荷電開始剤ポリマーおよび使用法
重合開始剤基および陽イオン部分を有する正荷電開始剤ポリマーが与えられる。開始剤ポリマーは、表面上での高分子マトリクスの形成のために重合性材料と共に用いることができる。開始剤ポリマーは、マクロマーを用いる細胞カプセル化に特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板表面上に高分子マトリクスを形成するために有用な化合物に関する。更に詳細には、本発明は、生体基板表面上に高分子マトリクスを形成するために有用な開始剤ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞および組織のカプセル化用高分子材料の使用は、疾患および他の医学的徴候の治療用に大きな可能性を提供する。特に有用な用途は、療法を提供するために、患者への移植用のカプセル化組織または細胞のための高分子材料を利用することを含む。哺乳類細胞をカプセル化するための種々の技術が数十年間にわたり知られてきたし、研究設定において用いられてきたが、細胞カプセル化技術が疾患の潜在的治療用に適用されてきたのは、ほんのつい最近のことである。
【０００３】
細胞カプセル化法は、一般に、移植されたカプセル化細胞を宿主免疫拒絶反応から防御するために、細胞または細胞群を物質バリアで取り囲むことを目標としている。細胞周りの物質バリアは、理想的には、細胞が生存したままであり宿主に対する治療価値を提供するために適正に機能することを可能とする。この機能を実行するために、一般的に高分子化合物を含む、細胞をカプセル化するために用いられる材料は、生分解に対して耐性があることが好ましく、細胞反応に関与する細胞老廃物、栄養物、および分子の拡散を可能とするために充分な透過性があることが好ましい。好ましくは、物質バリアは、異種細胞の破壊に寄与することができるであろう免疫グロブリンおよび補体因子などのある種の宿主分子に対して透過性はない。
【０００４】
細胞カプセル化技術の進歩は、細胞周りに形成される物質バリアの選択透過性、機械的性質、免疫防御性および生体適合性を改善することに焦点を合せてきた。高分子電解質錯化、熱可逆ゲル化、界面析出、界面重合、およびフラットシートによるマイクロカプセル化、および中空糸系マクロカプセル化を含む、種々のマイクロ−およびマクロカプセル化技術が研究されてきており、Uludagら Adv. Drug Deliv. Rev.４２：２９〜６４（２０００）により概観されている。
【０００５】
細胞カプセル化のための一つの通常用いられる方法は、ポリアニオン性アルギン酸塩およびポリカチオン性ポリリシンポリマーを用いるアルギン酸塩架橋法である。アルギン酸塩法によるカプセル化は、一般的に、Ｃａ2+イオンを介するアルギン酸塩の架橋およびポリリシンのアルギン酸塩分子との相互作用により起こる。都合悪いことに、細胞カプセル化へのこのアプローチに関連する多くの問題がある。こうした問題には、内部アルギン酸塩コアにおけるＣａ2+の存在に基づくアルギン酸塩マイクロカプセルの膨潤、アルギン酸塩／ポリリシンカプセル中のグルロン酸含量に基づく不充分な生体適合性、およびアルギン酸塩膜の不充分な機械強度が挙げられる。更に、アルギン酸塩カプセル化過程は非特定的であり、カプセル化しようと意図された細胞または細胞群を含有しないか、または、他の非目標生体材料を含有するマイクロカプセルの形成をもたらすことができる。これらの問題のために、細胞カプセル化に対する代替法が調査されてきた。
【０００６】
アルギン酸塩架橋に対する一つの有望な代替法は、界面重合と言われる方法である。界面重合は、その可能性を調査するためにほとんど何もなされていないが、細胞カプセル化およびその治療用途のためのアルギン酸塩カプセル化法のすべての利点を与える可能性を有する。界面重合は、一般に、生体基板の表面上に、合成または天然の重合性ポリマーなどの重合化材料層の形成を含む。高分子材料層の形成は、一般に、重合性ポリマーの存在下で、生体基板の表面上に堆積する重合開始剤の活性化により促進される。
【０００７】
界面重合法における使用のための一部の重合開始剤は、米国特許第５，４１０，０１６号および米国特許第５，５２９，９１４号において実証されてきた。これらの特許には、細胞膜上に重合開始剤、エオシンＹを堆積させ、次に、開始剤を活性化させてマクロマー溶液の重合を促進させることが記載されている。しかし、比較的非極性であるエオシンＹ、低分子量光活性化開始剤染料、またはエオシンに類似の化合物の使用は、界面重合法用の多くの不利を与えると共に、また、移植されるカプセル化細胞を受け取る対象に対する潜在的な問題点を提供する。例えば、これらの染料および他の類似の低分子量化合物は、それらが細胞中に浸透し、正常な生化学経路に干渉することができるので、毒性問題を与える。細胞中に浸透する場合、これらの染料は、外部エネルギー源により活性化される場合にフリーラジカル損傷を引き起こすことができる。染料が形成される高分子層から外に拡散し、それによって宿主生物に対する潜在的な毒性を産生することができる場合、他の欠点が生じてくる。エオシンなどの染料は、また、水溶液中に凝集する傾向があり、それによって、カプセル化法の効率を減少させると共に再現性に伴う問題を持ち込む。最終的に、充分なラジカル連鎖重合を開始することにおけるこれら染料の限定された効率の観点から、１以上の単量体重合「促進剤」を重合混合物に添加することは、多くの場合必要である。これらの促進剤は、また、細胞膜に浸透することができる小分子であり、且つ細胞毒性または発癌性である可能性を有する傾向がある。従って、これら促進剤の使用を最小化することは、また、望ましい。上記問題を克服しようとする試みにおいて、出願者らは、既に、新規な界面重合試薬および技術を紹介してきた（米国特許第６，００７，８３３号および第６，４１０，０４４号を参照すること）。
【０００８】
これらの教示にもかかわらず、界面重合法用の改善された開始剤が望まれている。重合開始剤が目標とされる細胞表面は、極めて複雑で、所期のやり方で機能する開始剤の設計に対して難問を投げかけてくる。例えば、細胞表面は、それらの一部が硫酸化プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンなどの荷電部分を含有する炭水化物基を有する多くの表面タンパク質を含有する。生体表面に局部集中するが、しかし、マイナスのやり方では細胞生理機能に影響を与えない開始剤を設計することは望ましい。例えば、改善された開始剤は、好ましくは、細胞死をもたらすシグナル経路などのいかなる有害な細胞過程をも始動させることなく有効なやり方で細胞表面上に高分子層の形成を促進するべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、基板表面上での本明細書において「高分子マトリクス」とも呼ばれる高分子層の形成に有用な試薬および方法を提供する。更に詳細には、本発明は、負荷電表面上の高分子層の形成に有用である正荷電重合開始剤ポリマーを提供する。正荷電重合開始剤ポリマーは、特に、細胞および組織を生体適合性ポリマーでカプセル化することに対して有用である。
【００１０】
一つの態様において、正荷電重合開始剤ポリマーは、生体表面上での高分子材料の重合を促進するための方法において用いられる。本方法は、一般的に高分子材料により被覆しようと意図される細胞、細胞群、または組織の表面である生体表面を与えることを含む。次に、開始剤ポリマーは、生体表面と接触して置かれる。本発明により、開始剤ポリマーは、（ｉ）重合開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にあるポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む。陽イオン部分は、水溶液中における開始剤ポリマーの溶解性を容易にすることができると共に、また、開始剤ポリマーの細胞表面との結合を可能とする。陽イオン部分は、開始剤ポリマーが、一般的に非極性であり開始剤ポリマーに実質的な程度での疎水性を付与する複数の開始剤基を含有する態様において、特に有利であることができる。好ましくは、陽イオン部分は、また、低〜中程度の重量平均分子量（Ｍw）を有し、複数の開始剤基を含有し、水溶液に可溶である開始剤ポリマーの調製を可能とする。
【００１１】
高分子マトリクスを形成する方法は、また、生体表面に重合性材料を与えることを含む。重合性材料は、一般的に、開始剤ポリマー塗布の前、間または後に塗布することができる重合性ポリマー（例えば、マクロマー）である。適するマクロマーには、好ましくは許容可能程度の生体適合性を有する成形マトリクスを与える天然または合成の重合性ポリマーが挙げられる。生体表面が開始剤ポリマーおよびマクロマーと接触した後、エネルギー源が表面にかけられて開始剤基を活性化させ、それによって、生体表面上または近くのマクロマーの重合を促進する。好ましい態様により、エネルギー源は、長ＵＶ波長、更に好ましくは可視光波長により与えられる。重合は直接または間接であることができるが、間接法は、一般的に、フリーラジカル重合を促進するために受容体または還元剤を利用する。
【００１２】
細胞、細胞群、または組織は、本発明の正荷電開始剤ポリマーを用いてカプセル化することができる。本発明は目標表面としていかなる特定タイプの天然または合成材料にも限定されるものではないが、正荷電開始剤ポリマーは、細胞周りのカプセル化マトリクスの形成を促進する試薬として、特に有用である。カプセル化細胞は、治療効果を与えるために対象中に移植することができる。こうした正荷電開始剤ポリマー用の用途には、糖尿病を患い治療の必要性のある対象中に移植するための膵島のカプセル化が挙げられる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、（ｉ）可視光活性化染料の群から選択される光開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む、正荷電開始剤ポリマーを与える。光開始剤基は開始剤ポリマーの高分子主鎖に結合されるが、好ましい態様において、陽イオン部分は、高分子主鎖にまた結合される陽性基により与えられる。適する光開始剤基には、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料などの可視光活性化染料が挙げられる。
【００１４】
特に有用な開始剤ポリマーには、ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にあり、更に好ましくはｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する状態にあり、最も好ましくはｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正電荷を有する開始剤ポリマーを与える陽性基が挙げられる。これらの陽イオン特性を与える基は、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元（ternary）スルホニウム基などの３元および第４級陽性基から選択することができる。特に有用な開始剤ポリマーは、低〜中程度の分子量範囲、すなわち、約３．２×１０6Ｄａ未満の重量平均分子量（Ｍw）を有する。好ましい開始剤ポリマーは、約２５０，０００Ｄａ以下、１００，０００Ｄａ以下、および５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する。開始剤ポリマーは、１個の好ましくは１個を超える開始剤基を含み、還元剤の存在下でポリマー（例えば、マクロマー）の重合を促進することができる開始剤活性を与える。特に好ましい開始剤ポリマーは、（ｉ）ポリアミン主鎖、（ｉｉ）主鎖に結合される複数の可視光活性化染料、（ｉｉｉ）主鎖に結合される複数の第４級アンモニウム基、および（ｉｖ）約３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを含む。
【００１５】
本発明は、また、表面に対する高分子膜を与えるためのキットを提供する。キットは、少なくとも、正荷電重合開始剤ポリマーおよび開始剤ポリマーと併せて用いることができる重合性材料を含む。キットの開始剤ポリマーは、（ｉ）重合開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にあるポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む。
【００１６】
本発明は、また、本明細書において記載されるように、正荷電開始剤ポリマーを用いる高分子マトリクスによりカプセル化される細胞、細胞群、および組織を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、本明細書において「開始剤ポリマー」とも呼ばれる正荷電開始剤ポリマー、開始剤ポリマーを含む組成物、およびこれらの開始剤ポリマーを用いる表面上または近辺での重合性材料の界面重合を行うための方法を提供する。「ポリマー」は１以上の異なる反復単量体単位を有する化合物を指し、線状ポリマーおよびコポリマー、本明細書において「デンドリマー」と呼ばれる高度に分岐したデンドリマーポリマーおよびコポリマーなどの分岐ポリマーおよびコポリマー、ならびにグラフトポリマーおよびコポリマーなどを含む。「表面」は、広く、あらゆる種類の天然または合成表面を指す。天然表面は、広く、例えば、細胞表面、または細胞群表面、または組織表面などのあらゆる種類の生体材料の表面を指す「生体表面」を含む。合成表面は、プラスチック、セラミック、樹脂、多糖類、シリコン、またはシリカ系材料、ガラス、金属、フィルム、ゲル、膜、ナイロン、絹、羊毛および綿などの天然繊維およびポリマーから作製される機能化および非機能化材料などのあらゆる有用な人工材料を含む。一つの態様において、表面は負電荷を有し、正荷電開始剤ポリマーは反対電荷を介してこの表面に結びつくことができる。
【００１８】
開始剤ポリマーは、また、あらゆる種類の生体外または生体内法において生体表面上に重合化材料のマトリクスを形成するために用いることができるが、それらは細胞カプセル化法に対して特に有用である。細胞カプセル化は、細胞、細胞群、または組織の表面の全体または部分にわたる高分子層の形成を含む。この高分子層は、一般的に、厚さ、透過性、強度、および保護性などの一部の物理および機能特性を有する。任意に、開始剤ポリマーは、天然または合成材料のあらゆるタイプの表面上に重合化材料のマトリクスを形成するために用いることができる。
【００１９】
本発明により、表面に膜を与えるために有用な正荷電開始剤ポリマーは、少なくとも一つの重合開始剤基、およびｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む。開始剤基は、特定的にエネルギーを受入れ、直接的または間接的にフリーラジカル種を発生させることができる開始剤ポリマーの一部を指すと共に、重合性材料のフリーラジカル重合を促進するために充分なものである。陽イオン部分は、ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正電荷を有する開始剤ポリマーを与えると共に、一部の態様において、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０まで、更に好ましくはｐＨ１２を含みｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正電荷を有する開始剤ポリマーを与えることができる。開始剤ポリマーの陽イオン部分は、正荷電高分子主鎖から、主鎖から垂れ下がる陽イオン基から、または両方から得ることができる。大部分の態様において、開始剤ポリマーの陽イオン特性はポリマー主鎖から垂れ下がる陽イオン部分から得られる。「ペンダント基」はその長さに沿ったあらゆる箇所でポリマー主鎖に結合される１以上の化学基、または主鎖のいずれかの末端で結合される化学基、または両方を指す。
【００２０】
一つの態様において、開始剤ポリマーは、細胞カプセル化法などの生体表面を被覆するための方法におけるステップにおいて用いることができる。これらの方法において、開始剤ポリマーは、被覆しようとする表面およびマクロマーなどの重合性材料と併せて用いられる。一部の態様において、開始剤ポリマーはマクロマー成分とは別に細胞に塗布され、他の態様において、開始剤ポリマーおよびマクロマー成分は細胞に対する重合性組成物として一緒に塗布される。従って、本発明は、また、正荷電開始剤ポリマーおよびマクロマー成分を含む組成物を与える。還元剤／受容体および他の重合促進成分、例えば、安定剤、増粘剤、および共触媒などの細胞カプセル化に有用な化合物は、既存ステップ、追加ステップにおいて重合工程中に導入することができるか、または、重合性組成物中の試薬として存在することができる。従って、本発明は、また、重合性組成物、および開始剤ポリマー、マクロマー成分、還元剤／受容体、および増粘剤を含むことができる、表面上にポリマー膜を形成するためのキットを与える。
【００２１】
さらなる特定態様において、本発明は、可視光活性化光開始剤基、およびｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む開始剤ポリマーを与える。可視光活性化光開始剤基は、エオシンなどの可視光活性化染料の群から選択することができる。別の特定態様において、本発明は、複数のポリマー主鎖に結合される可視光活性化光開始剤基、複数のポリマー主鎖に結合される３元または第４級陽性基、および３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する開始剤ポリマーを与える。
【００２２】
本明細書において用いられる「重量平均分子量」またはＭwは、分子量を測定する標準比較方式であり、開始剤ポリマーおよびマクロマーの調製物などの、ポリマー（調製物）の分子量測定のために特に有用である。ポリマー調製物は、一般的に、個々に小さな分子量変動を有するポリマーを含む。ポリマーは比較的高分子量を有する分子であり、ポリマー調製物内のこうした小さな変動は、ポリマー調製物の全体特性（例えば、開始剤ポリマー調製物の特徴）に影響を及ぼさない。重量平均分子量（Ｍw）は以下の式により定義することができる：
【００２３】
【数１】
【００２４】
式中、Ｎは質量Ｍを有する試料中のポリマーの分子数を表し、Σiは調製物中のすべてのＮiＭi（化学種）の総和である。Ｍwは光散乱または超遠心分離法などの通常の技術を用いて測定することができる。ポリマー調製物の分子量を定義するために用いられるＭwおよび他の用語の論議は、例えば、Ａｌｌｃｏｃｋ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｌａｍｐｅ，Ｆ．Ｗ．，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｐｇ ２７１（１９９０）に見出すことができる。
【００２５】
本発明は、また、界面重合法に用いられる化合物群における１成分としての正荷電開始剤ポリマー、および特定疾患の治療方法を、特定的に与える。これらの化合物および方法は、カプセル化細胞または組織が治療的に有用である細胞または組織のカプセル化を実行することができる。例えば、本発明の開始剤ポリマーを用いてカプセル化される膵島は、機能的膵臓組織を必要とする糖尿病患者に移植することができる。
【００２６】
開始剤ポリマーの陽イオン部分により与えられる正電荷は、開始剤ポリマーが特に細胞カプセル化法に対して驚くほどに効果的な重合開始剤として設定されることを可能とすることができる。一つの態様において、開始剤ポリマーの正電荷は、ポリマーに水溶液への高度な溶解性を与えることができる。この水溶液への高度な溶解性は、開始剤ポリマーが、一般的に非極性であり、本来開始剤ポリマーに対して実質的な疎水性程度を与える複数の開始剤基を有する態様において保持することができる。従って、陽イオン部分の存在は、相当な数の開始剤基を含み、開始剤基が活性化される場合に重合開始剤として機能することができる開始剤ポリマーの調製を可能とすることができる。この配置は、低〜中程度のＭwを有する開始剤ポリマーが高水準の細胞生存性を維持しながら細胞カプセル化法において調製され用いることができることが見出されてきたので、特に、有利である。従って、本発明により、開始剤ポリマーの陽イオン部分は、水溶液中に可溶であり、重合性材料の重合を開始するための特定化合物の能力に言及する高度な「開始剤潜在力」を有する開始剤ポリマーの調製を可能とする。この関連で、水溶液中への溶解度を改善するために開始剤ポリマーのサイズを増大させることは必要でない。
【００２７】
別の態様において、開始剤ポリマーの正電荷は、また、負荷電表面、例えば、生体材料の負荷電表面とのその相互作用を可能とすることができる。陰性荷電基を担持する細胞表面タンパク質は、一般的に、細胞表面上に負電荷を付与する。グリコサミノグリカンおよび硫酸化プロテオグリカンなどの表面分子は、細胞の荷電表面に寄与する。しかし、負荷電表面を有する他の生体材料は、また、本発明の開始剤ポリマーと結合することができる表面として適するものであることができる。従って、開始剤ポリマーの陽イオン部分は、細胞カプセル化過程の間、開始剤ポリマーを目標陰イオン表面、特に細胞表面に対して局限化する便利な方法を与える。
【００２８】
本発明により、開始剤ポリマーは、開始剤ポリマーの主鎖に結合される１以上の開始剤基を含む。開始剤ポリマーの開始剤基は、開始剤基が外部エネルギー源により活性化される場合に、マクロマーなどの重合性材料のフリーラジカル重合を促進することができる。活性化開始剤基は、直接的または間接的いずれかで重合性材料のフリーラジカル重合を引き起こすことができる。間接的方法は、一般的に、活性化開始剤基からのエネルギーの、フリーラジカルを形成することができると共に、受容体または還元剤、重合性材料の重合を引き起こすように作用することができる化学種への転位を含む。直接的方法においては、開始剤基はフリーラジカルそれ自体を与える。
【００２９】
本発明により、開始剤ポリマーは生体材料の表面などの負荷電表面に局限化することができる。開始剤基を活性化させると、開始剤ポリマーに近接している重合性材料は重合し、表面上に高分子材料層、すなわちマトリクスの形成をもたらす。このタイプの重合は、一般的に、界面重合と呼ばれる。
【００３０】
開始剤ポリマーは、光活性化光開始剤基、熱活性化開始剤基、化学的活性化開始剤基、またはそれらの組合せを含むことができる。適する熱活性化開始剤基は、４，４’アゾビス（４−シアノペンタン）酸および２，２−アゾビス［２−（２−イミダゾリニ−２−イル）プロパン］ジヒドロクロライドを含むか、またはこれらの開始剤を付与される他の熱活性化開始剤は、開始剤ポリマー中に組み込むことができる。化学的活性化開始は、多くの場合、酸化還元開始、酸化還元触媒作用、または酸化還元活性化を指す。一般に、有機および無機酸化剤、ならびに有機および無機還元剤の組合せは、重合用のラジカルを発生するために用いられる。酸化還元開始の説明は、Principles of Polymerization,2nd Edition，Odian G.，John Wiley and Sons,２０１〜２０４頁（１９８１）に見出すことができる。好ましくは、生体系に有害でない酸化還元開始剤が用いられる。好ましくは、生体系に有害でないエネルギーを用いる光開始剤基および熱活性化開始剤基が用いられる。一つの態様において、長波長ＵＶおよび可視光活性化周波数を有する光開始剤基は、開始剤ポリマーの主鎖に結合される。好ましい態様において、可視光活性化光開始剤はポリマー主鎖に結合される。
【００３１】
光開始は、ノリッシュ（Norrish）タイプＩ反応、分子内または分子間水素抽出反応、および光還元性または光酸化性染料を用いる光感作反応を含む種々の機構により生じることができる。後者の二つのタイプの反応は、一般的に、例えば、第３アミンであることができるエネルギー転位受容体または還元剤と共に用いられる。こうした第３アミンは、マクロマーの高分子主鎖中に組み込むことができる。好ましい態様において、開始剤ポリマーは、分子内または分子間水素抽出反応、または活性化される場合に光還元性または光酸化性染料を用いる光感作反応を可能とする１以上の開始剤基を含む。これらのタイプの開始剤と共に使用するための有用なエネルギー転位受容体または還元剤には、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチル・ジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル・ベンジルアミン、テトラメチル・エチレンジアミンなどの第３アミン；ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル・エタノールアミン、Ｎ−イソプロピル・ベンジルアミンなどの第２級アミン；およびエタノールアミン、リジン、およびオルニチンなどの第１級アミンが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
一つの態様において、３５０ｎｍ以上の吸収帯を有する光開始剤基が用いられる。更に好ましくは、５００ｎｍ以上の吸収帯を有する光開始剤基が用いられる。適する光開始剤基には、長波紫外（ＬＷＵＶ）光活性化性分子および可視光活性化性分子などの光活性化開始剤基が挙げられる。適する長波紫外（ＬＷＵＶ）光活性化性分子には、（（９−オキソ−２−チオキサンタニル）−オキシ）酢酸、２−ヒドロキシ・チオキサントン、およびビニルオキシメチルベンゾイン・メチル・エーテルが挙げられるがそれらに限定されない。適する可視光活性化性光開始剤基には、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３３】
これらの可視光活性化性光開始剤基および光開始剤基一般に関する一つの共通の特性は、非極性部分を有することのそれである。この非極性部分の存在のために、これらの光開始剤基は、一般に、水溶液中への低い溶解度を有する。これらの光開始剤基が開始剤ポリマーなどの別の分子に結合される場合に、光開始剤基は、ポリマーに非極性特性を付与することができると共に、一般に、その水溶液中への溶解度を低下させることができる。
【００３４】
開始剤ポリマーは、生体材料の表面などの基板表面上での重合性材料のフリーラジカル重合を促進するために充分な量において多くの開始剤基を含有する。開始剤ポリマーは、少なくとも一つの、更に一般的には複数の開始剤基を含有する。一部のケースにおいて、開始剤ポリマーは開始剤基を高度に詰め込んでおり、高水準の重合開始剤活性を与えることができる。この配置は、容易には重合して高分子層を形成しないマクロマーを含む方法または組成物において望ましくあることが可能である。それゆえに、本発明は開始剤基が高度に詰め込まれる正荷電開始剤ポリマーを与える。
【００３５】
従って、一つの態様において、開始剤ポリマーは少なくとも一つの開始剤基を含む。更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは５個以上の開始剤基を含み、なお更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは約１０個以上の開始剤基を含む。なお更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは３．２×１０6Ｄａ以下、最も好ましくは２５０，０００Ｄａ以下のＭwを有し、５個以上の開始剤基、更に好ましくは約１０個以上の開始剤基を含む。開始剤基は、あらゆる位置でポリマー主鎖に沿って垂れ下がることができると共に、不規則または規則的なやり方で間隔をとることができる。
【００３６】
開始剤基はあらゆる適する方法を用いて開始剤ポリマーに結合することができる。一つの方法において、例えば、開始剤基を有する重合性モノマーは、合成され、次に重合反応に用いられてペンダント開始剤基を有する開始剤ポリマーを造りだすことができる。開始剤誘導体化モノマーの合成は、標準化学反応を用いて容易に達成することができる。例えば、光活性化染料などの光開始剤基の酸塩化物類似物は、エチレン性不飽和アミン含有モノマーと反応して開始剤誘導体化モノマーを形成することができる。開始剤ポリマーを調製する別の方法において、反応基を有する予備形成ポリマーは開始剤基と反応して開始剤基を予備形成ポリマーに結合させる。例えば、イソチオシアン酸塩または光開始剤の酸塩化物類似物は、ペンダントアミン基を含有するポリマーと反応することができ、それによって、ペンダント開始剤基を担持する開始剤ポリマーを形成する。当業者に公知の他の合成体系は、開始剤ポリマーを調製するために用いることができる。これらの体系は考慮されるが、しかし、更に詳細には検討されない。
【００３７】
好ましい態様において、開始剤ポリマーは非極性である複数の開始剤基を含む。複数の非極性開始剤基の存在は、開始剤ポリマーに実質的な疎水性特質を付与することができる。それゆえに、この実質的な疎水性特質は、以下により詳細に検討される陽イオン部分を開始剤ポリマーに与えることにより、相殺することができる。
【００３８】
開始剤ポリマーの陽イオン部分の正電荷は、開始剤ポリマーの主鎖、主鎖から垂れ下がる正荷電基、または両方により負うことができる。一つの態様において、開始剤ポリマーは、開始剤ポリマーの主鎖から垂れ下がる複数の陽性基を有する；好ましくは、陽性基は３元または第４級アミン基などの第４級イオン部分により与えられる。別の態様において、高分子主鎖は窒素を含有し、例えば、高分子イミンであることができる。本発明の好ましい態様により、陽イオン部分は、水溶液中への溶解性を可能とする正電荷、および／または負荷電表面と相互作用する能力を有する開始剤ポリマーを与えることができる。
【００３９】
ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに対して正電荷を与える陽イオン部分は、開始剤ポリマーが複数の非極性開始剤基を含む態様において、特に有利である。非極性開始剤基により付与される疎水性特質は、水溶液中への開始剤ポリマーの溶解性を改善することができる開始剤ポリマー上に存在する陽イオン部分の存在により中和することができる。本発明により、陽イオン部分は開始剤ポリマーが水溶液中に可溶となることを可能とするように配置されると共に、また、開始剤ポリマーが細胞表面などの負荷電表面と相互作用することを可能とするように配置される。陽イオン部分は、ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する環境下での開始剤ポリマーに正電荷を与えるように配置されると共に、一部の態様において、陽イオン部分は、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する環境下、更に好ましくはｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する環境下での開始剤ポリマーに正電荷を与えるように配置される。
【００４０】
開始剤ポリマーがｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態に正電荷を保持するかどうかを測定するために、多くの試験のうちのいずれか一つを行うことができる。正荷電開始剤ポリマー用の適する試験は、一般に、８以上のｐＨを有する緩衝液を調製し、緩衝液に開始剤ポリマーを添加し、負電荷を与える材料と接触させてポリマー溶液を置き、次に、開始剤ポリマーが負荷電材料と相互作用するかどうかを測定することを含むことができる。例えば、開始剤ポリマーは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、重炭酸アンモニウム、または３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸塩などの適する高ｐＨ緩衝液により８以上のｐＨに調整した溶液に添加することができ；ポリマー混合物は、次に、陰イオン交換マトリクス（例えば、Ｑ−セファローズ（Sepharose）；ニュージャージー州、ピスキャタウエイのアマーシャム・バイオサイエンシズ（Amersham Biosciences Corp.,））に塗布することができ；カラムは、次に、高ｐＨ緩衝液により洗浄することができ；最終的に、カラムは、結合されている場合開始剤ポリマーを解離するために塩含有緩衝液（０．５Ｍ・ＮａＣｌなど）により溶出させることができる。開始剤ポリマーが選択される緩衝液状態に正電荷を保持する場合、それは溶出液中に存在し、分光法により検出可能である。８以上のｐＨを有する溶液中の開始剤ポリマーの電荷を測定するために有用な他の一般的に用いられる分析法は、考慮されるが、更には検討されない。
【００４１】
一部の態様において、開始剤ポリマーは、少なくとも１以上の一般的には複数の陽性基に結合される高分子主鎖を有する。一般にいかなる開始剤基または陽性基の添加なしでのポリマー鎖を指すポリマー主鎖は、一般的に、炭素および好ましくは窒素、酸素、および硫黄から選択される１以上の原子を含む。主鎖は炭素−炭素連鎖を含むことができると共に、一部の好ましい態様において、また、１以上のアミド、アミン、エステル、エーテル、ケトン、ペプチド、または硫化物連鎖、またはそれらの組合せを含むことができる。適するポリマー主鎖の例には、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエーテル（ポリオキシエチレンなど）、ポリスルホン、ポリウレタン、または代表的なモノマー基のあらゆる組合せを含有するコポリマーが挙げられる。
【００４２】
高分子主鎖は、陽性基を結合して開始剤ポリマーを形成するために有用な反応基を含むことができる。適する反応基には、酸（またはアシル）ハロゲン化物基、アルコール基、アルデヒド基、アルキルおよびアリールハロゲン化物基、アミン基、およびカルボキシル基などが挙げられる。これらのペンダント反応基は、開始剤基を結合するため、および一部の態様において、陽性基の高分子主鎖への結合のために用いることができる。これらの化学基は、予備形成ポリマー上または正荷電開始剤ポリマーを造りだすために用いられるモノマー上のいずれかに存在することができる。適する反応基または荷電側基を有するポリマーの例には、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリエチレンイミン、およびポリアミドアミンなどの反応アミン基を有するポリマー、特にデンドリマーが挙げられる。
【００４３】
本発明の一つの態様において、開始剤ポリマーの主鎖は、全体の正電荷を与え、陽イオン部分に寄与する。このタイプの高分子主鎖の例には、また第１級、第２級、または第３アミン基を含むポリイミンなどのイミン結合を有するポリマーが挙げられる。開始剤ポリマーの合成におけるこれらのタイプのポリマーの使用は、複数の陽性基および開始剤基が結合することができる高度誘導体化予備形成ポリマー主鎖をそれらが与えることができるので好ましい。開始剤ポリマーの合成のための出発ポリマーとして特に適するポリアミンには、ポリエチレンイミン、およびポリプロピレンイミンなど、ならびにポリアミンポリマーまたはコポリマー、および特に以下のアミン官能性モノマー：２−アミノメチルメタクリレート、３−（アミノプロピル）−メタクリルアミド、およびジアリルアミンなどのモノマーから形成されるデンドリマーが挙げられる。適するポリアミンは市販されており、例えば、ルパソル（Ｌｕｐａｓｏｌ）（登録商標）ＰＳ（ポリエチレンイミン；ニュージャージー州、ＢＡＳＦ）がある。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、開始剤ポリマーの主鎖は、１以上の陽性基に結合される。好ましい陽性基は安定な正電荷を有し、３元および第４級陽性基を含む。好ましい陽性基には、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元スルホニウムが挙げられる。これらのタイプの陽性基は、他の陽性基が脱プロトン化され、それらの正電荷を失うことができる広い範囲のｐＨ状態において、特に、より高いｐＨ状態において、開始剤ポリマーに正電荷を与えることができる。これらの開始剤ポリマー上の正電荷は、少なくともｐＨ８を含みｐＨ８までのｐＨを有する状態；および一部の態様においてｐＨ１０を含みｐＨ１０までのｐＨを有する状態、および一部の態様においてｐＨ１２を含みｐＨ１２までのｐＨを有する状態に保持される。
【００４５】
示されるように、好ましい陽性基には、第４級アンモニウム、３元スルホニウム、および第４級ホスホニウム基が挙げられる。これらの基は、例えば、各鎖上に１〜６個範囲の炭素を有する、例えば、アルキル化またはアルコキシル化形態において与えることができる。例には、テトラアルキルアンモニウム、テトラアルコキシアンモニウム、トリアルキルスルホニウム、トリアルコキシスルホニウム、テトラアルキルホスホニウム、およびテトラアルコキシホスホニウム陽イオンが挙げられるがそれらに限定されない。特定例には、テトラメチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、およびテトラベンジルアンモニウムなどが挙げられる。
【００４６】
陽性基は、ポリマー主鎖の長さに沿って不規則または規則的パターンで間隔をとることができるか、または、必要に応じてポリマー主鎖の一つの末端上に主として存在することができる。開始剤ポリマーは、また、必要に応じて陽性基の各種組合せを含むことができる。
【００４７】
ポリマー主鎖上に垂れ下がる陽性基の数は、機能性開始剤ポリマーを与えるために整えることができる。開始剤ポリマーの機能には、水溶液中へのその溶解性、表面と結合するその能力、および重合開始剤としてのその有効性を挙げることができる。一つの態様において、陽性基は、水溶液中に開始剤ポリマーを溶解するために充分な量で存在する。別の態様において、陽性基は、開始剤ポリマーの生体表面との相互作用を可能とするために充分な量で存在する。本発明により、開始剤ポリマーは、陽性基に結合される少なくとも一つの単量体単位を有する；更に好ましくは、開始剤ポリマーは陽性基に結合されるその単量体単位の約２０％以上を有し、最も好ましくは、開始剤ポリマーは陽性基に結合されるその単量体単位の約５０％以上を有する。複数の非極性開始剤基が存在する場合に、開始剤ポリマーは、充分な溶解性を与えると共に、また細胞表面に局限化することができる陽イオン部分により整えることができる。これは、開始剤基対陽性基の確定した比率を有する開始剤ポリマーを調製することにより達成することができる。従って、本発明の一つの態様において、開始剤ポリマー上の陽性基：開始剤基の比率は、少なくとも１：１である。更に好ましい態様において、この陽性基：開始剤基比率は少なくとも２．５：１であり、最も好ましい態様比率は少なくとも５：１である。
【００４８】
好ましい態様において、本発明は、正荷電主鎖および正荷電主鎖から垂れ下がる複数の第４級アミン基を有する開始剤ポリマーを与える。親水性主鎖は高分子イミン主鎖であることができると共に、アミン含有主鎖から垂れ下がる複数の第４級アミン基を有することができる。この態様において、第４級アミン基の存在は、開始剤ポリマーが溶液のｐＨにおけるいかなる変動にも拘わらず正電荷を保持し、溶液中への開始剤ポリマーの溶解性を維持することを可能とする。
【００４９】
開始剤基および陽性基を有する開始剤ポリマーは、種々の方法で調製することができる。例えば、開始剤基および陽性基は、開始剤および陽性基と反応する「予備形成」ポリマーまたはコポリマーに結合することができる。予備形成ポリマーまたはコポリマーは、市販元から入手するか、または、望ましいモノマーまたは各種モノマーの組合せの重合から合成することができる。開始剤ポリマーを調製する一つの例において、開始剤基および陽性基は、例えば、共有結合により、ポリマーまたはコポリマーの主鎖から垂れ下がる化学基と反応し、それらに結合される。開始剤基および陽性基のこうした結合は、例えば、置換または付加反応により達成することができる。
【００５０】
本発明の一つの好ましい態様において、開始剤ポリマーはポリマー主鎖としての高度誘導体化予備形成ポリマーを用いて調製される。好ましいポリマーは、ポリマーの分子量に対して、第１級アミン基などの大きい数の反応（誘導体化）基を含有する。適するポリマーおよびコポリマーは、ポリイミン、例えば、ポリエチレンイミンなどのアミン含有高分子単位を含む。開始剤ポリマー用の主鎖としてのこれらのタイプのポリマーまたはコポリマーの使用は、開始剤基および陽性基で高度に詰めることができる低〜中程度分子量の開始剤ポリマーの調製を可能とする。
【００５１】
開始剤ポリマーを調製する別の方法において、第１級、第２級、第３アミン、またはそれらの組合せを有するポリマーは４級化することができ、ポリマー上に荷電第４級アミン基の形成をもたらす。例えば、アミンは、引き続いて、例えば、アルキルハロゲン化物によりアルキル化されて、メンシュツキン（Ｍｅｎｓｈｕｔｋｉｎ）反応を介して第４級アミンを与えることができる。開始剤ポリマーを合成する別の有用な方法において、第３アミンを有するポリマーは、例えば、ベンジルハロゲン化物により誘導体化される光開始剤基と反応することができる。この反応は、光開始剤のポリマーへの結合、および同時に第３アミン基を荷電第４級アミン基に変換することを可能とする。
【００５２】
開始剤ポリマーを調製するなお別の方法において、開始剤基を有するモノマーおよび陽性基を有するモノマーが最初に調製される。これらの開始剤および陽性基含有モノマーは、次に共重合されて、開始剤および陽性基両方に結合される開始剤ポリマーを造りだす。一部の態様において、開始剤基および陽性基両方を有する個々のモノマーは、開始剤ポリマーを調製するために用いることができる。任意に、開始剤または陽性基のいずれにも結合されない他のモノマーは、陽イオンおよび開始剤結合モノマーと重合して開始剤ポリマーを造りだすことができる。開始剤ポリマーを調製する方法は以下に例示される。開始剤ポリマーを調製するための当業者に公知の他の標準方法は考慮されるが、更には検討されない。
【００５３】
一つの態様において、本発明の開始剤ポリマーは、一般に、生体表面とのその結合を可能とすると共に、その活性化の際に生体表面上でのマクロマーの重合を促進するために充分なサイズのものである。本発明の一つの好ましい態様において、低〜中分子量開始剤ポリマーが細胞カプセル化法に用いられる。低〜中分子量開始剤ポリマーは３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有すると言われるが、一方、高分子量ポリマーは３．２×１０6Ｄａ以上のＭwを有すると言われる。
【００５４】
従って、一つの好ましい態様において、本発明は、（ｉ）重合開始剤基、（ｉｉ）少なくともｐＨ８までの状態にあるポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、および（ｉｉｉ）３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する開始剤ポリマーを与える。更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは、約２５０，０００Ｄａ以下、１００，０００Ｄａ以下、および５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する。別の好ましい態様において、開始剤ポリマーは、３４００〜約２５０，０００Ｄａの範囲、更に好ましくは８５００〜約２５０，０００Ｄａの範囲、なお更に好ましくは８５００〜約１００，０００Ｄａの範囲、最も好ましくは８５００〜約５０，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する。別の態様において、開始剤ポリマーは、約１０００単量体単位以下、一般的には約２５〜約５００単量体単位の範囲にある。
【００５５】
開始剤ポリマーは、一般的に、表面上でのマクロマーなどの重合性材料の重合を促進し、それによって、生体表面上に高分子材料のマトリクスを形成する。重合性材料は、１以上の重合性基を有するモノマーおよびポリマーを含むあらゆる種類の化合物であることができる。重合性基は、炭素−炭素二重結合などのフリーラジカル重合を伝播することができる重合性化合物の部分である。好ましい重合性基は、ビニルまたはアクリレート基を有する重合性化合物中に見出される。更に特定的な重合性部分には、アクリレート基、メタクリレート基、エタクリレート基、２−フェニル・アクリレート基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、イタコネート基、およびスチレン基が挙げられる。細胞材料のカプセル化用に好ましい材料は、生体適合性重合可能ポリマー（マクロマーとも呼ばれる）である。こうしたマクロマーは、直鎖または分岐鎖ポリマーまたはコポリマー、またはグラフトコポリマーであることができる。本発明の開始剤ポリマーと共に使用するために適する合成高分子マクロマー、多糖類マクロマー、およびタンパク質マクロマーは、米国特許第５，５７３，９３４号（ハッベル（Hubbell）ら）に記載されており、その教示内容はその全体を本明細書において参考のため包含する。
【００５６】
好ましいマクロマーには、重合性ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、およびそれらのコポリマーが挙げられるがそれらに限定されない。特に、ＰＥＧおよびＰＡＡは、更に好ましいマクロマーである。これらのタイプのマクロマーは、一般的に、水中に可溶であり、生分解性ポリマーに比べて、生体内でより安定である。
【００５７】
一部のケースにおいて、重合性材料として天然産または合成マクロマーを用いることは望ましくあることが可能である。適するマクロマーには、それらの例にヒアルロン酸（ＨＡ）、でんぷん、デキストラン、ヘパリン、およびキトサンに限定されないがそれらが挙げられる多糖類などの天然産ポリマー；およびそれらの例にゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アルブミンおよびそれらの活性ペプチドに限定されないがそれらが挙げられるタンパク質（および他のポリアミノ酸）が含まれる。これらの天然産または合成マクロマーを重合性とするために、重合性基は標準熱化学反応を用いてポリマー中に組み込むことができる。例えば、重合性基はリジン残基を含有するアミンのアクリロイル・クロライドとの反応を介してコラーゲンに添加することができる。これらの反応は重合性部分を含有するコラーゲンをもたらす。同様に、マクロマーを合成する場合に、反応基を含有するモノマーは合成体系中に組み込むことができる。例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）またはアミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）は、Ｎ−ビニルピロリドンまたはアクリルアミドと共重合することができ、ペンダントヒドロキシルまたはアミン基を有する水溶性ポリマーを生成する。これらのペンダント基は、次に、アクリロイル・クロライドまたはグリシジル・アクリレートと反応してペンダント重合性基を有する水溶性ポリマーを形成することができる。適する合成ポリマーには、その教示内容の全体が本明細書において参考のため包含される、上の米国特許第５，４１０，０１６号に記載されているような分解性セグメントを含有する親水性モノマーが含まれる。
【００５８】
別の態様において、本発明は、正荷電開始剤ポリマーおよびマクロマーを含む重合性組成物を与える。重合性組成物は、また、還元剤／受容体および増粘剤などの細胞カプセル化法に有用な他の化合物を含むことができる。適する増粘剤には、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）、およびグリセロールが挙げられる。従って、一つの態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも一つの重合開始剤基、およびｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態でのポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を有する開始剤ポリマーおよび（ｉｉ）マクロマーを含む重合性組成物を与える。更に特定的な態様において、本発明は、（ｉ）可視光活性化染料の群から選択される光開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態でのポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む重合性組成物を与える。
【００５９】
前述のように、本発明の開始剤ポリマーは、一般的に、生体表面に膜を与えるための方法において、マクロマー、および一部のケースにおける還元剤／受容体と共に用いられる。試薬は細胞カプセル化法に特に適する。
【００６０】
カプセル化しようとする細胞または組織は、哺乳類などの生物から直接得ることができる。あるいは、細胞は細胞培養から得ることができる。カプセル化を意図する細胞は、形質変換またはさもなければ部分修正をすることができる。カプセル化し疾患治療に用いることができる細胞および組織の特定タイプは、以下に検討される。「細胞」は、組織または器官の一部として存在することができるか、または微生物として独立に機能することができる個々の膜結合生物単位を指す。「組織」は類似細胞群を含み、また、一般的に、細胞と結合する細胞外物質を含む生物質量を指す。細胞または特に組織は、カプセル化過程の前に処理を受けることができる。例えば、組織は、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、またはコラゲナーゼなどの酵素または他の適する試薬により処理して、カプセル化法に適するサイズの個々の細胞または細胞群を得ることができる。あるいは、組織は、適する細胞出発材料を調製するために機械加工を受けることができる。カプセル化法の前に、細胞は、また、薬物、プロドラッグ、またはホルモンなどで処理することができるか、または、望ましい発現パターンを示すか、またはある種の形態素性を有する細胞を与えるために培養することができる。細胞または組織の調製および調製された細胞または組織の治療用の詳細な指示書を与える技術文献は利用可能であり、例えば、Pollard, J. W. and Walker, J. M.Ｅｄ．，Basic Cell Culture Protocols（１９９７）に見出すことができる。あるいは、カプセル化に適すると共に、本発明の正荷電開始剤と共に用いるように意図される細胞または組織は、商業的に入手することができる。例えば、ミクロソームおよび肝細胞などの生物ヒト肝臓製剤および膵島などの生物ヒト膵臓製剤は、セルツダイレクト（CellzDirect,Inc.）（アリゾナ州、トウーソン）などの市販元から入手することができる。
【００６１】
技術文献において利用可能な情報により、一般に、表面を被覆するための方法において、および特に、細胞および組織をカプセル化するための本明細書において与えられる新規で革新的な方法において正荷電開始剤ポリマーを利用することができる。例えば、Cruiseら,Cell Transplantation ８：２９３（１９９９）の教示は、本発明の正荷電重合開始剤を用いる細胞カプセル化法のための基礎を与えることができる。上に示されるように調製される、または市販元から得られるカプセル化法に適する細胞または組織は、例えば、ロズウェルパークがん研究所（ＲＰＭＩ）媒体などの生体適合性緩衝水媒体などの適する媒体中に懸濁することができる。動物血清、アルブミンなどのタンパク質、酸化剤、還元剤、ビタミン、ミネラル、成長因子、または要望どおりに細胞または組織の生存性および機能に影響を与えることができる他の成分などの他の試薬は、この溶液に添加することができる。
【００６２】
正荷電開始剤ポリマーは、細胞または組織を溶液と接触させる前または後に、この溶液に添加することができる。開始剤ポリマーは、細胞または組織周りのマトリクスの形成を容易にするために充分である量で細胞と接触することができる。一つの態様において、開始剤ポリマーの濃度は、０．００１〜０．５重量％である。なお別の態様において、開始剤ポリマーの濃度は、０．１〜０．２５重量％である。一つの態様において、開始剤ポリマーは、開始剤ポリマーが細胞表面と結合するために充分である時間帯にわたり細胞と接触する。任意に、洗浄ステップは行うことができる。この洗浄ステップは、例えば、過剰な非結合開始剤または細胞と接触する他の物質を除去するために用いることができる。開始剤ポリマーが細胞または組織と接触した後、マクロマーなどの重合性材料は細胞と接触することができる。別の態様において、開始剤ポリマーは、重合性材料と共に細胞または組織と接触する。なお別の態様において、重合性材料は、開始剤ポリマーを細胞と接触させる前に、細胞と接触する。
【００６３】
重合性材料（例えば、マクロマー）は、所期の厚さのマトリクスの形成を可能とする量で細胞または組織と接触することができる。細胞カプセル化に有用な溶液中のマクロマー濃度は、５〜５０重量％の範囲、更に好ましくは１０〜３０重量％の範囲にあることができる。一部の態様において、重合性材料は、正荷電開始剤ポリマーを活性化する前に一時期細胞と接触して置くことができる。
【００６４】
他の試薬は、カプセル化過程の間細胞または組織と接触して持ち込むことができる。前述のように、こうした試薬には、フリーラジカルを形成し、重合性材料のフリーラジカル重合を引き起こすことができる第３アミン（例えば、トリエタノールアミン）などの受容体または還元剤が挙げられる。適する受容体または還元剤は技術上公知であり、市販されている。これらの受容体または還元剤は、一般的に、開始剤基がエネルギーを受容体または還元剤に与えて重合性材料のフリーラジカル重合を促進する間接重合法において用いられる。増粘性試薬などの試薬は、また、本発明の方法において用いることができる。増粘性試薬は重合工程を改善することができる。適する受容体または還元剤は技術上公知であり、市販されている。技術熟練者は、カプセル化法を行うためのあらゆるこれらの添加試薬の適する量を決定することができる。
【００６５】
マトリクスの形成を促進するために必要な試薬が被覆しようとする表面に接触して持ち込まれた後、開始剤基を活性化するために充分な熱または電磁エネルギーなどのエネルギー源が、重合性材料の重合を開始するために加えられる。長波紫外線（ＬＷＵＶ）および３５０ｎｍ〜９００ｎｍ範囲にある可視波長は好ましく、ランプおよびレーザー光源により供給することができる。これら波長の光を与えることができるランプまたはレーザー光源は市販されており、例えば、ＥＦＯＳ，Ｉｎｃ．（カナダ、オンタリオ州ミシサーガ）から入手することができる。本発明の好ましい開始剤ポリマーと共に使用するために特に適する波長は、約５２０ｎｍである。反応の時間および温度は、望ましい膜を与えるために保持される。例えば、開始剤ポリマーおよびマクロマーに接触する細胞および組織は、秒〜分の範囲にある時間帯にわたり光により処理することができる。重合反応は光源を除去することにより停止させることができる。カプセル化細胞または組織は、次に、必要ならばさらなる処理を受けることができる。例えば、カプセル化材料を対象中に導入する前に、例えば、遠心分離によりカプセル化材料を濃縮することは、望ましくあることが可能である。
【００６６】
示されるように、細胞をカプセル化するための詳細手順を与える多くの技術文献が利用可能であり、正荷電開始剤ポリマーを用いることができる枠組みを与えることができる。従って、利用可能な情報を用いて、材料の表面被覆、更に詳細には、本明細書においてまたは他の文献に記載される正荷電開始剤ポリマーおよび試薬を用いる細胞材料および組織のカプセル化を行うことができる。
【００６７】
本発明により、重合開始剤は、生体表面上での重合化材料のマトリクス形成を促進するために用いることができる。重合開始剤を用いる重合は、侵襲性または非侵襲性いずれかの手順において、対象に、一緒かまたは個別いずれかで、重合開始剤および重合性材料を適用することにより、生体内で行うことができる。他の特に有用な用途には、細胞または組織の生体外カプセル化が含まれる。この用途において、細胞または組織は適する供給源から取得し、本明細書において記載される開始剤ポリマーを含む組成物を用いる高分子材料マトリクスによりカプセル化し、次に、カプセル化細胞または組織を必要とする対象中に導入することができる。このタイプの生体外カプセル化および移植手順は、それが、宿主免疫拒絶反応からの防御効果を移植細胞に付与すると共に、なおカプセル化細胞が宿主に治療価値を与えることを可能とするマトリクス膜を与えることができるので有利である。一部のケースにおいて、移植カプセル化細胞を受入れ後、対象は、細胞をカプセル化する高分子層を貫通することができると共に、対象にとって治療価値のある細胞反応を引き起こすことができる薬剤を投薬することができる。
【００６８】
本発明の一つの態様において、開始剤ポリマーは、下垂体からの細胞、副腎からの細胞、甲状腺／副甲状腺からの細胞、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞、および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞などの膵島からの細胞、肝臓からの細胞、および精巣および卵巣などの生殖腺からの細胞を含む、内分泌腺系の腺および器官からの細胞または組織をカプセル化するために用いられる。内分泌腺細胞は、提供者個体から除去し、本明細書において記載される開始剤ポリマーを用いる高分子材料によりカプセル化することができる。
【００６９】
カプセル化内分泌腺細胞は、以下の状態または必要性にあるどれかを有する個体に移植することができる：下垂体障害、および成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、卵巣刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オキシトシン、または抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）を必要とする；副腎障害、および鉱質コルチコイド（例えば、アルドステロン）、グルココルチコイド（例えば、コルチゾール）、男性ホルモンステロイド、またはエピネフリンまたはノルエピネフリンなどのカテコールアミンを必要とする；甲状腺または副甲状腺障害、および甲状腺ホルモン、カルシトニン、または副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を必要とする；糖尿病などの膵臓障害、およびインシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵臓ポリペプチドを必要とする；肝臓障害、および胆汁または凝固因子を含む血漿タンパク質を必要とする；生殖腺障害、およびテストステロンなどの男性ホルモンまたはエストロゲンなどの女性ホルモンを必要とする。
【００７０】
カプセル化することができる他のタイプの細胞には、心臓血管、呼吸器、腎臓、神経、筋肉、および骨格系からの未成熟および成熟細胞が挙げられる。一部の態様において、形質変換されるかまたは遺伝子組み換えされた細胞は、カプセル化し、宿主中に移植することができる。例えば、ペプチドホルモンまたは酵素などの治療的に有用な化合物を産生するために形質変換されるかまたは遺伝子組み換えされた細胞は、カプセル化し、個体中に導入することができる。
【００７１】
開始剤ポリマーおよび重合性材料は、また、人工バリア、例えば、手術後の組織癒着を防止するためのバリアを与えるために、生体内用途に用いることができる。この用途に対して、重合性材料と共に開始剤ポリマーが組織表面に塗布される。次に、組成物は光を当てられて重合を開始しバリア・マトリクスの形成を始める。高分子マトリクスは、他の組織が被覆化組織に癒着するのを防ぐ。一部の手順において、高分子マトリクスは血管表面上に形成して、血小板などの血液因子または細胞が血管壁と相互作用するかまたはそれに癒着することを防ぐことができる。分解性および非分解性マクロマー系は両方ともこの目的のために用いることができる。
【００７２】
上述のように、一部の例において、薬剤はカプセル化細胞を受け入れた後に対象に投与することができる。薬剤は、必要とされる場合、カプセル化細胞から治療的に有用な細胞反応を引き起こすことができる。カプセル化細胞を有する対象に投与することができる他の有用な薬物には、坑血栓性、坑炎症性、抗菌、坑増殖性、および抗癌化合物、ならびに成長因子、および骨形成タンパク質などが挙げられる。
【００７３】
本発明は、今、以下の非限定実施例を参照して実証される。
【００７４】
表１
【化１】
【００７５】
【化２】
【実施例】
【００７６】
実施例１
ＡＰＴＡＣ−ポリエチレンイミン（ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩ）ポリマーの合成
光開始剤ポリマー調製用の出発材料として、陽性第４級アンモニウム基に結合されるポリエチレンイミン主鎖を有する正荷電ポリマーを調製した。
【００７７】
（アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム・クロライド分子の形態にある第４級アンモニウム基を、以下の手順を用いてポリエチレンイミン・ポリマーに結合させた：ポリエチレンイミン（１０，０００Ｍw；ペンシルベニア州、ウオリントンのポリサイエンシズ（Polysciences））５グラムを、脱イオン水１０ｍｌ中に溶解させて５０％ＰＥＩ溶液とした。５０％ＰＥＩ溶液に、７５％（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウム・クロライド溶液（ＡＰＴＡＣ；ミズーリー州、セントルイスのシグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich Corp.,））１６ｇを添加した。ＰＥＩおよびＡＰＴＡＣの混合物を５５℃で一夜にわたり振動させた。得られる生成物は粘性の琥珀色溶液であり、これを室温で密閉ガラスビン中に保存した。
【００７８】
ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩの調製に用いられる等価濃度の小スケール反応を用いてＮＭＲ（核磁気共鳴）によりＡＰＴＡＣ分子のビニルプロトンを監視することによって、反応が室温で１６時間において９９％完了することが示された。
【００７９】
上述のようにＡＰＴＡＣ対ＰＥＩの２．４：１重量比（ＡＰＴＡＣ１２ｇ対ＰＥＩ（１０，０００Ｄａ）５ｇ）を用いて、ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩの最終Ｍwが、出発ＰＥＩポリマーのＭw（１０，０００Ｄａ）よりも約３．４倍大きい（３４，０００Ｄａ）ことが推定された。
【００８０】
実施例２
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ポリエチレンイミン（ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ）開始剤ポリマーの合成
【００８１】
実施例１において合成される正荷電ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマーを、ペンダント光開始剤基を有する光開始剤ポリマー調製用の出発材料として用いた。
【００８２】
実施例１において合成されるＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマー（２００μｌ）を、ＤＭＳＯ５ｍｌ中に溶解した。エオシン−イソチオシアネート（１００ｍｇ）（ＥＩＴＣ；オレゴン州、スプリングフィールドのヘリックス・リサーチ（Helix Research））をＤＭＳＯ４５ｍｌ中に溶解して２．２ｍＭのＥＩＴＣ溶液を作成した。ＥＩＴＣ溶液を含有する溶解または反応を、引き続き、暗所かまたは明るい密閉容器中で行った。ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩ／ＤＭＳＯ溶液５ｍｌを２．２ｍＭ・ＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液４５ｍｌと混合し、室温で２４時間にわたり混ぜた。
【００８３】
２４時間後、洗浄液として２０％ＤＭＳＯ、８０％水溶液２，０００ｍｌｓを用いて、二つのバイオマックス（Biomax）フィルタ（５，０００Ｍwカットオフ（ＭＷＣＯ）；マサチューセッツ州、ビルリカのミリポア（Millipore Co.））を用いる限外濾過を介して、未反応ＥＩＴＣを除去した。次の洗浄を、また二つの５，０００Ｍwカットオフ・バイオマックスフィルタを用いて、ＤＭＳＯ／水溶液の代わりに５０ｍＭ・炭酸アンモニウム２，０００ｍｌで行った。ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩポリマー生成物２３１ｍｇを凍結乾燥により回収し、室温で光をよけて保存した。ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマー生成物の最終重量は、約４２．５ｋＤａであった。
【００８４】
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマー生成物は、表Ｉ中の化合物Ｉにより表すことができる。
【００８５】
実施例３
種々の分子量のＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマーの調製
実施例１および２に記載されるそれに類似の手順を用いて、（ａ）分子量および（ｂ）ＥＩＴＣ含量両方の変動を有するＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマーを調製した。
【００８６】
７５０，０００（７５０Ｋ）Ｄａ、１０，０００（１０Ｋ）Ｄａ、２，０００（２Ｋ）Ｄａ、および８００ＤａのＭwｓを有するＰＥＩポリマーを、ペンシルベニア州、ウオリントンのポリサイエンシズから入手した。５０％ＡＰＴＡＣ結合を有するＰＥＩを調製するために、それぞれ各種サイズのＰＥＩポリマーに対してＡＰＴＡＣ対ＰＥＩ、２．４：１重量比を用いた。２０％ＡＰＴＡＣ結合を有するＰＥＩを調製するために、それぞれ各種サイズのＰＥＩポリマーに対してＡＰＴＡＣ対ＰＥＩ、０．９６：１重量比を用いた。実施例１に詳細に記載される試薬および反応時間をそれぞれの調製物に対して用いた。続いて、列挙されるサイズのＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマーの調製物を、次に、実施例２に詳細に記載される試薬および反応時間を用いるＥＩＴＣ分子に結合した。詳細には、各ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマー調製物（２００μｌ）をＤＭＳＯ５ｍｌ中に溶解し、２．２ｍＭ・ＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液４５ｍｌと混合し、次に、室温で２４時間にわたり混合した。実施例２に詳細に記載される精製ステップをそれぞれの試料に対して実施し、各調製物の収率は、実施例１および２の１０，０００ＭwＰＥＩポリマーを用いる回収のそれに比較し得るものであった。
【００８７】
結果により、５０％ＡＰＴＡＣ目標負荷での開始剤の最終Ｍwｓは以下の通りであると計算される：
【００８８】
出発ＭwＰＥＩ（Ｄａ） 近似最終ＭwＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ（Ｄａ）
（ａ）８００ ３４００
（ｂ）２０００ ８５００
（ｃ）１０，０００ ４２，５００
（ｄ）７５０，０００ ３．２×１０6
【００８９】
実施例４
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−デンドリマー開始剤ポリマーの調製
実施例１および２に記載されるそれに類似の手順を用いて、ＰＥＩ−ＡＰＴＡＣ−デンドリマー開始剤ポリマーを調製した。１４，２１５Ｄａの分子量を有するアミン官能性デンドリマーを、実施例１および２で用いた１０，０００Ｄａ・ＰＥＩの代わりにポリマー主鎖として用いた。
【００９０】
デンドリマー開始剤ポリマーの合成における第１ステップとして、中間ＡＰＴＡＣ−デンドリマーを作成した。エチレンジアミン−コア・ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代、ＦＷ１４，２１５Ｄａ、メタノール中１０重量％；ミズーリー州、セントルイスのシグマ・アルドリッチ）１グラムを、７５％ＡＰＴＡＣ溶液（シグマ・アルドリッチ）４４．７ｍｇと共にフラスコ中に入れた。メタノールをロータリー・エバポレータで除去して残留物１７６ｍｇを得、残留物を３．５日間にわたり３７℃でオーブン中において加熱した。重水素を含むメタノール（ＣＤ3ＯＤ）中の残留物のＮＭＲ分析により、反応がＡＰＴＡＣのビニルプロトンに対して９９％を超えて完了していることが示された。
【００９１】
ＡＰＴＡＣ−デンドリマー／ＤＭＳＯ溶液を、ＡＰＴＡＣ−デンドリマー中間物３０ｍｇをＤＭＳＯ５ｍｌ中に溶解することにより調製した。ＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液を、エオシン−イソチオシアネート（ＥＩＴＣ；オレゴン州、スプリングフィールドのヘリックス・リサーチ）２５ｍｇをＤＭＳＯ３００マイクロリットル中に溶解することにより調製した。デンドリマー−ＡＰＴＡＣ／ＤＭＳＯ溶液をＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液と混ぜ合わせ、室温で２４時間にわたり混合した。ＥＩＴＣを含む溶解または反応を、光防御容器（琥珀色ガラスビン）中で行った。
【００９２】
２４時間後、未反応ＥＩＴＣを、洗浄液として２０％ＤＭＳＯ、８０％水溶液２リットルを用いて、二つのバイオマックス・フィルタ（５，０００Ｍwカットオフ（ＭＷＣＯ）；マサチューセッツ州、ビルリカのミリポア）を用いる限外濾過を介して除去した。次の洗浄を、また二つの５，０００Ｍwカットオフ・バイオマックスフィルタを用いてＤＭＳＯ／水溶液の代わりに５０ｍＭ炭酸アンモニウム２リットルにより実施した。ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−デンドリマー生成物４７ｍｇを凍結乾燥により回収し、室温で光から防御して保存した。
【００９３】
実施例５
トリメチロールプロパン・エトキシレート（２０／３ＥＯ／ＯＨ）・トリアクリレート・マクロマーの調製
【００９４】
ＰＥＧ系マクロマーを開始剤ポリマーと共に使用するため以下に詳細に記載されるように合成した。
【００９５】
ＰＥＧ系マクロマーの合成を図１に示す。トリメチロールプロパン・エトキシレート（ＰＥＧトリオール；１００．０ｇ、９８．６ｍモル；平均Ｍwｃａ．１，１０４；Ｃａｔ．Ｎｏ．４１，６１７−７；ウィスコンシン州、ミルウオーキーのアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company, Inc.,））を、攪拌しながらトルエン２００ｍｌｓ中に溶解し、１時間にわたり還流した。ＰＥＧ−トリオール溶液を放置して約８０℃に冷却した。この時に、４−メトキシフェノール（ＭＥＨＱ；ニュージャージー州、フィリップスバーグのＪ．Ｔ．ベーカー（Baker））５０ｍｇ（０．４０３ｍモル）、アクリル酸（ニュージャージー州、フィリップスバーグのＪ．Ｔ．ベーカー）４２．７ｇ（０．５９２モル）、および硫酸（ウィスコンシン州、ミルウオーキーのアルドリッチ・ケミカル・カンパニー）１０ｍｌｓ（０．１８８モル）を、攪拌しながら反応溶液に添加した。反応溶液を加熱して還流した。約６．０ｍｌｓの水が生成しディーン＆スターク（Ｄｅａｎ ＆ Ｓｔａｒｋ）容器を介して収集されるまで（約１時間）、反応を進めさせた。反応混合物を放置して５０℃に冷却し、攪拌しながら重炭酸ナトリウム溶液（脱イオン水２．５リットル中２７０ｇ）中に注いだ。有機層を分離し、脱イオン水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ＰＥＧ−トリアクリレートを拭き取りフィルム蒸留器（ウィスコンシン州、ソークビルのポープ・サイエンティフィック（Pope Scientific, Inc.,））を用いて単離した。
【００９６】
ＰＥＧ−トリアクリレート・マクロマー生成物は表Ｉ中の化合物ＩＩにより表される。
【００９７】
実施例６
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマーを用いる細胞カプセル化
実施例１、２、および３において調製される正荷電開始剤ポリマーを重合開始剤として用いて、細胞表面上にカプセル化性高分子膜を与える。細胞カプセル化手順は以下のステップを含む：（ｉ）細胞を実施例１〜３において調製されるＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩポリマーを含有する溶液と接触させ、（ｉｉ）細胞を実施例４のＰＥＧ−トリアクリレート・マクロマーを含有する溶液と接触させ、（ｉｉｉ）マクロマーおよび開始剤と接触する細胞をアルゴン・レーザー光源で処理し、および（ｉｖ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄すること。これらのステップの後、細胞を検査して、細胞周りの膜の品質（顕微鏡検査を介して）、および細胞生死判定（トリパンブルー排除法またはヨウ化プロピジウム染色法）を決定する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＰＥＧ系マクロマー、ＰＥＧ−トリアクリレート（化合物ＩＩ）調製のための合成体系を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板表面上に高分子マトリクスを形成するために有用な化合物に関する。更に詳細には、本発明は、生体基板表面上に高分子マトリクスを形成するために有用な開始剤ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞および組織のカプセル化用高分子材料の使用は、疾患および他の医学的徴候の治療用に大きな可能性を提供する。特に有用な用途は、療法を提供するために、患者への移植用のカプセル化組織または細胞のための高分子材料を利用することを含む。哺乳類細胞をカプセル化するための種々の技術が数十年間にわたり知られてきたし、研究設定において用いられてきたが、細胞カプセル化技術が疾患の潜在的治療用に適用されてきたのは、ほんのつい最近のことである。
【０００３】
細胞カプセル化法は、一般に、移植されたカプセル化細胞を宿主免疫拒絶反応から防御するために、細胞または細胞群を物質バリアで取り囲むことを目標としている。細胞周りの物質バリアは、理想的には、細胞が生存したままであり宿主に対する治療価値を提供するために適正に機能することを可能とする。この機能を実行するために、一般的に高分子化合物を含む、細胞をカプセル化するために用いられる材料は、生分解に対して耐性があることが好ましく、細胞反応に関与する細胞老廃物、栄養物、および分子の拡散を可能とするために充分な透過性があることが好ましい。好ましくは、物質バリアは、異種細胞の破壊に寄与することができるであろう免疫グロブリンおよび補体因子などのある種の宿主分子に対して透過性はない。
【０００４】
細胞カプセル化技術の進歩は、細胞周りに形成される物質バリアの選択透過性、機械的性質、免疫防御性および生体適合性を改善することに焦点を合せてきた。高分子電解質錯化、熱可逆ゲル化、界面析出、界面重合、およびフラットシートによるマイクロカプセル化、および中空糸系マクロカプセル化を含む、種々のマイクロ−およびマクロカプセル化技術が研究されてきており、Uludagら Adv. Drug Deliv. Rev.４２：２９〜６４（２０００）により概観されている。
【０００５】
細胞カプセル化のための一つの通常用いられる方法は、ポリアニオン性アルギン酸塩およびポリカチオン性ポリリシンポリマーを用いるアルギン酸塩架橋法である。アルギン酸塩法によるカプセル化は、一般的に、Ｃａ2+イオンを介するアルギン酸塩の架橋およびポリリシンのアルギン酸塩分子との相互作用により起こる。都合悪いことに、細胞カプセル化へのこのアプローチに関連する多くの問題がある。こうした問題には、内部アルギン酸塩コアにおけるＣａ2+の存在に基づくアルギン酸塩マイクロカプセルの膨潤、アルギン酸塩／ポリリシンカプセル中のグルロン酸含量に基づく不充分な生体適合性、およびアルギン酸塩膜の不充分な機械強度が挙げられる。更に、アルギン酸塩カプセル化過程は非特定的であり、カプセル化しようと意図された細胞または細胞群を含有しないか、または、他の非目標生体材料を含有するマイクロカプセルの形成をもたらすことができる。これらの問題のために、細胞カプセル化に対する代替法が調査されてきた。
【０００６】
アルギン酸塩架橋に対する一つの有望な代替法は、界面重合と言われる方法である。界面重合は、その可能性を調査するためにほとんど何もなされていないが、細胞カプセル化およびその治療用途のためのアルギン酸塩カプセル化法のすべての利点を与える可能性を有する。界面重合は、一般に、生体基板の表面上に、合成または天然の重合性ポリマーなどの重合化材料層の形成を含む。高分子材料層の形成は、一般に、重合性ポリマーの存在下で、生体基板の表面上に堆積する重合開始剤の活性化により促進される。
【０００７】
界面重合法における使用のための一部の重合開始剤は、米国特許第５，４１０，０１６号および米国特許第５，５２９，９１４号において実証されてきた。これらの特許には、細胞膜上に重合開始剤、エオシンＹを堆積させ、次に、開始剤を活性化させてマクロマー溶液の重合を促進させることが記載されている。しかし、比較的非極性であるエオシンＹ、低分子量光活性化開始剤染料、またはエオシンに類似の化合物の使用は、界面重合法用の多くの不利を与えると共に、また、移植されるカプセル化細胞を受け取る対象に対する潜在的な問題点を提供する。例えば、これらの染料および他の類似の低分子量化合物は、それらが細胞中に浸透し、正常な生化学経路に干渉することができるので、毒性問題を与える。細胞中に浸透する場合、これらの染料は、外部エネルギー源により活性化される場合にフリーラジカル損傷を引き起こすことができる。染料が形成される高分子層から外に拡散し、それによって宿主生物に対する潜在的な毒性を産生することができる場合、他の欠点が生じてくる。エオシンなどの染料は、また、水溶液中に凝集する傾向があり、それによって、カプセル化法の効率を減少させると共に再現性に伴う問題を持ち込む。最終的に、充分なラジカル連鎖重合を開始することにおけるこれら染料の限定された効率の観点から、１以上の単量体重合「促進剤」を重合混合物に添加することは、多くの場合必要である。これらの促進剤は、また、細胞膜に浸透することができる小分子であり、且つ細胞毒性または発癌性である可能性を有する傾向がある。従って、これら促進剤の使用を最小化することは、また、望ましい。上記問題を克服しようとする試みにおいて、出願者らは、既に、新規な界面重合試薬および技術を紹介してきた（米国特許第６，００７，８３３号および第６，４１０，０４４号を参照すること）。
【０００８】
これらの教示にもかかわらず、界面重合法用の改善された開始剤が望まれている。重合開始剤が目標とされる細胞表面は、極めて複雑で、所期のやり方で機能する開始剤の設計に対して難問を投げかけてくる。例えば、細胞表面は、それらの一部が硫酸化プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンなどの荷電部分を含有する炭水化物基を有する多くの表面タンパク質を含有する。生体表面に局部集中するが、しかし、マイナスのやり方では細胞生理機能に影響を与えない開始剤を設計することは望ましい。例えば、改善された開始剤は、好ましくは、細胞死をもたらすシグナル経路などのいかなる有害な細胞過程をも始動させることなく有効なやり方で細胞表面上に高分子層の形成を促進するべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、基板表面上での本明細書において「高分子マトリクス」とも呼ばれる高分子層の形成に有用な試薬および方法を提供する。更に詳細には、本発明は、負荷電表面上の高分子層の形成に有用である正荷電重合開始剤ポリマーを提供する。正荷電重合開始剤ポリマーは、特に、細胞および組織を生体適合性ポリマーでカプセル化することに対して有用である。
【００１０】
一つの態様において、正荷電重合開始剤ポリマーは、生体表面上での高分子材料の重合を促進するための方法において用いられる。本方法は、一般的に高分子材料により被覆しようと意図される細胞、細胞群、または組織の表面である生体表面を与えることを含む。次に、開始剤ポリマーは、生体表面と接触して置かれる。本発明により、開始剤ポリマーは、（ｉ）重合開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にあるポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む。陽イオン部分は、水溶液中における開始剤ポリマーの溶解性を容易にすることができると共に、また、開始剤ポリマーの細胞表面との結合を可能とする。陽イオン部分は、開始剤ポリマーが、一般的に非極性であり開始剤ポリマーに実質的な程度での疎水性を付与する複数の開始剤基を含有する態様において、特に有利であることができる。好ましくは、陽イオン部分は、また、低〜中程度の重量平均分子量（Ｍw）を有し、複数の開始剤基を含有し、水溶液に可溶である開始剤ポリマーの調製を可能とする。
【００１１】
高分子マトリクスを形成する方法は、また、生体表面に重合性材料を与えることを含む。重合性材料は、一般的に、開始剤ポリマー塗布の前、間または後に塗布することができる重合性ポリマー（例えば、マクロマー）である。適するマクロマーには、好ましくは許容可能程度の生体適合性を有する成形マトリクスを与える天然または合成の重合性ポリマーが挙げられる。生体表面が開始剤ポリマーおよびマクロマーと接触した後、エネルギー源が表面にかけられて開始剤基を活性化させ、それによって、生体表面上または近くのマクロマーの重合を促進する。好ましい態様により、エネルギー源は、長ＵＶ波長、更に好ましくは可視光波長により与えられる。重合は直接または間接であることができるが、間接法は、一般的に、フリーラジカル重合を促進するために受容体または還元剤を利用する。
【００１２】
細胞、細胞群、または組織は、本発明の正荷電開始剤ポリマーを用いてカプセル化することができる。本発明は目標表面としていかなる特定タイプの天然または合成材料にも限定されるものではないが、正荷電開始剤ポリマーは、細胞周りのカプセル化マトリクスの形成を促進する試薬として、特に有用である。カプセル化細胞は、治療効果を与えるために対象中に移植することができる。こうした正荷電開始剤ポリマー用の用途には、糖尿病を患い治療の必要性のある対象中に移植するための膵島のカプセル化が挙げられる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、（ｉ）可視光活性化染料の群から選択される光開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む、正荷電開始剤ポリマーを与える。光開始剤基は開始剤ポリマーの高分子主鎖に結合されるが、好ましい態様において、陽イオン部分は、高分子主鎖にまた結合される陽性基により与えられる。適する光開始剤基には、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料などの可視光活性化染料が挙げられる。
【００１４】
特に有用な開始剤ポリマーには、ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にあり、更に好ましくはｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する状態にあり、最も好ましくはｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正電荷を有する開始剤ポリマーを与える陽性基が挙げられる。これらの陽イオン特性を与える基は、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元（ternary）スルホニウム基などの３元および第４級陽性基から選択することができる。特に有用な開始剤ポリマーは、低〜中程度の分子量範囲、すなわち、約３．２×１０6Ｄａ未満の重量平均分子量（Ｍw）を有する。好ましい開始剤ポリマーは、約２５０，０００Ｄａ以下、１００，０００Ｄａ以下、および５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する。開始剤ポリマーは、１個の好ましくは１個を超える開始剤基を含み、還元剤の存在下でポリマー（例えば、マクロマー）の重合を促進することができる開始剤活性を与える。特に好ましい開始剤ポリマーは、（ｉ）ポリアミン主鎖、（ｉｉ）主鎖に結合される複数の可視光活性化染料、（ｉｉｉ）主鎖に結合される複数の第４級アンモニウム基、および（ｉｖ）約３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを含む。
【００１５】
本発明は、また、表面に対する高分子膜を与えるためのキットを提供する。キットは、少なくとも、正荷電重合開始剤ポリマーおよび開始剤ポリマーと併せて用いることができる重合性材料を含む。キットの開始剤ポリマーは、（ｉ）重合開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にあるポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む。
【００１６】
本発明は、また、本明細書において記載されるように、正荷電開始剤ポリマーを用いる高分子マトリクスによりカプセル化される細胞、細胞群、および組織を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、本明細書において「開始剤ポリマー」とも呼ばれる正荷電開始剤ポリマー、開始剤ポリマーを含む組成物、およびこれらの開始剤ポリマーを用いる表面上または近辺での重合性材料の界面重合を行うための方法を提供する。「ポリマー」は１以上の異なる反復単量体単位を有する化合物を指し、線状ポリマーおよびコポリマー、本明細書において「デンドリマー」と呼ばれる高度に分岐したデンドリマーポリマーおよびコポリマーなどの分岐ポリマーおよびコポリマー、ならびにグラフトポリマーおよびコポリマーなどを含む。「表面」は、広く、あらゆる種類の天然または合成表面を指す。天然表面は、広く、例えば、細胞表面、または細胞群表面、または組織表面などのあらゆる種類の生体材料の表面を指す「生体表面」を含む。合成表面は、プラスチック、セラミック、樹脂、多糖類、シリコン、またはシリカ系材料、ガラス、金属、フィルム、ゲル、膜、ナイロン、絹、羊毛および綿などの天然繊維およびポリマーから作製される機能化および非機能化材料などのあらゆる有用な人工材料を含む。一つの態様において、表面は負電荷を有し、正荷電開始剤ポリマーは反対電荷を介してこの表面に結びつくことができる。
【００１８】
開始剤ポリマーは、また、あらゆる種類の生体外または生体内法において生体表面上に重合化材料のマトリクスを形成するために用いることができるが、それらは細胞カプセル化法に対して特に有用である。細胞カプセル化は、細胞、細胞群、または組織の表面の全体または部分にわたる高分子層の形成を含む。この高分子層は、一般的に、厚さ、透過性、強度、および保護性などの一部の物理および機能特性を有する。任意に、開始剤ポリマーは、天然または合成材料のあらゆるタイプの表面上に重合化材料のマトリクスを形成するために用いることができる。
【００１９】
本発明により、表面に膜を与えるために有用な正荷電開始剤ポリマーは、少なくとも一つの重合開始剤基、およびｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む。開始剤基は、特定的にエネルギーを受入れ、直接的または間接的にフリーラジカル種を発生させることができる開始剤ポリマーの一部を指すと共に、重合性材料のフリーラジカル重合を促進するために充分なものである。陽イオン部分は、ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正電荷を有する開始剤ポリマーを与えると共に、一部の態様において、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０まで、更に好ましくはｐＨ１２を含みｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正電荷を有する開始剤ポリマーを与えることができる。開始剤ポリマーの陽イオン部分は、正荷電高分子主鎖から、主鎖から垂れ下がる陽イオン基から、または両方から得ることができる。大部分の態様において、開始剤ポリマーの陽イオン特性はポリマー主鎖から垂れ下がる陽イオン部分から得られる。「ペンダント基」はその長さに沿ったあらゆる箇所でポリマー主鎖に結合される１以上の化学基、または主鎖のいずれかの末端で結合される化学基、または両方を指す。
【００２０】
一つの態様において、開始剤ポリマーは、細胞カプセル化法などの生体表面を被覆するための方法におけるステップにおいて用いることができる。これらの方法において、開始剤ポリマーは、被覆しようとする表面およびマクロマーなどの重合性材料と併せて用いられる。一部の態様において、開始剤ポリマーはマクロマー成分とは別に細胞に塗布され、他の態様において、開始剤ポリマーおよびマクロマー成分は細胞に対する重合性組成物として一緒に塗布される。従って、本発明は、また、正荷電開始剤ポリマーおよびマクロマー成分を含む組成物を与える。還元剤／受容体および他の重合促進成分、例えば、安定剤、増粘剤、および共触媒などの細胞カプセル化に有用な化合物は、既存ステップ、追加ステップにおいて重合工程中に導入することができるか、または、重合性組成物中の試薬として存在することができる。従って、本発明は、また、重合性組成物、および開始剤ポリマー、マクロマー成分、還元剤／受容体、および増粘剤を含むことができる、表面上にポリマー膜を形成するためのキットを与える。
【００２１】
さらなる特定態様において、本発明は、可視光活性化光開始剤基、およびｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む開始剤ポリマーを与える。可視光活性化光開始剤基は、エオシンなどの可視光活性化染料の群から選択することができる。別の特定態様において、本発明は、複数のポリマー主鎖に結合される可視光活性化光開始剤基、複数のポリマー主鎖に結合される３元または第４級陽性基、および３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する開始剤ポリマーを与える。
【００２２】
本明細書において用いられる「重量平均分子量」またはＭwは、分子量を測定する標準比較方式であり、開始剤ポリマーおよびマクロマーの調製物などの、ポリマー（調製物）の分子量測定のために特に有用である。ポリマー調製物は、一般的に、個々に小さな分子量変動を有するポリマーを含む。ポリマーは比較的高分子量を有する分子であり、ポリマー調製物内のこうした小さな変動は、ポリマー調製物の全体特性（例えば、開始剤ポリマー調製物の特徴）に影響を及ぼさない。重量平均分子量（Ｍw）は以下の式により定義することができる：
【００２３】
【数１】
【００２４】
式中、Ｎは質量Ｍを有する試料中のポリマーの分子数を表し、Σiは調製物中のすべてのＮiＭi（化学種）の総和である。Ｍwは光散乱または超遠心分離法などの通常の技術を用いて測定することができる。ポリマー調製物の分子量を定義するために用いられるＭwおよび他の用語の論議は、例えば、Ａｌｌｃｏｃｋ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｌａｍｐｅ，Ｆ．Ｗ．，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｐｇ ２７１（１９９０）に見出すことができる。
【００２５】
本発明は、また、界面重合法に用いられる化合物群における１成分としての正荷電開始剤ポリマー、および特定疾患の治療方法を、特定的に与える。これらの化合物および方法は、カプセル化細胞または組織が治療的に有用である細胞または組織のカプセル化を実行することができる。例えば、本発明の開始剤ポリマーを用いてカプセル化される膵島は、機能的膵臓組織を必要とする糖尿病患者に移植することができる。
【００２６】
開始剤ポリマーの陽イオン部分により与えられる正電荷は、開始剤ポリマーが特に細胞カプセル化法に対して驚くほどに効果的な重合開始剤として設定されることを可能とすることができる。一つの態様において、開始剤ポリマーの正電荷は、ポリマーに水溶液への高度な溶解性を与えることができる。この水溶液への高度な溶解性は、開始剤ポリマーが、一般的に非極性であり、本来開始剤ポリマーに対して実質的な疎水性程度を与える複数の開始剤基を有する態様において保持することができる。従って、陽イオン部分の存在は、相当な数の開始剤基を含み、開始剤基が活性化される場合に重合開始剤として機能することができる開始剤ポリマーの調製を可能とすることができる。この配置は、低〜中程度のＭwを有する開始剤ポリマーが高水準の細胞生存性を維持しながら細胞カプセル化法において調製され用いることができることが見出されてきたので、特に、有利である。従って、本発明により、開始剤ポリマーの陽イオン部分は、水溶液中に可溶であり、重合性材料の重合を開始するための特定化合物の能力に言及する高度な「開始剤潜在力」を有する開始剤ポリマーの調製を可能とする。この関連で、水溶液中への溶解度を改善するために開始剤ポリマーのサイズを増大させることは必要でない。
【００２７】
別の態様において、開始剤ポリマーの正電荷は、また、負荷電表面、例えば、生体材料の負荷電表面とのその相互作用を可能とすることができる。陰性荷電基を担持する細胞表面タンパク質は、一般的に、細胞表面上に負電荷を付与する。グリコサミノグリカンおよび硫酸化プロテオグリカンなどの表面分子は、細胞の荷電表面に寄与する。しかし、負荷電表面を有する他の生体材料は、また、本発明の開始剤ポリマーと結合することができる表面として適するものであることができる。従って、開始剤ポリマーの陽イオン部分は、細胞カプセル化過程の間、開始剤ポリマーを目標陰イオン表面、特に細胞表面に対して局限化する便利な方法を与える。
【００２８】
本発明により、開始剤ポリマーは、開始剤ポリマーの主鎖に結合される１以上の開始剤基を含む。開始剤ポリマーの開始剤基は、開始剤基が外部エネルギー源により活性化される場合に、マクロマーなどの重合性材料のフリーラジカル重合を促進することができる。活性化開始剤基は、直接的または間接的いずれかで重合性材料のフリーラジカル重合を引き起こすことができる。間接的方法は、一般的に、活性化開始剤基からのエネルギーの、フリーラジカルを形成することができると共に、受容体または還元剤、重合性材料の重合を引き起こすように作用することができる化学種への転位を含む。直接的方法においては、開始剤基はフリーラジカルそれ自体を与える。
【００２９】
本発明により、開始剤ポリマーは生体材料の表面などの負荷電表面に局限化することができる。開始剤基を活性化させると、開始剤ポリマーに近接している重合性材料は重合し、表面上に高分子材料層、すなわちマトリクスの形成をもたらす。このタイプの重合は、一般的に、界面重合と呼ばれる。
【００３０】
開始剤ポリマーは、光活性化光開始剤基、熱活性化開始剤基、化学的活性化開始剤基、またはそれらの組合せを含むことができる。適する熱活性化開始剤基は、４，４’アゾビス（４−シアノペンタン）酸および２，２−アゾビス［２−（２−イミダゾリニ−２−イル）プロパン］ジヒドロクロライドを含むか、またはこれらの開始剤を付与される他の熱活性化開始剤は、開始剤ポリマー中に組み込むことができる。化学的活性化開始は、多くの場合、酸化還元開始、酸化還元触媒作用、または酸化還元活性化を指す。一般に、有機および無機酸化剤、ならびに有機および無機還元剤の組合せは、重合用のラジカルを発生するために用いられる。酸化還元開始の説明は、Principles of Polymerization,2nd Edition，Odian G.，John Wiley and Sons,２０１〜２０４頁（１９８１）に見出すことができる。好ましくは、生体系に有害でない酸化還元開始剤が用いられる。好ましくは、生体系に有害でないエネルギーを用いる光開始剤基および熱活性化開始剤基が用いられる。一つの態様において、長波長ＵＶおよび可視光活性化周波数を有する光開始剤基は、開始剤ポリマーの主鎖に結合される。好ましい態様において、可視光活性化光開始剤はポリマー主鎖に結合される。
【００３１】
光開始は、ノリッシュ（Norrish）タイプＩ反応、分子内または分子間水素抽出反応、および光還元性または光酸化性染料を用いる光感作反応を含む種々の機構により生じることができる。後者の二つのタイプの反応は、一般的に、例えば、第３アミンであることができるエネルギー転位受容体または還元剤と共に用いられる。こうした第３アミンは、マクロマーの高分子主鎖中に組み込むことができる。好ましい態様において、開始剤ポリマーは、分子内または分子間水素抽出反応、または活性化される場合に光還元性または光酸化性染料を用いる光感作反応を可能とする１以上の開始剤基を含む。これらのタイプの開始剤と共に使用するための有用なエネルギー転位受容体または還元剤には、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチル・ジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル・ベンジルアミン、テトラメチル・エチレンジアミンなどの第３アミン；ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル・エタノールアミン、Ｎ−イソプロピル・ベンジルアミンなどの第２級アミン；およびエタノールアミン、リジン、およびオルニチンなどの第１級アミンが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
一つの態様において、３５０ｎｍ以上の吸収帯を有する光開始剤基が用いられる。更に好ましくは、５００ｎｍ以上の吸収帯を有する光開始剤基が用いられる。適する光開始剤基には、長波紫外（ＬＷＵＶ）光活性化性分子および可視光活性化性分子などの光活性化開始剤基が挙げられる。適する長波紫外（ＬＷＵＶ）光活性化性分子には、（（９−オキソ−２−チオキサンタニル）−オキシ）酢酸、２−ヒドロキシ・チオキサントン、およびビニルオキシメチルベンゾイン・メチル・エーテルが挙げられるがそれらに限定されない。適する可視光活性化性光開始剤基には、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３３】
これらの可視光活性化性光開始剤基および光開始剤基一般に関する一つの共通の特性は、非極性部分を有することのそれである。この非極性部分の存在のために、これらの光開始剤基は、一般に、水溶液中への低い溶解度を有する。これらの光開始剤基が開始剤ポリマーなどの別の分子に結合される場合に、光開始剤基は、ポリマーに非極性特性を付与することができると共に、一般に、その水溶液中への溶解度を低下させることができる。
【００３４】
開始剤ポリマーは、生体材料の表面などの基板表面上での重合性材料のフリーラジカル重合を促進するために充分な量において多くの開始剤基を含有する。開始剤ポリマーは、少なくとも一つの、更に一般的には複数の開始剤基を含有する。一部のケースにおいて、開始剤ポリマーは開始剤基を高度に詰め込んでおり、高水準の重合開始剤活性を与えることができる。この配置は、容易には重合して高分子層を形成しないマクロマーを含む方法または組成物において望ましくあることが可能である。それゆえに、本発明は開始剤基が高度に詰め込まれる正荷電開始剤ポリマーを与える。
【００３５】
従って、一つの態様において、開始剤ポリマーは少なくとも一つの開始剤基を含む。更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは５個以上の開始剤基を含み、なお更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは約１０個以上の開始剤基を含む。なお更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは３．２×１０6Ｄａ以下、最も好ましくは２５０，０００Ｄａ以下のＭwを有し、５個以上の開始剤基、更に好ましくは約１０個以上の開始剤基を含む。開始剤基は、あらゆる位置でポリマー主鎖に沿って垂れ下がることができると共に、不規則または規則的なやり方で間隔をとることができる。
【００３６】
開始剤基はあらゆる適する方法を用いて開始剤ポリマーに結合することができる。一つの方法において、例えば、開始剤基を有する重合性モノマーは、合成され、次に重合反応に用いられてペンダント開始剤基を有する開始剤ポリマーを造りだすことができる。開始剤誘導体化モノマーの合成は、標準化学反応を用いて容易に達成することができる。例えば、光活性化染料などの光開始剤基の酸塩化物類似物は、エチレン性不飽和アミン含有モノマーと反応して開始剤誘導体化モノマーを形成することができる。開始剤ポリマーを調製する別の方法において、反応基を有する予備形成ポリマーは開始剤基と反応して開始剤基を予備形成ポリマーに結合させる。例えば、イソチオシアン酸塩または光開始剤の酸塩化物類似物は、ペンダントアミン基を含有するポリマーと反応することができ、それによって、ペンダント開始剤基を担持する開始剤ポリマーを形成する。当業者に公知の他の合成体系は、開始剤ポリマーを調製するために用いることができる。これらの体系は考慮されるが、しかし、更に詳細には検討されない。
【００３７】
好ましい態様において、開始剤ポリマーは非極性である複数の開始剤基を含む。複数の非極性開始剤基の存在は、開始剤ポリマーに実質的な疎水性特質を付与することができる。それゆえに、この実質的な疎水性特質は、以下により詳細に検討される陽イオン部分を開始剤ポリマーに与えることにより、相殺することができる。
【００３８】
開始剤ポリマーの陽イオン部分の正電荷は、開始剤ポリマーの主鎖、主鎖から垂れ下がる正荷電基、または両方により負うことができる。一つの態様において、開始剤ポリマーは、開始剤ポリマーの主鎖から垂れ下がる複数の陽性基を有する；好ましくは、陽性基は３元または第４級アミン基などの第４級イオン部分により与えられる。別の態様において、高分子主鎖は窒素を含有し、例えば、高分子イミンであることができる。本発明の好ましい態様により、陽イオン部分は、水溶液中への溶解性を可能とする正電荷、および／または負荷電表面と相互作用する能力を有する開始剤ポリマーを与えることができる。
【００３９】
ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある開始剤ポリマーに対して正電荷を与える陽イオン部分は、開始剤ポリマーが複数の非極性開始剤基を含む態様において、特に有利である。非極性開始剤基により付与される疎水性特質は、水溶液中への開始剤ポリマーの溶解性を改善することができる開始剤ポリマー上に存在する陽イオン部分の存在により中和することができる。本発明により、陽イオン部分は開始剤ポリマーが水溶液中に可溶となることを可能とするように配置されると共に、また、開始剤ポリマーが細胞表面などの負荷電表面と相互作用することを可能とするように配置される。陽イオン部分は、ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する環境下での開始剤ポリマーに正電荷を与えるように配置されると共に、一部の態様において、陽イオン部分は、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する環境下、更に好ましくはｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する環境下での開始剤ポリマーに正電荷を与えるように配置される。
【００４０】
開始剤ポリマーがｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態に正電荷を保持するかどうかを測定するために、多くの試験のうちのいずれか一つを行うことができる。正荷電開始剤ポリマー用の適する試験は、一般に、８以上のｐＨを有する緩衝液を調製し、緩衝液に開始剤ポリマーを添加し、負電荷を与える材料と接触させてポリマー溶液を置き、次に、開始剤ポリマーが負荷電材料と相互作用するかどうかを測定することを含むことができる。例えば、開始剤ポリマーは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、重炭酸アンモニウム、または３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸塩などの適する高ｐＨ緩衝液により８以上のｐＨに調整した溶液に添加することができ；ポリマー混合物は、次に、陰イオン交換マトリクス（例えば、Ｑ−セファローズ（Sepharose）；ニュージャージー州、ピスキャタウエイのアマーシャム・バイオサイエンシズ（Amersham Biosciences Corp.,））に塗布することができ；カラムは、次に、高ｐＨ緩衝液により洗浄することができ；最終的に、カラムは、結合されている場合開始剤ポリマーを解離するために塩含有緩衝液（０．５Ｍ・ＮａＣｌなど）により溶出させることができる。開始剤ポリマーが選択される緩衝液状態に正電荷を保持する場合、それは溶出液中に存在し、分光法により検出可能である。８以上のｐＨを有する溶液中の開始剤ポリマーの電荷を測定するために有用な他の一般的に用いられる分析法は、考慮されるが、更には検討されない。
【００４１】
一部の態様において、開始剤ポリマーは、少なくとも１以上の一般的には複数の陽性基に結合される高分子主鎖を有する。一般にいかなる開始剤基または陽性基の添加なしでのポリマー鎖を指すポリマー主鎖は、一般的に、炭素および好ましくは窒素、酸素、および硫黄から選択される１以上の原子を含む。主鎖は炭素−炭素連鎖を含むことができると共に、一部の好ましい態様において、また、１以上のアミド、アミン、エステル、エーテル、ケトン、ペプチド、または硫化物連鎖、またはそれらの組合せを含むことができる。適するポリマー主鎖の例には、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエーテル（ポリオキシエチレンなど）、ポリスルホン、ポリウレタン、または代表的なモノマー基のあらゆる組合せを含有するコポリマーが挙げられる。
【００４２】
高分子主鎖は、陽性基を結合して開始剤ポリマーを形成するために有用な反応基を含むことができる。適する反応基には、酸（またはアシル）ハロゲン化物基、アルコール基、アルデヒド基、アルキルおよびアリールハロゲン化物基、アミン基、およびカルボキシル基などが挙げられる。これらのペンダント反応基は、開始剤基を結合するため、および一部の態様において、陽性基の高分子主鎖への結合のために用いることができる。これらの化学基は、予備形成ポリマー上または正荷電開始剤ポリマーを造りだすために用いられるモノマー上のいずれかに存在することができる。適する反応基または荷電側基を有するポリマーの例には、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリエチレンイミン、およびポリアミドアミンなどの反応アミン基を有するポリマー、特にデンドリマーが挙げられる。
【００４３】
本発明の一つの態様において、開始剤ポリマーの主鎖は、全体の正電荷を与え、陽イオン部分に寄与する。このタイプの高分子主鎖の例には、また第１級、第２級、または第３アミン基を含むポリイミンなどのイミン結合を有するポリマーが挙げられる。開始剤ポリマーの合成におけるこれらのタイプのポリマーの使用は、複数の陽性基および開始剤基が結合することができる高度誘導体化予備形成ポリマー主鎖をそれらが与えることができるので好ましい。開始剤ポリマーの合成のための出発ポリマーとして特に適するポリアミンには、ポリエチレンイミン、およびポリプロピレンイミンなど、ならびにポリアミンポリマーまたはコポリマー、および特に以下のアミン官能性モノマー：２−アミノメチルメタクリレート、３−（アミノプロピル）−メタクリルアミド、およびジアリルアミンなどのモノマーから形成されるデンドリマーが挙げられる。適するポリアミンは市販されており、例えば、ルパソル（Ｌｕｐａｓｏｌ）（登録商標）ＰＳ（ポリエチレンイミン；ニュージャージー州、ＢＡＳＦ）がある。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、開始剤ポリマーの主鎖は、１以上の陽性基に結合される。好ましい陽性基は安定な正電荷を有し、３元および第４級陽性基を含む。好ましい陽性基には、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元スルホニウムが挙げられる。これらのタイプの陽性基は、他の陽性基が脱プロトン化され、それらの正電荷を失うことができる広い範囲のｐＨ状態において、特に、より高いｐＨ状態において、開始剤ポリマーに正電荷を与えることができる。これらの開始剤ポリマー上の正電荷は、少なくともｐＨ８を含みｐＨ８までのｐＨを有する状態；および一部の態様においてｐＨ１０を含みｐＨ１０までのｐＨを有する状態、および一部の態様においてｐＨ１２を含みｐＨ１２までのｐＨを有する状態に保持される。
【００４５】
示されるように、好ましい陽性基には、第４級アンモニウム、３元スルホニウム、および第４級ホスホニウム基が挙げられる。これらの基は、例えば、各鎖上に１〜６個範囲の炭素を有する、例えば、アルキル化またはアルコキシル化形態において与えることができる。例には、テトラアルキルアンモニウム、テトラアルコキシアンモニウム、トリアルキルスルホニウム、トリアルコキシスルホニウム、テトラアルキルホスホニウム、およびテトラアルコキシホスホニウム陽イオンが挙げられるがそれらに限定されない。特定例には、テトラメチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム、およびテトラベンジルアンモニウムなどが挙げられる。
【００４６】
陽性基は、ポリマー主鎖の長さに沿って不規則または規則的パターンで間隔をとることができるか、または、必要に応じてポリマー主鎖の一つの末端上に主として存在することができる。開始剤ポリマーは、また、必要に応じて陽性基の各種組合せを含むことができる。
【００４７】
ポリマー主鎖上に垂れ下がる陽性基の数は、機能性開始剤ポリマーを与えるために整えることができる。開始剤ポリマーの機能には、水溶液中へのその溶解性、表面と結合するその能力、および重合開始剤としてのその有効性を挙げることができる。一つの態様において、陽性基は、水溶液中に開始剤ポリマーを溶解するために充分な量で存在する。別の態様において、陽性基は、開始剤ポリマーの生体表面との相互作用を可能とするために充分な量で存在する。本発明により、開始剤ポリマーは、陽性基に結合される少なくとも一つの単量体単位を有する；更に好ましくは、開始剤ポリマーは陽性基に結合されるその単量体単位の約２０％以上を有し、最も好ましくは、開始剤ポリマーは陽性基に結合されるその単量体単位の約５０％以上を有する。複数の非極性開始剤基が存在する場合に、開始剤ポリマーは、充分な溶解性を与えると共に、また細胞表面に局限化することができる陽イオン部分により整えることができる。これは、開始剤基対陽性基の確定した比率を有する開始剤ポリマーを調製することにより達成することができる。従って、本発明の一つの態様において、開始剤ポリマー上の陽性基：開始剤基の比率は、少なくとも１：１である。更に好ましい態様において、この陽性基：開始剤基比率は少なくとも２．５：１であり、最も好ましい態様比率は少なくとも５：１である。
【００４８】
好ましい態様において、本発明は、正荷電主鎖および正荷電主鎖から垂れ下がる複数の第４級アミン基を有する開始剤ポリマーを与える。親水性主鎖は高分子イミン主鎖であることができると共に、アミン含有主鎖から垂れ下がる複数の第４級アミン基を有することができる。この態様において、第４級アミン基の存在は、開始剤ポリマーが溶液のｐＨにおけるいかなる変動にも拘わらず正電荷を保持し、溶液中への開始剤ポリマーの溶解性を維持することを可能とする。
【００４９】
開始剤基および陽性基を有する開始剤ポリマーは、種々の方法で調製することができる。例えば、開始剤基および陽性基は、開始剤および陽性基と反応する「予備形成」ポリマーまたはコポリマーに結合することができる。予備形成ポリマーまたはコポリマーは、市販元から入手するか、または、望ましいモノマーまたは各種モノマーの組合せの重合から合成することができる。開始剤ポリマーを調製する一つの例において、開始剤基および陽性基は、例えば、共有結合により、ポリマーまたはコポリマーの主鎖から垂れ下がる化学基と反応し、それらに結合される。開始剤基および陽性基のこうした結合は、例えば、置換または付加反応により達成することができる。
【００５０】
本発明の一つの好ましい態様において、開始剤ポリマーはポリマー主鎖としての高度誘導体化予備形成ポリマーを用いて調製される。好ましいポリマーは、ポリマーの分子量に対して、第１級アミン基などの大きい数の反応（誘導体化）基を含有する。適するポリマーおよびコポリマーは、ポリイミン、例えば、ポリエチレンイミンなどのアミン含有高分子単位を含む。開始剤ポリマー用の主鎖としてのこれらのタイプのポリマーまたはコポリマーの使用は、開始剤基および陽性基で高度に詰めることができる低〜中程度分子量の開始剤ポリマーの調製を可能とする。
【００５１】
開始剤ポリマーを調製する別の方法において、第１級、第２級、第３アミン、またはそれらの組合せを有するポリマーは４級化することができ、ポリマー上に荷電第４級アミン基の形成をもたらす。例えば、アミンは、引き続いて、例えば、アルキルハロゲン化物によりアルキル化されて、メンシュツキン（Ｍｅｎｓｈｕｔｋｉｎ）反応を介して第４級アミンを与えることができる。開始剤ポリマーを合成する別の有用な方法において、第３アミンを有するポリマーは、例えば、ベンジルハロゲン化物により誘導体化される光開始剤基と反応することができる。この反応は、光開始剤のポリマーへの結合、および同時に第３アミン基を荷電第４級アミン基に変換することを可能とする。
【００５２】
開始剤ポリマーを調製するなお別の方法において、開始剤基を有するモノマーおよび陽性基を有するモノマーが最初に調製される。これらの開始剤および陽性基含有モノマーは、次に共重合されて、開始剤および陽性基両方に結合される開始剤ポリマーを造りだす。一部の態様において、開始剤基および陽性基両方を有する個々のモノマーは、開始剤ポリマーを調製するために用いることができる。任意に、開始剤または陽性基のいずれにも結合されない他のモノマーは、陽イオンおよび開始剤結合モノマーと重合して開始剤ポリマーを造りだすことができる。開始剤ポリマーを調製する方法は以下に例示される。開始剤ポリマーを調製するための当業者に公知の他の標準方法は考慮されるが、更には検討されない。
【００５３】
一つの態様において、本発明の開始剤ポリマーは、一般に、生体表面とのその結合を可能とすると共に、その活性化の際に生体表面上でのマクロマーの重合を促進するために充分なサイズのものである。本発明の一つの好ましい態様において、低〜中分子量開始剤ポリマーが細胞カプセル化法に用いられる。低〜中分子量開始剤ポリマーは３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有すると言われるが、一方、高分子量ポリマーは３．２×１０6Ｄａ以上のＭwを有すると言われる。
【００５４】
従って、一つの好ましい態様において、本発明は、（ｉ）重合開始剤基、（ｉｉ）少なくともｐＨ８までの状態にあるポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、および（ｉｉｉ）３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する開始剤ポリマーを与える。更に好ましい態様において、開始剤ポリマーは、約２５０，０００Ｄａ以下、１００，０００Ｄａ以下、および５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する。別の好ましい態様において、開始剤ポリマーは、３４００〜約２５０，０００Ｄａの範囲、更に好ましくは８５００〜約２５０，０００Ｄａの範囲、なお更に好ましくは８５００〜約１００，０００Ｄａの範囲、最も好ましくは８５００〜約５０，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する。別の態様において、開始剤ポリマーは、約１０００単量体単位以下、一般的には約２５〜約５００単量体単位の範囲にある。
【００５５】
開始剤ポリマーは、一般的に、表面上でのマクロマーなどの重合性材料の重合を促進し、それによって、生体表面上に高分子材料のマトリクスを形成する。重合性材料は、１以上の重合性基を有するモノマーおよびポリマーを含むあらゆる種類の化合物であることができる。重合性基は、炭素−炭素二重結合などのフリーラジカル重合を伝播することができる重合性化合物の部分である。好ましい重合性基は、ビニルまたはアクリレート基を有する重合性化合物中に見出される。更に特定的な重合性部分には、アクリレート基、メタクリレート基、エタクリレート基、２−フェニル・アクリレート基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、イタコネート基、およびスチレン基が挙げられる。細胞材料のカプセル化用に好ましい材料は、生体適合性重合可能ポリマー（マクロマーとも呼ばれる）である。こうしたマクロマーは、直鎖または分岐鎖ポリマーまたはコポリマー、またはグラフトコポリマーであることができる。本発明の開始剤ポリマーと共に使用するために適する合成高分子マクロマー、多糖類マクロマー、およびタンパク質マクロマーは、米国特許第５，５７３，９３４号（ハッベル（Hubbell）ら）に記載されており、その教示内容はその全体を本明細書において参考のため包含する。
【００５６】
好ましいマクロマーには、重合性ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、およびそれらのコポリマーが挙げられるがそれらに限定されない。特に、ＰＥＧおよびＰＡＡは、更に好ましいマクロマーである。これらのタイプのマクロマーは、一般的に、水中に可溶であり、生分解性ポリマーに比べて、生体内でより安定である。
【００５７】
一部のケースにおいて、重合性材料として天然産または合成マクロマーを用いることは望ましくあることが可能である。適するマクロマーには、それらの例にヒアルロン酸（ＨＡ）、でんぷん、デキストラン、ヘパリン、およびキトサンに限定されないがそれらが挙げられる多糖類などの天然産ポリマー；およびそれらの例にゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、アルブミンおよびそれらの活性ペプチドに限定されないがそれらが挙げられるタンパク質（および他のポリアミノ酸）が含まれる。これらの天然産または合成マクロマーを重合性とするために、重合性基は標準熱化学反応を用いてポリマー中に組み込むことができる。例えば、重合性基はリジン残基を含有するアミンのアクリロイル・クロライドとの反応を介してコラーゲンに添加することができる。これらの反応は重合性部分を含有するコラーゲンをもたらす。同様に、マクロマーを合成する場合に、反応基を含有するモノマーは合成体系中に組み込むことができる。例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）またはアミノプロピルメタクリルアミド（ＡＰＭＡ）は、Ｎ−ビニルピロリドンまたはアクリルアミドと共重合することができ、ペンダントヒドロキシルまたはアミン基を有する水溶性ポリマーを生成する。これらのペンダント基は、次に、アクリロイル・クロライドまたはグリシジル・アクリレートと反応してペンダント重合性基を有する水溶性ポリマーを形成することができる。適する合成ポリマーには、その教示内容の全体が本明細書において参考のため包含される、上の米国特許第５，４１０，０１６号に記載されているような分解性セグメントを含有する親水性モノマーが含まれる。
【００５８】
別の態様において、本発明は、正荷電開始剤ポリマーおよびマクロマーを含む重合性組成物を与える。重合性組成物は、また、還元剤／受容体および増粘剤などの細胞カプセル化法に有用な他の化合物を含むことができる。適する増粘剤には、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧｓ）、およびグリセロールが挙げられる。従って、一つの態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも一つの重合開始剤基、およびｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態でのポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を有する開始剤ポリマーおよび（ｉｉ）マクロマーを含む重合性組成物を与える。更に特定的な態様において、本発明は、（ｉ）可視光活性化染料の群から選択される光開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態でのポリマーに正電荷を与える陽イオン部分を含む重合性組成物を与える。
【００５９】
前述のように、本発明の開始剤ポリマーは、一般的に、生体表面に膜を与えるための方法において、マクロマー、および一部のケースにおける還元剤／受容体と共に用いられる。試薬は細胞カプセル化法に特に適する。
【００６０】
カプセル化しようとする細胞または組織は、哺乳類などの生物から直接得ることができる。あるいは、細胞は細胞培養から得ることができる。カプセル化を意図する細胞は、形質変換またはさもなければ部分修正をすることができる。カプセル化し疾患治療に用いることができる細胞および組織の特定タイプは、以下に検討される。「細胞」は、組織または器官の一部として存在することができるか、または微生物として独立に機能することができる個々の膜結合生物単位を指す。「組織」は類似細胞群を含み、また、一般的に、細胞と結合する細胞外物質を含む生物質量を指す。細胞または特に組織は、カプセル化過程の前に処理を受けることができる。例えば、組織は、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、またはコラゲナーゼなどの酵素または他の適する試薬により処理して、カプセル化法に適するサイズの個々の細胞または細胞群を得ることができる。あるいは、組織は、適する細胞出発材料を調製するために機械加工を受けることができる。カプセル化法の前に、細胞は、また、薬物、プロドラッグ、またはホルモンなどで処理することができるか、または、望ましい発現パターンを示すか、またはある種の形態素性を有する細胞を与えるために培養することができる。細胞または組織の調製および調製された細胞または組織の治療用の詳細な指示書を与える技術文献は利用可能であり、例えば、Pollard, J. W. and Walker, J. M.Ｅｄ．，Basic Cell Culture Protocols（１９９７）に見出すことができる。あるいは、カプセル化に適すると共に、本発明の正荷電開始剤と共に用いるように意図される細胞または組織は、商業的に入手することができる。例えば、ミクロソームおよび肝細胞などの生物ヒト肝臓製剤および膵島などの生物ヒト膵臓製剤は、セルツダイレクト（CellzDirect,Inc.）（アリゾナ州、トウーソン）などの市販元から入手することができる。
【００６１】
技術文献において利用可能な情報により、一般に、表面を被覆するための方法において、および特に、細胞および組織をカプセル化するための本明細書において与えられる新規で革新的な方法において正荷電開始剤ポリマーを利用することができる。例えば、Cruiseら,Cell Transplantation ８：２９３（１９９９）の教示は、本発明の正荷電重合開始剤を用いる細胞カプセル化法のための基礎を与えることができる。上に示されるように調製される、または市販元から得られるカプセル化法に適する細胞または組織は、例えば、ロズウェルパークがん研究所（ＲＰＭＩ）媒体などの生体適合性緩衝水媒体などの適する媒体中に懸濁することができる。動物血清、アルブミンなどのタンパク質、酸化剤、還元剤、ビタミン、ミネラル、成長因子、または要望どおりに細胞または組織の生存性および機能に影響を与えることができる他の成分などの他の試薬は、この溶液に添加することができる。
【００６２】
正荷電開始剤ポリマーは、細胞または組織を溶液と接触させる前または後に、この溶液に添加することができる。開始剤ポリマーは、細胞または組織周りのマトリクスの形成を容易にするために充分である量で細胞と接触することができる。一つの態様において、開始剤ポリマーの濃度は、０．００１〜０．５重量％である。なお別の態様において、開始剤ポリマーの濃度は、０．１〜０．２５重量％である。一つの態様において、開始剤ポリマーは、開始剤ポリマーが細胞表面と結合するために充分である時間帯にわたり細胞と接触する。任意に、洗浄ステップは行うことができる。この洗浄ステップは、例えば、過剰な非結合開始剤または細胞と接触する他の物質を除去するために用いることができる。開始剤ポリマーが細胞または組織と接触した後、マクロマーなどの重合性材料は細胞と接触することができる。別の態様において、開始剤ポリマーは、重合性材料と共に細胞または組織と接触する。なお別の態様において、重合性材料は、開始剤ポリマーを細胞と接触させる前に、細胞と接触する。
【００６３】
重合性材料（例えば、マクロマー）は、所期の厚さのマトリクスの形成を可能とする量で細胞または組織と接触することができる。細胞カプセル化に有用な溶液中のマクロマー濃度は、５〜５０重量％の範囲、更に好ましくは１０〜３０重量％の範囲にあることができる。一部の態様において、重合性材料は、正荷電開始剤ポリマーを活性化する前に一時期細胞と接触して置くことができる。
【００６４】
他の試薬は、カプセル化過程の間細胞または組織と接触して持ち込むことができる。前述のように、こうした試薬には、フリーラジカルを形成し、重合性材料のフリーラジカル重合を引き起こすことができる第３アミン（例えば、トリエタノールアミン）などの受容体または還元剤が挙げられる。適する受容体または還元剤は技術上公知であり、市販されている。これらの受容体または還元剤は、一般的に、開始剤基がエネルギーを受容体または還元剤に与えて重合性材料のフリーラジカル重合を促進する間接重合法において用いられる。増粘性試薬などの試薬は、また、本発明の方法において用いることができる。増粘性試薬は重合工程を改善することができる。適する受容体または還元剤は技術上公知であり、市販されている。技術熟練者は、カプセル化法を行うためのあらゆるこれらの添加試薬の適する量を決定することができる。
【００６５】
マトリクスの形成を促進するために必要な試薬が被覆しようとする表面に接触して持ち込まれた後、開始剤基を活性化するために充分な熱または電磁エネルギーなどのエネルギー源が、重合性材料の重合を開始するために加えられる。長波紫外線（ＬＷＵＶ）および３５０ｎｍ〜９００ｎｍ範囲にある可視波長は好ましく、ランプおよびレーザー光源により供給することができる。これら波長の光を与えることができるランプまたはレーザー光源は市販されており、例えば、ＥＦＯＳ，Ｉｎｃ．（カナダ、オンタリオ州ミシサーガ）から入手することができる。本発明の好ましい開始剤ポリマーと共に使用するために特に適する波長は、約５２０ｎｍである。反応の時間および温度は、望ましい膜を与えるために保持される。例えば、開始剤ポリマーおよびマクロマーに接触する細胞および組織は、秒〜分の範囲にある時間帯にわたり光により処理することができる。重合反応は光源を除去することにより停止させることができる。カプセル化細胞または組織は、次に、必要ならばさらなる処理を受けることができる。例えば、カプセル化材料を対象中に導入する前に、例えば、遠心分離によりカプセル化材料を濃縮することは、望ましくあることが可能である。
【００６６】
示されるように、細胞をカプセル化するための詳細手順を与える多くの技術文献が利用可能であり、正荷電開始剤ポリマーを用いることができる枠組みを与えることができる。従って、利用可能な情報を用いて、材料の表面被覆、更に詳細には、本明細書においてまたは他の文献に記載される正荷電開始剤ポリマーおよび試薬を用いる細胞材料および組織のカプセル化を行うことができる。
【００６７】
本発明により、重合開始剤は、生体表面上での重合化材料のマトリクス形成を促進するために用いることができる。重合開始剤を用いる重合は、侵襲性または非侵襲性いずれかの手順において、対象に、一緒かまたは個別いずれかで、重合開始剤および重合性材料を適用することにより、生体内で行うことができる。他の特に有用な用途には、細胞または組織の生体外カプセル化が含まれる。この用途において、細胞または組織は適する供給源から取得し、本明細書において記載される開始剤ポリマーを含む組成物を用いる高分子材料マトリクスによりカプセル化し、次に、カプセル化細胞または組織を必要とする対象中に導入することができる。このタイプの生体外カプセル化および移植手順は、それが、宿主免疫拒絶反応からの防御効果を移植細胞に付与すると共に、なおカプセル化細胞が宿主に治療価値を与えることを可能とするマトリクス膜を与えることができるので有利である。一部のケースにおいて、移植カプセル化細胞を受入れ後、対象は、細胞をカプセル化する高分子層を貫通することができると共に、対象にとって治療価値のある細胞反応を引き起こすことができる薬剤を投薬することができる。
【００６８】
本発明の一つの態様において、開始剤ポリマーは、下垂体からの細胞、副腎からの細胞、甲状腺／副甲状腺からの細胞、ベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞、および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞などの膵島からの細胞、肝臓からの細胞、および精巣および卵巣などの生殖腺からの細胞を含む、内分泌腺系の腺および器官からの細胞または組織をカプセル化するために用いられる。内分泌腺細胞は、提供者個体から除去し、本明細書において記載される開始剤ポリマーを用いる高分子材料によりカプセル化することができる。
【００６９】
カプセル化内分泌腺細胞は、以下の状態または必要性にあるどれかを有する個体に移植することができる：下垂体障害、および成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、卵巣刺激ホルモン（ＦＳＨ）、性腺刺激ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オキシトシン、または抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）を必要とする；副腎障害、および鉱質コルチコイド（例えば、アルドステロン）、グルココルチコイド（例えば、コルチゾール）、男性ホルモンステロイド、またはエピネフリンまたはノルエピネフリンなどのカテコールアミンを必要とする；甲状腺または副甲状腺障害、および甲状腺ホルモン、カルシトニン、または副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を必要とする；糖尿病などの膵臓障害、およびインシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵臓ポリペプチドを必要とする；肝臓障害、および胆汁または凝固因子を含む血漿タンパク質を必要とする；生殖腺障害、およびテストステロンなどの男性ホルモンまたはエストロゲンなどの女性ホルモンを必要とする。
【００７０】
カプセル化することができる他のタイプの細胞には、心臓血管、呼吸器、腎臓、神経、筋肉、および骨格系からの未成熟および成熟細胞が挙げられる。一部の態様において、形質変換されるかまたは遺伝子組み換えされた細胞は、カプセル化し、宿主中に移植することができる。例えば、ペプチドホルモンまたは酵素などの治療的に有用な化合物を産生するために形質変換されるかまたは遺伝子組み換えされた細胞は、カプセル化し、個体中に導入することができる。
【００７１】
開始剤ポリマーおよび重合性材料は、また、人工バリア、例えば、手術後の組織癒着を防止するためのバリアを与えるために、生体内用途に用いることができる。この用途に対して、重合性材料と共に開始剤ポリマーが組織表面に塗布される。次に、組成物は光を当てられて重合を開始しバリア・マトリクスの形成を始める。高分子マトリクスは、他の組織が被覆化組織に癒着するのを防ぐ。一部の手順において、高分子マトリクスは血管表面上に形成して、血小板などの血液因子または細胞が血管壁と相互作用するかまたはそれに癒着することを防ぐことができる。分解性および非分解性マクロマー系は両方ともこの目的のために用いることができる。
【００７２】
上述のように、一部の例において、薬剤はカプセル化細胞を受け入れた後に対象に投与することができる。薬剤は、必要とされる場合、カプセル化細胞から治療的に有用な細胞反応を引き起こすことができる。カプセル化細胞を有する対象に投与することができる他の有用な薬物には、坑血栓性、坑炎症性、抗菌、坑増殖性、および抗癌化合物、ならびに成長因子、および骨形成タンパク質などが挙げられる。
【００７３】
本発明は、今、以下の非限定実施例を参照して実証される。
【００７４】
表１
【化１】
【００７５】
【化２】
【実施例】
【００７６】
実施例１
ＡＰＴＡＣ−ポリエチレンイミン（ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩ）ポリマーの合成
光開始剤ポリマー調製用の出発材料として、陽性第４級アンモニウム基に結合されるポリエチレンイミン主鎖を有する正荷電ポリマーを調製した。
【００７７】
（アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム・クロライド分子の形態にある第４級アンモニウム基を、以下の手順を用いてポリエチレンイミン・ポリマーに結合させた：ポリエチレンイミン（１０，０００Ｍw；ペンシルベニア州、ウオリントンのポリサイエンシズ（Polysciences））５グラムを、脱イオン水１０ｍｌ中に溶解させて５０％ＰＥＩ溶液とした。５０％ＰＥＩ溶液に、７５％（３−アクリルアミドプロピル）−トリメチルアンモニウム・クロライド溶液（ＡＰＴＡＣ；ミズーリー州、セントルイスのシグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich Corp.,））１６ｇを添加した。ＰＥＩおよびＡＰＴＡＣの混合物を５５℃で一夜にわたり振動させた。得られる生成物は粘性の琥珀色溶液であり、これを室温で密閉ガラスビン中に保存した。
【００７８】
ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩの調製に用いられる等価濃度の小スケール反応を用いてＮＭＲ（核磁気共鳴）によりＡＰＴＡＣ分子のビニルプロトンを監視することによって、反応が室温で１６時間において９９％完了することが示された。
【００７９】
上述のようにＡＰＴＡＣ対ＰＥＩの２．４：１重量比（ＡＰＴＡＣ１２ｇ対ＰＥＩ（１０，０００Ｄａ）５ｇ）を用いて、ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩの最終Ｍwが、出発ＰＥＩポリマーのＭw（１０，０００Ｄａ）よりも約３．４倍大きい（３４，０００Ｄａ）ことが推定された。
【００８０】
実施例２
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ポリエチレンイミン（ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ）開始剤ポリマーの合成
【００８１】
実施例１において合成される正荷電ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマーを、ペンダント光開始剤基を有する光開始剤ポリマー調製用の出発材料として用いた。
【００８２】
実施例１において合成されるＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマー（２００μｌ）を、ＤＭＳＯ５ｍｌ中に溶解した。エオシン−イソチオシアネート（１００ｍｇ）（ＥＩＴＣ；オレゴン州、スプリングフィールドのヘリックス・リサーチ（Helix Research））をＤＭＳＯ４５ｍｌ中に溶解して２．２ｍＭのＥＩＴＣ溶液を作成した。ＥＩＴＣ溶液を含有する溶解または反応を、引き続き、暗所かまたは明るい密閉容器中で行った。ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩ／ＤＭＳＯ溶液５ｍｌを２．２ｍＭ・ＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液４５ｍｌと混合し、室温で２４時間にわたり混ぜた。
【００８３】
２４時間後、洗浄液として２０％ＤＭＳＯ、８０％水溶液２，０００ｍｌｓを用いて、二つのバイオマックス（Biomax）フィルタ（５，０００Ｍwカットオフ（ＭＷＣＯ）；マサチューセッツ州、ビルリカのミリポア（Millipore Co.））を用いる限外濾過を介して、未反応ＥＩＴＣを除去した。次の洗浄を、また二つの５，０００Ｍwカットオフ・バイオマックスフィルタを用いて、ＤＭＳＯ／水溶液の代わりに５０ｍＭ・炭酸アンモニウム２，０００ｍｌで行った。ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩポリマー生成物２３１ｍｇを凍結乾燥により回収し、室温で光をよけて保存した。ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマー生成物の最終重量は、約４２．５ｋＤａであった。
【００８４】
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマー生成物は、表Ｉ中の化合物Ｉにより表すことができる。
【００８５】
実施例３
種々の分子量のＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマーの調製
実施例１および２に記載されるそれに類似の手順を用いて、（ａ）分子量および（ｂ）ＥＩＴＣ含量両方の変動を有するＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマーを調製した。
【００８６】
７５０，０００（７５０Ｋ）Ｄａ、１０，０００（１０Ｋ）Ｄａ、２，０００（２Ｋ）Ｄａ、および８００ＤａのＭwｓを有するＰＥＩポリマーを、ペンシルベニア州、ウオリントンのポリサイエンシズから入手した。５０％ＡＰＴＡＣ結合を有するＰＥＩを調製するために、それぞれ各種サイズのＰＥＩポリマーに対してＡＰＴＡＣ対ＰＥＩ、２．４：１重量比を用いた。２０％ＡＰＴＡＣ結合を有するＰＥＩを調製するために、それぞれ各種サイズのＰＥＩポリマーに対してＡＰＴＡＣ対ＰＥＩ、０．９６：１重量比を用いた。実施例１に詳細に記載される試薬および反応時間をそれぞれの調製物に対して用いた。続いて、列挙されるサイズのＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマーの調製物を、次に、実施例２に詳細に記載される試薬および反応時間を用いるＥＩＴＣ分子に結合した。詳細には、各ＡＰＴＡＣ−ＰＥＩポリマー調製物（２００μｌ）をＤＭＳＯ５ｍｌ中に溶解し、２．２ｍＭ・ＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液４５ｍｌと混合し、次に、室温で２４時間にわたり混合した。実施例２に詳細に記載される精製ステップをそれぞれの試料に対して実施し、各調製物の収率は、実施例１および２の１０，０００ＭwＰＥＩポリマーを用いる回収のそれに比較し得るものであった。
【００８７】
結果により、５０％ＡＰＴＡＣ目標負荷での開始剤の最終Ｍwｓは以下の通りであると計算される：
【００８８】
出発ＭwＰＥＩ（Ｄａ） 近似最終ＭwＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ（Ｄａ）
（ａ）８００ ３４００
（ｂ）２０００ ８５００
（ｃ）１０，０００ ４２，５００
（ｄ）７５０，０００ ３．２×１０6
【００８９】
実施例４
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−デンドリマー開始剤ポリマーの調製
実施例１および２に記載されるそれに類似の手順を用いて、ＰＥＩ−ＡＰＴＡＣ−デンドリマー開始剤ポリマーを調製した。１４，２１５Ｄａの分子量を有するアミン官能性デンドリマーを、実施例１および２で用いた１０，０００Ｄａ・ＰＥＩの代わりにポリマー主鎖として用いた。
【００９０】
デンドリマー開始剤ポリマーの合成における第１ステップとして、中間ＡＰＴＡＣ−デンドリマーを作成した。エチレンジアミン−コア・ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代、ＦＷ１４，２１５Ｄａ、メタノール中１０重量％；ミズーリー州、セントルイスのシグマ・アルドリッチ）１グラムを、７５％ＡＰＴＡＣ溶液（シグマ・アルドリッチ）４４．７ｍｇと共にフラスコ中に入れた。メタノールをロータリー・エバポレータで除去して残留物１７６ｍｇを得、残留物を３．５日間にわたり３７℃でオーブン中において加熱した。重水素を含むメタノール（ＣＤ3ＯＤ）中の残留物のＮＭＲ分析により、反応がＡＰＴＡＣのビニルプロトンに対して９９％を超えて完了していることが示された。
【００９１】
ＡＰＴＡＣ−デンドリマー／ＤＭＳＯ溶液を、ＡＰＴＡＣ−デンドリマー中間物３０ｍｇをＤＭＳＯ５ｍｌ中に溶解することにより調製した。ＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液を、エオシン−イソチオシアネート（ＥＩＴＣ；オレゴン州、スプリングフィールドのヘリックス・リサーチ）２５ｍｇをＤＭＳＯ３００マイクロリットル中に溶解することにより調製した。デンドリマー−ＡＰＴＡＣ／ＤＭＳＯ溶液をＥＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液と混ぜ合わせ、室温で２４時間にわたり混合した。ＥＩＴＣを含む溶解または反応を、光防御容器（琥珀色ガラスビン）中で行った。
【００９２】
２４時間後、未反応ＥＩＴＣを、洗浄液として２０％ＤＭＳＯ、８０％水溶液２リットルを用いて、二つのバイオマックス・フィルタ（５，０００Ｍwカットオフ（ＭＷＣＯ）；マサチューセッツ州、ビルリカのミリポア）を用いる限外濾過を介して除去した。次の洗浄を、また二つの５，０００Ｍwカットオフ・バイオマックスフィルタを用いてＤＭＳＯ／水溶液の代わりに５０ｍＭ炭酸アンモニウム２リットルにより実施した。ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−デンドリマー生成物４７ｍｇを凍結乾燥により回収し、室温で光から防御して保存した。
【００９３】
実施例５
トリメチロールプロパン・エトキシレート（２０／３ＥＯ／ＯＨ）・トリアクリレート・マクロマーの調製
【００９４】
ＰＥＧ系マクロマーを開始剤ポリマーと共に使用するため以下に詳細に記載されるように合成した。
【００９５】
ＰＥＧ系マクロマーの合成を図１に示す。トリメチロールプロパン・エトキシレート（ＰＥＧトリオール；１００．０ｇ、９８．６ｍモル；平均Ｍwｃａ．１，１０４；Ｃａｔ．Ｎｏ．４１，６１７−７；ウィスコンシン州、ミルウオーキーのアルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company, Inc.,））を、攪拌しながらトルエン２００ｍｌｓ中に溶解し、１時間にわたり還流した。ＰＥＧ−トリオール溶液を放置して約８０℃に冷却した。この時に、４−メトキシフェノール（ＭＥＨＱ；ニュージャージー州、フィリップスバーグのＪ．Ｔ．ベーカー（Baker））５０ｍｇ（０．４０３ｍモル）、アクリル酸（ニュージャージー州、フィリップスバーグのＪ．Ｔ．ベーカー）４２．７ｇ（０．５９２モル）、および硫酸（ウィスコンシン州、ミルウオーキーのアルドリッチ・ケミカル・カンパニー）１０ｍｌｓ（０．１８８モル）を、攪拌しながら反応溶液に添加した。反応溶液を加熱して還流した。約６．０ｍｌｓの水が生成しディーン＆スターク（Ｄｅａｎ ＆ Ｓｔａｒｋ）容器を介して収集されるまで（約１時間）、反応を進めさせた。反応混合物を放置して５０℃に冷却し、攪拌しながら重炭酸ナトリウム溶液（脱イオン水２．５リットル中２７０ｇ）中に注いだ。有機層を分離し、脱イオン水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ＰＥＧ−トリアクリレートを拭き取りフィルム蒸留器（ウィスコンシン州、ソークビルのポープ・サイエンティフィック（Pope Scientific, Inc.,））を用いて単離した。
【００９６】
ＰＥＧ−トリアクリレート・マクロマー生成物は表Ｉ中の化合物ＩＩにより表される。
【００９７】
実施例６
ＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩ開始剤ポリマーを用いる細胞カプセル化
実施例１、２、および３において調製される正荷電開始剤ポリマーを重合開始剤として用いて、細胞表面上にカプセル化性高分子膜を与える。細胞カプセル化手順は以下のステップを含む：（ｉ）細胞を実施例１〜３において調製されるＡＰＴＡＣ−ＥＩＴＣ−ＰＥＩポリマーを含有する溶液と接触させ、（ｉｉ）細胞を実施例４のＰＥＧ−トリアクリレート・マクロマーを含有する溶液と接触させ、（ｉｉｉ）マクロマーおよび開始剤と接触する細胞をアルゴン・レーザー光源で処理し、および（ｉｖ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄すること。これらのステップの後、細胞を検査して、細胞周りの膜の品質（顕微鏡検査を介して）、および細胞生死判定（トリパンブルー排除法またはヨウ化プロピジウム染色法）を決定する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＰＥＧ系マクロマー、ＰＥＧ−トリアクリレート（化合物ＩＩ）調製のための合成体系を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表面を与え（providing）、
（ｂ）該表面を、（ｉ）開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマーと接触させ、
（ｃ）該表面を重合性材料と接触させ、および
（ｄ）正荷電開始剤ポリマーの開始剤基を活性化させて、少なくとも表面の一部上で重合性材料の重合を引き起こすこと、のステップを含む方法。
【請求項２】
正荷電開始剤ポリマーが窒素を含む高分子主鎖を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高分子主鎖がポリイミン主鎖を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
高分子主鎖がポリエチレンイミンを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
正荷電開始剤ポリマーが高分子主鎖を有し、陽イオン部分が高分子主鎖から垂れ下がる（pendent）陽性基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
陽イオン部分が、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元（ternary）スルホニウムからなる群から選択される基を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
陽イオン部分が第４級アンモニウム基を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
陽イオン部分が、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
陽イオン部分が、ｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
開始剤基が光開始剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
光開始剤が３５０ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光開始剤が５００ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
光開始剤が、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
正荷電開始剤ポリマーが少なくとも５個の開始剤基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
正荷電開始剤ポリマーが３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
正荷電開始剤ポリマーが２５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜２５０，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜１００，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
正荷電開始剤ポリマーが１０００単量体単位以下を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
表面が負荷電表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
表面が生体表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
表面が細胞を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
更に、ステップ（ａ）〜（ｄ）から生成される被覆細胞または複数の被覆細胞を対象中に導入するステップ（ｅ）を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）高分子主鎖、
（ｂ）アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択され、高分子主鎖に結合される光開始剤基、および
（ｃ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、
を含む正荷電開始剤ポリマー。
【請求項２５】
（ａ）（ｉ）重合開始剤基、および
（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマー、および
（ｂ）重合性材料、を含む、表面に高分子膜を与えるためのキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表面を与え、
（ｂ）（ｉ）開始剤基、および
（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマーに該表面を接触させ、
（ｃ）該表面を重合性材料と接触させ、および
（ｄ）正荷電開始剤ポリマーの開始剤基を活性化させて、少なくとも表面の一部上で重合性材料の重合を引き起こすこと、のステップを含む方法。
【請求項２】
正荷電開始剤ポリマーが窒素を含む高分子主鎖を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高分子主鎖がポリイミン主鎖を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
高分子主鎖がポリエチレンイミンを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
正荷電開始剤ポリマーが高分子主鎖を有し、陽イオン部分が高分子主鎖から垂れ下がる陽性基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
陽イオン部分が、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元（ternary）スルホニウムからなる群から選択される基を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
陽イオン部分が第４級アンモニウム基を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
陽イオン部分が、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
陽イオン部分が、ｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
開始剤基が光開始剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
光開始剤が３５０ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光開始剤が５００ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
光開始剤が、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
正荷電開始剤ポリマーが少なくとも５個の開始剤基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
正荷電開始剤ポリマーが３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
正荷電開始剤ポリマーが２５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜２５０，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜１００，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
正荷電開始剤ポリマーが１０００単量体単位以下を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
表面が負荷電表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
表面が生体表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
表面が細胞を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
更に、ステップ（ａ）〜（ｄ）から生成される被覆細胞または複数の被覆細胞を対象中に導入するステップ（ｅ）を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）高分子主鎖、
（ｂ）アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択され、高分子主鎖に結合される光開始剤基、および
（ｃ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマー。
【請求項２５】
（ａ）（ｉ）重合開始剤基、および
（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマー、および
（ｂ）重合性材料、を含む、表面に高分子膜を与えるためのキット。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法により形成される高分子マトリクスによりカプセル化される１以上の細胞。
【請求項１】
（ａ）表面を与え（providing）、
（ｂ）該表面を、（ｉ）開始剤基、および（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマーと接触させ、
（ｃ）該表面を重合性材料と接触させ、および
（ｄ）正荷電開始剤ポリマーの開始剤基を活性化させて、少なくとも表面の一部上で重合性材料の重合を引き起こすこと、のステップを含む方法。
【請求項２】
正荷電開始剤ポリマーが窒素を含む高分子主鎖を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高分子主鎖がポリイミン主鎖を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
高分子主鎖がポリエチレンイミンを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
正荷電開始剤ポリマーが高分子主鎖を有し、陽イオン部分が高分子主鎖から垂れ下がる（pendent）陽性基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
陽イオン部分が、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元（ternary）スルホニウムからなる群から選択される基を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
陽イオン部分が第４級アンモニウム基を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
陽イオン部分が、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
陽イオン部分が、ｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
開始剤基が光開始剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
光開始剤が３５０ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光開始剤が５００ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
光開始剤が、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
正荷電開始剤ポリマーが少なくとも５個の開始剤基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
正荷電開始剤ポリマーが３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
正荷電開始剤ポリマーが２５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜２５０，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜１００，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
正荷電開始剤ポリマーが１０００単量体単位以下を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
表面が負荷電表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
表面が生体表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
表面が細胞を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
更に、ステップ（ａ）〜（ｄ）から生成される被覆細胞または複数の被覆細胞を対象中に導入するステップ（ｅ）を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）高分子主鎖、
（ｂ）アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択され、高分子主鎖に結合される光開始剤基、および
（ｃ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、
を含む正荷電開始剤ポリマー。
【請求項２５】
（ａ）（ｉ）重合開始剤基、および
（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマー、および
（ｂ）重合性材料、を含む、表面に高分子膜を与えるためのキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表面を与え、
（ｂ）（ｉ）開始剤基、および
（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマーに該表面を接触させ、
（ｃ）該表面を重合性材料と接触させ、および
（ｄ）正荷電開始剤ポリマーの開始剤基を活性化させて、少なくとも表面の一部上で重合性材料の重合を引き起こすこと、のステップを含む方法。
【請求項２】
正荷電開始剤ポリマーが窒素を含む高分子主鎖を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高分子主鎖がポリイミン主鎖を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
高分子主鎖がポリエチレンイミンを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
正荷電開始剤ポリマーが高分子主鎖を有し、陽イオン部分が高分子主鎖から垂れ下がる陽性基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
陽イオン部分が、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、および３元（ternary）スルホニウムからなる群から選択される基を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
陽イオン部分が第４級アンモニウム基を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
陽イオン部分が、ｐＨ１０を含み少なくともｐＨ１０までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
陽イオン部分が、ｐＨ１２を含み少なくともｐＨ１２までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
開始剤基が光開始剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
光開始剤が３５０ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光開始剤が５００ｎｍ以上の励起波長を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
光開始剤が、アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
正荷電開始剤ポリマーが少なくとも５個の開始剤基を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
正荷電開始剤ポリマーが３．２×１０6Ｄａ未満のＭwを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
正荷電開始剤ポリマーが２５０，０００Ｄａ以下のＭwを有する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜２５０，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
正荷電開始剤ポリマーが８，５００〜１００，０００Ｄａの範囲にあるＭwを有する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
正荷電開始剤ポリマーが１０００単量体単位以下を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
表面が負荷電表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
表面が生体表面を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
表面が細胞を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
更に、ステップ（ａ）〜（ｄ）から生成される被覆細胞または複数の被覆細胞を対象中に導入するステップ（ｅ）を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）高分子主鎖、
（ｂ）アクリジン・オレンジ、カンファーキノン、エチル・エオシン、エオシンＹ、エリトロシン、フルオレセイン、メチレングリーン、メチレンブルー、フロキシム、リボフラビン、ローズベンガル、チオニン、およびキサンチン染料からなる群から選択され、高分子主鎖に結合される光開始剤基、および
（ｃ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマー。
【請求項２５】
（ａ）（ｉ）重合開始剤基、および
（ｉｉ）ｐＨ８を含み少なくともｐＨ８までのｐＨを有する状態にある正荷電開始剤ポリマーに正電荷を与える陽イオン部分、を含む正荷電開始剤ポリマー、および
（ｂ）重合性材料、を含む、表面に高分子膜を与えるためのキット。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法により形成される高分子マトリクスによりカプセル化される１以上の細胞。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５２４６８０（Ｐ２００６−５２４６８０Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７１８５（Ｐ２００６−５０７１８５）
【出願日】平成１６年３月１２日（２００４．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７８０９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９３８４６
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５０００６４８９０）サーモディックス，インコーポレイティド (15)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１２日（２００４．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７８０９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９３８４６
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５０００６４８９０）サーモディックス，インコーポレイティド (15)
【Ｆターム（参考）】
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