１１】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が負の選択によって末梢血単核細胞から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗原がウイルス、細菌、真菌、癌又は毒素から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
Ｂ細胞による自己免疫性抗体の分泌によって引き起こされる自己免疫障害のための治療を必要とする疑いのある患者を同定するステップと、
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞を阻害するのに十分な量の抗ＩＬ−１２阻害剤で前記患者を治療するステップと
を含む、自己免疫疾患をモジュレートする方法。
【請求項１５】
抗ＩＬ−１２阻害剤が、抗ＩＬ−１２ｐ４０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１２ｐ７０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１２受容体、可溶性の不活性ＩＬ−１２及びそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＩＬ−１２阻害剤がＩＬ−１２受容体アンタゴニストを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が負の選択によって選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が活性化樹状細胞の存在下で活性化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、関節炎、全身性関節炎及び乾癬性関節炎から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１２阻害剤が、自己免疫性抗体が発達する前に自己免疫疾患に感受性である疑いのある対象に提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、
ＩＬ−１２の存在下で標的抗原を発現する活性化樹状細胞の存在下で前記ナイーブＣＤ４Ｔ細胞を成熟させるステップと、
を含む方法によって作製されるＢ細胞ヘルパーＴ細胞であって、前記成熟したＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が抗原に応答してナノモル量のＩＬ−２１を放出する、Ｂ細胞ヘルパーＴ細胞。
【請求項２３】
ＩＬ−２１分泌ＢヘルパーＴ細胞を、ＩＬ−１２阻害剤を含む組成物に曝露することにより、免疫グロブリン分泌細胞へのＢ細胞の増殖、成熟及び活性化を調節する方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１２阻害剤が、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞によるＩＬ−２１及びＩＦＮ−γの両方の分泌を減少させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ナノモル量のＩＬ−２１の放出を誘発するのに十分な量のＩＬ−１２と共にナイーブＣＤ４Ｔ細胞をインキュベートするステップを含む、ＢヘルパーＴ細胞を濃縮する方法。
【請求項１】
ＢヘルパーＴ細胞活性を遮断するのに十分な量でＩＬ−１２阻害剤を含む有効量の治療組成物を、自己免疫障害を有する対象に投与するステップを含む、自己免疫障害を治療するための方法。
【請求項２】
ＩＬ−１２阻害剤が少なくとも１つの遮断抗ＩＬ−１２抗体又はその断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−１２阻害剤が、１回当たり１〜１，０００ｍｇの用量で投与されるＩＬ−１２阻害抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＩＬ−１２阻害剤がＩＬ−１２阻害抗体を含み、対象に前記抗体を反復用量で与える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ−１２阻害剤が、ヒト人間以下の霊長類の抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択される抗ＩＬ−１２抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＩＬ−１２阻害剤がＩＬ−１２のＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又は他の核酸阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎及び線維性肺胞炎からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞又はマクロファージ又は炎症性サイトカインに対する二次治療薬を別個に投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗原に対する抗原特異的Ｂ細胞応答を高める方法であって、
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、
ＢヘルパーＴ細胞を発達及び活性化させるのに十分な有効量のＩＬ−１２を用いて、抗原負荷した樹状細胞の存在下で前記ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を成熟させるステップと
を含み、前記ＩＬ−１２で処理したＢヘルパーＴ細胞がナノモル量のＩＬ−２１を分泌する、方法。
【請求項１１】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が負の選択によって末梢血単核細胞から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗原がウイルス、細菌、真菌、癌又は毒素から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
Ｂ細胞による自己免疫性抗体の分泌によって引き起こされる自己免疫障害のための治療を必要とする疑いのある患者を同定するステップと、
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞を阻害するのに十分な量の抗ＩＬ−１２阻害剤で前記患者を治療するステップと
を含む、自己免疫疾患をモジュレートする方法。
【請求項１５】
抗ＩＬ−１２阻害剤が、抗ＩＬ−１２ｐ４０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１２ｐ７０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１２受容体、可溶性の不活性ＩＬ−１２及びそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗ＩＬ−１２阻害剤がＩＬ−１２受容体アンタゴニストを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が負の選択によって選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が、ＣＤ８に対する抗体並びにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６及びＨＬＡ−ＤＲに対する１又は２以上の抗体を用いる負の選択によって末梢血単核細胞から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が活性化樹状細胞の存在下で活性化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、関節炎、全身性関節炎及び乾癬性関節炎から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１２阻害剤が、自己免疫性抗体が発達する前に自己免疫疾患に感受性である疑いのある対象に提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離するステップと、
ＩＬ−１２の存在下で標的抗原を発現する活性化樹状細胞の存在下で前記ナイーブＣＤ４Ｔ細胞を成熟させるステップと、
を含む方法によって作製されるＢ細胞ヘルパーＴ細胞であって、前記成熟したＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞が抗原に応答してナノモル量のＩＬ−２１を放出する、Ｂ細胞ヘルパーＴ細胞。
【請求項２３】
ＩＬ−２１分泌ＢヘルパーＴ細胞を、ＩＬ−１２阻害剤を含む組成物に曝露することにより、免疫グロブリン分泌細胞へのＢ細胞の増殖、成熟及び活性化を調節する方法。
【請求項２４】
ＩＬ−１２阻害剤が、ＣＤ４＋ＢヘルパーＴ細胞によるＩＬ−２１及びＩＦＮ−γの両方の分泌を減少させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ナノモル量のＩＬ−２１の放出を誘発するのに十分な量のＩＬ−１２と共にナイーブＣＤ４Ｔ細胞をインキュベートするステップを含む、ＢヘルパーＴ細胞を濃縮する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５０４５５５（Ｐ２０１２−５０４５５５Ａ）
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２９３７５（Ｐ２０１１−５２９３７５）
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５８８９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３９７４２
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月２９日（２００９．９．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５８８９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３９７４２
【国際公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
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